PL175342B1 - Sposób klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C - Google Patents
Sposób klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu CInfo
- Publication number
- PL175342B1 PL175342B1 PL94311653A PL31165394A PL175342B1 PL 175342 B1 PL175342 B1 PL 175342B1 PL 94311653 A PL94311653 A PL 94311653A PL 31165394 A PL31165394 A PL 31165394A PL 175342 B1 PL175342 B1 PL 175342B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hepatitis
- hcv
- virus
- epitope
- specific
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 88
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 37
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title claims description 9
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title claims description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 50
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims abstract description 32
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 84
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 80
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 74
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims description 28
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 26
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 12
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 9
- 241000711557 Hepacivirus Species 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 4
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 claims description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 3
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 2
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 claims 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 claims 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 claims 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims 1
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 claims 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 43
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 35
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 21
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 18
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 9
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- RSPISYXLHRIGJD-UHFFFAOYSA-N OOOO Chemical compound OOOO RSPISYXLHRIGJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- -1 aliphatic amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 2
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KSPIYJQBLVDRRI-UHFFFAOYSA-N N-methylisoleucine Chemical compound CCC(C)C(NC)C(O)=O KSPIYJQBLVDRRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 108010015780 Viral Core Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 3-(iminomethylideneamino)-n,n-dimethylpropan-1-amine Chemical compound CN(C)CCCN=C=N ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000714198 Caliciviridae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/82—Hepatitis associated antigens and antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
1 1. Sposób klasyfikowania jednego lub wiekszej liczby typów wirusa zapalenia watroby typu C, znamienny tym, ze w etapie (a) uzyskuje sie próbke biologiczna z osobni- ka z podejrzeniem wirusowego zapalenia watroby typu C, w etapie (b) kontaktuje sie ta próbke z pierwszym reagentem zawiera- jacym polaczenie typowo swoistych epito- pów wirusa zapalenia watroby typu C, przy czym co najmniej jeden epitop w tym polaczeniu pochodzi z niestrukturalnego re- gionu 4 wirusa zapalenia watroby typu C i przy czym kontaktowanie to prowadzi sie w warunkach umozliwiajacych powstanie pier- wszego kompleksu epitop-przeciwcialo, na- stepnie w etapie (c) oznacza sie obecnosc kompleksu epitop-przeciwcialo w próbce i ocenia sie czy przeciwciala w próbce wiaza sie do epitopów w pierwszym reagencie. F I G . 1 PL PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C, charakteryzujący się tym, że w etapie (a) uzyskuje się próbkę biologiczną z osobnika z podejrzeniem wirusowego zapalenia wątroby typu C, w etapie (b) kontaktuje się tą próbkę z pierwszym reagentem zawierającym połączenie typowo swoistych epitopów wirusa zapalenia wątroby typu C, przy czym co najmniej jeden epitop w tym połączeniu pochodzi z niestrukturalnego regionu 4 wirusa zapalenia wątroby typu C i przy czym kontaktowanie to prowadzi się w warunkach umożliwiających powstanie pierwszego kompleksu epitopprzeciwciało, następnie w etapie (c) oznacza się obecność kompleksu epitop-przeciwciało w próbce i ocenia się czy przeciwciała w próbce wiążą się do epitopów w pierwszym reagencie. Korzystnie ponadto w etapie (d) kontaktuje się tą próbkę z drugim reagentem zawierającym drugi typowo swoisty epitop wirusowego zapalenia wątroby typu C, przy czym ten drugi epitop pochodzi z regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C i przy czym kontaktowanie prowadzi się w warunkach pozwalających na powstanie drugiego kompleksu epitop-przeciwciało, następnie w etapie (e) oznacza się obecność drugiego kompleksu epitop-przeciwciało w próbce i ocenia się czy przeciwciała w próbce wiążą się z epitopem w drugim reagencie. W korzystnej odmianie wynalazku w etapie oznaczania próbę wykonuje się techniką analizy kompetytywnej, techniką kanapkową, techniką immunofluorescencyjną, radioimmunologiczną albo enzymatyczną techniką na immunosorbencie.
Również korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako pierwszy reagent stosuje się reagent zawierający dodatkowy, typowo swoisty epitop, otrzymywany z regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C lub ze strukturalnego regionu 5 wirusa zapalenia wątroby typu C.
Jeszcze bardziej korzystnie dodatkowy typowo swoisty epitop zlokalizowany jest między resztami aminokwasowymi 67 i 84, lub 2281 i 2313 wirusa zapalenia wątroby typu C-1 albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C. W korzystnym wariancie sposobu wynalazku stosuje się typowo swoisty epitop z niestrukturalnego regionu 4, który zlokalizowany jest między resztami aminokwasowymi 1689 i 1718 wirusa zapalenia wątroby typu C-1 lub homologicznych regionach innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
Korzystnie stosuje się pierwszy reagent, który związanyjest na trwałym podłożu nitrocelulozowym. Pierwszy reagent w sposobie według wynalazku zawiera co najmniej jeden typ swoistego epitopu z każdego z regionów wybranych z niestrukturalnego regionu 4, niestrukturalnego regionu 5 i z regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C. Również korzystnie sposób według wynalazku jest realizowany, gdy pierwszy reagent zawiera wiązkę typowo swoistych epitopów z niestrukturalnego regionu 4 wirusa zapalenia wątroby typu C.
W odmianie wynalazku sposób klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C, charakteryzuje się tym, że w etapie (a) uzyskuje się próbkę biologicznąz osobnika z podejrzeniem wirusowego zapalenia wątroby typu C, w etapie (b) kontaktuje się tą próbkę z pierwszym reagentem zawierającym połączenie przeciwciał swoistych wobec co najmniej dwóch różnych typów swoistych epitopów wirusa zapalenia wątroby typu C, przy czym co najmniej jedno przeciwciało w tym połączeniu jest swoiste wobec typowo swoistego epitopu pochodzącego z niestrukturalnego regionu 4 wirusa zapalenia wątroby typu C i przy czym kontaktowanie rodzi się w warunkach pozwalających na powstanie pierwszego kompleksu epitopprzeciwciało, następnie w etapie (c) oznacza się w próbce obecność kompleksów epitop-przeciwciało.
W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku, w etapie (d) kontaktuje się próbkę z drugim reagentem zawierającym przeciwciało swoiste wobec drugiego typowo swoistego epitopu wirusa zapalenia wątroby typu C, przy czym ten drugi epitop pochodzi z regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C i przy czym kontaktowanie prowadzi się w warunkach
175 342 pozwalających na powstanie drugiego kompleksu antygen-przeciwciało i następnie w etapie (e) oznacza się w próbce obecność drugiego kompleksu epitop-przeciwciało. Również korzystnie w etapie oznaczania próbę wykonuje się techniką analizy kompetytywnej, techniką kanapkową, techniką immunofluorescencyjną, radioimmunologiczną albo enzymatyczną techniką na immunosorbencie. W sposobie tym, również jako pierwszy reagent stosuje się reagent zawierający przeciwciało swoiste wobec dodatkowych typów swoistych epitopów otrzymanych z regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C lub regionu niestrukturalnego 5 wirusa zapalenia wątroby typu C.
Jako dodatkowe epitopy korzystnie stosuje się dodatkowy epitop zlokalizowany między resztami aminokwasowymi 67-84, lub 2281 -2313 wirusa zapalenia wątroby typu C-1, lub homologicznie regiony innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C. Będący przedmiotem wynalazku sposób klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C jest sposobem użytecznym do klasyfikowania wirusów HCV na podstawie genotypu i serotypu.
Stosowane w sposobie według wynalazku swoiste dla danego typu epitopy, epitopy swoiste dla wiązki typów, kwasy nukleinowe kodujące te epitopy do użyciajako sondy oraz kwasy nukleinowe komplementarne do regionów flankujących te, które kodują epitopy do stosowania jako primety są często elementami kompozycji do klasyfikowania wirusów HCV. Stosowane w sposobie według wynalazku epitopy typowo-swoiste albo epitopy swoiste wobec wiązki typów wchodzą w skład polipeptydów obejmujących te epitopy. Polipeptydy te wywodzą się z trzech różnych regionów genomu HCV. Jeden zestaw polipeptydów obejmuje epitopy typowo-swoiste albo epitowy swoiste wobec wiązki typów, otrzymane z regionu rdzeniowego wirusa HCV. Ten pierwszy zestaw znajduje się pomiędzy resztami aminokwasowymi 67 a 84 wirusa HCV-1 i homologicznymi regionami innych typów HCV. W niniejszy opisie użyte są następujące skróty reszt aminokwasowych: A = alanina, I = izoleucyna, L = leucyna, M = metionina, F = fenyloalanina, P = prolina, W = trypofan, V = walina, N = asparagina, C = cysteina, Q = glutamina, G = glicyna, S = seryna, T = treotonina, Y = tyrozyna, R = arginina, H = histydyna, K = lizyna, D = kwas asparaginowy i E = kwas glutaminowy.
Poszczególne sekwencje reszt aminokwasowych wywodzące się z regionu rdzeniowego i podtypy, z których je otrzymano są następujące:
1. PEGRTWAQ, podtyp 1a albo 1b
2. STGKSWGK, podtyp 2a albo 2b
3. SEGRSWAQ, podtyp 3a albo 4.
Inny zestaw polipeptydów obejmuje typowo-swoisty epitop otrzymany z niestrukturalnego regionu 4 wirusa HCV (NS4). Ten drugi zestaw obejmuje obszar pomiędzy resztami aminokwasowymi 1689 a 1718 wirusa HCV-1 i homologicznymi regionami innych typów HCV.
Poszczególne sekwencje reszt aminokwasowych oraz typy i podtypy, z których one pochodzą są następujące:
1. CSQHLPY, podtyp 1a
2. CASHLPY, podtyp 1b
3. CASRAAL, podtyp 2a albo 2b.
Jeszcze inny zestaw polipeptydów obejmuje epitop typowo-swoisty albo epitopy swoiste względem wiązki typów, otrzymane z niestrukturalnego regionu 5 (NS5) wirusa zapalenia wątroby typu C. Ten zestaw znajduje się pomiędzy resztami aminokwasowymi 2281 a 2313 wirusa HCV-1 i homologicznymi regionami innych typów wirusa zapalenia wątroby typu C.
Poszczególne sekwencje reszt aminokwasowych oraz typy i podtypy, z których one pochodzą są następujące:
1. PDYEPPWHG, podtyp 1a
2. PDYVPPVVHG, podtyp 1b
3. PDYQOATVAG, podtyp 2a
4. PGYEPPTVLG, podtyp 2b
5. FAQASPVW, podtyp 1a
6. FPPQALPIW, podtyp 1b
175 342
7. FPQALPAW, podtyp 2a
8. FPPQALPPW, podtyp 2b.
Sekwencje reszt aminokwasowych opisanych powyżej epitopów typowo swoistych i typowo swoistych wobec wiązki typów, są kodowane przez cząsteczki kwasu nukleinowego. Te cząsteczki kwasu nukleinowego są użyteczne jako sondy, np. w próbach plamienia Southera lub w innych próbach rozpoznania DNA, takich jak próba wychwytywania, opisana w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.868.105 i 5.124.246.
Cząsteczki kwasu nukleinowego, które mogąbyć stosowane w sposobie według wynalazku, mogą stanowić cząsteczki komplementarne do sekwencji kwasu nukleinowego flankujących regiony kodujące epitopy typowo swoiste i epitopy swoiste wobec wiązki typów. Te cząsteczki kwasu nukleinowego są użyteczne do prowadzenia łańcuchowej reakcji z udziałem polimerazy (PCR) do oznaczania genotypów konkretnych HCV. Wynalazek zilustrowano na rysunku na którym:
Figura 1 przedstawia schemat strategii doświadczalnego oznaczania serotypu.
Figura 2 przedstawia schemat strategii wyczerpującego mapowania epitopu.
Figura 3 przedstawia kompilację wykresów przedstawiających wyniki mapowania epitopu wirusa HCV 1a (Rodney).
Figura 4 przedstawia kompilację wykresów przedstawiających wyniki mapowania epitopu wirusa HCV 2b (Nomoto).
Wirus zapalenia wątroby typu C” albo ”HCV” odnosi się do tych rodzajów wirusa, których typy patogenne powodują NANBH oraz do pochodzących od nich typów atenuowanych albo defektywnych cząstek interferujących. Wirus ten jest opisany w publikacjach cytowanych w niniejszym opisie. Genom HCV jest zbudowany z RNA. Wirusy zawierające RNA charakteryzują się stosunkowo wyższymi szybkościami mutacji spontanicznych, szacowanych na rząd 10'3 do 104 na wbudowany nukleotyd (Fields i Knipe, “Fundamental Virology”, 1986, Raven Press, NY). Poniważ heterogenność i płynność genotypu są u RNA-wirusów cechami dziedzicznymi, w obrębie rodzaju HCV istnieje wiele typów i podtypów, które mogą być wirulentne albo niezłośliwe.
