RO115471B1 - Metoda pentru stabilirea unuia sau a mai multor tipuri de virus al hepatitei c - Google Patents
Metoda pentru stabilirea unuia sau a mai multor tipuri de virus al hepatitei c Download PDFInfo
- Publication number
- RO115471B1 RO115471B1 RO95-01952A RO9501952A RO115471B1 RO 115471 B1 RO115471 B1 RO 115471B1 RO 9501952 A RO9501952 A RO 9501952A RO 115471 B1 RO115471 B1 RO 115471B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- hepatitis
- virus
- epitope
- specific
- type
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 title claims abstract description 41
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 58
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 31
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 34
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 27
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 241000134307 Hepatitis C virus genotype 1 Species 0.000 claims description 6
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 5
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 3
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 claims 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 claims 2
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 abstract 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 136
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 136
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 94
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 89
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 82
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 44
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 37
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N Cysteine Chemical compound SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 21
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 21
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 21
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 19
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 19
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 15
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 15
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 13
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 13
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 12
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 12
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 12
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 9
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 6
- 210000000746 body region Anatomy 0.000 description 6
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- -1 sarcozine (Sar) Chemical class 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical group O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 2
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 3-(iminomethylideneamino)-n,n-dimethylpropan-1-amine Chemical compound CN(C)CCCN=C=N ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000928106 Alain Species 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000714198 Caliciviridae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000008039 phosphoramides Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/82—Hepatitis associated antigens and antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
Prezenta invenție se referă la o metodă pentru stabilirea unuia sau a mai multor tipuri de virus al hepatitei C, care este aplicată în medicina umană, și, în special, invenția se referă la o metodă pentru stabilirea tipului de hepatită C (HCV), folosind peptide noi dependente de tip.
Este cunoscut că hepatita virală este produsă de 5 tulpini virale diferite și este cunoscută ca hepatita A, B, C, D și E. Este cunoscut, de asemenea, că HAV este un virus ARN care nu conduce la simptome clinice de lungă durată. HBV este un virus AND, HDV este un virus dependent care este incapabil să infecteze celulele în absența HBV. HEV este un virus născut și prezent în apă. HCV a fost, inițial, identificat și caracterizat ca fiind cauza hepatitei non-A, non-B (NANBH), așa cum este cunoscut din literatura de specialitate. Aceasta a condus la descrierea a numeroase polipeptide generale și specifice care sunt utilizate ca reactivi imunologici în identificarea HCV (datele sunt prezentate în literatura de spcialitate). Este cunoscut că HCV este cauza principală a hepatitei care este legată de transfuzia de sânge.
în literatura de specialitate a fost caracterizat prototipul izolat la HCV. Așa cum este folosit în prezenta descriere, termenul HCV”. Așa cum este folosit în prezenta descriere, termenul HCV” include noi specii virale NANBH izolate. Termenul “HCV-1 se referă la virusul care este cunoscut din literatura de specialitate.
Din momentul identificării inițiale a HCV, au fost identificate cel puțin șase tipuri virale diferite și s-au desemnat de la HCV-1 la HCV-6 (și acestea sunt cunoscute din literatura de specialitate). în aceste tipuri sunt numeroase subtipuri. Tipul de virus cu care este infectat un pacient poate afecta prognoza clinică și, de asemenea, răspunsul față de diverse tratamente. Dat fiind că cel mai serios efect clinic al infecției HCV este carcinomul hepatocelular, ar fi util să se poată determina cu care tip sau tipuri de HCV este infectat un pacient.
Metoda care este utilizată în mod curent pentru a se determina tipul de virus este stabilirea genotipului; aceasta constă în izolarea prin reacție polimerazică de catenă (PCR). Această metodă nu este numai laborioasă și consumatoare de timp, dar este și nepotrivită pentru utilizare la probele care au fost stocate în condiții care nu permit conservarea ARN-ului sau probele de la pacienți care nu au un titru suficient. Ar fi utili să existe o metodă pentru tipizarea HCV, prin imunoanaliză sau serotipizare.
Metoda, conform invenției, cuprinde etapele: a) prelevarea unei probe biologice de la un individ suspectat a fi infectat cu virusul hepatitei C; b] punerea în contact a probei cu un reactiv cuprinzând o combinație de epitopi tip -specifici ai virusului hepatitei C în care cel puțin un epitop din combinație este din regiunea 4 nestructurală a virusului hepatitei C și în care, în mod suplimentar, contactarea se realizează în condiții care permit formarea primelor complexe epitrop-anticorp; și c) testarea prezenței complexelor epitrop-anticorp în probă pentru a determina dacă anticorpii din probă se leagă la primul reactiv. Suplimentar, metoda mai cuprinde și etapele de: d] punerea în contact a probei cu un al doilea reactiv epitop-specific al hepatitei C, în care epitopul menționat este din regiunea centrală a virusului hepatitei C și în care, în mod suplimentar, contactarea se realizează în condiții care permit formarea unui al doilea complex epitrop-anticorp; și e) testarea a prezenței unui al doilea complex epitrop-anticorp în probă pentru a determina dacă anticorpii din probă se leagă la al doilea reactiv. în etapa de testare, aceasta se realizează printr-un test de competiție, un test de intercalare de tip sandwich, un test de imunofluorescență, un test de radioimunitate sau un test de imunoabsorbție cu enzimă legată. Primul reactiv cuprinde un epitrop-specific suplimentar, obținut din regiunea centrală a virusului
RO 115471 Bl hepatitei C sau din regiunea 5 nestructurală a virusului hepatitei C. Epitopul tip- 50 specific, suplimentar este localizat între resturile de aminoacizi 67 și 84 sau 2281 și 2313 ale virusului-1 al hepatitei C sau în regiuni omoloage ale altor tipuri de virus al hepatitei C.
Metoda, conform invenției, mai poate fi definită și prin etapele: a) prelevarea unei probe biologice de la un individ suspectat de a fi infectat cu un virus al hepatitei 55 C; b) punerea în contact a probei cu un prim reactiv cuprinzând o combinație de anticorpi specifici pentru cel puțin doi epitopi-tip specifici ai virusului hepatitei C, în care cel puțin unul dintre anticorpii din combinație este specific pentru un epitop tipspecific din regiunea 4 nestructurală a virusului hepatitei C și în care, în mod suplimentar, contactarea se realizează în condiții care permit formarea primelor complexe 60 epitop-anticorp; și c] testarea prezenței complexelor epitrop-anticorp în probă. Această metodă mai poate cuprinde suplimentar și etapele: d] punerea în contact a probei cu un al doilea reactiv cuprinzând un anticorp specific pentru un al doilea epitop tip-specific al virusului hepatitei C, în care cel de al doilea epitop menționat este din regiunea centrală a virusului hepatitei C și în care, în mod suplimentar, contactarea 65 se realizează în condiții care permit formarea unui al doilea complex epitop-anticorp; și e) testarea pentru prezența unui al doilea complex epitop-anticorp în probă. în etapa de testare, testarea se realizează printr-un test de competiție, un test de intercalare de tip sandwich, un test de imunofluorescență, un test de radioimunitate sau un test de imunoabsorbție cu enzimă legată. Primul reactiv cuprinde un anticorp specific 70 pentru un epitop-specific suplimentar obținut în regiunea centrală a virusului hepatitei C sau din regiunea 5 nestructurală este localizat între resturile de aminoacizi 67 sau 84 sau 2281 și 2313 ale virusului-1 al hepatitei C sau în regiuni omoloage ale altor tipuri de virus al hepatitei C. Epitopul tip specific din regiunea 4 nestructurală este localizat între resturile de aminoacizi 1689 și 1718 ale virusului-1 al hepatitei C sau 75 în regiuni omoloage ale altor tipuri de virus al hepatitei C. Primul reactiv este legat de un suport solid de nitroceluloză și cuprinde cel puțin un epitop tip specific-din regiunea 4 nestructurală, din regiunea centrală a virusului hepatitei C. Primul reactiv cuprinde o multitudine de epitopi tip -specifici din regiunea 4 nestructurală a virusului hepatitei C. 80
Deci, metoda curentă pentru selecționarea sângelui și diagnosticarea pacienților este un imunotest. Imunotestul folosește un antigen de la HCV-1 care conține un număr suficient de eptitopi comuni pentru detectarea anticorpilor la alte tipuri de HCV. Imunotestul nu face deosebire între infecții diferite ale HCV.
Invenția de față include compoziții și metode pentru tipizarea HCV-urilor prin 85 genotip și serotip. Compozițiile includ epitopi specifici de tip, epitopi specifici grupului tip acizi nucleici care codifică epitopii de utilizat ca sonde și acizi nucleici complementari regiunilor care mărginesc pe cei care codifică epitopii pentru folosire ca primeri.
Un aspect al invenției este o metodă pentru tipizarea HCV cuprinzând etapele 90 de asigurare a unei probe care conține anticorp de la un individ; contactarea probei cu epitopul specific unui tip sau epitopi specifici grupului tip în condiții care permit legarea antigen-anticorp; și determinarea dacă anticorpii din probă se leagă la epitop.
Alt aspect al invenției se referă la o metodă pentru tipizarea HCV, care cuprinde etapele asigurării unei probe care conține anticorp de la un individ; 95 contactarea probei cu un prim epitop specific de tip sau epitop specific grupului tip în condiții care permit legarea antigen-anticorp; contactarea probei cu al doilea epitop specific grupului tip în condiții care permit legarea antigen-anticorp și determinarea
RO 115471 Bl dacă anticorpii din probă se leagă fie la primul, fie la al doilea epitop.
Alt aspect al invenției se referă la polipeptide care conțin epitopi specifici tipului sau epitopi specifici grupului tip. Polipetidele sunt derivate de la trei regiuni diferite ale genomului HCV. Un set de polipeptidă include un epitop specific de tip sau epitopi specifici grupului tip obținute între reziduurile aminoacide 67 și 84 ale HCV-1 și regiuni omoloage ale altor tipuri de HCV. Așa cum s-a folosit în prezenta invenție, abrevierile restului aminoacid sunt după cum urmează: A, alanină; I, izoleucină; L, leucină; M, metionină; F, fenilalanină; W, triptofan; V, valină; N, asparagină; C, cisteină; Q glutamină; G, glicină; S, serină; T, treonină; Y, tirozină; R, arginină; H, hidtidină; K, lisină; D, acid aspartic și E, acid glutamic.
Secvențele resturilor aminoacide particulare derivate din regiunea centrală și subtipurile de la care sunt derivate, sunt după cum urmează:
1. PEGRTWAQ, subtip 1 a sau 1 b.
2. STGKSWGK, subtip 3a sau 4.
3. SEGRSWAQ, subtip 3a sau 4.
Un alt set de polipeptide include un tip specific de epitop obținut din regiunea 4 (NS4) nestructurală de HCV. Acest al doilea set se găsește între reziduurile de aminoacizi 1689-1718 al HCV-1 și regiunile omoloage ale altor țipi de HCV.
Secvențele resturilor aminoacide particulare și tipurile sau subtipurile de la care sunt derivate sunt precum urmează:
1. CSQHLPY, subtip 1a.
2. CASHLPY, subtip 1b.
3. CASRAAL, subtip 2a sau 2b.
Alt set de polipeptide include un epitop specific de tip sau epitopi specifici grupului tip obținut de la regiunea nestructurală 5 (NS5) a unui virus de hepatită C. Acest set se găsește între resturile aminoacide 2281-2313 ale HCV-1 și regiuni omoloage ale altor tipuri ale virusului hepatitei C.
Secvențele resturilor aminoacide particulare și tipurile sau subtipurile de la care sunt acestea derivate sunt după cum urmează:
1. PDYEPPWHG, subtip 1a.
2. PDYVPPWHG, SUBTIP 1B.
3. PDYQPATVAG, subtip 2a
4. PGYEPPTVLG, subtip 2b.
5. FAQASPVW, subtip 1a.
6. EPPQALPIW, subtip 1a
7. EPQALPAW, subtip 2a.
8. EPPQALPPW, subtip 2b.
Alt aspect al invenției include molecule de acid nucleic care codifică secvențele restului de aminoacid ale epitopilor specifici de tip și grup tip descrise. Aceste molecule de acid nucleic sunt utile ca sonde, de exemplu în bloturi Southern sau alte analize de recunoaștere AND, așa cum este analiza de captură care este descrisă în literatura de specialitate.
Alt aspect al invenției include molecule de acid nucleic complementare la secvențe de acid nucleic care mărginesc regiuni care condifică epitopi de tip și specifici tipului de grup. Astfel de molecule de acid nucleic sunt utile în realizarea PCR pentru determinarea unui HCV anume.
