CZ20003819A3 - Imunodiagnostický test pouľívající redukující činidla - Google Patents
Imunodiagnostický test pouľívající redukující činidla Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20003819A3 CZ20003819A3 CZ20003819A CZ20003819A CZ20003819A3 CZ 20003819 A3 CZ20003819 A3 CZ 20003819A3 CZ 20003819 A CZ20003819 A CZ 20003819A CZ 20003819 A CZ20003819 A CZ 20003819A CZ 20003819 A3 CZ20003819 A3 CZ 20003819A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hcv
- reducing agent
- protein
- polypeptide
- solid phase
- Prior art date
Links
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 title claims description 59
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 14
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 5
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract 2
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 claims description 83
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 59
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 59
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 59
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 54
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 51
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 48
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 47
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 34
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 21
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 21
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 20
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 20
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 101800001838 Serine protease/helicase NS3 Proteins 0.000 claims description 14
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 8
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000006326 desulfonation Effects 0.000 claims description 5
- 238000005869 desulfonation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 claims 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 144
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 101100289061 Drosophila melanogaster lili gene Proteins 0.000 description 38
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 28
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 24
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 20
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 20
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 12
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 6
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 6
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 6
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 6
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 3
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- SJMLATCMQNTURW-UHFFFAOYSA-N 2-sulfanyl-n'-(2-sulfanylacetyl)acetohydrazide Chemical compound SCC(=O)NNC(=O)CS SJMLATCMQNTURW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 2
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 2
- 101800001014 Non-structural protein 5A Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 150000003958 selenols Chemical class 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 2
- 150000003558 thiocarbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 2
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- TXUICONDJPYNPY-UHFFFAOYSA-N (1,10,13-trimethyl-3-oxo-4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl) heptanoate Chemical compound C1CC2CC(=O)C=C(C)C2(C)C2C1C1CCC(OC(=O)CCCCCC)C1(C)CC2 TXUICONDJPYNPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 101150082072 14 gene Proteins 0.000 description 1
- YWXCBLUCVBSYNJ-UHFFFAOYSA-N 2-(2-sulfanylethylsulfonyl)ethanethiol Chemical compound SCCS(=O)(=O)CCS YWXCBLUCVBSYNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150106774 9 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710118188 DNA-binding protein HU-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000017278 Glutaredoxin Human genes 0.000 description 1
- 108050005205 Glutaredoxin Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 241000288105 Grus Species 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010019773 Hepatitis G Diseases 0.000 description 1
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100046526 Mus musculus Tnf gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101150038760 Ns3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710199667 Nuclear export protein Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 101800001554 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000311088 Schwanniomyces Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000532784 Thelia <leafhopper> Species 0.000 description 1
- -1 Thiol compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910021626 Tin(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000235017 Zygosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012018 catalyst precursor Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 238000002809 confirmatory assay Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- VLYUGYAKYZETRF-UHFFFAOYSA-N dihydrolipoamide Chemical compound NC(=O)CCCCC(S)CCS VLYUGYAKYZETRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XIMIGUBYDJDCKI-UHFFFAOYSA-N diselenium Chemical compound [Se]=[Se] XIMIGUBYDJDCKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 150000004662 dithiols Chemical class 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- DVEKCXOJTLDBFE-UHFFFAOYSA-N n-dodecyl-n,n-dimethylglycinate Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC([O-])=O DVEKCXOJTLDBFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- NEOZOXKVMDBOSG-UHFFFAOYSA-N propan-2-yl 16-methylheptadecanoate Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(C)C NEOZOXKVMDBOSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L sodium dithionite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])=O JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 235000011150 stannous chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001119 stannous chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003871 sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L tetrathionate(2-) Chemical compound [O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
- C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
(5 7) Anotace:
Vynález se vztahuje k diagnóze a léčení infekce HCV. Zabývá se provádčním a přípravou imunotestů s antigenem na pevné fázi za přítomnosti redukčního činidla, které se přidává k pevné fázi během procesu potahování, blokování a/nebo fixace daného antigenu na pevnou fázi nebo během předběžné úpravy pevné fáze. Dále vynález popisuje přípravu expresních plazmidů, produkci proteinů v buňkách E.coli a purifikaci rekombinantně exprimovaného proteinu obsahující cystein, která sestává z kroků: sulfonace lyzátu rekombinantních hostitelských buněk v přítomnosti guanidinchloridu, úpravy detergentem s obojetným ionem a následné putifikace sulfonovaných rekombinantních proteinů s následným odstraněním detergentu.
α · a • * · * * · * • · · · · · «· ·· ·4 a·· ?F 3jm - 3M
-glopšonc činidla é ^munodiagnostick^, test|^ používající redukující
Oblast techniky
Předkládaný vynález se vztahuje k oblasti diagnózy a léčení w infekce HCV. Konkrétně se předkládaný vynález vztahuje k HCV NS3
*. helikáze (HCV NS3 helicase) a jejímu použití. Předkládaný vynález se také vztahuje ke zlepšeným imunodiagnostickým testům.
Dosavadní stav techniky
Virus hepatitidy C (Hepatitis C Virus, HCV) tvoří rod uvnitř Flaviviridae s nejbližší homologií k virům hepatitid G a GB a k Pestivirům (Pestiviruses). Genom s kódující RNA (positive-stranded RNA genom) kóduje nejméně 9 proteinů. Core, El a E2 tvoří strukturní proteiny. NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A a NS5B jsou nestrukturní (nonstructural, NS) proteiny. Izoláty HCV vykazují vysokou úroveň sekvenční heterogenity, která umožňuje klasifikaci do minimálně 11 typů a 90 subtypů (Maertens and Stuyver, 1977) . HCV infekce lidských jater je často klinicky benigní, s mírnou žloutenkou v akutní fázi.
V některých případech akutní mírné hepatitdy C (acute resolving hepatitis C) onemocnění může dokonce probíhat nepozorovaně. Ve většině případů (> 70%) vede ale infekce HCV k chronicky
R přetrvávající nebo aktivní infekci, často s komplikacemi jaterní cirhózy a auto-imunitních potíží. Po 20 až 35 letech se může objevit * hepatocelulární rakovina (Saito et al., 1990), někdy dokonce bez přechodné fáze cirhózy. V současnosti není k dispozici žádná prevence a léčení interferonem alfa (IFN-a) vede pouze v 4 - 36% léčených případů k dlouhodobému vyřešení v závislosti na genotypu HCV (Maertens and Stuyver, 1997).
Protože nejsou v současné době k dispozici metody pro účinnou kultivaci HCV a protože v pacientech koluje jenom nepatrné množství HCV antigenů, nemůže se provádět rutinně přímý průkaz HCV a nepřímý • « · t
I · 4 ·· ·· důkaz je možný pouze s použitím obtížné amplifikační techniky HCV RNA. Na rozdíl od mnoha ostatních virálních infekcí setrvávají částice HCV v krvi, játrech a lymfocytech, přestože existuje buněčná a humorální imunitní odpověď na většinu proteinů HCV. HCV protilátky mohou být vhodně detekovány ELISA technikou, která umožňuje testování mnoha vzorků v krevních bankách a klinických laboratořích. Ve většině zemí se vyžaduje a je nyní nařízené doplňkové testování protilátek. Odliší se tak skutečná HCV reaktivita od falešné reaktivity, která může být způsobena nespecifickou vazbou sérových nebo plazmových imunoglobulínů nebo antí-idiotypových (antiídiotypic) komponentů k potahovacím nebo blokovacím činidlům, nebo ke kontaminantům přítomným v preparátu HCV antigenu, nebo dokonce k fúzním částem nebo nespecifickým oblastem vlastních rekombinantních antigenů (McFarlane et al., 1990). Pro monitorování chronického onemocnění HCV (zejména během léčení) byla v poslední době zavedena detekce HCV RNA pomocí PCR nebo technik rozvětvené DNA (branched DNA, bDNA). Detekce HCV RNA je někdy překvapivě používána pro potvrzení testů přítomnosti HCV Ab, přestože pouze asi 70-94% vzorků z opakovaně HCV Ab pozitivních pacientů je pozitivní při „nested PCR (Marin et al., 1994). Z pozitivních dárců krve, kteří mají obvykle mírnější formu onemocnění a nízké hladiny HCV RNA, je pouze asi 40ΐ pozitivních při „nested PCR (Waumans et al, 1993; Stuyver et al., 1996). Proužkové testy (strip-based assays) tedy poskytují jedinou spolehlivou alternativu pro potvrzení HCV Ab. Dokonce i v případě nejasných výsledků v ověřovacím testu se doporučuje spíše serologické sledování než detekce HCV RNA (Di Bisceglie et al., 1998). Protože přírodní antigeny HCV nejsou k dispozici v dostatečném množství, používají takovéto konfirmační testy syntetické peptidy a/nebo rekombinantní fragmenty proteinů HCV. Jedním z kritických problémů při potvrzení protilátek představuje reaktivita NS3 proteinu (Zaaijer et al., 1994). NS3 protilátky se často objevují jako první při sérokonverzních sériích a reaktivita N53 proteinu se zdá být odlišná u různých komerčních testů dostupných v současnosti.
Imunogenetics uvedla koncept proužkové technologie (strip technology), kde je obvykle aplikována kombinace syntetických peptidů a rekombinantních proteinů v samostatných , uspořádaných a • φφφ • « · φ « · φ φ φ φφφφ φ φφ ·· ·· ··· snadno rozpoznatelných linkách. Testy INNO-LIA HIV Ab se ukázaly lepší než rutinně používané western bloty (Pollet et al., 1990).
Line Immuno Assay umožňuje multiparametrové testování a tak umožňuje zahrnout mezní (cutoff) a jiné systémy hodnocení, zahrnutí kontroly přidání vzorku a také testování falešné raktivity k ne-HCV proteinům, použitých jako nosič nebo fúzní partner nezbytný pro některé antigeny v ELISA testu. Forma testu umožňuje v zásadě kombinovat antigeny různých etiologíckých látek nebo fenotypově souvisejících podmínek v jednom testu.
INNO-LIA HCV Ab III je Line Immuno Assay třetí generace, který obsahuje HCV antigeny odvozené od Core oblasti, E2 hypervariabilní oblasti (HVR), oblasti NS3 helikázy a oblasti NS4A, NS4B a NS5A. U třetí generace testů dává vysoce purifikovaný rekomobinantní subtyp proteinu lb NS3 a peptidy E2 vynikající citlivost při zachování specifity charakteristické pro testy založené na peptidech (Peeters et al., 1993). Pravděpodobně jednou z nejdúležitějších vlastností tohoto testu je jeho nebývalá shoda s HCV RNA pozitivitou (Claeys et al., 1992; De Beenhouwer et al., 1992).
Antigeny jsou naneseny v 6 oddělených linkách na nylonovém proužku s plastikovou výztuhou. Na každém proužku jsou navíc čtyři kontrolní linky: anti-streptavidin, 3+ pozitivní kontrola (protilidský Ig), 1+ pozitivní kontrola (lidský IgG) a ± mezní linka (cutoff line) (lidské IgG). Zředěný testovací vzorek se inkubuje ve žlábku společně s LIA III proužkem. Jsou-li ve vzorku HCV protilátky, dojde k jejich navázání k HCV antigenům v linkách na proužku. Pak se přidá konjugát afinitně purifikovaných, s alkalickou fosfatázou konjugovaných kozích proti-lidských IgG (H+L), které reagují se specifickými komplexy HCV antigen/protilátka (jestliže došlo k jejich vytvoření). Inkubací s enzymovým substrátem dojde ke vzniku kaštanově hnědého zabarvení, jehož intenzita odpovídá množství HCV specifických protilátek zachycených ze vzorku na kterékoliv dané lince. Vývoj barevné reakce se zastaví kyselinou sírovou. Jestliže nejsou přítomné HCV specifické protilátky, konjugát se naváže pouze na kontrolní linky +, 1+ a 3+. Jestliže se omylem nepřidá vzorek, zabarví se pouze kontrolní linky ± a 1+.
• 4·· ·
• 44 4 · · 4 4 ·
44 4« 44*
Definice
Následující definice slouží pro ilustraci různých termínů a výrazů používaných v předkládaném vynálezu.
Termín „HCV NS3 protein se vztahuje k polypeptidu nebo jeho analogu (např. mimotopy - mimotopes) obsahujícímu aminokyselinovou sekvenci (a/nebo aminokyselinová analoga) definující alespoň jeden HCV epítop buď HCV NS3 proteázy nebo helikázy.
Termín „obalový protein hepatítidy viru C se vztahuje k polypeptidu nebo jeho analogu (např. mimotopy) obsahujícímu aminokyselinovu sekvenci (a/nebo aminokyselinová analoga) definující alespoň jeden HCV epitop buď El nebo E2 oblasti (viz WO 96/04385, jehož obsah je zde zahrnut odkazem).
Také by mělo být jasné, že izoláty (biologické vzorky) použité v části příklady předkládaného vynálezu nebyly zamýšleny jako omezení oblasti vynálezu a že jakýkoliv izolát náležející k typu 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 nebo jakýkoliv nový genotyp HCV je vhodným zdrojem HCV sekvencí pro upotřebení předkládaného vynálezu.
HCV antigeny použité v předkládaném vynálezu můžou být virové proteiny plné délky, nebo jejich varianty o téměř plné délce nebo jejich funkční fragmenty (např. fragmenty, kterým nechybí sekvence nutné pro tvorbu nebo uchování epitopu). Dále můžou HCV antigeny předkládaného vynálezu také zahrnovat jiné sekvence, které neblokují nebo nebrání tvorbě kterýchkoliv zájmových konformačních epitopů. Přítomnost nebo nepřítomnost konformačních epitopů tak může být snadno určena prověřením daného antigenu protilátkou (polyklonální sérum nebo monoklonální protilátka) a porovnáním jejich aktivity s antigenem v denaturovaném stavu, kdy zůstanou zachovány pouze lineární epitopy (jestli se vůbec některé epitopy zachovají). Když se při takovémto prověřování používají nejprve polyklonální protilátky, může být výhodné adsorbovat polyklonální sérum nejdříve s denaturovaným antigenem a zjistit, jestli udrží protilátky proti antigenu, který zkoumáme.
Termínem „fúzní polypeptid se myslí polypeptid, u kterého je antigen (nebo antigeny), zejména HCV antigen (nebo antigeny) částí jednoho souvislého řetězce aminokyselin, který se neobjevuje • *00 • 0 00·· · · ·
0000 0 00 00 00 000 v přírodě. Antigeny HCV můžou být spojené přímo jeden k druhému peptidovými vazbami, nebo mohou být oddělené aminokyselinovu sekvencí. Fúzní polypeptid také může obsahovat aminokyselinové sekvence exogenní k HCV.
Výraz „pevná fáze nebo „pevný nosič znamená pevný povrch, ke kterému se kovalentně nebo nekovalentně (například hydrofobní adsorpcí) váží jednotlivé HCV antigeny nebo fúzní polypeptidy obsahující HCV antigeny. Příkladem pevných povrchů můžou být mikrotitrační destičky, membránové proužky jako třeba nylonové nebo nitrocelulózové proužky a silikonové čipy.
Termínem „biologický vzorek se myslí tekutina nebo pletivo savčího jedince (např. antropoid nebo člověk), které běžně obsahují protilátky produkované individuem, zejména protilátky proti HCV. Tekutina nebo pletivo můžou obsahovat také HCV antigeny. Takovéto složky jsou odborníkům známé a patří mezi ně mimo jiné krev, plasma, sérum, moč, míšní mok, tkáňový mok, respirační, střevní nebo močopohlavní výměšky, slzy, sliny, mléko, bílé krvinky a myelomy. Tělní složky zahrnují biologické tekutiny. Termín „biologické tekutiny se vztahuje k tekutinám získaným z organismu. Některé biologické tekutiny se používají jako zdroj jiných produktů, např. faktorů srážení (např. Faktor VIII), sérového albuminu, růstového hormonu atp. V takovém případě je důležité, aby zdroj biologických tekutin byl bez virových kontaminant, jakým může být například HCV.
Termín „imunologicky reaktivní” znamená, že daný antigen bude reagovat specificky s protilátkami proti HCV přítomnými v tělních složkách z HCV infikovaného jedince nebo imunizovaného jedince.
Výrazem „imunitní komplex se myslí struktura vytvořená při navázání protilátky k epitopů nebo antigenu.
Výrazy El a E2, které se zde používají, jsou plně vysvětlené ve WO 96/04385, který je v tomto popisu obsažen odkazem.
Výraz „purifikovaný se zde používá pro směs, kde požadovaný protein tvoří alespoň 35% z celkových proteinů ve směsi. Lepší je, když daný protein tvoří nejméně 40% ve směsi, nebo ještě lépe 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% a nebo vůbec nejlépe když tvoří nejméně 95% ve směsi všech proteinů. Směs může obsahovat i jiné složky, např. glycidy, sole, lipidy, rozpouštědla apod. bez ovlivnění stanovení • 9· 9 • 9 9 9 * 9 9 9 9 ···« · ·· 99 99 99« procenta čistoty zde uvedeného. „Izolovaným HCV proteinem se mysli směs s HCV proteinem nejméně z 35% čistým.
Výraz „podstatně purifikované proteiny (essentially purified proteíns) se používá pro tak purifikované proteiny, které se můžou použít v in vitro diagnostických metodách a jako terapeutická sloučenina. Tyto proteiny jsou značně zbavené buněčných proteinů nebo DNA, proteinů vektora nebo DNA vektora, nebo jiných HCV viráiních složek. Tyto proteiny jsou obvykle purifikovány do značné homogenity (obvykle jsou z 80% čisté, lépe z 85%, 90%, 95%, 97%,
98%, 99%, 99,5% a vůbec nejlepší je, když jsou kontaminující proteiny nedetekovateiné konvenčními metodami, jako například SDSPAGE elektroforézou při barvení stříbrem.
Termín „rekombinantě exprimované používaný v kontextu předkládaného vynálezu se vztahuje ke skutečností, že proteiny předkládaného vynálezu jsou produkovány metodami rekombinantní exprese v prokaryotech, nebo nižších či vyšších eukaryotech, jak je podrobně diskutováno dále.
Výraz „nižší eukaryoty se používá pro hostitelské buňky jako například kvasinky, houby atd. Nižší eukaryoty jsou většinou (ale ne nezbytně) jednobuněčné. Mezi preferované eukaryoty patří kvasinky, zejména druhy Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Klyvercmyces, Pichia (např. Píchla pastoris), Hansunela (např. ffansunela polymorpha) , Yarowia, Schwanniomyces, Zygosaccharomyces a podobně. Nejpoužívanějšími kvasinkovými hostiteli jsou Saccharomyces cerevisiae, S. carlbergensis a K. lactis.
Výraz „prokaryota se vztahuje k hostitelům jako E. coli, Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis nebo Streptomyces. Také tito hostitelé jsou uvažováni v předkládaném vynálezu.
