CN104193827B - 一种丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原，该融合抗原氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，本发明还公开了所述融合抗原在制备丙型肝炎病毒HVR1抗体检测试剂盒中的应用。经实验验证，本发明的融合抗原较单片段HVR1抗原的交叉反应性有显著提高，与丙型肝炎病毒RNA阳性患者的检出符合率高达99％。由于HVR1是丙型肝炎病毒中的主要中和性抗原表位，因此，通过本发明抗原的应用，对于丙型肝炎病毒HVR1抗体检测，实现对HCV感染全面检测目的，以及用于HCV疾病的转归和预后、干扰素疗效的预测等问题均可得到有效解决，具有极大的临床应用前景。

Description

一种丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原及其应用

技术领域

本发明涉及丙型肝炎病毒抗原，尤其涉及一种丙型肝炎病毒第一高变区(HVR1)融合抗原及其在制备丙型肝炎病毒HVR1抗体检测试剂盒中的应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染最显著的临床特征就是引起慢性感染，约有70％的丙肝有可能发展成慢性肝炎，20％发展成肝硬化，12％发展成肝癌，危害十分地严重。全世界约有1.7亿人携带HCV，预计我国HCV感染者4300万，而且每年的新发病例数不断上升，感染率约为3.2％。

自1989年HCV基因获得克隆以来，人们一直在致力于疫苗的研究工作，但因病毒RNA在血液含量较低且非常不稳定，HCV基因组变异率较高(目前主要分为6种基因型：HCV1～HCV6)，病毒准种多，缺乏理想的体外感染细胞模型，导致预防性疫苗缺乏保护性抗体，不能阻止患者再次感染，使得疫苗研究进展缓慢，至今未能研制出有效的丙肝疫苗，造成了丙肝预防上的困难，发病率正呈逐渐上升趋势，流行范围也逐渐扩大。血液筛查是我国目前主要采取来控制丙肝蔓延的手段。这使得研究开发丙型肝炎病毒检测试剂盒十分迫切并具有重要的临床意义。

HCV基因组长约9.6kb,编码一个长约3000个氨基酸残基的多聚蛋白前体，在宿主信号肽酶和病毒自身编码蛋白酶的作用下生成4种结构蛋白(C、E1、E2、p7)和6种非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)，其中E1、E2为包膜糖蛋白，是中和抗体的主要靶抗原。丙型肝炎病毒第一高变区(HVR1，hypervariable region 1)位于E2包膜蛋白的N端，约27个残基，是HCV整个基因组中的变异最大的区域，并随着感染者体内免疫压力的变化HVR1序列呈现出不同的动态变化。目前，克隆测序的HVR1序列已经多达上千种，呈现出很强的多样性和复杂性。由于HVR1含有HCV重要的中和性抗原表位，感染者早期出现抗HVR1抗体与疾病的自愈有关(Zibert A,Meisel H,Kraas W,et al.Early antibody response againsthypervariable region 1 is associated with acute self-limiting infections ofhepatitis C virus.Hepatology.1997；25(5):1245-9.)。因此，对HVR1抗体的检测较HCV其他区抗体检测更具有临床诊断意义。然而，由于HVR1变异的复杂性，对HVR1抗体的检测目前主要通过对HVR1-RNA的钓取，合成相应的HVR1多肽进行检测。上述方法可以直接检测到相应的变异株的HVR1抗体。但由于HCV感染者存在RNA间歇阳性及早期病毒滴度低的特点，上述方法无法普遍应用于大多数HCV感染的HVR1抗体检测。

进一步研究发现HVR1抗原并不是严格的株特异性，而具有一定的交叉活性，即一条HVR1抗原可以和多份不同的HCV血清发生阳性反应。因此，可以通过获得一条能囊括大部分变异株的HVR1抗原解决膜区抗原的变异问题。美国Chiron公司在即将推出的第四代HCV免疫诊断试剂盒中，就加入了一段具有高交叉反应性的HVR1模拟肽，该抗原在临床HCV患者的血清中的交叉范围为69％，但在献血员HCV阳性血清中的覆盖面只能达到39％，远低于C区抗体的检测率(65％)。这显然是不能满足HCV诊断中对包被抗原的活性要求。修冰水等研究获得了12条重组HVR1肽抗原，用随机选择的27份我国HCV阳性血清进行交叉反应性检测，发现每条重组HVR1均和不止一份的阳性血清有反应。选择其中4条适合我国的交叉反应性较好的重组HVR1，其交叉反应率可覆盖27份阳性血清的25份(92.5％)(修冰水,凌世淦,宋晓国,张贺秋等丙型肝炎病毒第一高变区代表序列重组肽的交叉性研究，军事医学科学院院刊，2002，26(2)：93-98。军事医学科学院基础医学研究所，专利号:ZL 01141879.6)。基于此，利用筛选丙型肝炎病毒主要基因型的HVR1区序列，通过基因重组的方法，将筛选的基因型HVR1区抗原融合成一条融合多肽，获得了一条具有覆盖HCV所有基因型、高交叉反应的HVR1融合抗原有着极大的临床应用和开发前景。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种丙型肝炎病毒第一高变区(HVR1)融合抗原及其在制备丙型肝炎病毒HVR1抗体检测试剂盒中的应用。

