CN108949716A - 一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法 - Google Patents

一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法 Download PDF

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CN108949716A CN201810651498.6A CN201810651498A CN108949716A CN 108949716 A CN108949716 A CN 108949716A CN 201810651498 A CN201810651498 A CN 201810651498A CN 108949716 A CN108949716 A CN 108949716A
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刘金朝
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Abstract

本发明公开一种热启动TaqDNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：(1)将纯化的TaqDNA聚合酶作为底物包被，利用噬菌体展示技术进行三轮的淘选流程，得到富集的同底物具有高亲和力的阳性备选配体；(2)分析富集的阳性备选配体序列组成，同底物结构比对后，选择若干可以与之结合的阳性克隆，利用大肠杆菌体外表达系统表达得到系列阳性配体；(3)将体外表达得到的配体、TaqDNA和多克隆抗体按照3：3：1的比例混合后得到热启动TaqDNA聚合酶。本发明制备的热启动TaqDNA聚合酶，能够在最大限度保持酶活性的基础上常温更好的封闭酶的活性，在分子诊断多个平台上验证其使用效果优于传统的热启动TaqDNA聚合酶。

Description

一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物学技术领域具体涉及一种热启动Taq DNA聚合酶及其制备方法。
背景技术
聚合酶链式反应技术(PCR反应)是现代生物技术的核心技术之一，该技术的原理为利用Taq DNA聚合酶在体外利用与目的模板特异结合的上下游引物，通过95℃变性、60℃退火、72℃延伸三个步骤经过25-40个循环达到对目的基因片段的大量扩增。该技术经过近40年的发展，已经广泛的应用于生物科学科研和医学检测中。
随着检测技术的发展和需求的提高，PCR技术已经由之前的定性分析发展到了定量分析。通过实时荧光定量技术，检测人员可以实现对样品中的较低的病毒数量进行检测分析，为医生提供更为早期的诊断依据。而传统的Taq DNA聚合酶由于其在常温下具备一定的活性，从而容易造成引物二聚体和非特异扩增，进而造成检测结果的偏离甚至产生假阳性的结果。
针对这一应用需求开发出了热启动技术，其核心机制在于抑制Taq DNA聚合酶常温下的活性反应。目前常见的热启动技术分为：1石蜡包埋法；2抗体抑制法；3化学修饰法等：
1、石蜡包埋法的原理是将Taq DNA聚合酶包埋于石蜡小球中，常温下酶同反应体系隔绝，加热后石蜡融化释放酶参加反应。但石蜡球制备复杂，且石蜡对于荧光读取有一定干扰，使用受到很大限制。
2、抗体抑制法使用传统单克隆抗体，低温抗体同酶结合抑制活性，高温抗体失活释放活性。本方法为目前主流方法之一。但抗体抑制法的问题在于：a.传统的单克隆抗体制备方式无法在制备阶段特异性的针对酶的活性位点进行制备，所以对于酶的抑制效果有限，即对于扩增反应中无模板对照组(NTC)的抑制效果有限，无法满足高特异性应用的需求。b.单克隆抗体制备成本较高，且抗体批次稳定性较差也限制了其大规模的应用。
3、化学修饰法使用生化试剂对特定氨基酸进行修饰，进而达到抑制活性的作用。化学修饰法成本较抗体抑制法低，也是主流热封闭技术。但化学封闭技术容易造成Taq DNA聚合酶结构的不可逆损伤，进而影响活化后酶的灵敏度，不适用于一些对检测灵敏度高的应用。而且由于化学修饰的自身的稳定性，导致打开化学键释放酶活性的过程需要大量的能量，体现在反应中则需要95℃更长的时间。已ABI公司的金牌热启动Taq酶来说激活过程长达10-15min。大大增加了反应时间，增加了反应的不确定性。
总体来说，热启动技术的重点集中在不损失酶活性的基础上的常温活性控制。化学修饰由于其“无差别”封闭的特点会造成活性的损失，渐渐的不能适应更高的检测要求。而传统的单克隆抗体由于缺少有效的检测方法，很难筛选到正好能针对活性位点结合的抗体株。同时酶的活性是由多个活性区域决定的，单一抗体很难满足需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种由噬菌体体外展示筛选得到特异性系列配体配合多克隆抗体的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，弥补市面上常规的抗体抑制法和化学修饰法制备出的热启动Taq DNA聚合酶存在的缺点，为分子诊断和科研提供特异性更好、扩增效率更高的热启动Taq DNA聚合酶。
为了实现上述目的，克服现有技术存在的不足，本发明采用以下技术方案：一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，具体步骤如下所述：
