CN110628885B - 反应液、pcr反应液及其使用方法和用途 - Google Patents

反应液、pcr反应液及其使用方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种反应液、PCR反应液及其使用方法和用途。反应液，包括反应液A，所述反应液A包括Tris‑HCl 5‑15mmol/L、Tth酶10‑30U/mL、UNG酶1‑3U/mL、Mn2+40‑100mmol/L和甘油20％‑70％V甘油/V反应液A。PCR反应液，包括反应液A和反应液B。PCR反应液的使用方法：将反应液A、反应液B分别加入提取到的核酸中进行PCR反应，然后测试即可。PCR反应液的用途，用于血液筛查HIV、HBV和HCV。本申请提供的反应液，酶稳定性好，保存时间长；本申请提供的PCR反应液，能抵抗高温对酶活性的影响，有效的防止污染，具有高效率、高稳定性的突出特点。

Description

反应液、PCR反应液及其使用方法和用途
技术领域
本发明涉及PCR反应领域，尤其涉及一种反应液、PCR反应液及其使用方法和用途。
背景技术
PCR(聚合酶链式反应)是现代分子生物学中的基础之一，目前已经普遍运用在分子诊断层面。对血液进行鉴定，建库，筛查等也离不开PCR。
RT-PCR技术(实时荧光定量PCR技术)是普通PCR技术的衍生，具有更好的扩增特异性以及更高的检测灵敏度，将RT-PCR技术和血液筛查技术结合起来，将更好的提高样本检测的效率，提高血液检测的灵敏度，以及HCV、HBV、HIV的发现概率，降低风险。使用PCR进行血液筛查方面的检测将提高血液的安全性。
PCR反应液的配置会极大的影响PCR反应的质量和效率，例如反应液中酶的稳定性、Mg2+影响反应的特异性和扩增片段的产率、PCR反应的效率及稳定性等问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种反应液、PCR反应液及其使用方法和用途，以解决上述问题。
为实现以上目的，本发明特采用以下技术方案：
一种反应液，包括反应液A，所述反应液A包括Tris-HCl 5-15mmol/L、Tth酶10-30U/mL、UNG酶1-3U/mL、Mn2+40-100mmol/L和甘油20％-70％V甘油/V反应液A。
缓冲液Tris-HCl和甘油的配合使用，可以有效提高酶的稳定性，延长保存时间。
优选地，所述Tris-HCl的浓度为10mmol/L、pH为7-9，所述Tth酶的浓度为20U/mL，所述UNG酶的浓度为2U/mL，所述Mn2+的浓度为60mmol/L，所述甘油的体积百分比为50％；
优选地，所述Tris-HCl的pH为7.5；
优选地，所述Mn2+对应的物质为醋酸锰。
可选地，所述反应液A中，Tris-HCl的浓度可以是5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L、15mmol/L以及5-15mmol/L之间的任一值，Tth酶的浓度可以是10U/mL、11U/mL、12U/mL、13U/mL、14U/mL、15U/mL、16U/mL、17U/mL、18U/mL、19U/mL、20U/mL、21U/mL、22U/mL、23U/mL、24U/mL、25U/mL、26U/mL、27U/mL、28U/mL、29U/mL、30U/mL以及10-30U/mL之间的任一值，UNG酶的浓度可以是1U/mL、1.5U/mL、2U/mL、2.5U/mL、3U/mL以及1-3U/mL之间的任一值，Mn2+的浓度可以是40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L、60mmol/L、65mmol/L、70mmol/L、75mmol/L、80mmol/L、85mmol/L、90mmol/L、95mmol/L、100mmol/L以及40-100mmol/L之间的任一值，甘油占反应液A总体积的百分比可以为20％、30％、40％、50％、60％、70％以及20％-70％之间的任一值。所述Tris-HCl的pH可以为7、7.5、8、8.5、9以及7-9之间的任一值。
一种PCR反应液，包括所述反应液和反应液B；
所述反应液B包括缓冲液、DATP 3-5mol/mL、DGTP 3-5mol/mL、DCTP3-5mol/mL、DUTP 6-10mol/mL、DTT 0.1-5mmol/L、BSA 0.1-5mmol/L和Mn2+40-100mmol/L；以所述反应液B的总体积计，所述缓冲液包括bicine/KOH 30-80mmol/L、K-acetate 80-140mmol/L和甘油4％-12％V甘油/V反应液B；
使用时，所述反应液A与所述反应液B的体积比为(1-5)：(20-40)。
本申请提供的PCR反应液，相比市面通用反应液，可以扩增GC含量超过60％的GC-rich片段，增加了引物选择范围；能够长期于2-8℃保存，方便操作也避免了反复冻融，提高了便利性并增加了稳定性。反应液B对反应液A拥有激活功能。
所述反应液B中，DATP(脱氧核糖核苷三磷酸)、DGTP(脱氧鸟苷三磷酸)、DCTP(脱氧胞嘧啶核苷)的浓度均可以独立的是3mol/mL、3.5mol/mL、4mol/mL、4.5mol/mL、5mol/mL以及3-5mol/mL之间的任一值，DUTP(脱氧尿嘧啶)的浓度可以是6mol/mL、7mol/mL、8mol/mL、9mol/mL、10mol/mL以及6-10mol/mL之间的任一值，DTT(二硫苏糖醇)的浓度可以是0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L、4.0mmol/L、4.5mmol/L、5.0mmol/L以及0.1-5mmol/L之间的任一值，BSA(牛血清白蛋白)的浓度可以是0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L、4.0mmol/L、4.5mmol/L、5.0mmol/L以及0.1-5mmol/L之间的任一值，Mn2+的浓度可以是40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L以及40-100mmol/L之间的任一值；以所述反应液B的总体积计，所述缓冲液中，bicine/KOH(N,N-二羟乙基甘氨酸/氢氧化钾)的浓度可以是30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L以及30-80mmol/L之间的任一值，K-acetate(醋酸钾)的浓度可以是80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、110mmol/L、120mmol/L、130mmol/L、140mmol/L以及80-140mmol/L之间的任一值，甘油占反应液B的总体积的百分比可以为4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％以及4％-12％之间的任一值。所述反应液A与所述反应液B的体积比可以为1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40以及(1-5)：(20-40)之间的任一值。
优选地，所述的PCR反应液还包括矿物油，所述矿物油与所述反应液A的体积比为(10-30)：(1-5)；
优选地，所述矿物油包括石蜡油；
优选地，优选地，所述反应液A、所述反应液B、所述石蜡油的体积比为3：27：20。
在实验过程中，不可避免的会出现气溶胶污染以及体系蒸发，由于PCR反应极为灵敏，在高温反应过程不可避免的会出现蒸发现象，封盖石蜡油后则会避免这种现象的发生，提高了稳定性，降低了误差。
可选地，所述矿物油与所述反应液A的体积比可以为2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、15：1、20：1、25：1、30：1以及(10-30)：(1-5)之间的任一值。
优选地，以所述反应液B的总体积计，所述缓冲液中：
所述bicine/KOH的浓度为50mmol/L，所述K-acetate的浓度为115mmol/L，所述甘油的体积百分比为8％；
优选地，所述缓冲液的pH为7-9；
优选地，所述缓冲液的pH为8.2。
酶本质上是一种蛋白质，在最适应pH值下才能有较好的活力；使用醋酸锰提供锰离子，反应效果最好。
可选地，所述缓冲液的pH可以为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0以及7-9之间的任一值。
优选地，所述反应液B中：
所述DATP、所述DGTP、所述DCTP的浓度均为4mol/mL，所述DUTP的浓度为8mol/mL，所述DTT的浓度为1mmol/L、所述BSA的浓度为0.1mmol/L，所述Mn2+的浓度为60mmol/L。
对各个组分的用量的优选，有利于提高反应液的稳定性以及PCR反应的灵敏度和结果的准确性。
优选地，所述反应液A和所述反应液B的溶剂均为水。
一种所述的PCR反应液的使用方法，包括以下步骤：
将所述反应液A、所述反应液B分别加入核酸中进行PCR反应即可。