本发明所述丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原，其特征在于：所述融合抗原氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体描述是：

STYATGGAAGRETSTWAGLFNPGAAQKGGGGSGGGGSGGGGSTTYTTAGSAARATYTLTSLFKTGPKQKGGGGSGGGGSGGGGSETHVTGGTAAHGALGITSLLSRGPKQNGGGGSGGGGSGGGGSGTHVTGGKAGHTIHGFTSLFTRGSAQNGGGGSGGGGSGGGGSSTHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQKGGGGSGGGGSGGGGSTTYVSGGASGFNTHVFTGIFSSGASQK。

上述丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原的氨基酸序列构建方法，其特征在于：将筛选确定的如下6种丙型肝炎病毒HCV1～HCV6基因型第一高变区抗原，在其氨基酸序列间加入柔性短肽序列，使其连接成为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的融合抗原；其中，

所述6种丙型肝炎病毒HCV1～HCV6基因型第一高变区抗原氨基酸序列如下：

①STYATGGAAGRETSTWAGLFNPGAAQK

②TTYTTAGSAARATYTLTSLFKTGPKQK

③ETHVTGGTAAHGALGITSLLSRGPKQN

④GTHVTGGKAG HTIHGFTSLFTRGSAQN

⑤STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQK

⑥TTYVSGGASG FNTHVFTGIF SSGASQK；

所述柔性短肽氨基酸序列如下：

GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY。

为实现上述目的，申请人查找阅读了HCV sequences database(http://hepatitis.ibcp.fr.)，通过序列对比，筛选出6条分属于HCV 6种基因型的HVR1抗原序列。

为了有利于多型别HVR1融合抗原基因在E.coli中获得高效的表达，本发明选择大肠杆菌的偏好性密码子设计并合成多型别HVR1融合抗原基因。为了使获得的抗原具有良好的生物活性，本发明在各个HVR1基因片段间加入GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY柔性肽；为了便于基因克隆到表达载体，在融合基因两端引入BamHI和Xho I两个酶切位点，以适合表达载体pET28a。双酶切后插入载体pET28a中，构建相应的表达质粒。构建后的表达质粒需用PCR法鉴定，以证明多型别HVR1融合抗原基因片段已获正确插入。

将获得的多型别HVR1融合抗原表达质粒，转化E.coli BL21后，通过IPTG诱导培养，取全菌液进行SDS-PAGE鉴定，证明多型别HVR1融合抗原已得到高效表达，再经过亲和纯化和离子交换柱纯化，可获得高纯度的多型别HVR1融合抗原，即本发明所述的丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原。

本发明所述丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原在制备丙型肝炎病毒HVR1抗体检测试剂盒中的应用。

在获得本发明所述的丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原的前提下，利用该多型别HVR1融合抗原以酶联免疫法为基础即可制作出的丙型肝炎病毒HVR1抗体检测试剂盒，其不仅可以有效的避开PCR法的弊端，同时又能够消除因HCV在感染者体内变异造成的漏检现象，并且具有操作简单、重复性好等特点，在临床上具有很大的应用和推广价值。

实验结果证明，本发明提供的丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原(即多型别HVR1融合抗原)与随机HCV感染者血清的交叉反应率高达99％。

本发明经设计查找、筛选丙型肝炎病毒6种主要基因型的HVR1区序列，通过基因重组的方法，将6种基因型HVR1区抗原融合成一条融合多肽，获得了一条具有覆盖HCV所有基因型、高交叉反应的HVR1抗原。并在此基础上研制了一种基于HVR1融合抗原的检测HVR1抗体检测试剂盒。研究证实，将6条HVR1序列通过加入柔性肽方法连接后获得的融合抗原较单片段HVR1抗原的交叉反应性有显著提高，与丙型肝炎病毒RNA阳性患者的检出符合率高达99％。由于HVR1是丙型肝炎病毒中的主要中和性抗原表位，因此，通过本发明抗原的应用，对于丙型肝炎病毒HVR1抗体检测，实现对HCV感染全面检测目的，以及用于HCV疾病的转归和预后、干扰素疗效的预测等问题均可得到有效解决，具有极大的临床应用前景。