Namnażanie, identyfikacja, detekcja i izolacja różnych typów i izolatów HCV są udokumentowane w piśmiennictwie. Jak zaznaczono, wszystkie sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe pochodząz wymienionych typów HCV. Ilość sekwencji genomowych HCV-1 i aminokwasowych jest taka, jaka jest opisana przez Choo i wsp., Brit. Med. Buli. 1990, 46, 423-441. Ujawnienie zawarte w opisie pozwala na oznaczenie różnych typów.
Użyty w opisie termin “typ” oznacza wirusy HCV różniące się pod względem genotypu o więcej niż około 30%, określenie “podtyp” oznacza wirusy HCV różniące się pod względem genotypu o 10-20%, a określenie “izolat” oznacza wirusy różniące się genotypowo o mniej niż około 10%. “Klasyfikowanie” odnosi się do rozróżnienia jednego typu wirusa HCV od drugiego typu.
W publikacji zgłoszenia międzynarodowego, WO 93/00365 znajduje się informacja o kilku typach/podtypach HCV, zwłaszcza o typie lub podtypie CDC/HCV1 (zwanym również HCV-1). Informacja o jednym typie albo podtypie, taka jak częściowa sekwencja genomowa lub aminokwasowa, jest wystarczająca dla specjalisty z tej dziedziny stosującego standardowe techniki do wyizolowania nowych typów HCV. Przykładowo, przeprowadzono skrining kilku różnych typów HCV w sposób opisany poniżej. Takie typy, które uzyskano z wielu surowic ludzkich (i z różnych stref geograficznych) klasyfikowano stosując sposób i odczynniki opisane w niniejszym opisie.
Wprowadzono strukturę genomu i sekwencję nukleotydową genomowego RNA wirusa HCV-1. Okazuje się, że genom jest jednoniciowym RNA zawierającym 10.000 nukleotydów. Genom posiada nić dodatnią i ciągłą, translacyjną otwartą ramkę odczytu (ORF) kodującą poliproteinę złożoną z około 3000 aminokwasów.
W tej ramce ORF, białko strukturalne jest kodowane w mniej więcej pierwszej ćwiartce regionu końca aminowego, a z większej części tej poliproteiny powstają białka niestrukturalne (NS). Przy porównaniu ze wszystkimi znanymi sekwencjami wirusowymi, obserwuje się niewielkie ale
175 342 znaczące ko-liniowe homologię z białkami mestrukturalnymi (NS) z rodziny flaviwirusa i pestywirusami (co do których, obecnie uważa się, że stanowią część rodziny Flaviwirusów).
Opierając się na przypuszczalnych resztach aminokwasowych kodowanych przez sekwencję nukleotydową HCV-1 i na innym dowodzie, wyprowadzono możliwe domeny białkowe kodowanej poliproteiny HCV oraz przybliżone wiązania. Są one przedstawione w tabeli 1.
Tabela 1
| Przypuszczalna domena | Przybliżone wiązania (numery aminokwasów) |
| C (białko nukleokapsydu) | 1-191 |
| El (białko otoczki wirionu) | 192-383 |
| E2/NS1 (otoczka) | 384-800 |
| NS2 (funkcja nieznana) | 800-1050 |
| NS3 (proteaza) | 1050-1650 |
| NS4 (funkcja nieznana) | 1651-2100 |
| NS5 (polimeraza) | 2100-3011 (koniec) |
Te domeny są przypuszczalne. Przykładowo, granica E1-NS2 znajduje się prawdopodobnie w regionie 750-810, a granica NS3-NS4 istnieje przypuszczalnie w regionie około 1640-1650. Istnieje również dowód na to, ze wersja C zawierająca 191 aminokwasów (aa) jest prekursorem podlegającym dalszemu przetwarzaniu do długości około 170 aminokwasów i do NS2. Obydwa białka NS4 i NS5 są dalej przetwarzane do dwu białek dojrzałych.
Różne typy HCV definiuje się według różnych kryteriów, takich jak np. ORFo długości od około 9.000 nukleotydów do około 12.000 nukleotydów, kodująca białko o rozmiarach podobnych do rozmiarów HCV-1, kodowana poliproteina o właściwościach hydrofobowych i/lub antygenowych podobnych do tych, jakie posiada HCV-1 oraz obecność ko-limowych sekwencji polipeptydowych zachowanych w wirusie HCV-1.
Do identyfikacji typów HCV można zastosować następujące parametry homologii kwasu nukleinowego i homologii aminokwasowej, bądź pojedynczo bądź w kombinacji. Na ogół, jak podano powyżej, różne typy HCV wykazują około 70% homologii, podtypy wykazują 80-90% homologii, a izolaty charakteryzują się homologią około 90 procentową.
Używane w opisie określenie: polinukleotyd “pochodzący z” określonej sekwencji odnosi się do sekwencji polinukleotydowej złożonej z co najmniej około 6 nukleotydów, korzystnie, co najmniej około 8 nukleotydów, korzystniej, co najmniej około 10 do 12 nukleotydów, a nawet bardziej korzystnie, co najmniej około 15 do 20 nukleotydów korespondujących z regionem tej określonej sekwencji nukleotydowej. Wyrażenie “korespondujący” oznacza homologiczny z określonąsekwencjąalbo do niej komplementarny. Korzystnie, sekwencja regionu, z którego pochodzi polinukleotyd jest homologiczna z sekwencją unikalną w genomie HCV albo jest do tej sekwencji komplementarna. Techniki hybrydyzacji do oznaczania komplementarności sekwencji kwasów nukleinowych są znane. Są one np. opisane przez Maniatisa i wsp. (1982). Ponadto, niedopasowania polinukleotydów dupleksowych powstających w wyniku hybrydyzacji można oznaczyć znanymi technikami, w tym np. techniką trawienia nukleazą, takąjak nukleaza S1, która swoiście trawi jednoniciowe obszary polinukleotydów dupleksowych. Regiony, z których mogą pochodzić typowe sekwencje DNA obejmują, ale nie ograniczają się do np. regionów kodujących epitopy typowo swoiste oraz regiony nie podlegające transkrypcji ani/lub translacji.
Pochodny polinukleotyd niekoniecznie fizycznie pochodzi z przedstawionej sekwencji nukleotydowej, ale może być otrzymany w dowolny sposób, w tym np. przez syntezę chemiczną, przez replikację DNA albo przez odwrotną transkrypcję lub translację. Poza tym, można modyfi8
175 342 kować kombinacje regionów odpowiadających wyznaczonej sekwencji znanymi metodami, tak, aby były one odpowiednie do zamierzonego zastosowania.
Podobnie, określenie: polipeptyd albo sekwencja aminokwasowa “pochodząca z” określonej sekwencji aminokwasowej albo sekwencji kwasu nukleinowego odnosi się do polipeptydu posiadającego sekwencję aminokwasową identyczną z tą jaką posiada polipeptyd kodowany w tej sekwencji albo jego części, która to część składa się z co najmniej 3 do 5 aminokwasów, korzystniej, co najmniej 8-10 aminokwasów, ajeszcze korzystniej, co najmniej 11 do 15 aminokwasów albo odnosi się do polipeptydu, który jest możliwy do identyfikacji immunologicznej za pomocą polipeptydu kodowanego w tej sekwencji. Termin ten obejmuje również polipeptyd wytwarzany przez ekspresję określonej sekwencji kwasu nukleinowego.
Rekombinantowy lub pochodny polipeptyd nie musi powstawać w wyniku translacji określonej sekwencji kwasu nukleinowego. Można go wytwarzać w dowolny sposób, obejmujący np. syntezę chemiczną albo ekspresję rekombinantowego układu ekspresyjnego albo izolację z HCV, w tym z mutowanego HCV. Polipeptydy przedstawione w niniejszym opisie są relatywnie krótkie, a zatem, najłatwiej się je syntetyzuje drogą chemiczną.
Taki rekombinantowy lub pochodny polipeptyd może zawierać w swej sekwencji jeden lub większą ilość analogów aminokwasów albo aminokwasów nie występujących w stanie naturalnym. Metody wbudowywania analogów aminokwasów do sekwencji są znane. Można również włączać jeden lub większą ilość znaczników, co jest sprawą znaną dla specjalisty z tej dziedziny. Szczegółowy opis analogów i “mimotopów” znajduje się w opisie patentu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5.194.392.
Do analogów peptydowych należą analogi, w których dokonano delecji, addycji, podstawienia albo modyfikacji przy zachowaniu zdolności rozpoznawania typu wirusa HCV. Do korzystnych “podstawień” należąpodstawienia konserwatywne, to znaczy takie, w których dana reszta jest zastąpiona przez inną resztę tego samego typu. Jak wiadomo, aminokwasy występujące w stanie naturalnym można dzielić na kwaśne, zasadowe, obojętne i polarne albo obojętne i niepolarne. Ponadto, trzy kodowane aminokwasy są aromatyczne. Korzystne jest, aby kodowane polipeptydy różniące się od naturalnego epitopu zawierały podstawione kodony dla aminokwasów należących do tej samej grupy co zastępowany aminokwas. Tak więc, aminokwasy zasadowe: Lys, Arg i His sąw zasadzie wzajemnie wymienialne, aminokwasy kwaśne: kwas asparaginowy i kwas glutaminowy są wzajemnie wymienialne, obojętne, polarne aminokwasy: Ser, Thr, Cys, Gln i Asn są wzajemnie wymienialne, niepolarne alifatyczne aminokwasy: Gly, Ala, Val, Ile i Leu sąw stosunku do siebie nawzajem konserwatywne (ale z powodu rozmiarów, ściślej spokrewnione są Gly z Ala oraz Val z Ile i z Leu), a także aromatyczne aminokwasy: Phe, Trp i Tyr są wzajemnie wymienialne. Prolina jest aminokwasem niepolarnym i obojętnym, a pomimo tego stwarza trudności z powodu swego wpływu na konformację. Podstawienia prolinąlub w miejsce proliny nie są korzystne za wyjątkiem przypadków, kiedy można uzyskać tę samą albo zbliżoną konformację. Do polarnych aminokwasów reprezentujących zmiany konserwatywne należą Ser, Thr, Gln, Asn i w mniejszym stopniu Met. Ponadto, Ala, Gly i Ser, jakkolwiek klasyfikuje się je w różnych kategoriach, wydają się być wzajemnie wymienialne, a Cys dodatkowo pasuje do tej grupy albo może być klasyfikowana do polarnych obojętnych aminokwasów.
Należy poza tym zaznaczyć, że jeśli polipeptydy wytwarza się syntetycznie, można również dokonywać podstawień przez aminokwasy, które nie są kodowane przez dany gen. Do takich alternatywnych reszt należą na przykład omega-aminokwasy o wzorze H2N(CH2)nCOOH, w którym n ma wartość 2 do 6. Sąto obojętne, niepolarne aminokwasy, takie jak sarkozyna (Sar), t-butylo-alanina (t-BuA), t-butylo-glicyna (t-BuG), N-metylo-izoleucyna (N-Mel le) i norleucyna (Nle). Przykładowo, fenyloglicynę można podstawić w miejsce Trp, Tyr albo Phe, aromatycznego aminokwasu obojętnego. Cytrulina (Cit) i sulfotlenek metioniny (MSO) są polarne, ale obojętne, cykloheksyloalanina (Cha) jest obojętna i niepolarna, kwas cysternowy (Cya) jest kwaśny, a omityna (Orn) jest zasadowa. Właściwości konformacyjne nadane obecnością reszt próbny można zachować podstawiając jedną lub większą ilość tych reszt hydroksyproliną (Hyp).
175 342
Termin “aalmukleotyd rekomóinantowy” oznacza w niniejszym oaicib polinukleotyd pochodzenia genomowbgo, cDNA, półsyntetyczny albo syntetyczny, który ze względu na swe pochodzenie albo w wyniku manipulacji (1) nie jest związany ani z całością ani z częścią aolinuklbatydu, z którym jest związany w stanie naturalnym, (2) jest połączony z aalinukleotydem innym niż ten, z którym jest związany w stanie naturalnym albo (3) nie występuje w ^ο naturalnym.