Termenul de “virus hepatită C” sau “HCV” se referă la specii virale ale căror tipuri patogene produc NANBH și tipuri atenuate sau particule defective de interferență derivate de la acestea.Genomul HCV este cuprins ARN-ului. Virusurile
RO 115471 Bl
150 care cuprind ARN au rate relativ ridicate de mutație spontană, care sunt raportate la ordinul 1CT3 până la 1O4 pe nucleotida încorporată (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Dat fiind această situație, heterogenitatea și fluiditatea genotipului sunt inerente virusurilor ARN, existând multiple tipuri/subtipuri în speciile HCV care pot fi virulente sau avirulente. Propagarea, identificarea, detectarea și izolarea diferitelor tipuri sau izolate HCV este arătată în literatura de specialitate. Așa cum se prezintă în descrierea de față, toate nucleotidele și secvențele resturilor aminoacide sunt de la tipuri HCV cunoscute. Numărul genomului HCV-1 și secvențele resturilor aminoacide sunt așa cum este descris în literatura de specialitate. în prezenta descriere, se poate permite diagnosticarea a diverse tipuri de virus.
De asemenea, așa cum este folosit în prezenta descriere, termenul de “tip” se referă la HCV-uri care diferă genotipic prin mai mult decât circa 30 %; termenul de “subtip” se referă la HCV-uri care diferă genotipic prin aproximativ 10 ... 20 %, iar termenul de “izolat” se referă la HCV-uri care diferă genotipic prin circa mai puțin de 10 %. Termenul de “tipizare” se referă la deosebirea unui tip de HCV de alt tip.
Informația asupra câtorva tipuri/subtipuri HCV diferite este prezentată în literatura de specialitate, în special asupra tipului sau subtipului CDC/HCV-1 (numit, de asemenea HCV-1). Informația de la un tip sau subtip, precum o secvență genomică parțială sau secvență aminoacidă, este suficientă pentru a permite specialiștilor în domeniu să utilizeze tehnici standard pentru a izola tipuri noi de HCV. De exemplu, câteva tipuri diferite ale HCV au fost izolate așa cum se va descrie în continuare. Pentru aceste tipuri, care s-au obținut dintr-un număr de seruri umane (și din diferite zone geografice) s-au stabilit tipurile, folosind metoda și reactivii care sunt descriși în prezenta invenție.
S-a dedus structura genomică și secvența nucleotidică a ARN-ului genomic al HCV-1. Genomul pare a fi un ARN cu o singură bandă care conține 10000 nucleotide. Genomul prezintă o bandă pozitivă și posedă un cadru de citire deschis translațional continuu (ORF) care codifică o poliproteină de aproximativ 3000 aminoacizi. în QRF, proteina (le) structurale apar a fi codificate în aproximativ primul sfert al regiunii amino-termale, cu cea mai mare parte a poliproteinei responsabile pentru proteinele nestructurale (NS). Când s-au comparat cu toate secvențele virale cunoscute, s-au observat omologii co-liniare mici, dar semnificative, cu proteine nestructurale (NS) ale familiei flavirusurilor și cu pestivirusurile (care acum sunt considerate că fac parte din familia Flavivirus).
în tabelul 1 care urmează se prezintă, pe baza resturilor aminoacide probabil codificate în secvența aminoacidă a HCV-1 și a altor dovezi, domeniile proteice posibile ale poiliproteinei codificate HCV, precum și limitele aproximative.
Tabelul 1
155
160
165
170
175
180
185
| Domeniul probabil | Limita aproximativă (numerele aminoacizilor] |
| C (proteina nucleocapsidei) | 1 - 191 |
| En (proteina anvelopei virionice) | 192-383 |
| E2/NS1 [anvelopa] | 383 - 800 |
| NS2 (funcție necunoscută) | 800-1050 |
| NS3 (protează) | 1050-1650 |
| NS4 (funcție necunoscută) | 1651 - 2100 |
| NS5 (polimerază) | 2100-3011 (sfârșit] |
190
RO 115471 Bl
Aceste domenii sunt nesigure. De exemplu, marginea E1-NS2 este probabil în regiunea 750 - 810 și marginea NS3-NS4 este circa 1640 - 1650. De asemenea, există dovada că aminoacidul 191 (aa) versiunea lui C este un precursor care este prelucrat ulterior până la circa 170 aa în lungime și că proteinele NS2, NS4 și ND5 sunt fiecare prelucrate ulterior la două proteine mature.
Diferite tipuri ale HCV sunt definite în conformitate cu diverse citerii, precum, de exemplu, un ORF de aproximativ 9000 nucleotide până la aproximativ 12000 nucleotide, care codifică o poliproteină similară ca mărime celei a HCV-1, o poliproteină codificată hidrofobicitate similară și/ sau caracter antigenic celui a HCV-1 și prezența secvențelor polipeptidice co-lineare care sunt conservate cu HCV-1.
Pentru identificarea tipurilor HCV sunt aplicabili următorii parametri ai omologiei acidului nucleic și omologiei aminoacide, fie singuri, fie în combinație. în general, așa cum s-a descris mai sus, diferite tipuri ale HCV sunt circa 70% omoloage, în timp ce subtipurile sunt circa 80 ... 90 % omoloage, iar izolatele sunt circa 90 % omoloage.
Așa cum s-a folosit în prezenta descriere de invenție, o polinucleotidă “derivată de la O secvență desemnată se referă la o secvență polinucleotidică care este cuprinsă unei secvențe de cel puțin circa 6 nucleotide, de preferință cel puțin circa 8 nucleotide, mai preferabil de cel puțin circa 10...12 nucleotide și chiar preferabil de cel puțin circa 15...20 nucleotide corespunzătoare unei regiuni a secvenței nucleotidice desemnate. Termenul “corespunzător” înseamnă omolog sau complementar la secvența desemnată. De preferință, secvența regiunii de la care este derivată polinucleotidă este omoloagă sau complementară la o secvență care este unică pentru un genom HCV. Tehnicile de hibridizare pentru determinarea complementarității secvențelor de acid nucleic sunt cunoscute din literatura de specialitate din domeniu, în plus, împerecherile greșite ale duplexului de polinucleotide formate prin hibridizare se pot determina prin tehnici cunoscute, inclusiv, de exemplu, digestia cu nuclează, precum SI care digeră specific zonele cu bandă unică în duplexul polinucleotidelor. Regiuni de la care pot fi “derivate” secvențe AND tipice includ, dar nu se limitează la, de exemplu, regiuni care codifică epitopi specifici de tip, precum și regiuni netranscrise și/sau netranslate.
Polinucleotidă derivată nu este în mod necesar derivată fizic de la secvența nucleotidică prezentată, ci poate fi generată în orice mod, inclusiv, de exemplu, sinteza chimică sau replicare AND sau transcriere inversă sau transcriere. în plus, combinații ale regiunilor corespunzătoare la cea a secvenței desemnate pot fi modificate pe căi cunoscute în domeniu a fi în concordanță cu o utilizare intenționată.
în mod similar, o polipeptidă sau secvență aminoacidă “derivată de la” o secvență aminoacidă sau de acid nucleic desemnată se referă la o polipeptidă care are o secvență aminoacidă identică cu cea a unei peptide codificate în secvență, sau o porțiune a acesteia în care porțiunea constă în cel puțin 3...5 aminoacizi, mai preferabil din cel puțin 8... 10 aminoacizi și chiar mai preferabil din cel puțin 11,15 aminoacizi, sau care este identificabilă imunologic cu o polipeptidă exprimată de la o secvență exprimată și desemnată de acid nucleic.
O polipeptidă recombinată sau derivată poate include în secvența sa unul sau mai mulți aminoacizi analogi sau aminoacizi care nu se întâlnesc în mod natural.
Metode de inserare a aminoacizilor analogi într-o secvență sunt cunoscute în domeniul de specialitate. De asemenea, se pot include unul sau mai multe marcaje, care sunt cunoscute celor în domeniu. O descriere detaliată a analogilor și mimotopilor se găsește în literatura de specialitate.
RO 115471 Bl
245
Peptide analoage includ deleții, adiții, substituiții sau modificări ale acestora care mențin capacitatea de tipizare HCV. Substituțiile” preferate sunt cele care sunt conservatoare, cu alte cuvinte, cele în care un rest este înlocuit cu un altul de același tip general. Este de înțeles că aminoacizii întâlniți în mod natural se pot subclasifica ca acizi, bazici sau neutri și nepolari. Mai mult decât atât, trei dintre aminoacizii codificați sunt aromatici. în general, se preferă polipeptide codificate care diferă de epitopul natural să conțină cadoni substituiți pentru aminoacizii care sunt din același grup sau cel al aminoacizilor înlocuiți. Astfel, în general, aminoacizii bazici Lys, Arg și His sunt interschimbabili; aminoacizii ca acid aspartic și acid glutamic sunt interschimbabili; aminoacizii neutri polari Ser, Thr, Cys, Gin și Asn sunt interschimbabili; aminoacizii alifatici nepolari Gly, Ala, Val, lle și Leu sunt conservatori unul față de altul (dar din cauza mărimii, Gly și Ala sunt înrudiți, iar Val, lle și Leu sunt înrudiți mai aproape), și aminoacizii aromatici Phe, Trp și Tyr sunt interschimbabili. Deoarece prolina este un aminoacid neutru polar, acesta reprezintă dificultăți datorită efectelor sale asupra conformației și substituțiile prin sau pentru pralină nu sunt preferate, cu excepția când pot fi obținute aceleași rezultate sau rezultate conformaționale similare. Aminoacizii polari care reprezintă schimbări conservative includ Ser, Thr, Gin, Asn și met pentru o extindere minoră. în plus, deși clasificați în categorii diferite Ala, Gly și Ser par a fi interschimbabili, și suplimentar Cys intră în acest grup sau poate fi clasificat cu aminoacizii neutrii polari.
Ar mai fi de remarcat în plus că, dacă polipeptidele sunt obținute sintetic, pot fi de asemenea făcute substituții prin aminoacizii care nu sunt codificați prin genă. Resturi alternative includ, de exemplu, aminoacizii omega de formula H2N(CH2)nC0CH, în care n este 2...6. Aceștia sunt aminoacizii neutri, nepolari, cum sunt sarcozina (Sar), t-butil alanina (t-Bu-A), t-butil glicina (t-Bu-G), N-metil lle (N-Melle) și norleucina (Nle). Fenilglicina, de exemplu poate fi substituită pentru Trp, Tyr sau Phe cu un aminoacid aromatic neutru; citrulina (Cit) și metionin sulfoxidul (MSO) sunt polari,dar neutri, ciclohexil alaina (Cha) este neutru și nepolar, acidul cisteic (Cya) este un acid și ornitina (Crn) este bazică.
Conformația care conferă proprietățile resturilor de pralină poate fi menținută dacă unul sau mai multe dintre acestea este substituit prin hidraxiprolină (Hyp).
Termenul de “polinucleotidă recombinată” așa cum este folosit în prezenta invenție intenționează să reprezinte o polinucleotidă de origine genomică, cADN, semisintetică care, în virtutea originii sale sau manipulării: (1) nu este asociată în totalitate sau într-o porțiune a unei polinucleotide cu care ea esteasociată în natură;
(2) este legată la o polinucletidă, alta decât cea la care este ea legată în natură, sau (3) nu se întâlnește în mod natural.
Termenul “polinucleotidă” așa cum este folosit în prezenta invenție se referă la o formă polimerică a nucleotidelor de orice lungime,atât ribonucleotide,cât și dezoxiribonucleotide. Acest termen se referă numai la structura primară a moleculei. Astfel, acest termen include AND mono- și dublu catenar și ARN. El include, de asemenea, tipuri cunoscute de modificări, de exemplu marcaje care sunt cunoscute în domeniu, metilarea, substituția uneia sau mai multor nucleotide întâlnite în mod natural cu un analog, modificări internucleotidice precum, de exemplu, cele cu lanțuri neîncărcate (de exemplu metilfosfonați, fosfotriesteri, fosforamidați, carbamați etc.) Și cu legături încărcate (de exemplu, fosforotionat, fosforoditionați etc.) care conțin jumătăți atașate cum ar fi, de exemplu, proteine care includ, dar nu se limitează la, nucleoze, toxine, anticorpi,peptide semnal și po/AL-lizină; cele care au intercalați (de exemplu acridină, psoralen etc) pe cele care conțin chelatori (de exemplu, metale,
250
255
260
265
270
275
280
285
290
RO 115471 Bl metale alcaline, metale radioactive, bor, metale oxidante etc.), pe cele care conțin alchilanți, cele cu legături modificate (de exemplu, acizi nucleici alfa anomeri etc.) precum și forme nemodificate ale polipeptidei. Polinucleotidele descrise sunt relativ scurte și, astfel, majoritatea sunt sintetizate cu ușurință pe cale chimică.
