FI118688B - Hepatiitti-C-virustyypit 4,5 ja 6 - Google Patents

Hepatiitti-C-virustyypit 4,5 ja 6 Download PDF

Info

Publication number
FI118688B
FI118688B FI955224A FI955224A FI118688B FI 118688 B FI118688 B FI 118688B FI 955224 A FI955224 A FI 955224A FI 955224 A FI955224 A FI 955224A FI 118688 B FI118688 B FI 118688B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
hcv
peptide
type
antigenic
peptides
Prior art date
Application number
FI955224A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI955224A (fi
FI955224A0 (fi
Inventor
Peter Simmonds
Peng Lee Yap
Ian Hugo Pike
Original Assignee
Common Services Agency
Murex Diagnostics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB939309237A external-priority patent/GB9309237D0/en
Priority claimed from GB9400263A external-priority patent/GB9400263D0/en
Application filed by Common Services Agency, Murex Diagnostics Ltd filed Critical Common Services Agency
Publication of FI955224A0 publication Critical patent/FI955224A0/fi
Publication of FI955224A publication Critical patent/FI955224A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI118688B publication Critical patent/FI118688B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/82—Hepatitis associated antigens and antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/811—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an inorganic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/826—Viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Description

118688
Hepatiitti-C-virustyypit 4, 5 ja 6
Tekninen ala Tämä keksintö koskee vasta selvitettyjä tyypin 4 5 (HCV-4) ja tyypin 5 hepatiitti C -viruksen (HCV-5) sekvens sejä ja vasta löydettyä tyyppiä 6 (HCV-6). Erityisesti se koskee tyypin 4, 5 ja 6 hepatiitti C -viruksen etiologista agenssia ja polynukleotideja sekä immunoreaktiivisia polypeptide jä, jotka ovat hyödyllisiä immunologisissa määrityk-10 sissä HCV-4:n, HCV-5:n ja HCV-6:n havaitsemiseksi biologisissa näytteissä.
Keksinnön tausta
Akuutti virushepatiitti on tauti, joka voi johtaa krooniseen maksavaurioon. Se diagnosoidaan kliinisesti pe-15 rustuen hyvin määriteltyyn joukkoon potilaan oireita, joihin kuuluvat keltaisuus, maksan arkuus sekä seerumin ala-niiniaminotransferaasin ja aspartaattiaminotransferaasin tason kohoaminen. Seerumin immunologisia määrityksiä suoritetaan yleensä aiheuttajaviruksen spesifisen tyypin diagno-20 soimiseksi. Historiallisesti potilailla, joilla nähtiin hepatiitin oireet ja jotka eivät muuten olleet hepatiitti A-, ,·. hepatiitti B-, Epstein-Barr- eivätkä sytomegaloviruksella ]"*. infektoituneita, diagnosoitiin kliinisesti oletusarvoisesti ; I olevan ei-A-ei-B-hepatiitti (NANBH).
• · · ]· / 25 Monien vuosien ajan ei-A-ei-B-hepatiitin aiheuttaja • · · ··· ί pysyi arvoituksena. Nyt on saatu selville, että monet • · : NANBH-tapaukset aiheuttaa eri virus, josta käytetään termiä • · · V * hepatiitti C -virus (HCV). EP-patenttihakemuksessa nro 0 318 216 esitetään eräästä HCV-kannasta peräisin olevia 30 cDNA-sekvenssejä, polynukleotidikoettimia ja polypeptidejä immunologisissa määrityksissä käytettäviksi. Enemmän tietoa • · t .* . tästä kannasta tarjotaan EP-patenttihakemuksessa nro • · · *· *; 0 388 232 .