Výraz „vyšší eukaryota se vztahuje k hostitelským buňkám odvozeným z vyšších zvířat, jako jsou savci, plazi, hmyz atd.
V současnosti preferované vyšší eukaryotní hostitelské buňky jsou odvozené od křečků (Chinese hamster) (např. CHO), opic (např. COS nebo Věro buňky), ledvin mláďat křečků (baby hamster kidney - BHK), prasečích ledvin (PK15), buněk 13 z králičích ledvin (RK13), buněčné linie lidských osteosarkomů 143 B, lidská buněčné linie HeLa a lidské nádorové jaterní buněčné linie jako Hep G2 a hmyzí buněčné « · * « ** · · * » V «···«««· · • 9 ······ ···« · ·· ·· ·· ·♦· linie (např. Spodoptera frugiperda] . Hostitelské buňky můžou být ve formě suspenze, kultur pěstovaných v baňkách, tkáňových kultur, orgánových kultur atp. Hostitelké buňky můžou také být z transgennich zvířat.
Termín „polypeptid se vztahuje k aminokyselinovému polymeru bez udání určité délky produktu; polypeptidem se tak rozumí peptid, olígopeptid a protein. Tento termín se také nevztahuje k a nevylučuje post-expresní modifikace polypeptidu, například glykosylaci, acetylaci, fosforylaci a tak podobně. Definice zahrnuje například polypeptidy obsahující jeden nebo více analogů aminokyselin (včetně například normálně se nevyskytujících aminokyselin, PNA atp.), polypeptidy se substituovanými vazbami a dalšími modifikacemi, které jsou známé odborníkům a které se vyskytují přírodně i takové, které se přírodně nevyskytují.
Výraz „rekombinantní polynukleotid nebo nukleová kyselina přináleží genomovému polynukleotidu nebo nukleové kyselině genomového, cDNA, polosyntetického nebo syntetického původu, které (podle původu nebo úprav): (1) nejsou spojení s žádným nebo jenom částí polynukleotidu, se kterým jsou spojeni přírodně, (2) jsou spojeni s jiným polynukleotidem než se kterým jsou spojeni přírodně (3) nevyskytují se v přírodě.
Termíny „rekombinantní hostitelské buňky, „hostitelské buňky, „buňky, „buněčné linie”, „buněčné kultury” a ostatní takovéto termíny, označující mikroorganismy nebo vyšší eukaryotní buněčné linie pěstované jako jednobuněčné jednotky, se vztahují k buňkám, které můžou být nebo byly použity jako příjemci pro rekombinantní vektory nebo jiné přenášené polynukleotidy a zahrnují potomstvo originální buňky, která byla transformována. Je zřejmé, že potomstvo jedné rodičovské buňky nemusí být nutně zcela identické morfologicky, nebo co se týče genomové nebo celkové DNA jako originální rodič, díky přirozeným, náhodným nebo úmyslným mutacím.
Termín „replikon se používá pro jakýkoliv genetický element, např. plazmid, chromozom, virus, kosmid atd., který se chová jako autonomní jednotka polynukleotidu replikujících se uvnitř buňky, tj. je schopný replikace, kterou sám řídi.
„Vektor je replikon, který dále obsahuje sekvence zajišťující replikaci a/nebo expresi požadovaného otevřeného čtecího rámce.
• · «ta·· · · φ • · ····♦··« · • · ······· »··· · ·· ·· ·· »·· „Řidiči sekvence se vztahuje k polynukleotidovým sekvencm, které jsou nezbytné pro expresi kódující sekvence, ke které jsou přiligovány. Povaha takovýchto řídících sekvencí se liší v závislosti na hostitelském organismu; v prokaryotech takovéto řídící sekvence obsahují zpravidla promotor, místo, kde se vážou ribozómy a terminátory; u eukaryotů obecně takovéto řídící sekvence obsahují promotor a můžou obsahovat zesilovače. Výraz „řídící sekvence zahrnuje alespoň všechny komponenty, jejichž přítomnost je nutná pro expresi a může také zahrnovat další komponenty, jejíchž přítomnost je výhodná, například úvodní sekvence, které řídí sekreci.
Termínem „promotor se označuje nukleotidová sekvence, která se skládá z konsensuálních sekvencí, které umožňují navázání RNA polymerázy na DNA templát takovým způsobem, že se iniciuje mRNA produkce z běžného počátečnho místa transkripce pro přilehlý strukturní gen.
Výraz „operačně připojený'' se vztahuje k takovému postavení vedle sebe, kdy komponenty takto označené jsou ve vztahu umožňujícím jim jejich fungování zamýšleným způsobem. Řídící sekvence „operačně připojená ke kódující sekvenci je přiligována takovým způsobem, že za podmínek vhodných pro řídící sekvenci se dosáhne exprese kódující sekvence.
„Otevřený čtecí rámec” (open reading frame - ORF) je oblast polynukleotidové sekvence, která kóduje polypeptid a neobsahuje stop kodón ve vybraném čtecím rámci; tato oblast může reprezentovat část kódující sekvence nebo celkovou kódující sekvenci.
„Kódující sekvence je polynukleotidové sekvence, která je transkribovaná do mRNA a/nebo translatovaná do polypeptidu, je-li pod řízením odpovídajících regulačních sekvencí. Okraje kódující sekvence jsou určeny kodónem startujícím translaci na 5' -konci a kodónem zastavujícím translaci na 3' -konci. Kódující sekvence může zahrnovat kromě jiného mRNA, virovou RNA, DNA (včetně cDNA) a rekombinantní polynukleotidové sekvence.
Používané termíny „epitop nebo „antigenní determinanta znamenají aminokyselinovou sekvenci, která je imunoreaktivní. Obecně se epitop skládá z nejméně 3 až 4 aminokyselin, častěji ale z nejméně 5 až 6 aminokyselin, někdy z 7 až 8 aminokyselin a někdy dokonce až z okolo 10 aminokyselin. Epitopem daného polypeptidu se • ··· «« *♦· zde myslí epitopy se stejnou aminokyselinovou sekvencí jako epitop ve stanoveném polypeptidu a jeho imunologické ekvivalenty. Takovéto ekvivalenty zahrnuji také kmeny, subtypy (=genotypy), nebo typově(skupinově) specifické varianty, např. současně známé sekvence nebo kmeny náležící k genotypům la, lb, lc, Id, le, lf, 2a, 2b, 2c,
2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 4a, 4b, 4c, 4d,
4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k, 41, 5a, 5b, 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 8a,
8b, 9a, 9b, 10a, 11a, 12a nebo jakýkoliv nově definovaný (sub)typ HCV. Mělo by být jasné, že aminokyseliny tvořící epitop nemusí být částí lineární sekvence, ale můžou být proložené jednou nebo více sériemi různého počtu aminokyselin, čímž se vytvoří konformační epitop.
Pojem „imunogenní se vztahuje ke schopnosti substance vyvolat humorální a/nebo buněčnu odpověď ať už samotné nebo ve spojení s nosičem, v přítomnosti nebo nepřítomnosti adjuvans. „Neutralizací se rozumí imunitní odpověď, která blokuje infekčnost infekčního agens ať už zcela nebo částečně. „Vakcína je imunogenní směs schopná vyvolat ochranu před HCV, ať už částečnou nebo celkovou. Vakcína může být také užitečná pro léčení osoby a pak se nazývá léčebná vakcína (therapeutic vaccine).
Výraz „léčebný se vztahuje k směsi schopné léčit infekci HCV.
Výraz „účinné množství se vztahuje k množství polypeptidu nesoucího epitop dostatečného pro vyvolání imunogenní odpovědi u jedince, kterému je podáno, nebo jinak detekovatelně imunoreagujcmu v zamýšleném systému (např. imunotestu). Přednostně je účinné množství dostatečné pro uskutečnění léčby tak jak byla definována výše. Přesné nezbytné množství bude různé podle aplikace.
Výraz „protilátka se vztahuje k polyklonálním nebo monoklonálním protilátkám. „Monoklonální protilátka” představuje směs protilátek s homogenní populací protilátek. Výraz není omezen co se týče druhu nebo zdroje protilátek a není také limitován způsobem, kterým byly tyto protilátky připraveny. Mělo by se zdůraznit, že také protilátky s lidským původem (humanized antiody), jednořetězcová protilátka (single chain antibody) a jakýkoliv jejich jiný fragment, který si z větší části podržel specifitu dané protilátky, také patří do předkládaného vynálezu.
9 9·9
9
9
9 • 999 ·
9 9 • 9 9·
9 to
999
Výraz „protilátky s lidským původem (humanized antibody) znamená, že nejméně část rámcových oblastí imunoglobulinu je odvozená od lidských imunoglobulinových sekvencí.
Termín „jednořetězcová protilátka (single chain antibody) se vztahuje k protilátkám připraveným určením vazebných domén protilátky (jak těžkého, tak lehkého -řetězce) a poskytnutím spojovací části, která umožňuje zachování vazebné funkce.
Zde používaný termín „fragmenty (protilátek) se vztahuje k Fab, F(ab)2, Fv a ostatním fragmentům, které si zachovají schopnost vázat antigen a specifitu rodičovské protilátky.
Cíle vynálezu
Cílem předkládaného vynálezu je poskytnout zlepšené komponenty diagnostického testu HCV a terapeutické proteiny.
Zvláštním cílem předkládaného vynálezu je poskytnout zlepšené preparáty HCV NS3 proteinu pro použití při diagnóze protilátek proti HCV a/nebo pro léčení HCV.
Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnutí metody pro zvýšení reaktivity HCV protilátek s rekombinantním nebo syntetickým NS3 helikázovým proteinem nebo jeho částí na pevném povrchu.
Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout novou metodu pro purifikaci cystein obsahujících rekombinantních proteinů, zejména rekombinantním HCV proteinům.
Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout nové sekvence kódující HCV NS3 protein.
Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout nové sekvence kódující HCV NS3 protein, který nereaguje s falešně pozitivními HCV vzorky.
Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout metodu pro detekci nukleových kyselin vynálezu.
Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout sondy a primery pro detekci nukleových kyselin vynálezu.
Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout diagnostickou soupravu pro detekci nukleových kyselin vynálezu.
Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout nové HCV NS3 polypeptidy.
• φ • φ φ φ • φ φφφφ « • * φφφ φφ φφ φφφ φ φ φφφφ φ φ φ φφ φφ φφ φφφ
Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout nové HCV NS3 polypeptidy, které nereagují s falešně pozitivními vzorky HCV.
Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout farmaceutickou směs pro prevenci nebo léčení HCV infekce.
Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout metodu pro detekci polypeptidů vynálezu.
Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout protilátky k polypeptidům předkládaného vynálezu pro použití v pasivní imunizaci a/nebo léčení.
Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout metodu pro produkci polypeptidů vynálezu.
Všechny cíle předkládaného vynálezu se dosáhly formami vysvětlenými dále.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se vztahuje zejména k imunotestu s pevnou fází, obsahujícímu na zmíněné pevné fázi antigen za přítomnosti redukčního činidla. Jak je ukázáno v části Příklady, účastní vynálezci zjistili, že přítomnost redukčního činidla jako je například DTT (vedle antigenu přichyceného k pevnému povrchu) učiní antigen imunotestu připojený na pevném povrchu mnohem více reaktivním s protilátkami proti danému antigenu. Také v roztoku se antigen redukcí stává reaktivnější.
Redukční činidlo podle předkládaného vynálezu je jakákoliv látka, která způsobí redukci S-S disulfidových můstků. Redukce rS-S disulfidových můstků je chemická reakce, kterou jsou disulfidy redukovány na thiol (-SH). Činidla a metody rozrušující disulfidové můstky jsou popsány v WO 96/04385 a jsou v tomto popisu zahrnuté odkazem. 'S-S' redukce se může dosáhnout (1) kaskádou enzymatických drah nebo (2) redukčními činidly. 0 enzymech jako thioredoxin, glutaredoxin je známo, že se účastní in vivo redukce disulfidů a také bylo prokázáno, že jsou účinné při redukci 'S-S' můstků in vitro. Disulfidové vazby jsou rychle rozštěpeny redukovaným thioredoxinem při pH 7,0 reakcí druhého řádu, která je asi 104 krát rychlejší než odpovídajíc rychlostní konstanta reakce s DTT.
β ··· ·· · ·
Redukční kinetika může být dramaticky zvýšena preinkubací roztoku proteinu s 1 mM DTT nebo dihydrolipoamidem (Holmgren, 1979).
Thiolovými sloučeninami schopnými redukovat proteinové disulfidové můstky jsou například dithithreitol (DTT), dithioerythrytol (DTE), beta-merkaptoetanol, thiokarbamáty, bis(2-merkaptoetyl) sulfon a N,N'-bis(merkaptoacetyl) hydrazin a dithioničitan sodný.
Redukční činidla bez thiolových skupin, jako např. askorbát nebo chlorid cínatý (SnCl2), které se ukázaly jako velmi užitečné při redukci disulfidových můstků v monoklonálních protilátkách (Thakur et al., 1991), se také můžou použít pro redukci NS3. Působení hydroboritanu sodného se ukázalo jao účinné pro redukci disulfidových můstků v peptidech (Gailit, 1993). Tris (2karboxyetyl) fosforovodík (tris (2-karboxyetyl) phosphine, TCEP) je schopný redukovat disulfidy při nízkém pH (Burns et al., 1991). Selenol (selenol) katalyzuje redukci disulfidů na thioly, když se jako redukční činidlo použije DTT nebo borohydrid sodný. Jako prekurzor katalyzátoru se použil selenocysteamin, komerčně dostupný diselenid (Singh and Kats, 1995).
Předkládaný vynález se vztahuje zejména k metodám pro produkci imunotestů tak jak jsou definovány výše, kde je dané redukční činidlo přidané k dané pevné fázi během kroku potahování, blokování a/nebo fixace daného antigenu na daný pevný povrch.
Předkládaný vynález se také vztahuje k metodě pro vykonávání imunotestu jak je definován výše, kde je daná redukční látka přidán během předběžné úpravy pevné fáze.
Jak vědí odborníci, podmínky potahování se můžou značně lišit a zahrnují aplikaci proteinu na pevnu fázi a umožněni reakce, při níž se naváže protein na pevnou fázi. K navázání může dojít kovalentní, hydrofobní nebo iontovou vazbou, Van Der Waelsovými silami, vodíkovými můstky, ale í dalšími způsoby. Pro tento krok se můžou použít různé pufry známé odborníkům, například karbamátový nebo fosfátový pufr, ale i další.
Pro blokování se může použít jakákoliv metoda známá odborníkům, například se může použít albumin, sérové proteiny, polyvinylpyrolidon (PVP), detergenty, želatina, polyvinylalkohol (PVA) nebo kasein.
t · ··· • · »······ ···· · ·· ·· ·· ···
Pro fixaci se může použít jakákoliv metoda známá odborníkům.
Další příklady blokování, fixace a potahování jsou v sekci Příklady.
Předkládaný vynález se dále zejména vztahuje k metodě definované výše, kde je dané redukční činidlo přidané k dané pevné fázi během procesu potahování pevné fáze antigenem. Příklady potahovacích pufrů jsou v sekci Příklady. Všechny ostatní známé potahovací pufry známé odborníkům také tvoří část předkládaného prohlášení.
Předkládaný vynález se vztahuje k metodě definované výše, kde je dané redukční činidlo přidané k dané pevné fázi během procesu blokování dané pevné fáze, včetně antigenu, který byl navíc aplikován za přítomnosti nebo nepřítomnosti redukčního činidla. Příklady blokujících pufrů jsou uvedeny v sekci Příklady. Všechny ostatní známé blokovací pufry známé odborníkům také tvoří část předkládaného prohlášení.
Předkládaný vynález se vztahuje k metodě definované výše, kde je dané redukční činidlo přidané k pevné fázi během procesu fixace potahovacího antigenu k dané pevné fázi, včetně antigenu, který navíc byl aplikován 2a přítomnosti nebo nepřítomnosti redukčního činidla Fixačnímu kroku mohl předcházet krok blokování za přítomnosti nebo nepřítomnosti redukčního činidla. Příklady fixačních pufrů jsou uvedené v sekci Příklady. Všechny ostatní známé fixační pufry známé odborníkům také tvoří část předkládaného prohlášení.
Předkládaný vynález se vztahuje k metodě provádění imunotestů jak je definováno výše, kde je dané redukční činidlo přidané během předběžné úpravy pevné fáze před přidáním vzorku. Předběžná příprava destiček může být provedena s destičkami, které byly upraveny redukčním činidlem v potahovacím, blokovacím a/nebo fixačním kroku nebo s destičkami, které nebyly předem upraveny redukčním činidlem.
Nakonec, redukční činidlo může být přidané během jakéhokoliv dalšího kroku vykonávaného při enzymových imunotestech, jako část předkládaného vynálezu, třeba po aplikaci redukčního činidla v jednom nebo více z výše uvedených čtyřech kroku (potahování, blokování, fixace a/nebo předběžná úprava). Takovéto další kroky
900
9
000« 9 zahrnují například inkubaci protilátek, detekci navázaných protilátek nebo vývoj zabarvení a další.
Překládaný vynález se vztahuje přednostně k metodě jak je definovaná výše, kde je daným redukčním činidlem DDT, DTE nebo TCEP.
Předkládaný vynález se také vztahuje k metodě definované výše, kde je dané redukční činidlo použité v koncentraci v rozsahu od 0,1 mM do 1 M, zejména pak v koncentracích od 0,5 mM do 500 mM, od 1 mM do 250 mM a nejspíše pak v koncentraci od 1 mM do 50 mM.
Některé aplikace můžou vyžadovat redukční činidlo o koncentraci v rozsahu od 0,5 do 50 mM, od 1 o 30 mM, od 2 do 20 mM, od 5 do 15 mM nebo okolo 10 mM. Jiné aplikace vyžadují koncentrace DTT v rozsazích 50-500 mM, 100-300 mM nebo 200 mM. Preferovaným redukčním činidlem je zejména DTT.
Předkládaný vynález se také vztahuje k metodě definované výše, kde je daným antigenem HCV NS3 protein, zejména HCV NS3 helikáza. Preferovaný je také obalový protein HCV, jako El a/nebo E2 protein. Také jakýkoliv další protein známý odborníkům může reagovat lépe s protilátkami proti danému proteinu, když se protein přidá k pevné fázi za přítomnosti DTT, nebo je upraven DTT následovně.
Předkládaný vynález se také vztahuje k metodě popsané výše, kde daný imunotest na pevné fázi obsahuje kombinaci antigenů různých etiologických látek nebo fenotypicky návazných podmínek.
Předkládaný vynález se také vztahuje k imunotestu na pevné fázi připraveném metodami popsanými výše. Zejména souprava obsahující alespoň pevnou fázi, jako je mikrotitrační destička, membránový proužek nebo silikonový čip, který obsahuje antigen, za přítomnosti redukční látky.