(1)将纯化的Taq DNA聚合酶作为底物包被，利用噬菌体展示技术进行三轮的淘选流程，得到富集的同底物具有高亲和力的阳性备选配体；
(2)分析富集的阳性备选配体序列组成，同底物结构比对后，利用大肠杆菌体外表达系统表达得到系列阳性配体，利用qPCR技术验证其对扩增效率和特异性的影响；
(3)将配体、Taq DNA和多克隆抗体按照3：3：1的比例混合后得到热启动Taq DNA聚合酶。
所述的配体为一种或两种以上配体的混合物。
本发明的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，具有以下有益效果：在特异性方面优于传统抗体抑制法热启动酶；在酶活性保留方面优于化学修饰法热启动酶(金牌Taq酶)。特异配体可以通过体外大量合成，配合的多克隆抗体相比较单克隆抗体更容易获得，成本更低。
本发明提到的利用噬菌体肽库筛选出的阳性系列配体本身基于用于药用靶向抗体筛选的单链抗体技术，优势如下：1、以亲和力为指标，保证了同靶分子的结合效果；2、配体序列可知，可以通过信息学分析比对选择最佳结合位点；3、利用分子生物学和蛋白质工程技术实现该配体的高效、规模化、低成本的体外标准化制备，从而省略昂贵的细胞培养过程；4、利用多克隆抗体位点多样性的特点，对Taq DNA聚合酶进行进一步的封闭以达到对重点位点封闭基础上对未知或功能不明确区域的封闭。
附图说明
图1是筛选出的3种配体的电泳图；
图2是不同热启动Taq DNA聚合酶特异性比较；
图3模板梯度稀释绘制标准曲线；
图4本发明的热启动Taq DNA聚合酶扩增效率验证；
图5本发明的热启动Taq DNA聚合酶扩增灵敏度验证。
具体实施方式
实施例一：制备热启动Taq DNA聚合酶
一、噬菌体肽库筛选
1、培养基和溶液：
LB培养基：每升含：10g Bacto-Tryptone，5g yeast extract,5g NaCl。高压灭菌，室温贮存。
LB/IPTG/Xgal平板：
LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mlIPTG/Xgal*，混匀倒平板。平板4℃避光贮存。
顶层琼脂：
每升含：10g Bacto-Tryptone，5g yeast extract,5g NaCl,1g MgCl2·6H2O,7g琼脂粉。高压灭菌，分成50ml等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。
四环素贮液：以20mg/ml的浓度溶于乙醇中。-20℃避光贮存。用前摇匀。
LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml四环素贮液，混匀倒平板。平板4℃避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。
封阻缓冲液：0.1M NaHCO3(pH 8.6),5mg/ml BSA,0.02％NaN3。过滤除菌，4℃贮存。
TBS:50mM Tris-HCl(pH 7.5),150mMNaCl。高压灭菌，室温贮存。
PEG/NaCl:20％(w/v)PEG-8000,2.5M NaCl。高压灭菌，室温贮存。
碘化物缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA,4M NaI。室温避光贮存。
链霉亲和素贮液：将1.5mg链霉亲和素冻干粉(本试剂盒提供)溶于1ml10mM磷酸钠(pH7.2)、100mMNaCl、0.02％NaN3溶液中。4℃或-20℃贮存，避免反复冻融。
2、测定噬菌体滴度
(1).接种ER2738单菌落于5-10ml LB培养基中，摇床培养至对数中期(OD600～0.5)。
(2).细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45℃备用。
(3).37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。
(4).在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。
建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。
(5).当菌体培养物达对数中期，分成200μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。
(6).每管加入10μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min。
(7).将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
(8).待平板冷却5min后，倒置于37℃培养过夜。
(9).检查平板，计数有～102个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。
3、淘选程序：
第一天：
根据需同时在其上进行文库淘选的靶分子的数量和种类不同，淘选试验可以在单个灭菌聚苯乙烯培养皿、12或24孔板、96孔微量板中进行。每种靶分子至少包被一个板(或一个孔)。下述方法中给出的量是60×15mm培养皿的用量，括号中为微孔板的用量，其他中等尺寸的孔相应地调整此用量。但每种情况下，加入的噬菌体数量都是相同的：2×1011个病毒子。
(1).准备100μg/ml的靶分子溶液(溶于0.1M pH 8.6的NaHCO3)。