综上，与现有技术比，本发明技术具有以下突出特点：

(1)多型别HVR1融合抗原的筛选是通过生物信息学技术实现的

由于HCV HRV1的变异性特别高，不可能一一对活性做出判断。本发明利用生物信息学技术，根据HCV 6种基因型氨基酸序列同源性，对大量HVR1序列进行筛选，最终得到6条分属于6种基因型的HVR1片段。

(2)多型别HVR1抗原融合抗原具有极高的阳性血清覆盖率

本发明将HCV 6种基因型的具有高交叉反应性的HVR1序列，通过加入柔性肽方法使各基因型HVR1抗原在空间上保持相对独立，最大限度保持了各基因型HVR1抗原的生物活性，进而可以结合不同HCV基因型HCV感染者血清中的HVR1中和性抗体。在临床上适用于检测不同HCV基因型HCV感染者筛查工作，不易造成漏检。

(3)多型别HVR1抗原融合抗原应用于丙型肝炎病毒HVR1抗体检测试剂盒的研制

目前，我国主要采取血液筛查来达到控制HCV蔓延的目的。现行的血液检测主要通过RT-PCR、酶联免疫法进行筛查。但由于HCV感染者存在RNA间歇阳性及早期病毒滴度低的特点，且RT-PCR操作复杂，对样本质量要求高容易造成假阳性或假阴性结果，无法满足大多数临床需求。

附图说明

图1：纯化后的多型别HVR1融合抗原SDS-PAGE图

其中：M为Mark，1为多型别HVR1融合抗原电泳条带。

具体实施方式

实施例1：候选抗原表位的选择

申请人通过查找HCV sequences database(http://hepatitis.ibcp.fr.)，对HCV6种基因型的共1700条HVR1序列进行分析，根据氨基酸序列的同源性，依次分筛选出6条分属于HCV 6种基因型的HVR1抗原序列。其中，所述6种丙型肝炎病毒HCV1～HCV6基因型第一高变区(HVR1)抗原氨基酸序列如下：

①STYATGGAAGRETSTWAGLFNPGAAQK

②TTYTTAGSAARATYTLTSLFKTGPKQK

③ETHVTGGTAAHGALGITSLLSRGPKQN

④GTHVTGGKAG HTIHGFTSLFTRGSAQN

⑤STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQK

⑥TTYVSGGASG FNTHVFTGIF SSGASQK。

实施例2：多型别HVR1融合抗原即丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原的克隆与表达

1.多型别HVR1融合抗原表达质粒的构建

1.1多型别HVR1融合抗原的合成及多型别HVR1融合抗原基因序列合成

根据实施例1所述6条分属于HCV 6种基因型的HVR1抗原氨基酸序列，委托上海捷瑞生物工程有限公司分别合成各基因型HVR1多肽。

利用基因重组方法，将实施例1所述6条分属于HCV 6种基因型的HVR1抗原氨基酸序列加入柔性短肽(GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY，优选GGGGSGGGGSGGGGS)使其连接在一起(其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)，采用大肠杆菌偏好密码子，将氨基酸序列翻译成核苷酸序列，分别在5’端和3’端引入BamHI和Xho I两个酶切位点，并委托上海捷瑞生物工程有限公司合成上述多型别HVR1融合抗原序列的基因及本发明所述丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原序列的基因。

1.2多型别HVR1融合抗原表达质粒的构建

1.2.1合成多型别HVR1融合抗原基因序列及表达载体pET28a的双酶切

取以上合成基因产物及pET28a表达载体各30ul分别置于1.5ml Eppendorf离心管中，加入10×buffer5ul、BamHI(10U/ul)和Xho I(10U/ul)各3ul，加入灭菌蒸馏水4ul，置37℃水浴酶切3小时。

酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收：合成基因及pET28a表达载体双酶切后产物按照TaKaRa DNA凝胶回收试剂盒产品说明书进行。

1.2.2连接：于灭菌Eppendorf离心管中加入上述酶切后的载体和目的基因各2ul、10×T4DNA Ligase buffer 2ul、T4 DNA Ligase(5U/ul)1ul，加入灭菌蒸馏水至20ul，置16℃过夜。

1.2.3转化：在超净工作台中，用无菌吸头吸取100ul感受态细胞(感受态细胞按照《分子克隆》(科学出版社，第三版)的方法进行)悬液于Eppendorf中，加入上述连接产物10ul，轻轻涡旋混匀，冰浴30分钟。立即转移到42℃水浴中放置2分钟，每管加入0.5ml LB培养基，37℃温箱振荡培养60分钟，吸取培养液涂布与LB培养基上(含抗生素)，置37℃温箱倒置培养过夜。

1.2.4阳性重组子的筛选：各挑取上述培养过夜的平皿中的单克隆菌落，接种于5ml LB液体培养基(含抗生素)中，37℃温箱振荡培养5小时。保存各单克隆菌液并提取质粒(按照《分子克隆》(科学出版社，第三版)的方法进行)。提取后的质粒用BamHI和Xho I酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

2多型别HVR1融合抗原的表达与纯化

2.1表达菌株的培养：取上述阳性表达菌株单克隆菌液20ul接种于100ml LB培养基中，37℃温箱振荡培养过夜。次日，按照1％接种比例转种于LB培养基，37℃温箱振荡培养3小时，当OD₆₀₀值达到0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养，终浓度1mmol/L，37℃温箱振荡培养5小时。将菌液合并，6000rpm离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。

2.2提取包涵体：将沉淀称湿重，用10倍体积的20mmol/L，pH8.0Tris缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声破碎菌体。12000rpm，离心10分钟，其上清，沉淀用1mol/L NaCl洗1次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M尿素(用20mmol/L，pH8.0Tris配制)溶解，加入1‰DTT，于4℃，12000rpm，离心10分钟，去沉淀取上清。

2.3纯化：将上述包涵体溶解液过S-Sepharose柱阶段梯度洗脱，用不同浓度的NaCl(用平衡器配制)洗脱，收集0.15M NaCl洗脱峰，再经Sephadex G50柱脱盐，收集第一个洗脱峰。重组多型别HVR1融合抗原用SDS-PAGE鉴定。结果见图1。

3多型别HVR1融合抗原活性鉴定

首先将得到的HCV 1-6型基因型HVR1抗原多肽分别作活性鉴定。

目前，我国HCV感染患者以HCV 1b、HCV 2a型为主，为尽可能多的检测出HVR1抗体，因此，初步进行HVR1抗原多肽试验组合计划是1型和2型HVR1多肽。我们用pH7.4的磷酸盐缓冲液分别将1型和2型HVR1多肽稀释到5.0ug/ml，包被ELISA测定板，经封闭后，对收集的50例HCV阳性血清(经HCV RNA检测确定)进行检测。结果如表1。

结果表明，在50例样本中可以检出47例HVR1抗体阳性标本，还有3例未检出。这说明我国HCV患者中还有其他基因型患者。单纯依靠1型和2型多肽检测容易造成漏检可能。

表1：1型和2型HVR1多肽包被测定板检测血清结果

基于以上结果，迫切需要获得了一种具有覆盖HCV所有基因型、高交叉反应的HVR1抗原。利用本发明纯化的多型别HVR1融合抗原实施检测以期获得更高的检出率。

进一步的，

将纯化的多型别HVR1融合抗原，用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到5.0ug/ml，包被ELISA测定板，经封闭后，对收集的90份HCV阳性血清(经HCV RNA检测确定)，90份阴性血清进行测定。结果如表2所示。

由检测结果表明：本发明抗原包被的酶联免疫吸附板可以检出89份HCV阳性血清，符合率高达98.89％。此外，我们又采集了180例非HCV疾病类交叉样本进行了普检，主要包括HBsAg、抗TP、抗HIV、TORCH系列。结果(见表3)未出现假阳性病例，说明本发明抗原特异性良好。可以确定，采用本发明抗原可以大大降低通过ELISA法检测HCV的漏检率。

表2：多型别HVR1抗原检测板检测血清结果

表3多型别HVR1抗原检测板检测抗干扰血清检测结果

Claims (3)

1.一种丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原，其特征在于：所述融合抗原氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体描述是：

STYATGGAAGRETSTWAGLFNPGAAQKGGGGSGGGGSGGGGSTTYTTAGSAARATYTLTSLFKTGPKQKGGGGSGGGGSGGGGSETHVTGGTAAHGALGITSLLSRGPKQNGGGGSGGGGSGGGGSGTHVTGGKAGHTIHGFTSLFTRGSAQNGGGGSGGGGSGGGGSSTHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQKGGGGSGGGGSGGGGSTTYVSGGASGFNTHVFTGIFSSGASQK。

2.如权利要求1所述丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原，其特征在于：所述融合抗原的氨基酸序列包含筛选确定的如下分别属于6种丙型肝炎病毒HCV I～HCV VI基因型的第一高变区抗原，其氨基酸序列分别为：

HCV I型：STYATGGAAGRETSTWAGLFNPGAAQK

HCV II型：TTYTTAGSAARATYTLTSLFKTGPKQK

HCV III型：ETHVTGGTAAHGALGITSLLSRGPKQN

HCV IV型：GTHVTGGKAG HTIHGFTSLFTRGSAQN

HCV V型：STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQK

HCV VI型：TTYVSGGASG FNTHVFTGIF SSGASQK。

3.权利要求1所述丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原在制备丙型肝炎病毒HVR1抗体检测试剂盒中的应用。