CN114134220A

CN114134220A - 一种可以用于血液检测的pcr反应液及其试剂盒

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Publication number: CN114134220A
Application number: CN202210113295.8A
Authority: CN
Inventors: 牟新涛; 刘婉君; 韩典霖; 杨亮
Original assignee: Genfine Biotech Beijing Co ltd
Current assignee: Genfine Biotech Beijing Co ltd
Priority date: 2022-01-30
Filing date: 2022-01-30
Publication date: 2022-03-04

Abstract

本发明公开了一种用于血液直接扩增的PCR反应液，包括Taq DNA聚合酶、缓冲体系、二价阳离子、一价阳离子、dNTPs、PCR反应增强剂和PCR体系稳定剂；所述的Taq DNA聚合酶是抗体修饰的热启动DNA聚合酶、Taq DNA Polymerase中的一种或者两种混合。本发明提供的PCR反应液可以以全血为模板进行扩增，也可以在血液存在的情况下，扩增其它靶基因，最高可以耐受40%血液。

Description

一种可以用于血液检测的PCR反应液及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体一种可以血液为模板直接进行PCR检测的反应液及其试剂盒。

背景技术

聚合酶链反应(PCR)是一种敏感的DNA扩增程序，可以从复杂混合物中检测特定的核酸。反应体系中包含核酸模板，特异性引物、DNA聚合酶及相应的缓冲体系及离子。在核酸扩增过程中，目的基因、引物和聚合酶混合物在不同的温度下经受连续热循环过程（25～35），扩增新的互补目标序列。自20世纪80年代中期以来，PCR已成为检测微量核酸的标准。

对于临床诊断和法医检测来说，样本中的抑制物是造成PCR反应中假阴性和低灵敏度的主要问题。

做为临床上非常重要的血液样本PCR的分析，与人类健康相关的遗传疾病诊断测试中最大的一部分疾病、病毒和微生物感染、血型和安全血库有非常大的相关性。

血液对PCR的抑制作用尚未明确，部分研究表明抑制扩增的主要原因是DNA聚合酶的失活和/或者捕获或降解目标DNA和原分子。人血液中PCR的几种主要抑制剂如血红蛋白、免疫球蛋白G和乳铁蛋白另外血液蛋白酶活性也可能导致PCR效率的降低(5,9–12)。外源性的抗凝剂包括EDTA、肝素等，对PCR扩增也有一定的抑制作用。

除了上述物质可以抑制PCR反应外，在全血样本的特异性检测中，通常会有其它的非特异扩增，与靶基因共同竞争导致目的基因产物不纯或者无法扩增。

为了降低血液成分对PCR的抑制作用，人们开发了多种DNA提取方法。这些预处理步骤通常是耗时、劳动密集型和样本特异性的。此外，即使在提取DNA时使用试剂盒，一些PCR抑制剂可能仍然无法完全消除。例如，乙肝病毒检测使用血液DNA纯化试剂盒约有14%的人可能是假阴性。

目前广泛使用的DNA聚合酶，如Taq DNA Polymerase和热启动型Taq Gold，都可以使用低于0.2%的浓度全血进行PCR扩增。一些非Taq DNA聚合酶，如rTth，Tfl，HotTub和Pwo，能耐受较高浓度的血液。部分Taq突变体，如KT10，T36等可以耐受10-20%血液。通过研究发现一些试剂加入体系后会降低血液对Taq酶的抑制，使Taq酶可以在含2%血液体系中进行扩增，但是这种效果同样具有样本特异性。这些试剂包括，甜菜碱、单链结合蛋白、或者某些蛋白的混合物。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种全新的可用于血液直扩的PCR反应液（Mix2），其最高可以耐受40%血液。本试剂的发明将有利于利用PCR技术对全血样本进行分析检测并克服现有PCR技术存在的上述缺点。

本发明所提供的PCR反应液，包括Taq DNA聚合酶、缓冲体系、二价阳离子、一价阳离子、dNTPs、PCR反应增强剂和PCR体系稳定剂。

其中，所述的Taq DNA聚合酶是抗体修饰的热启动DNA聚合酶、Taq DNAPolymerase中的一种或者两种混合。

进一步的，所述抗体修饰的热启动DNA聚合酶可选自济凡生物科技（北京）有限公司出售的下述至少一种：A110、A112和A113。

所述A110：GenFQ II Hot Start Taq DNA Polymerase（商品目录号为A110-01或A110-02）；

所述A112：GenFQ Hot Start Taq DNA Polymerase（商品目录号为A112-1或A112-2）；

所述A113：GenFQ III Hot Start Taq DNA Polymerase（商品目录号为A113-1或A113-2）。

所述Taq DNA聚合酶可为济凡生物科技（北京）有限公司的产品GenFQ Taq DNAPolymerase，商品目录号为A111-01或A111-02。

根据本发明的一个实施例，所述的Taq DNA聚合酶可为A110或A111或A113或，A112和A110的混合物(酶活比1:1)，或A110和A113的混合物(酶活比1:1)。

