KR102264902B1 - 안정성이 향상된 pcr 프리믹스 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안정성이 향상된 PCR 프리믹스 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 제조방법은 열풍 건조, 다양한 물질의 단계를 포함함으로써 PCR 프리믹스의 활성 저하를 방지하고, 생산 시간을 단축할 수 있으며, 안정성이 유지될 수 있는 PCR 프리믹스를 제조할 수 있다.

Description

안정성이 향상된 PCR 프리믹스 조성물 및 이의 제조방법 {PCR premix composition with improved stability and its preparation method}

아래 실시예들은 안정성이 향상된 PCR 프리믹스 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

중합효소 연쇄 반응(PCR)은 검출을 원하는 특정 표적 유전물질을 증폭하는 방법으로, DNA진단, DNA복제, 바이러스, 세균의 검출, 표적DNA농도의 정량, 측정 등 다양한 용도에 사용하고 있다.

PCR 반응에 사용되는 Taq DNA polymerase는 열에 매우 안정한 DNA 중합 효소로서, 특이적 서열이 작용하는 프라이머 서열로부터 증폭을 일으키는 효소이다. PCR을 위한 조성물은 Taq DNA polymerase 와 반응버퍼 (dNTP 및 버퍼) 그리고 template에 결합할 수 있는 프라이머를 포함한다. 이러한 PCR을 진행할 때 실험 스킬이나 정밀도에 따라 사용하는 프라이머의 양, dNTP의 양, Taq DNA polymerase의 양이 각각 다르게 사용될 수 있어 PCR 실험의 결과에 오차가 생길 수 있으며, 결과적으로 PCR 준비에 많은 시간이 소모되고, 각각의 오리지널 스탁이 오염되어 잘못된 결과가 도출될 수 있다.

이러한 문제를 방지하기 위한 것이 premix로, 일반적인 premix는 Taq DNA polymerase, 반응 버퍼와 dNTPs를 포함하는 조성물이 미리 구비된 제품이다. 실험자는 Template DNA 및 primer, 증류수 만을 넣어 최종 1배가 되도록 볼륨을 맞추어 PCR을 준비하게 된다. 동결건조된 프리믹스의 경우 DNA 침강제, 염료, 스태빌라이저를 포함하는 버퍼를 분주하여 건조시킨 후 연구자는 증류수와 DNA template 및 프라이머를 추가하여 PCR 결과를 빠르게 확인할 수 있다.

이와 관련하여, 종래의 프리믹스는 영하 20도로 배송되는 2x솔루션 타입의 프리믹스, 또는 동결건조된 프리믹스가 주로 사용되고 있다. 솔루션 타입의 프리믹스는 여러번 동결과 해동을 반복할 경우 안정성과 오염 가능성 측면에서 문제가 발생할 수 있고, 동결건조의 프리믹스는 이동 보관 및 사용이 편리하나 제조 단가가 높고 생산 시간이 길다는 단점이 있다.

이러한 배경하에서 본 발명자는 특이성, 안정성이 우수한 프리믹스의 제조방법을 연구함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허공보 제10-2019-0007216호 한국공개특허공보 제10-2016-0075955호

본 발명은 DNA 중합효소, 반응 버퍼, 4종의 dNTP, 침강물질, MgCl₂, 및 염료를 튜브에 혼합하는 단계; 상기 튜브에 실리카 나노입자 및 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트를 첨가하는 단계; 상기 튜브를 열전도 블록에서 직가열 열풍 건조하여 액체 성분을 증발시키는 단계; 및 상기 증발된 튜브를 상온 보관하는 단계를 포함하는, 열안정성 및 보관성이 향상된 PCR 프리믹스 조성물의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 및 다른 목적과 이점은 바람직한 실시예를 설명한 하기의 설명으로부터 분명해질 것이다.

