CN107881225A - 线粒体基因组dna快速分离、测序新方法及试剂盒 - Google Patents

线粒体基因组dna快速分离、测序新方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN107881225A
CN107881225A CN201711256028.1A CN201711256028A CN107881225A CN 107881225 A CN107881225 A CN 107881225A CN 201711256028 A CN201711256028 A CN 201711256028A CN 107881225 A CN107881225 A CN 107881225A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
mitochondrial
mitochondrial genomes
separation
sequencing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711256028.1A
Other languages
English (en)
Inventor
黄方亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN201711256028.1A priority Critical patent/CN107881225A/zh
Publication of CN107881225A publication Critical patent/CN107881225A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开线粒体基因组DNA快速分离、测序新方法及试剂盒。本发明采用核酸外切酶III或Plasmid‐Safe ATP‐Dependent DNase酶降解线性染色体序列，进而富集线粒体基因组DNA用于高通量测序。本发明线粒体DNA测序方法为线粒体基因组的检测,特别是可以针对没有参照序列的线粒体基因组检测。

Description

线粒体基因组DNA快速分离、测序新方法及试剂盒
技术领域
本发明属于DNA检测技术领域，涉及一种线粒体基因组DNA快速分离、测序新方法及试剂盒。
背景技术
绝大多数真核生物都有线粒体，线粒体是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为生物发动机。线粒体拥有自身的遗传物质和遗传系统，但其基因组较小，是一种半自主细胞器。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。动物的线粒体序列缺陷会引起很严重的疾病，而且线粒体基因组序列被广泛用于研究物种进化。
线粒体基因组序列比较难得到，以前研究线粒体基因组序列的方法有三种：1、在检测全基因组序列的时候，顺便检测染色体基因组序列；这样需要的经费就比较大，而且在数据覆盖度不够大的情况下，线粒体序列也不一定能检测完全。从其他高通量数据间接得到线粒体基因组信息的方法存在一个重要问题即Numts的污染。Numts专指生物体线粒体基因组起源的核序列，是由线粒体基因组转移到核基因组形成的细胞核Numts，在脊椎动物和无脊椎动物中广泛存在，具有序列长、拷贝数高的特点。由于Numts与线粒体基因组的序列近似或完全匹配，因此容易将转入核基因组的Numts错误分析成线粒体基因组的序列，造成生物多样性、种群遗传、物种系统进化关系和线粒体疾病的错误研究和推断。2、用超速离心机分离线粒体，提取DNA检测；这样做的缺点是需要很大的组织样本，前期实验过程比较繁琐。3、设计覆盖全线粒体基因组的引物，通过PCR得到线粒体序列，测序；这样做的缺点是不能检测还未知的线粒体序列，引物设计费用比较大，PCR容易带入突变影响测序结果,总有一些区域不能被检测到。
本发明采用核酸外切酶III或Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶降解线性染色体序列，进而富集线粒体基因组DNA用于高通量测序。核酸外切酶III或Plasmid-SafeATP-Dependent DNase酶可以作用于双链DNA，沿3’到5’方向逐步催化去除单核苷酸。核酸外切酶III一般应用于单向巢式缺失，定点突变，链特异性探针的制备，双脱氧测序用单链底物制备。Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶目前一般用于消化环化质粒DNA中混入的线性基因组DNA；或者消化乙肝病人的血液DNA，富集环化的乙肝病毒DNA，增加检测灵敏度。这两种酶都还未有报道用于真核生物线粒体DNA的富集。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于非诊断目的的分离检测线粒体基因组DNA的方法。
本发明步骤包括:
步骤(1)、提取生物组织样品或血液样品总DNA，其中生物组织样品可以是动物,植物,真菌；
步骤(2)、分离富集线粒体DNA：
将步骤(1)提取的基因组DNA,加入核酸外切酶III(Exonuclease III)或Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶，以及相应的反应缓冲液，37℃，0.5-16小时,磁珠回收纯化DNA,回收的核酸中绝大部分线性DNA被消化，线粒体DNA含量比例升高。