所述的缓冲体系可以是Tris-HCl缓冲液。

所述的二价阳离子可以是Mg²⁺、Mn²⁺中的一种或者两种混合。具体的，所述Mg²⁺可由MgCl₂提供；所述Mn²⁺可由MnCl₂提供。

所述的一价阳离子可以是K⁺、NH4⁺、Na⁺、Li⁺中的一种或者几种混合。

所述的dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP；具体的，所述dNTPs中，dATP、dCTP、dGTP、dTTP的摩尔比可为0.3mM：0.3mM：0.3mM：0.3mM。

所述的PCR反应增强剂可以是甜菜碱、海藻糖、二甲亚砜（DMSO）、明胶、甘油、SSB（单链结合蛋白）、sso7d蛋白、牛血清白蛋白(BSA)中的一种或者几种混合。

10 ×所述PCR反应增强剂，包括下述终浓度的物质：甜菜碱1～5M、DMSO 0.5～4%（v/v%）、明胶0.05～1%（w/w%）、ET SSB （极高热稳定性单链 DNA结合蛋白）0.01～1%（w/w%），溶剂为水。

根据本发明的一个实施例，所述10 ×PCR反应增强剂，包括下述终浓度的物质：甜菜碱3M、DMSO 3%（v/v%）、明胶0.5%（w/w%）、ET SSB 0.5%（w/w%）。

所述的PCR体系稳定剂可以是PEG2000、PEG6000、Tween20、 NP40、Triton X-100、山梨醇中的一种或几种。

进一步的， 2×PCR反应液，包括下述浓度的物质：Taq DNA聚合酶0.02-0.2U/ul 、Tris-HCl（pH8.3-9.0）60～400mM、dNTPs 0.2～2mM、MgCl₂ 4～20mM、KCl 20～200M、(NH4)₂SO₄10 ～80mM、10 ×PCR反应增强剂2%～20%（v/v%）和PCR体系稳定剂0.01%～5%（w/w%）。

本发明中所述2 × PCR反应液中的溶剂为水，更进一步可为双蒸水（ddH₂O）。

根据本发明的一个实施例，所述2×PCR反应液，包括下述终浓度的物质：Tris-HCl（pH9.0）150mM、(NH4)₂SO₄8mM、MgCl₂4mM、10% Tween 20 0.01%（v/v%）、dNTPs 0.4mM、KCl120mM、10X enhancer 20%（v/v%）、A111 0.1U/μl，溶剂为dd H₂O。

根据本发明的一个实施例，所述2×PCR反应液，包括下述终浓度的物质：Tris-HCl（pH8.5）300mM、(NH4)₂SO₄20mM、MgCl₂6mM、10% Tween 20 0.01%（v/v%）、dNTPs 0.6mM、KCl100mM、10X enhancer 20%（v/v%）、A112&A110(酶活比1:1) 0.1U/μl，溶剂为dd H₂O。

根据本发明的一个实施例，所述2×PCR反应液，包括下述终浓度的物质：Tris-HCl（pH8.5）200mM、(NH4)₂SO₄30mM、MgCl₂6mM、10% Tween 20 0.01%（v/v%）、dNTPs 0.6mM、10Xenhancer 20%（v/v%）、A113 0.1U/μl，溶剂为dd H₂O。

根据本发明的一个实施例，所述2×PCR反应液，包括下述终浓度的物质：Tris-HCl（pH8.5）200mM、(NH4)₂SO₄30mM、MgCl₂6mM、10% Tween 20 0.01%（v/v%）、dNTPs 0.6mM、10Xenhancer 20%（v/v%）、A110&A113(酶活比1:1)0.1U/μl，PEG6000 1%（w/w%）；溶剂为dd H₂O。