Předkládaný vynález se také vztahuje zejména k ELISA připravené metodou definovanou výše.
V preferovaném případě se předkládaný vynález vztahuje k ELISA zhotovené metodou popsanou výše, kde je dané redukční činidlo přednostně přidáváno v potahovacím a/nebo fixačním kroku. V jednom preferovaném případě může být redukční činidlo aplikováno v potahovacím kroku. V jiném preferovaném případě může být redukční činidlo aplikováno ve fixačním kroku. Zejména se ale preferuje případ, kdy je redukční činidlo přidané v obou krocích, jak potahovacím, tak fixačním.
• · · · · • * »·«.·*· ····· ·* *· *· ·*·
V jiném preferovaném případě se předkládaný vynález vztahuje k ELISA zhotoveným metodou popsanou výše, kde je dané redukční činidlo přidané během předběžné přípravy desky před přidáním vzorku. Předběžná příprava desky se může udělat u desek, které byly upravené redukčním činidlem při potahovacím a/nebo fixačním kroku, nebo u desek, které nebyly předtím upravené redukčním činidlem. Redukční činidlo se muže také přidat během jakéhokoliv dalšího kroku enzymového imunotestu. Takovéto další kroky zahrnují například inkubaci protilátek, detekci navázaných protilátek, vývoj zabarvení a další.
Předkládaný vynález se také vztahuje k linkovému testu [Line Immunoassay, LIA) zhotovenmu metodou popsanou výše.
V preferovaném případě se předkládaný vynález vztahuje k LIA zhotovenému metodou popsanou výše, kde je dané redukční činidlo přednostně přidáváno v potahovacím a/nebo fixačním kroku. Redukční činidlo se může také přidat během jakéhokoliv dalšího kroku zhotovování nebo provádění enzymového imunotestu. Takovéto další kroky zahrnují například fixaci, předběžnou úpravu, inkubací protilátek, detekci navázaných protilátek, vývoj zabarvení a další.
Předkládaný vynález se také vztahuje ke QUICK testu zhotovenému metodou popsanou výše.
V preferovaném případě se předkládaný vynález vztahuje ke QUICK testu zhotovenému metodou popsanou výše, kde je dané redukční činidlo přednostně přidáváno při potahování antigenu na proužek. QUICK test je laterální průtokový test (lateral flow assay), kde jsou proužky potahovány antigenem postřikem. V tomto testu je redukční činidlo přednostně přidáváno do postřikovacího roztoku. Redukční činidlo se také může přidat během jakéhokoliv dalšího kroku při zhotovování nebo provádění enzymového testu. Takovéto další kroky zahrnují například blokování, fixaci, předběžnou přípravu, inkubaci protilátek, detekci navázaných protilátek, vývoj zabarvení a další.
Předkládaný vynález se také vztahuje k použití testu charakterizovanému výše pro in vitro diagnózu protilátek získaných proti antigenu vymezenému výše.
• 999 • 9 9999 99·
9999 9 99 99 99 ···
Předkládaný vynález se také vztahuje k HCV NS3 proteinu upravenému metodou zahrnujicím kroky sulfonace a následné desulfonace.
Sulfonace a desulfonace je reakce, kterou se do proteinu zavádí nebo se z něj odstraňuje -SOj skupina.
Sulfonace je definována jako proces, kde thiolové skupiny (SH) na proteinech (R) a disulfidové můstky jsou převedeny na Ssulfonáty, podle následující reakce:
RSH---> RS-SOj (1)
RS-SR + 2 -SOf + H20---> 2 RS-SO., + 2 OH' (2)
Produkty reakcí jsou S-sulfoproteiny, které jsou obvykle stabilní při neutrálním pH. Reakce (1) se může provést inkubací roztoku proteinu s tetrathionátem při pH>7 (Inglis and Liu, 1970). Reakce (2) pokračuje do konce v přítomnosti měďnatých iontů (Cole, 1967). Chán (1968) ukázal, že při působení siřičitanu sodného na protein a katalytického množství cysteinu za přítomnosti kyslíku dává sulfo-proteiny.
Desulfonace se může provést (1) přebytkem kompetitivních -SH (thiolových) skupin, (2) redukčním činidlem, nebo (3) inkubací při jiném než neutrálním pH.
RS-SOj + R'SH — -> RSH + R' S-SOý
RS-SO/ + redukční činidlo ---> RSH
Kompetitivní thiolové skupiny se můžou získat z nízkomolekulárních sloučenin nebo z proteinových -SH skupin.
Příklady sloučenin obsahujících mono- nebo dithiol jsou: cystein, cysteinamin, redukovaný glutathion, N-acetyl cystein, homocystein, beta-merkaptoetanol, thiokarbamáty, bis(2-merkaptoetanol) sulfon (BMS) a N,N' -bis(merkaptoacetyl) hydrazin (BMH), 5,5' -dithiobis-(2-kyselina nitrobenzoová) (DTNB nebo Elamnovo reagens), dithiothreitol (DTT) a dithioerythritol (DTE).
Předkládaný vynález se dále vztahuje k HCV NS3 proteinu jak je definováno výše, který je dále upravený detergentem s obojetným • · 999
9 9999 999 •099 9 99 99 99 999 ionem (zwitterionic detergent). Odborníci znají další vhodné detergenty, které jsou uvedeny také v WO 96/04385.
Předkládaný vynález se dále vztahuje k metodě purifikace rekombínantně exprimovaného proteinu obsahujícímu cystein, která se sestává z nejméně 2, lépe ze 3 nebo 4 a nejlépe ze všech následujících kroku:
(a) sulfonace lyzátu rekombinantních hostitelských buněk nebo lýze rekombinantních hostitelských buněk za přítomnosti guanidin chloridu (přednostně 6 M Gu.HCl) a sulfonace buněčného lyzátu, (b) úprava detergentem s obojetným ionem (zwitterionic detergent), přednostně po odstranění buněčných zbytků, (c) purifikace sulfonovaného rekombinantního proteinu nebo purifikace sulfonovaného rekombinantního proteinu s následným odstraněním detergentu s obojetným ionem, přičemž pro zmíněnou purifikaci se preferuje chromatografie, zejména Ni-IMAC chromatografie, kde je daný rekombinantní protein rekombinantním proteinem s His-kotvou (His-tagged), (d) desulfonace sulfonovaného rekombinantního proteinu nejlépe molárním přebytkem redukčního činidla jako je DTT, (e) uchování za přítomnosi molárního přebytku DTT.
Příkladem zvláště preferovaného detergentu s obojetným ionem (zwitterionic detergent) je Empigen. Zjistilo se, že použití takového detergentu s obojetným ionem a DTT zlepšuje purifikační protokol pro HCV N53 helikázu a obalové proteiny HCV.
Předkládaný vynález se také vztahuje k polynukleové kyselině HCV kódující HCV NS3 polyprotein, jak je ukázáno na obr. 1 (SEQ ID NO 3-18), nebo specifické části polynukleové kyseliny HCV se sekvencí uvedenou v obr. 2-1, 3-1, 4-1, 5-1, 6-1, 7-1 a 8-1 (SEQ ID NO 19, 21, 23, 25, 27, 29 a 31).
Předkládaný vynález se také vztahuje k polynukleové kyselině HCV definované výše a charakterizované na obr. 2-1, 3-1, 4-1, 5-1, 6-1, 7-1 a 8-1 a faktem, že její produkt nereaguje s falešně pozitivními HCV vzorky, nebo jejich části, která kóduje NS3 epitopy, které nereagují s falešně pozitivními HCV vzorky. Zejména bylo překvapivé, že proteiny kódované klony reprezentovanými SEQ ID NO 19, 21, 23, 25, 27, 29 a 31 mají schopnost nereagovat s falešně φ Φφφφ φ φ • φ • •Φ φ φ φ φφ ·Φ· φ φ φφφφ · · · φ· Φ· φφ φφφ pozitivními HCV vzorky, ale přesto jsou schopné reagovat s většinou známých vzorku pozitivních na ΝΞ3 protilátky po úpravě DTT.
Předkládaný vynález se také vztahuje k rekombinantnímu vektoru obsahujícímu popsanou polynukleovou kyselinu.
Předkládaný vynález se dále vztahuje k hostitelské buňce obsahující vektora vynálezu.
Předkládaný vynález se dále vztahuje k metodě detekce nukleové kyseliny vynálezu. Touto detekční metodou může být kterákoliv metoda známá odborníkům, jak například metoda popsaná detailně v WO 96/13590 Maertens í Stuyver.
Předkládaný vynález se zejména dále vztahuje k metodě detekce nukleových kyselin vynálezu zahrnující:
- kontakt dané nukleové kyseliny se sondou
- určení komplexu vytvořeného mezi danou nukleovou kyseliny a sondou
Předkládaný vynález se tak vztahuje také k izolované nukleové kyselině popsané výše nebo k jejímu fragmentu použitému jako sonda nebo primer.
Předkládaný vynález se dále vztahuje k diagnostické soupravě pro detekci sekvence nukleové kyseliny popsané výše, obsahujícím alespoň jeden primer a/nebo alespoň jednu sondu podle vynálezu. Pro detailní popis přehledu těchto aplikací je proveden odkaz na WO 96/13590.
Kromě reaktivity získané redukcí je také reaktivita velmi určená sekvencí NS3 antigenu.
Předkládaný vynález se tak také vztahuje k HCV polypeptidu, který má část nebo všechny aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 1, 2-2, 3-2, 4-2, 5-2, 6-2, 7-2 a 8-2 (SEQ ID NO 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32). Předkládaný vynález se také vztahuje k proteinu HCV NS3 helikázy, jak je uvedeno na obr. 1 (SEQ ID NO 1-18} nebo jeho specifické části.
Předkládaný vynález se také vztahuje k proteinu HCV NS3 helikázy nebo jeho části obsahujícímu buď S1200, A1218, A1384,
P1407, V1412, P1424 nebo F1444, nebo kombinaci těchto aminokyselin s kteroukoliv z následujících aminokyselin - L1201, S1222, 11274, 51289, T1321, A1323, T1369, L1382, V1408, A1409 nebo F1410.
·0 ·0· • 0
0
0000 0
0 0 0 0 0« 00 00 000
Číslování je podle běžně akceptovaného číslovacího systému pro aminokyseliny HCV.
Předkládaný vynález se dále vztahuje k farmaceutické směsi (pharmaceutical composition) obsahující polypeptid vynálezu, nebo jakoukoliv jeho funkčně ekvivalentní variantu nebo fragment. Výraz „farmaceutická směs se vztahuje ke směsi nebo léku (oba termíny se dají zaměnit) obsahující polypeptid předkládaného vynálezu a farmaceuticky akceptovatelný nosič nebo pomocnou látku (excipient) (oba termíny se dají zaměnit). Tato farmaceutická směs se může použít jako lék. Tato farmaceutická směs se může použít jako lék pro léčení nebo prevenci infekce HCV. Vhodnými nosiči nebo pomocnými látkami známými odborníkům jsou fyziologický roztok, Ringerův roztok, dextrózový roztok, Hankův roztok, stabilní oleje (fixed oils), etyl oleát, 5% dextróza ve fyziologickém roztoku, látky zvyšující izotonicitu a chemickou stabilitu, pufry a konzervační látky. Jiné vhodné nosiče zahrnují jakýkoliv nosič, který sám neindukují tvorbu protilátek škodlivých individuu, kterému jsou aplikovány směsi, jako proteiny, polysacharidy, kyselina polymléčná (polylactic acid), kyselina polyglykolová, polymerní aminokyseliny a kopolymery aminokyselin. „Farmaceutická směs nebo „lék (medicament) se můžou podávat jakoukoliv vhodnou metodou známou odborníkům. Preferovaným způsobem je parenterální podávání nebo vakcína. Při parenterálním podávání nebo při použití vakcíny bude lék tohoto vynálezu připraven v dávkové jednotce injekční formy, jako například roztoku, suspenze nebo emulze ve spojení s farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami, jak je uvedeno výše. Pro aplikace vakcíny nebo například pro přípravu polyklonálního antiséra/protilátek se může účinné množství lišit v závislosti na druhu, věku a obecném stavu jedince, vážnosti léčených podmínek, daném vybraném polypeptidu, způsobu podávání atd. Má se za to, že účinné množství bude nalezeno v relativně velkém, ne-kritickém rozsahu. Vhodné účinné množství se muže pohotově určit pouze rutinním experimentováním. Preferované rozsahy NS3 a/nebo El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 jednotlivého nebo specifických oligomerních obalových proteinů pro prevenci onemocnění HCV jsou 0,01 až 1000 ug/dávku, lépe pak 0,1 až 100 ug/dávku a nejlépe 1 až 50 ug/dávku. Jednotliví jedinci múzou potřebovat pro vyvolání dostatečné imunitní odpovědi a následné ochrany před onemocněním HCV několik dávek.
V případě léčebné vakcíny může být počet nutných vakcín i větší než 10. Může se také použít nepřetržitá infuze při dávce 5 až 20 ug/kg/minutu nebo lépe při dávce mezi 7 až 15 ug/kg/minutu. Mělo by také být jasné, že farmaceutická směs předkládaného vynálezu může obsahovat funkčně ekvivalentní variantu nebo fragment sekvence uvedené v SEQ ID NO 3-18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 a 32. Druhý termín se vztahuje k molekule, která obsahuje úplnou proteinovou sekvenci polypeptidu vynálezu, nebo část proteinové sekvence polypeptidu vynálezu, u kterých se provedla určitá modifikace a která si zachovává všechny nebo některé biologické vlastnosti polypeptidu vynálezu. Takovéto modifikace zahrnují kromě jiného přidání polysacharidových řetězců, přidání určitých chemických skupin, přidání lipidové části, fúzi s jiným peptidem nebo proteinovými sekvencemi a tvorbu intramolekulárních křížových vazeb.
Předkládaný vynález se také vztahuje k imunotestúm obsahujícím HCV polypeptid jak je definovaný výše. Daný imunotest může mít jakýkoliv formát známý odborníkům (viz například WO 96/13590 a Coligan et al., 1992). Předkládaný vynález se vztahuje zejména k metodě pro detekci polypeptidu vynálezu zahrnující:
- kontakt daného polypeptidu s ligandem vázajícím se k danému polypeptidu;
- určení komplexu vytvořeného mezi daným polypeptidem a daným ligandem.
Předkládaný výraz se tedy také vztahuje k ligandu vázajícím polypeptid vynálezu. Termín „ligand” se vztahuje k jakékoliv molekule schopné vázat polypeptidy předkládaného vynálezu. Druhý výraz se specificky vztahuje k polyklonálním a/nebo monoklonálním protlátkám specificky získaným (jakoukoliv známou metodou) proti polypeptidům předkládaného vynálezu a také zahrnuje jakékoliv protilátkám podobné a jiné konstrukty, popsané detailně v EP 97870092.0 Lorré et al. Takovéto protilátky můžou být velmi užitečné pro detekci antigenu v biologických roztocích. Detekce antigenu se může provést jakýmkoliv imunotestem známým odborníkům, jako například testy, které využívají biotin a avidin nebo streptavidin, ELISA, imunoprecipitace, imunohistochemické techniky a aglutinační ···« · ·» ·· ·· testy. Detailní popis těchto testů je v WO 96/13590, který je tak zde zahrnut odkazem.
Kromě toho můžou být dané protilátky velmi užitečné pro léčbu HCV nebo jiných onemocnění a můžou tedy být (jsou-li vyprodukovány v jiném, nežli lidském organismu) polidštěny (humanized).
Předkládaný vynález se pak také vztahuje ke směsím těchto protilátek ve farmaceuticky přijatelné pomocné látce pro použití jako lék.
Předkládaný vynález se také vztahuje k jakékoliv metodě pro produkci a použití daných polyproteinů vynálezu. Metody pro produkci a použití HCV polyproteinů jsou uvedeny v WO 96/13590. Daná použití nezahrnují jenom diagnostické použití, ale také terapeutické a preventivní použití. NS3 proteiny vynálezu jsou zejména vhodné pro začlenění do vakcínových směsí. Daná vakcínová směs může obsahovat kromě· aktivní složky jakékoliv adjuvans známé odborníkům.
V předkládaném popisu je tak zahrnut odkazem WO 96/13590. NS3 proteiny předkládaného vynálezu se také můžou použít v jakékoliv aplikaci, kde je na místě použití NS3 helikázy, například pro účely vyhledávání (screening) léků.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1. Aminokyselinová sekvence HCV NS3 klonů izolovaných z HCV subtypu la a lb infikovaného séra.
Obrázek 2-1. DNA kódující sekvence mTNFH6N33 klonu 19b fúzního proteinu. Sekvence znázorněná tučně není sekvence NS3. Tato sekvence kóduje fúzního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Obrázek 2-2. Aminokyselinová sekvence mTNFH6NS3 klonu 19b fúzního proteinu. Sekvence znázorněná tučně není sekvence NS3. Tato sekvence obsahuje fúzního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Obrázek 3-1. DNA kódující sekvence mTNFH6NS3 klonu B9 fúzního proteinu. Sekvence znázorněná tučně není sekvence NS3. Tato sekvence kóduje fúzního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Obrázek 3-2. Aminokyselinová sekvence mTNFH6NS3 klonu B9 fúzního proteinu. Sekvence znázorněná tučně není sekvence NS3. Tato ♦ · ·· .( · · *·· · · · . · ········ · • * ···♦··· .... ; .. .· ·· ·· sekvence kóduje fúzního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Obrázek 4-1. DNA kódující sekvence mTNFH6NS3 Typ 3a klonu 21 fúzního proteinu. Sekvence znázorněná tučně není sekvence NS3. Tato sekvence kóduje fúzního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Obrázek 4-2. Aminokyselinová sekvence mTNFH6NS3 Typ 3a klonu 21 fúzního proteinu. Sekvence znázorněná tučně neníu sekvence NS3.