如果需要稳定靶分子，也可使用其他相似离子强度的缓冲液(含金属离子等)。
(2).每板(孔)加入1.5ml(微孔板每孔150μl)上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润(小心不要使溶液溅出)。
(3).在增湿容器(如：排列有湿纸巾的可封口塑料盒)中4℃轻微震荡，孵育过夜。平板可在此容器中4℃贮存备用。
第二天：
(4).挑ER2738单克隆(噬菌体滴度测定时铺的板)于10ml LB液体培养基中。如果同一天扩增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20ml LB液体培养基，这时请用250ml三角瓶(不要用50ml锥形管)。37℃剧烈震荡培养。
(5).倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。每板(或孔)加满封阻液，4℃作用至少1hr。
(6).按5中所述方法除去封阻液。再用TBST(TBS+0.1％[v/v]Tween-20)缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液(或使用自动洗板机)。此操作要快以避免板干燥。
(7).用1ml(微孔板则用100μl)的TBST缓冲液稀释2×1011的噬菌体(即10μl的原始文库)，然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10-60min。
(8).倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。
(9).按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。
(10).根据所研究的分子间相互作用，用1ml(微孔板则用100μl)适当的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。一般情况下，是将靶分子的已知配体以0.1-1mM的浓度溶于TBS溶液中或者用游离靶分子溶液(～100μg/ml溶于TBS中)从固定靶分子上将结合的噬菌体竞争性洗脱下来。室温温和摇动10-60min，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中。
另外，也可用非特异性缓冲液如0.2M Glycine-HCl(pH 2.2),1mg/ml BSA来分离已结合的分子：温和摇动>10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用150μl(微量孔则用15μl)1M Tris-HCl(pH 9.1)中和上述洗脱液。
(11).按上述常规M13方法中的程序测定少量(～1μl)洗脱物的滴度。如需要，可对第一或第二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述。(必要时可将剩余洗脱物4℃贮存过夜，第二天扩增。这时，可将ER2738在LB-Tet培养基中过夜培养，第二天将培养物1:100稀释于20ml LB中(用250ml三角瓶盛装)，加入未扩增洗脱物。37℃剧烈摇动培养4.5hr，继续第13步)。
(12).剩余洗脱物应当被扩增：将洗脱物加入到20ml ER2738培养物中(菌体应当处于对数前期)，37℃剧烈摇动培养4.5hr。
(13).将培养物转入一离心管中，然后，4℃10,000rpm离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心。
(14).将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4℃沉淀至少60min，最好过夜。
第三天
(15).4℃10,000rpm离心PEG沉淀15min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。
(16).沉淀物重悬于1ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5min使残余细胞沉淀。
(17).上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60min。
4℃离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。
(18).沉淀物重悬于200μl TBS,0.02％NaN3中。离心1min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。
(19).根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4℃贮存。
(20).再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用，参照步骤1-3。
第四和第五天
(21).计数板上蓝斑数确定滴度。用这个值来计算相应于2×1011pfu的加入量。如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至109pfu的噬菌体加入量进行试验。
(22).进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中2×1011pfu的噬菌体量重复步骤(4)-(18)，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.5％(v/v)。
