CN111662386A

CN111662386A - Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，包含其的聚合酶反应体系，及其应用

Info

Publication number: CN111662386A
Application number: CN202010542947.0A
Authority: CN
Inventors: 曹洋; 李行; 宋新文; 张帅; 耿亮; 马静; 辛文
Original assignee: BEIJING TRANSGEN BIOTECH CO LTD
Current assignee: Beijing quanshijin Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2040-06-15
Also published as: CN111662386B

Abstract

本发明公开了Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，包含其的聚合酶反应体系，及其应用。本发明首先公开了Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，该组合包括单克隆抗体4A8和单克隆抗体5H6。本发明进一步公开了上述抗体组合在降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增和/或保证Taq DNA聚合酶的热稳定性中的应用及包含上述组合的反应体系及试剂盒。本发明上述抗体组合及优化的反应液在低温度条件下能够充分封闭Taq DNA聚合酶的活性区域，有效降低非特异性扩增并保证酶的热稳定性，在扩增的循环数更高的条件下仍可有效维持酶活性的持久性。

Description

Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，包含其的聚合酶反应体系，及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，包含其的聚合酶反应体系，及其应用。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术被广泛应用于分子生物学实验中，在体外几小时就可以将1个DNA分子扩增10⁹倍。PCR技术类似于双链DNA的天然复制过程，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。DNA聚合酶是实现DNA复制的关键。

Taq DNA聚合酶是一种从水生栖热菌(Thermus aquatcus)YT-1中分离得到的耐热的DNA聚合酶。PCR技术具有特异性强、灵敏度高、快速、简便及重复性好等特点。但是，这些耐热的DNA聚合酶在低温条件下，仍有一定聚合酶活性，当引物3’端少数几个碱基与非扩增目标区的模板DNA序列发生配对时，很容易产生非特异性的扩增以及产生引物二聚体。目前，可以通过很多途径来提高Taq DNA聚合酶的最适反应温度，达到热启动的目的，如通过物理隔绝法、化学修饰法、设计特殊的引物或者用基因工程的方法对酶进行突变和改造。

对Taq DNA聚合酶进行改造是一种常用的方法，例如用基因工程的方法去除TaqDNA聚合酶N端278个氨基酸，并且进行E626K和I707L突变，使得酶的最适工作温度升高，提高了PCR反应的特异性，减少了非特异性的扩增。但是此方法对于酶的长期稳定性提升有限(Milko B.Kermekchiev,Anatoly Tzekov and Wayne M.Barnes.Cold-sensitive mutantsof Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR[J].Nucleic Acids Research,2003,31(21):6139-6147.)。

对Taq DNA聚合酶进行化学修饰而得到的AmpliTaq Gold和Hotstart Taq这两种酶，虽然可以降低PCR过程中的非特异性扩增，但这两种酶的激活需要经过95℃孵育5至15分钟且反应的最适pH需小于等于8.3，这样容易导致DNA的脱嘌呤和断裂，影响了酶的长期稳定性和保真性(Cheng,S.,Fodder,C.,Bames,W.M.and Higuchi,R.Effectiveamplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA[J].Proe.Natl Acad·Sci.,1994,91:5695-5699.Barnes,W.M.Tips and tricks for longand accurate PCR[J].Trends Biochem·Sci,1994,19:342.)。

利用Taq DNA聚合酶抗体或者抑制剂对酶活性区域进行封闭是比较有效的一种降低低温非特异扩增的方法。利用抑制剂的封闭方法应用并不广泛，包括核酸复合体、蛋白、小分子化合物等，但是这些抑制剂与酶的结合并不完全契合，稳定性不高，难以达到低温抑制聚合酶活性，高温分解，不再抑制聚合酶活性的理想效果(De Franchis R,Cross NC,Foulkes NS and Cox TM.A potent inhibitor of Taq polymerase copurifies withhuman genomic DNA[J].Nucleic Acids Res.1988,16(21):10355.Bélec L,Authier J,Eliezer-Vanerot MC,Piédouillet C,Mohamed AS and Gherardi RK.Myoglobin as apolymerase chain reaction(PCR)inhibitor:a limitation for PCR from skeletalmuscle tissue avoided by the use of Thermus thermophilus polymerase[J].MuscleNerve.1998,21(8):1064-7.Mizushina Y1,Sugiyama Y,Yoshida H,Hanashima S,Yamazaki T,Kamisuki S,Ohta K,Takemura M,Yamaguchi T,Matsukage A,Yoshida S,Saneyoshi M,Sugawara F and Sakagauchi K.Galactosyldiacylglycerol,a mammalianDNA polymerase alpha-specific inhibitor from a sea alga,Petaloniabingbamiae.Biol Pharm Bull.2001,24(9):982-7.)