Tato sekvence kóduje fúzního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Obrázek 5-1. DNA kódující sekvence mTNFH6NS3 Typ 3a klonu 32 fúzního proteinu. Sekvence znázorněná tučně není sekvence NS3. Tato sekvence kóduje fúzního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Obrázek 5-2. Aminokyselinová sekvence mTNFH6NS3 Typ 3a klonu 32 fúzního proteinu. Sekvence znázorněné tučně nejsou sekvence NS3. Tato sekvence kóduje fúzního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Obrázek 6-1. DNA kódující sekvence mTNFH6NS3 Typ 2a fúzního proteinu. Sekvence znázorněná tučně není sekvence NS3. Tato sekvence kóduje fúzního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Obrázek 6-2. Aminokyselinová sekvence mTNFH6NS3 Typ 2a fúzního proteinu. Sekvence znázorněná tučně není sekvence NS3. Tato sekvence kóduje fúzního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Obrázek 7-1. DNA kódující sekvence mTNFH6NS3 Typ 2b fúzního proteinu. Sekvence znázorněná tučně není sekvence ΝΞ3. Tato sekvence kóduje fúzního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Obrázek 7-2. Aminokyselinová sekvence mTNFH6NS3 Typ 2b fúzního proteinu. Sekvence znázorněná tučně není sekvence NS3. Tato sekvence kóduje fúzního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Obrázek 8-1. DNA kódující sekvence mTNFH6NS3 Typ 2c fúzního proteinu. Sekvence znázorněná tučně není sekvence NS3. Tato sekvence • · kóduje fÚ2ního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Obrázek 8-2. Aminokyselinová sekvence mTNFH6NS3 Typ 2c fúzního proteinu. Sekvence znázorněná tučně není sekvence NS3. Tato sekvence kóduje fúzního partnera mTNF, hexahistidinovou kotvu a část multilinkeru.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1. Exprese HCV ΝΞ3 Typl klonu 19b v E. coli
1.1 Klonování genů HCV NS3 Typ lb klony 19a a 19b
Doména NS3helikázy (aminokyseliny 1188-1465) se amplifikovala pomocí RT-PCR ze séra IG8309 HCV subtypu lb (Innogenetics, Gent, Belgie) s použitím syntetických oligonukleotidových primerů HCPr59 (5'-GGGCCCCACCATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTT-3') (SEQ ID NO 1) a HCPr60 (5'-CTATTAGCTGAAAGTCGACTGTCTGGGTGACAGCA-3') (SEQ ID NO 2). Vznikl tak PCR fragment 19, který se nakloňoval do E. coli. Negativní (sense) primer HCPr59 nese restrikční místo pro Apal, které obsahuje umělý metionin. Pozitivní (antisense) oligonukleotid HCPrGO nese stopkodon po aminokyselině (aa) 1465. PCR fragment se následně rozštěpil Apal a výsledný Apal fragment 833 bp dlouhý byl klonován do expresního vektora TNFHRP (Innogenetics, Gent, Belgie), který byl rozštěpen restrikčním enzymem Apal. Čtyři klony hepatitidy C (HCCl) se osekvenovaly: HCC119a a HCC119b (viz odvozená aminokyselinová sekvence na obr. 1 a obr. 2-2). Klon HCC119b (pmTNFHRPHCC119b) se uložil pro další subklonování.
1.2 Konstrukce expresního plazmidu pEmTNFMPHHCC119b
Z vektora pmTNFHRPHCCll9b se izolovala kódovací sekvence NS3 klonu 19b dlouhá 900 bp pomocí restrikčního enzymu Ncol a tento úsek se vložil do stejným enzymem rozštěpeného expresního vektora pEmTNFMPH (Innogenetics, Gent, Belgie). Tak vznikl vektor pEmTNFMPHHCCH9b. Tento plasmid exprimoval HCV NS3 klon 19b jako Nkoncový fúzní protein s 25 aminokyselinami myšího TNF na N-konci « 9 » · 9 9 99
9 9 9 999 · · 9 • 9 9 9*999» •999 9 »9 9» 99 999 následovaný hexahistidinovou purifikační kotvou a štěpným místem kyseliny mravenčí (SEQ ID NO 19 a 20; obr. 2).
1.3 Exprese HCV NS3 klonu 19b v E. coli
Buňky kmene MC1061 (pAcI) (Wertman et al., 1986) se transformovaly plasmidem pEmTNFMPHHCCll9b. Buňky MC1061 (pAcI) nesoucí plasmid pEmTNFMPHHCCH9b se pěstovaly přes noc v kultivačním médiu Luria Broth (LB) s přídavkem 10/ug/ml tetracyklinu při 28 °C. Kultury se zředily 20x čerstvým LB médiem a dále pěstovaly při 28 °C do ODóoo 0,2; pak se zdvihla teplota na 42 ’C. Za 2-3 hodiny po indukci se získaly buňky. Exprese HCV NS3 klonu 19b fúzního proteinu se analyzovala technikou western blotů s použitím specifických monoklonálních protilátek a HCV pozitivního lidského séra.
Příklad 2. Exprese HCV NS3 klonu B9 v E. coli
2.1 Klonování genu HCV NS3 Typ la klonu B9
Doména NS3helikázy (aminokyseliny 1188-1465) se amplifikovala pomocí RT-PCR ze séra IG21054 HCV subtypu la (Innogenetics, Gent, Belgie) s použitím syntetických oligonukleotidových primerů HCPr59 (5'-GGGCCCCACCATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTT-3') (SEQ ID NO 1) a HCPr60 (5'-CTATTAGCTGAAAGTCGACTGTCTGGGTGACAGCA-3') (SEQ ID NO 2). Vznikl tak PCR fragment B, který byl klonován do E. coli. Negativní (sense) primerHCPr59 vnese restrikční místo pro Apal, které obsahuje umělý metionin. Pozitivní (antisense) oligonukleotid HCPr60 vnese stopkodon po aminokyselině (aa) 1465. PCR fragment je následně klonován do expresního vektora pGEM-T (Promega, Madison, WI, USA). Čtyři klony byly osekvenovány: B7, B9, B12 a B14 (viz odvozená aminokyselinová sekvence na obr. 1 a obr. 3-2). Klon B9 (pGEMTNS3B9) se uložil pro další subklonování.
2.2 Konstrukce expresního plazmidů pIGFHlllNS3B9
Z vektora pGEMTNS3B9 se izolovala kódovací sekvence klonu B9 dlouhá 850 bp pomocí restrikčních enzymů Ncol/Spel (fragment se • » · ··« · · • « « · · · · «« ·« ·· ··· zarovnanými konci) a tento úsek se vložil do stejnými enzymy rozštěpeného expresního vektora plGFHlll (Innogenetics, Gent, Belgie). Tak vznikl vektor pIGFHlllNS3B9. Tento plasmid exprimoval HCV NS3 klon B9 jako N- koncový fúzní protein s 25 aminokyselinami myšího TNF na N-konci následovaný hexahistidinovou purifikační kotvou a štěpným místem kyseliny kyseliny mravenčí (SEQ ID NO 21 a 2 2; obr. 3).
2.3 Exprese HCV NS3 klonu B9 v E. coli
Buňky kmene MC1061 (pAcI) (Wertman et al., 1985) se transformovaly plasmidem pIGFHlllNS3B9. Buňky MC1061 (pAcI) nesoucí plasmid pIGFHlllNS3B9 se pěstovaly přes noc v kultivačním médiu Luria Broth (LB) s přídavkem 10 ug/ml tetracyklinu při 28 °C. Kultury se zředily 20x čerstvým LB a dále pěstovaly při 28 °C do ODó50 0,2; pak se zdvihla teplota na 42 ’Ο. Za 2~3 hodiny po indukci se získaly buňky. Exprese HCV NS3 klonu B9 fúzního proteinu se analyzovala technikou western blotú s použitím specifických monoklonálních protilátek a HCV pozitivního lidského séra.
Příklad 3 Exprese HCV NS3 Typ la klonů A26, C16 a D18 v E.
coli.
Klony A26, C16 a D18 se izolovaly z infikovaných sér HCV subtypu la (séra IG21051, IG17790 a IG21068) podobným způsobem, jak je uvedeno pro klon B9 s využitím primerů HCPr59 a HCPr50. Klony A5, A26, Cl, C3, C4, C12, C16, D17, D18 a D19 se klonovaly a osekvenovaly (viz předpokládané aminokyselinové sekvence na obr. 1). Klony A26, C16 a D18 se uložil pro další subklonování.
Příklad 4. Exprese HCV NS3 Typ3a klonů 21 a 32 v E. coli
4.1 Klonování genů HCV NS3 Typ 3a klonů 21 a 32
Doména NS3helikázy (aminokyseliny 1188-1465) se amplifikovala pomocí RT-PCR z HCV séra subtypu 3a IG21349 a IG20014 (Innogenetics, Gent, Belgie) s použitím syntetických oligonukleotidových primerů • ··· « « ····*·♦ ·>·· · ·· ·· ·· ♦··
403 (5'-GGGCCCCACCATAGGTGTAGCAAAAGCCCTACAGTT-3') (SEQ ID NO 33) a
404 (5' -CTATTAGCTGAAGTCAACGTACTGTTCAACAGC-3' ) (SEQ ID NO 34). Vznikl tak v obou případech PCR fragment o délce asi 850 bp, který se následně subklonoval do vektora pGEM-T (Promega, Madison, WI, USA).
Z každého klonovaného PCR fragmentu se osekvenovalo několik klonů, ale po sekvenování se z každého séra ukázal pouze jeden klonovaný fragment jako zcela správný. Byly to klony 21 (pGEM-TNS3T3a.21) ze séra IG 21349 a klon 32 (pGEM-TNS3T3a.32) ze séra IG20014 (obr. 4 a 5) .
4.2 Konstrukce expresních plazmidů pGEM-TNS3T3a.21 a pGEM-TNS3T3a.32
Z vektorů pGEM-TNS3T3a.21 a pGEM-TNS3T3a.32 se izolovaly kódovací sekvence klonů 21 a 32 dlouhé 850 bp pomocí restrikčních enzymů Ncol/Sall a tyto úseky se vložily do stejnými enzymy rozštěpeného expresního vektora pIGFHlll (Innogenetics, Gent,
Belgie). Tak vznikly vektory pIGFHlllNS3T3a.21 a pIGFHlllNS3T3a.32. Tyto plasmidy exprimovaly HCV NS3 Typ 3a klony 21 a 32 jako Nkoncové fúzní proteiny s 25 aminokyselinami myšího TNF na N-konci následovanými hexahistidinovou purifikační kotvou a štěpným místem kyseliny kyseliny mravenčí (SEQ ID NO 23-26; obr. 4 a 5).
4.3 Exprese HCV NS3 typ 3a klonů 21 a 32 v E. coli
Buňky kmene MC1061 (pAcI) (Wertman et al., 1986) se transformovaly plasmidy pIGFHlllNS3T3a.21 a pIGFHlllNS3T3a.32. Buňky MC1061 (pAcI) nesoucí plasmid pIGFHlllNS3T3a.21 nebo pIGFHlllNS3T3a.32 se pěstovaly přes noc v kultivačním médiu Luria Broth (LB) s přídavkem 10 ug/ml tetracyklinu při 28 °C. Kultury se zředily 20x čerstvým LB a dále pěstovaly při 28 °C do QDĚOo 0,2; pak se zdvihla teplota na 42 °C. Za 2-3 hodiny po indukci se získaly buňky. Exprese HCV NS3 klonu B9 fúzního proteinu se analyzovala technikou western blotů s použitím specifických monoklonálních protilátek a HCV pozitivního lidského séra.
Příklad 5. Exprese HCV NS3 Typ2a klonu 3 v E. coli • 999
9
9
9 9 9
9 9 9 9 9 9
99 99 999
5.1 Klonování genu HCV NS3 Typ2a klonu 3
Doména NS3helikázy (aminokyseliny 1188-1465) se amplifikovala pomocí RT-PCR ze séra IG21342 HCV subtypu 2a (Innogenetics, Gent, Belgie) s použitím syntetických oligonukleotidových primerů 412 (5' GGGCCCCACCATGGGCGTGGCCAAGTCCATAGACTT-3') (SEQ ID NO 35) a 413 (5'CTATTAGCTGAAGTCTACAACTTGAGTGACCGC-3') (SEQ ID NO 36). Vznikl tak PCR fragment o délce asi 850 bp, který byl následně subklonován do vektora pGEM-T (Promega, Madison, WI, USA). Několik klonů se osekvenovalo a klon 3 pGEM-TNS3T2 se uchoval pro další subklonování (obr. 6).
5.2 Konstrukce expresního plazmidu pIGFHlllNS3T2
Z vektora pGEM-TNS3T2a se izolovala kódovací sekvence klonu 3 dlouhá 850 bp pomocí restrikčního enzymu Ncol a tento úsek se vložil do stejným enzymem rozštěpeného expresního vektora pXGFHlll (Innogenetics, Gent, Belgie). Tak vznikl· vektor pIGFHlllNS3T2a.
Tento plasmid exprimoval HCV NS3 Typ 2a klon 3 jako N- koncový fúzní protein s 25 aminokyselinami myšího TNF na N-konci následovaný hexahistídinovou purifikační kotvou a štěpným místem kyseliny mravenčí (SEQ ID NO 27 a 28; obr. 6).
5.3 Exprese HCV NS3 Typ 2a klonu 3 v E. coli
Buňky kmene MC1061 (pAcI) (Wertman et al., 1986) se transformovaly plasmidem pIGFHlllNS3T2a. Buňky MC1061 (pAcI) nesoucí plasmid pIGFHlllNS3T2a se pěstovaly přes noc v kultivačním médiu Luria Broth (LB) s přídavkem 10 ug/ml tetracyklinu při 28 eC.
Kultury se zředily 20x čerstvým LB a dále pěstovaly při 28 ’C do OD6Q0 0,2; pak se zdvihla teplota na 42 °C, Za 2-3 hodiny po indukci se získaly buňky. Exprese HCV NS3 Typu 2a klonu 3 fúzního proteinu se analyzovala technikou western blotů s použitím specifických monoklonálních protilátek a HCV pozitivního lidského séra.
Příklad 6. Exprese HCV NS3 Typ2b klonu 9 v E. coli • ··* • · ···*··>· 4 • · ·»*·*»· «Μ» « · ·* ·* ···
6.1 Klonování genu HCV NS3 Typ 2b klonu 9
Doména NS3helikázy (aminokyseliny 1188-1465) se amplifikovala pomocí RT-PCR ze séra IG20192 HCV subtypu 2b (Innogenetics, Gent,
Belgie) s použitím syntetických oligonukleotidových primerů 401 (5' — GGGCCCCACCATGGGCGTAGCCAAATCCATTGACTT-3') (SEQ ID NO 37) a 402 (5'CTATTAGCTGAAGTCTACAATTTGAGACCGC-3' ) (SEQ ID NO 38). Vznikl tak PCR fragment o délce asi 850 bp, který byl následně subklonován do vektora pGEM-T (Promega, Madison, WI, USA). Několik klonů se osekvenovalo a klon 9 se uchoval pro další subklonován! (obr. 7).
6.2 Konstrukce expresního plazmidu pIGFHlllNS3T2b
Z vektora pGEM-TNS3T2b se izolovala kódovací sekvence klonu 9 dlouhá 850 bp pomocí restrikčního enzymu Ncol a tento úsek se vložil do stejným enzymem rozštěpeného expresního vektora pIGFHlll (Innogenetics, Gent, Belgie). Tak vznikl vektor pIGFHlllNS3T2b.
Tento plasmid exprimoval HCV NS3 Typ 2b klon 9 jako N- koncový fúzní protein s 25 aminokyselinami myšího TNF na N-konci následovaný hexahistidinovou purifikační kotvou a štěpným místem kyseliny mravenčí (SEQ ID NO 29-30? obr. 7).
6.3 Exprese HCV NS3 Typ 2a klonu 3 v E. coli
Buňky kmene MC1061 (pAcI) (Wertman et al., 1986) se transformovaly plasmidem pIGFHlllNS3T2b. Buňky MC1061 (pAcI) nesoucí plasmid pIGFHlllNS3T2b se pěstovaly přes noc v kultivačním médiu Luria Broth (LB) s přídavkem 10 ug/ml tetracyklinu při 28 °C.
Kultury se zředily 20x čerstvým LB a dále pěstovaly při 28 *C do OD60o 0,2; pak se zdvihla teplota na 42 °C. Za 2-3 hodiny po indukci se získaly buňky. Exprese HCV NS3 Typu 2b klonu B9 fúzního proteinu se analyzovala technikou western blotů s použitím specifických monoklonálních protilátek a HCV pozitivního lidského séra.
Příklad 7. Exprese HCV NS3 Typ2c klonu 14 v E, coli
000
000 9 • »0 00 000 0 • 0 0 0 0 0 0 0 00 00 00
7.1 Klonování genu HCV NS3 Typ 2c klonu 14
Doména NS3helikázy (aminokyseliny 1188-1465) se amplifikovala pomocí RT-PCR ze séra IG20031 HCV subtypu 2c (Innogenetics, Gent, Belgie) s použitím syntetických oligonukleotidových primerů 401 (5' GGGCCCCACCATGGGCGTAGCCAAATCCATTGACTT-3') (SEQ ID NO 37) a 402 (5'CTATTAGCTGAAGTCTACAATTTGAGACCGC-3') (SEQ ID NO 38). Vznikl tak PCR fragment o délce asi 850 bp, který byl následně subklonován do vektora pGEM-T (Promega, Madison, WI, USA). Několik klonů se osekvenovalo a klon 14 (pGEM-TNS3T2c) se uchoval pro další subklonování (obr. 8).
7.2 Konstrukce expresního plazmidu pIGFHlllNS3T2c
Z vektora pGEM-TNS3T2c se izolovala kódovací sekvence klonu 14 dlouhá 850 bp pomocí restrikčního enzymu Ncol a tento úsek se vložil do stejným enzymem rozštěpeného expresního vektora pIGFHlll (Innogenetics, Gent, Belgie). Tak vznikl vektor pIGFHlllNS3T2c.
Tento plasmid exprimoval HCV NS3 Typ 2c klon 14 jako N- koncový fúzní protein s 25 aminokyselinami myšího TNF na N-konci následovaný hexahistidinovou purifikační kotvou a štěpným místem kyseliny mravenčí (SEQ ID NO 31 a 32; obr. 8).
7.3 Exprese HCV NS3 Typ 2c klonu 14 v E. coli
Buňky kmene MC1061 (pAcI) (Wertman et al., 1986) se transformovaly plasmidem pIGFHlllNS3T2c. Buňky MC1061 (pAcI) nesoucí plasmid pIGFHlllNS3T2b se pěstovaly přes noc v kultivačním médiu Luria Broth (LB) s přídavkem 10 ug/ml tetracyklinu při 28 °C.
Kultury se zředily 20x čerstvým LB a dále pěstovaly při 28 °C do ODóqq 0,2; pak se zdvihla teplota na 42 °C. Za 2-3 hodiny po indukci se získaly buňky. Exprese HCV Typ 2c NS3 klonu 14 fúzního proteinu se analyzovala technikou western blotů s použitím specifických monoklonálních protilátek a HCV pozitivního lidského séra.
Příklad 8. Purifikace proteinové domény NS3 helikázy ··«
4 * 444 · · 4
4 · 4 4 · • 4 4 4 4 4 4 · « 4« 44 ·4 444
Na jeden gramekvivalent vlhké pasty E. coli se přidalo devět objemů 8M guanidin hydrochloridu (Gu.HCl) a 1 objem 0,2 M NaHPO4 a tato směs se homogenizovala souvislým vortexováním. Do roztoku se přidaly Na2S4Oč a Na2SO3 v pevném stavu až do konečných koncentrací 65 a 360 mM. Ze zásobního roztoku (0,1 M v 25% NHJ se přidal CuSO4 do konečné koncentrace 100 uM. Roztok se míchal přes noc v temné komoře a po inkubaci při -70 °C se vyčeřil centrifugací při 4 °C (30 minut, 20 000 ot./min, rotor JA20).