步骤(1)提取的基因组DNA与核酸外切酶III或Plasmid-Safe ATP-DependentDNase酶的质量体积比为(1-3)ug：(1-3)ul；
步骤(3)、线粒体基因组DNA测序：
取步骤(2)中分离的(0.001-1)ug线粒体DNA，构建200bp短片段文库，或者取步骤(2)中分离的(1-3)ug线粒体DNA，构建3kb mate-pair文库；用高通量测序仪，得到100M以上的数据，拼接后得到线粒体基因组完成序列。
本发明的另一个目的是提供线粒体基因组DNA检测试剂盒。
该试剂盒包括核酸外切酶III(Exonuclease III)或Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶，以及反应缓冲液；可以搭配文库构建试剂使用。
本发明线粒体DNA测序方法为线粒体基因组的检测,特别是可以针对没有参照序列的线粒体基因组检测。
本发明试剂盒可以通过少量血液检测线粒体病，基于线粒体DNA的物种进化分析等研究提供了简便快速低成本的技术方法。
核酸外切酶III(Exonuclease III)或Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶在弱碱性条件下，消化线性双链DNA为脱氧核苷酸。但对于环状或双链DNA超螺旋DNA没有活性。将该酶用于总DNA的消化,就可以除去线性染色体DNA,富集环状的线粒体基因组DNA。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明线粒体基因组DNA快速分离、测序新方法，包括以下步骤:
步骤(1)、提取生物组织样品总DNA：
取200ug左右的生物组织样品(动物,植物,真菌),放入研钵,液氮冷冻,研磨成粉状,反复冷冻研磨2-3次,看不到块状组织为止；加入1-3ML Plant DNAzol,继续研磨混匀；溶解后将液体转入2毫升离心管，放到60℃金属浴加热15-60分钟，期间多次颠倒混匀；高速离心3分钟；上清液转移到新1.5毫升离心管，加入等体积氯仿，最高速离心3分钟；上层液体转移到新1.5毫升离心管，加60％异丙醇，颠倒混匀，最高速离心15分钟；弃上清，加1毫升70％酒精，颠倒混匀，最高速离心1分钟；弃上清，晾干，加100微升TE溶液，溶解总DNA。采用试剂盒用膜吸附或者磁珠吸附的方法提取的总DNA也都可以用。
步骤(2)、分离富集线粒体DNA：
将步骤(1)提取的基因组DNA,加入核酸外切酶III(Exonuclease III)或Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶，以及相应的反应缓冲液，37℃，0.5-16小时,磁珠回收纯化DNA,回收的核酸中绝大部分线性DNA被消化，线粒体DNA含量比例升高。
步骤(1)提取的基因组DNA与核酸外切酶III或Plasmid-Safe ATP-DependentDNase酶的质量体积比为1-3ug：1-3ul；
步骤(3)、线粒体基因组DNA测序：
取步骤(2)中分离的0.001ug-1ug线粒体DNA，构建200bp短片段文库，或者取步骤(2)中分离的0.001ug-3ug线粒体DNA构建3kb mate-pair文库，用高通量测序仪，得到100M以上的数据，拼接后就能得到线粒体基因组完成序列。
线粒体基因组DNA检测试剂盒，包括核酸外切酶III(Exonuclease III)或Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶，以及反应缓冲液；
实施例1
1)取10mg拟南芥新鲜样本，利用基因组试剂盒或者液氮研磨，氯仿去除蛋白，异丙醇沉淀的方法提取总基因组DNA，加水溶解。
2)取2ug的总DNA，加1微升Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶,2微升10*buffer，0.8微升10毫摩尔ATP，加水补足到20微升体系，37度，反应1-3小时。
3)在反应体系中加入30微升超纯水，加40微升AMP XP磁珠，混匀，吸附没有被降解的DNA，用70％的酒精洗两次，晾干3分钟，加20微升超纯水溶解DNA。
4)取100ng经过Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶处理的DNA，利用Ion PGMTMTemplate OT2 200Kit构建200bp文库，用Ion Torrent个人化操作基因组测序仪(PGMTM)检测DNA序列，得到9M数据。
5)利用clc genomics workbench分析软件，去除低质量序列，拼接结果可以看到拟南芥线粒体基因组被覆盖了1.15倍。
实施例2
1)取10mg猪肉冰冻样本，利用液氮研磨，氯仿去除蛋白，异丙醇沉淀DNA的方法提取总基因组DNA，加水溶解。
2)取1ug的总DNA，加1微升Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶,2微升10*buffer，0.8微升10毫摩尔ATP，加水补足到20微升体系，37度，过夜反应12小时。
3)在反应体系中加入30微升超纯水，加40微升AMP XP磁珠，混匀，吸附没有被降解的DNA，用70％的酒精洗两次，晾干3分钟，加20微升超纯水溶解DNA。
4)利用Ion PGMTMTemplate OT2 200Kit构建200bp文库，用Ion Torrent个人化操作基因组测序仪(PGMTM)检测DNA序列，得到17M数据。