而利用抗体作为封闭剂可以与活性位点结合紧密，封闭效果较好，在低温条件下抗体结合能力稳定，高温条件抗体失活，Taq DNA聚合酶活性基团暴露，起到了良好的热启动的作用。有文献报道用Taq DNA聚合酶免疫实验动物获得抗Taq DNA聚合酶的单抗或者多抗(Scalice,E.R.,Sharkey,D.J.and Daiss,J.L.Monoclonal antibodies preparedagainst the DNA polymerase from Thermus aquaticus are potent inhibitors ofenzyme activity[J].Immunol.Methods,1994,172:147-163.Kellogg,D.E,Rybalkin,I.,Chen,S.,Mukhamedova,N.,Vlasik,T.,Siebert,P.D.and Chenchik,A.TaqStartantibody：‘hot start’PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibodydirected against Taq DNA polymerase[J].Biotechniques,1994,16:1134-1137.Sharkey,D.J Scalice,E.R.,Christy,K.G,Atwood,S,M,and Daiss,J.L.Antibodiesas thermolabile switches:high temperature triggering for the polymerase chainreaction[J]Biotechnology,1994,12:506-509.)。在反应中，低温下酶与抗体形成抗原抗体复合物，使得聚合酶暂时失活。在较高温度下时，抗体变性，使得Taq DNA聚合酶得以释放发挥活性，实现热启动PCR扩增。

然而由于抗体筛选耗时耗力，难以筛选得到效果最佳的抗体，尽管可以在一定程度上降低非特异性扩增，但是由于体系内增加了抗体后，会造成聚合酶活性下降，酶长期稳定性受到影响，整体扩增能力下降，产物减少等问题。因此需要开发一种新型抗体封闭系统，最大程度降低Taq DNA聚合酶非特异性扩增、保证聚合酶长期热稳定性。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合及其在降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增和/或保证Taq DNA聚合酶的热稳定性中的应用。

本发明的第二个目的在于提供包含上述Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合的反应体系及其在DNA扩增中的应用。

本发明的第三个目的在于提供包含上述Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合的试剂盒及其在DNA扩增中的应用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

第一方面，本发明提供一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，包括单克隆抗体4A8和单克隆抗体5H6；

所述单克隆抗体4A8含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.1第26-35位、SEQ ID NO.1第51-58位和SEQ ID NO.1第99-109位所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别为SEQ ID NO.2第24-40位、SEQ ID NO.2第54-60位和SEQ ID NO.2第93-101位所示；

所述单克隆抗体5H6含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.3第26-35位、SEQ ID NO.3第51-58位和SEQ ID NO.3第99-107位所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别为SEQ ID NO.4第24-39位、SEQ ID NO.4第53-59位和SEQ ID NO.4第92-100位所示。

可选的，所述单克隆抗体4A8的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述单克隆抗体5H6的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

可选的，所述单克隆抗体4A8由保藏号为CGMCC No.19191的鼠抗EasyTaq DNA聚合酶单克隆抗体细胞株4A8产生；

所述单克隆抗体5H6是由保藏号为CGMCC No.19192的鼠抗EasyTaq DNA聚合酶单克隆抗体细胞株5H6产生。

第二方面，本发明提供上述Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合在降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增和/或保证Taq DNA聚合酶的热稳定性中的应用。

第三方面，本发明提供了一种反应体系，所述反应体系包括上述Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合和Taq DNA聚合酶。

可选地，所述反应体系中单克隆抗体5H6、单克隆抗体4A8和Taq DNA聚合酶的摩尔比为(1.0-1.5)：(1.0-1.5)：1。

可选的，所述反应体系中单克隆抗体5H6、单克隆抗体4A8和Taq DNA聚合酶的摩尔比为1.0-1.5：1.5：1；更优选的，所述反应体系中单克隆抗体5H6、单克隆抗体4A8和Taq DNA聚合酶的摩尔比为1.5：1.5：1或1.0：1.5：1。

第四方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合、Taq DNA聚合酶和反应液。

可选的，所述反应液为几何配位离子缓冲系统反应液1，几何配位离子缓冲系统反应液2或几何配位离子缓冲系统反应液3，

所述几何配位离子缓冲系统反应液1包括如下各组分：30mM Tris-SO₄，32mMK₂SO₄，5mM CoCl₂，5mM MnCl₄，4mM(NH₄)₂SO₄，3mM MgSO₄；pH8.8，溶剂为水；

所述几何配位离子缓冲系统反应液2包括如下各组分：30mM Tricine-KOH，50mMKCl，5mM CoCl₂，7.5mM MnCl₄，8mM(NH₄)₂SO₄，3mM MgCl₂；pH8.6，溶剂为水；

所述几何配位离子缓冲系统反应液3包括如下各组分：30mM Tris-HCl，40mM KCl，5mM CoCl₂，4mM(NH₄)₂SO₄，2.5mM MgCl₂；pH8.3，溶剂为水。

优选的，所述反应液为几何配位离子缓冲系统反应液1或几何配位离子缓冲系统反应液2；最优选的，所述反应液为几何配位离子缓冲系统反应液1。

第五方面，本发明提供了上述反应体系和试剂盒在DNA扩增中的应用。

在本发明中，所述Taq DNA聚合酶为EasyTaq DNA聚合酶，具体为TransGen公司的货号为AP111的EasyTaq DNA聚合酶(EasyTaq DNA Polymerase)。