K supernatantu se přidal Empigen BB™ (albright & Wilson Ltd., Okibury, VB) a imida2Ol do finálních koncentrací 1% (váha/objem) a 20 mM. IN HCl se upravilo pH na hodnotu 7,2. Vzorek odpovídající 3 litrům kultury se nanesl na ekvilibrovanou kolonu Ni-IDA Sepharose FF rychlostí 2 ml/min (kolona XK 16/20, Pharmacia, Upsala, Švédsko). Kolona byla ekvilibrována pufrem A, který obsahoval 20 mM imidazolu (pufr A: 50 mM fosfátu, 6M Gu.HCl, 1% Empigen, pH 7,2). Ni-IDA kolona se potom postupně promyla:
- pufrem A obsahujícím 20 mM imidazolu
- pufrem A obsahujícím 35 mM imidazolu
- pufrem A obsahujícím 50 mM imidazolu
- pufrem B obsahujícím 50 mM imidazolu (pufr B: 50 mM fosfátu, 6M Gu.HCl, pH 7,2)
- pufrem B obsahujícím 200 mM imidazolu
Každý promývací krok trval tak dlouho, dokud se absorbance při 280 nm nevrátila na základní úroveň. Kolona se regenerovala 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, pH 7,0.
Frakce se analyzovaly pomocí SDS-PAGE elektroforézy za neredukujících podmínek a obarvením stříbrem. MTNF-NS3 B9 fúzní protein se získal elucí pufrem s 200 mM imidazolem. Western blot s použitím králičího proti-lidského TNF (1 ug NS3/dráhu) a králičí antí-E.coli (10 ug NS3/dráhu) ukázal, že NS3 vykázal po tomto jediném chromatografickém kroku více jak 99% čistotu.
Frakce získané po eluci 200 mM imidazolem se spojily a odsolily.
Vzorek 40 ml Ni-IDA eluátu se nanesl rychlostí 10 ml/min. na 300 ml kolonu Sephadex G25 (XK 50, Pharmacia, Upsala, Švédsko) zekvilibrovanou pufrem s 50 mM fosfátu, 6M močovinou a lrriM EDTA, pH 7,2. Jímaly se 10 ml frakce a koncentrace proteinu se určila mikro • · * · ♦ 999 · • 9*· · e · 9 a · • 9 ·· 99 9··
BCA metodou (Pierce, Rockford, IL, US). Koncentrace proteinu se upravila před desulfonací na 500 ug/ml pufrem, který se použil pro odsoleni. Celkový výtěžek byl 50-55 mg purifikovaného NS3 fúzního proteinu/1 1 kultury.
Nakonec se přidal DTT {zásobní roztok 100 mM v destilované vodě) ve 100 násobném molárním přebytku oproti obsahu cysteinu v NS3 antigenu (např. NS3 19b obsahuje 7 cysteinů). Roztok se potom pročistil dusíkem a inkubován 1 hodinu při 28 °C. Vzorek ΝΞ3 se následně zředil příslušným pufrem použitým pro ELISA a LIA potahování.
Příklad 9. Reaktivita protilátek proti NS3 helikáze testovaná v LIA
Aby se otestovala reaktivita protilátek proti NS3 helikáze aplikovala se na nylonový membránový proužek linka roztoku antigenu NS3 (50 ug/ml) ve fyziologickém roztoku tlumeném fosfátem (phosphate bufferred šalině, PBS). Proužky se po dobu alespoň jedné hodiny vysušily při teplotě 18-24 °C a dále blokovaly PBS/kaseinem za přítomnosti nebo nepřítomnosti redukčního činidla DTT (10 mM). Proužky se následně opláchly PBS obsahujícím Tween 20 s nebo bez DTT (10 mM) a s 1 mM EDTA. Membrány se usušily (30 minut) a rozstříhaly na proužky pro testování různých vzorků pacientů.
Výsledky experimentu, kde se proužky inkubovaly s anti-HCV serokonversním panelem PHV903 (Boston Biomedica lne., Boston, USA) jsou uvedené v tabulce 1.
Příklad 10. Reaktivita protilátek proti NS3 helikáze testovaná v ELISA
Aby se otestovala reaktivita protilátek proti NS3 helikáze potáhly se mikrotitrační ELISA destičky NS3 antigeny purifikovanými jak je uvedeno v příkladu 4 následujícím způsobem.
Jamky mikrotitrační destičky se potáhly NS3 proteinem o koncentraci 0,3 ug/ml NS3 proteinu v potahovacím pufru obsahujícím 50 mM uhličitanový pufr, s nebo bez DTT (200 mM) a 1 mM EDTA. Mikrotitrační desky se inkubovaly 18 hodin při 20 °C a blokovaly 300 * « «999999* 9 « « 9999 99· • 99« 9 99 99 «« ··· ul PBS/kaseinového pufru v každé jamce. Desky se inkubovaly 2 hodiny při 20 °C a následně fixovaly 300 ul fixačního pufru s nebo bez DTT (200 mM) a 1 mM EDTA 2 hodiny při 20 ŮC.
Výsledky ukazují tabulky 2 a 3. Tabulka 2 ukazuje hodnoty signálu k šumu testů zahrnujících NS3 potažené a fixované, s nebo bez DTT při použití BBI sérokonverzních panelů PHV901 a PHV 912. Tabulka 3 shrnuje počet dnů, o kolik můžou být detekovány HCV protilátky dříve, použije-li se test zahrnující DTT. U 12 HCV serokonverzí se při použití DTT v testu dosáhlo detekce o celkem 34 dní dříve.
• ···
Tabulka 1. BB1 panely testované v LIA potažené HCV NS3 jak je popsáno u vzorku 9
| PHV | +DTT | -DTT1 |
| 903-01 | - | - |
| 903-02 | - | - |
| 903-03 | +/- | - |
| 903-04 | 2 | |
| 903-05 | 2 | +/- |
| 903-06 | 2 | +/- |
| 903-07 | 4 | 2 |
| 903-08 | 4 | 2 |
bez reakce; + pozitivní reakce; hodnocení intenzity v porovnání s různými mezními hodnotami (cut off) linek nastříkanými na ten samý proužek « «ν·ν · φ φφ • · · φ φφφ φφφ • φ φφφφ φφφφ φ φ · φφφφφφφ ··· » φφ φφ φφ φφφ
Tabulka 2: Panely ΒΒΙ testované v ELISA potažené HCV NS3 podle popisu v příkladu 10
| MEMBER ID# | DATUM KRVÁCENÍ | + DTT OD450 | - DTT OD450 |
| PHV901-01 | 09/23/93 | 0,1 | 0,3 |
| PHV901-02 | 27/11/93 | 0,1 | 0,3 |
| PHV901-03 | 29/12/93 | 2,0 | 2,9 |
| PHV901-04 | 31/12/93 | 2,1 | 3,0 |
| PHV901-05 | 01/05/94 | 2,2 | 3,1 |
| PHV901-06 | 01/07/94 | 2,4 | 3,2 |
| PHV901-07 | 02/01/94 | 4,1 | 6,0 |
| PHV901-08 | 02/09/94 | 3,9 | 5,9 |
| PHV901-09 | 03/01/94 | 4,0 | 7,9 |
| PHV90I-10 | 03/08/94 | 4,1 | 7,8 |
| PHV901-11 | 14/04/94 | 4,2 | 8,3 |
| PHV903-01 | 02/07/92 | 0,2 | 0/2 |
| PHV903-02 | 02/12/92 | 0,9 | 0,9 |
| PHV903-03 | 14/02/92 | 1,3 | 1,6 |
| PHV903-04 | 19/02/92 | 2,5 | 2,7 |
| PHV903-05 | 21/02/92 | 2,8 | 2,8 |
| PHV903-06 | 26/02/92 | 3,2 | 4,6 |
| PHV903-07 | 28/02/92 | 3,5 | 5,4 |
| PHV903-08 | 03/04/92 | 3,5 | 4,1 |
| PHV904-01 | 18/04/95 | 0,1 | 0,2 |
| PHV904-02 | 20/04/95 | 0,1 | 0,3 |
| PHV904-03 | 25/04/95 | 0,1 | 0,2 |
| PHV904-Q4 | 04/27/95 | 0,1 | 0,2 |
| PHV904-05 | 05/02/95 | 0,4 | 0,4 |
| PHV904-06 | 05/09/95 | 0,8 | 0,5 |
| PHV904-07 | 05/11/95 | 0,8 | 0,5 |
| PHV905-01 | 17/11/95 | 0,1 | 0,2 |
| PHV905-02 | 21/11/95 | 0,1 | 0,3 |
| PHV905-03 | 11/24/95 | 0,1 | 0,3 |
| PHV905-04 | 28/11/95 | 0,2 | 0,3 |
| PHV905-05 | 12/01/95 | 0,5 | 0,3 |
| PHV905-06 | 12/05/95 | 1,0 | 0,4 |
| PHV905-07 | 12/08/95 | 2,5 | 0,8 |
| PHV905-08 | 12/12/95 | 3,5 | 2,2 |
| PHV905-09 | 15/12/95 | 3,5 | 3 ,2 |
··· • · · • · · · ·· » » * · » * ♦ »····· ···· · ·· ·· 0· ···
| MEMSER ID# | DATUM KRVÁCENÍ | + DTT | - DTT |
| PHV 907-01 | 04/06/96 | 0,1 | 0,2 |
| PHV907-02 | 04/10/96 | 0,1 | 0,2 |
| PHV9Q7-03 | 13/04/96 | 0,1 | 0,2 |
| PHV907-04 | 19/04/96 | 3,0 | 2,2 |
| PHV907-05 | 24/04/96 | 3,7 | 4,1 |
| PHV907-06 | 27/04/96 | 3,6 | 4,1 |
| PHV907-07 | 17/09/96 | 3,9 | 7,6 |
| PHV908-01 | 26/01/96 | 0,1 | 0,1 |
| PHV908-02 | 29/01/96 | 0,1 | 0,1 |
| PHV908-03 | 31/01/96 | 0,1 | 0,1 |
| PHV908-04 | 02/06/96 | 0,1 | 0,1 |
| PHV908-05 | 02/08/96 | 0,1 | 0,1 |
| PHV908-06 | 14/02/96 | 0,2 | 0,1 |
| PHV908-07 | 20/02/96 | 1,4 | 0,2 |
| PHV908-08 | 22/02/96 | 1,6 | 0,2 |
| PHV908-09 | 27/02/96 | 1,9 | 0,2 |
| PHV908-10 | 03/01/96 | 2,3 | 0,2 |
| PHV908-11 | 03/07/96 | 2,3 | 0,4 |
| PHV908-12 | 03/11/96 | 2,8 | 0, 5 |
| PHV908-13 | 14/03/96 | 2,8 | 0, 5 |
| PHV909-01 | 01/28/96 | 0,1 | 0,4 |
| PHV909-02 | 02/15/96 | 2,3 | 5,4 |
| PHV909-03 | 17/02/96 | 2,4 | 5,3 |
| PHV910-01 | 26/08/96 | 0,1 | 0,2 |
| PHV910-02 | 30/08/96 | 0,4 | 0,2 |
| PHV910-03 | 09/03/96 | 2,7 | 3,1 |
| PHV9I0-04 | 09/06/96 | 3,6 | 6,4 |
| PHV910-05 | 09/10/96 | 3,9 | 8,1 |
| PHV911-01 | 30/10/96 | 0,1 | 0,2 |
| PHV911-Q2 | 11/02/96 | 0,1 | 0,2 |
| PHV911-03 | 13/11/96 | 2,1 | 4,0 |
| PHV911-04 | 11/20/96 | 3,6 | 7,8 |
| PHV911-05 | 23/11/96 | 3,7 | 7,7 |
| PHV912-01 | 01/06/96 | 0, 2 | 0,3 |
| PHV912-02 | 01/10/96 | 0,2 | 0,2 |
| PHV912-03 | 01/13/96 | 4,5 | 9,9 |
• * *
• 44 4 4
444 · 4 444 4 4
4 4 « ·4 4 «4 ·· ··»
| MEMBER ID# | DATUM KRVÁCENÍ | +DTT | -DTT |
| PHV902-01 | 02/10/92 | 0,1 | 0,2 |
| PHV902-02 | 02/12/92 | 0,1 | 0,2 |
| PHV902-03 | 17/02/92 | 0,1 | 0,3 |
| PHV902-04 | 19/02/92 | 0,3 | 0,6 |
| PHV902-05 | 24/02/92 | 2,6 | 3,9 |
| PHV902-06 | 26/02/92 | 3,1 | 5,9 |
| PHV902-07 | 03/02/92 | 3,4 | 6,5 |
| PHV906-01 | 10/07/95 | 0,5 | 0,3 |
| PHV906-02 | 10/09/95 | 0,5 | 0,4 |
| PHV906-03 | 14/10/95 | 1,6 | 0,6 |
| PHV906-04 | 17/10/95 | 1,5 | 1,2 |
| PHV906-05 | 21/10/95 | 2,2 | 3,0 |
| PHV906-06 | 24/10/95 | 2,5 | 4,5 |
| PHV906-07 | 28/10/95 | 2,9 | 5,7 |
99 • 9 9·99 9 • 9 9 9 999 9 9 9 « · 99 99 9*9 9 9 « * 9999 999
99·· · ·· ·· ·· ···
Tabulka 3. Přehled BBI panelů počty dní s časnější detekcí
| PHV | +DTT | -DTT |
| 901 | 0 | 0 |
| 902 | 0 | 0 |
| 903 | 0 | 0 |
| 904 | 0 | 0 |
| 905 | 7 | 0 |
| 906 | 3 | 0 |
| 907 | 0 | 0 |
| 908 | 24 | 0 |
| 910 | 0 | 0 |
| 911 | 0 | 0 |
| 912 | 0 | 0 |
♦ · · * · • » » · * * * · ··· · · • · · · • · · • · ·»· • · · · ·· *· ·· ·
Citované prameny
Burns, J., Butler, J., Moran, J., and Whitesides, G. (1991) Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. J. Org. Chem. 56, 2648-2650.
Chán, W. (1968) A method for the complete S sulfonation of cysteine residues in proteins. Biochemistry 7, 4247-4254.
Claeys, H., Volkaerts, A., Verhaert, H., De Beenhouwer, H., and Vermylen, C. (1992) Evaluation of anti-HCV capsid indeterminate samples. The Lancet 340, 249.
Cole, R. (1967) Sulfitolysis. Meth. Enzymol. 11, 206.
Coligan, J., Kniisbeek, A., Margulis, D., Shevach, E. and Strober, W. (1992) Current protocols in immunology. Wiley Interscience.
De Beenhouwer, H., Verhaert, H., Claeys, H., and Vermylen, C. (1992) Confirmation of hepatitis C virus positive blood donors by immunoblotting and polymerase chain reaction. Vox. Sang. 63, 198203.
Di Bisceglie, AM, Carithers, RL Jr, Gores, GJ (1998) Hepatocellular carcinoma. Hepatology. 28, 1161-1165.
Gailit, J. (1993) Restoring free sulfhydryl groups in synthetic peptides. Anal, Biochem., 214, 334-335.
Holmgren, A. (1979) Thioredoxin catalyses the reduction of insulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide. J. Biol. Chem. 254, 9627-9632.
» · 9 9 · 9 9
9 * 9 9·9 · 9
9 99 99 999 9 • « 9999 99
9999 9 99 99 «9 9
Inglis, A., and Liu, T. (1970) The stability of cysteine and cystine during acid hydrolysis of proteins and peptides. J. Biol. Chem. 245, 112-116.
McFarlane, L, Smith, H., Johnson, P., Bray, G., Vergani, D., and Williams, R. (1990) Hepatitis C virus antibodíes in chronic active hepatitis: pathogenic factor or false-positive result? The Lancet 335, 754-757.
Maertens, G. and Stuyver, L, (1997) Genotypes and Genetic variation of hepatitis C virus. In: Molecular Medicíně of Hepatitis (Eds, Zuckerman, A. and Harrison, T.), Molecular Medical Science Series (Eds. James, K. and Moms A) John Wiley and Sons Ltd., Chichester, England, Chapter 13, pp. 183-233.
Marin, M., Bresciani, S., Puoti, M., Rodella, A., Gussago, A., Ravaggi, A., Pizzocolo, G., Albertini, A., and Cariani, E. (1994) Clinical significance of sérum HCV RNA as markér of HCV infection.
J. Clin. Microbiol. 32, 3008-3012.
Peeters, D., Dekeyser, F., DeLeys, R., Maertens, G., and Pollet, D. (1993) Confirmation of anti-hepatitis C virus antibodies using the INNO-LIA HCV Ab III including Core, E2/NS1, NS3, NS4, and N55 epitopes. International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease, Tokyo, abstract 413.
Pollet, D., Šaman, E., Peelers, D., Warmenbol, H., Heyndricks, L., Wouters, C., Beelaert, G., van der Groen, G., and Van Heuverswyn, H. (1990) Confirmation and differentiation of antibodies to human immunodefíciency virus 1 and 2 with a strip-based assay including recombinant antigens and synthetic peptides. Clin. Chem. 37, 1700-1707.
Saito, L, Miyamura, T., Ohbayashi, A., Harada, H., Katayama,
T., Kikuchi, S., Watanabe, Y., Koi, S., Onji, M., Ohta, Y., Choo, Q.-L., Houghton, M., and Kuo, G. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 6547-6549.
• · ·
9 • 99 9 9 • 9 * • · 999 9 9
99 99« 9 • 9 9 9 9 9
Singh, R., and Kats, L. (1995) Catalysis of reduction of disulfide by selenol. Anal. Biochem.,232, 86-91.
Stuyver, L., Fretz, C., Esquivel, C., Boudifa, A., Jaulmes,
D., Azar, N., Lunel, F., Leroux-Roels, G., Maertens, G., and Fournel, J. (1996) HCV genotype analysis in apparently healthy antiHCV positive Parisian blood donors. Transfusion 36, 552-558.
Thakur, M., DeFulvio, J., Richard, M., and Park, C. (1991) Technetium-99m iabelled monoclonal antibodies: evaluation of reducing agents. Nucl. Med. Biol., 18, 227- 233. Waumans, L.,
Claeys, H., Verhaert, H., Mertens, W., and Vermylen, C. (1993) Hepatitis C virus confirmation in blood donor screening. Vox. Sang. 64, 145-149.
Wertman K.F., Wyman A.R. and Botstein D. (1986) Host/vector interactions which affect the viability of recombinant phage lambda dones. Gene 49: 253-262.
Zaaijer, H., Vrielink, H., van Exel-Oehlers, P., Cuypers, H., and Lelie, P. (1994) Confirmation of hepatitis C infeccion: a comparison of five immunoblot assays. Transfusion 34, 603-607.