5)利用clc genomics workbench分析软件，去除低质量序列，拼接结果可以看到猪线粒体基因组被覆盖了10倍。
实施例3
1)高速离心10毫升取酵母过夜培养液，弃上清，用液氮研磨，异丙醇沉淀的方法提取总基因组DNA，加水溶解。
2)取3ug的总DNA，加3微升Exonuclease III酶,2微升10*buffer，加水补足到20微升体系，37度，反应0.5小时。
3)在反应体系中加入30微升超纯水，加40微升AMP XP磁珠，混匀，吸附没有被降解的DNA，用70％的酒精洗两次，晾干3分钟，加20微升超纯水溶解DNA。
4)取100ng经过Exonuclease III酶处理的DNA，利用Ion PGMTMTemplate OT2200Kit构建200bp文库，用Ion Torrent个人化操作基因组测序仪(PGMTM)检测DNA序列，得到7.5M数据。
5)利用clc genomics workbench分析软件，去除低质量序列，拼接结果可以看到拟南芥线粒体基因组被覆盖了0.73倍。
实施案例4
1)取3ml新鲜静脉血，用血液基因组提取试剂盒提取总基因组DNA，加水溶解。
2)取2ug的总DNA，加1微升Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶,2微升10*buffer，0.8微升10毫摩尔ATP，加水补足到20微升体系，37度，反应3小时。
3)在反应体系中加入30微升超纯水，加40微升AMP XP磁珠，混匀，吸附没有被降解的DNA，用70％的酒精洗两次，晾干3分钟，加20微升超纯水溶解DNA。
4)取50ng经过Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶处理的DNA，利用TruePrepDNA Library Prep Kit v2试剂盒构建300bp文库，用Illmina测序仪检测DNA序列，得到500M数据。
5)利用clc genomics workbench分析软件，去除低质量序列，拼接结果可以看到人线粒体基因组被覆盖了64倍。
6)可以通过与已知的参考序列比对，查找确认突变位点。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.线粒体基因组DNA快速分离、测序新方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤(1)、提取生物组织样品或血液样品总DNA；
步骤(2)、分离富集线粒体DNA：
将步骤(1)提取的基因组DNA,加入核酸外切酶III，以及相应的反应缓冲液，37℃，0.5-16小时,磁珠回收纯化DNA；
步骤(1)提取的基因组DNA与核酸外切酶III的质量体积比为(1-3)ug：(1-3)ul；
步骤(3)、线粒体基因组DNA测序：
取步骤(2)中分离的(0.001-1)ug线粒体DNA，构建200bp短片段文库，或者取步骤(2)中分离的(1-3)ug线粒体DNA，构建3kb mate-pair文库；用高通量测序仪，得到100M以上的数据，拼接后得到线粒体基因组完成序列。
2.线粒体基因组DNA快速分离、测序新方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤(1)、提取生物组织样品或血液样品总DNA；
步骤(2)、分离富集线粒体DNA：
将步骤(1)提取的基因组DNA,加入Plasmid-Safe ATP-Dependent
DNase酶，以及相应的反应缓冲液，37℃，0.5-16小时,磁珠回收纯化DNA；
步骤(1)提取的基因组DNA与Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶的质量体积比为(1-3)ug：(1-3)ul；
步骤(3)、线粒体基因组DNA测序：
取步骤(2)中分离的(0.001-1)ug线粒体DNA，构建200bp短片段文库，或者取步骤(2)中分离的(1-3)ug线粒体DNA，构建3kb mate-pair文库；用高通量测序仪，得到100M以上的数据，拼接后得到线粒体基因组完成序列。
3.线粒体基因组DNA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括核酸外切酶III，以及反应缓冲液。
4.线粒体基因组DNA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase酶，以及反应缓冲液。
CN201711256028.1A 2017-12-03 2017-12-03 线粒体基因组dna快速分离、测序新方法及试剂盒 Pending CN107881225A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711256028.1A CN107881225A (zh) 2017-12-03 2017-12-03 线粒体基因组dna快速分离、测序新方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711256028.1A CN107881225A (zh) 2017-12-03 2017-12-03 线粒体基因组dna快速分离、测序新方法及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107881225A true CN107881225A (zh) 2018-04-06