本发明的有益效果如下：

本发明利用单克隆抗体4A8和单克隆抗体5H6组成的Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合及优化的几何配位离子缓冲系统反应液在低温度条件下能够充分封闭Taq DNA聚合酶的活性区域，有效降低非特异性扩增，随着温度升高，聚合酶活性位点逐渐暴露，在酶最佳的退火及延伸条件下，可以与Taq DNA聚合酶完全分离，使酶活性达到最大，这一逐渐释放的过程可以有效保护Taq DNA聚合酶活性，在有效降低非特异扩增的基础上，还能够在变性过程中，逐步释放Taq DNA聚合酶，使高温对酶活性的影响更低，保证了酶的热稳定性，在扩增的循环数更高(达到45个循环)的条件下仍可有效维持酶活性的持久性。

保藏说明

参据的生物材料(株)：4A8

建议的分类命名：鼠抗EasyTaq DNA聚合酶单克隆抗体细胞株

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年12月6日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.19191

参据的生物材料(株)：5H6

建议的分类命名：鼠抗EasyTaq DNA聚合酶单克隆抗体细胞株

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年12月6日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.19192

参据的生物材料(株)：9B7

建议的分类命名：鼠抗EasyTaq DNA聚合酶单克隆抗体细胞株

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年12月17日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18882

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出分子信标实验原理。

图2示出单克隆抗体封闭EasyTaq DNA聚合酶扩增效果。

图3示出EasyTaq DNA聚合酶单克隆抗体蛋白纯化结果。

图4示出ELISA方法测定单克隆抗体与EasyTaq DNA聚合酶结合效价。

图5示出单克隆抗体对EasyTaq DNA聚合酶封闭效果测试。

图6示出单克隆抗体组合对EasyTaq DNA聚合酶封闭效果测试。

图7示出优选的单克隆抗体组合在不同几何配位离子缓冲系统中对于封闭效果的影响。

图8示出利用优选的体系进行EasyTaq DNA聚合酶活性稳定测试。

具体实施方式

为使本发明的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明涉及的试剂或试剂盒及其来源如下：

弗氏完全佐剂Freund's Adjuvant,Complete(货号为F5881)、弗氏不完全佐剂Freund's Adjuvant,Incomplete(货号为F5506)、HAT Media Supplement(50×)(货号为H0262)、HT Media Supplement(50×)(货号为H0137)、Polyethylene glycol solution(货号为P7181)均购自于sigma公司。

抗体亚型检测试剂盒Mouse Isotyping Kit(货号为ISO-M8a-20)购自于Antagen公司。

EasyTaq DNA聚合酶(EasyTaq DNA Polymerase)(货号为AP111)，PBS(1×)(货号为FG701)，TransSerum EQ Fetal Bovine Serum(货号为FS201)，DMEM(货号为FI101)，Penicillin-Streptomycin(100×)(货号为FG101)，ProteinFind Goat Anti-Mouse IgG(H+L)HRP Conjugate(货号为HS201)，Easy II Protein Quantitative Kit(BCA)(货号为DQ111)，TMB ELISA Substrate(货号为HE101)，ProteinIso Protein G Resin(货号为DP401)，2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix(货号为AS231)，TransZol Up PlusRNA Kit(货号为ER501)，TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(货号为AT301)均来自TransGen公司。

本发明涉及的引物如下，均由Genewiz合成：

实施例1动物免疫、融合与初步筛选过程

(1)动物免疫：

采用8周龄BALB/C雌鼠，抗原为EasyTaq DNA聚合酶，采用常规免疫法进行免疫，具体免疫方式：

第一次免疫为每只小鼠背部皮下分3到4点注射50μg EasyTaq DNA聚合酶与弗氏完全佐剂等体积混合后得到的免疫原；

两周后进行二次免疫，每只小鼠背部皮下分3到4点注射50μg EasyTaq DNA聚合酶与弗氏不完全佐剂等体积混合后得到的免疫原；

两周后进行三次免疫，每只小鼠背部皮下分3到4点注射50μg EasyTaq DNA聚合酶与弗氏不完全佐剂等体积混合后得到的免疫原；

两周后加强免疫，每只小鼠腹腔注射50μg EasyTaq DNA聚合酶与生理盐水等体积混合后得到的免疫原。

(2)细胞融合：

小鼠最后一次免疫后第三天开始。

脾细胞悬液的制备：取最后一次免疫后第三天的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离小鼠血清作为抗体检测时的阳性对照，同时颈脱位致死小鼠，取其脾脏，制备脾细胞悬浮液；

骨髓瘤细胞悬液的制备：提前两周复苏骨髓瘤细胞(保证使用时细胞处于对数生长期)，得到骨髓瘤细胞悬液；

饲养层细胞的制备：融合前一天获得小鼠腹腔巨噬细胞，加入96孔板培养，得到含饲养层细胞的细胞板；

细胞融合：采用PEG介导融合方法，取脾细胞悬液与骨髓瘤细胞悬液按照细胞数比为5:1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1200rpm离心5分钟，去掉上清，用手指轻弹离心管底部，使两种细胞松散混匀，放于装有37℃水的烧杯中保温，在1分钟内加入1ml 50％PEG(pH 8.0)融合细胞，边加边摇动，加完后静置30秒，加入无血清的DMEM培养基终止融合，1000rpm离心5分钟，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养层细胞的细胞板中，37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养；

其中，配制500ml HAT培养基需100ml FBS，5ml青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)，10ml HAT培养基添加剂(HAT Media Supplement)，385ml DMEM。

(3)杂交瘤细胞筛选

细胞培养箱中培养至第7天，融合细胞覆盖孔底10％-50％时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔。用Taq酶包板，检测杂交瘤细胞培养上清，二抗为酶标记羊抗鼠抗体，步骤(2)分离的小鼠血清作为阳性对照，筛选出抗体效价较高的阳性杂交瘤细胞；

(4)杂交瘤细胞克隆化

从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，来源于二个或者多个杂交瘤细胞，他们分泌的抗体是不同质的，为了得到完全同质的单克隆抗体，对阳性杂交瘤细胞进行克隆化；

克隆化的前一天按照步骤(2)制备饲养层细胞并铺板；用移液器将待克隆的孔内阳性杂交瘤细胞吹打混匀，用HT培养基将孔内细胞稀释至每个孔内1个细胞；37℃、5％CO₂培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，最终初步筛选获得了10株单抗杂交瘤细胞株，取上清进行下一步的功能筛选；

其中，配制500ml HT培养基需100ml FBS，5ml青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)，10ml HT培养基添加剂(HT Media Supplement)，385ml DMEM。

实施例2杂交瘤细胞的扩增抑制筛选

为了检测初步筛选出来的杂交瘤细胞株分泌的抗体是否有封闭EasyTaq DNA聚合酶的活性区域的作用，利用分子信标检测实验进行验证，其中，分子信标检测实验的原理如图1所示，引物与Molecular Beacon(MB，序列如SEQ ID NO.7所示)的环状区互补，延伸后可使MB茎环打开，致使发光。根据Molecular Beacon设计茎环引物(即SEQ ID NO.8所示的Primer-MB)。

(1)使用EasyTaq DNA聚合酶(TransGen，AP111)中的10×Reaction Buffer作为反应液，在PCR管中按照以下体系配制反应体系：

(2)使用BioRad CFX96荧光定量PCR仪，55℃孵育，每1min作为一个循环，收集一次荧光，共60个循环。

结果如图2所示，未封闭的EasyTaq DNA聚合酶(图中以“未封闭的EasyTaq酶表示”)有荧光信号；而封闭后的EasyTaq DNA聚合酶(图中以“抗体封闭后的EasyTaq酶表示”)没有荧光信号。

将10株杂交瘤细胞培养得到的上清分别与EasyTaq DNA聚合酶进行混合后进行上述试验，其中，有三株杂交瘤细胞没有荧光信号，其余7株均出现了荧光信号，因此筛选出三株杂交瘤细胞可以封闭EasyTaq DNA聚合酶的活性区域，将这三株杂交瘤细胞命名为杂交瘤细胞4A8、杂交瘤细胞5H6和杂交瘤细胞9B7。

杂交瘤细胞4A8已于2019年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.19191。

杂交瘤细胞5H6已于2019年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.19192。

杂交瘤细胞9B7已于2019年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.18882。

将杂交瘤细胞4A8、5H6、9B7分泌的抗体分别命名为单克隆抗体4A8、单克隆抗体5H6和单克隆抗体9B7。

实施例3杂交瘤细胞的基因扩增及亚型鉴定

通过杂交瘤细胞分泌的抗体的重链和轻链上的信号肽序列及恒定区部分设计引物，提取杂交瘤细胞总RNA反转录为cDNA，以该cDNA为模板，利用VH-VDJ-UmIgVH+(SEQ IDNO.9)和VH-VDJ-UmIgJH-(SEQ ID NO.10)扩增得到抗体重链可变区(V_H)的DNA序列，利用VL-VDJ-UmIgVK+(SEQ ID NO.11)和VL-VDJ-UmIgJK-(SEQ ID NO.12)扩增得到抗体轻链可变区(V_L)的DNA序列。

利用2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix进行扩增，在PCR管中按照以下体系配制反应体系。

使用移液器或漩涡振荡器充分混匀，将PCR管置于PCR仪中执行以下程序：

通过上述方法分别得到单克隆抗体4A8、单克隆抗体5H6和单克隆抗体9B7的重链可变区及轻链可变区的DNA序列，将DNA序列进行翻译得到蛋白序列：

单克隆抗体4A8的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.1第26-35位、SEQ IDNO.1第51-58位和SEQ ID NO.1第99-109位所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别为SEQ ID NO.2第24-40位、SEQ ID NO.2第54-60位和SEQ ID NO.2第93-101位所示；

