CN109055490A - 一种具有核酸洗脱功能的反转录pcr反应液和核酸提取方法 - Google Patents

一种具有核酸洗脱功能的反转录pcr反应液和核酸提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，其组分包括两种方案：其一包括双功能聚合酶，dNTPs，引物，探针，氯化锰或醋酸锰，Bicine/KOH，醋酸钾和甘油；其二包括耐热反转录酶mlv，dNTPs，引物，探针，KCl和Tris‑HCl；pH≥8.0。本发明配制了一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，该反应液可耐受50‑95℃高温，采用该反转录PCR反应液替代了原经典检测方法中的PCR反应液和洗脱液，即将原PCR反应液和洗脱液合成为一个试剂‑‑‑反转录PCR反应液，同时可将洗脱步骤与后续PCR体系构建步骤合并，简化了一个步骤，该步骤的缩减对于自动化尤其是核酸POCT的实现非常关键。

Description

一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液和核酸提取方法
技术领域
本发明涉及PCR扩增技术领域，尤其是涉及一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，本发明还涉及使用该反转录PCR反应液进行核酸提取的方法。
背景技术
核酸检测过程包括核酸提取和PCR扩增检测。经典的检测步骤包括：裂解吸附，洗涤，洗脱，洗脱物加入PCR体系，加入PCR试剂，混合后进行检测。由于洗脱过程往往需要在高温（50-95℃）下进行，而高温会对反转录酶的活性造成影响，降低了反转录效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，解决了高温洗脱对反转录酶活性的影响；本发明同时还提供采用该反转录PCR反应液进行核酸提取的方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
方案1：本发明所述的具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，包括以下组分：2-100U双功能聚合酶，50-400μM dNTPs，50-400nM引物，20-400mM探针，2-10mM 氯化锰或醋酸锰，10-100mM Bicine/KOH，20-200mM醋酸钾，5-10%甘油；其pH≥8.0。
方案2：本发明所述的具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，包括以下组分：2-100U耐热反转录酶mlv，50-400μM dNTPs，50-400nM引物，20-400mM探针，10-100mM KCl，20-200mM Tris-HCl；其pH≥8.0。
本发明方案1或方案2中还可以包括PCR增强剂。
本发明所述的一种核酸检测方法，包括磁珠法核酸提取和PCR扩增，所述磁珠法核酸提取用的洗脱液和PCR扩增用的PCR反应液合成为按方案1或方案2配制的一种试剂----反转录PCR反应液；这样即可将洗脱步骤与后续PCR体系构建步骤合并为一个步骤。
本发明的优点在于配制了一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，该反应液可耐受50-95℃高温，采用该反转录PCR反应液替代了原经典检测方法中的PCR反应液和洗脱液，即将原PCR反应液和洗脱液合成为一个试剂---反转录PCR反应液，同时可将洗脱步骤与后续PCR体系构建步骤合并，简化了一个步骤，该步骤的缩减对于自动化尤其是核酸POCT的实现非常关键。
本发明将反转录酶采用耐高温的Tth酶或耐热的mlv聚合酶，解决了高温洗脱对反转录酶活性的影响。利用pH 8.0以上的高pH条件和60-90℃高温实现核酸的洗脱，同时高温洗脱，促进了RNA的解链，恢复低温后，促进了引物与RNA模板的结合，更有效的提高了反转录效果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。如无特殊说明，本发明中采用的方法均为本领域的常规方法，所用的检验设备或试剂均为市售产品。
实施例1 配制一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液（方案1，采用双功能聚合酶）
其组分为：2-100U双功能聚合酶，50-400μM dNTPs，50-400nM引物，20-400mM探针，2-10mM 氯化锰或醋酸锰，10-100mM Bicine/KOH，20-200mM醋酸钾，5-10%甘油；反应液的pH≥8.0。也可添加一定的PCR增强剂，形式可以为一个混合物，或者由固体石蜡等相变剂分隔成的多组分仓室，在反应时，相变后几种组分会自动混合成一种试剂。
实际配制时，其具体组分可为：20U商品化Tth酶，100μM dNTPs，200nM引物，50mM探针，5mM氯化锰或醋酸锰，20mM Bicine/KOH,20mM 醋酸钾，5%甘油，pH 8.0。
洗脱步骤为：吸附有模板的磁珠进入PCR反应液，60-90℃ 孵育1-10min，磁吸去除磁珠，洗脱和PCR体系构建完成。
实施例2 配制一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液（方案2，采用耐热反转录酶）