Family

ID=61772819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711256028.1A Pending CN107881225A (zh) 2017-12-03 2017-12-03 线粒体基因组dna快速分离、测序新方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107881225A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019081813A1 (en) * 2017-10-24 2019-05-02 Oulun Yliopisto METHODS FOR PREPARING RNA PROBES FOR EXOME SEQUENCING AND ORGANIC DNA DEPLOYMENT
CN111172260A (zh) * 2020-03-17 2020-05-19 安吉康尔（深圳）科技有限公司 检测人尿液或血液样本中的线粒体基因组的方法及试剂盒
CN111235249A (zh) * 2020-03-26 2020-06-05 同济大学 一种检测线粒体基因组开放状态的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102417903A (zh) * 2011-10-09 2012-04-18 温州医学院 一种人类线粒体dna纯化方法
WO2014071178A1 (en) * 2012-11-05 2014-05-08 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Method of isolating pure mitochondrial dna

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102417903A (zh) * 2011-10-09 2012-04-18 温州医学院 一种人类线粒体dna纯化方法
WO2014071178A1 (en) * 2012-11-05 2014-05-08 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Method of isolating pure mitochondrial dna

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019081813A1 (en) * 2017-10-24 2019-05-02 Oulun Yliopisto METHODS FOR PREPARING RNA PROBES FOR EXOME SEQUENCING AND ORGANIC DNA DEPLOYMENT
CN111172260A (zh) * 2020-03-17 2020-05-19 安吉康尔（深圳）科技有限公司 检测人尿液或血液样本中的线粒体基因组的方法及试剂盒
CN111235249A (zh) * 2020-03-26 2020-06-05 同济大学 一种检测线粒体基因组开放状态的方法
CN111235249B (zh) * 2020-03-26 2022-10-11 同济大学 一种检测线粒体基因组开放状态的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3636769B1 (en) Sample nucleic acid measurement test kit, reagent, and application thereof
CN107043766A (zh) 一种即用型的核酸磁珠提取试剂
CN104988149A (zh) 人类cyp2c19基因多态性检测特异性引物和试剂盒
CN107557450A (zh) 一种快速构建高通量测序文库的试剂及方法及其应用
CN107881225A (zh) 线粒体基因组dna快速分离、测序新方法及试剂盒
US9862988B2 (en) Methods and kits for breaking emulsions
KR20130098163A (ko) Ｒｎａ 추출용 용액
CN108165617A (zh) 叶绿体基因组dna分离、测序新方法、试剂盒及其应用
CN101586162B (zh) 一种提取靶核酸并进行pcr扩增检测的方法
CN113604540B (zh) 一种利用血液循环肿瘤dna快速构建rrbs测序文库的方法
CN105986039A (zh) 乙型肝炎病毒的耐药突变位点和基因型检测试剂盒及其使用方法和应用
CN112538537A (zh) 检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控lamp芯片及检测方法
Gautam Isolation of DNA from blood samples by salting method
CN117187251B (zh) 五甲基四氢叶酸的核酸适配体及其在畜产品检测中的应用
CN114134220A (zh) 一种可以用于血液检测的pcr反应液及其试剂盒
CN107034287A (zh) 用于异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见SNPs的Sanger测序法
CN109536624B (zh) 用于甄别半滑舌鳎真伪雄鱼性的荧光分子标记和检测方法
CN113550013B (zh) 一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建rrbs测序文库的方法
CN108715887A (zh) 用于荧光pcr检测的dna快速提取方法和亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的检测方法
CN111154836A (zh) 靶向核酸捕获和检测方法
WO2013040060A2 (en) Nucleic acids for multiplex detection of hepatitis c virus
CN114187968A (zh) 基于ngs技术的无菌检测方法
CN101220390B (zh) 一种快速提取植物样本dna的方法
CN102344970B (zh) 同时检测人cmv和bk病毒dna的引物序列及定量检测试剂盒
US20100209972A1 (en) Method for synthesis of single- or double-stranded dna, and kit for the synthesis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination