CN102584952B - 一种丙型肝炎病毒f蛋白的抗原构象表位模拟肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学及免疫学领域，公开了丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽及其应用。该丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽的序列为SEQIDNO.1。本发明采用噬菌体展示技术，以鼠抗HCV-F抗血清为包被抗体，筛选了噬菌体12肽库，然后对四轮筛选后得到阳性克隆采用ELISA、DNA测序、免疫印迹、生物信息学分析等方法，最终找到了能与鼠抗HCV-F抗体特异性结合的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽。本发明提供的丙型肝炎病毒F蛋白抗原构象表位模拟肽可用于制备丙型肝炎F抗体诊断试剂盒。对于丙型肝炎的预防、控制具有重要的社会效益和经济效益。

Description

一种丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种丙型肝炎病毒F蛋白抗原构象表位模拟肽及其应用。

背景技术

国家卫生部2011年12月发布的全国法定传染病疫情报告显示，我国28种传染病中，病毒性肝炎的发病率及死亡率均位居第一。丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus，HCV)是导致输血性或社区获得性非甲非乙型肝炎的主要病因，是丙型肝炎的病原体，在世界范围内的感染率是3％，感染者总计超过1.7亿。在我国，约75％的急性丙肝感染者会发展为慢性肝炎，约20％的患者最终发展为肝硬化和肝细胞肝癌等终末期肝病。HCV感染已成为我国乃至世界所面临的严峻的公共卫生难题。

丙型肝炎病毒是单股正链RNA病毒，黄病毒科丙肝病毒属，基因组全长9.6kb，分为5’非翻译区(UTR)、一个开放阅读框(ORF)和3’非翻译区，编码10个主要蛋白：C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。由于HCV是RNA病毒，RDRP缺乏校验性，故HCV变异率高。目前的标准治疗方案是聚乙二醇干扰素联用利巴韦林，但平均应答率不超过50％，至今尚无有效的疫苗和特效治疗药物问市。故亟需对HCV的预防、控制和治疗进一步研究。

除了以上10种蛋白之外，HCV基因组还编码一种F蛋白(Synthesis of a novelhepatitis C virus protein by ribosomal frameshift.EMBO J，2001，20(14)：3840-3848)，是HCV基因组C蛋白编码移位的产物，在自然感染过程中即可出现。研究发现，F蛋白在体外也可以形成与HCV病毒颗粒外形相似的，直径约35nm的病毒样颗粒，提示F蛋白可能参与HCV病毒颗粒的形成，在HCV的病毒生命周期中具有重要作用，并参与HCV的病理进程(HCV F蛋白体外自组装以及在HCV感染者肝组织中的分布研究。中华实验和临床感染病杂志，2007，1(3)：138-139)。在不同临床类型的丙肝患者中，中重度和肝硬化患者F抗体阳性率最高(Expression of hepatitis C virus F protein leads transfected cell totransformation.Journal of Nanjing University(natural sciences)，2010，46，40-42)；且肝细胞肝癌慢性HCV患者F抗体阳性率高于非肝细胞肝癌慢性HCV患者(High levels of HCV core+1 antibodies in HCV patients with hepatocellularcarcinoma.Journal ofGeneral Virology(2011)，92：1343-1351)。以上研究表明，F蛋白抗体可能与丙型肝炎的病情进展和预后有关，对患者体内F蛋白抗体的检测有助于丙型肝炎的控制和监测。

丙型肝炎病毒的检测目前主要是针对上述10种结构蛋白或非结构蛋白的ELISA检测和HCV RNA定量等等。F蛋白抗体的检测与HCV的诊断、病情进展和预后有一定相关性，且F蛋白在HCV各种基因型间的同源率高于80％，交叉免疫原性好(CN 101407813B)，故可作为补充手段，加强对HCV控制和监测，具有重要的社会效益和经济效益。

确定蛋白质或肽类抗原表位常用的方法有肽池测序、肽扫描、定点突变、组合肽库法等。这些方法需要或者合成大量交叠肽，或者裂解为小肽，或者通过定点突变技术一个个改变氨基酸残基，再通过多肽结合试验来测定，而且得到的结果通常是线性表位(药物生物信息学。化学工业出版社，2004)。研究显示，蛋白质或多肽刺激机体产生抗体的表位，90％为构象性表位，仅10％为线性表位。因此，确定抗原的空间构象表位对于抗原-抗体的免疫诊断和病毒疫苗和特效性药物的开发具有更重要的意义(抗原表位预测的免疫信息学方法研究进展。中国免疫学杂志，2008，24：857-861)。