Termin “palinuklootyd” oznacza w niniejszym opisie palimerycpuą formę nuklootydów o dowolnej długości, zarówno aybauukleotydśw jak i dbzoksyayóouukleotydów. Termin ten odnosi się tylko do struktury pierwszoazędowej cząsteczki. Tak więc, obejmuje on dwu- i gednoniciowy dNa i RNA. Zawiera on również znane typy modyfikacji, np. znaczniki znane w stanie techniki, formy metylowane, formy o strukturze “cap” (osłonięte), formy zawierające podstawienie jednego lub większej ilości naturalnie występujących nukleotydów analogiom, polinukleotydy zawierające modyfikacje międzynukleotydowe, takie jak np. wiązania nie zawierające ładunków (np. metylofocfonianowe, fosfotrójestrowe, amidofosforenawb, karbammianowo i podobne) oraz takie, które zawierają ładunki (np. tiofocforany, ditiofasforany i podobno), takie, które zawibrąjąrespty wiszące, np. białka takio jak nukleazy, toksyny, przeciwciała, peptydy sygnalno i poli-L-lizyna, aolinukloatydy pawieaająco interkalatary (takio jak akrydyne, acaraleu i podobne), zawierające chelatory (np. metale, metale radioaktywno, bor, metale utleniająco i podobne), takie, które zawierają środki alkilujące, takie, które zawierają wiązania modyfikowane (np. alfa anomoryczne kwasy nukleinowe i podobne) oraz niemodyfikowane formy tego polmukleotydu. Polinuklbatydy przedstawione w opisie są relatywnie krótkie, a zatom łatwo je otrzymać na drodze syntezy chemicznej.
Określenie “oczyszczony aolipeptyd” odnosi się do aolipbptydu w stanie zasadniczo wolnym od innych aaliaeptydów, to znaczy, w kompozycji zawierającej co nagmuieg około 50% wagowych (stosunek żądanego polipeptydu do całkowitej ilości wszystkich poliabatydów w kompozycji), korzystnie co najmniej około 70%, a nawet bardziej korzystnie, co najmniej około 90% żądanego aalipeatydu, bez uwzględniania materiału niebiałkowego w toj kompozycji. Techniki oczyszczania wirusowych aoliaeptydów są znano. Oczyszczono przeciwciała są zdefiniowane podobnie w stanie techniki.
Wyrażenie “epitop” oznacza determinantę antygenową polipoptydu. Eaitoa możo zawierać 3 albo większąilość aminokwasów decydujących o miejscu wiązania z przeciwciałem. W zasadzie, opitop składa się z co najmniej 5 aminokwasów, a czasem zawiera co najmniej 8 aminokwasów. Metody mapowania opitopów są znane.
Termin “epitop typowo-swoisty” odnosi się do epitopu występującego w jednym typie HCV. Wyrażenie “opitop swoisty dla wiązki typów” znajduje się w więcej niż jednym, ale nio we wszystkich typach HCV. Przykładowo, konkretny epitop możo być rozpoznawany przez przeciwciała pochodzące od pacjenta zakażonego wirusom HCV-1, ale nie będą rozpoznawano albo będą rozpoznawane mniej skutecznie przez przeciwciała pochodzące od pacjenta zakażonego wirusem HCV-2. Podobnie, opitop swoisty dla wiązki typów pochodzący z HCV-3 możo być rozpoznany przez przeciwciała pochodzące od pacjenta zakażonego wirusem HCV-3 albo HCV-4, ale nie przez przeciwciała pochodzące od pacjenta zakażonego wirusami HCV-1 albo HCV-2. “Konserwatywnymi eaitaaami” są te, które są rozpoznawane przez przeciwciała swoiste dla wszystkich typów HCV.
Polipeptyd jest “reaktywny immunologicznie” z przeciwciałom, które przyłącza się do poptydu w wyniku rozpoznania przez to przeciwciało swoistego epitopu zawartego w tym aolipbptydzie. Reaktywność immunologiczną można oznaczać przez wiązanie z przeciwciałom, zwłaszcza przez oznaczanie kinetyki wiązania z przeciwciałem i/lub przez oznaczanie kompetycji wiązania, stosując jako czynniki konkurencyjno znane palipeptydy zawierające eaitap, przeciwko któremu jest skierowane to przeciwciało. Techniki określania, czy aolipeatyd jest reaktywny immunologicznie z danym przeciwciałem są znano.
Stosowany w niniejszy opicie termin “przeciwciało” odnosi się do polipeptydu albo grupy aoliaeatydrw zawierających co najmniej jedno miejsce wiążąco. “Miejsce wiążąco przeciw10
175 342 ciała” albo “domena wiążąca” powstają w wyniku sfałdowama domen zmiennych cząsteczki przeciwciała z utworzeniem trójwymiarowych przestrzeni wiążących, w których kształt powierzchni wewnętrznej i rozmieszczenie ładunków jest komplementarne do charakterystycznych cech epitopu na antygenie, co pozwala na reakcję immunologiczną z tym antygenem. Miejsce wiążące przeciwciała może się tworzyć z domeny o łańcuchu ciężkim i/lub lekkim (odpowiednio VH i VL) tworzącej hiperzmienne pętle biorące udział w wiązaniu antygenu. Określenie “przeciwciało” oznacza np. przeciwciała zwierząt kręgowych, przeciwciała hybrydowe, przeciwciała chimerowe, przeciwciała zmienione, przeciwciała jednowartościowe, białka Fab i przeciwciała jedno-domenowe.
Przeciwciała swoiste wobec polipeptydów i polipeptydy można wytwarzać dowolnym sposobem znanym w stanie techniki. Przykładowo, polipeptydy na ogół zawiesza się w buforze akceptowalnym fizjologicznie, miesza się je z odpowiednim adiuwantem i wstrzykuje zwierzęciu. Sposoby otrzymywania przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych są znane i nie są podane w niniejszym opisie.
Określenie “polipeptyd” oznacza polimer aminokwasowy i nie określa długości własnej produktu. Tak więc, definicją polipeptydu są objęte polipeptydy, oligopeptydy i białka. Termin ten nie obejmuje modyfikacji post-ekspresyjnych tego polipeptydu, np. glikozylacji, acetylacji, fosforylacji i podobnych. Definicją tą objęte są np. polipeptydy zawierając jeden lub większą ilość analogów aminokwasów (w tym np. aminokwasy nie występujące w stanie naturalnym i podobne), polipeptydy z podstawionymi wiązaniami oraz inne znane modyfikacje, zarówno występujące w stanie naturalnym, jak i nie występujące w naturze.
Pod określeniem “leczenie” rozumie się profilaktykę i/lub terapię.
Stosowane w opisie określenie “osobnik” odnosi się do kręgowców, zwłaszcza należących do rodzaju ssaków i obejmuje ale nie ogranicza się do zwierząt (np. psów, kotów, bydła, świni, owiec, kóz, królików, myszy, szczurów, świnek morskich i podobnych) oraz do naczelnych, w tym małp, szympansów, pawianów i ludzi.
Wyrażenie “nić sensowna” kwasu nukleinowego oznacza sekwencję wykazującąhomologię do sekwencji mRNA. “Nić antysensowna” oznacza sekwencję komplementarną do nici sensownej.
“Genom z nicią dodatnią” danego wirusa oznacza taki wirus, w którym genom, zarówno RNA jak i DNA, jestjednoniciowy i koduje wirusowy polipeptyd albo polipeptydy. Przykładami RNA wirusów z nicią dodatnią są Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picomaviridae i Caliciviridae. Do takich wirusów należą również Flaviviridae, poprzednio klasyfikowane jako Togaviridae (Fields i Knipe, 1986).
Termin “zawierająca przeciwciało próbka ciała” odnosi się do składnika ciała danego osobnika służącego jako źródło żądanych przeciwciał. Zawierające przeciwciała składniki organizmu sąznane i obejmująale nie ograniczają się do np. osocza, surowicy, płynu rdzeniowego, płynu limfatycznego, zewnętrznych sekcji przewodów: oddechowego, pokarmowego i moczowo-płciowego, łez, śliny, mleka, białych krwinek i szpiczaków.
“Próbka biologiczna” oznacza próbkę tkanki lub płynu wyizolowanego z osobnika, obejmującą, ale nie ograniczającą się do np. osocza, surowicy, płynu rdzeniowego, płynu limfatycznego, zewnętrznych sekcji skóry i przewodów: oddechowego, pokarmowego i moczowo-płciowego, łez, śliny, mleka, komórek krwi, nowotworów i narządów. Termin ten obejmuje również próbki składników hodowli komórkowych in vitro (obejmujących, ale nie ograniczających się do kondycjonowanego medium wytworzonego w wyniku wzrostu komórek w podłożu hodowlanym, komórek przypuszczalnie zakażonych wirusem, komórek rekombinantowych i składników komórkowych).
W praktycznym wykonaniu wynalazku, o ile nie podano inaczej, są zastosowane konwencjonalne techniki biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinacji DNA, syntezy polipeptydów i kwasów nukleinowych i immunologii znane w stanie wiedzy. Techniki te są w pełni wyjaśnione w piśmiennictwie, np.: Maniatis, Fitsch i Sambrook: “Molecular Cloning: A. Laboratory Manual” (1992); “DNA cloning, tomy I i II” (wyd. D.N. Glover, 1985)· “Oligonucleo tide Synthesis” (wyd. M.J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization (wyd. B.D. Hames i S.J. Hig175 342 gins, 1984); “Transcription and Translation” (wyd. B.D. Hames i S.J. Higgins, 1984); “Animal Cell Culture” (wyd. R.I. Freshney, 1986), “Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, ”A Practical Guide To Molecular Cloning”, (1984); seria: “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells” (wyd. J.H. Miller i M.P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Meth. Enzymol., tom 154 i tom 155 (wyd. odpowiednio Wu i Grossman i Wu), wyd.: Mayer i Walker, 1987), “Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology” (Academic Press, Londyn); Scopes, (1987) “Protein Purification: Principles and Practice”, II wyd. (Springer Verlag, N.Y) i “Handbok of Experimental Immunology”, tom I-IV (wyd.: D.M. Weir i C.C. Blackwell, 1986).
Wszystkie patenty, zgłoszenia i publikacje patentowe cytowane powyżej i poniżej są włączone do opisu jako odnośniki.
Sposoby wykrywania i klasyfikowania infekcji wirusem HCV obejmują zarówno próby immunologiczne jak i identyfikację kwasu nukleinowego metodami obejmującymi, ale nie ograniczającymi się do hybrydyzacji metodąSouthema i łańcuchowej reakcji z udziałem polimerazy (PCR). W celu identyfikacji zakażenia HCV, próbkę biologiczną inkubuje się z jednym z polipeptydów opisanych w niniejszym opisie w warunkach umożliwiających wiązanie antygenu z przeciwciałem i wykonuje się oznaczenie, czy przeciwciała w próbce wiążą się z epitopem obecnym na polipeptydzie.
Peptydy zawierające epitopy typowo swoiste i epitopy swoiste dla wiązki typów są użyteczne w próbach immunologicznych do wykrywania obecności przeciwciał HCV albo obecności wirusa i/lub antygenów wirusowych w próbkach biologicznych. Projektowanie prób immunologicznych jest przedmiotem ogromnej zmienności i znanych jest wiele formatów. W próbie immunologicznej będzie się stosować co najmniej jeden epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów. W jednym rozwiązaniu, w próbie immunologicznej stosuje się kombinację epitopów typowo swoistych i/lub epitopów swoistych dla wiązki typów.
Polipeptydy są przydatne do znaczenia typu HCV przez zastosowane epitopów do oznaczania obecności przeciwciał swoistych względem danego typu albo przeciwciał swoistych dla wiązki typów. Polipeptydy te są również przydatne do generowania przeciwciał swoistych względem danego typu albo przeciwciał swoistych dla wiązki typów, które to przeciwciała mogą być następnie stosowane w próbie immunologicznej do odróżniania różnych typów HCV.
Polipeptydy te pochodzą z trzech różnych regionów genomu HCV. Jeden zestaw polipeptydów zawiera epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów otrzymany z rdzieniowego regionu HCV. Następny zestaw polipeptydów zawiera epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów, otrzymany z niestrukturalnego regionu 4 (NS4) wirusa HCV. Trzeci zestaw polipeptydów zawiera epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów, otrzymany z niestrukturalnego regionu 5 (NS5) wirusa zapalenia wątroby C. Ten zestaw znajduje się pomiędzy resztami aminokwasowymi 2281 a 2313 wirusa HCV-1 i w homologicznych regionach innych typów wirusa zapalenia wątroby typu C.
Polipeptydy te nadają się do stosowania w próbach immunologicznych na określenie jednego albo większej ilości typów HCV. W celu oznaczenia jednego typu, próbkę kontaktuje się z jednym lub z większą ilością polipeptydów zawierających epitop swoisty dla wiązki typów w warunkach umożliwiających wiązanie antygenu z przeciwciałem i oznacza się, czy przeciwciała w próbce wiążą się z epitopem.
