KR100330278B1 - 간염c바이러스의타이핑방법및사용시약 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간염 C 바이러스의 타이핑 방법 및 타이핑 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

Description

간염 C 바이러스의 타이핑 방법 및 사용 시약

본 발명은 간임 C 바이러스 (HCV)의 타이핑에 관한 것이다. 특히 본 발명은 유형-의존적인 신규한 펩티드를 이용한 HCV의 타이핑 방법에 관한 것이다.

배경

바이러스 간염은 간염 A, B, C, D 및 E로 알려진 5 가지 다른 바이러스에 의해 야기되는 것으로 알려져 있다. HAV는 RNA 바이러스이고 장기간의 임상 증후를 유도하지는 않는다. HBV는 DNA 바이러스이다. HDV는 HBV의 부재하에서는 세포를 감염시킬 수 없는 의존적인 바이러스이다. HEV는 물이 운반하는 바이러스이다. HCV는 비-A, 비-B 간염 (NANBH)의 원인으로 처음 확인되었고 특성규명되었다. Houghton et al., EOO Pub. 제 388,232호, 이것은 HCV의 확인시에 면역 시약으로서 유용한 다수의 일반적이고 특이적인 폴리펩티드의 개시를 유도하였다. 예를들면, Choo et al. (1989) Science, 244: 359-362: Kuo et al., 1989 Science, 244: 362-364: 및 Houghton et al., (1991) Hepatology 14: 381-388 참조 HCV는 혈액 수혈-관련 간염의 주요 원인이다.

HCV의 원형 분리물은 EP 공개공보 제 318,216호 및 제 388,232호에 특성규명 되어있다. 여기에서 이용될 때 용어 "HCV"는 새롭게 분리된 NANBH 바이러스 종을 포함한다. 용어 "HCV-1"은 상기에서 언급된 공개공보에서 기술된 바이러스에 관한것이다.

HCV의 초기 확인 이후로 적어도 6가지 다른 바이러스 유형이 확인되었고 HCV-1 내지 HCV-6으로 표시되었다. Cha et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7144- 7148. 이들 유형내에 많은 서브유형이 있다. 환자가 감염되는 바이러스의 유형은 임상 진단과 또한 다양한 치료에 대한 반응에 영향을 줄 것이다. Yoshioka et al. (1992) Hepatology 16:293-299. 가장 심각한 HCV 감염의 임상 결과가 간세포 종양이라는 점에 비추어 볼 때, 환자가 어떠한 유형의 HCV로 감염되었는지를 결정할 수 있다면 유용할 것이다.

바이러스 유형의 결정에 현재 이용되는 방법은 유전자 타이핑: 즉, 바이러스를 분리하고 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 다양한 단편의 서열을 결정하는 것이다. 이것은 힘이 들고 시간 소비적인 방법일 뿐만 아니라 RNA 보존을 가능케 하지 않는 조건하에서 저장된 샘플이나 또는 충분한 바이러스 역가를 갖지 않는 환자로부터의 샘플에 이용하기에 적당하지 않다. 이것은 면역 분석이나 혈청 타이핑에 의해 HCV을 타이핑하는 방법에 유용할 것이다.

혈액을 스크리닝하고 환자를 진단하기 위한 현재의 방법은 면역 분석이다. 면역 분석은 다른 유형의 HCV에 대한 항체를 검출하기에 충분한 수의 보편 에피토프를 포함하는 HCV-1으로부터의 항원을 이용한다. 면역 분석은 상이한 유형들의 HCV에 의한 감염을 구별하지 않는다.

제 1도는 혈청타이핑의 실험방법의 흐름도이다.

제 2도는 포괄적인 에피토프 맵핑 방법의 흐름도이다.

제 3도는 HCV 1a (Rodney)의 에피토프 맵핑의 결과를 도시하는 그래프의 수집이다.

제 4도는 HCV 2b (Nomoto)의 에피토프 맵핑의 결과를 도시하는 그래프의 수집이다.

발명의 개시

본 발명은 유전자형과 혈청형에 의해 HCV를 타이핑하기 위한 조성물과 방법을 포함한다. 조성물은 유형 특이적 에피토프, 유형-집단 특이적 에피토프, 프로브로서의 이용을 위한 에피토프를 암호화하는 핵산 및 프라이머로서의 이용을 위한 에피토프를 암호화하는 영역의 측면에 위치하는 영역에 대해 상보적인 핵산을 포함한다.

본 발명의 한 측면은 개체로부터 항체-포함 샘플을 제공하는 단계; 항원-항체 결합을 허용하는 조건하에서 유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토르와 샘플을 접촉시키는 단계; 및 샘플중의 항체가 에피토프에 결합하는지를 측정하는 단계로 이루어진 HCV의 타이핑 방법이다.

본 발명의 다른 태양은 개체로부터 항체-포함 샘플을 제공하는 단계; 항원-항체 결합을 허용하는 조건하에서 첫번째의 유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토프와 샘플을 접촉시기는 단계: 항원-항체 결합을 허용하는 조건하에서두번째의 유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토프와 샘플을 접촉시키는 단계; 및 샘플중의 항체가 첫번째나 아니면 두번째 에피토프에 결합하는지 여부를 측정하는 단계로 이루어진 HCV를 타이핑하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 태양은 유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토프를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 폴리펩티드는 HCV 게놈의 세가지 상이한 영역으로부터 유래된다. 한 세트의 폴리펩티드는 HCV 코어 영역으로부터 얻은 유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토프를 포함한다. 이 첫번째 세트는 HCV-1의 아미노산 잔기 67과 84 사이 및 다른 유형의 HCV의 상동영역에서 발견된다. 여기에서 이용되는 아미노산 잔기 약자는 다음과 같다: A. 알라닌: I. 이소류신: L. 류신: M. 메티오닌: F. 페닐알라닌: P. 프롤린: W. 트립토판: V. 발린: N. 아스파라긴: C. 시스테인: Q. 글루타민: G. 글리신: S. 세린: T. 트레오닌: Y. 티로신: R. 아르기닌: H. 히스티딘: K. 리신: D. 아스파르트산: 및 E. 글루탐산.

코어 영역으로부터 유래된 특정 아미노산 잔기 서열과 이들이 유래된 서브유형은 다음과 같다.

1. PEGRTWAQ 서브유형 1a 또는 1b.

2. STGKSWGK. 서브유형 2a 또는 2b.

3. SEGRSWAQ. 서브유형 3a 또는 4.

다른 세트의 폴리펩티드는 HCV 비-구조 영역 4 (NS4)로부터 얻은 유형 특이적 에피토프를 포함한다. 이 두번째 세트는 HCV-1의 아미노산 잔기 1689-1718 사이 및 다른 유형의 HCV 상동 영역에서 발견된다.

특정 아미노산 잔기 서열과 이들이 유래되는 유형이나 서브유형은 다음과 같다:

1. CSQHLPY. 서브유형 1a.

2. CASHLPY. 서브유형 1b.

3. CASRAAL. 서브유형 2a 또는 2b.

다른 세트의 폴리펩티드는 간염 C 바이러스의 비-구조 영역 5 (NS5)로부터 얻은 유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토프를 포함한다. 이 세트는 HCV-1의 아미노산 잔기 2281-2313 사이 및 다른 유형의 간염 C 바이러스의 상동영역에서 발견된다.

특정 아미노산 잔기 서열과 이들이 유래되는 유형이나 서브유형은 다음과 같다.

1. PDYEPPVVHG. 서브유형 1a.

2. PDYVPPVVHG. 서브유형 1b.

3. PDYQPATVAG. 서브유형 2a.

4. PGYEPPTVLG. 서브유형 2b.

5. FAQASPVW. 서브유형 1a.

6. FPPQALPIW. 서브유형 1b.

7. FPQALPAW. 서브유형 2a.

8. FPPQALPPW. 서브유형 2b.

본 발명이 다른 태양은 기술된 유형 특이적 및 유형-집단 에피토프의 아미노산 잔기 서열을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 이들 핵산 분자는 예를 들면 서던블러트나 미국 특허 제 4,868,105호: 및 제 5,124,246에서 기술된 포획 분석과 같은 다른 DNA 인식 분석에서 프로브로서 유용하다.

본 발명의 다른 관점은 유형 특이적 및 유형-집단 특이적 에피토프를 암호화하는 영역의 측면에 위치하는 핵산 서열에 대해 상보적인 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 특정 HCV의 유전자형을 결정하기 위해 PCR을 수행하는데 유용하다.

정의

"간염 C 바이러스"나 "HCV"는 NANBH를 일으키는 병원균 유형의 바이러스 종 및 이들로부터 유래되는 약화된 유형이나 결함있는 입자에 관한 것이다. "배경"으로 제목 붙여진 절에서 인용된 출판물을 참조. HCV 게놈은 RNA로 이루어져 있다. 바이러스를 포함하는 RNA는 보고에 의하면 삽입된 뉴클레오티드 당 10^-3내지 10^-4차수의 비교적 높은 비율의 자연 돌연변이를 갗는다. Fields & Knipe (1986) "기초바이러스학" (Raven Press, NY). 유전자형의 이질성과 유동성은 RNA 바이러스에 고유한 특성이기 때문에 전염성이거나 비전염성일 수도 있는 HCV 종내에는 복합 유형/서브유형이 있다. 다양한 HCV 유형이나 분리물의 증식, 확인,검출 및 분리는 문헌에서 기록되어 있다. 여기에서 도해된 바와 같이 모든 뉴클레오티드의 아미노산 잔기 서열은 지시된 HCV 유형으로부터 유래된다. HCV-1 게놈과 아미노산 잔기 서열의 수는 Choo et al. (1990) Brit Med Bull., 46: 423-441에서 기술된 바와 같다. 개시물은 다양한 유형의 진단을 허용한다.

여기에서 이용될 때 "유형"은 유전자형이 약 30% 이상 다른 HCV를 말하고 "서브유형"은 유전자형이 약 10-20% 이상 다른 HCV를 말하며 "분리물"은 유전자형이 약 10% 미만 다른 HCV를 말한다. "타이핑"은 HCV의 한 유형과 다른 유형을 구별하는 것을 말한다.

몇몇 다른 HCV 유형/서브유형에 대한 정보는 국제 공개공보 제 WO93/00365호의 특정유형 또는 서브유형 CDC/HCV1 (또한 소위 HCV-1)에 개시되어 있다. 부분적인 게놈이나 아미노산서열과 같이 한 유형이나 서브유형으로부터의 정보는 기술분야에서 통산의 기술을 가진자가 새로운 유형의 HCV를 분리할 수 있도록 하는 데에 충분하다. 예를 들면 HCV의 몇몇 다른 유형은 하기에서 기술된 바와 같이 스크린하였다. 다수의 사람 혈청으로부터(및 다른 지리적 영역으로부터) 얻은 이들 유형은 여기에서 기술된 방법과 시약을 이용하여 타이핑하였다.

HCV-1 게놈 RNA의 게놈 구조와 뉴클레오티드 서열을 추정하였다. 게놈은 10,000 뉴클레오티드를 포함하는 단일-가닥 RNA인 것으로 보인다. 게놈은 포지티브-가닥이고 약 3,000 아미노산의 폴리단백질을 암호화하는 연속적인 번역의 개방형 해독틀 (ORF)을 가지고 있다. ORF 에서 대부분의 폴리단백질은 비-구조(NS) 단백질에 필요하며, 구조 단백질은 아미노-말단 영역의 약 최초 1/4에서 암호화되는 것 같다. 알려진 모든 바이러스 서열과 비교할 때 작지만 중요한 공직선적 유사성이 플라비 바이러스과의 비-구조(NS) 단백질과 페스티 바이러스 (지금은 또한 플라비 바이러스과의 부분으로 여겨지는)에서 관찰된다.

HCV-1의 뉴클레오티드 서열에서 암호화되는 추정 아미노산 잔기와 다른 증거에 기초하여 대략적인 경계뿐만 아니라 암호화된 HCV 폴리단백질의 가능한 단백질 도메인이 표 1에 제시되어 있다.

[표 1]

이들 도메인은 불확실하다. 예를 들면 E1-NS2 경계는 750-810 영역에 있고 NS3-NS4 경계는 약 1640-1650이다. 또한 C의 191 아미노산(aa) 버젼은 약 170 aa 길이로 더 진행되는 전구체이고, NS2 NS4 및 NS5 단백질은 각각 2개의 성숙 단백질로 더 진행된다는 증거가 있다.

다른 유형의 HCV는 예를 들면 HCV-1과 크기가 유사한 폴리단백질을 암호화하는 약 9.000 뉴클레오티드 내지 약 12.000 뉴클레오티드의 ORF. HCV-1의 특성과 유사한 소수성 및/또는 항원 특성의 암호화된 폴리단백질, 및 HCV-1로 보존되는 공-직선성 폴리펩티드 서열의 존재와 같은 다양한 범주에 따라 정의된다.

핵산 유사성과 아미노산 유사성의 다음 파라미터는 단독으로 아니면 조합하여 HCV 유형의 확인시에 적용할 수 있다. 일반적으로 상기에서 기술된 바와 같이 상이한 유형의 HCV는 약 70% 유사한 반면 서브유형은 약 80-90% 유사하고 분리물은 약 90% 유사하다.

여기에서 사용된 지시된 서열"로부터 유래된" 폴리뉴클레오티드는 지시된 뉴클레오티드서열 영역에 해당하는 적어도 약 6 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 약 8 뉴클레오티드 더 바람직하게는 적어도 약 10-12 뉴클레오티드, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 15-20 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. "해당하는"은 지시된 서열에 대해 유사하거나 상보적인 것을 의미한다. 바람직하게는 폴리뉴클레오티드가 유래된 영역의 서열은 HCV 게놈에 특유한 서열에 대해 유사하거나 상보적이다. 핵산 서열의 상보성을 결정하는 혼성화 기술이 이 분야에서 알려져 있다. 예를 들면 Maniatis et al. (1982)참조. 게다가 혼성화에 의해 형성된 이중체 폴리뉴클레오티드의 미스매치는 결합은 예를 들면 이중체 폴리뉴클레오티드에서 단일-가닥 영역을 특이적으로 분해시키는 S1과 같은 뉴클레아제로 분해하는 것을 포함하여 공지 기술에 의해 결정될 수 있다. 보통의 DNA 서열이 "유래될" 수 있는 영역은 예를 들면 유형 특이적 에피토프를 암호화하는 영역 이외에도 비-전사 및/또는 비-번역 영역을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다.

유래된 폴리뉴클레오티드는 나타나 있는 뉴클레오티드 서열의 반드시 물리적으로 유래된 형태일 필요는 없고 예를 들면 화학 합성이나 DNA 복제 또는 역전사또는 전사를 포함하여 어떠한 방식으로도 생성될 수도 있다. 게다가 지시된 서열의 영역에 해당하는 영역의 조합은 이 분야에서 의도된 이용과 일치하는 것으로 알려진 방식으로 변형될 수도 있다.

유사하게, 지시된 아미노산이나 핵산 서열로부터 "유래된" 폴리펩티드나 아미노산 서열은 서열에서 암호화된 폴리펩티드의 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드나 이들의 부분을 말하는데, 이들 부분은 적어도 3-5 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 8-10 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 11-15 아미노산으로 이루어져 있거나, 또는 이들은 서열에서 암호화된 폴리펩티드와 면역학적으로 동일한 것으로 인정할 수 있다. 이 용어는 또한 지시된 핵산 서열로부터 발현된 폴리펩티드를 포함한다.

재조합 또는 유래된 폴리펩티드는 반드시 지시된 핵산 서열로부터 번역될 필요는 없다: 이것은 예를 들면 화학 합성이나 재조합 발현 시스템의 발현, 또는 돌연변이된 HCV를 포함한 HCV로부터의 분리를 포함하여 어떠한 방식으로도 생성될 수 있다. 여기에서 기술된 폴리펩티드는 일반적으로 비교적 짧고 따라서 쉽게 화학 합성된다.

재조합 또는 유래된 폴리펩티드는 그 서열내에 한가지 이상의 아미노산 유사체나 본래의 것이 아닌 아미노산을 포함할 수 있다. 서열로 아미노산 유사체를 삽입하는 방법이 이 분야에서 알려져 있다. 이것은 또한 한가지 이상의 표지를 포함할 수도 있는데 이 분야의 전문가에게 알려져 있다. 유사체와 "미모토프(mimotope)"의 상세한 기술은 U.S. 특허 제 5,194,392호에서 찾을 수 있다.

펩티드 유사체는 HCV 타이핑 능력을 보유하는 이들의 결실, 첨가, 치환 또는 변형을 포함한다. 바람직한 "치환"은 보존적인 것인데, 즉 동일한 일반형의 다른 것에 의해 잔기가 치환된 것이다. 잘 알려져 있는 바와 같이 자연-발생 아미노산은 산성, 염기성, 중성과 극성 또는 중성과 비극성으로 아분류될 수 있다. 더욱이 암호화된 세가지 아미노산은 방향족이다. 자연적 에피토프와 다른 암호화된 폴리펩티드는 치환된 아미노산의 코돈과 동일한 군으로부터 유래된 아미노산 대신 치환된 코돈을 포함하는 것이 바람직하다. 따라서 일반적으로 염기성 아미노산인 Lys, Arg 및 His는 상호 교환할 수 있고, 산성 아미노산인 아스파르트산과 글루탐산은 상호 교환할 수 있고, 중성 극성 아미노산인 Ser. Thr, Cys. Gln. 및 Asn은 상호 교환할 수 있고, 비극성 지방족 아미노산인 Gly, Ala. Val. Ile 및 Leu는 각각 서로에 대해서 보존적이고(그러나 크기 때문에 Gly와 Ala는 더 밀접하게 관련되어 있고, Val. Ile 및 Leu이 더 밀접하게 관련되어 있다) 방향족 아미노산인 Phe, Trp 및 Tyr은 상호 교환할 수 있다. 반면에 프롤린은 비극성 중성 아미노산인데 구조에 미치는 이것의 효과 때문에 어려움을 나타내고 프롤린에 의한 치환이나 프롤린에 대한 치환은 동일하거나 유사한 구조적 결과를 얻을 수 있을 때를 제외하고는 바람직하지 않다. 보존적인 변화를 나타내는 극성 아미노산은 Ser. Thr. Gln. Asn: 및 더 적은 정도로 Met을 포함한다. 게다가 다른 범주로 분류될 수 있지만 Ala. Gly 및 Ser은 상호 교환할 수 있는 것 같고 Cys는 부가적으로 이 군에 적합하거나 극성 중성 아미노산으로 분류될 수도 있다.

만약 폴리펩티드가 합성적으로 만들어진다면 유전자에 의해 암호화되지 않은 아미노산에 의한 치환이 또한 만들어질 수도 있다는 것이 주의되어야 한다. 선택적인 잔기는, 예를 들면 n이 2-6일 때 식 H₂N(CH₂)_nCOOH의 오메가 아미노산을 포함한다. 이들은 사코신 (Sar) t-부틸 알라닌 (t-BuA), t-부틸 글리신 (t-BuG), N-메틸 Iie (N-MeIle) 및 노르류신 (Nle)과 같이 중성, 비극성 아미노산이다. 예를 들면 페닐 글리신은 방향족 중성 아미노산인 Trp, Tyr 또는 Phe 대신 치환될 수 있다; 시트룰린 (Cit)과 메티오닌 설폭시드 (MSO)는 극성이지만 중성이고 시클로헥실 알라닌 (Cha)는 중성이고 비극성이며, 시스테인산 (Cya)은 산성이고 오르니틴 (Orn)은 염기성이다. 프롤린 잔기의 특성을 부여하는 구조는 이들의 한가지 이상이 히드록시프롤린 (Hyp)에 의해 치환된다면 유지될 수도 있다.

용어 "재조합 폴리뉴클레오티드"가 여기에서 이용될 때 게놈, cDNA, 반합성 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의도하는데: 이들은 그 기원이나 조작에 의하여 (1) 본래 연관되어 있는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 연관되어 있지 않거나 (2) 본래 연결되어 있는 폴리뉴클레오티드 이외의 다른 폴리뉴클레오티드에 연결되어 있거나, (3) 자연적으로 발생하기 않는다.

여기에서 이용될 때 용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드나 아니면 디옥시리보뉴클레오티드의 어떠한 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태를 말한다. 이 용어는 분자의 1차구조만을 말한다. 따라서 이 용어는 이중-및 단일-가닥 DNA와 RNA를 포함한다. 이것은 또한 폴리뉴클레오티드의 변형되지 않은 형태뿐만 아니라알려진 유형의 변형, 예를 들면 이 분야에서 알려진 표지, 메틸화, "캡", 한가지 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 내부 폴리뉴클레오티드 변형, 예를 들면 전하를 띄지 않는 연결 (즉, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카바메이트 등)을 갖는 변형과 전하를 띤 연결 (즉, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 변형 예를 들면 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩티드 및 폴리-L-리신을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는 단백질과 같은 팬던트 부위를 포함하는 변형: 인터칼레이터 (즉, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 변형 킬레이터 (즉, 금속, 방사능금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 포함하는 변형, 알킬레이터를 포함하는 변형, 변형된 연결 (즉, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 변형을 포함함다. 여기에서 기술된 폴리뉴클레오티드는 비교적 짧고 따라서 가장 용이하게 화학 합성된다.

"정제된" 폴리펩티드는 실질적으로 다른 폴리펩티드가 없는 상태, 즉 조성물중의 비단백질성 물질을 고려하지 않고 중량당 최소 약 50% (원하는 폴리펩티드/조성물중의 전체 폴리펩티드), 바람직하게는 최소 약 70%, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 최소 원하는 폴리펩티드의 약 90%를 포함하는 조성물에 있는 폴리펩티드를 말한다. 바이러스 폴리펩티드의 정제 기술은 이 분야에서 알려져 있다. 정제된 항체는 이 분야에서 유사하게 정의된다.

여기에서 사용될 때 "에피토프"는 폴리펩티드의 항원 결정인자를 말한다. 에피토프는 항체의 결합부위를 결정하는 3 이상의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일반적으로 에피토프는 적어도 5 아미노산으로 구성되고 어떤 경우는 적어도 8 아미노산으로 구성된다. 에피토프의 맵핑 방법은 이 분야에 공지이다.

여기에서 사용될 때 "유형 특이적 에피토프"는 하나의 HCV 유형에서 발견되는 에피토프를 말한다. "유형-집단 특이적 에피토프"는 한가지 이상이지만 모든 유형보다는 적은 수의 HCV유형에서 발견된다. 예를 들면, 특정 에피토프는 HCV 1으로 감염된 환자로부터의 항체에 의해 인식될 수도 있지만 HCV 2로 감염된 환자로부터의 항체에 의해 인식될 수 없거나 또는 덜 효과적으로 인식될 것이다. 마찬가지로, HCV-3으로부터 유래된 유형-집단 특이적 에피토프는 HCV-3이나 HCV-4로 감염된 환자로부터의 항체에 의해 인식될 수도 있지만 HCV-1이나 HCV-2로 감염된 환자로부터의 항체에 의해서는 인식될 수 없다. "보존적 에피토프"는 모든 HCV 유형에 특이적인 항체에 의해 인식되는 것이다.

폴리펩티드는 폴리펩티드내 포함되어 있는 특이적 에피토프의 항체 인식에 기인하여 펩티드에 결합하는 항체와 "면역학적으로 반응적"이다. 면역학적인 반응성은 항체결합, 더 구체적으로 항체 결합의 반응속도론 및/또는 항체가 향하는 에피토프를 포함하는 알려진 폴리펩티드를 경쟁자로서 이용하는 결합에서의 경쟁에 의해 결정될 수도 있다. 폴리펩티드가 항체와 면역학적으로 반응하는지 여부를 결정하는 기술이 이 분야에서 알려져 있다.

여기에서 사용될 때 용어 "항체"는 적어도 한가지의 항체 결합부위로 구성된 폴리펩티드나 폴리펩티드군을 말한다 "항체 결합 부위"나 "결합 도메인"은 항원의 에피토프 특성에 보충적인 내부 표면 형태와 전하 분포와 함께 3차 결합 공간을 형성하는 항체 분자의 다양한 도메인의 폴딩으로부터 형성되는데 이것은 항원과 면역학적인 반응을 가능케 한다. 항체결합 부위는 중쇄 및/또는 경쇄 도메인 (각각 V_H및 V_L)으로부터 형성될 수도 있는데 이것은 항원 결합에 기여하는 고도가변 루프를 형성한다. 용어 "항체"는 예를 들면 척추동물 항체, 하이브리드 항체, 키메라 항체, 변형된 항체, 일가(univalent) 항체 Fab 단백질 및 단일 도메인 항체를 포함한다.

폴리펩티드에 특이적인 항체와 폴리펩티드는 이 분야에서 알려진 방법에 의해 만들어질수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 일반적으로 약학적으로 허용가능한 완충액에서 현탁되고 적당한 보조제와 혼합되어 동물에 주사된다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 생성 방법은 이 분야에서 알려려 있고 여기에서는 상세하게 기술되지 않을 것이다.

용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 폴리머를 말하지만 생성물의 특정 길이를 말하는 것은 아니다: 따라서 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의내에 포함된다. 이 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 변형, 예를 들면 글리코실레이션, 아세틸레이션, 포스포릴레이션 등만을 말하거나 이들을 배제하는 것도 아니다. 정의내 포함된 것은 예를 들면 아미노산 (예를 들면 비자연 아미노산 등을 포함하여)의 한가지 이상의 유사체를 포함하는 폴리펩티드 치환된 연결을 갖는 폴리펩티드 이외에도 이 분야에서 알려진 자연 발생 및 비자연 발생적인 다른 변형을 갖는 폴리펩티드가 포함된다.

"처치"는 여기에서 사용될 때 예방 및/또는 치료를 말한다.

"개체"는 여기에서 사용될 때 척추동물, 특히 포유류 종의 구성원을 말하고 동물(즉, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 염소. 토끼, 마우스, 랫트, 기니아 피그 등)과 원숭이, 침팬지, 비비 및 사람을 포함하는 영장류를 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다.

여기에서 사용될 때 핵산의 "센스 가닥"은 mRNA의 서열과 유사한 서열을 갖는 서열을 포함한다. "안티-센스 가닥"은 "센스 가닥"의 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

여기에서 사용될 때 바이러스의 "포지티브 가닥 게놈"은 RNA나 DNA이든지 단일가닥이고 바이러스 폴리펩티드를 암호화하는 게놈의 한가지이다. 포지티브 가닥 RNA 바이러스의 예는 Togaviridae. Coronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae, 및 Caliciviridae를 포함한다. 또한 전에는 Togaviridae로 분류된 Flaviridae가 포함된다. Fields & Knipe (1986)참조.

여기에서 사용될 때 "항체를 포함하는 신체 샘플"은 관심있는 항체의 출처인 개체의 신체의 구성요소를 말한다. 항체를 포함하는 신체의 구성요소는 이 분야에서 알려져 있고, 예를 들면, 혈장, 혈청 척추액, 림프액, 호흡기관, 장 및 비뇨 생식기관의 외부부분, 눈물, 타액, 젖, 백혈구 및 골수종 등을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다.

여기에서 사용될 때 "생물학적 샘플"은 개인으로부터 분리된 조직이나 분비액의 샘플을 말하는데 이들은 예를 들면 혈장, 혈청, 척추액, 림프액, 피부, 호흡기관, 장, 및 비뇨생식기관의 외부부분, 눈물, 타액, 젖, 혈구세포, 종양, 기관 등을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다. 또한 생체 밖 세포 컬쳐 성분 (컬쳐 배지에서 세포의 성장을 일으키는 조직에 맞춰진 배지, 추정적으로 바이러스에 감염된 세포, 재조합 세포, 및 세포구성성분을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다)의 샘플이 포함된다.

발명을 수행하는 방식

본 발명의 실행은 다른 지시가 없으면 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 폴리펩티드와 핵산의 합성, 및 면역학의 종래 기술을 이용하는데 이들은 이 분야의 기술범위내이다. 이러한 기술은 문헌에서 완전하게 설명되어 있다. 예를 들면 Maniatis, Fitsch & Sambrook, "분자 클로닝" 실험실 매뉴얼 (1982); "DNA 클로닝, I 및 II 권" (D.N.Glover ed. 1985): "올리고뉴클레오티드 합성" (M.J. Gaie ed., 1984); "핵산 혼성화"(B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); "전사 및 번역" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984)L "동물 세포 컬쳐" (R.I. Freshney ed. 1986): "고정세포 및 효소" (IRL Press, 1986): B. Perbal, "분자 클로닝의 실제 안내서" (1984), "효소학 방법" 시리즈 (Academic Press, Inc.): "포유류 세포의 유전자 전이 벡터" (J.H. Miller 및 M.P. Calos eds., 1987 Cold. Spring Harbor Laboratory). Meth. Enzymol., Vol. 154 및 Vol. 155 (각각 Wu 및 Grossman 및 Wu. eds.). Mayer 및 Walker eds. (1987). "세포학 및 분자생물학에서의 면역화학 방법" (Academic Press, London): Scopes, (1987) "단백질 정제: 원리 및 실제" 2판(Springer-Verlag, N.Y.): 및 "실험 면역학의 안내서" I-IV권 (D.M. Weir 및 C.C. Black-well eds. 1986) 참조.

여기에서 언급된 상기와 하기의 모든 특허, 특허 출원 및 공개물은 여기에서 참고문헌으로 포함된다.

본 발명은 HCV를 검출하고 다른 유형의 HCV에 의한 감염을 확인하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 방법에서의 이용을 위한 폴리펩티드와 핵산 분자를 포함한다.

HCV에 의한 감염을 검출하고 타이핑하는 방법은 면역분석 및 서던 블러트 분석과 중합효소 연쇄 반응을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는 방법에 의한 핵산의 확인 양자를 포함한다. HCV에 의한 감염을 확인하기 위해서 생물학적 샘플은 항원-항체 결합을 허용하는 조건하에서 여기에 기술된 한가지의 폴리펩티드와 항온처리되고, 샘플중의 항체가 폴리펩티드에서 발견되는 에피토프에 결합하는지에 대해 결정된다.

면역분석 및 진단 키트

유형 특이적 에피토프와 유형-집단 특이적 에피토프를 포함하는 펩티드는 생물학적 샘플에서 HCV 항체의 존재 또는 바이러스 및/또는 바이러스 항원의 존재를 검출하는 면역분석에 유용하다. 면역분석의 디자인은 다수의 변형을 겪고 많은 포맷이 이 분야에서 알려져 있다.

면역분석은 적어도 한가지의 유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토프를 이용할 것이다. 한 실시예에서 면역분석은 유형 특이적 에피토프 및/또는 유형-집단 특이적 에피토프의 포함을 이용한다.

폴리펩티드는 유형 특이적 또는 유형-집단 특이적 항체의 존재를 검출하기위하여 에피토프를 이용하여 HCV를 타이핑하는데 유용하다. 폴리펩티드는 또한 다양한 유형의 HCV 사이를 구별하는 면역분석에서 이용될 수 있는 유형 또는 유형-집단 특이적 항체의 생성시의 이용에 적당하다.

폴리펩티드는 HCV 게놈의 3가지 다른 영역으로부터 유래된다. 한 세트의 폴리펩티드는 HCV 코어 영역으로부터 얻은 유형 또는 유형-집단 특이적 에피토프를 포함한다. 다른 세트의 폴리펩티드는 HCV의 비구조영역 4 (NS4)로부터 얻은 유형 또는 유형-집단특이적 에피토프를 포함한다. 다른 세트의 폴리펩티드는 간염 C 바이러스의 비-구조영역 5 (NS5)로부터 얻은 유형 또는 유형-집단 특이적 에피토프를 포함한다. 이 세트는 HCV-1의 아미노산 잔기 2281-2313 사이 및 다른 유형의 간염 C 바이러스의 상동 영역에서 발견된다.

폴리펩티드는 한가지 이상의 HCV 유형을 위한 면역분석에서의 이용에 적당하다. 한 유형을 분석하기 위해서 샘플은 항원-항체 결합을 허용하는 조건하에서 유형-집단특이적 에피토프를 포함하는 한가지 이상의 폴리펩티드와 접촉시키고 샘플중의 항체가 에피토프에 결합하는지를 측정한다.

특정 유형의 HCV를 구별하는 면역분석에서 생물학적 샘플을 개체로부터 얻고 항원-항체결합을 허용하는 조건하에서 첫번째 유형 특이적 에피토프 또는 유형-집단 특이적 에피토프와 접촉시키고; 항원-항체 결합을 허용하는 조건하에서 두번째 유형 특이적 에피토프 또는 유형-집단 특이적 에피토프와 접촉시키고 샘플중의 항체가 첫 번째나 아니면 두 번째 에피토프에 결합하는지를 결정한다. 이들 단계를 유형 및/또는 유형-집단 특이적 에피도프를 포함하는 어떠한 수의 폴리펩티드로 반복할 수 있다.

전형적으로 항-HCV 항체의 면역분석은 항체를 포함하는 것으로 여겨지는 생물학적 샘플과 같은 테스트 샘플의 선택과 제조에 이어 이것을 항원- 항체 복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토프와의 배양에 이어 이러한 복합체 형성의 검출을 수반한다. 적당한 배양 조건은 이 분야에서 잘 알려져 있다. 면역분석은 제한없이, 이질성 포맷이나 동질성 포맷 및 표준 유형이나 경쟁 유형이 있을 것이다.

이질성 포맷에서, 유형 특이적 에피토프 또는 유형-집단 특이적 에피토프는 전형적으로 배양후 폴리펩티드로부터 샘플의 분리를 용이하게 하기 위해 고체 지지대에 결합된다. 이용될 수 있는 고체 지지대의 예는 니트로셀룰로스 (즉, 막이나 마이크로티터웰 형태) 염화폴리비닐(즉, 시트나 마이크로티터 웰), 폴리스티렌 라텍스 (즉, 비드나 마이크로티터 플레이드), 플루오르화 폴리리닐리딘 (으로 알려진), 이질소화된 페이퍼, 나일론 막, 활성화된 비드 및 단백질 A 비드를 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다. 예를 들면 Dynatech의1 이나2 마이크로타이터 플레이트 또는 0.25 인치 폴리스티렌티렌비드 (Precision Plastic Ball)는 이질성 포맷에서 이용될 수 있다. 유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토프를 포함하는 고체지지대는 전형적으로 테스트 샘플로부터 이것을 분리한 후, 그리고 결합된 항체의 검출 이전에 세척한다. 표준 및 경쟁 포맷 둘다는 이 분야에서 알려져 있다.

동질성 포맷에서, 테스트 샘플은 용액중의 유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토프와 함께 배양된다. 예를 들면 이것은 형성된 어떠한 항원-항체 복합체를 침전시키는 조건하일 것이다. 이들 분석을 위한 표준 및 경쟁 포맷은 이 분야에서 알려져 있다.

표준 포맷에서는, 항체-유형 또는 항체-유형-집단 특이적 에피토프의 복합체를 형성하는 HCV 항체의 양이 직접 확인된다. 이것은 항-HCV 항체상의 에피토프를 인식하는 표지화된 항-이질성 (즉, 항-사람) 항체가 복합체 형성에 기인하여 결합하는지를 결정하여 수행될 수도 있다. 경쟁 포맷에서, 샘플중의 HCV 항체의 양은 복합체내의 알려진 양의 표지된 항체 (또는 다른 경쟁 리간드)의 결합에 미치는 경쟁 효과를 확인하여 추론된다.

억제 분석에서, 여러 가지 상이한 유형 특이적 에피토프 내지 유형 집단-특이적 에피토프를 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 항체의 능력이 결정된다. 항체는 우선 HCV의 한 유형이나 유형-집단으로부터의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드에 노출시키고 다음에 HCV의 또 다른 유형이나 유형-집단으로부터의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드에 노출시킨다. 이 과정은 HCV의 추가 유형이나 유형-집단에 대해 반복할 수도 있다.

항-HCV 항체를 포함하여 형성된 복합체 (또는 경쟁 분석의 경우 경쟁하는 항체의 양)는 포맷에 따라 수많은 공지 기술중 어느 것으로 검출한다. 예를 들면 복합체중의 표지화되지 않은 HCV 항체는 표지와 복합체 형성된 항이종성 1g의 컨쥬게이트, (즉 효소 표지)를 이용하여 검출될 수도 있다.

전형적인 면역분석에서, 테스트 샘플, 전형적인 생물학적 샘플은 항원-항체복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 한 가지 이상의 유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토프를 포함하는 폴리펩티드와 배양한다. 다양한 포맷이 이용될 수 있다. 예를 들면 "샌드위치 분석"이 이용될 수도 있는데 여기에서 고체 지지대에 결합된 항체는 테스트 샘플과 배양하고: 세척하고: 분석물에 대한 두번째, 표지된 항체와 배양하고 지지대는 다시 세척한다. 분석물은 두번째 항체가 지지대에 결합되는지의 결정에 의하여 검출된다. 이질성이거나 아니면 동질성일 수 있는 경쟁 포맷에서 테스트 샘플은 대개 항체와 배양되고 표지화된 경쟁 항원 또한 연속적으로 또는 동시에 배양된다. 이들 및 다른 포맷들이 이 분야에서 잘 알려져 있다.

유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토프에 대한 항체는 NANBH를 일으키는 HCV가 있는 환자와 감염성 혈액의 헌혈자에서 바이러스 항원의 검출을 위한 면역분석에서 이용될 수 있다. 더욱이 이들 항체는 급성상 헌혈자와 환자의 검출에 상당히 유용할 수도 있다.

면역분석은 예를 들면 유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토프에 대한 모노클로날 항체, 하나의 바이러스 항원의 에피토프에 대한 모노클로날항체의 조합, 다른 바이러스 항원의 에피토프에 대한 모노클로날 항체, 동일한 바이러스 항원에 대한 폴리클로날 항체 또는 다른 바이러스 항원에 대한 폴리클로날 항체를 이용할 수 있다. 프로토콜은 예를 들면, 경쟁 분석, 직접 반응 분석 또는 샌드위치형 분석을 기초로 할 수 있다. 프로토콜은 또한 예를 들면 고체 지지대를 이용하거나 면역침전에 의할 수도 있다. 대부분의 분석은 표지된 항체나 폴리펩티드의 이용을 수반하고, 그 표지는 효소 분자, 형광 분자, 화학발광분자, 방사능 분자 또는염료 분자일 수도 있지만 이들에 제한되지는 않는다. 프로브로부터 시그날을 증폭하는 분석이 또한 알려져 있다: 이들의 예는 비오틴과 아비딘 및 ELISA 분석과 같이 효소-표지되고 효소-매개되는 면역분석을 이용하는 분석이다.

본 발명은 기술된 유형 특이적 에피토프와 유형-집단 특이적 에피토프의 아미노산잔기 서열을 암호화하는 핵산 분자를 더 포함한다. 이들 핵산 분자는 예를 들면 서던 블러트나 미국 특허 제 4,868,105호 및 제 5,124,246호에서 기술된 포획화 분석과 같은 다른 DNA 인식분석에서 프로브로서 유용하다.

HCV cDNA의 발현에 의한 항원 맵핑에 대한 연구는 이들 cDNA를 포함하는 많은 클론이 NANBH를 나타내는 개체로부터의 혈청과 면역반응하는 폴리펩티드를 발현한다는 것을 보여주었다. 단일의 폴리펩티드가 모든 혈청과 면역반응하지는 않았다. 이들의 5 가지 폴리펩티드는 검출에서의 오버랩이 완전하지는 않지만 이들 폴리펩티드에 있는 HCV 에피토프에 대한 항체가 많은 다른 환자의 혈청에서 검출되었다는 점에서 상당히 면역원성을 갖는다. 따라서 다양한 클론에서 암호화되는 폴리펩티드의 면역원성에 관한 결과는 HCV 감염을 위한 효율적인 검출 시스템이 에피토프의 패널의 이용을 포함할 수 있다는 것을 제시한다. 패널중의 에피토프는 하나 또는 다수의 폴리펩티드로 구성될 수 있다. 다양한 에피토프를 위한 분석은 연속하여 또는 동시에 일어날 수도 있다.

면역진단에 적당하고 적당한 표지화 시약을 포함하는 키트는 유형 특이적 에피토프와 유형-집단 특이적 에피토프를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드 또는 유형 특이적 에피토프와 유형-집단 특이적 에피토프에 대한 항체를 포함하는 적당한 물질을 적당한 용기내에 적당한 일련의 분석 지시뿐만 아니라 분석의 수행에 요구되는 잔여의 시약 및 물질과 함께 패키지되어 구성된다.

본 발명은 유형 특이적 에피토프와 유형-집단 특이적 에피토프를 암호화하는 핵산서열의 측면에 위치하는 영역에 상보적인 핵산 분자를 더 포함한다. 이러한 핵산분자는 특정 HCV의 유전자형을 결정하기 위하여 PCR을 수행하는데 유용하다.

가변영역 및 과대가변 영역이 HCV 게놈내에 있다는 것이 주목되어야 한다: 따라서 이들 영역에서의 유사성은 전체 게놈에서의 서열에 비해 상당히 작은 것으로 기대된다.

핵산과 아미노산의 서열 유사성을 결정하는 기술이 이 분야에서 알려져 있다. 예를 들면 아미노산 서열은 직접 결정할 수도 있고 여기에서 제공된 서열과 비교할 수도 있다. 택일적으로 추정 HCV의 게놈 물질의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있고 (cDNA 매개물을 통해)여기에서 암호화되는 아미노산 서열을 결정할 수 있으며 해당 영역을 비교할 수 있다.

상술한 논외와 실시예는 단지 본 발명을 예시하는 것이고 이 분야의 통상의 전문가는 본 발명이 다른 방식으로도 실행될 수 있고 본 발명은 단지 특허청구범위의 참고로서만 정의된다는 것을 이해할 것이다.

실시예 1

여러 가지 상이한 유형의 HCV 의 주요 에피토프의 비교

HCV의 다른 유형과 서브유형 사이의 아미노산 잔기의 유사성을 가변영역에 대해서 비교하였다. HCV의 서브유형은 Simmonds의 계통발생 분석에 의해 기술된 바와 같다. 아미노산 서열의 넘버링은 원형 HCV-1 서열에 대해 기술된 넘버링에 일치한다. Choo et al. 표 2는 NS4영역의 유형 특이적 에피토프와 유형-집단 특이적 에피토프 및 보존적인 주요 에피토프에 대한 아미노산 잔기 유사성의 %를 보여준다. 표 3은 NS5 영역의 두 가지 유형 특이적 에피토프나 유형-집단 특이적 에피토프 사이의 아미노산 잔기 유사성을 보여준다. 표 4는 코어영역의 보존적인 주요 에피토프와 유형 특이적 에피토프에 대한 아미노산 잔기 유사성의 %를 보여준다.

실시예 2

펩티드 합성

두 세트의 폴리펩티드를 합성하였다. 첫번째 세트는 HCV-1의 에피토프 맵핑을 수행하기 위해서 디자인하였고 두번째 세트는 에피토프 맵핑 연구에서 확인된 에프토프가 유형 특이적 에피토프를 포함하는지를 결정하기 위해서 디자인하였다. 첫 번째 세트의 폴리펩티드에서 64세트 (이중으로)의 오버랩핑 옥타펩티드를 전체 HCV-1 폴리단백질(3011 아미노산 잔기)을 교차시켜 Mimotopes에 의해 합성하였다.

두번째 세트의 폴리펩티드를 Geysen (1990) J. Trop. Med. Pub. Health 21: 523-383: 및 Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154에 의해 기술된 방법에 따라 만들었다.

두번째 세트의 폴리펩티드에서, HCV-1의 코어, NS4, NS5로부터의 비-보존적 서열의 주요 에피토프와, HCV 서브유형 1b, 2a, 3a 및 유형 4로부터의 그 해당 서열을 나타내는 4개의 항원 영역을 유형 특이적 에피토프의 합성을 위해 선택하였다. 코어로부터의 서열을 아미노산 잔기 67-88의 덜 보존적인 영역으로부터 선택하였다. NS4 영역으로부터의 서열을 아미노산 잔기 영역 1689-1718로부터 선택하였다. NS5 영역으로부터 선택된 서열은 아미노산 잔기 영역 2281-2313 및 2673-2707로부터 유래되었다.

실시예 3

생물학적 샘플

HCV의 상이한 유형들에 특이적인 항체들 사이의 구별시 폴리펩티드의 유효성을 결정하기 위해서 항혈청을 미합중국 동부 연안과 서부 연안, 일본 서부 유럽 국가 남부 유럽국가및 남아프리카를 포함하는 전세계의 다른 영역으로부터의 24명 만성 NANBH 환자로부터 얻었다. 바이러스 RNA의 분리, cDNA 합성, PCR 증폭, DNA 서열결정 및 올리고뉴클레오티드 프로브의 혼성화를 Cha et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 7144-7148에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다.

실시예 4

에피토프 맵핑 순서

HCV의 영역이 에피토프를 포함하는지를 결정하기 위해서 집단이 특이적이든 보존적이든 전체의 HCV-1 폴리단백질을 에피토프 맵핑시켰다. 이용된 방법은 기본적으로 제 2도에 요약되어 있다.

64세트 (이중으로)의 오버랩핑 옥타펩티드를 전체 HCV-1 폴리단백질 (3011 아미노산)을 교차시켜에 의해 합성하였다. 미국의 25가지 HCV 항체 반응적인 샘플 일본의 9가지 HCV 반응적인 샘플 및 6가지 HCV 비-반응적인 네가티브 대조군 샘플을 포함하는 40가지 샘플의 패널을 에피토프 맵핑과 집단 분석을 위해 선택하였다. 면역분석을 표준 ELISA방법을 이용하여 수행하였다.

주요 에피토프의 확인을 위한 범주는 항체 반응 빈도와 이들 에피토프에 대한 항체반응강도 (타이터)를 기초로 하였다. 결과를 제 3도 및 제 4도에 제시하였다.

실시예 5

펩티드 유래된 효소-결합 면역 흡착 분석

실시예 2에서 기술된 폴리펩티드를 이용한 최적 면역분석을 결정하기 위해서 두가지 독립적인 유형의 폴리펩티드에서 유래된 효소-결합 면역 분석 (ELISA)을 수행하였고 결과를 비교하였다. 첫번째 유형의 ELISA는 펩티드가 단순히 흡착되는 Nunc MaxiSorb^TM이었고 두번째 유형은 폴리펩티드가 공유적으로 결합되는 Nunc Covalink NH^TM를 이용하였다. 카르복실산과 아민 사이의 아미드 결합의 형성은 카르보디이미드의 첨가에 의해 개시된다. 가수분해를 감소시키기 위해서 활성 에스테르를 상기 컨쥬케이션 절차에 N-히드록시-숙신이미드 (NHS) 를 첨가하여 만들 수 있다.

첫번째 유형의 ELISA를 위한 마이크로타이터 플레이트를 다음과 같이 수행하였다. 폴리펩티드를 인삼염으로 완충처리된 식염수 (PBS)의 100㎕에 1㎍/웰의 농도로 Nunc MaxiSorb^TM마이크로타이터 플레이터의 웰에 두었다. 폴리펩티드가 실온에서 하룻밤동안 흡수되게 하였다. 다음 마이크로타이터 플레이트를 세제없이 PBS로 4회 세척하였다. 다음 웰을 1시간동안 220㎕(Pierce)으로 후-코팅하였고 이어서 추가의 세척없이 증발시켰고 진공건조시켰다.

분석을 다음과 같이 수행하였다. 5㎕ 크기의 혈청 샘플을 5% 무지방 우유 100 ℓ로 웰에 첨가하였고 37℃에서 1 시간동안 배양하였다. 다음에 웰을 PBS에서 0.05% Tween으로 5회 세척하였다. 서양고추냉이의 퍼옥시다제 (Jackson Laboratories)로 표지화된 친화성으로 정제된 염소의 항-사람 IgG의 컨쥬게이트는 폴리펩티드로의 사람 항체의 결합도를 결정하기 위해 이용되었다. 컨쥬케이트를 미리 150mM NaCl, PBS. 5% 말 혈청 (열에 의해 변성된) 중의 5% IgG로 희석하였다. 컨쥬케이트 100㎕을 웰에 놓았고 1 시간동안 37℃에서 배양하였다. 다음에 웰을 실온에서 30분동안 PBS/Tween과 OPD [o-페닐렌-디아민-2HCl. 전개완충액(시트르산염 인산염으로 완충처리된 0.02% H₂O₂)당 하나의 타블렛; Sigma]로 5회 세척하엿고 492nm 와 620nm에서의 Ab를 측정하였다. 컷오프를 평균이나 약 0.45로부터 7 표준편차가 있는 임의 (정상) 의 200 샘플로부터 결정하였다.

두번째 유형의 ELISA를 위한 마이크로티터 플레이트를 다음과 같이 수행하였다. 폴리펩티드를 물 50㎕ 에서 10mg/웰의 농도로 Nunc MaxiSorb^TM마이크로타이터 플레이터의 웰에 두었다. 0.1M NHS (술포-N-히드로숙신이미드, Pierce) 25㎕ 과 0.1M EDC[1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필카르보디이미드) Sigma] 25㎕을 폴리펩티드에 첨가하였고 흔들 플랫폼에서 30분동안 실온에서 혼합하였다. 다음에 전체 내용물을 얼음에 차게한 0.1M Na 카르보네이트 ph 8.6의 52㎖ 첨가하였다. 혼합물 100㎍ 을 마이크로타이터 플레이트의 웰을 코팅하기 위해서 이용하였고 이어서 30분동안 4℃에서 배양하였다. 플레이트를 PBS/0.1% Triton X-100으로 4회 세척하였다. 다음에 플레이트를 Superblock으로 처리하였고 분석을 상기에서 기술된 바와 같이 수행하였다.

얻어진 결과를 다음 표 5-14 에서 제시하였다.

실시예 6

억제 분석

억제 분석은 펩티드가 항체와의 결합을 위해 서로 경쟁할 수 있는지를 결정하기 위해서 수행하였다. 다른 유형의 HCV 서열의 코어, NS4 및 NS5 영역으로부터의 3가지 세트의 짧은 폴리펩티드를 합성하였다. 이들 폴리펩티드는 아미노산 1689-1695, 1696-1702 및 1711-1917로부터의 서열 영역을 덮는다. 억제 분석을 상기 폴리펩티드의 10㎍을 샘플에 첨가하고 37℃에서 한 시간동안 배양한 다음 상기에서 기술된 바와 같이 ELISA를 수행하였다. 만약 억제가 항체 결합의 50% 이상인 것으로 발견된다면 폴리펩티드는 억제적인 것으로 여겨진다. 얻어진 걸과를 다음표 15 에서 제시하였다.

실시예 7

HCV 임상 샘플 타이핑

상기 표 16 에서 주어진 유형 또는 유형-집단 특이적 에피토프를 비-A, 비-B 간염환자(헌혈자 10명, 수혈-관련된 만성 비-A, 비-B 환자 3명)로부터의 13명 임상 샘플을 테스트하기 위해서 실시예 5의 ELISA 분석에서 이용하였다. 표 17은 이들 분석의 결과를 보여준다. 각 임상 샘플을 다양한 유형-특이적 또는 유형-집단 에피토프를 나타내는 주어진 영역 (aa 67-84, 1689-1718 또는 2281-2313)에 해당하는 12가지의 다른 펩티드와의 반응성을 알아보기 위해 분석하였다. 각 샘플은 각 타이핑 펩티드와 비-반응성 (NR), 약한 반응성 (WR) 또는 반응성 (R) 반응을 생성한다. 이들 결과는 PCR에 의해 결정된 우측 컬럼에서 주어진 HCV 유전자형과 관련있는 각샘플의 HCV 유전자형을 예시한다.

Claims (38)

1. 간염 C 바이러스에 의해 감염된 것으로 추정되는 사람으로부터의 생물학적 샘플로부터 하나 이상의 유형의 간염 C 바이러스를 검출하기 위한 키트로서, 첫 번째 유형의 간염 C 바이러스에 특이적인 유형 특이적 에피토프들의 조합으로 본질적으로 구성되는 첫 번째 시약을 포함하고, 상기 에피토프들은 간염 C 바이러스의 코어영역, NS4 영역 또는 NS5 영역으로부터 선택되며, 적어도 하나의 에피토프는, 성숙 HCV-1 폴리단백질 또는 다른 간염 C 바이러스 유형의 이들 영역에 대응하는 에피토프에 대하여 번호를 부여하여, 아미노산 잔기 67 내지 84, 아미노산 잔기 1689 내지 1718, 아미노산 잔기 2281 내지 2313에서 발견되는 아미노산 서열로부터 유래되고, 상기 에피토프는 길이가 5 내지 15 아미노산이고: 상기 검출은 샘플에서 첫 번째 에피토프-항체 복합체의 존재를 분석함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 키트.
2. 제 1항에 있어서, 두 번째 유형의 간염 C 바이러스에 특이적인 추가의 유형 특이적 에피토프를 포함하는 두 번째 시약을 더 포함하고, 상기 추가의 에피토프는 간염 C 바이러스의 코어영역, NS4 영역 또는 NS5 영역으로부터 선택되고 첫 번째 시약의 에피토프들과는 다른 영역으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 분석단계에서 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 면역형광 분석 화학발광 면역분석 (CLIA) 방사면역분석 또는 효소-결합 면역 흡착 분석을 사용하는 것을 특징으로 하는 키트.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 첫 번째 시약내의 적어도 한 에피토프는 간염 C 바이러스-1의 아미노산 67 내지 84에 걸쳐있는 아미노산 서열로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 키트.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 첫 번째 시약내의 적어도 한 에피토프는 간염 C 바이러스-1의 아미노산 1689 내지 1718에 걸쳐있는 아미노산 서열로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 키트.
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 첫 번째 시약내의 적어도 한 에피토프는 NS4 영역으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 키트.
7. HCV 항원을 보유하는 것으로 추정되는 생물학적 샘플로부터 하나 이상의 유형의 간염 C 바이러스를 검출하기 위한 키트로서, 첫 번째 유형의 간염 C 바이러스의 코어영역, NS4 영역 또는 NS5 영역으로부터 선택되는 적어도 두 개의 다른 유형 특이적 에피토프들에 대한 특이적인 항체의 조합을 포함하는 첫 번째 시약을 포함하고, 적어도 하나의 에피토프는, 성숙 HCV-1폴리단백질, 또는 다른 간염 C 바이러스 유형의 이들 영역에 대응하는 에피토프에 대하여 번호를 부여하여, 아미노산 잔기 67 내지 84, 아미노산 잔기 1689 내지 1718, 아미노산 잔기 2281 내지 2313에서 발견되는 아미노산 서열로부터 유래되고, 상기 에피토프는 길이가 5 내지 15 아미노산이고; 상기 검출은 샘플에서 첫 번째 항원-항체 복합체의 존재를 분석함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 키트.
8. 제 7항에 있어서, 두 번째 유형의 간염 C 바이러스로부터 유래되는 추가의 유형 특이적 에피토프에 대해 특이적인 항체를 포함하는 두 번째 시약을 더 포함하고. 상기 추가의 에피토프는 간염 C 바이러스의 코어영역, NS4 영역 또는 NS5 영역으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 분석단계에서 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 면역형광 분석, 화학발광 면역분석 (CLIA), 방사면역분석 또는 효소-결합 면역 흡착 분석을 사용하는 것을 특징으로 하는 키트.
10. 제 9항에 있어서, 첫 번째 시약내의 적어도 한 항체는 간염 C 바이러스-1의 아미노산 1689 내지 1718 또는 아미노산 67 내지 84에 걸쳐있는 아미노산 서열로부터 유래된 에피토프에 대해 특이적인 것을 특징으로 하는 키트.
11. 제 9항에 있어서, 조합 내의 적어도 한 항체는 NS4 영역으로부터 유래된 에피토프에 대해 특이적인 것을 특징으로 하는 키트.
12. 간염 C 바이러스의 코어영역 내의 유형 특이적 에피토프를 암호화하는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드로서, 상기 에피토프는 간염 C 바이러스-1의 아미노산 67 내지 84에 걸쳐있는 아미노산 서열로부터 유래되고 길이가 적어도 5 내지 15 아미노산인 폴리펩티드.
13. 간염 C 바이러스의 NS4 영역 내의 유형 특이적 에피토프를 암호화하는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드로서, 상기 에피토프는 간염 C 바이러스-1의 아미노산 1689 내지 1718에 걸쳐있는 아미노산 서열로부터 유래되고 길이가 적어도 5 내지 15 아미노산인 폴리펩티드.
14. 간염 C 바이러스-1의 아미노산 잔기 67 내지 84에 해당하는 간염 C 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 핵산 분자.
15. 간염 C 바이러스-1의 아미노산 잔기 1689 내지 1718에 해당하는 간염 C 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 핵산 분자.
16. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 첫 번째 시약은 니트로셀룰로스 고체 지지대에 부착되는 것을 특징으로 하는 키트.
17. 제 1항에 있어서, 첫 번째 시약은 간염 C 바이러스의 NS4 영역, NS5 영역 및 코어영역으로부터의 유형 특이적 에피토프를 각각 적어도 하나 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
18. 제 6항에 있어서, 첫 번째 시약은 간염 C 바이러스의 NS4 영역, NS5 영역 및 코어영역으로부터의 유형 특이적 에피토프를 각각 적어도 하나 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
19. 제 16항에 있어서, 첫 번째 시약은 간염 C 바이러스의 NS4 영역, NS5 영역 및 코어영역으로부터의 유형 특이적 에피토프를 각각 적어도 하나 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
20. 제 1항에 있어서, 첫 번째 시약은 간염 C 바이러스의 NS4 영역으로부터의 다수의 유형특이적 에피토프를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
21. 제 6항에 있어서, 첫 번째 시약은 간염 C 바이러스의 NS4 영역으로부터의 다수의 유형 특이적 에피토프를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
22. 제 16항에 있어서, 첫 번째 시약은 간염 C 바이러스의 NS4 영역으로부터의 다수의 유형 특이적 에피토프를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
23. 제 18항 내지 제 22항중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 시약은 간염 C 바이러스의 코어 영역으로부터의 유형 특이적 에피토프를 적어도 하나 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
24. 간염 C 바이러스로부터의 유형 특이적 에피토프의 조합을 포함하며, 상기 조합은 간염 C 바이러스의 NS4 영역으로부터의 에피토프를 적어도 하나 포함하는 하나 이상의 유형의 간염 C 바이러스를 타이핑하는데 유용한 시약.
25. 제 24항에 있어서, 조합은 간염 C 바이러스의 NS4 영역, NS5 영역 및 코어영역으로부터의 유형 특이적 에피토프를 각각 적어도 하나 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
26. 제 25항에 있어서, 조합은 간염 C 바이러스의 NS4 영역으로부터의 다수의 유형 특이적 에피토프를 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
27. 제 26항에 있어서, 조합은 간염 C 바이러스의 코어영역으로부터의 유형 특이적 에피토프를 적어도 하나 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
28. 제 24항에 있어서, 상기 시약은 니트로셀룰로스 고체 지지대에 부착되는 것을 특징으로 하는 시약.
29. 간염 C 바이러스의 코어영역, NS4 영역 또는 NS5 영역으로부터 선택되는, 간염 C 바이러스의 첫 번째 유형에 대해 유형 특이적 에피토프들의 조합을 포함하는 조성물.
30. 제 29항에 있어서, 조성물은, 간염 C 바이러스의 코어영역, NS4 영역 또는 NS5 영역으로부터 선택되고 첫 번째 유형의 간염 C 바이러스에 대해 특이적인 에피토프들과는 다른 영역으로부터 선택된, 두 번째 유형의 간염 C 바이러스에 대한 추가의 유형 특이적 에피토프를 적어도 하나 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
31. 제 29항 또는 제 30항에 있어서, 첫 번째 유형의 간염 C 바이러스에 대해 특이적인 적어도 하나의 에피토프는 간염 C 바이러스-1의 아미노산 67 내지 84에 걸쳐있는 아미노산 서열로부터 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
32. 제 29항 또는 제 30항에 있어서 첫 번째 유형의 간염 C 바이러스에 대해 특이적인 적어도 하나의 에피토프는 간염 C 바이러스-1의 아미노산 1689 내지 1718에 걸쳐있는 아미노산 서열로부터 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
33. 제 29항 또는 제 30항에 있어서, 첫 번째 유형의 간염 C 바이러스에 대해 특이적인 적어도 하나의 에피토프는 NS4 영역으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
34. 첫 번째 유형의 간염 C 바이러스의 코어영역, NS4 영역 또는 NS5 영역으로부터 선택되는 적어도 두 개의 서로 다른 유형 특이적 에피토프들에 대해 특이적인 항체들의 조합을 포함하는 조성물.
35. 제 34항에 있어서, 간염 C 바이러스의 코어영역, NS4 영역 또는 NS5 영역으로부터 선택되고, 두 번째 유형의 간염 C 바이러스로부터 유래된 추가의 유형 특이적 에피토프에 대해 특이적인 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
36. 제 34항 또는 제 35항에 있어서, 첫 번째 시약내의 적어도 한 항체는 간염 C 바이러스-1의 아미노산 1689 내지 1718 또는 아미노산 67 내지 84에 걸쳐있는 아미노산 서열 또는 다른 간염 C 바이러스 유형으로부터의 그것의 상동 영역으로부터 유래된 에피토프에 대해 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물.
37. 제 34항 또는 제 35항에 있어서, 조합내의 적어도 한 항체는 NS4 영역으로부터의 에피토프에 대해 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물.
38. 제 36항에 있어서, 조합내의 적어도 한 항체는 NS4 영역으로부터의 에피토프에 대해 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물.