O polipeptidă “purificată” se referă la polipeptida care este într-o stare lipsită în principal de alte polipeptide, adică într-o compoziție care conține un minim de circa 50 % în greutate (polipeptidă dorită/total polipeptidă din compoziție), de preferință de circa 70 %, și chiar mai de preferat un minim de circa 70%, și chiar mai de preferat un minim de circa 90 % polipeptidă dorită, fără a lua în considerare materialele neproteice din compoziție. Tehnici pentru purificarea polipeptidelor virale sunt cunoscute în domeniu. în mod similar, sunt definiți în domeniu anticorpii purificați.
Așa cum s-a folosit în cadrul prezentei invenții, termenul de “epitop” se referă la un determinant antigenic al unei polipeptide. Un epitop poate cuprinde 3 sau mai mulți aminoacizi care definesc situl de legare al unui anticorp. în general, un epitop constă din cel puțin 5 aminoacizi și uneori constă din cel puțin 8 aminoacizi. Metoda de configurare epitopică este cunoscută în domeniul de specialitate.
Termenul de “epitop specific de tip” se referă la un epitop care este găsit pe unul din tipurile HCV. Un “epitop specific tipului de grup” este găsit pe mai mult decât unul, dar mai puțin decât toate tipurile HCV. De exemplu, un epitop particular poate fi recunoscut prin anticorpi de la un pacient infectat cu HCV-1, dar nu poate fi recunoscut mai puțin eficient prin anticorpi de la un pacient infectat cu HCV-2. în mod similar, un epitop specific tipului de grup, derivat de la HCV-3, poate fi recunoscut prin anticorpi de la un pacient infectat cu HCV-3 sau HCV-4, dar nu prin anticorpi de la un pacient infectat cu HCV-1 sau HCV-2.Epitopi conservanți” sunt acei epitopi care sunt recunoscuți prin anticorpi specifici tuturor tipurilor HCV.
O polipeptidă este “reactivă imunologic” cu un anticorp care se leagă la o polipeptidă datorită recunoașterii de către anticorp a unui epitop specific conținut în polipeptidă. Reactivitatea imunologică poate fi determinată prin legarea anticorpului, mai precis prin cinetica legării anticorpului, și/sau competiție în legare folosind drept competitori polipeptide cunoscute care conțin un epitop împotriva căruia este orientat anticorpul. Tehnicile care determină dacă o polipeptidă este reactivă imunologic cu un anticorp sunt cunoscute în domeniul de specialitate.
Așa cum s-a folosit, în cadrul prezentei invenții, termenul “anticorp” se referă la o polipeptidă sau grup de polipeptide care sunt cuprinse în cel puțin un sit de combinare anticorp. Un sit de combinare anticorp” sau “domeniu de legare” este format din cutarea domeniilor variabile ale unei (unor) molecule anticorp pentru a forma spații de legare tridimensionale cu o formă a suprafeței interne și distribuția încărcării complementare trăsăturilor unui epitop al unui antigen, care permite o reacție imunologică cu antigenul. Un sit de combinare anticorp poate fi format dintr-un domeniu de lanț greu și/sau lanț ușor (VH și respectiv VL), care formează bucle hipervariabile care contribuie la legarea antigenului. Termenul “anticorp” include, de exemplu, anticorpul de vertebrate, anticorpi himerici, anticorpi modificați, anticorpi univalenți, proteine Fab și anticorpi de domeniu unic.
Anticorpi specifici pentru polipeptiode și grup de polipeptide se pot obține prin orice metodă cunoscută în domeniul de specialitate. De exemplu, polipeptidele sunt în general suspendate într-un tampon acceptabil din punct de vedere farmaceutic, amestecate cu un adjuvant adecvat și apoi injectate într-un animal. Metodele pentru obținerea anticorpilor monoclonali și policlonali sunt cunoscute în domeniul și nu vor fi descrise în detaliu în prezenta invenție.
RO 115471 Bl
345
Termenul de “polipeptidă” se referă la un polimer al aminoacizilor și nu se referă la lungimea specifică a produsului. Astfel, polipeptide, oligopeptide și proteine sunt incluse în definiția polipeptidei. De asemenea, acest termen nu se referă la, sau exclude modificările post-expresie ale polipeptidei, de exemplu, glicozilare, acetilare, fosforilare și altele asemenea. în definiție sunt incluse, de exemplu polipeptide care conțin unul sau mai mulți analogi ai unui aminoacid (incluzând de exemplu aminoacizi non-naturali etc.], polipeptide cu legături substituite, precum și alte modificări cunoscute în domeniu, care sunt întâlnite sau neîntîlnite în mod natural.
Termenul de “tratament”, așa cum se folosește în descriere, se referă la profilaxie și/sau terapie.
Un “individ”, așa cum este folosit în descriere, se referă la vertebrate, în special membri ai speciilor de mamifere și include, dar nu se limitează la, animale (de exemplu, câini, pisici, bovine, porcine, ovine, capre, iepuri, șoareci, șobolani, cobai etc.) Și primate incluzând maimuțe, cimpanzei, babuini și oameni.
Așa cum s-a folosit aici “banda sens” a unui acid nucleic conține secvența care are omologie de secvență la cea a mARN-ului. Banda anti-sens” conține o secvență care este complementară la cea a “benzii sens”.
Așa cum s-a folosit în prezenta invenție, “un genom de bandă pozitivă” al unui virus este unul în care genomul, fie ARN, fie AND, este de bandă unică și care codifică polipeptida(le) virale.Exemple de virusuri ARN de bandă pozitivă includ Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae și Caliciviridae. De asemenea, sunt incluse Flaviviridae, care în trecut au fost clasificate ca Togaviridae (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate], în conformitate cum s-a folosit în prezenta invenție, termenul de “probă conținând anticorpul corpului “ se referă la un component al corpului unui individ care este o sursă de anticorpi de interes. Componente ale corpului care conțin anticorpi sunt cunoscute în domeniu și includ, dar nu se limitează la, ca de exemplu, plasmă, ser, fluid spinal, fluid limfatic, secreții externe ale tractului respirator, intestinal și genitourinar, lacrimi, salivă, lapte, celule sanguine albe și mieloame.
Așa cum s-a folosit aici, termenul de “probă biologică” se referă la o probă de țesut sau fluid care este izolată de la un individ incluzând, dar fără să se limiteze, de exemplu, la plasmă, ser, fluid spinal, fluid limfatic, secțiuni externe ale pielii, ale tractului respirator, intestinal sau genito-urinar, lacrimi, salivă, lapte, celule sanguine, tumori, organe. Sunt incluse, de asemenea, probe ale constituenților culturilor de celule in vitro (incluzând, dar fără să se limiteze, la, mediu condiționat care rezultă din creșterea celulelor în mediu de cultură, celule care posibil sunt infectate viral, celule recombinante și componente celulare).
Invenția include și metode pentru detectarea HCV și identificarea infecției provocată de diferite tipuri de virus HCV. Invenția include, de asemenea, polipeptide și molecule de acid nucleic care sunt utilizate în metodele respective.
Metodele pentru detectarea și stabilirea tipului de infecție prin HCV includ atât imunoteste, cât și identificarea acidului nucleic, prin metode care includ dar nu se limitează la analize Southern și reacția polimerazică în lanț. în scopul identificării infecției prin HCV, se incubează o probă biologică cu una dintre polipeptidele care au fost descrise în prezenta invenție, în condiții care permit legarea antigen-anticorp, după care se efectuează determinarea dacă anticorpii din probă se leagă la epitopul găsit pe polipeptidă.
Peptidele care conțin epitopi specifici de tip și epitopi specifici tipului de grup sunt utile în imunoteste pentru detectarea prezenței anticorpilor HCV, sau prezența
350
355
360
365
370
375
380
385
RO 115471 Bl virusului și/sau antigenelor virale în probe biologice. Destinația imunotestelor este supusă unui mare grad de variație și sunt cunoscute în domeniu numeroase forme. Imunotestul va utiliza cel puțin un epitop specific de tip sau un epitop specific tipului de grup. într-unul dintre modurile de realizare, imunotestul folosește o combinație de epitopi specifici de tip și/sau epitoli specifici tipului de grup.
Polipeptidele sunt utile pentru stabilirea tipului HCV, folosind epitopii pentru determinarea prezenței anticorpilor specifici tipului sau specifici tipului de grup. Polipeptidele sunt de asemenea adecvate pentru utilizare, în generarea anticorpilor specifici tipului sau tipului de grup care pot fi apoi folosiți într-un imunotest pentru distingerea între diverse tipuri ale HCV.
Polipeptidele sunt derivate din trei regiuni diferite ale genomului HCV. Un set de polipeptide include un epitop specific de tip sau specific tipului de grup obținut din regiunea corpului central HCV. Alt set de polipeptide include un epitop specific tipului sau specific tipului de grup obținut din regiunea nestructurală 4 a HCV (ND4). Alt set de polipeptide include un epitop specific de tip sau specific tipului de grup obținut din regiunea nestructurală 5 (ND5) a unui virus de hepatită C. Acest set se găsește între resturile aminoacide 2281-2313 ale HCV-1 și regiunilor omoloage ale altor tipuri de virus de hepatită C.
Polipeptidele sunt corespunzătoare pentru utilizare în imunoteste pentru unul sau mai multe tipuri de HCV. în vederea testării, pentru un tip, proba se contactează cu una sau mai multe polipeptide care conțin un epitop specific de tip, în condiții care permit legare antigen-anticorp și apoi determinarea dacă anticorpii din probă se leagă la epitop.
într-un imunotest pentru distingerea unui tip anume al HCV, se obține o probă biologică de la un individ, se contactează cu un prim epitop specific de tip sau specific tipului de grup, în condiții care permit legarea antigen-anticorp; se contactează cu un al doilea epitop specific de tip sau epitop specific tipului de grup în condiții care permit legarea antigen-anticorp și determinarea dacă anticorpii din probă se leagă fie la primul fie la al doilea epitop. Aceste etape se pot repeta cu orice număr de polipeptide care conțin epitopi de tip și/sau specifici tipului de grup.
De obicei, o imunoanaliză pentru anticorpii] anti-HCV implică selectarea și prepararea probei test suspectă de conținut de anticorp, cum ar fi o probă biologică, apoi incubarea acesteia cu epitopul specific de tip sau epitopul specific tipului de grup, în condiții care permit să se formeze complexe antigen-anticorp, și apoi detectarea formării de complexe. Condițiile în care se face incubarea și sunt cele mai adecvate sunt cunoscute din domeniu. Imunotestul poate fi, dar fără limitări, sub formă heterogenă sau omogenă și de tip standard sau competitiv.
într-un format heterogen, epitopul specific de tip sau epitopul specific tipului de grup se leagă de obicei la un suport solid pentru facilitarea separării probei de polipeptidă după incubare. Exemple de suporturi solide care pot fi folosite includ,dar nu se limitează la, nitroceluloză (de exemplu, sub formă de membrană sau de godeu de microtitrare), clorură de polivinil (de exemplu, sub formă de fâșii sau godeuri de microtitrare), latex polistirenic (de exemplu, bile sau plăci de microtitrare], polivinilidin (cunoscut ca lmmulonR), hârtie diazotizată, membrane de nylon, bile activate și bile de proteină A. De exemplu, plăcile de microtitrare lmmulonR2 sau bilele de polistiren de □,25 inch, se pot folosi în format heterogen. Suportul solid care conține epitropul specific de tip sau specific tipului de grup este de obicei spălat, după separarea lui din proba test și înaintea detectării anticorpilor legați. Ambele formate, standard și competitive, sunt cunoscute în domeniul de specialitate.
RO 115471 Bl într-un format omogen, proba test este incubată cu epitopul specific de tip sau epitopul specific tipului de grup în soluție.De exemplu, ea poate fi în orice condiții care pot precipita orice complexe antigen-anticorp care se formează. Pentru aceste analize sunt cunoscute în domeniu atât formatele standard, cât și cele competitive.
într-un format standard, cantitatea anticorpilor HCV care formează complexe anticorp-epitop specific de grup sau anticorp-epitop specific tipului de grup este urmărită direct. Aceasta se poate realiza prin determinarea, dacă anticorpii marcați antixenogeneici (de exemplu, anti-uman] care recunosc un epitop pe anticorpi anti-HCV se vor lega datorită formării complexului. într-un format competitiv, cantitatea de anticorpi HCV din probă se deduce prin urmărirea efectului de competiție asupra legării unei cantități cunoscute de anticorp marcat (sau alt ligand competitiv] în complex.
într-o analiză de inhibare, se determină capacitatea anticorpilor de a se lega la polipeptide care conțin diverse tipuri și diferite de epitopi specifici de tip sau epitopi specifici tipului de grup. Anticorpii se expun inițial la polipeptide care conțin epitop(i) de la un tip sau tip de grup al HCV și apoi la polipeptide care conțin epitop(i) de la alt tip de grup al HCV. Procesul poate fi repetat pentru tipuri sau tipuri de grup ale HCV suplimentare.
Complexele formate care conțin anticorp anti-HCV (sau în cazul analizelor de competitivitate, cantitatea anticorpului concurent) sunt detectate prin oricare dintre numeroasele tehnici cunoscute, în funcție de format. De exemplu, anticorpii HCV nemarcați din complex se pot detecta folosind un conjugat de Ig antixenogeneic complexat cu un marcaj (de exemplu, un marcaj enzimatic).
în imunotestele obișnuite, proba de testat, care este de obicei o probă biologică, se incubează cu polipeptide care conțin unul sau mai mulți epitopi specifici tipului sau epitopi specifici tipului de grup în condiții care permit formarea complexelor de antigen-anticorp. Se pot folosi diverse formate. De exemplu, se poate folosi o “analiză tip sandwich”, unde anticorpul format la un suport solid cu un al doilea anticorp marcat pentru analit și suportul se spală din nou. Analitul se detectează prin determinarea dacă al doilea anticorp este legat la suport. într-un format competitiv, care poate fi heterogen sau omogen, proba de testat este de obicei incubată cu anticorp și cu marcaj; antigenul competitor este de asemenea incubat fie secvențial, fie simultan. Acestea, și alte formate sunt bine cunoscute în domeniul de specialitate.
Antigenii orientați împotriva epitopilor specifici de tip sau epitopilor specifici tipului de grup se pot folosi în imunoteste pentru detectarea antigenilor virali la pacienții cu HCV produsă NANBH și donatorii de sânge infectat. Mai mult decât atât, acești anticorpi pot fi extrem de utili în detectarea pacienților și donatorilor în faza acută.
Un imunotest poate utiliza, de exemplu, un anticorp monoclonal orientat spre un epitrop specific de tip sau epitopi specifici tipului de grup, o combinație de anticorpi monoclonali orientați spre epitopii unui antigen viral, anticorpi monoclonali orientați spre epitopii antigenilor virali diferiți, anticorpi policlonali orientați spre același antigen viral sau anticorpi anticlonali orientați spre diferiți antigeni virali. Protocoalele se pot baza, de exemplu, pe competiție sau reacția directă sau pe analiza de tip sandwich. De asemenea, protocoalele pot folosi, de exemplu, suporturi solide sau pot fi prin imunoprecipitare. Majoritatea analizelor implică utilizarea anticorpului sau polipeptidei marcate;marcajele pot fi, dar nu se limitează, enzimatice, fluorescente, chemiluminiscente, radioactive sau molecule clorurate. De asemenea, sunt cunoscute analize care amplifică semnale de la sondă; exemple de astfel de analize sunt acelea
440
445
450
455
460
465
470
475
480
485
RO 115471 Bl care utilizează biotina și avidina, precum și imunoteste de marcaj enzimatic și mediate precum analizele ELISA.
Invenția include, suplimentar, molecule de acid nucleic care codifică secvențele descrise ale resturilor aminoacide ale epitopilor specifici tipului sau epitopilor specifici tipului de grup. Aceste molecule de acid nucleic sunt utile ca sonde, de exemplu în bloturi sau alte analize de recunoaștere ADN, cum ar fi analiza de captură care este descrisă în literatura de specialitate.
Studiile asupra configurației antigenice prin exprimarea cADN-urilor HCV au arătat că un număr dintre clonele care conțin aceste cADN-uri au exprimat polipeptide care au fost reactive imunologic cu ser de la indivizi care prezintă NANBH. Numai o singură polipeptidă nu a fost reactivă imunologic cu toate serurile. Dintre aceste polipeptide, cinci dintre ele au fost imunogenice în anticorpi pentru epitopi HCV, și aceste polipeptide s-au detectat în seruri de la numeroși pacienți diferiți, deși suprapunerea în detectare nu a fost completă. Astfel, rezultatele asupra imunogenității polipeptidelor codificate în diferite clone sugerează că sisteme de detecție eficiente pentru infecția HCV pot include folosirea tablourilor de epitopi. Epitopii din tablou pot fi construiți ca polipeptidă singură sau ca polipeptide multiple.Analizele pentru diversificarea epitopilor pot fi secvențiale sau simultane.
Kituri adecvate pentru imunodiagnoză și care conțin reactivi marcați adecvați, sunt construite prin împerecherea materialelor corespunzătoare, incluzând polipeptidele din prezenta invenție care conțin epitopi specifici tipului și epitopi specifici tipului de grup în recipiente care sunt corespunzătoare, împreună cu resturi de reactivi și materiale care sunt necesare pentru dirijarea analizei, precum și un set corespunzător de instrucțiuni care privesc desfășurarea analizei.
Invenția include, suplimentar, molecule de acid nucleic complementare la secvențele acidului nucleic care codifică regiunile care mărginesc epitopii specifici de tip și epitopii specifici tipului de grup. Astfel de molecule de acid nucleic sunt utile în realizarea de PCR, pentru determinarea genotipului unui HCV particular.
Ar fi de remarcat că regiunile variabile și hipervariabile din genomul HCV, prin urmare omologia din aceste regiuni, este de așteptat să fie semnificativ mai mică decât cea din totalitatea genomului.
Tehnicile pentru determinarea omologiei acidului nucleic și secvenței aminoacide sunt cunoscute în domeniu. De exemplu, secvența aminoacidă se poate determina direct și compara cu secvențele furnizate în prezenta descriere. Alternativ, poate fi determinată secvența nucleotidică a materialului genomic și presupusului HCV (de obicei pe calea unui cADN intermediar), se poate determina secvența aminoacidă codificată prin acesta și pot compara regiunile corespunzătoare.
Discuțiile și cele arătate mai sus ilustrează doar invenția, iar persoanele care sunt în domeniu pot aprecia că invenția se poate aplica și în alte moduri.
Se dau în continuare 7 exemple de realizare a invenției, în legătură și cu fig. 1 4 care ilustrează următoarele:
- fig. 1 - este o diagramă a fluxului strategiei experimentale de serotipizare;
- fig. 2 - este o diagramă a fluxului strategiei hărții epitopice cuprinzătoare;
- fig. 3 - este o compilare a graficelor care prezintă rezultatele întocmirii hărții epitopului HCV la (Rodney);
- fig. 4 - este o compilare a graficelor care prezintă rezultatele întocmirii hărții epitopului HCV 2b (Nomoto).
RO 115471 Bl
Exemplul 1. Comparație a epitopilor principali ai diverselor tipuri diferite de HCV
S-a comparat pentru diverse regiuni omologia restului aminoacid între diferite tipuri și subtipuri ale HCV. Subtipul HCV este așa cum s-a descris prin analiza filogenetică Simmonds. Numerotarea secvenței aminoacide corespunde celei descrise pentru secvența prototipului HCV-1. Tabelul 2 care urmează arată procentul omologiei restului aminoacid pentru regiunea NS4, epitopii specifici tipului, epitopii specifici tipului de grup și epitopul principal conservat.
Tabelul 2
Omologiile aminoacide[%] între diferite subtipuri HCV
535
540
545
| Subtip HCV | Exemplul tipurilor abreviate | Epitopi principali specifici tipului din regiunea NS4 (1689-1718 aa) | Epitop principal conservat din regiunea NS4 (1910-1936 aa) |
| 1a | HCV-1 (1a)vs(1a) | 100% | 100% |
| 1b | HCV-J (1a)vs(1b) | 83 % | 100 % |
| 2a | HCV-J6 (1a)vs(2a) | 47 % | 93 % |
| 2b | HCV-J8 (1a)vs(2b) | 43 % | 93 % |
550
Tabelul 3 care urmează prezintă omologia restului aminoacid între doi epitopi specifici tipului sau epitopi specifici tipului de grup pentru regiunea ND5.
555
Tabelul 3
Omologiile aminoacide [%) între diferite subtipuri HCV
| Subtip HCV | Exemplul tipurilor abreviate | Epitopi principali specifici tipului din regiunea NS5 (2281-2313 aa) | Epitop principal conservat din regiunea NS5 (2673-2707 aa) |
| 1a | HCV-1 (1a)vs(1a) | 100% | 100 % |
| 1b | HCV-J (1a) vs(1b) | 76 % | 89 % |
| 2a | HCV-J6 (1a) vs(2a) | 70% | 83 % |
| 2b | HCV-J8 (1a) vs (2b) | 73 % | 83 % |
| 3a | HCV-E-b1 (1a) vs (3a) | 77 % | |
| 3b | HCV-Tb (1a) vs (3b) | 83 % |
560
565
570
Tabelul 4 prezintă procentul omologiei restului aminoacid pentru epitropii principali conservați în regiunea corpului central și epitopii specifici tipului.
RO 115471 Bl
Tabelul 4
Omologia restului aminoacid [%) între diferite tipuri HCV
| Subtip | Exemplul tipurilor abreviate | Epitopi principali conservați în regiunea corpului central (10-45 aa] | Epitopi principali specifici de tip din regiunea corpului central (67 - 84 aa] |
| 1a | HCV (1a) vs (1a) | 100% | 100% |
| 1b | HCV (1a) vs (1b) | 98 % | 100 % |
| 2a | HCV-J6 (1a)vs(2a) | 98 % | 61 % |
| 2b | HCV-J8 (1a)vs(2b) | 98 % | 61 % |
| 3a | HCV-E-b1 (1a) vs (3a) | 93 % | 89 % |
| 4 | HCV-EG-21(1a) vs (4) | 98 % | 83 % |
Exemplul 2. Sinteza peptidei
S-au sintetizat două seturi de polipeptide. Primul set a fost desemnat realizării configurației epitopului HCV-1, iar al doilea set a fost desemnat determinării acelor epitopi identificați în studiile de configurație epitopică care au un conținut de epitopi specifici tipului. în primul set de polipeptide s-au sintetizat 64 de seturi (în duplicat] de octapeptide de suprapunere prin Mimotopi peste întreaga poliproteină HCV-1 (3011 resturi aminoacide). Al doilea set de polipeptide s-a realizat în conformitate cu metoda care este descrisă în literatura de specialitate (de către Geysen și Merrifield).
în cele de, al doilea set de polipeptide s-au selectat patru regiuni antigenice care reprezintă epitopii principali ai secvențelor non-conservative din HCV-1 din corpul central, ND4, ND5 și secvențele lor corespunzătoare de la subtipurile HCV 1b, 2a, 3a și tipul 4 pentru sinteza epitopului specific tipului. Secvența de la corpul central s-a selectat din regiunea mai puțin conservată a resturilor aminoacide 67-88. Secvența din regiunea NS4 s-a selectat de la regiunea restului de aminoacid 1689-1718. Secvențele selectate din regiunea ND5 au fost de la regiunile restului aminoacid 2281-2313 și 2673-2707.
Exemplul 3. Probe biologice în scopul determinării eficacității polipeptidelor între anticorpi specifici pentru diferite tipuri ale HCV, s-au obținut antiseruri de la 24 pacienți NANBH cronici din diferite zone ale lumii, incluzând Statele Unite, coasta de Est și de Vest, Japonia, țările Europei de Vest, țările Europei de Sud și Africa de Sud. Izolarea ARN-ului viral, sinteza cADN, amplificarea PCR, secvențarea AND și hibridizarea sondei oligonucleotidice s-au realizat așa cum este descris în literatura de specialitate (de către Cha și al.).
Exemplul 4. Procedurile de configurare epitopică în scopul determinării regiunilor HCV care conțin epitopi, specifici de grup sau conservanți, s-a supus întocmirea hărții epitopului întreg de poliproteină HCV-1. Metoda folosită este în principal cea subliniată în fig.2.
S-au sintetizat 64 seturi (în dublicat) de octapeptide de suprapunere prin
MimotopesR față de întreaga proteină HCV-1 (3011 de aminoacizi). S-au selectat o gamă de 40 probe care conțin 25 probe reactive de anticorp HCV din Statele Unite, probe reactive HCV din Japonia și 6 probe de control negativ nereactive HCV pentru configurarea epitopică și analiza grupului. Imunotestele s-au realizat folosind proceduri cunoscute ELISA standard.