W próbie immunologicznej zaprojektowanej na oznaczanie konkretnego typu wirusa HCV, pobiera się od osobnika próbkę biologiczną, kontaktuje się ją z pierwszym typowo swoistym epitopem albo z epitopem swoistym dla wiązki typów w warunkach umożliwiających wiązanie przeciwciała z antygenem, kontaktuje się jąz drugim typowo swoistym epitopem albo z epitopem swoistym dla wiązki typów w warunkach umożliwiających wiązanie przeciwciała z antygenem i oznacza się, czy przeciwciała w próbce wiążą się z pierwszym lub z drugim epitopem. Procedury te można powtarzać z dowolną ilością polipeptydów zawierających epitopy typowo swoiste i/lub epitopy swoiste dla wiązki typów.
175 342
Na ogół, próba immunologiczna na obecność przeciwciał anty-HCV polega na selekcji i przygotowaniu badanej próbki podejrzanej o obecność przeciwciał, takiej jak próbka biologiczna, inkubacji tej próbki z epitopem typowo swoistym lub z epitopem swoistym dla wiązki typów w warunkach pozwalających na powstawanie kompleksów antygen-przeciwciało i wykryciu powstania takich kompleksów. Odpowiednie warunki inkubacji są znane z piśmiennictwa. Próbę immunologiczną można bez ograniczeń prowadzić w formacie heterogennym albo homogennym, może to być typ standardowy lub kompetytywny.
W formacie heterogennym wiąże się epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów ze stałym podłożem w celu ułatwienia oddzielenia próbki od polipeptydu po inkubacji. Przykłady stałych podłoży, które można użyć obejmują, ale nie ograniczają się do nitrocelulozy (np. w formie błony albo ścianki wgłębienia w płytce do mikromianowania), polichlorku winylu (np. w formie arkuszy albo ścianki wgłębienia w płytce do mikromianowania), lateksu polistyrenowego (np. w formie perełek albo płytek do mikromianowania, fluorku poliwinylidyny znanego pod nazwą immulonR), bibuły dwuazowanej, błon nylonowych, perełek aktywowanych i perełek Proteiny A. W formacie heterogennym można np. stosować płytki do mikromianowania Dynatech ImmulonR 1 albo ImmulonR 2 albo perełki polistyrenowe o średnicy 0,25 cala (Precision Plastic Bali). Stałe podłoże zawierające typowo swoisty epitop albo epitop swoisty dla wiązki typów zazwyczaj przemywa się po oddzieleniu go od badanej próbki a przed detekcją związanych przeciwciał. Formaty standardowe i kompetytywne są znane w piśmiennictwie.
W formacie homogennym, badanąpróbkę inkubuje się z typowo swoistym epitopem albo z epitopem swoistym dla wiązki typów w roztworze. Przykładowo, próbę prowadzi się w warunkach, w których zachodzi precypitacja utworzonych kompleksów antygen-przeciwciało. Zarówno formaty standardowe jak i kompetytywne tych prób są znane w stanie techniki.
W formacie standardowym wykonuje się bezpośredni pomiar ilości przeciwciał HCV tworzących kompleks z epitopem typowo swoistym albo z epitopem swoistym dla wiązki typów. Można tego dokonać przez oznaczenie zdolności wiązania znakowanych anty-ksenogenicznych (np. anty-ludzkich) przeciwciał rozpoznających epitop na przeciwciałach anty-HCV w wyniku powstawania kompleksu. W formacie kompetytywnym, ilość przeciwciał obecnych w próbce oznacza się pośrednio, przez monitorowanie wpływu współzawodnictwa na wiązanie znanej ilości znakowanego przciwciała (lub innego kompetytywnego ligandu) w tym kompleksie.
W teście inhibicyjnym oznacza się zdolność przeciwciał do wiązania się z polipeptydami zawierającymi różne epitopy typowo swoiste lub epitopy swoiste dla wiązki typów. Przeciwciała te najpierw kontaktuje się z polipeptydami zawierającymi epitop (epitopy) dlajednego typu lub wiązki typów HCV i następnie z polipeptydami zawierającymi epitop (epitopy) dla innego typu lub wiązki typów HCV. Procedurę tę można powtórzyć dla dodatkowych typów lub wiązki typów HCV.
Utworzone kompleksy zawierające przeciwciało anty-HCV (albo w przypadku próby kompetytywnej, pewną ilość przeciwciała współzawodniczącego) wykrywa się jedną z wielu znanych technik, zależnie od formatu. Przykładowo, nieznakowane przeciwciała HCV w kompleksie można wykryć stosując komugat antyksenogenicznej 1 g skompleksowanej ze znacznikiem (np. znacznikiem enzymatycznym).
W typowych próbach immunologicznych, badanąpróbkę, na ogół próbkę biologiczną, inkubuje się z polipeptydami zawierającymi jeden lub większą ilość epitopów typowo swoistych albo epitopów swoistych dla wiązki typów w warunkach pozwalających na powstawanie kompleksów antygen-przeciwciało. Można stosować różne formaty. Przykładowo, można zastosować technikę kanapkową, w której przeciwciało związane ze stałym podłożem inkubuje się z badaną próbką, następnie podłoże przemywa się, inkubuje się z drugim znakowanym przeciwciałem przeciw badanemu typowi i powtórnie przemywa się nośnik. Badany typ wirusa wykrywa się oznaczając, czy to drugie przeciwciało wiąże się z podłożem. W formacie kompetytywnym, który może być heterogenny lub homogenny, badanąpróbkę zazwyczaj inkubuje się z przeciwciałem oraz bądź kolejno bądź jednocześnie, ze znaczonym antygenem konkurencyjnym. Te i inne formaty są znane w technice.
175 342
Przeciwciała skierowane przeciw epitopom typowo swoistym albo epitopom swoistym dla wiązki typów można użyć w próbach immunologicznych do wykrywania antygenów wirusowych u pacjentów zakażonych wirusem zapalenia wątroby NANBH i u zakażonych dawców krwi. Ponadto, przeciwciała te mogą być szczególnie użyteczne do wykrywania dawców i pacjentów z ostrą fazą choroby.
W próbie immunologicznej można stosować np. przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw epitopowi typowo swoistemu albo epitopowi swoistemu wobec wiązki typów, kombinację przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw epitopom jednego antygenu wirusowego, monoklonalne przeciwciała skierowane przeciw epitopom różnych antygenów wirusowych, przeciwciała poliklonalne skierowane przeciw temu samemu antygenowi wirusowemu albo przeciwciała poliklonalne skierowane przeciw różnym antygenom wirusowym. Procedury postępowania mogą być oparte np. na zasadzie kompetycji albo na reakcji bezpośredniej lub na technikach kanapkowych. W próbach tych można stosować podłoża stałe albo wykorzystywać immunoprecypitację. W większości prób stosuje się znaczone przeciwciało albo znaczony polipeptyd. Jako znaczniki stosuje się znaczniki enzymatyczne, fluorescencyjne, chemiluminescencyjne, radioaktywne albo cząsteczki barwnika. Znane są również techniki, w których amplifikuje się sygnały wysyłane przez sondę. Przykładami takich technik sąte, w których stosuje się biotynę i awidynę, próby immunologiczne z użyciem znaczonego enzymu i pośrednie, takie jak ELISA. Sekwencje reszt aminokwasowych opisanych powyżej epitopów typowo swoistych i epitopów swoistych dla wiązki typów, są kodowane przez cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące te sekwencje. Te cząsteczki kwasu nukleinowego są użyteczne jako sondy, np. w próbach hybrydyzacji Southema albo w innych technikach identyfikacji DNA, takichjak próba wychwytywania ujawniona w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.868.105 i 5.124.246.
Badania nad mapowaniem antygenowym metodą ekspresji cDNA HCV wykazały, że wiele klonów zawierających te cDNA wytwarzało polipeptyd reagujące immunologicznie z surowicą pochodzącą od osobników wykazujących obecność NANBH. Żaden pojedynczy polipeptyd nie był reaktywny immunologicznie ze wszystkimi surowicami. Pięć z tych polipeptydów wykazywało wysoką reaktywność immunologiczną z przeciwciałami przeciw epitopom HCV w tych polipeptydach, które to przeciwciała wykrywano w wielu różnych surowicach od pacjentów, chociaż nie zachodziło całkowite nakładanie się podczas detekcji. Tak więc, wyniki badania immunologicznego polipeptydów kodowanych w różnych klonach świadczą o tym, że w skutecznych systemach wykrywania zakażenia HCV można stosować panele epitopów. Epitopy w takim panelu można konstruować w formie jednego albo wielu polipeptydów. Testy na obecność różnych epitopów mogą być sekwencyjne albo jednoczesne.
Zestawy do diagnostyki immunologicznej zawierające odpowiednie znakowane odczynniki, wytwarza się przez zapakowanie odpowiednich materiałów, łącznie z polipeptydami według wynalazku zawierającym epitopy typowo swoiste bądź epitopy swoiste dla wiązki typów albo przeciwciałami skierowanymi przeciw epitopom typowo swoistym bądź epitopom swoistym dla wiązki typów, w odpowiednich pojemnikach razem z pozostałymi odczynnikami i materiałami wymaganymi do przeprowadzenia oznaczenia jak również odpowiedniego zestawu instrukcji prowadzenia próby.
W sposobie według wynalazku wykonuje się cząsteczki kwasu nukleinowego komplementarne do sekwencji kwasu nukleinowego flankujących regiony kodujące epitopy typowo swoiste i epitopy swoiste dla wiązki typów. Takie cząsteczki kwasu nukleinowego są potrzebne do prowadzenia enzymatycznej reakcji amplifikacji, PCR, w której oznacza się genotyp konkretnego HCV.
Należy zwrócić uwagę na obecność regionów zmiennych i hiperzmiennych w genomie HCV. Zakłada się, że homologia w tych regionach będzie znacznie mniejsza od homologii w całym genomie.
Techniki oznaczania homologii sekwencji kwasu nukleinowego i aminokwasowych są znane w stanie techniki. Przykładowo, można bezpośrednio oznaczyć sekwencję aminokwa14
175 342 sowąi porównać jąz sekwencjami według wynalazku. Alternatywnie, można oznaczyć (zwykle poprzez pośredni cDNA) sekwencję nukleotydową materiału genomowego przypuszczalnego typu wirusa HCV, następnie oznaczyć kodowaną przez nią sekwencję aminokwasową i porównać odpowiednie regiony. Wynalazek zilustrowano następującymi przykładami:
Przykład I. Porównanie głównych epitopów wielu różnych typów HCV Porównano homologię reszt aminokwasowych występującą między różnymi typami i podtypami HCV dla różnych regionów. Podtyp HCV jest taki, jak opisany metodą analizy filogenetycznej Simmonds’a. Numery sekwencji aminokwasowej odpowiadają numerom opisanym dla prototypowej sekwencji HCV-1 (Choo i wsp.). Tabela 2 przedstawia homologię reszt aminokwasowych wyrażonąw procentach dla epitopów typowo swoistych i epitopów swoistych dla wiązki typów regionu nS4 i dla konserwatywnego głównego epitopu. Tabela 3 przedstawia homologię reszt aminokwasowych pomiędzy dwoma epitopami typowo swoistymi albo epitopami swoistymi dla wiązki typów regionu NS5. Tabela 4 przedstawia homologię reszt aminokwasowych wyrażonąw procentach dla konserwatywnych głównych epitopów i epitopów typowo swoistych z regionu rdzeniowego.
Tabela 2
Homologię aminokwasowe (w %) między różnymi podtypami HCV
| Podtyp HCV | Przykłady | skrótów typów | Główne epitopy typowo swoiste regionu NS4 (1689-1718 aa)* | Główny epitop konserwatywny regionu NS4 (1910-1936 aa)* |
| la | HCV-1 | (1a)/(1a) | 100% | 100% |
| 1b | HCV-J | (1a)/(1b) | 83% | 100% |
| 2a | HCV-J6 | (1a)/(2b) | 47% | 93% |
| 2b | HCV-J8 | (1a)/(2b) | 43% | 93% |
Tabela 3
Homologię aminokwasowe (w %) między różnymi podtypami HCV
| Podtyp HCV | Przykłady skrótów typów | Główne epitopy typowo swoiste regionu NS5 (2281-2313 aa)* | Główny epitop typowo swoisty regionu NS5 (2673-2707 aa)* | |
| la | HCV-1 | (1a)/(1a) | 100% | 100% |
| 1b | HCV-J | (1 a)/( 1b) | 76% | 89% |
| 2a | HCV-J6 | (1a)/(2a) | 70% | 83% |
| 2b | HCV-J8 | (1a)/(2b) | 73% | 83% |
| 3a | HCV-E-bl | (1a)/(3a) | 77% | |
| 3b | HCV-Tb | (1a)/(3b) | 83% |
175 342
Tabela 4
Homologię reszt aminokwasowych (w %) między różnymi podtypami HCV
| Podtyp HCV | Przykłady skrótów typów | Konserwatywne główne epitopy regionu rdzeniowego (10-45 aa)* | Główne epitopy typowo swoiste regionu rdzeniowego (67-84 aa)* | |
| la | HCV-1 | (1a)/(l)) | 100% | 100% |
| 1b | HCV-J | (1a)/(1b) | 98% | 100% |
| 2a | HCV-J6 | (1a)/(2a) | 98% | 61% |
| 2b | HCV-J8 | (1a)/(2b) | 98% | 61% |
| 3a | HCV-E-bl | (1a)/(3a) | 93% | 89% |
| 4 | HCV-EG-21 | (1a)/(4) | 98% | 83% |
Przykład II. Synteza peptydów
Zsyntetyzowano dwa zestawy polipeptydów. Pierwszy zestaw zaprojektowano w celu przeprowadzenia mapowania epitopów HCV-1, a drugi zestaw zaprojektowano tak, aby mógł służyć do oznaczeń, które epitopy zidentyfikowane w badaniach nad mapowaniem epitopów są epitopami typowo swoistymi. W pierwszym zestawie polipeptydów zsyntetyzowano techniką “Mimotopes” 64 zestawy (oraz duplikaty) częściowo nakładających się oktapeptydów obejmujące całą poliproteinę HCV-1 (3011 reszt aminokwasowych).
Drugi zestaw polipeptydów przygotowano sposobem opisanym przez Geysen’a (J. Trop. Med. Pub. Health, 21,523-533,1990) i Merrifield’a (J. Am. Chem. Soc. 85,2149-2154,1963).
W tym drugim zestawie polipeptydów, do syntezy epitopu typowo swoistego wyselekcjonowano cztery regiony antygenowe reprezentujące główne epitopy niekonserwatywnych sekwencji w HCV-1 z rdzenia, z regionów NS4, NS5 i odpowiednich sekwencji z podtypów HCV-1b, 2a, 3a i 4. Sekwencję z rdzenia wyselekcjonowano z mniej konserwatywnego regionu reszt aminokwasowych 67-88. Sekwencję z regionu NS4 wyselekcjonowano z reszt aminokwasowych 1689-1718. Sekwencje z regionu NS5 wyselekcjonowano z reszt aminokwasowych 2281-2313 i 2673-2707.
Przykład III. Próbki biologiczne
W celu oznaczenia efektywności polipeptydów pod względem rozróżniania poszczególnych przeciwciał swoistych wobec różnych typów hCv, zebrano surowice od 24 zakażonych chronicznie wirusem NANBH z różnych obszarów świata, w tym ze wschodniego i zachodniego wybrzeża Stanów Zjednoczonych, z Japonii, krajów Europy Zachodniej, krajów Europy Południowej i Południowej Afryki. Izolację wirusowego RNA, syntezę cDNa, reakcje amplifikacji PCR, sekwencjonowanie DNA i hybrydyzację z sondami oligonukleotydowymi prowadzono w sposób opisany przez Cha i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 7144-7148, 1992.
Przykład IV. Procedury mapowania epitopu
W celu określenia, które regiony HCV zawierają epitopy grupowo dwoiste bądź konserwatywne, poddano mapowaniu całąpoliproteinę HCV-1. Zastosowany sposób w zasadzie odpowiada schematowi przedstawionemu na fig. 2.
Zsyntetyzowano techniką “Mimotopes” 64 zestawy (oraz duplikaty) częściowo pokrywających się oktapeptydów w oparciu o całą poliproteinę HCV-1(3011 aminokwasów). Do mapowania epitopów i analizy epitopów swoistych dla wiązki typów wyselekcjonowano panel 40 próbek, z których 25 było próbkami reaktywnego przeciwciała HCV ze Stanów Zjednoczonych, 9 próbek zawierających reaktywny HCV pochodziło z Japonii, a 6 próbek, były to próbki nie zawierające HCV, stanowiące kontrolę negatywną. Próby immunologiczne wykonywano standardową techniką ELISA.
Kryteria identyfikacji głównych epitopów oparto na częstości reakcji przeciwciała i intensywności reakcji przeciwciała (miano) przeciw tym epitopom. Wyniki są przedstawione na fig. 3 i 4.
175 342
Przykład V. Enzymatyczna próba immunologiczna peptydo-pochodna (peptydo-pochodna technika ELISA)
W celu ustalenia optymalnej próby immunologicznej, w której byłyby użyte polipeptydy opisane przykładzie 2, przeprowadzono dwa oddzielne typy peptydo-pochodnej próby ELISA i porównano wyniki. Pierwszym typem próby ELISA był “Nunc MaxiSorb™” polegający na prostej adsorpcji peptydów. W drugim typie użyto zestaw “Nunc Covalinc NH1 M”. W tym teście polipeptydy były wiązane kowalencyjnie. Tworzenie wiązań amidowych między kwasami karboksylowymi a aminami inicjowano przez dodanie karbodiimidu. W celu zmniejszenia hydrolizy, można wytworzyć aktywny ester, dodając do powyższej mieszaniny koniugacyjnej N-hydroksysukcynimidu (NHS).
W pierwszym typie próby ELISA przygotowywano płytki do mikromianowania następująco: Polipeptydy umieszczano w dołkach płytek do mikromianowania Nunc MaxiSorb™ w stężeniu 1 pg/dołek w 100 pl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Polipeptydy pozostawiono do absorpcji przez dobę w temperaturze pokojowej. Następnie płytki przemywano cztery razy roztworem PBS bez detergenta, po czym dołki pokrywano ilością220 pl odczynnika SuperblockR (Pierce) przez godzinę, następnie zasysano bez dalszego przemywania i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem.
Oznaczenie prowadzono w sposób następujący: próbkę surowicy o objętości 5 pl nanoszono do dołków z dodatkiem 100 pl 5% odtłuszczonego mleka i inkubowano przez godzinę w temperaturze 37°C. Następnie dołki przemywano 5 razy w roztworze PBS z dodatkiem 0,05% Tween’u. W celu oznaczenia stopnia wiązania ludzkich przeciwciał do polipeptydów zastosowano koniugat charakteryzujący się powinowactwem oczyszczonej 1 gG koziej anty-ludzkiej znakowanej peroksydazą chrzanu (Jackson Laboratories). Koniugat ten uprzednio rozcieńczano do stężenia 1 gG wynoszącego 5% w 150 mM NaCl, PBS, 5% surowicy końskiej (denaturowanej ciepłem). Ilości po 100 pl tego koniugatu umieszczano w dołkach i inkubowano przez godzinę w temperaturze 37°C. Następnie dołki przemywano 5 razy roztworem PBS/Tween z dodatkiem OPD [dwuchlorowodorku orto-fenyleno-diaminy w ilości jedną tabletkę na bufor wywołujący (0,02% roztwór H2O2 buforowany buforem cytrynianowo-fosforanowym, Sigma] przez 30 minut w temperaturze pokojowej, po czym oznaczano przeciwciała przy 492 nm i 620 nm. Odcięcie oznaczano na podstawie 200 losowych (normalnych) próbek, gdzie 7 odchyleń standardowych od średniej wynosiło około 0,45.
Płytki do mikromianowania dla drugiego typu oznaczeń techniką ELISA przygotowano następująco. Polipeptydy umieszczano w dołkach płytek do mikromianowania “MaxiSorb” w stężeniu 10 mg/dołek w 50 pl wody. Do tych polipeptydów dodano 25 pl 0,1 M odczynnika NHS (sulfo-N-hydroksysukcymmid, Pierce) i 25 pl 0,1 M EDC [1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylokarbodiimid, Sigma] i mieszano w temperaturze pokojowej w czasie 30 minut na tacy wahhwej. Następnie, całą zawartość dodano do 52 ml schłodzonego lodem 0,1 M roztworu węglanu sodowego o wartości pH = 8,6. Ilość 100 pl tej mieszaniny stosowano do pokrywani dołków w płytkach do mikromianowania i następnie inkubowano w temperaturze 4°C w czasie 30 minut. Płytki przemywano 4 razy roztworem o składzie- PBS/0,1 % Triton Χ-100. Płytki te traktowano odczynnikiem o nazwie “Superblock” i dalej prowadzono próbę w sposób podany powyżej.
Uzyskane wyniki s przedstawione w tabelach 5-14.
175 342
T a b e i a 5
Anaiiza sorotypowe opttopśw w różnych typach HCV Region sekwencji: NS4 (1689-1718)
Próbka In Peptyn Peptyn Sekwenjjn zależne on typu
EIA (tpp HCV) '
F- FI y y f
W W
PI W W
CC W W o o a
WWW u u <
w w u
WWW
Q Q W
W W Q
WWW W W O >< ίχ WWW > > > WWW WWW Q Q Q
WWW Fi H W
F-i Fi >
< < <
WWW WWW o o o
WWW
1-1 Fi w w w w w w u u w w w w
W W W w W w* > FI w w W W
o W
CM CM
CM W r-i W i i i i
CM CM CM CM
O O O O r* rj< i# & Ol & Oj
U O O U
O rH < · w n
0X3 0X3 fi cm r-i r-i CM CM W ——'— W -r-i
Orion l—I r—i r-i r-i O fp i I I I O CM
CM CM CM CM r-l OOOO U Ό X) PPPP O r-i O U U U Ui
O r-i w
>H w
ww
Q w
CM
-H
-A Π2
O CM r-i
-ri ε <
S. 0X3 0X3 W
U r-i r-l CM CM FI to ----—— W
-H Orion W
O r-i r-i r-i r-i
I I I I O CO CM CM CM CM O
I OOOO r-l
O 'Φ'ί Ό
S PPPP, o o u u u o to
P >, w
X3 £
o
Pi >, w
o /-Η
Ό
PDREVLY n I
W
O >1 g
4J o
rM
P
-ri 5 W O xi u o > Ol O WO
ScM-tfco-tf o - · · ·
UMOOn s
o
Ό
W u
>.
g w
o rM
P w
•riO
AJ-*
Wt•Old
UW
WW •H ε
o
P o
w r- -η w P • 0) UD •H
Ł w
-r-i l—i
O
P co
O
P
N o
•i—>
O
Ai
O <U
W
| •H | |
| ε | |
| o | |
| P | |
| O | |
| w | |
| H | |
| P | > co cm σι |
| (U | m > ko co |
| N | |
| -H | |
| a; | |
| XI | |
| •o | |
| g | |
| P | |
| o | |
| -r—i | |
| O | cn |
| kO kO co rH O | |
| 0 | |
| CU w | |
| FI FI | 1 CO |
•ri ε
o
P o
4J
LD -r-l ’ί P • (U
UO •H ε
iw
-U
Ή rH o
P co
O
P
N o
-n
O
Ai
O tu w
175 342
Tabela 6
Anaiiza se-ro typowa eptlopów w różnych typach HCV
175 342
175 342
Tabela 8
Anaiiza serotypowa epitopów w różnych typach HCV
175 342
175 342 tO ro
Tabela 10
Zestawienie gfównyhh typowo swOisty^ epltopów w części rdzeniowea i w regiona^ NS4 i NS5 (U c
>, u
to s
G (U ra
G
O
Ω
CN tO
CN
Ω cH (0 rH—· Orf X O co 2 4J i X
OAD0 X—X
XI
Φ
G ω
(0
G φ
ω
G — Ο οο ΛΙΗ Γ >ηΩ a ι Οσι Ω C0 HCO ΟιΩ ω—>4 >
Μ
X
Ω
X
Λ
CN to (Ν
H
XI to
ΓΟ
I >
X
Ω
CN ι
>
X (1) jJ tn •H
O s
tn
ΟΧΙΟ <0l< sss E-<K|X| XXIX 000 MHB XK|K| I I I ft ΰΌ'ί >, ΗΝΰ 4-) 3 •Η -H π—1 ^τ—cw to to to
OCOr-ItNrO jj I I I I ΗΓη>>> 0x000
Η~Κ s Κ
Φ
G
S >,
4-1 tO
Φ ω G ·· Ο Χ4 5 >Η >
Ο ο— > γΗ Η I ο<>
Ο >, ΟΟ •Η Ο 0Χ
G Ο ΦΩ Ν -Η θ' χ χο
Ό G XΩ l-ι Φ >χ -αχ G ΦΐηΟΟ Ο β^Χίϋ -η 5 ι XX ζηΟχΧΧ ΦωηΧΩ Χ0Η-ΉΩ φ
4-1 ω
Ή
Ο
S cn
Ο
Ο (Χ-Η >|00
Ω Ω >
>ίΩ
Ο ι cm 4JC0 -ΗΚΟ ΟιΩ ΒΦ
G
S >1
4-1 (0
Φ cn
G
Ο
X >,
Cu ο
Ω — •tf-r-iLn χ Gro 2Φσι rd
G Φ ι Ο Gm •Η &CN Οι οχ φ γΗ ϊ—(
Χ0->4 >4
X X
Ο χ κι <1 0 0 >
>4
X
Ε-4
X κι >
X
X
X
XI φ
Ω tn •Η ο
cn <ΙΩ| X > > 2 Η«Χ|
Ε-ΊΗ>|Χ <|ΧΧΩ
ΧΧΩ<
ΟΙΒ<ΟΙ >4>4Ο1Χ| to (Ν
I >
X
Ε-4
EH
Χ|* >
XI
XI* I
Ω >
X|
XI
X
Λ (N
Ω0Κ ΜΙΧΧΙΧ X >4
Ο 5 Ο
G-Ω Χγοω 4-1 r-t ΓΟ-Η ><Ν G I (0 O Ω Ω 4-1 CO I Ω (N > OTN0
Φ
G >1
Ω (0 s
G
Φ cn
G —
LO ON< XXx X CN
XcnX G G i >4 ΟΟωΩ •H4JC0X &>G CN X Φ GtN< BB^S (0
CN ίβΩ ιβΛ (N CN Ω Ω i i i i >>>> 0000 ΧΧΧΧ
X
X >4
XI
XI
Φ
G
S
Ω (0
G to
CN ιίΛ rH γ-I i ι >> 00 XX
Ω
ΓΟ
I >
X
Ε-4
Η
Ω >
Φ X
G &! Ο>0 χοχ r-Χ ><Ν >4 G ι 0 0x0 ΩΓ'ΩΖΙΕ-'Ι ΗΦΗΟΙ CUCN0 X—XXI
XI
175 342 ω
g '5
Tabela 11
Anaiiza serotypowa epttopww z ^ζηγΗι typww sekwencji HCV () z próbek chronicznego zapalema wątroby NANBH od ρΗ^γ^ι daw^w Regoon sekwencji: rdzeń (67-84)
Próbka ED Peptyd EIA S/CO Peptyd (typ HCVi Sekwencje typowo zależne
CL Cl Cm Om 2 5 2 5 Cl Cl Cl Cl >4 >1 il« © © © o
Cl Cl O* Om
CX O O < © < < X 2 3: H tO 10 10 CC ić cc cc ©o © © ω η ω ω Cl to to to
CL
S
Cl.