本发明采用的噬菌体展示技术(Filamentous fusion phage：novel expressionvectors that display cloned antigens on the virion surface.Science，1985，228(4705)：1315-1317)，是将外源蛋白与丝状噬菌体融合展示于噬菌体颗粒表面，并能保持外源蛋白相对独立的、原有的空间结构。噬菌体肽库是由大量的单个噬菌体组成，每个噬菌体可展示一个肽段，可用于展示不同肽段的重组噬菌体库。噬菌体在其颗粒表面表达出外源蛋白后，以特异性抗体为靶分子，筛选随机噬菌体12肽库，并通过抗体浓度逐步降低、洗脱液浓度逐步升高的方法，筛选出与特异性抗体亲和力越来越高的携带特定构象肽段的噬菌体阳性克隆，再以ELISA、免疫印迹法鉴定其与抗体的亲和力，核酸测序确定其编码基因，用生物信息学方法分析序列，最终确定特异的蛋白构象模拟肽。

目前，对HCV表位的研究主要是C区、E1/E2区、NS3、NS4、NS5区的表位，抗HCV血清学检测主要来自这几个区，C区构象表位主要存在于19-26位，34-39位，73-83位氨基酸残基(Identification of antigenic sites on three hepatitis Cvirus proteins using phage-displayed peptide libraries.J Med Virol，1998，56：105-111)。E1区抗原性表位主要存在于297-306位氨基酸残基，E2区抗原性表位主要存在于480-494位氨基酸残基和613-621位氨基酸残基(Mappingof a conformational epitope shared between E1 and E2 on the serum-derived humanhepatitis C virus envelope.J Biol Chem，2003，278：44385-44392)。NS3区构象表位位于1396-1398，1376-1378位氨基酸残基(Characterization of mimotopesmimicking an immunodominant conformational epitope on the hepatitis C virus NS3helicase.J Med Virol，2004，72：385-395)。NS4区构象表位包含1698-1709位氨基酸残基(Usefulness of the phage display technology for the identification of ahepatitis C virus NS4A epitope recognized early in the course of the disease.J ViroMeth，2005，8：9-17)。NS5区抗原表位主要位于NS5A区2215-2313位氨基酸残基，其中2238-2313位氨基酸残基含有强的抗原性表位(Antigenic heterogeneity of thehepatitis C virus NS5A protein.J Clin Microbiol，2002，40：61-67)。

现今对丙肝病毒F蛋白抗原性的研究主要是包含线性表位的F基因全序列，有研究者采用原核表达的插入有大肠杆菌嗜性密码子F蛋白的65～134位氨基酸制备检测试剂盒(CN 101407813B)，该方法实现的关键是作为包被抗原的F蛋白片段(连续的70个氨基酸残基序列)的获取，由于所需分子生物学实验技术的复杂性，其实现难度较大，制备成本较高；而如SEQ ID NO.1所示序列的采用噬菌体肽库筛选丙肝病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽至今未见报道。

发明内容

本发明的目的是筛选出一种丙型肝炎病毒F蛋白抗原构象表位模拟肽，利用噬菌体展示技术，以噬菌体随机12肽库与小鼠抗HCV-F抗体结合，筛选得到的由12个氨基酸残基构成的短肽。

本发明的另一目的是提供上述丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽，在制备丙型肝炎F抗体的诊断试剂中的应用。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

一种丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽，其特征是由12个氨基酸残基构成的小肽，序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1：NH₂-Lys-Pro-Ser-Gly-Asn-Leu-Gly-Pro-Asp-Gly-Thr-Ser-COOH。

编码权利要求1所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽的核苷酸序列。

所述编码权利要求1所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽的核苷酸序列为：5’-AAGCCGTCTGGTAATTTGGGTCCGGATGGTACTTCT-3’(SEQID NO.7)。