RO 115471 Bl
Criteriile pentru identificarea epitopilor principali s-au bazat pe frecvența reacției anticorpului și intensitatea reacției anticorpului (titru) față de acești epitopi. Rezultatele sunt prezentate în fig. 3 și 4.
Teste imune cu anticorpi marcați cu enzime selecționate a peptidei derivate (ELISA):
în scopul determinării imunotestului optim care utilizează polipeptidele descrise în exemplul 2, s-au efectuat două teste imune cu anticorpi marcați cu enzime selecționate (ELISA) a două tipuri separate de polipeptide derivate și s-au comparat rezultatele. Primul tip ELISA a fost Nune MaxiSprb™ pe care sunt adsorbite peptidele în mod simplu și al doilea tip utilizat a fost Nune Covalink NH™ pe care polipeptidele sunt legate covalent. Formarea legăturilor amidice între acizii carboxilici și amine se inițiază prin adăugarea de carboiimidă. Pentru producerea hidrolizei se poate face esterul activ adăugând N-hidroxi-succinimidă (NHS) la procedurile de conjugare care au fost arătate mai sus.
Plăcile de microtitrare pentru primul tip de ELISA s-au realizat după cum urmează: Polipeptidele au fost plasate în godeuri ale plăcilor de microtitrare Nune MaxiSorb™ la o concentrație de 1 pg/godeu în 1OO pl de fosfat salin (PBS). Polipeptidele s-au lăsat să absoarbă peste noapte și la temperatura camerei. în continuare, plăcile de microtitrare s-au spălat de 4 ori cu PBS fără detergent. Godeurile au fost apoi acoperite cu 220 pl SuperblockR pe o perioadă de o oră și apoi s-au aspirat fără spălare suplimentară și s-au uscat în vid.
Analiza s-a realizat după cum urmează: S-au adăugat probe de ser în cantitate de 5 pl la godeuri cu 100 pl de lapte degresat 5% și s-au incubat timp de 4 ore la temperatura de 37°C. în continuare, godeurile s-au spălat de 5 ori în PBS cu 0,05 % Tween. Apoi s-a folosit un conjugat de afinitate de capră purificat anti-lgG uman marcat cu peroxidază din hrean, pentru determinarea gradului legării anticorpilor umani la polipeptide. Conjugatul a fost diluat anterior la 5 % IgG în 150 mM NaCI, PBS, 5% ser de cal (denaturat termic). S-au plasat 100 pl de conjugat în godeuri și s-a incubat timp de o oră la 37°C. Godeurile s-au spălat apoi de 5 ori cu PBS/Tween și OPD (0-fenilen-diamină-2HCI), o tabletă pe tampon developare care este citrat fosfat tamponat 0,02 % H202), pentru 30 min la temperatura camerei și s-au determinat absorbanțele la 492 nm și 620 nm. Separarea s-a determinat din 200 probe randomice (normale)unde au fost 7 deviații standard de la medie sau circa 0,45.
Plăcile de microtitrare pentru al doilea tip de ELISA s-au realizat după cum urmează: Polipeptidele s-au plasat în godeurile plăcilor de microtitrare Nune MaxiSorb™ la o concentrație de 10 mg/godeu în 50 pl apă. S-au adăugat 25 pl de 0,1 M NHS (sulfo-N-hidrosuccinat) și 25 pl de 0,1 M EDC (1-etil-3(3-dimetil-aminopropilcarbodiimidă) la polipeptide și s-au amestecat la temperatura camerei timp de 30 min, pe o platformă rotativă. Conținuturile integrale s-au adăugat apoi la 52 ml carbonat de sodiu 0,1 M cu pH 8,6, răcit pe gheață. S-au folosit 100 μΙ de amestec pentru învelirea godeurilor plăcilor de microtitrare și apoi s-a incubat la temperatura de 4°C timp de 30 min. Plăcile s-au spălat apoi de 4 ori cu PBS/0,1 % Triton X-100. în continuare, plăcile s-au tratat cu Superblock și analiza s-a realizat după cum s-a descris mai sus.
Rezultatele obținute s-au prezentat în tabelele 5 ... 14 care urmează:
620
625
630
635
640
645
650
655
660
CD
CD
| CD | CD | CD | CD |
| 00 | Xl | Xl | CD |
| O | CJ1 | O | CJ1 |
Reacționează cu epitop comun pentru 1a, 1b, 2a și 2 b
Ό
- □ m
<
| (II) Proba reacționează cu epitopi specifici de tip 84 -018669 | Reacționează cu epitopi comuni 1a, 1b, 2a și 2b PDREVLY K I | Probe donator | (I) Probe donator | Secvența regiunii: Proba ID | |||||||||||||
| CD CD | 8.94 | 6.20 | XI co co | 3.76 | 6.57 | 3.41 | cd ώ | CD iu C0 | I NS4 (1689-1718) Peptidă EIA | ||||||||
| sodCIOO ELISA (1a) | O X5 -k O na ω Γϋ ct | O -σ O na JO îG | o X o na ct | O X 4S O na o 0) | sodCIOO ELISA (1a) | O X A O na ω ω σ | ο X £» Ο na Γϋ Π3 0) | cp402-11 (1b) | cp 402-13 (2b) | O TJ A O na jO Π3 0) | O X £> O na CT | O X A O na o _i 0^ | Peptidă (tip HCV) | ||||
| NDRVWAPDKEILYEAFDEMEECASKAALI | NQRAWAPDKEVLYEAFDEMEECASRAALI | SGRPAVIPDREVLYQFDEMEECASHLPYI | SGKPAIIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYI | SGKPAIIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYI | Secvențe dependente de tip |
XJ
UI \l o
Xj O
UI
| Xl | CB | CD |
| o | CD | CD |
| o | UI | O |
740
X ω tn
XI
ΓΌ
CJ1
X ΓΌ O
| ΓΌ ω ΓΌ | MT-79 | ΓΌ 0) ί* ΓΌ | MT-32 | [1] Probe donatori | Descrierea probei | Secvența regiunii: ND4 (1689 - 1718) | ||||||||||
| 0.41 | 44 ΓΌ | 5.53 | 0.34 | 0.27 | 0.23 | 88 9 | 7.81 | 0.67 | 0,68 | Peptidă EIA Semnal/Separare | ||||||
| sodCIOO ELISA (1a) | O Ό 4^ O rp ω ΓΌ cr | CI Ό 4^ O ΓΌ _i ΓΌ ΓΌ CD | O Ό £> O ΓΌ cr | O T5 4^ O rp o 2L | ω o D. O 8 m Γ ω > | O O A O ΓΌ ω ΓΌ cr | O Ί3 O ΓΌ ΓΌ ΓΌ | O *O A O rp cr | O O O rp o 0^ | n Ό 4^ O rp ω ΓΌ CT | o Ό 4^ o rp ΓΌ ΓΌ 0) | O TJ O rp | O TJ O rp o QJ, | Peptide de la diferite tipuri HCV | ||
| Reactiv cu epitrop specific de tip CASRAAL CASKAAL | reactiv cu epitrop specific de tip CASRAAL CASKAAL | * Z * □ “0 o * 7\ m O 1“ -< m > “Π O m * m m O > ω □ | NQRAWAPDKEVLYEAFDEMEECASRAALI | SGKPAIIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYI | SGKPAIIPOREVLYREFDEMEECSQHLPYI | SGKPAIIPOREVLYREFDEMEECSQHLPYI | Secvențe dependente de tip |
| >-* | 1-4 | Ο U> |
| Φ Φ <Λ O | ||
| co A | Z > | o < -» Φ ”' “5 |
| — ♦ | z | φ 3 |
| w O | co | rt fi* |
| σ >-* | z | Φ |
| fi) -« | ||
| u> u» | o 0 | — φ (Q —1 —. o C |
| 2 | σ □ | |
| •Ό Φ | Ω a φ ω | φ — |
>
□ fi)
N fix
Q. Φ ω Φ “5
O o
N fi)
O
Φ
T5
O
Ό
O fix
Q.
O ι> Ο
ΕΞ3
| >-« | w | >-< | 1-t | >-< | w | Cfl | |
| « | X | G1 | X | X | X | Λ | |
| tn | tn | Cn | tn | tn | tn | IU | |
| Γ | r | r* | t- | r> | |||
| 4 | H | H | H | H | >4 | Φ | |
| x | tn | tn | w | X | X | ||
| X | 73 | 73 | 73 | X | X | ||
| r | r | r | r | r· | r | Φ | |
| ·< | *< | -< | ►< | >< | >< | ||
| IO | o | < | < | < | »-» | < | a |
| a | o | o | o | o | o | φ | |
| o | o | o | o | a | o | *D | |
| 73 | X | X | X | X | X | Φ | |
| 3 | X | 3 | X | r | r | 2 | |
| 7) | •4 | X | X | >4 | >4 | CL | |
| Z | Z | z | X | z | Z | Φ | |
| W | tn | tn | tn | tn | tn | □ | |
| X | X | X | X | X | X | ||
| O | Ω | o | a | o | O | Φ | |
| 7» | )O | 1O | o | io | X | ||
| i> | 0 | tn | ω | H | z | z | |
| Io | O | O | o | o | o | o | Φ |
| o | O | o | o | o | o | ||
| >< | ►< | K | ►< | •4 | >-< | — | |
| 7» | X | x | X | X | X | Ό | |
| 73 | 73 | 73 | X | X | X | ||
| O | O 2 | O 2 | o X | o X | o 2° | ||
| > tn | > tn | tn | > tn | > tn | tn | ||
| O | O | O | o | O | O | ||
| < | < | < | <; | < | < | ||
| r* | X | r | r | tr | t- | ||
| Ό | Ti | H | >4 | H | •4 | ||
| F~l | •4 | •4 | •4 | •4 | •4 | >4 |
| Xl | Xl | xl | Xl | Xl | XJ |
| xl | CD | CD | CD | CD | |
| O | CD | O | CD | O | CD |
| 00 | xJ | \J | •Xj | xj | |
| o | CD | CD | 00 | 00 | XJ |
| O | UI | O | UI | O | UI |
Schimbare critică în secvență a modificat răspunsul epitop din această probă
| nj | V) O ΖΓ |
| □ | |
| CT» | □ σ |
| NJ | & |
| xj | φ |
| π | |
| “1 | |
| Z.’ | |
| o | |
| fix |
□ cn
Φ o
<
| •-Τ' | O | O | NJ | bJ | GJ | Φ □ | ►_* | o | O | |
| 'UI | CN | xj | cn | ►_ | CD | fiX | cn | Xk | cn | |
| O | κΌ | Nj | cn | O | fi) | CD | CD | CD | ||
| Γ) | n | 0 | Ω | Ω | O | 3 0 o. -* o fi) Φ •o 0 | Π | 0 | n | |
| 1 | TD | T) | T3 | n | *□ | 15 | 1 | o | Ό | |
| ~T | Xk | x» | Xk | Xk | Xk | z | Xk | Xk | ||
| V) | O | o | O | o | O | O | ω | ω | O | O |
| vn | NJ | nj | e'J | NJ | NJ | NJ | n | u> | NJ | nj |
| 71 | 1 CD | 1 xj | 1 Ό | t σ» | UI | I Xk | o cn | 1 CD | 1 xj | |
| Γ* | —» | •—X | —X | r· | «-X. | |||||
| ·—♦ | bJ | NJ | NJ | 1—‘ | Φ | w | GJ | NJ | ||
| Co | Of | cr | σ | σ | fi) | “ | co | D» | cr | |
| > | > | *-* | ||||||||
| fii | 0 σ φ |
| >—► | o | ω | |||||
| Φ | Φ | ||||||
| ω | o | ||||||
| 09 Xb | o | n -5 | < Φ | ||||
| 1 O | Π O | Φ -1 | -«-► tu | ||||
| □ | Φ | ||||||
| CD | >— | fi) | Φ (Q | ||||
| GJ <T» | a | TD -1 | |||||
| σ* | z | o | C | ||||
| > | cr | ZJ | |||||
| z | φ | ||||||
| 03 | ”· | ||||||
| X | |||||||
| 13 | |||||||
| Φ | »1 | ||||||
| *n | 0 | ||||||
| rr | 3 | ||||||
| r— | |||||||
| CL | T3 | ||||||
| w | h | »—· | >-* | Φ | fi» | z | |
| H·· | co | ||||||
| ►—· | LH | Q | o | π | CL | cn | |
| σ» | NJ | K-* | χ4 | ||||
| > | σ | ^-x. | |||||
| o | NJ | ||||||
| CO | □ | CN | |||||
| ^x. | o | xj | |||||
| o | Π | tU | |||||
| o | Φ | 1 NJ | |||||
| O | |||||||
| xj | |||||||
| a | «O | a | 0 | X a. 0 o z; ® < ϋΞ. | |||
| Ό | Ί5 | *υ | 15 | ||||
| Xk | Xk | Xk | Xk | ||||
| O | o | o | O | ||||
| NJ 1 | Nj 1 | NJ l | NJ 1 | r* a. φ Φ | |||
| <0 | Qî | CH | Xk | ||||
| x | ^x» | ||||||
| GJ | NJ | μ- | )-* | •o Φ | |||
| σ | » | σ | c — | ||||
| *—* | X—'» | -i JU |
IO
| H4 | >-* | n | w | M | w |
| CO | X | cn | X | X | X |
| CO | ω | cn | cn | M | cn |
| r | Γ- | Γ* | r· | r· | r |
| H | Η | H | •4 | -J | -j |
| cn | FJ | rc | W | w | tn |
| 53 | V | » | X | X | X |
| r· | V | c | r | r* | r· |
| K | ►< | ►< | ►< | K | ·< |
| o | < | < | < | M | < |
| Ci | o | O | Ω | O | o |
| 0 | o | Ω | Ω | Ω | Ώ |
| *D | X | X | X | X | X |
| X | X | X | X | f | r |
| •4 | X | -j | |||
| z | z | X | z | z | z |
| co | (Λ | tn | cn | cn | cn |
| X | X | 7« | ?< | X | |
| 0 | O | Ω | Ω | Ω | o |
| > | o | O | 0 | O | M |
| o | w | cn | H | z | z |
| O | o | O | n | o | o |
| 0 | a | Ω | Ω | Ω | o |
| K | ►< | K | ·< | K | K |
| X | V | X | X | X | X |
| 53 | V | X | X | X | X |
| O s | n 2 | Ω | o X | o X | o |
| > co | S· cn | cn | > cn | 5 co | cn |
| 0 | O | Ω | Ω | Ω | Ώ |
| < | s | < | < | ||
| r | X | r | t4 | r< | f |
| 13 | >4 | >3 | H | •4 | |
| H | •4 | H | H | •4 |
ω φ o < φ ZJ -w
Φ
Q. Φ Ό
Φ □
Q. Φ
Φ a
φ
| ix ix | T3 O | hj m |
| m | ||
| Un IH | Z | |
| O | cu 0 | |
| o | 1 Ό | |
| -c | ||
| T3 | o |
| NJ NJ | mx Ό Φ | 2. \£^ Φ | r z ~·ο φ 75 x cn -..z | ||||
| 00 | u-i | X | Nr» | CQ | X » | 1 n - | |
| 03 0 | c | < | ui O | c | V TJ | <c* θ c | |
| 1 | Ό | D | Ito | >-o | 5 | o o | 3 |
| K> | Φ | 7? | >-* — | Λ | •o o | —* Φ | |
| fo | O | H | *V | x < | •o | ||
| 0 | z | ω-, | z | r x | -i O | ||
| 5 | ω | >< | υΐ“· | c/> | o x | 5’2 | |
| CA φ | σι | < | o | Xk | — x x o | 2.Ό | |
| X | Ό | o a | •σ O | ||||
| < | o | fip | < o | φ | |||
| &> | < | 1 1O | — o | ||||
| ·** | 1 | —· | »_· . | r* | |||
| »—· | o | — < | n -i | ||||
| — | Q | Ω | 0 | ||||
| □ | Ω | □ 77 | |||||
| ω | < | CA |
| ix | !X |
| Ω | O |
| o | f> |
| :CO | O |
| O | o |
| ω | o |
| -< | |
| X | X |
| X | |
| o § | Ω X > |
| Ln | <n |
| O | O |
| < | < |
| M | r |
| H | * jtt |
| H | H |
| J, | -L |
| Ω | o |
| < | < |
I !