(23).在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。
(24).再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用，参照步骤(1)-(3)。
第六天
(25).进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中2×1011pfu的噬菌体量重复步骤(4)-(11)，清洗步骤中同样用0.5％(v/v)的Tween。
(26).在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。第三轮洗脱物不必再扩增，滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用：只要注意平板培养时间不要超过18小时，培养时间过长容易出现缺失。其余洗脱物4℃贮存。
(27).挑一ER2738单克隆于LB-Tet培养基中培养过夜(不要接种稀释后的铺板培养物)。
二、结合克隆的特征鉴定
1、噬菌斑的扩增
(1).将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分1ml到培养管中。每个要鉴定的克隆一管。一般情况下，由第三轮淘选物中取10个克隆便足以检测结合肽中的共有序列。
(2).用灭菌牙签或吸头，挑一蓝色噬菌斑到上述1ml培养管中。注意：要从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。
(3).37℃摇床培养4.5-5hrs(不要过长)。
(4).备选步骤。除测序单个克隆外，也可以对整个被选噬菌体集合进行测序。这样只通过一个步骤就可以得到共有结合序列，但这种情况只是当公有序列元件出现在每个克隆的7肽“框架”内相同位置的时候。加10μl未扩增的洗脱物到1ml稀释的过夜培养物中，37℃摇床培养4.5-5hrs。
(5).培养物转入微量离心管中，离心30sec。上清转入以新鲜管中，再离心。用移液器将80％的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以4℃贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油1:1稀释后，-20℃贮存。
2、ELISA检测亲和力：用ELISA法检测所选多肽对靶分子的结合
(1).在扩增噬菌斑进行DNA测序时，将所剩余的含噬菌斑上清4℃保存。
(2).对每一个要鉴定的噬菌斑克隆，接种一管ER2738于20ml LB培养基中，37℃培养至稍微浑浊。或者，也可以将过夜培养的ER2738按1:100的比例稀释于20ml LB培养基中。
(3).于每管ER2738培养液中加入5μl噬菌体上清，37℃通气培养4.5hrs。
(4).上述培养物转入离心管中，10,000rpm离心10min。上清移入新鲜离心管，再离心。
(5).取80％上清于新鲜离心管中，加1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀至少1hr或过夜。
(6).4℃10,000rpm 15min离心沉淀，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。
(7).沉淀重悬于1ml TBS中，悬液转入微量离心管，4℃离心5min除去沉淀中的残留细胞。
(8).上清转入新鲜微量离心管，加1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上作用15-60min。4℃离心10min，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。
(9).沉淀重悬于50μl TBS中，按常规M13方法中所述测定噬菌体滴度。4℃贮存。
(10).用100-200μl 100μg/ml的靶分子(溶于0.1M pH 8.6NaHCO3中)包被ELISA板的每个孔，每个待鉴定克隆一排包被孔。在密封的湿盒(如：排有湿纸巾的封口塑料盒)中4℃包被过夜。
(11).甩出多余靶分子溶液，并倒置平板在纸巾上拍甩除去残液。每孔加满封阻液。另外，每个待鉴定克隆的一排未包被孔也加入封阻液，以检测所选序列对BSA包被塑料板的结合力。在将噬菌体加入靶分子包被板前，还要再准备一个微量滴定板进行噬菌体的系列稀释，这个板也要封阻。单独在另外一个封阻板中进行稀释是为了避免稀释过程中有噬菌体吸附到靶分子上。最后，所有封阻板4℃封阻1-2hrs。
(12).甩出封阻液，用1×TBS/Tween洗板6次，每次均倒置平板在干净纸巾上拍甩去洗液，Tween浓度应当与淘选清洗步骤中所用浓度相同。
(13).在单独的封阻板中每孔预先加入200μl TBS/Tween，由每排第一孔加入1012个病毒子开始对噬菌体进行4倍系列稀释至第12孔2×105个病毒子。
(14).用多通道移液器将每排稀释好的噬菌体加入包被有靶分子的板中。室温震荡作用1-2hrs。
(15).用1×TBS/Tween洗板6次(同步骤12)。
(16).在封阻液中以1:5,000的比例稀释HRP标记的抗-M13抗体(Pharmacia#27-9411-01)。每孔加入200μl稀释抗体，室温震荡作用1hr。