* • * HCV:n genomi koodittaa suurta polypeptidiesiastet- 35 ta, johon sisältyy rakenteellisia ja ei-rakenteellisia alu- • eitä. Yksittäinen proteiini ilmeisesti pilkotaan joukoksi 2 118688 eri proteiineja tuottamisen jälkeen. Useimmat rakenteelliset ja ei-rakenteelliset proteiinit on nyt tunnistettu in vitro RNA-translaatiosta ja ekspressiosta rekombinanttipro-teiineina. C- ja E-alueet koodattavat nukleokapsidin raken-5 neproteiineja ja vastaavasti vaipan rakenneproteiineja. Näitä seuraa ainakin viisi muuta aluetta, jotka koodittavat ei-rakenteellisia (NS) proteiineja, joiden toimintaa ei tunneta. Näiden uskotaan järjestyneen seuraavasti (A. Alberti, Journal of Hepatology, 1991, 12, 279 - 282) 10 5' 3' NCR : C : El : E2 : NS1 : NS2 : NS3 : NS4 : NS5
Tiettyjä immunoreaktiivisia proteiineja on kuvattu rekombinanttiproteiineina, esimerkiksi C22 (ydinalueella), C33 (NS3-alueella), 5-1-1 ja C100 (molemmat NS4-alueella) 15 ja NS5 (NS5-alueella). Hepatiitti C:n diagnoosi perustuu nykyisin usein menetelmiin, jotka havaitsevat C-100-kloonin tuotteen vastaisia vasta-aineita. Tämä klooni tuotettiin ligatoimalla osin päällekkäisiä klooneja suuremman virusan-tigeenin (C100) tuottamiseksi, joka vastaa osaa genomin 20 NS3-NS4-alueesta. Sitten C100 fuusioitiin ihmisen superok-sididismutaasigeenin (SOD) kanssa, ekspressoitiin käytössä suurena rekombinanttifuusioproteiinina (C100-3) ja käytet- *·· •••ί tiin kiinteässä faasissa radioleimattujen (RIA) ja entsyy- • · :.**i miin kytkettyjen immunosorbenttimääritysten (ELISA) kehit- • · :.*·· 25 tämiseksi.
HCV:n seulonnassa hyödyllisiksi väitettyjä polynuk-··*: leotideja esitetään EP-patenttihakemuksessa nro 0 398 748.
• t · EP-patenttihakemuksen nro 0 414 475 tarkoituksena on esit-tää HCV-.n lisääminen viljellyissä soluissa ja diagnostic-30 kassa käytettävien antigeenien tuotto. EP-patenttihake- • · · *... muksen nro 0 445 423 esittämän mainitaan olevan parannettu • ♦ *···* immunologinen määritys HCV-vasta-aineiden havaitsemiseksi.
• · : Veripankit Yhdistyneessä Kuningaskunnassa testaavat ·;·*: rutiininomaisesti HCV: n komponenttien vastaiset vasta- 35 aineet verenluovuttajista. Ensimmäisen polven määritykseen kuului C100-3-polypeptidien vastaisten HCV-vasta-aineiden havaitseminen. ClQ0-3-vasta-aine tunnistaa yhdistetyn poly- 118688 3 peptidiantigeenin viruksen ei-rakenteellisilla alueilla, ja se on HCV-infektion johdonmukainen merkkiominaisuus. Kuitenkin akuuteissa infektioissa tämä vasta-aine on epäluotettava johtuen serokonversion viiveestä (tyypillisesti 5 22 viikkoa) altistuksen jälkeen. Lisäksi C100-3-vasta- ainetesti ei ole spesifinen hepatiitti C -viruksen suhteen.
Toisen polven vasta-ainetesteissä käytetään rekom-binanttiantigeenejä ja/tai synteettisiä lineaarisia peptidejä, jotka edustavat rakenteellisia antigeenejä viruksen 10 erittäin konservoituneesta ydinalueesta sekä myös ei-rakenteellisia antigeenejä. On kuitenkin havaittu, että jotkin toisen polven ELlSA-testit voivat antaa vääriä positiivisia reaktioita. Rekomb i nant ti-immunob1o11ausmäärityk-sen (RIBA-2), jossa on mukana neljä antigeeniä HCV:n geno-15 mistä, on tarkoitus tuoda käytettäväksi menetelmä, jolla tunnistetaan aito HCV:n vastainen reaktiivisuus. Kuitenkin tulos voi olla "määrittelemätön". Tämän keksinnön tekijät ovat raportoineet (The Lancet, 338, 19. lokakuuta 1991) HCV-positiivisten verenluovuttajien vaihtelevasta reaktii-20 visuudesta antigeenejä 5-1-1, C100, C33 ja C22 kohtaan, ja verranneet näitä verinäytteissä olevan HCV-.n RNA:n suoriin havaintotuloksiin käyttäen polymeraasiketjureaktiota (PCR) * HCV:n polynukleotidien monistamiseksi. Kuitenkin työ osoit- I I taa, ettei HCV-infektioiden yksikäsitteinen diagnoosi ole • 1 · *· " 25 vielä mahdollinen.