所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽的融合蛋白。

所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽，在制备丙型肝炎F抗体的诊断试剂中的应用。

本发明提供的丙型肝炎病毒F蛋白抗原构象表位模拟肽是用以下方法得到的：

首先用分子生物学方法扩增丙肝病毒F蛋白基因进行原核表达，纯化重组F蛋白，免疫BALB/c小鼠，分离抗血清制备小鼠抗F蛋白抗体。以纯化的小鼠抗F蛋白抗体包被酶标板，用噬菌体12肽库进行筛选，逐渐减少包被的小鼠抗F蛋白抗体的浓度并提高漂洗液中吐温-20的浓度以加大筛选压力，使洗脱下的噬菌体与靶分子结合的亲和力越来越高，特异性越来越强，经过4轮筛选和ELISA鉴定获得亲和力强、特异性高的噬菌体阳性克隆，DNA测序并进行序列分析，通过免疫印迹鉴定、生物信息学软件DNAstar多重比对等方法，确定丙型肝炎病毒F蛋白抗原构象表位模拟肽序列。与野生型F蛋白氨基酸序列比较，该空间构象抗原表位序列保守但并不连续，且能与F蛋白抗体特异性结合，由此确定该12肽为模拟的丙型肝炎病毒F蛋白抗原构象表位。

本发明有益效果：

本发明首次将噬菌体展示技术用于丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽筛选。采用噬菌体肽库筛选F蛋白抗原构象表位模拟肽，可在噬菌体颗粒表面展示F蛋白的天然空间构象及生物活性，由此所得到的构象表位，与采用化学或生物方法筛选得到的线型序列表位肽完全不同，但却具有很好的免疫原性，较传统方法相比，对于蛋白或多肽抗原构象表位模拟肽的筛选具有独特的优势。由于噬菌体表面的融合蛋白可以直接分泌到培养液中，免去了繁琐的纯化过程，而且噬菌体颗粒稳定，更适用于研究和应用。

本发明所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽，仅有12个氨基酸残基，可以通过人工方法合成得到，为制备F抗体检测试剂盒的包被抗原提供了更大的便捷，可节省许多人力物力成本，对后期应用于检测试剂、疫苗和药物的开发具有明显而不可替代的优势。

附图说明

图1：纯化后的HCV-F蛋白的SDS-PAGE电泳分析，其中M：蛋白分子量标准；1：纯化后重组F蛋白；2：全菌沉淀(阳性对照)；3：空质粒的对照菌TG1(阴性对照)；

图2纯化后的抗HCV-F抗体的Western blot(免疫印迹)分析，其中M：蛋白分子量标准，1：F蛋白SDS-PAGE电泳结果，2：F蛋白与抗HCV-F阳性血清反应，3：对照小鼠血清(阴性对照)；

图3：噬菌体肽库生物淘洗流程。

图4：阳性噬菌体克隆单链模板的DNA电泳分析：M，DNAmarker DL 2000；1～15，第四轮淘筛后15个阳性噬菌体克隆单链模板。

图5：阳性噬菌体、空载体与F蛋白、抗HCV-F抗体竞争抑制性ELASA实验。

图6-1～图6-9：丙肝病毒F蛋白氨基酸序列与重组F蛋白及阳性噬菌体克隆12肽序列比对；

F1：ACJ04214.1；F2：ACJ04212.1；F3：ACJ04207.1；F4：ACJ04205.1；

F5：ACH99675.1；F6：ACH99673.1；F7：ACH99671.1；F8：ACH99649.1；

F9：ACE82437.1；F10：ABV46152.2；F11：ACA50643.1；F12：ABV46061.2；

F13：ABV46241.1；F14：ABV46229.1；F15：ABV46227.1；F16：重组F

蛋白；F epito：噬菌体阳性克隆的12肽序列。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

结合附图说明本发明的具体实施方法，如下：

实施例1、丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达和纯化

1、材料：E.coli TG1购自Stratagen公司。IPTG购自Promega公司。GlutathioneSepharose 4B凝胶购自Pharmacia公司。PCR试剂盒购自申能博彩公司。引物由上海博亚公司合成。各种限制性内切酶、DNA连接酶、载体及蛋白Marker购自TaKaRa公司。DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜公司。