优选地，反应体系中还加入矿物油。
优选地，所述PCR反应的变性温度为87-93℃、退火温度为55-61℃、延伸温度为52-58℃；循环次数为40-50次。
对变性、退火和延伸温度和循环次数的控制，可以更好的保证PCR反应的高效、稳定和准确。
可选地，所述PCR反应的变性温度可以为87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃以及87-93℃之间的任一值，退火温度可以为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃以及55-61℃之间的任一值，延伸温度可以为52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃以及52-58℃之间的任一值；循环次数可以为40次、41次、42次、43次、44次、45次、46次、47次、48次、49次、50次以及40-50次之间的任一值。最为优选地，所述PCR反应的变性温度为90℃、退火温度为58℃、延伸温度为55℃；循环次数为45次。
一种所述的PCR反应液的用途，用于血液筛查HIV、HBV和HCV。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
1.本申请提供的反应液，使用Tris-HCl作为缓冲液，并在其中添加甘油，使得反应液中的酶能够长期于2-8℃保存；
2.本申请提供的PCR反应液，反应液B使用了DUTP底物，有效的防止了反应自身产物造成的污染；反应液舍弃了镁离子而使用了Mn2+离子，使DNA模板进行引物延伸更为优选，能更好的提高PCR产物的特异性和反应的灵敏度；加入了BSA及DTT，反应液A、反应液B混合的同时，将极大的提高酶活性，保证反应的顺利进行；本申请提供的PCR反应液，能同时扩增多种不同的核酸，包括DNA及RNA；既可以防污染，也能避免高温导致酶失活的风险，具有高效率、高稳定性和高准确率的优势；
3.本申请提供的PCR反应液，使用方法简单，能够很好的契合自动化检测设备，检测效率高；
4.本申请提供的PCR反应液，可以用于血液单项或多项同时筛查HIV、HBV和HCV。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1为使用本申请实施例3提供的Tth酶及缓冲液进行37℃加速7天后对HCV样本5个梯度进行重复3次PCR反应的结果图；
图2为使用市售Tth酶及其缓冲液进行37℃加速7天后对HCV样本5个梯度进行重复3次PCR反应的结果图；
图3为使用本申请实施例3提供的PCR反应液对提取好的三种浓度混合核酸进行PCR反应后的PCR曲线图；
图4为使用对比例1提供的反应液对提取好的三种浓度混合核酸进行PCR反应后的PCR曲线图；
图5为使用-20℃储存7天的本申请实施例3提供的PCR反应液以及2～8℃储存7天的本申请实施例3提供的PCR反应液对提取好的2种浓度的同一批混合核酸进行PCR后的曲线图；
图6为使用2～8℃储存7天的本申请实施例3提供的PCR反应液以及常温(37℃)放置7天的本申请实施例3提供的PCR反应液对提取好的2种浓度的同一批混合核酸进行PCR后的曲线图。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请使用的测试仪器为上海宏石SLAN-96P。
实施例1
按照以下配方配置PCR反应液：
反应液A：Tris-HCl(pH 7at 25℃)5mmol/L、Tth酶30U/mL、UNG酶1U/mL、Mn2+100mmol/L、甘油20％V甘油/V反应液A；
反应液B：缓冲液(pH为9)、DATP 3mol/mL、DGTP 5mol/mL、DCTP 3mol/mL、DUTP10mol/mL、DTT 0.1mmol/L、BSA 5mmol/L和Mn2+40mmol/L；以反应液B的总体积计，缓冲液包括bicine/KOH 80mmol/L、K-acetate 80mmol/L和甘油12％V甘油/V反应液B；
反应液A与反应液B的体积比为1：20。
实施例2
按照以下配方配置PCR反应液：
反应液A：Tris-HCl(pH 9at 25℃)15mmol/L、Tth酶10U/mL、UNG酶3U/mL、Mn2+40mmol/L、甘油70％V甘油/V反应液A；
反应液B：缓冲液(pH为7)、DATP 5mol/mL、DGTP 3mol/mL、DCTP 5mol/mL、DUTP6mol/mL、DTT 5mmol/L、BSA 2mmol/L和Mn2+100mmol/L；以反应液B的总体积计，缓冲液包括bicine/KOH 30mmol/L、K-acetate 140mmol/L和甘油4％V甘油/V反应液B；