其组分为：2-100U耐热反转录酶 mlv，50-400μM dNTPs，50-400nM引物，20-400mM探针，10-100mM KCl,20-200mM Tris-HCl；反应液的pH≥8.0。也可添加一定的PCR增强剂，形式可以为一个混合物，或者由固体石蜡等相变剂分隔成的多组分仓室，在反应时，相变后几种组分会自动混合成一种试剂。
实际配制时，其具体组分可为：10U耐热反转录酶mlv，50μM dNTPs，100nM引物，25mM探针， 50mM KCl，20mM Tris-HCl； pH8.0。
洗脱步骤为：吸附有模板的磁珠进入PCR反应液，55-60℃ 孵育1-10min，磁吸去除磁珠，洗脱和PCR体系构建就完成了。
实施例3 反转录活性的验证
取提取好的HCV RNA扩增，梯度稀释3个梯度，重复检测3次。
反转录PCR反应液的配方为：20U 商品化Tth酶，100μM dNTPs，200nM引物，50mM探针，5mM氯化锰或醋酸锰，20mM Bicine/KOH,20mM 醋酸钾，5%甘油，pH 8.0。
标准扩增程序：60℃ 15min反转录；95℃2min变性；95℃ 10s变性，60℃ 30s退火延伸采集荧光，40个循环；
高温验证程序：90℃ 5min；60℃ 15min反转录；95℃2min变性；95℃ 10s变性，60℃30s退火延伸采集荧光，40个循环；
检测结果如下表1：
表1
如表1所示，添加高温步骤后，对反转录酶活性没有影响，同时还起到了意想不到的技术效果：引入了高温杂交步骤，引物和模板结合更充分，检测敏感度更高，表现在检测 Ct值提前。
实施例4 洗脱效果的验证
标本：取临床HCV阳性血清标本4例，高、中、低、临界浓度四个浓度水平，分别采用两种方法（常规方法和本发明方法）检测提取和扩增检测重复检测3次。
1、常规使用的标准方法：
（1）吸取200ul血清标本，加入400ul 裂解液，加入20ul 磁珠。
（2）吸打混匀10次，室温静置5min，磁吸1min，去上清。
（3）加600ul洗液，吸打混匀10次，磁吸1min，去上清。
（4）重复加600ul洗液，吸打混匀5次，磁吸1min，去上清。
（5）加100ul 洗脱液，吸打混匀10次，90℃ 5min。磁吸1min。
（6）取50ul上清，添加到PCR反应管。反应程序为：60℃ 15min反转录；95℃2min变性；95℃ 10s变性，60℃ 30s退火延伸采集荧光，40个循环；
（7）添加2*RT-PCR反应液50ul，进行反转录PCR反应。
注：第（5）步用的洗脱液配方为 10mM Tris-HCl＋1mM EDTA，pH 8.0。
第（7）步所用的2*RT-PCR反应液配方为：20U耐热反转录酶mlv，100μM dNTPs，200nM引物，50mM探针，100mM KCl，40mM Tris-HCl； pH8.0。
2、本发明方法（简化方法）：
（1）吸取200ul血清标本，加入400ul 裂解液，加入20ul 磁珠。
（2）吸打混匀10次，室温静置5min，磁吸1min，去上清。
（3）加600ul洗液，吸打混匀10次，磁吸1min，去上清。
（4）重复加600ul洗液，吸打混匀5次，磁吸1min，去上清。
（5）加1*RT-PCR反应液（代替洗脱液）100ul，90℃ 5min。磁吸1min；
其中的1*RT-PCR反应液的配方为：10U耐热反转录酶mlv，50μM dNTPs，100nM引物，25mM探针， 50mM KCl，20mM Tris-HCl； pH8.0。
（6）取上清进行反转录PCR反应。 反应程序为：60℃ 15min反转录；95℃2min变性；95℃ 10s变性，60℃ 30s退火延伸采集荧光，40个循环。
按照以上两种方法对标本进行检测，其结果如下表2所示：
如表2所示：本发明要求保护的创新性简化流程，缩减了提取步骤，同时起到了意想不到的技术效果：简化步骤，引入了高温杂交步骤，引物和模板结合更充分，检测敏感度更高，表现在高值 Ct值提前，临界浓度检出率更高。

Claims (4)

1.一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，其特征在于：包括以下组分：2-100U双功能聚合酶，50-400μM dNTPs，50-400nM引物，20-400mM探针，2-10mM 氯化锰或醋酸锰，10-100mM Bicine/KOH，20-200mM醋酸钾，5-10%甘油；其pH≥8.0。
2.一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，其特征在于：包括以下组分：2-100U耐热反转录酶mlv，50-400μM dNTPs，50-400nM引物，20-400mM探针， 10-100mM KCl，20-200mMTris-HCl；其pH≥8.0。
3.根据权利要求1或2所述的具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，其特征在于：还包括PCR增强剂。
4.一种核酸检测方法，包括磁珠法核酸提取和PCR扩增，其特征在于：所述磁珠法核酸提取用的洗脱液和PCR扩增用的PCR反应液合成为权利要求1或2所述的反转录PCR反应液；所述洗脱步骤与后续PCR体系构建步骤合并为一个步骤。
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