单克隆抗体5H6的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.3第26-35位、SEQID NO.3第51-58位和SEQ ID NO.3第99-107位所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别为SEQ ID NO.4第24-39位、SEQ ID NO.4第53-59位和SEQ ID NO.4第92-100位所示；

单克隆抗体9B7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.5第26-35位、SEQID NO.5第51-58位和SEQ ID NO.5第98-110位所示；所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别为SEQ ID NO.6第24-35位、SEQ ID NO.6第50-56位和SEQ ID NO.6第89-97位所示；

通过Ig BLAST进行序列比对，跟已有序列均不相同，具有特异性。

利用抗体亚型检测试剂盒(Mouse Isotyping Kit)对抗体亚型进行分析，结果显示，4A8单抗的亚型为IgG_2a，5H6单抗的亚型为IgG_2b，9B7单抗的亚型为IgG_l，三个抗体的轻链均为κ链。

实施例4：杂交瘤细胞大规模培养及单克隆抗体纯化

取完成鉴定的杂交瘤细胞4A8、5H6、9B7分别扩大培养至10cm细胞培养皿中，37℃，5％CO₂培养4天左右，直至密度达90％以上进行传代。

用移液枪将培养皿底的贴壁细胞轻轻吹吸后，移入至15ml无菌离心管中，1000rpm离心5分钟。离心好后将上清收集，离心下来的细胞用10ml培养液重悬，混匀后加入到T225培养瓶中，轻轻摇匀，放入培养箱继续培养；37℃，5％CO₂培养一周左右，直至瓶内液体呈黄色(培养时间可根据细胞生长状态而定)，得到细胞悬液，此时需要将细胞传代至滚瓶中。

将T225培养瓶中的细胞悬液摇匀后，将细胞悬液倒入两个50ml无菌离心管中离心，1000rpm，5分钟。向滚瓶内加入新鲜的培养液约300ml，离心后的细胞重悬在10ml培养液中，混匀后分别加入滚瓶内，将滚瓶放入培养箱内滚瓶机上，60rpm滚动培养一周左右，直至瓶内液体呈黄色，可进行上清收集和传代；

将收集好的上清倒入离心管中，2500rpm离心3分钟，收集上清，放入-80℃冰箱中保存，统一利用进行Protein G柱亲和层析纯化，具体步骤如下：

装柱：取5ml ProteinIso Protein G Resin介质加入层析柱(Protein G柱直径Φ1.6cm)，静置，使用10个柱体积的超纯水冲洗层析柱；

平衡：使用10个柱体积的预冷的Protein G柱平衡液(50mM Tris-HCl，100mMNaCl，溶剂为水，pH 8.0)平衡层析柱，至流出液的电导和pH保持不变；

上样：将上述处理过滤后的样品上样，上样前样品和流出液都保持在冰浴的环境中，流速为60-70rpm；待将样品上完第一遍后，再上一遍；

洗涤：用10个柱体积的预冷的Protein G柱平衡液清洗层析柱10个柱体积；

洗脱：洗脱前在收集管中按1ml洗脱液(100mM Glycine，150mM NaCl，溶剂为水，pH3.0)加入10μl中和缓冲液(2M Tris-HCl，溶剂为水，pH 9.0)的比例加入中和缓冲液得到洗脱缓冲液，用洗脱缓冲液洗脱，分管收集洗脱组分，每管10ml，流速为20rpm。颠倒混匀，用pH试纸测定中和后的pH值，使之恢复中性。

利用上述Protein G亲和层析柱纯化，最终获得纯化后的单克隆抗体4A8，5H6，9B7，利用SDS-PAGE电泳进行检测，结果如图3所示，蛋白纯度较高，可以用于下一步检测。

利用蛋白定量试剂盒(Easy II Protein Quantitative Kit(BCA))测定单克隆抗体4A8的浓度为2mg/ml，单克隆抗体5H6的浓度为2.4mg/ml，单克隆抗体9B7的浓度为1.6mg/ml。

实施例5评估三株单克隆抗体4A8，5H6，9B7与EasyTaq DNA聚合酶结合的ELISA效价

利用ELISA方法对实施例4得到纯化后的三株单克隆抗体4A8，5H6，9B7进行效价检测，通过效价推测结合能力，效价越高，反映出理论结合能力更好，具体步骤如下：

(1)包被：用包被缓冲液(Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.95g，加超纯水至1000ml)稀释EasyTaq DNA聚合酶至1μg/ml，加入到酶标板中，100μl/孔，37℃孵育2小时，弃掉孔中液体；

(2)洗板：用清洗液(PBST，含0.05％TWEEN-20的1×PBS)洗板1次，300μl/孔，弃掉孔中液体；

(3)封闭：加入0.5％BSA溶液，150μl/孔，37℃封闭2小时，弃掉孔中液体；

(4)稀释样品：用稀释缓冲液(含1％BSA的PBST)分别稀释单克隆抗体4A8，5H6，9B7至1mg/ml，然后将三个单克隆抗体分别稀释1000倍后，再进行3倍梯度稀释，稀释8个梯度，分别得到单克隆抗体4A8，5H6，9B7的稀释好的样品；