反应液还包括石蜡油；
反应液A、反应液B和石蜡油的体积比为5：40：20。
实施例3
按照以下配方配置PCR反应液：
反应液A：Tris-HCl(pH 7.5at 25℃)10mmol/L、Tth酶20U/mL、UNG酶2U/mL、醋酸锰60mmol/L、甘油50％V甘油/V反应液A；
反应液B：缓冲液(pH为8.2)、DATP 4mol/mL、DGTP 4mol/mL、DCTP 4mol/mL、DUTP8mol/mL、DTT 1mmol/L、BSA 0.1mmol/L和Mn2+60mmol/L；以反应液B的总体积计，缓冲液包括bicine/KOH 50mmol/L、K-acetate 115mmol/L和甘油8％V甘油/V反应液B；
反应液还包括石蜡油；
反应液A、反应液B和石蜡油的体积比为3：27：20。
对比例1
以购自凯杰生物技术(上海)有限公司的通用反应液作为对照，该反应液的成分为：蒸馏水9.9ul，5*Q buffer 10ul，10xPCR Buffer(with MgCl2)5ul，25mM MgCl2 2ul，2.5mM each DNTP 4ul，50U/ul Hotstartaq酶1ul。
为了证明本申请提供的反应液A、PCR反应液的优势，特进行对照如下：
A.酶稳定性
Tth酶一般情况下需要在-20℃长期储存才能保证其活性，2-8℃储存一般也仅能短期储存(一个月)，而将其储存在适当的酶缓冲液中将提高酶的稳定性。
使用市面上普通的Tth酶及其缓冲液(自带缓冲液)，与本发明使用的缓冲液(加有甘油的Tris-HCl)，将试剂进行37℃加速7天，取出后进行实验，为减少随机误，实验操作为同一位实验员分两天在同一实验进行，市售试剂在第8天进行，本发明试剂在第9天进行。样本选择HCV假病毒，浓度为1*106，分别进行5个梯度稀释(分别标记为1、2、3、4、5)，每个梯度稀释10倍，每组实验重复三次，并加入了内标及阴性对照。
结果如图1、图2所示。本发明试剂在含甘油的缓冲液保护下，进行加速实验后产生影响较小，仅极限浓度荧光值出现一点差异，其余部分曲线清晰，稳定性好；而市售Tth酶在加速实验后，其活性应受到了一定的影响，导致极限浓度两条未能检出，唯一检出的一条也效果较差(图2第5组曲线仅有1条)，说明本发明用于保护酶的缓冲液是具有稳定性优势的。
B.特异性检测
分别使用实施例3和对比例1提供的反应液进行PCR实验。实验设计使用两种不同的反应液及各自的PCR方法做3个浓度梯度，其中HIV-1的浓度分别为5*106IU/mL、5*105IU/mL、5*104IU/mL；HBV的浓度分别为1*106IU/mL、1*105IU/mL、1*104IU/mL；HCV的浓度分别为1*106IU/mL、1*105IU/mL、1*104IU/mL(分别按顺序标记对应表1中的浓度1、浓度2和浓度3)，分别使用两种反应液对这三个浓度梯度的混合核酸进行PCR，将结果做比较，提取试剂配方及方法如下：
提取试剂包括提取试剂A,B,C,D四种及蛋白酶K，矿物油,磁珠，内标，其中提取试剂A包括2.0-5.0M胍盐、2.0-5.0mM金属离子络合剂、100.0-300.0mM非离子表面活性剂和1.0-5.0M异丙醇的水溶液；
提取试剂B包括20.0-40.0mM柠檬酸和10.0-30.0mM金属离子络合剂的水溶液，pH值为3.5-4.5；
提取试剂C包括2.0-10.0mM柠檬酸和1.0-5.0mM金属离子络合剂的水溶液，pH值为3.5-4.5；
提取试剂D包括5.0-30.0mM三羟甲基氨基甲烷和1.0-15.0mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的水溶液。
磁珠为硅机磁珠，粒径大小为1-1.5μm，优选为1.2μM；所述矿物油为石蜡油；所述核酸内标为盔甲核糖核酸。
提取步骤为下：
(1)往待提取容器中依次加入蛋白酶K、内标、待测样本、提取试剂A、矿物油A，振荡使充分裂解；加入磁珠，震荡后进行磁吸附。
(2)加入提取试剂B进入步骤(1)中的溶液，振荡后磁吸附，弃液保留磁珠。
(3)加入提取试剂C进入步骤(2)中的溶液，振荡后磁吸附，弃液保留磁珠。
(4)加入提取试剂D进入步骤(3)中的溶液，振荡混匀后弃磁珠，洗脱得到的溶液即为目的核酸。
所述步骤(1)中蛋白酶K、内标、待测样本、提取试剂A、矿物油A、磁珠的体积比为4:1:50:50:5:1。
使用测试仪器上海宏石SLAN-96P进行测试。