2、方法：

1)引物

上游引物P1：5′-GT

AGCACAAATCCTAAGCCTCAGAG-3′(SEQID NO.2)；

上游引物P2：5′-CTAAGCCTCAGAGAAAGCCAAACGTAACACC-3′(SEQID NO.3)；

上游引物P3：5′-GT

CCAAACGTAACACC-3′(SEQ ID NO.4)；

下游引物P4：5′-GA

GCAACCAGGCAGA-3′(SEQ ID NO.5)。

上述引物参照南京医科大学蒋春梅的硕士学位论文《丙型肝炎病毒F蛋白基因的克隆表达及初步应用研究》。其中P1、P3中斜粗体下划线部分为BamH I酶切位点，P4中斜粗体下划线部分为EcoR I酶切位点，为保证酶切位点的有效切割，在切割序列外侧设有保护性碱基。

2)PCR扩增反应

HCV-F(PCR总反应体系共20μl)：ddH₂O 13.7μl，10×PCR Buffer 2.0μl，MgCl₂(25mmol/l)1.2μl，dNTP Mixture(10mmol/l)0.2μl，上游引物(25μmol/L)0.2μl，下游引物(25μmol/L)0.2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，HCV cDNA(模板)2.0μl，合计20.0μl混匀。上述试剂加入PCR反应管中混匀后稍离心，进行PCR扩增。

第1轮用P3、P4作为引物扩增HCV cDNA，扩增条件：95℃预变性4min，95℃40s，55℃30s，72℃60s，共35个循环，扩增出20～160aa的序列。

再分别利用(P2、P4)和(P1、P4)两对引物进行第2轮和第3轮扩增，以加上0框前10个aa序列：

第2轮用P2、P4引物扩增第1轮的PCR产物，扩增条件：95℃40s，50℃30s，72℃60s，共35个循环；

第3轮用P1、P4引物扩增第2轮的PCR产物，。扩增条件：95℃40s，52℃30s，72℃60s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

取8μ.l扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶(含EB)电泳。

3)重组表达载体pGEX-4T-2-F的构建HCV-F(ddH₂O 27.0μl，Buffer 6.0μl，DNA25.0μl，BamH I 1.0μl，EcoR I 1.0μl)和pGEX-4T-2载体(ddH₂O 32.0μl，Buffer6.0μl，DNA 20.0μl，BamH I 1.0μl，EcoR I 1.0μl)用EcoR I及BamH I双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，按DNA胶回收试剂盒的操作说明回收目的片断。将回收的HCV-F基因和pGEX-4T-2载体用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，并转化用氯化钙法制备的感受态大肠杆菌TG1。在铺有IPTG及X-Gal的氨苄青霉素平板上于37℃培养过夜，次日进行蓝白菌落筛选。挑取白色菌落，以碱裂解法抽提质粒DNA，进行双酶切及测序鉴定为pGEX-4T-2-F重组表达载体。

4)融合蛋白的诱导表达及纯化将以pGEX-4T-2-F转化的大肠杆菌接种到LB培养基中(含有100mg/L的氨苄青霉素)，于37℃摇床振荡培养至A₆₀₀＝0.6～0.8左右。加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，于37℃诱导培养4h。收取菌液，于4℃以4000rpm离心10min，弃去上清，进行SDS-PAGE电泳。每1g大肠杆菌沉淀加入5mL冰浴的裂解缓冲液中(含有1ml/L的TritonX-100，1mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF的磷酸盐缓冲液，pH7.4)，用超声波细胞粉碎机破碎菌体，直至细胞悬浮液变得澄清(冰浴条件下进行)。将裂解液于4℃以12000rpm离心15min，收集上清液，与Glutathione Sepharose 4B混匀，于室温搅拌混匀。将混合液体缓缓加入亲和层析柱上，用10倍体积的PBS(pH7.4)洗涤柱子3次，再用洗脱液(10mmol/L还原型谷胱甘肽及50mmol/L的Tris-HCl，pH8.0)洗脱。室温静置10min后，收集洗脱下来的蛋白溶液，进行SDS-PAGE电泳鉴定(图1)，于-30℃保存备用。

实施例2、F蛋白抗体的纯化与鉴定

1)材料：HRP标记的羊抗鼠IgG购自南京阿恩地公司。6～8周龄BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，由南京军区军事医学研究所饲养。福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂均为sigma产品。Western blot试剂盒购自华美生物工程公司。