(6)分别将单克隆抗体4A8，5H6，9B7稀释好的样品的每个梯度转移到酶标板中，50μl/孔，弃掉孔中液体；

(7)孵育：37℃1小时，弃掉孔中液体；

(8)洗板：用清洗液洗板5次，300μl/孔，弃掉孔中液体；

(9)酶结合物：将ProteinFind Goat Anti-Mouse IgG(H+L),HRP Conjugate用缓冲液稀释4000倍，100μl/孔，37℃孵育30分钟，弃掉孔中液体；

(10)洗板：用清洗液洗板5次，300μl/孔，弃掉孔中液体；

(11)底物：加TMB底物，100μl/孔，37℃避光孵育15分钟，弃掉孔中液体；

(12)终止：加入0.5M H₂SO₄，100μl/孔；

(13)测定：酶标仪读数，波长450nm；

实验结果如图4所示，3株单克隆抗体的效价随着抗体浓度的增加，OD值增大，其中单克隆抗体5H6的效价最高，单克隆抗体4A8次之，然后是单克隆抗体9B7。因此，单克隆抗体5H6对于EasyTaq DNA聚合酶活性结合能力最优，其次为单克隆抗体4A8，再次为单克隆抗体9B7。而对EasyTaq DNA聚合酶的封闭效果需要进一步通过实验验证。

实施例6：单克隆抗体组合和浓度对EasyTaq DNA聚合酶封闭效果影响

通过ELISA方法检测了单克隆抗体5H6、4A8和9B7对于EasyTaq DNA聚合酶的结合能力效果，5H6略优于其他，下一步我们需要利用PCR扩增的方法验证封闭效果，是否与ELISA检测效果一致，或者多种抗体联合使用可以获得更好的效果，因此设计了如下试验验证不同抗体浓度和组合对于EasyTaq DNA聚合酶的封闭效果的差异。

(1)单克隆抗体5H6、4A8和9B7分别按照下述反应体系进行不同摩尔比与EasyTaqDNA聚合酶混合，37℃封闭1小时，得到不同单一抗体封闭和抗体组合封闭的EasyTaq DNA聚合酶。

各抗体与EasyTaq DNA聚合酶(简称EasyTaq)的摩尔比如下：

a>4A8：EasyTaq＝1.5:1；

a1>4A8：EasyTaq＝1.0:1；

a2>4A8：EasyTaq＝0.5:1；

a3>4A8：EasyTaq＝0:1；

b>5H6：EasyTaq＝1.5:1；

b1>5H6：EasyTaq＝1.0:1；

b2>5H6：EasyTaq＝0.5:1；

b3>5H6：EasyTaq＝0:1；

c>9B7：EasyTaq＝1.5:1；

c1>9B7：EasyTaq＝1.0:1；

c2>9B7：EasyTaq＝0.5:1；

c3>9B7：EasyTaq＝0:1；

1>5H6：4A8：EasyTaq＝1.5:1.5:1；

2>5H6：4A8：EasyTaq＝1.0:1.5:1；

3>5H6：4A8：EasyTaq＝1.0:1.0:1；

4>5H6：9B7：EasyTaq＝0.5:1.5:1；

5>5H6：9B7：EasyTaq＝0.5:0.5:1；

6>5H6：9B7：EasyTaq＝1.0:1.0:1；

7>5H6：9B7：EasyTaq＝1.5:1.5:1；

(2)使用EasyTaq DNA聚合酶的10×Reaction Buffer作为反应液，选择基因sY14(Genbank号为NT_011896.10)为模板DNA进行扩增，所用引物为Primer_sY14_F(SEQ IDNO.13)和Primer_sY14_R(SEQ ID NO.14)，在PCR管中按照以下体系配制反应体系：

(3)使用移液器或漩涡振荡器充分混匀，将PCR管置于PCR仪中执行以下程序：

(4)扩增产物使用6×DNA loading Buffer稀释到1×，琼脂糖电泳检测抗体或抗体组合封闭的EasyTaq DNA聚合酶的扩增效果。

单一抗体封闭的结果如图5所示，当5H6与EasyTaq DNA聚合酶的摩尔比在0.5以上，4A8与EasyTaq DNA聚合酶的摩尔比在1.0以上，9B7与EasyTaq DNA聚合酶的摩尔比在1.5以上时，与其他的摩尔比相比可以获得最佳的封闭效果。抗体组合封闭的结果如图6所示，单克隆抗体5H6和单克隆抗体4A8组合，与EasyTaq DNA聚合酶的摩尔比为1.5:1.5:1和1.0:1.5:1(即1和2号反应体系)可以得到较好的封闭效果。