本申请实施例3提供的PCR反应液进行PCR反应的步骤为：
在核酸中先加入反应液A和反应液B，然后加入石蜡油。
控制PCR反应的程序为：
1.升温至50℃，2min；
2.升温至90℃，30s；
3.保存在58℃，25min；
4.95℃，15s；
5.55℃，60s；
6.4-5步循环45次。
使用本发明的PCR操作步骤，配合石蜡油及PCR底部采光技术，将得到稳定性较好的实验结果，结果如图3所示。
本申请对比例1提供的反应液进行PCR反应的步骤为：
将该反应液加入核酸中，进行反应。
控制PCR反应的程序为：
1.升温至96℃，15min；
2.保温至95℃，15s；
3.降温至55℃，20s；
4.升温至72℃，20s；
5.保温72℃，5min；
6.升温至95℃，1min；
7.降温至35℃，2min；
8.2-4步循环45次。
测试结果如图4所示。
表1不同核酸样本测试CT值
实施例1 HIV HBV HCV
浓度1 20.39 18.60 19.79
浓度2 23.29 22.51 22.43
浓度3 26.54 26.66 25.84
对比例1 HIV HBV HCV
浓度1 21.40 18.96 20.30
浓度2 23.82 22.82 23.12
浓度3 26.40 26.61 25.54
从图3和图4以及下表1的数据可知，使用本发明的PCR反应液后HIV-1的CT值为20.39，对比例1的反应液为21.40，相差个1.01CT值，HBV的CT值为18.86，对比例1的反应液CT值为18.96，相差0.30个CT值，HCV的CT值为19.79，对比例1的反应液为20.30，相差0.51个CT值，在使用的核酸样本及机器完全一致的情况下，本申请提供的PCR反应液扩增效率良好，对比例1的市售试剂在HBV第三个浓度出现了轻微的抑制现象，本发明的反应液具有一定的优势。同时，在程序优化上，本发明的PCR配套程序也进过一定优化，用时更少。
图3为使用本申请实施例3提供的PCR反应液对提取好的三种浓度混合核酸进行PCR反应后的PCR曲线图；图4为使用对比例1提供的反应液对提取好的三种浓度混合核酸进行PCR反应后的PCR曲线图。需要说明的是，图3中3条HIV测试曲线，从左至右依次对应浓度为5*106IU/mL、5*105IU/mL、5*104IU/mL；图3中3条HBV测试曲线，从左至右依次对应浓度为1*106IU/mL、1*105IU/mL、1*104IU/mL；图3中3条HCV测试曲线，从左至右依次对应浓度为1*106IU/mL、1*105IU/mL、1*104IU/mL。图4中3条HIV测试曲线，从左至右依次对应浓度为5*106IU/mL、5*105IU/mL、5*104IU/mL；图4中3条HBV测试曲线，从左至右依次对应浓度为1*106IU/mL、1*105IU/mL、1*104IU/mL；图4中3条HCV测试曲线，从左至右依次对应浓度为1*106IU/mL、1*105IU/mL、1*104IU/mL。
C.稳定性检测
由于市面上通用的PCR反应液需在-5～-20℃冰箱保存，而本发明的PCR反应液可以在2～8℃稳定保存，针对本发明试剂的稳定性，我们进行了以下实验设计来验证本发明反应液的稳定性。
将本申请实施例3提供的PCR反应液分成4个相同的组分(由完全相同的试剂组成)，命名为A,B,C,D。分成两组进行对比，A,B为第一组，C，D为第二组，对A组PCR反应液进行-20℃保存7天，B组PCR反应液2～8℃冰箱保存7天，然后使用A组PCR反应液,B组PCR反应液不同温度储存7天后的反应液与同一批相同的混合核酸进行PCR反应，核酸浓度分2个梯度(HIV-1的浓度分别为5*106IU/mL(标记为HIV-A)、5*104IU/mL(标记为HIV-B)；HBV的浓度分别为1*106IU/mL(标记为HBV-A)、1*104IU/mL(标记为HBV-B)；HCV的浓度分别为1*106IU/mL(标记为HCV-A)、1*104IU/mL(标记为HCV-B))。将得到的结果进行比对以观察不同在其他条件相同的情况下，仅存在储存温度这个变量对PCR结果产生的影响，结果如图5所示；同时对C组PCR反应液进行2～8℃保存7天，将D组PCR反应液常温(37℃)放置7天后，使用过同一批混合核酸与C组PCR反应液,D组PCR反应液进行PCR，核酸浓度分2个梯度(HIV-1的浓度分别为5*106IU/mL(标记为HIV-C)、5*104IU/mL(标记为HIV-D)；HBV的浓度分别为1*106IU/mL(标记为HBV-C)、1*104IU/mL(标记为HBV-D)；HCV的浓度分别为1*106IU/mL(标记为HCV-C)、1*104IU/mL(标记为HCV-D))，将得到的结果进行比对，结果如图6所示。