상기 목적은, DNA 중합효소, 반응 버퍼, 4종의 dNTP, 침강물질, MgCl₂, 및 염료를 튜브에 혼합하는 단계; 상기 튜브에 실리카 나노입자 및 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트를 첨가하는 단계; 상기 튜브를 열전도 블록에서 직가열 열풍 건조하여 액체 성분을 증발시키는 단계; 및 상기 증발된 튜브를 상온 보관하는 단계를 포함하는, 열안정성 및 보관성이 향상된 PCR 프리믹스 조성물의 제조방법에 의해 달성될 수 있다.

구체적으로, 상기 침강 물질은 피콜, 글리세롤, 글루시톨 또는 수크로스인 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 제조방법으로 제조된 PCR 프리믹스 조성물에 의해 달성되는 것일 수 있다.

구체적으로 상기 염료는 크실렌 시아놀인 것을 특징으로 하며, 상기 조성물은 젤라틴 및 솔비톨을 추가로 포함하고, 상기 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 또는 pfu DNA 중합효소인 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 열전도 블록은 열전도 랙을 포함하며 60℃의 온도로 유지되는 것이고, 상기 증발 단계는 진공 펌프를 이용한 밀폐 감압 챔버 조건에서 이루어지는 것이고, 상기 반응 버퍼는 암모늄 설페이트를 포함하지 않는 것이며, 상기 튜브에 실리카 나노입자, 폴리에틸렌옥사이드, 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, 우르소데옥시콜산, 퀘르세틴 및 루틴을 첨가하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법은 다양한 물질을 첨가하는 단계를 포함함으로써 PCR 프리믹스의 활성 저하를 방지하고, 생산 시간을 단축할 수 있으며, 안정성이 유지될 수 있는 PCR 프리믹스를 제조할 수 있다.

다만, 본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 일 실시예에 따른, 본 발명에 따른 PCR 프리믹스의 제조방법에 대한 대략적인 흐름도를 나타낸 것이다.
도 2는 일 실시예에 따른, 본 발명의 PCR 프리믹스 조성물을 이용해 template DNA를 증폭한 PCR 결과를 비교한 결과이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예들에 대한 특정한 구조적 또는 기능적 설명들은 단지 예시를 위한 목적으로 개시된 것으로서, 다양한 형태로 변경되어 실시될 수 있다. 따라서, 실시예들은 특정한 개시형태로 한정되는 것이 아니며, 본 명세서의 범위는 기술적 사상에 포함되는 변경, 균등물, 또는 대체물을 포함한다.

제1 또는 제2 등의 용어를 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 이런 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 해석되어야 한다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소는 제1 구성요소로도 명명될 수 있다.

어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명의 실시예들에서, 별도로 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명의 실시예에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 본 명세서 상에서 언급된 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우 '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성 요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.

구성 요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.

도면에서 나타난 각 구성의 크기 및 두께는 설명의 편의를 위해 도시된 것이며, 본 발명이 도시된 구성의 크기 및 두께에 반드시 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.

본 발명의 일 측면은, DNA 중합효소, 반응 버퍼, 4종의 dNTP, 침강물질, MgCl₂, 및 염료를 튜브에 혼합하는 단계; 상기 튜브에 실리카 나노입자 및 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트를 첨가하는 단계; 상기 튜브를 열전도 블록에서 직가열 열풍 건조하여 액체 성분을 증발시키는 단계; 및 상기 증발된 튜브를 상온 보관하는 단계를 포함하는, 열안정성 및 보관성이 향상된 PCR 프리믹스 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 프리믹스는 PCR 시험을 위해 혼합된 조성물로서 샘플을 넣고 PCR 기기를 사용하여 증폭과정을 거치고 확인할 수 있는 제품을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 4종의 dNTP는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP를 의미한다.