实施例7不同几何配位离子缓冲系统反应液对EasyTaq DNA聚合酶封闭效果影响

抗体封闭的EasyTaq DNA聚合酶在EasyTaq DNA聚合酶的Reaction Buffer中表现出比未封闭EasyTaq DNA聚合酶的优势，而不同的反应液对于DNA聚合酶活性影响较大，基本确定抗体组合和配比后，需要调试不同反应液对于封闭效果及EasyTaq DNA聚合酶活性的影响，力图筛选得到最适的反应液，因此，通过对EasyTaq DNA酶活性区域结构进行分析，找出与其活性位点配位结合相关的一系列离子基团，配制了一系列的几何配位离子缓冲系统反应液，来检测抗体封闭后的EasyTaq DNA聚合酶(实施例6的1号抗体组合封闭的EasyTaq DNA聚合酶，即1>5H6：4A8：EasyTaq＝1.5:1.5:1，下述称之为优选抗体组合封闭的EasyTaq DNA聚合酶)的扩增效果，具体步骤如下：

(1)不同反应液的配制：

#1>几何配位离子缓冲系统反应液：30mM Tris-HCl，50mM KCl，2.5mM CoCl₂，4mM(NH₄)₂SO₄，2.5mM MgCl₂，pH8.4，溶剂为水；

#2>几何配位离子缓冲系统反应液：30mM Tris-SO₄，25mM K₂SO₄，2.5mM CoCl₂，2.5mM MnCl₄，4mM(NH₄)₂SO₄，3mM MgSO₄，pH8.5，溶剂为水；

#3>几何配位离子缓冲系统反应液：30mM Tricine-KOH，45mM KCl，7.5mM MnCl₄，8mM(NH₄)₂SO₄，3mM MgSO₄，pH8.4，溶剂为水；

#4>几何配位离子缓冲系统反应液：30mM Tris-HCl，40mM KCl，5mM CoCl₂，4mM(NH₄)₂SO₄，2.5mM MgCl₂，pH8.3，溶剂为水；

#5>几何配位离子缓冲系统反应液：30mM Tris-SO₄，32mM K₂SO₄，5mM CoCl₂，5mMMnCl₄，4mM(NH₄)₂SO₄，3mM MgSO₄，pH8.8，溶剂为水；

#6>几何配位离子缓冲系统反应液：30mM Tricine-KOH，50mM KCl，5mM CoCl₂，7.5mM MnCl₄，8mM(NH₄)₂SO₄，3mM MgCl₂，pH8.6，溶剂为水；

(2)使用步骤(1)的不同反应液进行测试，选择扩增效率和特异性较弱于sY14的sY82(Genbank号为NT_011875.13)基因为模板DNA进行扩增，所用引物为Primer_sY82_F(SEQ ID NO.15)和Primer_sY82_R(SEQ ID NO.16)，在PCR管中按照以下体系配制反应体系：

(4)扩增产物使用6×DNA loading Buffer稀释到1×，琼脂糖电泳检测抗体封闭的EasyTaq DNA聚合酶或未封闭的EasyTaq DNA聚合酶的扩增效果。

结果如图7所示，不同的反应液对于EasyTaq DNA聚合酶活性影响较大，通过PCR扩增实验，确定了优选抗体组合封闭的EasyTaq DNA聚合酶的反应液，其中，#4>几何配位离子缓冲系统反应液、#5>几何配位离子缓冲系统反应液和#6>几何配位离子缓冲系统反应液的效果较好，#5>几何配位离子缓冲系统反应液(即30mM Tris-SO₄，32mM K₂SO₄，5mM CoCl₂，5mM MnCl₄，4mM(NH₄)₂SO₄，3mM MgSO₄，pH8.8，溶剂为水)表现出了对抗体封闭的EasyTaq DNA聚合酶最好的扩增效率和特异性。

实施例8：利用优选的抗体组合和反应液进行EasyTaq DNA聚合酶活性稳定性测试

利用优选的抗体组合进行PCR扩增目的片段时，单克隆抗体4A8和单克隆抗体5H6组合对EasyTaq DNA聚合酶进行封闭，可以有效降低非特异扩增，还能够起到在变性过程中，逐步释放DNA聚合酶的作用，使高温对酶活性的影响更低，使得有效扩增的循环数更高，大于40个循环的条件下仍可有效维持酶活性的持久性。

(1)选用#5>几何配位离子缓冲系统反应液作为稳定性测试的反应液，选用实施例6的1号抗体组合封闭的EasyTaq DNA聚合酶(即1>5H6：4A8：EasyTaq＝1.5:1.5:1，下述称之为优选抗体组合封闭的EasyTaq DNA聚合酶)作为反应体系，选择sY82基因作为模板DNA进行扩增，所用引物为Primer_sY82_F(SEQ ID NO.15)和Primer_sY82_R(SEQ ID NO.16)，在PCR管中按照以下体系配制反应体系：

(2)使用移液器或漩涡振荡器充分混匀，将PCR管置于PCR仪中执行以下程序：

(3)扩增产物使用6×DNAloading Buffer稀释到1×，琼脂糖电泳检测优选抗体组合封闭的EasyTaq DNA聚合酶与未封闭的EasyTaq DNA聚合酶在不同扩增循环数下的扩增效果。