CU
Ω O O O < < < < t 1 I 1 t— h- fO FO cr ft* σ a»
K>
0) f» bU σ i i π ό -j
175 |>|Q o hb *< *<
O > MIO î<
> r* *o ό r *o 73t> 751<H H wow χ < <
x iri> a o m
*o
O o ω Ό
Φ o o
Q_
Φ *□
| X | X | X | ~ m | X | X | X | Λ | ΓΠ | ||
| Ω | n | n | *-**C | O | Ω | o | cn | Ό | ||
| < | < | < | σ> — | < | < | < | -a | |||
| | | CD X | 1 | 1 | ) | 1 | r* | ||||
| K> | h-· | 1—» | νΰ θ | u> | N> | h-» | CD | 0 | ||
| Cu | σ | 0 | * | ι Έ | β> | ^•σ | ||||
| H» | ||||||||||
| fn | •J CA | O | sn | CA | ||||||
| Ί | Ό | |||||||||
| rj | CD Φ | NJ | V-* | Φ | ||||||
| σ | —' O | X* I | σ | σ | O | |||||
| f π | c | ) | c | ιω | ten | 73 | 5 | |||
| l> | f> | ω | O | cn | Η | W | 0 | |||
| ω | 1« 0 | “ | o | a | O | |||||
| ÎX W | X | a | X | IX | » | Q. | ||||
| 1? | r | Γ» | φ | |GQ ICA | Φ | |||||
| > | 73 | 73 | X X | X | ||||||
| Ir* | K | >< | r* Ό | 5» O | l£ | > O | *-* •D |
| X | m | *3 | - rn | |
| O | ^TJ | a | σ'-o | |
| IX X | σ\ -. | »< | -j | |
| Pî | M | *v | 1 ÎT | |
| h <: | ^-2 | X | CD 0 | |
| — c | 1 | Ί3 | Λ.Ό | |
| KJ »< | —X | |||
| U —* | o | »-* | O | |
| ·* >-· | o | a> | 0 | |
| a» | CD 5 | W | 3 | |
| M * | CA | CA | ||
| σ | Φ | >~· | Φ | |
| *-» ►—· | σ | |||
| σ | < | ·· | < | |
| *— | a> | ω | ||
| N> | -r* | |||
| C» |
| 00 | 00 | ω | co | ω |
| ω | ΓΌ | ro | —* | |
| O | CJl | O | σι | o |
Tabelul 10. Rezumatul epitopilor principali ai HCV specifici de tip din regiunile corp central, NS4 și NS5 805
| 00 | 00 | ω | ω | 00 | C0 |
| σι | σι | σι | U | ω | |
| Ο | σι | Ο | σι | Ο | σι |
UD σ> σ» σ'
| CD | — CD | |
| Ν> | X- Λ | |
| σ | 1 | fi» 1 |
| Ο | ** ο | |
| »-· | ►-» | |
| C3 | ||
| CJ | C0 | |
| LJ | σ» |
ο σ fiX σ
I
6,23 rC22 ELISA (2-120 aa) — ί-> Xi
| *- | Ο μ- | -J | Ο | <τ» | cn | -4 | ||||
| ο | >—· | \D | ο | LH | U» | <Λ | 05 | σ» | \Ο | |
| ω | \0 | C0 | NJ | μ- | μ— | σ' | \0 | Φ | U» |
| η | Ο | Ω | Π | π | Q | ο |
| Τ) | Ό | Ό | Ο | ο | X | X |
| χμ | XX | Χμ | Xă» | κ> | 4μ | χμ |
| ο | Ο | Ο | Ο | κ> | Ο | ο |
| ►—» | ►-» | >—· | Κ- | μ— | μ- | |
| 1 | 1 | 1 | Ι | W | i | ι |
| Ο | ο | ο | Ο | r | Ο | Ο |
| LH | Χμ | Μ | μ— | k-1 | LD | Χχ |
| .—> | —» | ω | —» | |||
| Xi. | u> | SJ | μ— | > | χμ | U» |
| α> | α> | ο» | ·>—’ | 0» | ||
| 2ϊ | R· | ·—* | ||||
| Ν> | μ- | Μ | ||||
| Ο* | σ | 1 | ||||
| >-* | ||||||
| rj | ||||||
| Ο |
ω a»
| η | Ο | π Ο | ο η ο | O | o | O | 0 |
| X | X* | ηυΌ’ϋ’ύ | ΌΌΌΌ | ||||
| χμ | NJ Χμ | Λ A Xk | Χμ | χμ | Xfc | Χμ | |
| Ο | Ο | Ν) Ο | Ο Ο Ο | O | o | o | O |
| μ- | μ- | μ- | μ- μ- ►— | μ- | μ- | μ- | μ- |
| Ι | Ι | Μ 1 | 1 1 1 | ί | ι | Ι | ι |
| Ο | Ο | r ο | ο ο ο | O | O | O | O |
| Ν> | μ— | w ςη | £μ Ν) Η» | cn | χμ | N> | |
| .<—» | «*·* | ω-* | -—» | —·» | |||
| Μ | μ- | > | Ο Ν> Η» | Xl· | u> | NJ | M |
| fi) | 0» | fi» Ρ 0» | fi» | > | » | ||
| ff» | ff» | hj | — ff» ff* | ff» | ff» | ||
| Μ | μ— | 1 | ro x-· | KJ | μ- | ||
| σ | σ | μ— | σ σ | cr | σ | ||
| —* | NJ | *»*— | ·«-* | ||||
| Ο | |||||||
| 01 | m | ||||||
| 0» | X | ||||||
| ’·* | |||||||
| O | |||||||
| X |
| * | ω | (Λ | cn | •ο | » | Ui | cn | Ui |
| η | ΓΠ | Η | σι | m | σι | Η | ||
| a | Ω | Ο | Ο | ο | α | Q | ||
| 73 | 73 | X | 7> | 73 | 50 | X | ||
| Ui | ω | Ui | Η | ω | ω | ω | ||
| X | X | X | Σ | X | X | X | ||
| » | > | > | ω | > | » | > | 3» | Ω |
| » | ιθ Ο | X | Ο | » | >ΟιΟ | X |
ο ο (Λ Φ “Τ <
ω
5555
53 73 50 » 53 X
ΓΠ Έ.
«-► ο
Ό « TJ
Φ η ο
*ύ
Ω κ χ χ
X *0
*ϋ *ϋ χ -σ Ω Ω Ω Ω X Κ Κ »<
X X Π3 *V χ χ χ χ χ X χ χ
ο.
φ •υ Φ σ <τ h— α ο
PJ μ-4 >
Ό Φ Ό
Ξ fix
U
X ο <
:ω φ ο < φ φ
Q.
Φ Ό Φ □ Ο. Φ 3 w· Φ
Ο. φ
D
!
Ο
Η* kD σ> ο & ο
Ο)
| ο | Ο | σι | ο | 04 | σι | Ο | Η* Η· | Χχ |
| Χχ | Χχ | Χχ | Xx | £Λ | Η* | r-» σι | σι | |
| Μ | 04 | \ώ | J-* | χχ | -4 | Ο *4 | ^0 |
| Ω | Ω | Ω | Ω | |
| 1 | TJ | nj | Ό | TJ |
| Ζ | XX | Xx | x* | XX |
| ω | O | O | O | O |
| υι | 04 | 04 | 04 | 04 |
| μ | 1 | 1 | 1 | 1 |
| r | O | o | o | O |
| >-t | GJ | 04 | 1—> | o |
| cn | x | ^-s | -—x | >**x |
| > | NJ | 04 | >-* | F-* |
| —. | cr | 0> | cr | |
| I— | —* | -- | *-*· |
£J
| Π | Ω Ω | Ω | o |
| 1 | 73 Ί3 | Ό | 73 |
| z | XX 4X | Xx | XX |
| 03 | O O | O | O |
| un | 04 04 | 04 | 04 |
| rt | 1 1 | 1 | 1 |
| Γ | o o | o | O |
| r-f | GJ 04 | H» | O |
| cn | *—x x | -X | X |
| :> | 04 04 | J-» | H» |
| cr cu | cr | OJ | |
| t-· | **-«* *«—* | *—- | *·-* |
| 0) |
Η υ
X ο <
ο Ο“ fix *υ
Φ
Ό α fiX m > (/) ο
Ο
Ό Φ Ό
CL fiX
ΓΠ ο *0 (Λ
Φ
Ο
Ο
ο.
φ
000
0 το
m 0
Ο 0 « 0 Φ
Ο *0 Ο ·< ο *0 > Η <
> Ο
Ο £Χ Φ
| X O | |||
| 75 | 73 | > | |
| *0 | 73 | 75 O | |
| > | > | > > | |
| r | r | r r | |
| 75 | ~v | 7J 77 | |
| 73 | > | M | <- |
| S | z | z | |
| > | > | > | > |
| 50 | 50 | 50 | 50 |
| 75 | 73 | 75 | 73 |
| O | σ | σ | O |
| ►< | ►< | Kî | K |
| Z | Z | z | z |
| tj | 73 | *0 | 75 |
| < | 73 | 73 | 73 |
| c | r | f | f |
| M | < | r< | < |
| M | pj | m | PI |
| H | w | CQ | H |
| s: | z | 5J | Z |
| X | 57 | ||
| 50 | 50 | o | 57 |
| 73 | 73 | 73 | 75 |
| 0 | O | O | O |
| ►< | K | ►< | X |
| M O | < | PJ | |
| 73 V | 75 | 75 | |
| 73 > | 75 | 75 | |
| <9 | < | < | |
| < | < | < | < |
| f | > | z | Z |
ω φ ο < φ □ r* fiX
Q.