본 발명의 제조방법은, DNA 중합효소에 대해 통상적인 동결건조하는 방식이 아닌 열풍 및 온도전달 블록을 이용해 빠르게 수분을 제거함으로써, 동결 건조하지 않은 PCR premix와 비교하여 증폭도에서 차이가 없는 PCR 증폭결과를 얻을 수 있고, 상온에 보관 시 최소 3달 동안 안정하게 유지될 수 있다는 장점이 있다. 이를 통해 제조방법의 간편화 및 사용자의 이용 간편화를 통해 제조, 보관, 사용의 편이성을 제공함으로써 유전자 증폭을 빠르게 진행할 수 있다.

열풍건조의 경우 공기가열과 튜브, 블럭을 통해 온도를 높여서 수분을 제거하므로 수분제거가 매우 빨라 제조시간이 상당히 절약될 수 있다. 설비 또한 열풍을 제공하는 드라이 오븐을 통해 짧은 시간 동안 건조가 가능하며, 비용 측면에서 동결건조에 비해 제조비용이 낮다는 장점이 있다. 직가열 블럭을 이용하고 건조한 더운 공기를 통해 프리믹스를 빠르게 건조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 침강 물질, 침강제는 아가로스 젤에 곧바로 로딩되어 사용할 수 있도록 하는 것으로, 상기 침강물질을 반응혼합물 조성에 첨가함으로써 PCR 반응 이후 추가 처리 없이 젤 로딩이 바로 가능하다. 상기 침강 물질은 피콜, 글리세롤, 글루시톨 또는 수크로스인 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 염료는 크실렌 시아놀인 것을 특징으로 할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 젤라틴 및 솔비톨을 추가로 포함할 수 있다. 젤라틴과 솔비톨은 DNA 중합효소와 dNTP의 안정화에 보조적인 도움을 준다.

일 실시예에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 또는 pfu DNA 중합효소인 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 열전도 블록은 열전도 랙을 포함하며 60℃의 온도로 유지되는 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 증발 단계는 진공 펌프를 이용한 밀폐 감압 챔버 조건에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 감압 조건은 내부의 압력을 650 내지 750mmHg로 감압한 것일 수 있다. 감압 조건이 상기 조건을 초과할 경우 열풍 건조가 잘 이루어지지 않을 수 있으며, 효소의 활성 및 안정성에 변화가 발생할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 반응 버퍼는 암모늄 설페이트를 포함하지 않는 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 튜브에 실리카 나노입자, 폴리에틸렌옥사이드, 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, 우르소데옥시콜산, 퀘르세틴 및 루틴을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 실리카 나노입자, 폴리에틸렌옥사이드, 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, 우르소데옥시콜산, 퀘르세틴 및 루틴은 각각 DNA 중합효소, dNTP의 안정성, 보관 기간 향상을 위한 것으로, DNA 중합효소의 변성, 불활성화, 분해를 억제하고, dNTP 분자 간의 자발적인 결합이나 응집을 방지한다.

일 실시예에 있어서, 상기 튜브에 실리카 나노입자, 폴리에틸렌옥사이드, 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, 우르소데옥시콜산, 퀘르세틴 및 루틴은 PCR 프리믹스 조성물 전체 대비, 각각 0.05 중량%, 0.1 중량%, 0.5 중량%, 0.01 중량%, 0.3 중량%, 0.7 중량%로 포함하는 것일 수 있다. 이러한 첨가 물질은 DNA 중합효소, dNTP의 안정성을 개선하는 역할을 하나, 과량 포함될 경우 PCR 반응의 결과값에 영향을 줄 수 있으므로 상기 중량%로 첨가되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 PCR 프리믹스 조성물, 상기 프리믹스 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

이하, 구체적인 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: PCR 프리믹스 조성물의 제조

PCR 프리믹스 조성물을 제조하기 위해, PCR 반응 버퍼 5mM, 염화마그네슘, 1mM, dNTPs 0.5mM, Taq polymerase(Takara, Japan) 1.25U을 각각 2μl씩 준비하여 튜브에 혼합하였다. 크실렌 시아놀, 및 피콜을 추가로 투여한 후 혼합하였다. 상기 혼합물에 실리카 나노입자, 폴리에틸렌옥사이드, 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, 우르소데옥시콜산, 퀘르세틴 및 루틴을 각각 PCR 프리믹스 조성물 전체 대비 0.05 중량%, 0.1 중량%, 0.5 중량%, 0.01 중량%, 0.3 중량%, 0.7 중량%로 포함되도록 첨가하였다.