根据本发明的一个实施例，所述2×PCR反应液，包括下述终浓度的物质：Tris-HCl（pH8.5）150mM、(NH4)₂SO₄30mM、MgCl₂6mM、10% Tween 20 0.01%（v/v%）、dNTPs 0.6mM、10Xenhancer 20%（v/v%）、A110 0.1U/μl、PEG6000 1%（w/w%）、山梨醇60mM；溶剂为dd H₂O。

用于测试本发明提供的PCR反应液对血液耐受度的引物是基于人和猪基因组进行的设计，片段长度从300bp-3kb。

具体的，针对人基因组序列设计了10对引物，片段长度300bp-3kb；

针对猪基因组序列设计了10对引物，片段长度300bp-2kb。

用于测试上述PCR反应液的血液可为猪血或人血，在PCR反应体系中血液的体积含量可为10%～40%。

本发明另一个目的是提供上述PCR反应液在血液样本扩增中的应用。

根据本发明的实施例，所述血液样本可为人血或猪血。

本发明再一个目的是提供一种扩增血液样本的方法。

本发明所提供的扩增血液样本的方法，包括使用上述的PCR反应液以血液为模板直接进行PCR反应，以获得经过扩增的血液样本。

所述PCR反应的反应体系中，血液的体积含量可为0.08%～40%；具体可为10%～40%。

进一步的，所述PCR反应的反应体系中，PCR反应液的体积含量可为60%～99.2%。

所述PCR反应的反应体系中还包括引物，所述引物的浓度可为0.2μM～1μM。

所述PCR反应的条件具体如下：

本发明还保护一种可以用于血液检测的试剂盒。

本发明所提供的用于血液检测的试剂盒，其包括上述的可用于血液直扩的PCR反应液。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明采用经过分子进化后的突变体Taq中的一种或几种，搭配优化的PCR反应体系和独特的PCR增强剂，可以在体系血液含量达到30～40%时，依然可以有效扩增。现有技术可以达到10～20%。

附图说明

图1为采用5个PCR反应液扩增不同血液的电泳检测图（猪：1.1kb）；其中，10%、20%、30%、40%均指PCR反应体系中血液的体积分数。

图2为采用4个PCR反应液扩增不同血液的电泳检测图（猪：334kb）；其中，10%、20%、30%、40%均指PCR反应体系中血液的体积分数。

图3为采用4个PCR反应液扩增不同血液的电泳检测图（猪：2 kb）；其中，10%、20%、30%、40%均指PCR反应体系中血液的体积分数。

图4为采用4个PCR反应液扩增不同血液的电泳检测图（人：1kb）；其中，10%、20%、30%、40%均指PCR反应体系中血液的体积分数。

图5为采用4个PCR反应液扩增不同血液的电泳检测图（人：3kb）；其中，10%、20%、30%、40%均指PCR反应体系中血液的体积分数。

图6为Mix2与诺唯赞PD103、全式金AD401扩增不同血液电泳检测图（人：1kb）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

下述实施例中猪：1.1kb、猪：334kb、猪：2 kb、人：1kb、人：3kb，引物序列见下表：

下述实施例中dNTPs由dATP、dCTP、dGTP和dTTP组成，其中，dATP、dCTP、dGTP、dTTP的摩尔比为0.3mM：0.3mM：0.3mM：0.3mM。

下述实施例中使用的A110、A111、A112、A113均购自济凡生物科技（北京）有限公司；

A110：GenFQ II Hot Start Taq DNA Polymerase（商品目录号为A110-01或A110-02）；

A111：GenFQ Taq DNA Polymerase（商品目录号为A111-01或A111-02）；

A112：GenFQ Hot Start Taq DNA Polymerase（商品目录号为A112-1或A112-2）；

A113：GenFQ III Hot Start Taq DNA Polymerase（商品目录号为A113-1或A113-2）

下述实施例中使用的10X enhancer由下述终浓度的物质组成：甜菜碱3M、DMSO 3%（v/v%）、明胶0.5%（w/w%）、ET SSB 0.5%（w/w%），溶剂为水。

下述对比例中使用的诺唯赞PD103，商品名为：Blood Direct PCR Kit V2，货号：PD103-01；

全式金AD401，商品名为：TransDirect® Blood PCR Kit，目录号AD401-01。

实施例1、

2X PCR反应液配制：

PCR扩增条件：

各PCR扩增体系下的电泳检测图结果如图1-5所示。

由图1可知，在以猪血作为模板时，以1.1kb-F和1.1kb-R为引物，扩增长度为1.1kb片段时，Mix4和Mix5在≤40%血液范围内可以有效扩增，Mix1只能在≤20%范围内有效扩增，Mix2和Mix3在≤30%血液范围内可以有效扩增。