Obr. 1-1
9« 9 «99 »9 99 « 9 9 9 99· 9 9 9 « 9 99 99 9»9· 9 • 9 9999 999
9·99 9 «· 99 ·9 999
| 1 Ο 1 ) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1(1111 1(1(111(1 | |||||||||||
| 3 | 1 > I | 1 I I | 1 1 1 | 1 1 I | 1 1 1 1 | r l 1 | í 1 | • 1 1 1 1 1 | 1 1 1 | 1 í 1 | 1 1 1 1 1 1 1 1 |
| Λ | 1 | 1 1 | , 1 | 1 1 | 1 4 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 1 |
| > | 1 | I | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 1 |
| Η | 1 | 1 | 1 | 1 1 | i | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 1 | |
| Ε-ι | I | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 1 |
| ω | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 1 |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 I | 1 | 1 | 1 1 1 | |
| ϋ | 1 | 1 | t | 1 | 1 1 | ω | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 1 |
| co | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 t | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| ο | 1 | 1 | t | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | Q | 1 1 1 |
| Η | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 i | 1 | 1 | 1 1 | i | 1 | 1 i 1 |
| (X | I | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | l | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 1 |
| < | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | l 1 | 1 | ||
| ffi | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| Ω | 1 | 1 | 1 | I | 1 1 | i | i | 1 1 | 1 | r | 1 1 1 |
| κ | 1 | 1 | 1 | t | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | J < | 1 | 1 1 1 | ||
| > | ι | i | 1 | 1 | 1 1 | 1 | I | J 1 | 1 | 1 | 1 1 1 |
| σ | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 i | 1 | 1 1 1 | |
| 1 | t | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | t 1 | 1 | 1 I 1 | ||
| co | 1 | 1 | 1 | 1 | i £-< | H | H | Η H | 1 | 1 Η H | |
| θ' | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| Du | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| > | 1 | 1 | 1 | 1 | ) 1 | r | 1 | 1 i | 1 | 1 1 1 | |
| < | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| Du | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 t | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| Οι | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 ] | ||
| C0 | 1 | 1 | t | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| W | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| Ω | 1 | 1 | ! | 1 | 1 t | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| Η | 1 | ( | t | 1 | 1 1 | 1 | 1 | J 1 | 1 | 1 1 1 | |
| Du | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 I | 1 | 1 1 ) | |
| > | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | I 1 ! | |
| CL | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| ω | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| ίϋ | t | 1 | 1 | 1 | [ 1 | 1 | r | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| 2 | [ | 1 | 1 | 1 | 1 i | 1 | r | 1 1 | t | 1 1 1 | |
| Η | 1 | 1 | t | i | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 I 1 | |
| Η | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 f | 1 | 1 | 1 1 | 1 | i 1 1 | |
| W | 1 | 1 | 1 | 1 | t 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| Ω | 1 | 1 | 1 | 1 | ' 2 | 2 | 2 | 2 2 | I | I 2 2 | |
| 2 | 1 | U} | ω | co | co ω | ω | ω | co ω | 1 | 1 | ι co ω |
| W | 1 | [ | 1 | 1 | [ i | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 1 |
| > | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | l | 1 1 | 1 | 1 1 1 | |
| CL | ι | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | I 1 1 | |
| Η | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | I | i | 1 > > | |
| Du | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 i | 1 | 1 | 1 1 | 1 | ||
| Ω | 1 | 1 | 1 | l | i 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | ! 1 1 | |
| ϊ> | i 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 1 1 | 1 1 | t 1 | t t 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 t |
| 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 I 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 1 | |
| > | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 I | 1 | 1 | I 1 | 1 | 1 | 1 1 1 |
| ϋ | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 1 |
| 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 | t 1 1 |
| ω | |||||||||||||||
| ω | σ | ||||||||||||||
| H | Η | ||||||||||||||
| Ω | Ω | ||||||||||||||
| ω | Ol | 'J1 | Ol | kD | Γ- | co | σ | ,u | O | ||||||
| ΙΌ | CM | r- | σ | i—1 | H | H | m | i—1 | H | Η | H | H | u | U | |
| < | cg | CG | CQ | m | u | o | u | u | u | Ω | Ω | Ω | 2 | ||
| f*) | (Ό | n | íO | ω | m | ΓΟ | ω | n | m | m | ΟΊ | ΓΟ | Ol | η | |
| co | co | co | co | co | CO | co | co | co | co | ω | co | CO | co | CO | CO |
| 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | ai | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
φ » φ • φ « · φ φ
ΦΦΦΦ *
Obr. 1-2 φφφ * · φφ • φ φφφ · φ · φ φ φ *·* φ φ φφφφ φ φ φ φφ φφ φφ φφφ
| ω | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| υ | 1 1 1 | l 2 | í | 1 | 1 | l | 1 I | tlil |
| ο | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | I | t 1 | lili |
| ο 9 | 1 1 1 1 1 1 1 1 1 | 1 1 1 1 | í 1 f | 1 1 » | 1 1 | 1 1 t | 1 1 1 1 | lili 2 i t i 111» |
| 1 1 1 1 1 I | f 1 1 1 | 1 1 | 1 J | 1 1 | 1 1 | 1 I 1 1 | 1 J 1 i lili | |
| fc | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| Ni | 1 1 t | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| o | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| >η | 1 1 1 | 1 1 | t | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| Ε-ι | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| co | 1 1 1 | I 1 | 1 | t | i | 1 | 1 1 | lili |
| 1 1 I | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili | |
| Η | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | I 1 | 1111 |
| Η | t 1 1 | t H | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| 2 | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| co Ο Η | 1 1 1 1 1 1 1 1 1 | 1 1 1 1 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 t | < 1 1 | < 1 1 1 1 1 | ' 1 < < liti lili |
| Η | 1 t 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| κ | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | i | 1 1 | lili |
| Η | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | iiii |
| oi | t 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| > | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| 0 | 1 1 1 | 1 l | t | 1 | 1 | < | I 1 | lili |
| Η | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| Pi | 1 I 1 | 1 1 | 1 | ] | 1 | 1 | i i | liti |
| Η | 1 1 1 | 1 I | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| 2 | 1 1 1 | 1 l | u | o | o | o 1 | O 1 1 1 | lili |
| 2 | 1 t t | 1 1 | 1 | 1 | 1 | lili | ||
| Q | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | liti |
| Η ϋ | 1 1 1 1 1 I | 1 1 | J | 1 | 1 | 1 | t | 1 > i 4 | > > > > |
| 1 1 1 | 1 > 1 | 1 | 1 ( | 1 | 1 1 | 1 i 1 1 | J 1 1 1 liti | |
| 1 1 1 Ni Ni | 2 2 | Ni | Ni | 1 Ni | 1 Ni | I 1 Ni Ni | 1 J 1 1 Ni Ni Ni Ni | |
| CQ | 1 1 I | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 I | lili |
| S | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | i i | i i i i |
| ί* | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| < | 1 1 1 | 1 1 | I | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| ο | 1 t 1 | 1 1 | t | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| fc | 1 2 1 | i r | 1 | 1 | 1 | 1 | r t | iiii |
| ο | 1 1 1 | t t | 1 | 1 | 1 | t | 1 1 | lili |
| q | 1 i 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| & | 1 1 1 1 1 1 | 1 1 1 1 | 1 I | 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 1 1 | lili lili |
| 1 1 1 t 1 1 | 1 1 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 1 1 | lili lili | |
| C0 | 1 1 1 | 1 I | 1 | 1 | 1 | l | 1 1 | lili |
| 2 | 1 1 t | 1 1 | 1 | 1 | r | 1 | 1 1 | lili |
| 2 | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili | |
| > | 1 1 1 | 1 ! | 1 | 1 | 1 | t | 1 1 | lili |
| 2 | 1 1 1 | 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | I 1 1 1 |
| > | 1 1 1 | » s | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | liti |
| Ni | I 1 I | I 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | lili |
| fc O σ | i >1 >< 1 1 1 1 1 1 | řH >1 1 1 1 1 | 1 1 | 1 1 | t 1 | r 1 | í* 1 1 1 I | >4 >4 tlil lili |
< CQ σ σι Η ι-4
| co | fN | ÍN | <0 | o | 00 | σ | U | U | |||||||
| lb | (N | > | σ | H | i—l | H | m | H | i—1 | H | H | H | U | U | |
| ra | m | ffl | u | U | U | u | U | Q | Q | Q | 2 | 2 | |||
| f9 | m | Γ0 | rn | rn | m | m | m | m | m | ΓΏ | rn | m | m | m | m |
| <0 | co | co | co | co | co | co | CO | CO | co | CO | CO | ca | CO | CO | co |
| 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
Obr. 1-3
| < | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 I | 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| > | 1 | 1 | 1 | ι | 1 1 | 111)1 | ϊ | 1 | 1 | t |
| w | I | 1 | 1 | 1 1 | lílli | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| ω | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 1-1 | ( | 1 | 1 | ί | 1 1 | 1 1 1 1 1 | ) | 1 | 1 | 1 |
| £ | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| CL | ι | 1 | 1 | 1 | 1 1 | ι 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| K | 1 | 1 | 1 | J | 1 1 | 11111 | J | 1 | 1 | 1 |
| CL | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| > | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1)111 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| H | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| > | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| ω | 1 | 1 | 1 | 1 | I 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 I ι | 1 | 1 | 1 | 1 |
| CL | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | ί | 1 | 1 | 1 |
| CL | r | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| g | Η I | Η | Η I | Η 1 | Εη η 1 | | Η Η E-ι Η Η 1 1 1 1 L | Η | Η | Η | Η |
| H | 1 | 1 | 1 | 1 | ) 1 | ί 1 1 ί 1 1 1 1 1 1 | 1 1 | 1 t | 1 1 | 1 1 |
| < | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| i-q | 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 1 1 | 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 | i I | 1 1 | 1 1 | 1 1 |
| ►q | 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 1 1 | 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 1 |
| Ctí | ί | 1 | 1 | 1 | 1 1 | ) 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| < | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| < | 1 | 1 | 1 | 1 1 | ι ι ι ι ι | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| H | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | ί | 1 | 1 | 1 | |
| ω | 1 | 1 | [ | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| < | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | t | 1 | 1 | 1 | |
| σ | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| ο | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1)111 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| > | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Η | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Ο | 1 | r | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Η | 1 | I | 1 | 1 1 | ι ι ι ι ι | 1 | 1 | 1 | ||
| ο | 1 | 1 | ο | 1 1 | 1)111 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| /1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 I | 1 | 1 | 1 | ||
| W | 1 | 1 | 1 | ) 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| ω μ. | 1 | 1 I | 1 1 | 1 J | 1 Η 1 ι | Ε-1 Η Η Η ι lilii | 1 | 1 | 1 | |
| < Ρΐ | 1 1 | 1 | 1 1 | ι ω 1 1 | U) W W W > I 1 ι I | > | 1 > | ω | ω | |
| ί—1 Η | 1 | 1 | 1 1 | 1 | 1 1 1 1 | 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 Η | 1 Η |
| « | 1 | 1 | 1 | I | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Κ | t | I | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 ) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| υ | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Η | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 111)1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | ι ι ι ι ι | 1 | 1 | 1 | 1 |
| υ | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | I | 1 | 1 | 1 |
| Η | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | ι ι ι ι ι | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Σ | Η | Η | Η | Η | Η Η | Η 1—1 Η 1—1 H | Η | Η | H | |
| Η | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 I 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Ο | [ | 1 | 1 | 1 | ι t | tlili | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | 1 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | ι 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Ο | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 | ι ι ι ι ι | 1 | 1 | 1 | 1 |
| ο | 1 | 1 | 1 | 1 | ί 1 | ι 1 1 1 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
cn ch
Η H
| ω | οι | οι | 0- | C0 | ΟΊ | .0) | ο | ||||||||
| LD | CN | Γ* | γΗ | Η | Η | ΓΩ | Η | Η | τΗ | Η | Η | υ | ο | ||
| m | CQ | ca | £Χ) | υ | υ | υ | υ | υ | Q | ο | α | κ | κ | ||
| η | ΓΩ | ΡΩ | η | ΡΩ | ΡΩ | ΓΩ | ΓΩ | ΓΩ | ΓΩ | ΓΩ | ΓΩ | ΓΩ | ΓΩ | ΓΩ | ΓΩ |
| ω | C0 | ω | W | ω | C0 | C0 | CQ | W | ω | ω | W | ω | ω | to | C0 |
| 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
9 9
Obr.
1-4 ···· »
NS3A5 LSTTGEIP F YGKAIPLE AI KGGRHLI FCHS KKKCDE LAAKLTALGVNAVAYYRG LDVSVI
Cm
Cu
| 1 1 1 1 1 | G | g | G | G | G | H | H | H | H | H I |
| 1 1 1 l 1 1 | 1 1 | 1 1 | 1 | 1 1 | 1 1 | > | tu | |||
| 1 1 1 | w | w | w | ω | w | 1 | 1 | 1 | U | O |
| > > > | ω | ω | ω | ω | Ui | > | > | > | CO | W |
Cm
O
Η f—1 σ σ\ H i—I G G
| ko | CN | -šP | 03 | kO | Γ | co | σ | U | U | |||||
| 01 | r- | σ | i—1 | rd | t—1 | m | H | H | i—1 | (—1 | rd | u | u | |
| < | m | CQ | CQ | u | U | U | O | U | G | G | Q | w | 2 | |
| ω | n | n | m | ω | m | m | n | ro | m | n | ro | n | m |
Obr. 1-5 «9 0 · ··· 9 9«
9 009999·· * « 9 0099 ···
0990 · 9· 99 ·· ·♦·
| _ | o | i—1 rd | OJ H | ro c4 | H | in rH | ω rd | Γ- 1—1 | CD 1—I | ||||||
| ro | iri | ÍO | Γ | OD | Cl | H | |||||||||
| O | O | O | o | o | O | o | o | O | o | o | o | o | o | o | o |
| £ | fe | £ | a | s | 2; | Z | z | z | z | z | z | z | z | z | |
| Q | Q | Q | o | Q | G | Q | D | Q | Q | Q | Q | G | Q | Q | Q |
| H | t-t | 1-1 | H | H | H | H | H | H | H | H | H | w | H | H | H |
| σ | σ | a | σ | σ | σ | σ | σ | G | G | G | G | G | G | G | G |
| K | ω | ca | W | ca | ca | ca | ca | ca | ca | ca | ta | ca | ca | ca | ca |
| to | co | co | U) | V) | ω | co | CO | co | co | co | co | co | co | co | co |
| co | 1 | 1 | 1 | Oí | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| fc. | 1 | 1 | l | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | H | 1 | t | 1 | |||