©
Om o
£ o
g >o
CŁ© ‘Ł
W cc cc cc cc cc cc © cc ggJS Ϊ iX2 Xł Ή CN ta ~ β < ra —* *H CN O rH CN «e UO O O O O I I I I «Η «—< r-H m—<
o o o o «σ· tt
Cl cl o- cl u u u u
O
C£ ’Ł
W
Π5 ra o
—- — CN
Λ X> «-<
«—( CN t
Q5 —» CN ra ra ra —
H CS Π T7 <
H CS T? in Hi O O O O U i i ł i ω cH «-Η O O O O (N r — τ O. C. CL C.O o u u υ u co © Os © «—» © UO Γ— © © o
<
H
CC ©
ω
CL ©
©
3:
w ©
to to to cc cc © ©
Om' ω to to *
X> x>
—i CN
43 ra ra ra »-t CN CO *-( CN 'C UO
O © © O
I i II r—< «-Η
O o © © 'C· «τ ’Τ „CL CL CL CL
5J U U U *-t CN © ©
CO UO © © r* Γ* r* © © O r©
CD
Γ* ro ro
TT
C o — O —* i ra i .o «σ· ·-< cn
CO © — ©
<
s
H
CC ©
u
CL ©
to ©
H to ra ra o
CN
I -O X)
CN CN *-* 43 l8 ra ra < r-t CN *-* **
W r-ł CN
J © O
U l I
CN O O
CN © CL CL
Li u u © CN UO —< O Γ ©
© ©
© ©
£
CN ©C#« < < « £ S to to cc cc © © Ld ω to to ra ra ©
CN r—<
I
CN ra ~ co -c· <
***-* to
O* UO ł-<
O O X3 t i ω «—* ©O CN 'C· CN et α © υ u u
ΓCD co
CO
CN
175 342
Analiza serotypowa epitopów z różnych typów sekwencji HCV (I) z próbek chronicznego zapalenia wątroby NANBH od płatnych dawców. Region sekwencji’ NS5 (2281-2313)
O O O O x x < w ££££ X X < X X CU CU CU w > o w > > > > Q Cl Cl U CU CU CU CU SC Q CC CC SC X SC SC 2 2 2 2 E-ι co co E-t W W W W > J > H J w w w
CU CU CU >
CU X X X X
2? 2 2 2 2
O o
c/5 <
1—4 ω
>, c,
Ł)
CU cc l—l
CJ
Cu
£.
Ό
O >, •R o
N
CU o
'3,
S >
x
W <
o <
w l-H < X
Cu CU Cu XXX u
<
>
Eh <
X o
Q
X
| <0 rH | to r—( | ||||
| ίύ | 22 (ϋ | s | ro 22 ro 22 | ||
| ł-1 | rH r\! | fsj | < | rH rH ΓΊ <N | < |
| '*—* | '— | *—* | oo | --. | oo |
| o | rH (M | Ci | ł-H | ' O rH (N O | l-H |
| o | O O | O | W | O O O O | W |
| 1 | 1 1 | ł | w | 1 1 1 1 | w |
| r\i | IM (N | (N | in | ΓΜ (Μ ΓΊ ΓΜ | in |
| o | O O | O | co | O O O O | co |
| -ςτ | =· | T | 2 | tt tt ·α· «e· | 2 |
| a | α cu | α | 1 | Oj Oj Oj Oj | 1 |
| υ | u u | u | Ui | U U O O | Ui |
| cn | kO | rH | r* | σ\ | r\} | DJ | |||
| id | ID | «Η | 1—4 | kO | σ\ | ||||
| • | * | • | • | • | • | • | • | • | |
| rH | Ή | O | ID | r\j | O | ID | O | O |
ro o
c?>
kS ko σ\ ro
DJ
CO r>
o i
co ro
175 342
T a b e 1 a 13
Anaiiza serotypowa epttopów z różnych typów sekwencji HCV (I) z próbek chronicznego zapalema wątroby NANHH od płanny^i dawców. Regoon sekwencji: NS5 (2281-2313)
Ό
O
O •S o
N
O 'θ' §
o co
O
U co
W
Ό a, o
o0 cs
X!
J=>
•O
u.
tz Si tc Si Ssss H W w b ω u w h £> X X I—1 X X X X CU Cu IX >
J J J < < < < o Cu Cl, Cc < Cu Cu Cu td X li. X (0 XI
O *-( oj o O O O O I I I I OJ OJ OJ OJ o o o o s·
Od Od O< O, u u υ u
<
co
I-I
X
X in co
I
O (0 X (0 X
Η Η N N
O Η N (O O O O O I I I I OJ OJ O) OJ o o o o
TT ·>? tt <qOd Od Od Od U U O o
| CT> | o | kO | |
| LD | rH | o | |
| • | • | • | • |
| \£> | O | o | V0 |
τ co Ol O s o ul n in
U <
σ.
LD
OJ
X tEpkopy typowo nieswoje (kgoseIwa^pwnle)
175 342 (0 43 (0 XI r-1 rH CN CN ro 45
Analiza serotypowa epitopów z różnych typów sekwencji HCV (I) z próbek chronicznego zapalenia wątroby NANBH od płatnych dawców. Region sekwencji: NS5 (2281-2313) β
Cu
Ό
O
O
Cw
N
O o
| OOOO | 0 0 0 u |
| X X < X | X X < X * |
| > > > > | |
| CU Cu < CU | CU CU O4 |
| CU O* CU Cu | X X X X |
| χ > α x | w > σ w * |
| X X X X | χ > χ X |
| Q C3 Q U | QQ Q O * |
| cu cu cu cu | Cu Cu CU u< |
| X Q X K | |
| X X X X | |
| 2 2 2 2 | |
| H W » H | |
| ώ η ω ω | |
| > X > w | |
| j j j j | |
| CU CU CU > | |
| CU CU CU CU | |
| X 2 2 X | |
| X X X X | |
| Q Q O £3 | |
| CU CU CU CU | |
| X X X X | |
| <£ < < < | s |
| 2 2 2 2 | -0 |
| ί> M < X | r—( |
| CU Cu Cu Cu | . mM |
| X X X X | W |
| < < < < | |
| cn x Cu x | |
| < X X X | o |
| (łi Cu Ił, Lu | ·*_» |
| X | |
| o |
X .23 o
U U X X
ŹŹ
CU CU X CU w > X X Q Q G. X
Cu
O ’Ł o
x tn '3
O
O ω
Ό
Pm
Θ es
U4
-O
-o i— cu >
o a
CU o
<
>
E-<
<
CU σ
X
Q
CU
CU *
| (0 | 43 | f0’43 | * | ro | 42 | (0 | 43 | — | ro 43 | f0 | 42 | < | ||
| X | r-ί | <N CN | 0 | < | rU | fU | CQ | CN | < | X | rU | r\? | CN | W |
| .— .— | g; | to | •—e | *—' | —* | .— | to | '— | —' | I-I | ||||
| O | rU | CN C-) | i—( | 1-1 | 0 | Ή | <N | n | I-I | O | ▼—1 | C\J | ro | X |
| O | 0 | O O | X | 0 | O | O | O | X | O | 0 | 0 | 0 | X | |
| 1 | 1 | 1 1 | X | 1 | t | I | 1 | X | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| cn | CN | CN CN | Ul | CN | 03 | CN | CN | UO | CN | CN | CQ | CN | UO | |
| O | O | O O | to | O | O | O | O | to | O | O | O | O | tO | |
| Ό· | ΜΓ | -T -<3· | X | σ | xr | *3* | < | X | T | TT | σ- | X | ||
| cu | X | X X | 1 | X | X X | X | 1 | X | X | CU | Χ | 1 | ||
| u | U | u u | Ul | U | u | u | u | β | ϋ | O | o | U | u |
| co | cn | 0 | Γ*** | ko |
| in | T—i | 0 | ||
| • | • | • | • | • |
| ko | O | O | KO |
| 0 | ΓΊ | \0 | CO | \O | co | cn | r* | KO | cn |
| co | in | in | CO | VD | ΓΟ | 0 | ΓΊ | co | |
| in | 0 | 0 | KO | r» | r* | V) | 0 | KO |
-Q r-i
ID <0
Ή KO uo £-<
175 342
Przykład VI. Test inhibicyjny
Testy inhibicyjne przeprowadzono w celu stwierdzenia, czy badane peptydy mogą między sobą współzawodniczyć o wiązanie z przeciwciałami. Zsyntetyzowano trzy zestawy krótkich polipeptydów z regionów rdzeniowych NS4 i NS5 różnych typów sekwencji HCV. Polipeptydy te pokrywają regiony sekwencji aminokwasowych od 1689 do 1696, od 1696 do 1702 i od 1711 do 1917. Testy inhibicji prowadzono dodając do próbki 10 fg powyższych polipeptydów i inkubując próbki w temperaturze 37°C w czasie godziny, po czym prowadzono oznaczenie techniką ELISA, jak opisano powyżej. W przypadkach, kiedy hamowanie wiązania przeciwciała wynosiło powyżej 50%, uznawano, że polipeptyd ma działanie hamujące. Wyniki są przedstawione w tabeli 15.
Tabela 15
1. 2 .
3.
4.
5.
6.
7.
8. 9. 10
SQHLPY
ASRAAL
ASKAAL
PDREVLY
PDYRPPVWHG
PDYQPATVAG
FAQALPWJ
FPPQALPPW
STGKSWGK
SEGRSWAQ
CHIEN-101
CHIEN-102
CHIEN-103
CHIEN-104
CHIEN-105
CHIEN-106
CHIEH-107
CHIEN-108
CHIEN-109
CHIEN-110
Region NS4
Region NS5
Rdzeń
Rdzeń
1712-1717
1712-1717
1712-1717
1696-1972
2304-2313
2304-2313
2281-2288
2281-2288
71-78
71-78 la
2a
2b
1a, 1b, 2a la
2a la
2b
2a & 2b 4
175 342 «0
O
CO
O >>
co
4-i ’Ł
| jo CS | |||||
| w | |||||
| CS | |||||
| «. | Λ | ||||
| JO | CD | r—< | CS | ||
| t—4 | r-ł | «. | ·- | ||
| ·. | (0 | <0 | |||
| KF | ro | r-1 | CS | ||
| CD | I | *»* | ·>—» | ||
| 1 | Ch | ||||
| r* | co | X | |||
| tO | CL· | to | ►J | ♦—ł | |
| ·—- | Z | > | |||
| CL· | ω | ||||
| X | cz | iZ | |||
| O | Ω | ||||
| CL· | u. | CL· |
Główne typowo swoiste epitopy HCV w rdzeniu i w regionach NS4 i NS5
a.
o
o.