이후, 상기 튜브를 열전도성을 갖는 특수 랙으로 구성된 열전도 블록에 전도하고, 랙을 60℃의 온도로 유지하여 열풍 건조를 수행하였다. 이 때 상기 열전도 블록은 진공 펌프를 이용한 밀폐 감압 챔버 조건이 유지되도록 하였으며, 내부 압력은 700mmHg로 유지하도록 하였다. 액체 성분이 증발된 후 조성물을 상온에 밀폐하여 보관함으로써 PCR용 프리믹스 조성물을 제조하였다.

한편 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 열풍 및 감압 조건에서의 직가열 건조 대신 동결건조 방식을 사용하여 건조한 제조예 2의 PCR 프리믹스 조성물과, 튜브에 안정화 조성물로서 실리카 나노입자, 폴리에틸렌옥사이드, 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, 우르소데옥시콜산, 퀘르세틴 및 루틴을 첨가하는 단계를 생략하고 제조한 제조예 3의 PCR 프리믹스 조성물을 제조하였다.

실험예 1: 상온 보관 후 PCR 반응시 반응성 및 보관성 확인

상기 제조예 1 내지 3의 PCR 프리믹스 조성물을 상온(25도)에서 30일 간 보관한 후, PCR 반응을 수행하여 반응성 및 안정성 정도를 확인하였다. 주형 DNA로는 람다 DNA를 사용하였으며, 프라이머는 해당 주형 DNA에 상보적 서열을 갖는 시판 프라이머(Sigma)를 구매하여 사용하였다

PCR 반응은 95℃에서 20초, 55℃에서 40초, 72℃에서 60초의 과정을 1회로 하여 총 30회를 수행하였고, 예비 변성과 신장은 각각 94℃에서 5분, 72℃에서 5분씩 수행하였다. PCR 반응에서 수득된 생성물을 아가로오스 겔에 DNA 분자량 마커와 함께 전기영동시킨 후 에티듐브로마이드로 염색한 후, DNA 밴드를 촬영하였다.

그 결과 도 2에서 볼 수 있듯이, 제조예 1의 PCR 프리믹스 조성물은 DNA 밴드가 또렷하게 나타나 DNA 중합효소의 반응성이 그대로 유지되었음을 확인하여, 30일이 지난 시점에서도 반응성과 안정성이 우수하게 유지됨을 알 수 있다(컬럼 2), 반면 제조예 2 및 3의 PCR 프리믹스 조성물은 제조예 1의 조성물에 비해 반응성이 비교적 저하되어 밴드의 두께가 다소 약하게 발현되었음을 알 수 있다 (컬럼 4, 5). 이를 통해 본 발명의 제조방법에 있어서 열풍 건조 단계 및 안정화 혼합 물질의 첨가를 통해 PCR 프리믹스 조성물의 안정성, 보관성을 향상시키고 편리하게 생산할 수 있음을 확인하였다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (3)

1. DNA 중합효소, 반응 버퍼, 4종의 dNTP, 침강물질, MgCl₂, 및 염료를 튜브에 혼합하는 단계;
   상기 튜브에 실리카 나노입자 및 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트를 첨가하는 단계;
   상기 튜브를 열전도 블록에서 직가열 열풍 건조하여 액체 성분을 증발시키는 단계; 및
   상기 증발된 튜브를 상온 보관하는 단계를 포함하는, 보관성이 향상된 PCR 프리믹스 조성물의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 침강 물질은 피콜, 글리세롤, 글루시톨 또는 수크로스인 것인, 제조방법.
   
3. 제1항에 제조방법으로 제조된 PCR 프리믹스 조성물.
   
   

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