| Q | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | t | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| > | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | t | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||||
| O | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | t | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| H | t | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | » | |||
| > | I | 1 | 1 | 1 | t | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||||
| O | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| H | 1 | 1 | ! | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| S | 1 | 1 | t | 1 | f | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| O | 1 | 1 | 1 | 1 | t | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| Q | ! | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| H | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| > | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| co | I | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | l | 1 | |||
| G | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | t | 1 | |||
| Uj | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| Q | t | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| O rj | 1 I | 1 | 1 | 1 I | 1 I | 1 1 | 1 | | 1 I | 1 | 1 1 | 1 | | 1 | |||
| 1 1 | 1 | G | En | &4 | Cn | G | Cil | G | I | 1 | 1 | G | G | ||
| o | t | 1 | 1 | 1 | I | 1 | 1 | 1 | t | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| H | 1 | 1 | 1 | 1 | t | 1 | 1 | 1 | l | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| S | 1 | 1 | 1 | l | t | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| G | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| G | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| H | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| 1 1 1 | 1 1 I | 1 t 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 l | 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | |||
| Q | 1 1 1 | 1 1 1 | l 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | t 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 t 1 | 1 1 1 | 1 ! 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | ||
| O | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| CO | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| H | 1 | r | 1 | 1 | 1 | 1 | [ | [ | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| CL | 1 | 1 | 1 | i | f | 1 | 1 | J | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
cn σι Η i—1
G G
| co | 05 | 05 | co | Γ* | co | σ | U | u | |||||||
| in | CN | b- | Ch | r-t | r-t | H | ro | i—l | i—l | i—i | t-1 | t-1 | u | u | |
| BQ | CQ | ffl | CQ | u | u | u | u | u | Q | Q | Q | I | X | ||
| ro | ro | ro | ro | ro | ro | ro | ro | ro | ro | ro | ro | ro | ro | to | ro |
| co | CO | co | CO | CO | co | CO | CO | co | co | CO | CO | CO | CO | CO | CO |
| z | S | Z | Z | Z | z | Z | Z | z | Z | Z | Z | Z | Z | z | z |
fc fc •
fcfcfc • * fc · • fc • •fcfc ·
Obr. 2-1 fc ·»« fc · fc • fc fc · • fc flfc ·♦
ATGGTAAGATCAAGTAGTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAAC
CACCAAGTGGAGGAGCAGGGAATTCACCATCACCATCACCACGTGGATCCCGGGCCCATG
GGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTACCCGTAGAGTCTATGGAAACCACCATGCGGTCC
CCGGTCTTTACGGATAACTCATCTCCTCCGGCCGTACCGCAGACATTCCAAGTGGCCCAT
CTACACGCCCCCACTGGTAGTGGCAAGAGCACTAAGGTGCCGGCTGCATATGCAGCCCAA
GGGTACAAGGTACTTGTCCTGAACCCATCCGTTGCCGCCACCTTAGGATTCGGGGCGTAT
ATGTCTAAAGCACATGGTGTCGACCCTAACATTAGAACTGGGGTAAGGACCATCACCACG
GGCGCCCCCATTACGTACTCCACCTACGGCAAGTTTCTTGCCGACGGTGGTTGCTCTGGG
GGCGCTTACGACATCATAATATGTGATGAGTGCCACTCGATTGACTCAACCTCCATCTTG
GGCATCGGCACCGTCCTGGATCAGGCGGAGACGGCTGGAGCGCGGCTTGTCGTGCTCGCC
ACTGCTACACCTCCGGGGTCGGTCACCGTGCCACATCCCAACATCGAGGAGGTGGCTCTG
TCCAGCACTGGAGAGATCCCCTTTTATGGCAAAGCCATCCCCATCGAGGTCATCAAAGGG
GGGAGGCACCTCATTTTCTGCCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCCGCAAAGCTA
TCGGGCTTCGGAATCAACGCTGTAGCGTATTACCGAGGCCTTGATGTGTCCGTCATACCG
ACTAGCGGAGACGTCGTTGTTGTGGCAACAGACGCTCTAATGACGGGCTTTACCGGCGAC
TTTGACTCAGTGATCGACTGTAACACATGCGTCACCCAGACAGTCGACTTCAGCTAA (SEQ ID NO 19) «
*
4
4 4 4 4
4
Obr. 2-2
444 4 4 ··
4 4 »
4»
4 » ·Μ mvrsssqnssdkpvahwanhqveeqgihhhhhhvdpgpmgvakavdfvpvesmettmrspvftd NSSPPAVPQTFQVAELHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGVDPN IRTGVRTITTGAPITYSTYGKFLADGGCSGGAYDII1CDECHSIDSTSILGIGTVLDQAETAGAR LWLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSSTGEIPFYGKAIPIEVIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKL SGFGINAVAYYRGLDVSVIPTSGDWWATDALMTGPTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFS (SEQ-ID NO 20)
Obr. 3-1 ··· • 9
999· · • · 9 * · *
99 ···
ATGGTAAGATCAAGTAGTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCA
AGTGGAGGAGCAGGGAATTCACCATCACCATCACCACGTGGATCCCGGGCCCATGGGGGTTGCGA
AGGCGGTGGACTTTATCCCCGTGGAGAGCCTAGAAACAACCATGAGGTCCCCGGTGTTCACAGAC
AACTCCTCCCCGCCAGCAGTGCCCCAGAGCTTCCAGGTGGCCCACCTGCATGCTCCCACCGGCAG
CGGTAAGAGCACCAAGGTCCCGGCCGCATATGCGGCTCAGGGCTACAAAGTGCTGGTGCTCAACC
CCTCCGTTGCTGCAACATTGGGCTTTGGTGCTTACATGTCCAAGGCCCATGGGATTGATCCTAAC
ATCAGGACTGGGGTAAGGACAATTACTACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTT
CCTTGCCGACGGCGGGTGCTCGGGGGGTGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCA
CAGATGCAACATCTATTTTGGGCATCGGCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGA
CTGGTTGTGCTTGCCACCGCTACCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCTAATATCGAGGA
GGTTGCTCTGTCCACCACCGGAGAGATCCCCTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTTGAGGCAATCA
AAGGGGGGAGACATCTCATCTTCTGCCACTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGCCAAACCG
GTCGCGTTGGGTGTCAATGCCGTGGCTTACTACCGCGGCCTTGACGTGCCCGTCATCCCGACCAG
TGGCGATGTTGTCGTCGTGGCAACTGATGCTCTCATGACCGGTTTTACCGGTGACTTCGACTCGG
TGATAGACTGTAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGACTTCAGCTAA (SEQ ID NO 21) » · ··· t
Obr. 3-2 • » MM » • · 4 · * · «· ·· ·· ♦*· mvrsssqnssdkpvahwanhqveeqgihhhhhhvdpgpmgvakavdfipveslettmrspvftd nssppavpqsfqvahlhaptgsgkstkvpaayaaqgykvlvlnpsvaatlgfgaymskahgidpn
IRTGVRTITTGSPITYSTYGKFLADGGCSGGAYDIIICDECHSTDATSILGIGTVLDQAETAGAR
LWLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSTTGEIPFYGKAIPLEAIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKP
VALGVNAVAYYRGLDVPVIPTSGDWWATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFS (SEQ ID NO 22)
V »
Λ · 9
999
Obr. 4-1 • » ··· • ♦ · · · * * ··
ATGGTAAGATCAAGTAGTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAAC caccaagtggaggagcagggaattcaccatcaccatcaccacgtggatcccgggcccatg
GCCGCGGGATTGGGCCCCCCCATAGGTGTAGCAAAAGCCCTACAGTTCATACCAGTGGAA
ACCCTTAGTACGCAGGCTAGGTCTCCATCTTTCTCTGACAATTCAACTCCTCCTGCTGTC
CCACAGAGCTATCAAGTAGGGTATCTTCATGCCCCGACCGGCAGCGGTAAGAGCACAAAG
GTCCCGGCCGCTTATGTAGCACAAGGATATAATGTTCTCGTGCTGAATCCATCGGTGGCG
GCCACACTAGGCTTCGGCTCTTTCATGTCGCGTGCCTATGGGATCGACCCCAACATCCGC
ACTGGGAACCGCACCGTCACAACTGGTGCTAAACTGACCTATTCCACCTACGGTAAGTTT
CTCGCGGACGGGGGTTGCTCCGGGGGGGCATATGATGTAATTATCTGTGATGAATGTCAT
GCCCAAGACGCCACTAGCATATTGGGCATAGGCACGGTCTTAGATCAGGCCGAGACGGCT
GGGGTGAGGCTGACGGTTTTAGCGACAGCAACTCCCCCAGGCAGCATCACTGTGCCACAT
TCTAACATCGAGGAAGTGGCCCTGGGCTCTGAAGGTGAGATCCCTTTCTACGGTAAGGCT
ATACCGATAGCCCTGCTCAAGGGGGGGAGACACCTCGTCTTTTGCCATTCCAAGAAAAAA
TGTGATGAGCTAGCATCCAAACTCAGAGGTATGGGGCTCAACGCTGTGGCGTACTATAGG
GGTCTCGATGTTTCCGTCATACCAACAACAGGAGACGTCGTGGTCTGCGCTACTGACGCC
CTCATGACTGGATTCACTGGAGACTTCGATTCTGTCATAGACTGCAACGTGGCTGTTGAA
CAGTACGTTGACTTCAGCTAA (SEQ ID NO 23)
Obr. 4-2 • ··· » # · * * ··· * * » · · · · · · ·* ·· ·· ··
MVRSSSQNSSDKPVAHWANHQVEEQGIHHHHHHVDPGPMAAGLGPPIGVAKALQFIPVE TLSTQARSPSFSDNSTPPAVPQSYQVGYLHAPTGSGKSTKVPAAYVAQGYNVLVLNPSVA ATLGFGSFMSRAYGIDPNIRTGNRTVTTGAKLTYSTYGKFLADGGCSGGAYDVIICDECH AQDATSILGIGTVLDQAETAGVRLTVLATATPPGSITVPHSNIEEVALGSEGEIP FYGKA IPIALLKGGRHLVFCHSKKKCDELASKLRGMGLNAVAYYRGLDVSVIPTTGDWVCATDA LMTGFTGDFDSVIDCNVAVEQYVDFS (SEQ ID NO 24) * 0
0 • *00
Obr. 5-1
0
000* *
0 0 ** 00
00
ATGGTAAGATCAAGTAGTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAAC CACCAAGTGGAGGAGCAGGGAATTCACCATCACCATCACCACGTGGATCCCGGGCCCATG GCCGCGGGATTGGGCCCCACCATAGGTGTAGCAAAAGCCCTACAGTTCATACCAGTGGAA ACCCTTAGCACACAGGCTAGGTCTCCATCTTTCTCTGACAATTCAACTCCTCCTGCTGTT CCACAGAGCTATCAAGTAGGGTACCTTCATGCCCCGACCGGCAGCGGTAAGAGCACAAAG GTCCCGGCCGCTTATGTAGCACAAGGATATACTGTTCTCGTGCTGAATCCATCGGTGGCG GCCACACTAGGCTTCGGCTCTTTCATGTCGCGTGCCTATGGGATCGACCCCAACATCCGC ACTGGGAACCGCACCGTTACAACTGGTGCTAAACTGACCTATTCCACCTACGGTAAGTTT CTTGCGGATGGGGGTTGCTCCGGGGGGGCATATGATGTGATTATCTGTGATGAGTGTCAT GCCCAAGACGCTACTAGCATATTGGGTATAGGCACGGTCTTAGATCAGGCCGAGACGGCT GGGGTGAGGCTGACGGTTTTAGCGACAGCGACCCCCCCAGGCAGCATCACTGTGCCACAT TCTAACATCGAAGAAGTGGCCCTGGGCTCTGAGGGTGAGATCCCCTTCTACGGCAAGGCT ATACCGATATCCCTGCTCAAGGGGGGGAGGCACCTTATCTTTTGCCATTCCAAAAAAAAG TGTGATAAGATAGCGTCCAAACTCAGAGGCATGGGGCTCAACGCTGTAGCGTACTATAGA GGTCTCGATGTGTCCGTCATACCAACAACAGGAGACGTCGTAGTTTGCGCTACTGACGCC CTCATGACTGGATACACCGGGGACTTCGATTCTGTCATAGACTGCAACGTGGCTGTTGAA CAGTACGTTGACTTCAGCTAA (SEQ ID NO 25) •
• 44 ·
* «44«
Obr. 5-2
4 444 • 4 ·· ·«
MVRSSSQNSSDKPVAHWANHQVEEQGIHHHHHHVDPGPMAAGLGPTIGVAKALQFIPVE TLSTQARSPSFSDNSTPPAVPQSYQVGYLHAPTGSGKSTKVPAAYVAQGYTVLVLNPSVA ATLGFGSFMSRAYGIDPNIRTGNRTVTTGAKLTYSTYGKFLADGGCSGGAYDVIICDECH AQDATSILGIGTVLDQAETAGVRLTVLATATPPGSITVPHSNIEEVALGSEGEIPFYGKA IPIS LLKGGRH LIFCHS KKKC DKI AS KLRGMGLNAVAYYRGLDVS VIP T TG D VWCAT DA LMTGYTGDFDSVIDCNVAVEQYVDFS (SEQ ID NO 26) φ
φ «φφ φ φ φφφ φ φ ···· φ φ φ • Φ «φ
Obr. 6-1
ATGGTAAGATCAAGTAGTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAAC
CACCAAGTGGAGGAGCAGGGAATTCACCATCACCATCACCACGTGGATCCCGGGCCCATG
GGCGTGGCCAAGTCCATAGACTTCATCCCCGTTGAGACACTCGACATCGTTACGCGGTCC
CCCACCTTTAGTGACAACAGCACGCCACCGGCTGTGCCCCAGACCTATCAGGTCGGGTAC
TTGCATGCCCCAACCGGCAGCGGAAAGAGCACCAAAGTCCCCGTCGCATACGCCGCCCAG
GGGTATAAAGTGTTAGTGCTCAATCCCTCGGTGGCTGCTACCCTGGGGTTTGGAGCGTAC
CTGTCCAAGGCACACGGCATCAATCCCAACATTAGGACTGGAGTCAGGACTGTGACGACT
GGCGAAGCCATCACGTACTCCACGTATGGCAAATTCCTCGCCGATGGGGGCTGCGCAGGT
GGCGCCTATGACATCATCATATGCGATGAATGCCACGCCGTGGATGCCACTACCATTCTC
GGCATCGGAACAGTCCTTGACCAAGCAGAGACAGCCGGGGTCAGGCTAACTGTGCTGGCT
ACGGCCACGCCCCCCGGGTCAGTGACAACCCCCCATCCCAACATAGAGGAGGTAGCCCTC
GGGCAGGAGGGTGAGACCCCCTTCTATGGGAGGGCGATCCCCCTGTCTTACATCAAGGGA
GGGAGACACTTGATCTTCTGCCACTCAAAGAAAAAGTGTGACGAGCTCGCGGCGGCCCTC
CGGGGCATGGGCCTGAACGCTGTGGCGTACTACAGAGGGCTCGACGTCTCCGTAATACCA
GCTCAGGGAGATGTAGTGGTCGTCGCCACCGACGCCCTCATGACGGGGTTCACTGGAGAC
TTTGACTCCGTGATCGACTGCAATGTAGCGGTCACTCAAGTTGTAGACTTCAGCTAA (SEQ ID NO 27) • *
9
Obr. 6-2 • 9
9
9
9999 » * 9 999 • 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 « 99 99
MVRSSSQNSSDKPVAHWANHQVEEQGIHHHHHHVDPGPMGVAKSIDFIPVETLDIVTRS PTFSDNSTPPAVPQTYQVGYLHAPTGSGKSTKVPVAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAY LSKAHGINPNIRTGVRTVTTGEAITYSTYGKFLADGGCAGGAYDIIICDECHAVDATTIL GIGTVLDQAETAGVRLTVLATATPPGSVTTPHPNIEEVALGQEGETPFYGRAIPLSYIKG GRHLIFCHSKKKCDELAAALRGMGLNAVAY YRGLDVSVI PAQGDWWATDALMTG FTGD FDSVIDCNVAVTQWDFS (SEQ ID NO 28) • φ • ···
9 9 · * 9 φ
9 9 9 9 Φ
99 99 «9«
Obr. 7-1 atggtaagatcaagtagtcaaaattcgagtgacaagcctgtagcccacgtcgtagcaaac
CACCAAGTGGAGGAGCAGGGAATTCACCATCACCATCACCACGTGGATCCCGGGCCCATG
GGCGTAGCCAAATCCATTGACTTCATCCCTGTTGAATCTCTCGATATCGCCTCACGGTCA
CCCAGTTTCTCTGACAACAGCACGCCACCAGCTGTGCCTCAGTCCTACCAGGTGGGCTAT
TTGCACGCGCCAACGGGCAGCGGGAAGAGCACCAAGGTCCCTGTCGCATATGCTAGTCAG
GGGTATAAAGTACTCGTGCTAAATCCCTCTGTCGCGGCCACGCTCGGCTTCGGGGCCTAC
ATGTCCAAAGCCCACGGGATCAACCCCAACATCAGAACCGGGGTACGGACTGTGACCACC
GGGGACCCCATCACCTACTCCACTTATGGCAAGTTTCTCGCAGATGGGGGCTGCTCAGCC
GGCGCCTATGATGTCATCATATGCGATGAATGCCACTCAGTGGACGCTACTACCATCCTT
GGCATTGGAACAGTCCTCGACCAGGCCGAGACCGCGGGTGCTAGGTTAGTGGTTTTAGCC
ACAGCCACGCCTCCTGGTACAGTGACAACTCCTCATAGCAACATAGAGGAGGTGGCTCTT
GGTCATGAAGGCGAGATCCCTTTCTACGGCAAGGCTATTCCCCTAGCTTTCATCAAGGGG
GGCAGACACCTAATCTTTTGCCATTCAAAGAAGAAGTGCGATGAGCTCGCGGCAGCCCTT
CGGGGCATGGGTGTCAACGCCGTTGCTTACTATAGGGGTCTCGACGTCTCTGTTATACCA
ACTCAAGGAGACGTGGTGGTCGTTGCCACCGATGCCCTAATGACTGGATACACCGGTGAC
TTTGACTCTGTTATTGACTGCAACGTTGCGGTCTCTCAAATTGTAGACTTCAGCTAA (SEQ ID NO 29) • 4
4444 ·
Obr. 7-2 « 4 4 4 4 4 4 ·« 44 44 44· mvrsssqnssdkpvahwanhqveeqgihhhhhhvdpgpmgvaksidfipvesldiasrs PSFSDNSTPPAVPQSYQVGYLHAPTGSGKSTKVPVAYASQGYKVLVLNPSVAATLGFGAY MSKAHGINPNIRTGVRTVTTGDPITYSTYGKFLADGGCSAGAYDVIICDECHSVDATTIL GIGTVLDQAETAGARLWLATATPPGTVTTPHSNIEEVALGHEGEIPFYGKAIPLAFIKG GRHLIFCHSKKKCDELAAALRGMGVNAVAY YRGLDVSVIPTQGDWWATDALMTGYTGD FDSVIDCNVAVSQIVDFS (SEQ ID NO 30) •
φ φ
φφ φ φ φ· φ · • » φ φ φφφφ φ φ · φφφ φ φ φ · · φ φ φ φ φφ φ*
Obr. 8-1
ATGGTAAGATCAAGTAGTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAAC
CACCAAGTGGAGGAGCAGGGAATTCACCATCACCATCACCACGTGGATCCCGGGCCCATG
GGCGTAGCCAAATCCATTGACTTCATCCCCGTTGAGTCTCTCGACATCGTGACTAGGTCT
CCAAGCTTCACTGACAACAGTACACCTCCAGCCGTGCCTCAGACCTACCAAGTGGGGTAT
CTCCACGCGCCCACTGGTAGCGGGAAGAGTACCAAGGTCCCTGCAGCGTACGCCGCTCAG
GGGTACAAGGTGCTGGTACTGAACCCCTCCGTGGCTGCCACTTTGGGATTTGGGGCCTAC
ATGTCAAAAGCGCACGGAGTCAATCCCAATATCAGGACCGGGGTTCGCACGGTGAACACT
GGGGATCCCATCACCTACTCCACGTATGGCAAATTCCTCGCAGATGGAGGCTGCTCTGGA
GGCGCCTATGGCATCATAATATGCGACGAATGCCATTCGACGGACTCCACGACCATCCTC
GGCATCGGGACCGTTCTCGACCAAGCTGAGACAGCTGGAGTTAGGTTGGTGGTCTTGGCC
ACGGCGACCCCACCCGGATCTGTAACAACCCCACACCCCAACATAGAGGAGGTGGCCCTC
GGCCACGAGGGCGAAATCCCCTTCTATGGGAAGGCCATCCCTCTCTCAACCATCAAGGGA
GGACGACATCTAATCTTCTGTCATTCAAAGAAAAAGTGCGACGAGCTCGCGGTGGCCCTC
CGAGCGATGGGCCTTAACGCGGTGGCATACTACAGAGGGCTTGACGTCTCCGTGATACCA
ACACAAGGAGACGTGGTGGTCGTCGCCACCGACGCCCTCATGACAGGATATACTGGAGAC
TTCGACTCTGTGATCGACTGCAACATGGCGGTCTCTCAAATTGTAGACTTCAGCTAA
V (SEQ ID NO 31) * * • 000 ·
· « v
0 «
Φ 0
0000 0
0
0
0
0
Obr. 8-2 ··
MVRSSSQNSSDKPVAHWANHQVEEQGIHHHHHHVDPGPMGVAKSIDFIPVESLDIVTRS PSFTDNSTPPAVPQTYQVGYLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAY MSKAHGVNPNIRTGVRTVNTGDPITYSTYGKFLADGGCSGGAYGIIICDECHSTDSTTIL GIGTVLDQAETAGVRLWLATATPPGSVTTPHPNIEEVALGHEGEIPFYGKAI PLSTI KG GRHLIFCHSKKKCDELAVALRAMGLNAVAYYRGLDVSVIPTQGDWWATDALMTGYTGD FDSVIDCNMAVSQIVDFS
Claims (35)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Imunotest s antigenem na pevné fázi za přítomnosti redukčního činidla.
- 2. Metoda pro produkci nebo provádění imunotestu podle nároku 1, kde je dané redukční činidlo přidané k dané pevné fázi během procesu potahování, blokování a/nebo fixace daného antigenů na danou pevnou fázi nebo během předběžné úpravy pevné fáze.
- 3. Metoda podle nároku 2, kde je redukční činidlo přidáno k pevné fázi během potahování pevné fáze antigenem.
- 4. Metoda podle nároku 2, kde je redukční činidlo přidáno k pevné fázi během blokování pevné fáze s antigenem aplikovaným v přítomnosti nebo nepřítomnosti redukčního činidla.
- 5. Metoda podle nároku 2, kde je dané redukční činidlo přidané k pevné fázi během procesu fixace dané pevné fáze obsahující antigen na ní aplikovaný v přítomnosti nebo nepřítomnosti redukčního činidla.