2)抗HCV-F抗体的制备分光光度计法测得纯化的HCV-F浓度是1μg/μL，按1∶1体积比混匀抗原和佐剂，用无菌注射器反复抽吸30min使其完全乳化。2只小鼠作为空白对照，8只进行免疫实验。第一周，初次免疫40μg/只的剂量对小鼠进行多点皮下注射乳化后的抗原和福氏完全佐剂。第三周，以20μg/只(抗原和福氏不完全佐剂)的剂量进行注射加强免疫。第二次免疫1周以后，剪鼠尾采血，用间接ELISA法检测抗体效价超过1∶10000。接着以剂量20μg/只(不加佐剂)加强免疫1次，1周后摘眼球取血。分离血清，-20℃保存。

3)间接ELISA测定抗体效价方阵滴定法确定包被抗原的稀释度是1∶100(浓度为10μg/ml)，每孔加入100μl用包被缓冲液1∶100稀释的抗原，湿盒4℃过夜，弃去孔内液体，加入封闭液，37℃放置1h。洗涤5次，加入100μl 1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶10000，1∶20000稀释的抗体和阴性对照(正常鼠血清)、空白对照(封闭液)，37℃放置1h。洗涤5次，每孔加入100μl，1∶3000稀释的HRP羊抗鼠IgG。37℃放置1h。每孔加入TMB底物A、B液各一滴，37℃避光显色15min，再分别加入2mol/L硫酸50μl终止反应，立即用酶标仪测定A₄₅₀值，测得血清抗体效价＞1∶10000。

4)抗HCV-F抗体的Western blot检测将融合蛋白经SDS-PAGE分离后再电转移至PVDF膜上。以5g/L脱脂奶粉封闭1h，依次滴加(1∶100)鼠抗HCV-F抗血清(室温反应2h，TBS洗涤4次)及(1∶1000)羊抗鼠IgG(室温反应2h，TBS洗涤4次)，然后用DAB溶液显色(图2)，双蒸水冲洗终止反应。

实施例3、噬菌体随机肽库筛选

1)M13噬菌体十二肽库(Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit)购自New England Biolabs公司

2)筛选方法：将稀释于包被液(碳酸缓冲溶液，pH 9.6)中的鼠抗HCV-F抗体(100μg/ml)包被酶标板，4℃过夜，加入封闭液4℃2-3小时，用TBST洗涤，甩干洗涤液。每孔加入稀释的噬菌体随机肽库，每轮加入的噬菌体数量均应在2×10^10-11CFU，室温孵育1小时，甩掉液体，用含0.1％吐温-20(v/v)的TBST缓冲液漂洗，最后用100μl pH 2.2甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱与F蛋白抗体特异性结合的噬菌体，并立即用10μl pH 9.8Tris缓冲液中和，取10μl进行噬菌体滴度测定，其余噬菌体转入新鲜菌液(ER2738OD＝0.2～0.4)中进行扩增，37℃4-5小时后，4℃，10000rpm离心10min，取上清重复离心一次，用PEG沉淀收获噬菌体，经梯度稀释滴定后投入下一轮筛选(图3)。第二轮筛选时，抗HCV-F抗体的包被浓度为50μg/ml，TBST漂洗液中吐温-20浓度为0.3％(v/v)。第三轮筛选时抗HCV-F抗体的包被浓度为20μg/mL，TBST漂洗液中吐温-20浓度为0.5％(v/v)。第四轮筛选时抗HCV-F抗体的包被浓度为10μg/ml，TBST漂洗液中吐温浓度为0.5％(v/v)。

实施例4、噬菌体滴度的测定

每轮筛选都必须对投入和洗脱下来的噬菌体进行滴定测定，计算产率。将待测噬菌体梯度(1∶10～1∶10¹²)稀释，加到含有大肠杆菌ER2738(OD为0.2～0.4)的LB培养基中，孵育1-5分钟，加入熔化的45℃顶层琼脂中，立即均匀铺于含X-gal和IPTG的底层LB琼脂板上。37℃过夜，计数蓝色克隆数并计算噬菌体滴度。生物淘洗的产率根据该公式进行计算：产率＝洗出噬菌体数/投入噬菌体数。随着淘筛的进行，洗脱下来的噬菌体与F蛋白抗体的亲和力越来越高，产率也逐渐升高，与F蛋白结合阳性的噬菌体克隆得到富集(表1)。