(17).用1×TBS/Tween洗板6次(同步骤12)。
(18).按下述方法准备HRP底物溶液：
ABTS贮液可以提前准备：将22mg ABTS(Sigma#A1888)溶于100ml 50mM的柠檬酸钠溶液(pH 4.0)中，过滤除菌，4℃贮存。对每个待检测板，于检测步骤前将36μl 30％的H2O2加入21ml ABTS贮液中。
(19).每孔加200μl底物溶液，室温作用10-60min。
(20).用读板仪记录405-415nm处的吸光值。
3、测序模板的快速纯化
(1).阳性克隆扩增，在第一步离心后，将500μl含噬菌体上清转入一新鲜离心管。
(2).加200μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10min。
(3).离心10min，弃上清液。
(4).短暂离心，小心吸去残余上清。
(5).沉淀物彻底重悬于100μl碘化物缓冲液中，加入250μl乙醇。室温温育10min。短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。
(6).离心10min，弃上清。用70％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。
(7).沉淀重悬于30μl TE[10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA]中。
(8).5μl的上述模板溶液足够进行35S或33P标记的手工双脱氧测序,或染料标记的自动循环双脱氧测序。根据测序方法的不同,适当增减模板用量
实施例二：制备热启动Taq DNA聚合酶
一、阳性克隆表达工程菌制备以及目标配体表达纯化制备
根据测序的结果，人工全基因合成表达质粒；转化BL21(DE3)工程菌，表达纯化具体操作如下：
1、将BL21(DE3)感受态细胞从-80℃取出，置于冰上慢慢溶化；
2、将合成的质粒0.5μl加入感受态中，吹打混匀后，置于冰上30min；
3、42℃水浴热激90sec后立即冰浴2min；
4、加入1ml无抗性LB37℃200rpm培养45min；
5、2500rpm离心5min；弃上清，沉淀用100μlLB培养基悬浮均匀后均匀涂布于抗性平板上；
6、37℃倒置培养16～20h；
7、挑取长势良好的单克隆加入5ml抗性LB培养基中37℃震荡过夜培养为种子；
8、将种子加入1L的抗性LB中，37℃200rpm培养8h至OD600＝0.8；加入1MIPTG溶液500μl；继续过夜培养；
9、收集过夜培养的培养液，4000rpm离心后得菌体2g；
10、加入50ml50mMTris-HclpH8.0溶液(平衡液)悬浮均匀；
11、超声破碎仪；30％功率超5s停5s；共计200次；4℃14,000rpm离心30min取上清；
12、上清液上DEAE柱；流速5ml/min；用平衡液平衡20个柱体积至OD280不再变化。
13、平衡液中加入终浓度10mMNaCl为洗柱液；使用20个柱体积的洗柱液淋洗纯化柱，以去除结合的杂蛋白，至OD280不再变化；
14、平衡液加入终浓度200mMNaCl为洗脱液；使用5个柱体积的洗脱液淋洗纯化柱，收集洗脱峰即为目的蛋白；
15、洗脱峰透析换液到保存液(20mMPBpH7.4)浓缩到2mg/ml；
16、加入等体积的灭菌甘油；-20℃保存，备用；
17、配体1、配体2、配体3按照1：1：3比例混合为样品A；纯化后得到的配体1、配体2、配体3从左至右如图1所示；
18、样品A同Taq DNA聚合酶按照1：1混合为样品B；
19、样品B同多克隆抗体按照3：1比例混合即为热启动Taq DNA聚合酶。
实施例三：本发明的方法制备的热启动Taq DNA聚合酶特异性的验证
采用5对引物，进行NTC验证，NTC验证即无模板扩增对照实验，反应体系中不加入扩增模板，用于验证扩增的特异性，特异性不好的引物NTC会有扩增。使用热启动Taq DNA聚合酶可以有效的改善NTC扩增。
结果如图2所示，相比较普通Taq DNA聚合酶NTC扩增结果，5组引物使用热启动TaqDNA聚合酶NTC扩增均有改善，而使用本发明方法制备的热启动TaqDNA聚合酶NTC抑制效果更为明显。说明本发明的方法制备的热启动Taq DNA聚合酶封闭效果更好，特异性更高。
2.扩增能力
将模板梯度稀释绘制标准曲线，如图3所示；标准曲线扩增效率100％；R2为1说明扩增能力良好，准确度极高，如图4所示。
3、一步法体系扩增能力
带入一步法qRT-PCR体系中检测灵敏度达到指标，如图5所示。

Claims (2)

1.一种热启动TaqDNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将纯化的TaqDNA聚合酶作为底物包被，利用噬菌体展示技术进行三轮的淘选流程，得到富集的同底物具有高亲和力的阳性备选配体；
(2)分析富集的阳性备选配体序列组成，同底物结构比对后，选择若干可以与之结合的阳性克隆，利用大肠杆菌体外表达系统表达得到系列阳性配体；
(3)将体外表达得到的配体、TaqDNA和多克隆抗体按照3：3：1的比例混合后得到热启动TaqDNA聚合酶。
2.根据权利要求1所述的热启动TaqDNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述的配体为一种或两种以上配体的混合物。
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