φ 1 • · · ϊ·ϊ ϊ Hiljattain on löydetty uusia HCV:n tyyppejä, jotka • · :.! i poikkeavat huomattavasti toisistaaan sekvenssiltään, ja • · · ί,ί · näitä on kutsuttu HCV-2:ksi, -3:ksi ja -4:ksi. Patenttiha kemuksemme WO93/10 239 (julkaistu 27. toukokuuta 1993) ku-30 vaa tiettyjä HCV-2:n -3:n ja -4:n antigeenisiä sekvenssejä. HCV-4:n kohdalla esitetyt sekvenssit ovat vain 5'-NCR- ja *·· .· . ydinalueissa. Ensin mainittu ei koodita mitään proteiinia, * i · *·1| jota voitaisiin käyttää HCV:n immunologisessa määritykses- * 1 sä, kun taas ydinalue on yleensä konservoitunut.
• · * · · • » · * 1 · 4 118688
Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö sisältää aikaisemmin tuntemattoman tyypin 6 HCV-variantin löytämisen vertailemalla polymeraasiketjureaktiolla (PCR) HCV:n genomin tietyistä alueista 5 monistettuja sekvenssejä, joka löytö vahvistettiin fyloge-neettisellä analyysillä. Keksinnössä on tunnistettu poly-nukleotidisekvenssejä ja polypeptidejä, jotka ovat HCV-4-, HCV-5- ja HCV-6-spesifisiä. Näitä voidaan käyttää HCV-4-, HCV-5- ja HCV-6-infektion diagnosoimiseksi, ja siksi ne pi-10 täisi ottaa mukaan kaikkiin HCV-infektion lopullisiin testeihin.
Tämän keksinnön eräs puoli tuo käytettäväksi poly-nukleotidin, jolla on nukleotidisekvenssi, joka on ainutlaatuinen hepatiittiviruksen tyypille 4, 5 tai 6.
15 Sekvenssit ovat ainutlaatuisia kullekin HCV-tyy- pille siinä mielessä, ettei sekvenssiä esiinny missään muussa HCV:n tyypissä, ja siten sitä voidaan käyttää kyseisen HCV-tyypin yksinomaiseen havaitsemiseen. Sekvenssien vaihtelua HCV-4:n, -5:n ja -6:n välillä on löydetty erityi-20 sesti NS4-, NS5- ja ydinalueissa, ja siksi erityisesti juuri näistä alueista voidaan saada tyyppispesifisiä polynuk-.·. leotideja ja peptidejä. Termi tyyppispesifinen viittaa sii- [I]*. hen, että mukana on sille HCV-tyypille ainutlaatuinen sek- • ·· ! !| venssi. Lisäksi kunkin HCV-tyypin sisällä voi olla joukko t · · / " 25 alatyyppejä, joissa on vähäisiä sekvenssimuutoksia.
• · f ί·! ϊ Keksintöön sisältyy NS4-polynukleotidisekvenssejä, : jotka ovat ainutlaatuisia HCV-4:lie, HCV-5:lle ja HCV- • · · V: 6:lie. Sekvenssit voivat olla RNA- tai DNA-sekvenssejä, mu kaan lukien cDNA-sekvenssit. Tarvittaessa DNA-sekvenssejä ***.. 30 voidaan monistaa polymeraasiketjureaktiolla. DNA-sekvensse- jä voidaan käyttää hybridisaatiokoettimena. Sekvenssit voi- ··· .· . vat olla rekombinanttisia (so. transformoiduissa soluissa • * · *· *| ekspressoituja) tai synteettisiä, ja ne voivat sisältyä * * tarvittaessa pitempiin sekvensseihin. Yhtä lailla voidaan :*;*· 35 myös sietää deleetioita, insertioita ja substituutioita, • · jos polynukleotidi voi yhä toimia spesifisenä koettimena.
5 118688
Polynukleotidisekvenssit, jotka koodittavat antigeenisiä proteiineja, ovat myös erityisen hyödyllisiä.
Keksinnön toinen puoli tuo käytettäviksi peptidin, jolla on hepatiittiviruksen tyypille 4, 5 tai 6 ainutlaa-5 tuinen aminohapposekvenssi.
Keksintö sisältää antigeenisen, HCV-4-, HCV-5- tai HCV-6-spesifisen polypeptidin NS4-alueelta, tai tätä antigeeniä sisältävät polypeptidit. Useampia kopioita peptidiä voi olla sitoutuneena moniantigeenipeptidin ytimeen ("mul-10 tiple antigen peptide core").