结果如图8所示，每两条泳道代表两次重复，经优选抗体组合封闭的EasyTaq DNA聚合酶在40个循环后依旧有稳定的扩增，说明经抗体封闭的EasyTaq DNA聚合酶的稳定性和特异性较未封闭EasyTaq DNA聚合酶有较大的提高。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京全式金生物技术有限公司

<120> Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，包含其的聚合酶反应体系，及其应用

<130> JLP20I0177

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Trp Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Val His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Glu Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Ser Lys Thr Ser Thr Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Thr Val Ser Thr Thr

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met Lys Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Leu Lys

85 90 95

Asp Leu Thr Tyr Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys

100 105

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Met Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Lys His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Lys Glu Asp Val Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Gly Ile Leu Arg Gly Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Thr Val Glu Phe Thr

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg

50 55 60

Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro

65 70 75 80

Val Thr Glu Glu Asp Ala Ala Thr Phe Tyr Cys Gln Glu Ser Leu Glu

85 90 95

Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Val Thr Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Ile Asp Leu Ile Ser Tyr Leu Asp Ser Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Met Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Val Ile Ser Tyr Phe Gly Val Ser Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ala Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Phe Ala Ser Val Lys Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Glu Asp Phe Ser Met Pro Leu

85 90 95

Ala Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caccctgaag taccccatcg agcacggcat cgtcaccaac tgggacgaca tggagaaaat 60

ctggcaccac accttctaca atgagctgcg tgtggctccc gaggagcacc ccgtgctgct 120

gaccgaggcc cccctgaacc ccaaggccaa ccgcgagaag atgacccaga tcatgtttga 180

gaccttcaac accccagcca tgtacgttct cgatggggta cttcagggtg 230

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aacgtacatg gctggggtgt t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgaggtgcag ctggaggagt c 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtgaccgtgg tccctgcgcc ccag 24

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gacattctga tgacccagtc t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttttatttcc agcttggtcc c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaatattccc gctctccgga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctggtgctc cattcttgag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atcctgccct tctgaatctc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cagtgtccac tgatggatga 20

Claims

1.一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，其特征在于：所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合包括单克隆抗体4A8和单克隆抗体5H6；

所述单克隆抗体4A8含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.1第26-35位、SEQID NO.1第51-58位和SEQ ID NO.1第99-109位所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别为SEQ ID NO.2第24-40位、SEQ ID NO.2第54-60位和SEQ ID NO.2第93-101位所示；

所述单克隆抗体5H6含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.3第26-35位、SEQID NO.3第51-58位和SEQ ID NO.3第99-107位所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别为SEQ ID NO.4第24-39位、SEQ ID NO.4第53-59位和SEQ ID NO.4第92-100位所示。

2.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，其特征在于：所述单克隆抗体4A8的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；

3.根据权利要求1或2所述的Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，其特征在于：所述单克隆抗体4A8由保藏号为CGMCC No.19191的鼠抗EasyTaq DNA聚合酶单克隆抗体细胞株4A8产生；

4.权利要求1-3任一所述的Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合在降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增和/或保证Taq DNA聚合酶的热稳定性中的应用。

5.一种反应体系，其特征在于：所述反应体系包括权利要求1-3任一所述的Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合和Taq DNA聚合酶。

6.根据权利要求5所述的反应体系，其特征在于：所述反应体系中单克隆抗体5H6、单克隆抗体4A8和Taq DNA聚合酶的摩尔比为(1.0-1.5)：(1.0-1.5)：1；

优选的，所述反应体系中单克隆抗体5H6、单克隆抗体4A8和Taq DNA聚合酶的摩尔比为1.0-1.5：1.5：1；更优选的，所述反应体系中单克隆抗体5H6、单克隆抗体4A8和Taq DNA聚合酶的摩尔比为1.5：1.5：1或1.0：1.5：1。

7.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-3任一所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合、Taq DNA聚合酶和反应液。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述反应液为几何配位离子缓冲系统反应液1，几何配位离子缓冲系统反应液2或几何配位离子缓冲系统反应液3，

所述几何配位离子缓冲系统反应液1包括如下各组分：30mM Tris-SO₄，32mM K₂SO₄，5mMCoCl₂，5mM MnCl₄，4mM(NH₄)₂SO₄，3mM MgSO₄；pH8.8；

所述几何配位离子缓冲系统反应液2包括如下各组分：30mM Tricine-KOH，50mM KCl，5mM CoCl₂，7.5mM MnCl₄，8mM(NH₄)₂SO₄，3mM MgCl₂；pH8.6；

所述几何配位离子缓冲系统反应液3包括如下各组分：30mM Tris-HCl，40mM KCl，5mMCoCl₂，4mM(NH₄)₂SO₄，2.5mM MgCl₂；pH8.3。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述反应液为几何配位离子缓冲系统反应液1或几何配位离子缓冲系统反应液2。

10.权利要求5或6所述的反应体系或权利要求7-9任一所述的试剂盒在DNA扩增中的应用。