表1

Unit	第一轮	第二轮	第三轮	第四轮
					投入噬菌体数	6×109	3.6×109	1.8×1010	1.1×1010
洗出噬菌体数	9×103	2.2×104	1.95×105	2.8×105
					产率	1.5×10-6	6.1×10-6	1.1×10-5	2.5×10-5

实施例5、噬菌斑的扩增及噬菌体阳性克隆的鉴定

挑取在LB(Tet/IPTG/X-gal)平板上生长的ER2738单克隆于LB(Tet抗性)培养液中，37℃摇床250rpm扩增至OD₆₀₀＝0.4～0.5，用LB(Tet抗性)培养液1∶10稀释，每个试管中加入2ml。第四轮淘洗后的洗脱产物经梯度稀释滴定，挑取在LB平板(Tet/IPTG/X-gal)上生长的单个蓝色噬菌体克隆接种到含2ml大肠杆菌ER2738的LB培养液中，37℃摇床250rpm 4～5h。离心弃沉淀，上清用PEG沉淀噬菌体，并用等体积TBS重悬。将扩增重悬于TBS的噬菌体加入到包被抗HCV-F抗体的酶标板(10μg/mL)上，以空的M13噬菌体作阴性对照，37℃孵育1h，TBST漂洗三次，加入1∶5000倍稀释的HRP标记的鼠抗HCV-F抗血清，37℃孵育1h，漂洗后加OPD底物显色，酶标仪检测A₄₉₀。以P/N＞2.1者判为阳性，测得结果(图5)。

实施例6、阳性噬菌体克隆DNA序列的测定与分析

参照Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit的噬菌体单链DNA模板抽提方法提取ssDNA。用大肠杆菌ER2738对15个阳性噬菌体克隆进行扩增，当含有四环素的LB培养液中的大肠杆菌ER2738株处于对数生长初期(OD₆₀₀＝0.4～0.5)时，取5ml该菌液加入50μl单克隆噬菌体上清，37℃，250rpm摇4.5-5h；培养液4℃，10000rpm，离心5min，取上清重复离心一次，再取80％上清。取1ml噬菌体上清加入400μl PEG，4℃10min沉淀噬菌体；4℃，12000rpm离心10min，获得噬菌体沉淀；加入200μl Loddie Buffer(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，4M NaI，常温避光保存)，重悬噬菌体；加入500μl无水乙醇，混匀室温放置10min，12000rpm离心10min，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，室温干燥5min，将沉淀溶于30μl灭菌超纯水中，取5μl进行电泳分析(图4)，剩余的噬菌体单链模板用96gIII测序引物进行Sanger双脱氧法核酸序列自动测序，M13-96gIII测序引物序列为5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’(SEQ ID NO.6)。结果显示挑取的15个阳性噬菌体克隆插入的核酸序列完全一致，编码链序列均为5’-AAGCCGTCTGGTAATTTGGGTCCGGATGGTACTTCT-3’(SEQ ID NO.7)，根据噬菌体肽库说明书中提供的M13噬菌体密码子表，翻译出展示于阳性噬菌体表面的12肽为NH₂-Lys-Pro-Ser-Gly-Asn-Leu-Gly-Pro-Asp-Gly-Thr-Ser-COOH(SEQID NO.1)。

实施例7、阳性噬菌体克隆的特异性检测

竞争性抑制ELISA：将稀释于包被液(pH 9.6的碳酸盐缓冲液)中的抗HCV-F抗体(100μg/ml)包被96孔酶标板，4℃过夜，BSA封闭。纯化的重组F蛋白或抗HCV-F抗体与等体积的噬菌体培养上清混合，加入酶标板中37℃孵育1h。TBST漂洗三次，加入HRP标记的鼠抗M13单克隆抗体，37℃孵育1h，漂洗后加底物OPD显色15分钟，显色结束后用2M硫酸终止显色反应，酶标仪检测A₄₉₀。按如下公式计算竞争抑制率：[(A1-A2)/A1]×100％，A1为无抑制物竞争时的A₄₉₀，A2为有抑制物竞争时的A₄₉₀。阳性噬菌体克隆与重组F蛋白之间的特异性结合可被鼠抗HCV-F抗血清和重组F蛋白所抑制，竞争抑制率分别为68.3％和64.4％(如图5)。