Φ Ο Φ
Ο. Φ □ fix
ο. φ
| ω | ω | 00 | 00 | 00 |
| co | 00 | Xj | xJ | cn |
| ui | O | ui | O | UI |
| CD | CD | CD | CD | CO | 00 |
| —i | —1 | O | O | CD | CD |
| cri | O | UI | □ | UI | O |
Epitopi ne-specifici de tip (conservate) I WARPDYN
T ra
UI
Ό I— bj
0»
| ui | UI | xx | as |
| • | • | • | • |
| Ui | CO | ||
| o | eu | CO | xx |
| 0 | Ω | 0 | 0 |
| 73 | 73 | 73 | 73 |
| Xx | Xx | Xx | Xx |
| O | O | O | O |
| ru | eu 1 | eu | tu |
| 1 O | 1 O | l o | 1 o |
| L-J | ÎU | l·-» | o |
O
CJ » z cn ui ra ra
| o | o | as | |
| » | • | • | • |
| XX | cn | ru | |
| o | kO | 03 |
| 0 | Ω | n | a |
| ra ό ra tj | |||
| Xx | Xx | Xx | Xx |
| O | O | O | O |
| ru I | CU 1 | tu | tU | |
| 1 O | 1 O | 1 O | 1 O |
| CJ | cu | H* | o |
| *—s | |||
| tu | tu | μ* | |
| σ | ω |
| ra | ra | ra | ra |
| ra | ra | ra | > |
| ra | ra | ra | O |
| > | > | > | > |
| r* | t- | r | r |
| ra | ra | ra | ra |
| ra | > | M | < |
S S X x 3» > > > ra ra x> ra ra ra ra ra σ σ o σ ►<►<><►< z z z z ra ra ra < ra ra ra ra ra ra ra ra
W MM H cn cn
ra ra o
ra ra ra ra ω o o σ κ κ κ κ MO < M ra ra ra ra ra > ra ra r > α x O Cî O ii
ΓΠ cn o O
T5 Φ
Ό
Ξ
0><
cn » o < Φ r* Φ
CL Φ σ o 3 a n> ZJ
Φ a φ
.09 r-NS5 ELISA
| o | <jy | xj | xj | σ» | o | O | UI | xj | o • | o | o | xj | |
| GJ | o | GJ | σ\ | 03 | <J1 | UI | CD | GJ | 1-* | ui | tU | ||
| xj | <0 | co | σ» | CD | gj | O | CTi | xj | o | kO | CD |
| Ω | n | Ω | Ω | 0 | a | Ω | Ω | π | Ω | Ω | Ω | o | ||
| Ή | *U | 1 | TJ | rs | TJ | ΤΟ | 1 | TJ | Ό | T5 | 55 | |||
| Xx | Z | -£k | Xb | ζ | λ | |||||||||
| O | o | O | O | U) | o | o | O | Ο | tn | O | O | O | O | |
| CU | CU | cu | CU | un | cu | N> | ro | cu | cn | m | cu | CU | tu | N> |
| 1 | 1 | 1 | 1 | t71 | ! | 1 | 1 | 1 | cn | Ό | 1 | 1 | 1 | 1 |
| o | O | o | o | r | O | o | o | ο | r | o | o | o | o | |
| GJ | tu | w | o | >-« | GJ | M | k—4 | ο | t-4 | O | GJ | tu | h-· | o |
| -—' | x | ----s | z---- | ω | .—s. | >—X. | Cfl | Ό | S. | X | ||||
| ru | tu | h-4 | H4 | > | tu | N> | H4 | Η4 | > | tu | tu | »—» | ||
| σ | 2J | cr | CU | —. | σ | iu | σ | α» | (I) T3 | σ.α> | cr | tu | ||
| — | >-· | '—' | ^~·* | **** | Φ | *** | X' |
<
hH
O O
XD >
<
> Ω
G
Q.
O
| m | ~Ό | χ χ χ χ |
| χ χ χ > | ||
| χ χ χ ο | ||
| > > > > | ||
| Ρο | t- c- f f | |
| ω | χ χ X χ | |
| Ό | σ | τι > χ < |
| Φ | ||
| ·> > > > | ||
| -4» | X X 53 X | |
| O | τι χ τι Ό | |
| Q. | ο σ σ ο | |
| Φ | ||
| ζ ζ ζ ζ | ||
| X X X X | ||
| Ό | < X X X | |
| rrr r | ||
| χ < χ < | ||
| o | Μ X Ρ3 PJ | |
| <-3 (λ ω >4 | ||
| >-· | X X X 5 | |
| cr | X Zi X « | |
| *-* | χ χ σ zi | |
| x x | τι χ Ότι | X X X X |
| σ ο | * 0 σ σ σ | 0 σ σ σ |
| κ κ | ►<►<><►< | <<►<►<►< |
| < Ρ1 | * Μ Ο < Μ | mo < μ |
| χ τι | χ χ χ χ | X 55 53 X |
| X X | χ > χ χ | X > X X |
| 33 | *3333 | 3333 |
| X X | * r > χ χ | f > X X |
| 0 0 | Ω Ω Ω Ω | Ω Ω Ω Ω |
| Η· »-* | tu cu Μ Η* | |
| cr ο | cr ο> σ a» | |
ω φ o < Φ □ w· Φ
Q. Φ O Φ □ £X Φ □ e* Φ
CL Φ
O
| CD | CD | (0 | ω | CD | CD |
| 4L. | ω | ω | Γϋ | Γϋ | |
| σι | Ο | υι | Ο | υι | ο |
RO 115471 Bl
Exemplul 6. Test de inhibare
Testele de inhibare s-au realizat pentru a determina dacă peptidele ar 950 putea concura cu fiecare alta pentru reglare la anticorp. S-au sintetizat trei seturi de polipeptide scurte din regiunile corpului central ND4 și ND5 din diferite tipuri ale secvențelor HCV. Aceste polipeptide acoperă secvența regiunilor de la aminoacizii 1689-1695, 1606-1702 și 1711-1917. Analizele de inhibare s-au realizat prin adăugarea a 10 pg din polipeptidele de mai sus 955 la probă și incubare timp de o oră la temperatura de 37°C, după care s-au realizat analizele ELISA, așa cum s-a descris mai sus. După inhibare, s-a găsit a fi mai mult decât 50 % anticorp legat la polipeptidă și atunci s-a considerat acțiunea inhibitorie. Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelele 15 și 16 care urmează.
960 Exemplul 7. Tipizarea HCV a probei clinice
Epitropii specifici tipului sau specifici tipului de grup care au fost prezentați în tabelul 16 de mai sus s-au folosit în testul ELISA din exemplul 5 de realizare pentru a testa 13 probe clinice de la pacienți cu hepatita non-A, non-B (10 donatori, 3 transfuzii de la pacienți cronici non-A, non-B).
965 I Tabelul 17 care urmeazăj prezintă rezultatele acestor analize. Fiecare
C probă clinică s-a realizat pentru reactivitatea cu 12 peptide diferite | corespunzătoare regiunilor date (aa 67-84, 1689-1718 sau 2281-2313] reprezentând diferiți epitopi specifici de tip sau specifici tipului de grup. Fiecare probă prezintă un răspuns cu fiecare probă tipizată non-reactiv (NR), slab 970 reactiv (WR) sau reactivi (R). Aceste rezultate prevăd un genotip HCV pentru fiecare probă care corelează cu genotipul HCV determinat prin PCR, dat în coloana din partea dreaptă.
Claims (14)
- Revendicări1. Metodă pentru stabilirea unuia sau a mai multor tipuri de virus al hepatitei C, caracterizată prin aceea că cuprinde etapele: a] prelevarea unei probe biologice de la un individ suspectat de a fi infectat cu virusul hepatitei V; b) punerea în contact a probei cu un reactiv cuprinzând o combinație de epitopi tip-specifici ai virusului hepatitei C, în care cel puțin un epitop din combinație este din regiunea 4 nestructurală a virusului hepatitei C și în care, în mod suplimentar, contactarea se realizează în condiții care permit formarea primelor complexe epitop-anticorp; și c) testarea prezenței complexelor epitop-anticorp în probă pentru a determina dacă anticorpii din probă se leagă la primul reactiv.
- 2. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că cuprinde suplimentar etapele de: d) punere în contact a probei cu un al doilea reactiv, care cuprinde un al doilea epitop tip-specific al virusului hepatitei C, în care epitopul menționat este din regiunea centrală a virusului hepatitei C și în care, în mod suplimentar, contactarea se realizează în condiții care permit formarea unui al doilea complex epitop-anticorp; și e) testarea prezenței unui al doilea complex epitop-anticorp în probă pentru a determina dacă anticorpii din probă se leagă la al doilea reactiv.
- 3. Metodă, conform cu revendicarea 1 sau 2, caracterizată prin aceea că în etapa de testare, testarea se realizează printr-un test de competiție, un test de intercalare de tip sandwich, un test de imunofluorescență, un test de radioimunitate sau un test de imunoabsorbție cu enzimă legată.
- 4. Metodă conform cu oricare dintre revendicările 1 ... 3, caracterizată prin aceea că primul reactiv cuprinde un epitop tip-specific suplimentar, obținut din regiunea centrală a virusului hepatitei C sau din regiunea 5 nestructurală a virusului hepatitei C.
- 5. Metodă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că epitopul tipspecific suplimentar este localizat între resturile de aminoacizi 67 și 84 sau 2281 și 2313 ale virusului -1 al hepatitei C sau în regiuni omoloage ale altor tipuri de virus al hepatitei C.
- 6. Metodă pentru stabilirea unuia sau a mai multor tipuri de virus al hepatitei C, caracterizată prin aceea că cuprinde etapele de: a] prelevarea unei probe biologice de la un individ suspectat de a fi infectat cu un virus al hepatitei C; b] punerea în contact a probei cu un prim reactiv cuprinzând o combinație de anticorpi specifici pentru cel puțin doi epitopi-tip specifici ai virusului hepatitei C, în care cel puțin unul dintre anticorpii din combinație este specific pentru un epitop tip-specific din regiunea 4 nestructurală a virusului hepatitei C și în care, în mod suplimentar, contactarea se realizează în condiții care permit formarea primelor complexe epitopanticorp; și c) testarea prezenței complexelor epitop-anticorp în probă.
- 7. Metodă, conform reveneicării 6, caracterizată prin aceea că cuprinde suplimentar etapele de: d) punerea în contact a probei cu un al doilea reactiv cuprinzând un anticorp specific pentru un al doilea epitop tip-specific al virusului hepatitei C, în care cel de-al doilea epitop menționat este din regiunea centrală a virusului hepatitei C și în care în mod suplimentar contactarea se realizează în condiții care permit formarea unui al doilea complex epitop-anticorp; și e) testarea pentru prezența unui al doilea complex epitop-anticorp în probă.
- 8. Metodă, conform revendicării 6 sau 7, caracterizată prin aceea că, în etapa de testare, testarea se realizează printr-un test de competiție, un test de intercalare de tip sandwich, un test de imunofluorescență, un test de radioimunitate10451050105510601065107010751080RO 115471 Bl sau un test de imunoabsorbție cu enzima legată.
- 9. Metodă, conform revendicărilor 6 ... 8, caracterizată prin aceea că primul reactiv cuprinde un anticorp specific pentru un epitop tip-specific suplimentar obținut din regiunea centrală a virusului hepatitei C sau din regiunea 5 nestructurală a virusului hepatitei C.
- 10. Metodă, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că epitopul tipspecific suplimentar este localizat între resturile de aminoacizi 67 și 84 sau 2281 și 2313 ale virusului-1 al hepatitei C sau în regiuni omoloage ale altor tipuri de virus al hepatitei C.
- 11. Metodă, conform cu oricare dintre revendicările 1...3 caracterizată prin aceea că epitopul tip-specific din regiunea 4 nestructurală este localizat între resturile de aminoacizi 1689 și 1718 ale virusului-1 al hepatitei C sau în regiuni omoloage ale altor tipuri de virus al hepatitei C.
- 12. Metodă, conform cu oricare dintre revendicările 1 ... 3, caracterizată prin aceea că primul reactiv este legat de un suport solid de nitroceluloză.