ω
CO '3
| 0^0 | |||
| < U A | X X | ||
| 2 2 2 | CL· CL· < | ||
| H to to | J J < | ||
| CZ sz cz | X X tz ϋ | ||
| 0 o o | o w w | ||
| W H w | CO < < | ||
| CL· tO 10 | u u u | ||
| co | |||
| X5 -Q | «—< | JO | |
| •-t CS | Γ- | CS | |
| TT | u | »~ł | |
| co | <2 <2 0 | <2 | |
| 1 | Cr\ | ||
| Γ | ro (0 (0 | CD | ro JO rO |
| to | «-ł CS ΓΊ | tD | »—<·—< CS |
| 1 1 | 1 1 1 | ||
| > > > | > > > | ||
| u u u | UDO | ||
| XXX | XXX |
| U Q< 0- ω X Q CL· | ΞΞ) | o o < u > t> Η H < CL· CL· CL· O ω X X O o CL· CL· | CL· U < o < b- | |
| r—C | ||||
| m | JO | |||
| <s | rH | |||
| <2 | ||||
| CO | ||||
| CS | <0 | co JO | ro | |
| CS | CS CS | •-rt | ||
| «Μ»- | 1 t | 1 | ||
| > | > > | > | ||
| u | o u | o | ||
| X | X X | X |
| <0 n | ||
| > | JO | |
| u | CS | |
| X | ||
| 3 | -1 1 | > |
| ł—1 | < o. i | U |
| CL· | -1 H | X |
| U | ||
| < | CL· < | H |
| O | H | |
| CL· | b- « | |
| CL· | > | > |
| U- | O | o |
| to | to | |
| Λ | 5 | < |
| CS | CZ | Ł4- |
| <2 | u | u |
| <0 | cz | cz |
| CS | cz | cz |
| X | X | |
| JO | o | o |
| «-Η | o | u |
| 1 | σ | to |
| > | < | o |
| u | u | o |
| ii | ϋ |
| >1 | o |
| CL· | |
| O ’Ł | >> |
| o | TO |
| o | £ |
| -o | <o tn |
| 5 | O az |
O
U >
W ł o > e> o o x o — CL·
I»- e> SZ U > CC Q Có O O CL· CZ CZ CZ CZ CL· z u H U
Γo
Γ-*
CS
I m
Γ* \D cs
| <0 CS | |
| <0 | £> JO |
| r-4 | rH O |
| 1 > | 1 1 > > |
| u | o u |
| X X |
H
H
J >
o to g
υ cz cz
X o
u r· ω
o cz
175 342
Przykład VII. Klasyfikowanie HCV w próbce klinicznej
Epitopy typowo swoiste lub swoiste dla wiązki typów przedstawione w tabeli 16, powyżej, użyto w próbie ELISA opisanej w przykładzie 5 do badania 13 próbek klinicznych pochodzących od pacjentów z zapaleniem wątroby nie-A, nie-B (10 płatnych dawców, 3 pacjentów z nabytym przez transfuzję zapaaenmiem wątroby nie-A, nie-B). W tabeli 17 przedstawione są wyniki tych prób. W każdej próbce klinicznej oznaczano reaktywność z dwunastoma różnymi peptydami odpowiadającymi podanym regionom (aa 67-84, 1689-1718 lub 2281 -2313) reprezentującym różne epitopy typowo swoiste lub swoiste względem wiązki typów. Każda próbka daje z danym charakterystycznym dla typu peptydem następującą odpowiedź: brak reakcji (NR), słaba reakcja (WR) albo reakcja (R). Wyniki tej próby określają genotyp HCV dla każdej próbki, korelujący z genotypem HCV oznaczonym w łańcuchowej reakcji z udziałem polimerazy, PCR, podanym w kolumnie o prawej stronie.
175 342
Serotyp .XLS
175 342
HCV DNA(RNA)
9.000 , Proteina HCV
3,000
2,993
3,000
FIG. 2
175 342
testowane próbki cząstotliwość względna
800 Η
8H28-1 ίαωη miano przeciwciała
175 342
testowane próbki (OMfl
Miano przeciwciała częstotliwość względna
175 342
| M U | ||||
| -μ | ||||
| ni | ||||
| g | ||||
| 1) | ||||
| -J | G | |||
| w Ή | Φ 0 | |||
| ę | C | |||
| tn | 3 | |||
| 0 | pi | |||
| 3 | •H | i | ||
| 0 | o | |||
| U | J-) | |||
| 3 | 433 | Φ | ||
| U | '0 c | tn | ||
| *7> | μ j. | |||
| ug | (0 | |||
| u | H | |||
| α | ΓΊ | G | ||
| 0 | Φ C | d | ||
| +j | Cr- | N | ||
| •ri | tj α | U | ||
| CU | Φ c | Π3 | ||
| 0) | nn | G | ||
| C | N | |||
| Ή | ϋ | |||
| n | n | |||
| 3 | < c | N | ||
| cn | ||||
| Φ | rri 3 | G | ||
| iri | h-K | U | ||
| 3 | w c | 1 | >. | |
| U | c | c | ||
| N | nJ4J | rtj | ||
| •rri»r | X | |||
| 4) | cc | dl | ||
| >4 | 3 α | >5 | ||
| Ό | 3 | N | ||
| jj | >%G | 3 | ||
| * | 44 C | |||
| Srii* | 1 | > | ||
| * | 3Ή | O | ||
| 3 | G | * 3 | ||
| O | U r | |||
| 3 | >ir | l | G > | |
| 0 | u | >tł4 | ||
| H | G | 3 U | ||
| Γ7» | G | |||
| Φ | 3 Φ | |||
| k4 | JriM- | rrO | ||
| Qi> | 1 | U | ||
| N | μ | nj h | ||
| 3 Q | •ri | |||
| 3 | ·> * | Φ 3 | ||
| Φ | Tl | μ 0 | ||
| α | c | o > | ||
| >1 | φπ- | £±3 | ||
| U | Ή C | |||
| a | C (. | |||
| <ł) | m | |||
| α | S3 | |||
| U | ||||
| Π3 | 44 | |||
| N | ||||
| Φ | ΦΗ | |||
| 4J | r-ίχ | |||
| 3 | o- | |||
| >1 | μ | |||
| 71 | Oir | |||
| o α | ||||
| en C |
FIG. I
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 6,00 zł
Claims (14)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C, znamienny tym, że w etapie (a) uzyskuje się próbkę biologiczną z osobnika z podejrzeniem wirusowego zapalenia wątroby typu C, w etapie (b) kontaktuje się tą próbkę z pierwszym reagentem zawierającym połączenie typowo swoistych epitopów wirusa zapalenia wątroby typu C, przy czym co najmniej jeden epitop w tym połączeniu pochodzi z niestrukturalnego regionu 4 wirusa zapalenia wątroby typu C i przy czym kontaktowanie to prowadzi się w warunkach umożliwiających powstanie pierwszego kompleksu epitop-przeciwciało, następnie w etapie (c) oznacza się obecność kompleksu epitop-przeciwciało w próbce i ocenia się czy przeciwciała w próbce wiążą się do epitopów w pierwszym reagencie.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto w etapie (d) kontaktuje się tąpróbkę z drugim reagentem zawierającym drugi typowo swoisty epitop wirusowego zapalenia wątroby typu C, przy czym ten drugi epitop pochodzi z regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C i przy czym kontaktowanie prowadzi się w warunkach pozwalających na powstanie drugiego kompleksu epitop-przeciwciało, następnie w etapie (e) oznacza się obecność drugiego kompleksu epitop-przeciwciało w próbce i ocenia się czy przeciwciała w próbce wiążą się z epitopem w drugim reagencie.
- 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w etapie oznaczania próbę wykonuje się techniką analizy kompetytywnej, techniką kanapkową, techniką immunofluorescencyjną, radioimmunologiczną albo enzymatyczną techniką na immunosorbencie.
- 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako pierwszy reagent stosuje się reagent zawierający dodatkowy, typowo swoisty epitop, otrzymywany z regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C lub ze strukturalnego regionu 5 wirusa zapalenia wątroby typu C.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że dodatkowy typowo swoisty epitop zlokalizowany jest między resztami aminokwasowymi 67 i 84, lub 2281 i 2313 wirusa zapalenia wątroby typu C-1 albo homoloogicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
- 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się typowo swoisty epitop z niestrukturalnego regionu 4, zlokalizowany między resztami aminokwasowymi 1689 i 1718 wirusa zapalenia wątroby typu C-1 lub w homologicznych regionach innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
- 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się pierwszy reagent związany na trwałym podłożu nitrocelulozowym.
- 8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że pierwszy reagent zawiera co najmniej jeden typ swoistego epitopu z każdego z regionów wybranych z niestrukturalnego regionu 4, niestrukturalnego regionu 5 i regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C.
- 9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że pierwszy reagent zawiera wiązkę typowo swoistych epitopów z niestrukturalnego regionu 4 wirusa zapalenia wątroby typu C.
- 10. Sposób klasyfikowaniajednego lub więlb zej liczby typów wirus a zapalenia wątroby typu C, znamienny tym, że w etapie (a) uzyskuje się próbkę biologiczną z osobnika z podejrzeniem wirusowego zopelenia wątroby typu typu C, w etapie (b) kontaktuje się tą próbkę z pierwszym reagentem zawierającym połączenie przeciwciał swoistych wobec co nojmuibg dwóch różnych typów swoistych epitapów wirusa zepolonio wątroby typu C, przy czym co najmniej j edno przeciwciało w tym pałączbniujest swoiste wobec typowo swoistego opitopu pochodzącego z uibctapktpaalnego regionu 4 wirusa zapalenia wątroby typu C i przy czym kontaktowanie prowadzi się w warunkach pozwalających na powstanie pieawszogo kompleksu eattoa-pazeciwciało, następnie w etapie (c) oznacza się w próbce obecność kompleksów eaitaa-aazeciwciało.175 342
- 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że ponadto w etapie (d) kontaktuje się próbkę z drugim reagentem zawierającym przeciwciało swoiste wobec drugiego typowo swoistego epitopu wirusa zapalenia wątroby typu C, przy czym ten drugi epitop pochodzi z regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C i przy czym kontaktowanie prowadzi się w warunkach pozwalających na powstanie drugiego kompleksu antygen-przeciwciało i następnie w etapie (e) oznacza się w próbce obecność drugiego kompleksu epitop-przeciwciało.
- 12. Sposób według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że w etapie oznaczania próbę wykonuje się techniką analizy kompetytywnej, techniką kanapkową, techniką immunofluorescencyjną, radioimmunologiczną albo enzymatyczną techniką na immunosorbencie.
- 13. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako pierwszy reagent stosuje się reagent zawierający przeciwciało swoiste wobec dodatkowych typów swoistych epitopów otrzymanych z regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C lub regionu niestrukturalnego 5 wirusa zapalenia wątroby typu C.