由图2可知，在以猪血作为模板时，以334-F和334-F为引物，扩增长度为334kb片段时，除Mix1外，其它几个Mix在≤40%血液范围内可以有效扩增，Mix1只能在≤30%范围内有效扩增。

由图3可知，在以猪血作为模板时，以2kb-F和2kb-R为引物，扩增长度为2kb片段时，Mix2和Mix4在≤30%血液范围内可以有效扩增，其它几个Mix只能在≤20%范围内有效扩增。

由图4可知，在以人血作为模板时，以1kb-F和1kb-R为引物，扩增长度为1kb片段时，Mix2在≤40%血液范围内可以有效扩增，其它几个Mix只能在≤20%范围内有效扩增。

由图5可知，在以人血作为模板时，以3kb-F和3kb-R为引物，扩增长度为3kb片段时，Mix2在≤40%血液范围内可以有效扩增，其它几个Mix只能在≤20%范围内有效扩增。

由以上实施例可知，本发明提供了一种可以PCR反应液，可以以全血为模板进行扩增，也可以在血液存在的情况下，扩增其它靶基因，最高可以耐受40%血液。

本发明利用济凡公司的酶和试剂设计了5个PCR反应液用于测试，通过对比显示

对于猪血而言，MIX4性能最佳；对人血而言，MIX2性能最佳；其它Mix 对血液的耐受程度有差异。

对比例1、采用诺唯赞PD103或全式金AD401以人血作为模板的扩增实验

将实施例1中的Mix2与诺唯赞PD103、全式金AD401，以人血作为模板，以1kb-F和1kb-R为引物，扩增长度为1kb片段，结果见图6。

由图6可知，在以人血作为模板，扩增长度为1kb片段时，Mix2在≤40%血液范围内可以有效扩增，诺唯赞PD103可以≤20%血液里有效扩增，全式金AD401只在能在≤10%血液有效扩增。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 济凡生物科技（北京）有限公司

<120>一种可以用于血液检测的PCR反应液及其试剂盒

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atcggatgat gacacggacg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

aggggtagaa gcggatgagt 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atacgactag cctactcctc ctc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

tactgatcag acaaacaggg gtg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

aaaccccgat agaccttacc aac 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

ttctcttgtc ctttcgtact ggg 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

cagccagaga gaaaggtcgg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

ataggtgtgg tgtggtgctg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

ggaaggggct caacgaagaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

gtgtggaact gctgaagggt 20

Claims

1.一种用于血液直接扩增的PCR反应液，包括Taq DNA聚合酶、缓冲体系、二价阳离子、一价阳离子、dNTPs、PCR 反应增强剂和PCR体系稳定剂；

2×所述PCR反应液，包括下述终浓度的物质：Tris-HCl缓冲液300mM、(NH4)₂SO₄20mM、MgCl₂6mM、Tween 20溶液（10%） 0.01%（v/v%）、dNTPs 0.6mM、KCl 100mM、10×PCR反应增强剂 20%（v/v%）、A112和A110 0.1U/μl，溶剂为dd H₂O；其中，Tris-HCl的pH值为8.5，所述A112和A110的酶活比为1:1；

所述的dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP；其中，dATP、dCTP、dGTP、dTTP的摩尔比为1：1：1：1；

所述的10×PCR反应增强剂，由下述终浓度的物质组成：甜菜碱3M、DMSO 3%（v/v%）、明胶0.5%（w/w%）、ET SSB 0.5%（w/w%），溶剂为水；

所述的A110：为济凡生物科技（北京）有限公司的产品GenFQ II Hot Start Taq DNAPolymerase，商品目录号为A110-01或A110-02；

所述的A112：为济凡生物科技（北京）有限公司的产品GenFQ Hot Start Taq DNAPolymerase，商品目录号为A112-1或A112-2。

2.一种用于血液直接扩增的试剂盒，其包括权利要求1所述的PCR反应液。

3.权利要求1所述的PCR反应液或权利要求2所述的试剂盒在血液样本扩增中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述血液样本为人血或猪血。

5.一种扩增血液样本的方法，包括使用权利要求1所述的PCR反应液以血液为模板直接进行PCR反应，以获得经过扩增的血液样本。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR反应的反应体系中，血液的体积含量为0.08%～40%；

所述PCR反应的反应体系中，PCR反应液的体积含量为60%～99.2%。