实施例8、序列比对和分析

从NCBI蛋白质数据库上搜索不同来源的F蛋白氨基酸序列，用DNAstar中的MegAlign组件，将重组F蛋白和另外15个来源于不同基因型的丙肝病毒F蛋白的氨基酸序列与噬菌体阳性克隆的12肽序列进行比对。结果发现12个氨基酸残基与15个不同来源的丙肝病毒F蛋白序列一致，但并不连续(图6-1～图6-9)。这12个保守的氨基酸分别是Lys(6)、Pro(7)、Ser(24)、Gly(40)、Asn(63)、Leu(64)、Gly(74)、Pro(75)、Asp(95)、Gly(96)、Thr(111)、Ser(139)。由于一级结构上呈不连续性且距离较远(大约在133个氨基酸残基的范围内)，故不能确定为线性表位，此乃构象表位。

实施例9、衣壳蛋白gIII融合了F蛋白12肽抗原构象表位模拟肽的噬菌体的扩增

噬菌体12肽库是通过把随机12肽与噬菌体表面的gIII蛋白融合，将12肽表达在噬菌体衣壳蛋白gIII的N末端形成12肽-gIII融合蛋白，再经过噬菌体衣壳蛋白的装配，将12肽展示于噬菌体颗粒的表面。

用大肠杆菌ER2738对展示丙肝病毒F蛋白12肽抗原构象表位模拟肽的噬菌体克隆进行扩增，当含有四环素的LB培养液中的大肠杆菌ER2738株处于对数生长初期(OD₆₀₀＝0.4～0.5)时，取20ml该菌液加入200μl单克隆噬菌体上清，37℃，250rpm摇4.5～5h；培养液4℃，10000rpm，离心5min，取上清重复离心一次，再取80％上清。每毫升噬菌体上清加入400μl PEG，4℃10min沉淀噬菌体；4℃，12000rpm离心10min，获得噬菌体沉淀，用4ml生理盐水重悬。每个噬菌体衣壳蛋白gIII的N端都融合了丙肝病毒F蛋白12肽抗原构象表位模拟肽。

实施例10、丙型肝炎F抗体诊断试剂盒的构建

直接以人工合成的SEQ ID No.1所示的模拟抗原表位12肽作为抗原，以终浓度10μg/ml稀释于包被液(碳酸缓冲溶液，pH 9.6)中，以每孔100μl包被96孔酶标板，37℃，2h，PBST洗板三次，用5％脱脂奶粉，4℃封闭过夜；弃封闭液，PBST洗板3次，每孔加入100μl 1∶400倍稀释的经丙肝病毒F蛋白免疫的BALB/c小鼠抗血清，同时以等量1∶400倍稀释的免疫前小鼠血清做阴性对照，免疫血清和阴性对照血清各做3个重复孔，37℃孵育2小时，PBST洗板3次，每孔加入100μl 1∶1000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃温育1h，PBST洗板三次，以TMB显色试剂盒进行显色，酶标仪检测各孔A₄₅₀。免疫小鼠血清平均A₄₅₀为0.485，阴性对照血清平均A₄₅₀为0.102，符合P/N＞2.1的判断标准。

序列表

<110>  中国药科大学

 

<120>  一种丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽及其应用

 

<130> 

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  12

<212>  PRT

<213>  人工合成多肽

 

<400>  1

 

Lys Pro Ser Gly Asn Leu Gly Pro Asp Gly Thr Ser

1               5                   10          

 

 

<210>  2

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gtggatccag cacaaatcct aagcctcaga g                                    31

 

 

<210>  3

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ctaagcctca gagaaagcca aacgtaacac c                                    31

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gtggatcccc aaacgtaaca cc                                              22

 

 

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

gagaattcgc aaccaggcag a                                               21

 

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ccctcatagt tagcgtaacg                                                 20

 

 

<210>  7

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

aagccgtctg gtaatttggg tccggatggt acttct                               36

 

 

Claims (4)

1.一种丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽，其特征是由12个氨基酸残基构成的小肽，序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于序列如SEQ ID NO.7所示。

4.一种权利要求1所述的丙型肝炎病毒F蛋白的抗原构象表位模拟肽在制备丙型肝炎F抗体的诊断试剂中的应用。

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