- 6. Metoda podle nároku 2, kde je dané redukční činidlo přidané během předběžné úpravy pevné fáze obsahující antigen na ní aplikovaný v přítomnosti nebo nepřítomnosti redukčního činidla.
- 7. Metodu podle jakéhokoliv nároku 1 až 6, kde je daným redukčním činidlem DTT, DTE nebo TCEP.
- 8. Metoda podle jakéhokoliv nároku 1 až 7, kde je dané redukční činidlo použité v koncentračním rozsahu 0,1 mM až 1 M, zejména v rozsahu 0,5 mM až 500 mM, nebo ještě spíše v rozsahu 1 mM až 25 mM, přičemž některé aplikace můžou vyžadovat rozsah 0,5 až 50 mM, 1 až 300 mM, 2 až 20 mM, 5 až 15 mM nebo okolo 10 mM.
- 9. Metody podle kteréhokoliv z nároků 2 až 8, kde je daným antigenem HCV NS3 protein.
- 10. Imunotest na pevné fázi připravený podle jakéhokoliv z nároků 2 až 9.• 9 « « v · · * ··· 9 · · »9 9 · 9 9 9 « » 9 9 9 9 * 9 99999 9 »· »« ·· ··
- 11. ELISA připravená metodou podle jakéhokoliv z nároků 2 až9.
- 12. ELISA podle nároku 11 kde je dané redukční činidlo přidané při potahování a/nebo fixaci.
- 13. QUICK test připravený metodou podle jakéhokoliv z nároků 2 až 9.
- 14. QUICK test podle nároku 13, kde je dané redukční činidlo přidané při blokovacím kroku.
- 15. Linkový imunotest test připravený metodou podle jakéhokoliv z nároků 2 až 9.
- 16. Linkový imunotest podle nároku 15, kde je dané redukční činidlo přidané při blokovacím kroku.
- 17. Použití jakéhokoliv testu podle nároků 10 až 16 pro použití v in vitro diagnostice protilátek získaných proti antigenu popsanému v nároku 1.
- 18. HCV NS3 protein upravený metodou zahrnující kroky sulfonace a následné desulfonace
- 19. HCV NS3 protein podle nároku 18, který je dále upravený detergentem s obojetným ionem, nejlépe s Empigenem.
- 20. Metoda purifikace rekombinantně exprimovaného proteinu obsahujícím cystein, která se sestává z nejméně 2, lépe ze 3 nebo 4 a nejlépe ze všech následujících kroku:(a) sulfonace lyzátu rekombinantních hostitelských buněk nebo lýze rekombinantních hostitelských buněk za přítomnosti guanidin chloridu (přednostně 6 M Gu.HCl) a sulfonace buněčného lyzátu, (b) úprava detergentem s obojetným ionem (zwitterionic detergent), přednostně po odstranění buněčných zbytků, (c) purifikace sulfonovaných rekombinantních proteinů nebo purifikace sulfonovaných rekombinantních proteinů s následným odstraněním detergentu s obojetným ionem, přičemž pro zmíněnou purifikaci se prferuje chromatografie, zejména Ni-IMAC chromatografie, kde je daný rekombinantní protein rekombinantníra proteinem s His-kotvou (His-tagged), (d) desulfonace sulfonovaného rekombinantního proteinu nejlépe molárním přebytkem redukčního činidla jako je DTT, (e) uchování za přítomnosti molárního přebytku DTT.• 4 • 4·4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 * • 4 · 4 4 4 |« ·· ···
- 21. Polynukleová kyselina HCV kódující HCV NS3 polypeptid, jak je ukázáno na obr. 1 (SEQ ID NO 3-18), nebo specifická část polynukleové kyseliny HCV, zejména polynukleová kyselina se sekvencí uvedenou v obr. 2-1, 3-1, 4-1, 5-1, 6-1, 7-1 a 8-1 (SEQ ID NO 19, 21, 23, 25, 27, 29 a 31).
- 22. Polynukleová kyselina HCV podle nároku 21 jak je znázorněná na obr. 2-1, 3-1, 4-1, 5-1, 6-1, 7-1 nebo 8-1 a charakterizovaná faktem, že její produkt nereaguje falešně . pozitivně s HCV vzorky nebo jejich část, která kóduje NS3 * epitop, který nereaguje falešně pozitivně s pozitivními HCV r vzorky.
- 23. Rekombinantní vektor obsahující polynukleovou kyselinu nároku 21 nebo 22.
- 24. Hostitelská buňka obsahující vektor nároku 23.
- 25. Metoda pro detekci sekvence nukleové kyseliny podle nároku 21 nebo 22 zahrnující:- kontakt dané nukleové kyseliny se sondou- určení komplexu vytvořeného mezi danou nukleovou kyselinou a danou sondou.
- 26. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 21 nebo 22 nebo její fragment použitá jako sonda nebo primer pro detekci nukleové kyseliny podle nároku 21 nebo 22.
- 27. Diagnostická souprava pro detekci sekvence nukleové kyseliny podle nároku 21 nebo 22, obsahující alespoň jeden primer a/nebo alespoň jednu sondu podle nároku 26.
- 28. HCV polypeptid s částí nebo celou aminokyselinovou sekvencí polypeptidu kódovaného polynukleovou kyselinou r podle nároku 21 nebo 22.
- 29. HCV NS3 helikázový protein nebo jeho část obsahující buď • S12Q0, A1384, P14Q7, V1412, P1424 nebo F1444, nebo kombinaci těchto aminokyselin s kteroukoliv z následujících aminokyselin L1201, S1222, 11274, S1289, T1321, A1323, T1369, L1382, V1408, A1409, F1410.
- 30. Farmaceutickou směs obsahující polypeptid podle nároku 28 nebo 29, nebo jakékoliv jejich funkčně ekvivalentní varianty nebo fragmenty.• 9 9·· • * v ·9 9 9 » ’ί··*·· ·9999 9 ·· ·· »· ···
- 31. Farmaceutickou směs obsahující polypeptid podle nároku 28 nebo 29, nebo jakékoliv jejich funkčně ekvivalentní varianty nebo fragmenty pro použití jaké lék pro prevenci nebo léčení HCV infekce.
- 32. Metodu pro detekci polypeptidu podle nároku 28 nebo 29 zahrnující:- kontakt daného polypeptidu s ligandem vážícímu se k danému polypeptidu > - určení komplexu vytvořeného mezi daným polypeptidem a daným * ligandem.4
- 33. Ligand vážící se k polypeptidu podle nároku 28 nebo 29.*
- 34. Směs obsahující alespoň ligand podle nároku 33, ve farmaceuticky přijatelné pomocné látce pro použití jako lék
- 35. Metoda přípravy polypeptidu podle nároku 28 nebo 29 pro diagnostické nebo léčebné účely.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98870087 | 1998-04-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20003819A3 true CZ20003819A3 (cs) | 2001-10-17 |
| CZ298268B6 CZ298268B6 (cs) | 2007-08-08 |
Family
ID=8237028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20003819A CZ298268B6 (cs) | 1998-04-17 | 1999-04-15 | Imunodiagnostický test používající redukující cinidla |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7935490B2 (cs) |
| EP (2) | EP1071955B2 (cs) |
| JP (2) | JP2002512370A (cs) |
| KR (1) | KR20010042807A (cs) |
| CN (1) | CN1305589A (cs) |
| AT (2) | ATE401340T1 (cs) |
| AU (1) | AU751362B2 (cs) |
| BR (1) | BRPI9909678B8 (cs) |
| CA (2) | CA2324970C (cs) |
| CY (1) | CY1108424T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ298268B6 (cs) |
| DE (2) | DE69939132D1 (cs) |
| DK (2) | DK1471074T3 (cs) |
| ES (2) | ES2230851T5 (cs) |
| HU (1) | HUP0101719A3 (cs) |
| IL (1) | IL138791A0 (cs) |
| PL (1) | PL343469A1 (cs) |
| PT (2) | PT1471074E (cs) |
| TR (4) | TR200101648T2 (cs) |
| WO (1) | WO1999054735A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA200005445B (cs) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1555270A1 (en) * | 1998-06-24 | 2005-07-20 | Innogenetics N.V. | HCV NS3 proteins and nucleic acids |
| US6960569B2 (en) * | 2000-08-17 | 2005-11-01 | Tripep Ab | Hepatitis C virus non-structural NS3/4A fusion gene |
| US7022830B2 (en) | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
| AR035868A1 (es) | 2001-04-24 | 2004-07-21 | Innogenetics Nv | Un acido nucleico recombinante que codifica una proteina de un peptido lider de lisozima de ave o equivalente funcional, un vector que lo comprende, una celula huesped, un metodo para producir una proteina de envoltura del hcv o una parte de la misma. |
| JP2004108914A (ja) * | 2002-09-18 | 2004-04-08 | Kudo Norio | コラーゲンの測定方法 |
| EP1558283A2 (en) * | 2002-11-08 | 2005-08-03 | Innogenetics N.V. | Hcv vaccine compositions comprising e1 and ns3 peptides |
| US20050014136A1 (en) * | 2003-05-28 | 2005-01-20 | Innogenetics N.V. | Modified HCV NS5 |
| CN1871518B (zh) | 2003-10-28 | 2010-08-25 | 株式会社先端生命科学研究所 | 丙型肝炎病毒的检测方法 |
| CA2657223A1 (en) * | 2006-07-07 | 2008-01-10 | Pall Corporation | Use of denaturing agents during affinity capture |
| US20100304353A1 (en) * | 2007-07-16 | 2010-12-02 | Pfizer Inc | Methods of improving a genomic marker index of dairy animals and products |
| CN101970688A (zh) * | 2007-09-12 | 2011-02-09 | 美国辉瑞有限公司 | 遗传标记和相关上位相互作用的使用方法 |
| EP2205766A4 (en) * | 2007-10-03 | 2012-12-12 | Pfizer | GENETIC MARKERS OF HORN AND CORNE-FREE LIVESTOCK AND RELATED METHODS |
| CN101952718A (zh) * | 2007-12-17 | 2011-01-19 | 美国辉瑞有限公司 | 改善产乳动物和产品的遗传图谱的方法 |
| EP2318838B1 (en) * | 2008-07-16 | 2013-09-04 | Radiometer Medical ApS | High capacity solid phase |
| CN102081018A (zh) * | 2009-11-30 | 2011-06-01 | 希森美康株式会社 | 样品的预处理方法及hcv的免疫测定方法 |
| FR2984328B1 (fr) | 2011-12-20 | 2016-12-30 | Bio-Rad Innovations | Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c |
| US10088483B2 (en) | 2014-10-29 | 2018-10-02 | Abbott Laboratories | Subject anti-HCV antibody detection assays employing NS3 capture peptides |
| CN109870581B (zh) * | 2017-12-04 | 2021-05-04 | 厦门万泰凯瑞生物技术有限公司 | 一种定量检测HBsAg的试剂盒及方法 |
| CN109678954B (zh) * | 2018-12-29 | 2022-01-07 | 山东莱博生物科技有限公司 | 一对能够特异性识别hcv ns3蛋白的单克隆抗体及其应用 |
| CN110988362B (zh) * | 2019-12-20 | 2023-11-14 | 迈克生物股份有限公司 | 抗组蛋白抗体测定试剂、试剂盒及其使用方法 |
| CN112225783B (zh) * | 2020-09-16 | 2021-08-31 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | Hcv重组抗原及其突变体 |
| CN112285361B (zh) * | 2020-09-27 | 2023-12-05 | 中国人民解放军空军军医大学 | 排除抗-cd38单克隆抗体药物对抗人球蛋白检测干扰的试剂 |
| CN113219169B (zh) * | 2021-05-22 | 2021-12-17 | 北京金诺百泰生物技术有限公司 | 生物检测用封闭剂及其制备方法、包被板及应用该包被板的试剂盒 |
| CN115112897B (zh) * | 2021-12-10 | 2024-11-01 | 中山大学附属第八医院（深圳福田） | 一种用于鉴别抗体检测生物学假阳性的方法 |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0139526A2 (en) * | 1983-10-20 | 1985-05-02 | Warner-Lambert Company | An insolubilized stable specific binding protein |
| US4616078A (en) * | 1985-04-08 | 1986-10-07 | Eli Lilly And Company | Process for purifying proinsulin-like materials |
| CA1340877C (en) * | 1987-12-28 | 2000-01-18 | Takashi Sugiyama | Elastase inhibitory polypeptide and process for production thereof by recombinant gene technology |
| EP0341439B1 (en) * | 1988-05-11 | 1993-08-04 | Abbott Laboratories | Method for increasing specificity in competitive immunoassays |
| US4923967A (en) * | 1988-09-26 | 1990-05-08 | Eli Lilly And Company | Purification and refolding of recombinant proteins |
| US6194140B1 (en) * | 1990-04-04 | 2001-02-27 | Chiron Corporation | HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility |
| EP1304335B1 (en) * | 1990-04-04 | 2009-06-10 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Hepatitis C virus protease |
| US5606031A (en) * | 1990-04-06 | 1997-02-25 | Lile; Jack | Production and purification of biologically active recombinant neurotrophic protein in bacteria |
| WO1993000365A2 (en) * | 1991-06-24 | 1993-01-07 | Chiron Corporation | Hepatitis c virus (hcv) polypeptides |
| JP3225468B2 (ja) | 1992-08-28 | 2001-11-05 | ダイナボット株式会社 | 抗体測定用試薬 |
| NZ266148A (en) | 1993-04-27 | 1997-06-24 | Innogenetics Sa Nv | Polynucleic acid compositions of hepatitis c virus sequences, hcv protein compositions and uses of both |
| DE69434295T2 (de) | 1993-11-04 | 2006-02-16 | Innogenetics N.V. | Von menschlichen T-Zellen immunodominante Epitopen des Virus der C-Hepatitis |
| ES2167372T3 (es) | 1994-06-23 | 2002-05-16 | Energy Answers Corp | Sistema para la obtencion de productos derivados de la ceniza y de energia a partir de residuos rechazados. |
| DE69526636D1 (de) * | 1994-07-29 | 2002-06-13 | Innogenetics Nv | Gereinigte hepatitis-c-virus hüllproteine zur diagnostischen und therapeutischen verwendung |
| DE4428705A1 (de) * | 1994-08-12 | 1996-02-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus |
| JPH0862219A (ja) | 1994-08-19 | 1996-03-08 | Dainabotsuto Kk | 還元型抗原に対する抗体アッセイ試薬及びそれを使用した測定方法 |
| PT804584E (pt) | 1994-10-21 | 2002-11-29 | Innogenetics Nv | Sequencias de virus da hepatite c genotipo 7 e sua utilizacao como agentes profilacticos terapeuticos e de diagnostico |
| US5705330A (en) * | 1995-04-14 | 1998-01-06 | Abbott Laboratories | Chemiluminescent immunoassay for antibody detection |
| US5616460A (en) * | 1995-06-07 | 1997-04-01 | Abbott Laboratories | Buffer composition for reagents for immunoassay |
| JP3945822B2 (ja) | 1996-05-24 | 2007-07-18 | カイロン コーポレイション | 複数エピトープ融合タンパク質 |
| KR100487455B1 (ko) * | 1997-01-13 | 2005-05-09 | 롬 앤드 하스 일렉트로닉 머티리얼스 씨엠피 홀딩스, 인코포레이티드 | 사진석판술에 의해 유도된 표면 패턴(들)이 있는 연마용 중합체 패드 및 이에 관련된 방법 |
-
1999
- 1999-04-15 CA CA002324970A patent/CA2324970C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-15 DE DE69939132T patent/DE69939132D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-15 ES ES99920678T patent/ES2230851T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-15 PT PT04103238T patent/PT1471074E/pt unknown
- 1999-04-15 DK DK04103238T patent/DK1471074T3/da active
- 1999-04-15 DE DE69920895T patent/DE69920895T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-15 CA CA2658218A patent/CA2658218C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-15 AT AT04103238T patent/ATE401340T1/de active
- 1999-04-15 PL PL99343469A patent/PL343469A1/xx unknown
- 1999-04-15 JP JP2000545027A patent/JP2002512370A/ja active Pending
- 1999-04-15 EP EP99920678A patent/EP1071955B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-15 IL IL13879199A patent/IL138791A0/xx unknown
- 1999-04-15 BR BRPI9909678A patent/BRPI9909678B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-04-15 TR TR2001/01648T patent/TR200101648T2/xx unknown
- 1999-04-15 PT PT99920678T patent/PT1071955E/pt unknown
- 1999-04-15 TR TR2001/01647T patent/TR200101647T2/xx unknown
- 1999-04-15 AT AT99920678T patent/ATE278960T1/de active
- 1999-04-15 DK DK99920678T patent/DK1071955T4/da active
- 1999-04-15 TR TR2002/02213T patent/TR200202213T2/xx unknown
- 1999-04-15 ES ES04103238T patent/ES2310701T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-15 CN CN99807283A patent/CN1305589A/zh active Pending
- 1999-04-15 HU HU0101719A patent/HUP0101719A3/hu unknown
- 1999-04-15 EP EP04103238A patent/EP1471074B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-15 AU AU38171/99A patent/AU751362B2/en not_active Expired
- 1999-04-15 WO PCT/EP1999/002547 patent/WO1999054735A1/en active IP Right Grant
- 1999-04-15 KR KR1020007011555A patent/KR20010042807A/ko not_active Ceased
- 1999-04-15 TR TR2000/03024T patent/TR200003024T2/xx unknown
- 1999-04-15 CZ CZ20003819A patent/CZ298268B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-10-05 ZA ZA200005445A patent/ZA200005445B/en unknown
-
2005
- 2005-01-05 JP JP2005000767A patent/JP3974620B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-08-02 US US11/497,259 patent/US7935490B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-10-16 CY CY20081101157T patent/CY1108424T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7935490B2 (en) | Immunodiagnostic assays using reducing agents | |
| US6416944B1 (en) | Methods of typing hepatitis C virus and reagents for use therein | |
| FI113967B (fi) | Hepatitis-C-virustesti | |
| FI118688B (fi) | Hepatiitti-C-virustyypit 4,5 ja 6 | |
| JP4641695B2 (ja) | 新規なｈｅｖ抗原性ペプチド及び方法 | |
| US20060234214A1 (en) | Methods of detecting hepatitis C virus | |
| AU2002301931B2 (en) | Improved immunodiagnostic assays using reducing agents | |
| MXPA02004052A (es) | Proteinas de hcv reversibles por redox con conformacion pseudo-nativa. | |
| MXPA00009956A (en) | Improved immunodiagnostic assays using reducing agents | |
| Bosman | Maertens et al.(43) Pub. Date: Nov. 23, 2006 | |
| US20040185061A1 (en) | Redox reversible HCV proteins with native-like conformation | |
| HK1036653B (en) | Improved immunodiagnostic assays using reducing agents |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 19990415 |