Peptidi voi olla leimattu havaitsemisen helpottamiseksi ja voi olla esimerkiksi leimattu, antigeeninen, HCV- 4-, HCV-5- tai HCV-6-spesifinen polypeptidi NS4-alueelta käytettäväksi immunologiseen määritykseen vastaavien vasta-15 aineiden havaitsemiseksi.
On ymmärrettävä, että polypeptidit eivät välttämättä käsitä koko NS4-aluetta, vaan voidaan käyttää sen tunnusomaisia osia (yleensä tunnusomaisia epitooppeja), jotka ovat ainutlaatuisia tietyntyyppiselle HCV:lie.
20 Keksinnön vielä eräs puoli tuo tarjolle näiden pep- . tidien vastaisia vasta-aineita, erityisesti HCV-4:n, HCV- ti· 5:n tai HCV-6:n NS4-antigeenien vastaisia, erityisesti mo- · » '· " noklonaalisia vasta-aineita, hoidossa ja diagnoosissa käy- • · ·.*·: tettäviksi. Siten leimattuja vasta-aineita voidaan käyttää • · j,j j 25 in vivo -diagnoosiin. Sytotoksisia aineita kantavia vasta- : aineita voidaan käyttää HCV-4:n, HCV-5:n tai HCV-6:n infek- ··· i ;*·*: toimia soluja vastaan hyökkäämiseen.
Keksinnön vielä eräs puoli tuo käytettäväksi mene- ··. telmän HCV:n in vitro -tyypittämiseksi, joka käsittää sen, • ·· 30 että suoritetaan HCV:tä sisältävän näytteen endonukle- • · Ί* aasidigestio restriktiofragmenttien saamiseksi, restrik- • · ·.*·; tiokuvion ollessa tunnusmerkillinen HCV-4: lie, HCV-5: lie ·:··: tai HCV-6: lie.
.·*·. Lopuksi tämä keksintö kattaa myös sellaiset määri- • · # ] \ 35 tystarvikesarjat, jotka sisältävät polypeptidejä, jotka si sältävät ainakin yhden HCV-4:n, HCV-5:n tai HCV-6:n anti- 118688 e geenin epitoopin (tai sellaisen vastaisen vasta-aineen), sekä myös tarpeelliset preparatiiviset reagenssit, pesu-reagenssit, havaitsemisreagenssit ja signaalin tuottavat reagenssit.
5 HCV-4-, HCV-5- tai HCV-6-spesifisiä polynukleoti- disekvenssejä voidaan käyttää HCV-viruksen itsensä (yleensä PCR:llä monistettuna) tunnistamiseen hybridisaatioteknii-koilla.
Vaihtelevia alueita, esim. NS4-aluetta, vastaavia 10 oligonukleotideja, voitaisiin käyttää tyyppispesifiseen PCR:ään. Ulompaa ja sisempää "sense"-aluketta voidaan käyttää yhdessä kahden konservoituneen "anti-sense"-alukkeen kanssa spesifistä HCV:n tyyppien 4, 5 ja 6 havaitsemismene-telmää varten.
15 Tämä keksintö tuo myös käytettäviksi tässä määri tellyn mukaisia DNA-sekvenssejä sisältäviä ekspressiovekto-reita, jotka kykenevät asianmukaisessa isännässä ekspres-soimaan DNA-sekvenssiä tässä määritellyn mukaisten peptidien tuottamiseksi.
20 Ekspressiovektori sisältää normaalisti DNA:n sääte- . lyosia, jotka vaikuttavat DNA-sekvenssin ekspressioon ··» asianmukaisessa isännässä. Nämä osat voivat vaihdella isän- • · • t t *. *: nän mukaan, mutta yleensä ne sisältävät promoottorin, ri- • * :.*·· bosomin sitoutumiskohdan, translaation alku- ja loppukohdat • · · 25 ja transkription lopetuskohdan. Esimerkkeihin tällaisista : vektoreista kuuluvat plasmidit ja virukset. Tämän keksinnön **· · ;*·*; mukaiset ekspressiovektorit käsittävät sekä kromosominul- koiset vektorit että vektorit, jotka ovat integroituneena ;·, isäntäsolun kromosomiin. E. colissa käyttöä varten ekspres- • ·· *... 30 siovektori saattaa sisältää tämän keksinnön mukaisen DNA- ♦ · • · *1* sekvenssin mahdollisesti fuusiona, joka on liitetty sellai- • · S.*·· sen DNA-sekvenssin joko 5'- tai 3' -päähän, joka koodittaa *:**: esimerkiksi β-galaktosidaasia tai sellaisen DNA-sekvenssin φ.*·. 3'-päähän, joka koodittaa esimerkiksi trpE-geeniä. Hyön- • » · 35 teisbakulovirussysteemissä (AcNPV) käyttöä varten DNA-sek- • · 118688 7 venssi voi olla mahdollisesti fuusioituna polyhedriinin koodattavaan sekvenssiin.
Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi isäntäsolun, joka on transformoitu tässä määritellyn mukaisilla ekspres-5 siovektoreilla.
Esimerkkeihin isäntäsoluista, jotka ovat tässä keksinnössä hyödyllisiä, kuuluvat prokaryootti- ja eukaryoot-tisolut, kuten bakteeri-, hiiva-, nisäkäs- ja hyönteisso-lut. Erityisiä esimerkkejä tällaisista soluista ovat E. co-10 li, S. cerevisiae, P. pastoria, kiinanhamsterin munasarjan ja hiiren solut sekä Spodoptera frugiperda ja Tricoplusia ni. Isäntäsolun valinta voi riippua monista tekijöistä, mutta jos HCV-viruksen peptidin translaationjälkeinen muokkaus on tärkeää, silloin eukaryootti-isäntä olisi edulli-15 nen.
Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi menetelmän tässä määritellyn mukaisen peptidin valmistamiseksi, joka käsittää sen, että eristetään tässä määritellyn mukainen DNA-sekvenssi HCV:n genomista tai syntetisoidaan tässä mää-20 ritellyn mukaisia peptidejä koodittava DNA-sekvenssi, tai , muodostetaan peptidiä koodittava DNA-sekvenssi, sijoitetaan • · · •••! DNA-sekvenssi sellaiseen ekspressiovektoriin, että se kyke- *.**: nee asianmukaisessa isännässä ekspressoitumaan, transfor- • · ·.*·· moidaan isäntäsoluja ekspressiovektorilla, viljellään • · !.! j 25 transformoituja isäntäsoluja ja eristetään peptidi.
i Peptidiä koodittava DNA-sekvenssi voidaan synteti- ·*;’· soida standardimenettelyjä käyttäen (Gait, Oligonucleotide
Synthesis: A Practical Approach, 1984, Oxford, IRL Press).
··. Haluttu DNA-sekvenssi, joka on saatu kuten edellä • ·· |... 30 on kuvattu, voidaan sijoittaa ekspressiovektoriin sinänsä • ♦ *!* tunnetulla tavalla. Ekspressiovektori yleensä katkaistaan • · ί,*·| käyttäen restriktioentsyymejä, ja DNA-sekvenssi sijoitetaan *:*·: paikalleen käyttäen tasaisten tai epätasaisten päiden li- ,·!·. gaatiota. Katkaisu tehdään yleensä sellaisen restriktiokoh- • · · 35 dan kohdalta, joka on sillä tavalla sopivassa asemassa eks-pressiovektorissa, että paikalleen sijoitettuina DNA-sek- venssit ovat sellaisten DNA:n funktionaalisten osien sääte lyn alaisina, jotka vaikuttavat sen ekspressioon.
118688 s
Isäntäsolun transformaatio voidaan suorittaa sinänsä tunnetulla tavalla. Yleensä käytetään jotakin fenotyyp-5 pistä merkkiä erottamaan transformantit, jotka ovat onnistuneesti saaneet sisäänsä ekspressiovektorin niistä, jotka eivät ole. Transformoitujen solujen viljely ja tarvittaessa peptidin eristys voidaan myös suorittaa sinänsä tunnetulla tavalla.
10 Tämän keksinnön mukaiset peptidit voidaan siis val mistaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla tai voidaan syntetisoida esimerkiksi automaattisyntetisoijaa käyttäen.
Termiä "peptidi" (ja "polypeptidi") käytetään tässä niin, että siihen sisältyvät epitooppiset peptidit, joissa 15 on antigeenisyyteen tarvittava minimimäärä aminohappotähteitä, oligopeptideihin, jopa proteiineihin asti. Peptidi voi olla transformoidusta solusta ekspressoitu rekombinant-tipeptidi, tai se voisi olla kemiallisella synteesillä tuotettu synteettinen peptidi.