- 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się dodatkowy epitop zlokalizowany między resztami aminokwasowymi 67-84, lub 2281-2313 wirusa zapalenia wątroby typu C-1, lub homologiczne regiony innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.Wynalazek dotyczy sposobu klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C (hCv), a zwłaszcza sposobu klasyfikowania HCV przy użyciu nowych peptydów zależnych od typu wirusa.Wiadomo, że wirusowe zapalenie wątroby powodowane jest przez pięć różnych wirusów, znanych jako wirusy zapalenia wątroby A, B, C, D i E. HAV jest RNA-wirusem i nie powoduje długotrwałych objawów klinicznych. HBV jest DNA wirusem. HDV jest wirusem zależnym, niezdolnym do zakażenia komórek w nieobecności HBV.HEV jest wirusem przenoszonym z wodą. Początkowo, wirus HCV zidentyfikowano i scharakteryzowano jako przyczynę zapalenia wątroby nie-A i nie-B (NANBH). Wirus ten został ujawniony przez Houghtona i wsp. w publikacji opisu patentowego europejskiego, EP 388.232. Doprowadziło to do opracowania wielu nieswoistych i swoistych polipeptydów użytecznych jako odczynniki immunologiczne do identyfikacji HCV (Choo i wsp., Science, 1989, 244, 359-362; Kuo i wsp., Science 1989, 244, 362-364; Houghton i 'wsp., Hepatology, 1991, 14, 381-388. Wirus HCVjest głównąprzyczynązapalenia wątroby nabywanego po transfuzji krwi.Prototypowy izolat HCV jest scharakteryzowany w publikacji opisów patentowych europejskich, nr 318.216 i 388.232. Stosowany w niniejszym opisie termin “HCV” obejmuje nowo wyizolowane rodzaje wirusów NANBH. Termin “HCV-1 odnosi się do wirusa opisanego w wyżej cytowanych publikacjach.Od czasu pierwszej identyfikacji wirusa HCV, zidentyfikowano i oznaczono symbolami od HCV-1 do HCV-6 co najmniej sześć różnych typów tego wirusa (Cha i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89,7144-7148). W obrębie tych typów istnieje wiele podtypów. Typ wirusa, którym jest zakażony pacjent jest odpowiedzialny za prognozę klinicznego przebiegu zakażenia oraz reakcję na różne rodzaje leczenia (Yoshioka i wsp., Hepatology, 1992, 16, 293-299). W świetle faktu, że najgroźniejszym rezultatem infekcji wirusem HCV jest rak komórek wątroby, mogłaby być użyteczna możliwość oznaczenia typu lub typów wirusa HCV, którymi jest zakażony pacjent.Sposobem stosowanym obecnie do oznaczenia typu wirusajest oznaczenie jego genotypu, polegające na izolowaniu wirusowego RNA i oznaczaniu sekwencji różnych segmentów techniką łańcuchowej reakcji z użyciem polimerazy (PCR). Sposób ten jest praco- i czasochłonny i nie nadaje się do analizowania próbek przechowywanych w warunkach nie pozwalających na konserwację RNA ani próbek pobranych od pacjentów z niedostatecznym mianem wirusa. Użyteczny byłby więc sposób klasyfikacji HCV przez analizę immunologiczną albo oznaczanie stereotypu.175 342Stosowanym obecnie sposobem skriningu krwi i diagnozowania pacjentów jest próba immunologiczna. W próbie tej wykorzystuje się antygen z HCV-1, który zawiera wystarczającą ilość pospolitych epitopów do tego, aby były wykrywane przeciwciała wobec innych typów HcV. Próba ta nie daje rozróżnienia pomiędzy infekcjami różnymi typami wirusa HCV.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6040093A | 1993-05-10 | 1993-05-10 | |
| PCT/US1994/005151 WO1994027153A1 (en) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Methods of typing hepatitis c virus and reagents for use therein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL311653A1 PL311653A1 (en) | 1996-03-04 |
| PL175342B1 true PL175342B1 (pl) | 1998-12-31 |
Family
ID=22029220
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94323367A PL175360B1 (pl) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Cząsteczka kwasu nukleinowego i kompozycja do wykrywania infekcji wirusa zapalenia wątroby typu C |
| PL94323368A PL175338B1 (pl) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Polipeptyd i reagent do klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) |
| PL94311653A PL175342B1 (pl) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Sposób klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94323367A PL175360B1 (pl) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Cząsteczka kwasu nukleinowego i kompozycja do wykrywania infekcji wirusa zapalenia wątroby typu C |
| PL94323368A PL175338B1 (pl) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Polipeptyd i reagent do klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6054264A (pl) |
| EP (1) | EP0698216B2 (pl) |
| JP (1) | JP3645904B2 (pl) |
| KR (1) | KR100330278B1 (pl) |
| CN (1) | CN1129795C (pl) |
| AT (1) | ATE281647T1 (pl) |
| CZ (1) | CZ294629B6 (pl) |
| DE (1) | DE69434117T3 (pl) |
| DK (1) | DK0698216T4 (pl) |
| ES (1) | ES2232815T5 (pl) |
| GE (1) | GEP20012421B (pl) |
| HU (1) | HU224513B1 (pl) |
| PL (3) | PL175360B1 (pl) |
| PT (1) | PT698216E (pl) |
| RO (1) | RO115471B1 (pl) |
| RU (1) | RU2158928C2 (pl) |
| SK (1) | SK282543B6 (pl) |
| UA (1) | UA46707C2 (pl) |
| WO (1) | WO1994027153A1 (pl) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0610436B9 (en) | 1991-11-21 | 2003-03-26 | Common Services Agency | Hepatitis-c virus testing |
| US7255997B1 (en) * | 1993-04-27 | 2007-08-14 | N.V. Innogenetics S.A. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
| EP0984068B1 (en) | 1993-04-27 | 2012-03-28 | Innogenetics N.V. | Sequences of hepatitis c virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
| SK282543B6 (sk) * | 1993-05-10 | 2002-10-08 | Chiron Corporation | Spôsob klasifikácie hepatitis C vírusu a činidlá na použitie pri tomto spôsobe |
| US5882852A (en) * | 1993-06-29 | 1999-03-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Hepatitic C virus (HCV) core gene nucleotide sequences and related methods of detecting major and minor genotypes of HCV isolates |
| US7070790B1 (en) | 1993-06-29 | 2006-07-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 and core genes of isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
| DE19504302A1 (de) * | 1995-02-09 | 1996-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Methode zur serologischen Typisierung mittels typspezifischer Antigene |
| WO1996034013A1 (en) * | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Srl, Inc. | Antigen peptide compound and immunoassay method |
| US6514731B1 (en) | 1996-05-24 | 2003-02-04 | Chiron Corporation | Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
| RU2146825C1 (ru) * | 1998-05-07 | 2000-03-20 | Харламова Флора Семеновна | Способ диагностики внепеченочной персистенции вирусных антигенов в тканях у детей, больных хроническим гепатитом в, или дельта, или с |
| US7052830B1 (en) | 1998-06-09 | 2006-05-30 | Branch Andrea D | Hepatitis C virus peptides and uses thereof |
| WO2000031130A1 (en) * | 1998-11-20 | 2000-06-02 | Bio Merieux | Synthetic polypeptides corresponding to the hepatitis c virus (hcv) and applications |
| US6995299B2 (en) * | 1999-11-02 | 2006-02-07 | University Of Connecticut | Propagation of human hepatocytes in non-human animals |
| US8124348B2 (en) * | 2000-08-23 | 2012-02-28 | Jonathan Zmuda | Oral fluid rapid assay for hepatitis C virus (HCV) antibodies using non-antibody labeling of IgA molecules recognizing HCV peptide epitopes |
| WO2002090572A2 (en) * | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid detection in pooled samples |
| US7196183B2 (en) * | 2001-08-31 | 2007-03-27 | Innogenetics N.V. | Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent |
| WO2003085375A2 (en) * | 2002-04-04 | 2003-10-16 | Achillion Pharmaceuticals, Inc. | Hcv antiviral and cytotoxicity drug screening assay |
| WO2005010035A2 (en) * | 2003-07-22 | 2005-02-03 | Branch Andrea D | Alternate reading frame polypeptides derived from hepatitis c and methods of their use |
| US20050075309A1 (en) | 2003-07-25 | 2005-04-07 | Richard Storer | Purine nucleoside analogues for treating Flaviviridae including hepatitis C |
| ES2596753T3 (es) * | 2003-08-29 | 2017-01-11 | Fujirebio Europe N.V. | Nuevo clado del virus de la hepatitis C y secuencias prototipo del mismo |
| RU2269134C2 (ru) * | 2003-11-27 | 2006-01-27 | Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера | Способ прогнозирования исходов острого вирусного гепатита с |
| CA2552949C (en) | 2004-01-07 | 2012-10-02 | Third Wave Technologies, Inc. | Determination of hepatitis c virus genotype |
| JP4533656B2 (ja) * | 2004-04-28 | 2010-09-01 | アボットジャパン株式会社 | 特異性の改良されたｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗体測定法 |
| US7858752B2 (en) | 2006-12-05 | 2010-12-28 | Abbott Laboratories | Recombinant antibodies against hepatitis C virus and methods of obtaining and using same |
| FR2984328B1 (fr) | 2011-12-20 | 2016-12-30 | Bio-Rad Innovations | Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c |
| CN110261616B (zh) * | 2019-04-30 | 2021-07-20 | 广东菲鹏生物有限公司 | 一种丙型肝炎病毒检测试剂盒 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4868105A (en) * | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| US5124246A (en) * | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| WO1989004669A1 (en) * | 1987-11-18 | 1989-06-01 | Chiron Corporation | Nanbv diagnostics and vaccines |
| US5350671A (en) * | 1987-11-18 | 1994-09-27 | Chiron Corporation | HCV immunoassays employing C domain antigens |
| WO1990011089A1 (en) * | 1989-03-17 | 1990-10-04 | Chiron Corporation | Nanbv diagnostics and vaccines |
| US5106726A (en) * | 1990-02-16 | 1992-04-21 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV |
| RO109916B1 (ro) * | 1990-04-04 | 1995-07-28 | Chiron Corp | Compozitie de antigeni ai hepatitei virale c |
| US6190864B1 (en) * | 1991-05-08 | 2001-02-20 | Chiron Corporation | HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics |
| DE69232871T2 (de) * | 1991-06-24 | 2003-05-08 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Polypeptide des hepatitis c-virus (hiv) |
| ATE161291T1 (de) * | 1991-08-27 | 1998-01-15 | Hoffmann La Roche | Verfahren und reagenzien zum nachweis von hepatitis c |
| US5427909A (en) * | 1991-09-09 | 1995-06-27 | Immuno Japan Inc. | Oligonucleotides and determination system of HCV genotypes |
| DE69230917T3 (de) * | 1991-09-16 | 2005-04-07 | Abbott Laboratories, Abbott Park | Verfahren zur detektion von hepatitis c |
| EP0610436B9 (en) * | 1991-11-21 | 2003-03-26 | Common Services Agency | Hepatitis-c virus testing |
| KR100317509B1 (ko) | 1992-07-16 | 2002-02-20 | 야스모토 토루 | C형간염바이러스를분류하기위한항원성펩티드,이펩티드를포함하는키트및이펩티드를사용하는c형간염바이러스를분류하는방법 |
| EP0672049A4 (en) * | 1992-11-06 | 1997-10-15 | Chiron Mimotopes Pty Ltd | SUPPORT FOR THE SYNTHESIS OF MODULE POLYMERS. |
| AU695259B2 (en) | 1993-05-05 | 1998-08-13 | Common Services Agency | Hepatitis-C virus type 4, 5 and 6 |
| SK282543B6 (sk) * | 1993-05-10 | 2002-10-08 | Chiron Corporation | Spôsob klasifikácie hepatitis C vírusu a činidlá na použitie pri tomto spôsobe |
| WO1995011918A1 (en) * | 1993-10-29 | 1995-05-04 | Srl, Inc. | Antigen peptide compound and immunoassay method |
-
1994
- 1994-05-09 SK SK1359-95A patent/SK282543B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 AT AT94916061T patent/ATE281647T1/de active
- 1994-05-09 WO PCT/US1994/005151 patent/WO1994027153A1/en not_active Ceased
- 1994-05-09 ES ES94916061T patent/ES2232815T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 JP JP52562794A patent/JP3645904B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 CZ CZ19952929A patent/CZ294629B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 EP EP94916061A patent/EP0698216B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 PT PT94916061T patent/PT698216E/pt unknown
- 1994-05-09 GE GEAP19942944A patent/GEP20012421B/en unknown
- 1994-05-09 RO RO95-01952A patent/RO115471B1/ro unknown
- 1994-05-09 DK DK94916061T patent/DK0698216T4/da active
- 1994-05-09 UA UA95114832A patent/UA46707C2/uk unknown
- 1994-05-09 PL PL94323367A patent/PL175360B1/pl unknown
- 1994-05-09 PL PL94323368A patent/PL175338B1/pl unknown
- 1994-05-09 KR KR1019950704993A patent/KR100330278B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 CN CN94192560A patent/CN1129795C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 HU HU9503219A patent/HU224513B1/hu active IP Right Grant
- 1994-05-09 PL PL94311653A patent/PL175342B1/pl unknown
- 1994-05-09 RU RU95122701/13A patent/RU2158928C2/ru active
- 1994-05-09 DE DE69434117T patent/DE69434117T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-09 US US08/336,553 patent/US6054264A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-05-11 US US08/439,157 patent/US6416944B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-11-09 US US09/437,895 patent/US6416946B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL175342B1 (pl) | Sposób klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C | |
| EP0591431B1 (en) | Hepatitis c virus (hcv) polypeptides | |
| US7402315B2 (en) | Hepatitis-C virus type 4, 5 and 6 | |
| JP2006104207A (ja) | Ｎａｎｂｖの診断用薬 | |
| ES2145746T5 (es) | Analisis de deteccion de la hepatitis c. | |
| JPH0940694A (ja) | 肝炎ｇｂウイルスの合成ペプチド及びその使用 | |
| Chang et al. | Artificial NS4 mosaic antigen of hepatitis C virus | |
| CA2162250C (en) | Methods of typing hepatitis c virus and reagents for use therein | |
| EP0672066A1 (en) | Peptides from the c33 region of hcv, antibodies thereto and methods for the detection of hcv | |
| JPH08505131A (ja) | 肝炎ｃ型ウイルス（ｈｃｖ）非構造−３−ペプチド、該ペプチドに対する抗体及びｈｃｖの検出方法 |