- 13. Metodă, conform revendicării 12, caracterizată prin aceea că primul reactiv cuprinde cel puțin un epitop tip-specific din regiunea 4 nestructurală, din regiunea 5 nestructurală și din regiunea centrală a virusului hepatitei C.
- 14. Metodă, conform cu revendicările 1 ... 3, caracterizată prin aceea că primul reactiv cuprinde o multitudine de epitopi tip-specifici din regiunea 4 nestructurală a virusului hepatitei C.Președintele comisiei de invenții: biochim. Cretu Adina
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6040093A | 1993-05-10 | 1993-05-10 | |
| PCT/US1994/005151 WO1994027153A1 (en) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Methods of typing hepatitis c virus and reagents for use therein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO115471B1 true RO115471B1 (ro) | 2000-02-28 |
Family
ID=22029220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO95-01952A RO115471B1 (ro) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Metoda pentru stabilirea unuia sau a mai multor tipuri de virus al hepatitei c |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6054264A (ro) |
| EP (1) | EP0698216B2 (ro) |
| JP (1) | JP3645904B2 (ro) |
| KR (1) | KR100330278B1 (ro) |
| CN (1) | CN1129795C (ro) |
| AT (1) | ATE281647T1 (ro) |
| CZ (1) | CZ294629B6 (ro) |
| DE (1) | DE69434117T3 (ro) |
| DK (1) | DK0698216T4 (ro) |
| ES (1) | ES2232815T5 (ro) |
| GE (1) | GEP20012421B (ro) |
| HU (1) | HU224513B1 (ro) |
| PL (3) | PL175338B1 (ro) |
| PT (1) | PT698216E (ro) |
| RO (1) | RO115471B1 (ro) |
| RU (1) | RU2158928C2 (ro) |
| SK (1) | SK282543B6 (ro) |
| UA (1) | UA46707C2 (ro) |
| WO (1) | WO1994027153A1 (ro) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE610436T1 (de) * | 1991-11-21 | 1995-08-03 | Common Services Agency | Detektion des Hepatis-C Virus. |
| US7255997B1 (en) * | 1993-04-27 | 2007-08-14 | N.V. Innogenetics S.A. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
| CA2139100C (en) | 1993-04-27 | 2009-06-23 | Geert Maertens | New sequences of hepatitis c virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
| DK0698216T4 (da) * | 1993-05-10 | 2009-06-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Fremgangsmåder til typebestemmelse af hepatitis-C-virus og anvendte reagenser heri |
| US7070790B1 (en) | 1993-06-29 | 2006-07-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 and core genes of isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
| US5882852A (en) * | 1993-06-29 | 1999-03-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Hepatitic C virus (HCV) core gene nucleotide sequences and related methods of detecting major and minor genotypes of HCV isolates |
| DE19504302A1 (de) * | 1995-02-09 | 1996-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Methode zur serologischen Typisierung mittels typspezifischer Antigene |
| WO1996034013A1 (en) * | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Srl, Inc. | Antigen peptide compound and immunoassay method |
| US6514731B1 (en) | 1996-05-24 | 2003-02-04 | Chiron Corporation | Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
| RU2146825C1 (ru) * | 1998-05-07 | 2000-03-20 | Харламова Флора Семеновна | Способ диагностики внепеченочной персистенции вирусных антигенов в тканях у детей, больных хроническим гепатитом в, или дельта, или с |
| US7052830B1 (en) | 1998-06-09 | 2006-05-30 | Branch Andrea D | Hepatitis C virus peptides and uses thereof |
| WO2000031130A1 (en) * | 1998-11-20 | 2000-06-02 | Bio Merieux | Synthetic polypeptides corresponding to the hepatitis c virus (hcv) and applications |
| US6995299B2 (en) * | 1999-11-02 | 2006-02-07 | University Of Connecticut | Propagation of human hepatocytes in non-human animals |
| US8124348B2 (en) | 2000-08-23 | 2012-02-28 | Jonathan Zmuda | Oral fluid rapid assay for hepatitis C virus (HCV) antibodies using non-antibody labeling of IgA molecules recognizing HCV peptide epitopes |
| US20030152942A1 (en) * | 2001-05-09 | 2003-08-14 | Lance Fors | Nucleic acid detection in pooled samples |
| US7196183B2 (en) * | 2001-08-31 | 2007-03-27 | Innogenetics N.V. | Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent |
| CA2481502A1 (en) * | 2002-04-04 | 2003-10-16 | Achillion Pharmaceuticals, Inc. | Hcv antiviral and cytotoxicity drug screening assay |
| WO2005010035A2 (en) * | 2003-07-22 | 2005-02-03 | Branch Andrea D | Alternate reading frame polypeptides derived from hepatitis c and methods of their use |
| CN1852915A (zh) * | 2003-07-25 | 2006-10-25 | 艾登尼科斯（开曼）有限公司 | 治疗包括丙型肝炎的黄病毒科病毒所致疾病的嘌呤核苷类似物 |
| ES2596753T3 (es) * | 2003-08-29 | 2017-01-11 | Fujirebio Europe N.V. | Nuevo clado del virus de la hepatitis C y secuencias prototipo del mismo |
| RU2269134C2 (ru) * | 2003-11-27 | 2006-01-27 | Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера | Способ прогнозирования исходов острого вирусного гепатита с |
| CN1977050B (zh) | 2004-01-07 | 2012-09-05 | 第三次浪潮技术公司 | 丙型肝炎病毒基因型的确定 |
| JP4533656B2 (ja) * | 2004-04-28 | 2010-09-01 | アボットジャパン株式会社 | 特異性の改良されたｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗体測定法 |
| US7858752B2 (en) * | 2006-12-05 | 2010-12-28 | Abbott Laboratories | Recombinant antibodies against hepatitis C virus and methods of obtaining and using same |
| FR2984328B1 (fr) | 2011-12-20 | 2016-12-30 | Bio-Rad Innovations | Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c |
| CN110261616B (zh) * | 2019-04-30 | 2021-07-20 | 广东菲鹏生物有限公司 | 一种丙型肝炎病毒检测试剂盒 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4868105A (en) * | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| US5124246A (en) * | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| EP0318216B2 (en) * | 1987-11-18 | 2001-08-29 | Chiron Corporation | NANBV diagnostics |
| US5350671A (en) * | 1987-11-18 | 1994-09-27 | Chiron Corporation | HCV immunoassays employing C domain antigens |
| KR0185373B1 (ko) * | 1989-03-17 | 1999-05-01 | 로버트 피. 블랙버언 | Hcv 폴리단백질에서 유래되는 hcv 아미노산 서열 부분을 포함하는 폴리펩티드 및 그 사용 |
| US5106726A (en) * | 1990-02-16 | 1992-04-21 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV |
| WO1991015771A1 (en) * | 1990-04-04 | 1991-10-17 | Chiron Corporation | Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use in immunoassays for anti-hcv antibodies |
| US6190864B1 (en) * | 1991-05-08 | 2001-02-20 | Chiron Corporation | HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics |
| HU227547B1 (en) * | 1991-06-24 | 2011-08-29 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Hepatitis c virus (hcv) polypeptides |
| PT787807E (pt) * | 1991-08-27 | 2003-08-29 | Hoffmann La Roche | Iniciadores e sondas para a deteccao da hepatite c |
| EP0532258A2 (en) * | 1991-09-09 | 1993-03-17 | Immuno Japan Inc. | Oligonucleotides and determination system of HCV genotypes |
| CA2119013A1 (en) * | 1991-09-16 | 1993-04-01 | Richard R. Lesniewski | Hepatitis c assay |
| DE610436T1 (de) * | 1991-11-21 | 1995-08-03 | Common Services Agency | Detektion des Hepatis-C Virus. |
| DE69334323D1 (de) | 1992-07-16 | 2010-05-06 | Advanced Life Science Inst Inc | Antigenetische Peptide für die Gruppierung des Hepatitis C Virus sowie Reagenzien und Verfahren dafür |
| AU680450B2 (en) * | 1992-11-06 | 1997-07-31 | Mimotopes Pty Ltd | Support for the synthesis of modular polymers |
| ATE281526T1 (de) | 1993-05-05 | 2004-11-15 | Common Services Agency | Hepatitis-c virus typ 4,5 und 6 |
| DK0698216T4 (da) * | 1993-05-10 | 2009-06-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Fremgangsmåder til typebestemmelse af hepatitis-C-virus og anvendte reagenser heri |
| US5885771A (en) * | 1993-10-29 | 1999-03-23 | Srl, Inc. | Antigenic peptide compound and immunoassay |
-
1994
- 1994-05-09 DK DK94916061T patent/DK0698216T4/da active
- 1994-05-09 AT AT94916061T patent/ATE281647T1/de active
- 1994-05-09 UA UA95114832A patent/UA46707C2/uk unknown
- 1994-05-09 PL PL94323368A patent/PL175338B1/pl unknown
- 1994-05-09 RO RO95-01952A patent/RO115471B1/ro unknown
- 1994-05-09 JP JP52562794A patent/JP3645904B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 PL PL94323367A patent/PL175360B1/pl unknown
- 1994-05-09 GE GEAP19942944A patent/GEP20012421B/en unknown
- 1994-05-09 CZ CZ19952929A patent/CZ294629B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 PL PL94311653A patent/PL175342B1/pl unknown
- 1994-05-09 DE DE69434117T patent/DE69434117T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 WO PCT/US1994/005151 patent/WO1994027153A1/en not_active Ceased
- 1994-05-09 PT PT94916061T patent/PT698216E/pt unknown
- 1994-05-09 EP EP94916061A patent/EP0698216B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 CN CN94192560A patent/CN1129795C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 RU RU95122701/13A patent/RU2158928C2/ru active
- 1994-05-09 KR KR1019950704993A patent/KR100330278B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 SK SK1359-95A patent/SK282543B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 HU HU9503219A patent/HU224513B1/hu active IP Right Grant
- 1994-05-09 ES ES94916061T patent/ES2232815T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-09 US US08/336,553 patent/US6054264A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-05-11 US US08/439,157 patent/US6416944B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-11-09 US US09/437,895 patent/US6416946B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RO115471B1 (ro) | Metoda pentru stabilirea unuia sau a mai multor tipuri de virus al hepatitei c | |
| RU2148587C1 (ru) | Полипептид и способ его получения, реагент для иммуноанализа, способ определения присутствия антител и способ индукции иммунного ответа | |
| Bhattacherjee et al. | Use of NS-4 peptides to identify type-specific antibody to hepatitis C virus genotypes 1, 2, 3, 4, 5 and 6 | |
| EP0610436B1 (en) | Hepatitis-c virus testing | |
| JPH04504715A (ja) | Ｎａｎｂｖの診断用薬 | |
| ES2231773T3 (es) | Virus de la hepatitis c de tipo 4, 5 y 6. | |
| CZ20003819A3 (cs) | Imunodiagnostický test pouľívající redukující činidla | |
| PT1064309E (pt) | Epítopos em proteínas virais de envelope e anticorpos específicos dirigidos contra estes epítopos: utilização para a detecção de antigenes virais do hcv em tecido do hospedeiro | |
| EP1328811A2 (en) | Hcv mosaic antigen composition | |
| Ferroni et al. | Identification of four epitopes in hepatitis C virus core protein | |
| CN102659922B (zh) | 来源于c型肝炎病毒的肽 | |
| JPH0940694A (ja) | 肝炎ｇｂウイルスの合成ペプチド及びその使用 | |
| Chang et al. | Antigenic heterogeneity of the hepatitis C virus NS4 protein as modeled with synthetic peptides | |
| Chang et al. | Artificial NS4 mosaic antigen of hepatitis C virus | |
| Takao et al. | Antibody reactive to a hepatitis C virus (HCV)‐derived peptide capable of inducing HLA‐A2 restricted cytotoxic T lymphocytes is detectable in a majority of HCV‐infected individuals without HLA‐A2 restriction | |
| US20060234214A1 (en) | Methods of detecting hepatitis C virus | |
| WO1996013616A1 (en) | Peptides for detection of hepatitis c antibodies | |
| Chien et al. | Use of recombinant HCV antigen in the serodiagnosis of hepatitis C virus infection: Significant improvement in HCV antibody detection as compared with the first generation HCV C100‐3 ELISA and the synthetic peptide EIA tests | |
| US5716779A (en) | Diagnostic antigen and a method of in vitro diagnosing an active infection caused by hepatitis C virus | |
| Wong | Humoral Responses and Clinical Outcome in Chronic Hepatitis C Virus Infection | |
| WO1996034013A1 (en) | Antigen peptide compound and immunoassay method |