从图5可以看出，三种核酸的CT值几乎是完全一样的，曲线重合度很好(一组两条线分别表示不同保存条件下的测试结果)，从图6中可以看出三种核酸的CT值曲线也是基本完全重合的，说明本发明的PCR反应液的稳定性十分好，既可以在-20℃保存后解冻使用，也可以在2～8℃冰箱中储存，即便在常温下(37℃)密封放置7天，也不会影响效果。
D.反应液性能研究
为验证反应试剂在缓冲液中的稳定性，我们设计在其他条件相同的情况下进行比较实验，取适量浓度血筛样本(包含HIV/HBV/HCV)，总共设计5个梯度进行10倍梯度实验，极限浓度约等于LOD(20IU/ML)。
实验一：A组，在2-8℃环境中，将反应液A、反应液B分开放置。B组，在2-8℃环境中，将反应液A、反应液B混合放置后。最后将两组试剂等待8,24,48小时后进行实验。
实验二：C组，在37℃常温环境中，将反应液A、反应液B分开放置。D组，在37℃常温环境中，将反应液A、反应液B混合放置，等待8,24,48小时后进行实验，每组进行3个重复。
实验结果如下表2所示：
表2反应液性能研究结果
Figure BDA0002250765750000151
上表2的结果表明，本发明反应液在分开放置的情况下，在2-8℃及常温37℃放置8/24/48h的情况下，具有良好的稳定性；而将反应液A、反应液B合并后，仅在2-8℃放置8小时的情况下能勉强检出。说明本发明的反应液按要求分开放置储存后，具有极强的稳定性。
本申请提供的PCR反应液不同于市面通用反应液，可以扩增GC含量超过60％的GC-rich片段，增加了引物选择范围，同时使用了特殊配置的缓冲液，使得酶可以长期于2-8℃保存，使用了DUTP底物，有效的防止了污染；使用了Mn2+离子，能更好的提高PCR产物的特异性；加入了BSA及DTT，反应液A、反应液B混合的同时，将极大的提高酶活性，保证反应的顺利进行，优选封盖了石蜡油，减少了反应蒸发尤其是变性时液体蒸发所造成的产物丢失。相对于市面上常规的-20℃的储存方式，本发明的PCR反应液可以长期储存在2-8℃下，方便操作也避免了反复冻融，本发明反应液可以高效的契合自动化的核酸提取流程，是核酸提取进化上的必经之路。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

Claims (9)

1.一种PCR反应液，其特征在于，包括反应液A和反应液B；
所述反应液A由Tris-HCl 10mmol/L、Tth酶20U/mL、UNG酶2U/mL、Mn2+ 60mmol/L和甘油50% V甘油/V反应液A组成；所述Tris-HCl的pH为7.5；
所述反应液B由缓冲液、DATP4mol/mL、DGTP 4 mol /mL、DCTP 4 mol /mL、DUTP 8 mol/mL、DTT 1mmol/L、BSA 0.1mmol/L和Mn2+ 60mmol/L组成；以所述反应液B的总体积计，所述缓冲液由bicine/KOH 50mmol/L、K-acetate 115mmol/L和甘油8%V甘油/V反应液B组成；所述缓冲液的pH为8.2；
使用时，所述反应液A与所述反应液B的体积比为3：27。
2.根据权利要求1所述的PCR反应液，其特征在于，所述Mn2+对应的物质为醋酸锰。
3.根据权利要求1所述的PCR反应液，其特征在于，还包括矿物油，所述矿物油与所述反应液A的体积比为（10-30）：（1-5）。
4.根据权利要求3所述的PCR反应液，其特征在于，所述矿物油包括石蜡油。
5.根据权利要求4所述的PCR反应液，其特征在于，所述反应液A、所述反应液B、所述石蜡油的体积比为3：27：20。
6.根据权利要求1~5任一项所述的PCR反应液，其特征在于，所述反应液A和所述反应液B的溶剂均为水。
7.一种权利要求1~6任一项所述的PCR反应液的非疾病诊断和治疗目的的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述反应液A、所述反应液B分别加入核酸中进行PCR反应即可。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述PCR反应的变性温度为87-93℃、退火温度为55-61℃、延伸温度为52-58℃；循环次数为40-50次。
9.一种权利要求1~6任一项所述的PCR反应液的用途，其特征在于，用于制备血液筛查HIV、HBV和HCV的产品。
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