20 Tämän keksinnön mukaiselle peptidille spesifinen . vasta-aine voidaan tuottaa peptidiä käyttäen. Vasta-ainetta • « * voidaan käyttää peptidien valmistuserien laaduntarkkailu- • i * *· '· testeissä, peptidin tai viruslysaatin puhdistuksessa, epi- • · *.**: tooppikartoituksessa, leimatussa muodossa konjugaattina • · ·.· · 25 kilpailutyyppisessä määrityksessä vasta-aineen havaitsemiin*: seen ja antigeeninhavaitsemismäärityksiin.
Tämän keksinnön mukaisen peptidin vastainen poly-klonaalinen vasta-aine voidaan saada injektoimalla pepti- j·. diä, mahdollisesti kantajaan kytkettynä immuunivasteen saa- • » #···β 30 miseksi aikaan, nisäkäsisäntään, kuten hiireen, rottaan, • · *" lampaaseen tai kaniin, ja ottamalla talteen näin tuotettu • ♦ V*: vasta-aine. Peptidi yleensä annetaan injektoitavana formu- *"*! laationa, jossa peptidi on sekoitettuna fysiologisesti hy- .V. väksyttävään laimennusaineeseen. Adjuvantteja, kuten Freun- • * · 35 din täydellistä adjuvanttia (FCA) tai Freundin epätäydel- lista adjuvanttia (FIA), voidaan sisällyttää formulaatioon.
* · 9 118688
Formulaatiota injektoidaan yleensä isäntään sopivan pitkän ajan kuluessa, ja plasmanäytteitä otetaan sopivin välein HCV-viruksen vastaisen vasta-aineen määrittämiseksi. Kun sopiva aktiivisuustaso on saatu, isännästä otetaan verta. 5 Sitten vasta-aine eristetään ja puhdistetaan veriplasmasta standardimenetelmin, esimerkiksi proteiini A:11a tai ionin-vaihtokromatografiällä.
Tämän keksinnön mukaisen peptidin vastainen mono-klonaalinen vasta-aine voidaan saada fuusioimalla soluja 10 kuolemattomaksi tekevästä solulinjasta sellaisten solujen kanssa, jotka tuottavat vasta-ainetta viruspeptidiä tai sille topografisesti sukua olevaa peptidiä vastaan, ja viljelemällä fuusioitua, kuolemattomaksi tehtyä solulinjaa. Tyypillisesti nisäkäsisäntään, joka ei ole ihminen, kuten 15 hiireen tai rottaan, inokuloidaan peptidiä. Sen jälkeen kun on kulunut riittävästi aikaa, että isännällä on muodostunut vasta-ainevaste, otetaan vasta-ainetta tuottavia soluja, kuten pernasoluja. Kuolemattomaksi tekevän solulinjan, kuten hiiren tai rotan myeloomasolulinjan, soluja fuusioidaan 20 vasta-ainetta tuottavien solujen kanssa ja saadut fuusiot , seulotaan haluttua monoklonaalista vasta-ainetta erittävän * · « •;**t solulinjan, kuten hybridooman, tunnistamiseksi. Fuusioitua • * * *· *: solulinjaa voidaan viljellä ja monoklonaalinen vasta-aine • · *.’·! puhdistaa elatusaineesta polyklonaalisen vasta-aineen puh- • * ·.· · 25 distusta vastaavalla tavalla.
jt| j Tähän keksintöön perustuvia diagnostisia määrityk- siä voidaan käyttää HCV-infektion poissaolon, läsnäolon ja kyseessä olevan HCV-tyypin määrittämiseen. Niitä voidaan ;·, myös käyttää tällaisen infektion hoidon seurantaan, esimer- ]···, 30 kiksi interferonihoidossa.
• · T Määrityksessä virusinfektion diagnoosia varten on \*·: pohjimmiltaan kolme erilaista lähestymistapaa, joita voi- * daan käyttää, joihin kuuluvat viruksen nukleiinihapon, vi-rusantigeenin ja vastaavasti virusvasta-aineen havaitsemi- • * · 35 nen. Viruksen nukleiinihappoa pidetään yleensä parhaana in- dikaattorina viruksen itsensä läsnäolosta, ja se tunnistai- • · 10 118688 si materiaalit, jotka luultavasti ovat infektiivisiä. Kuitenkaan nukleiinihapon havaitseminen ei ole tavallisesti niin suoraviivaista kuin antigeenien tai vasta-aineiden havaitseminen, koska kohteen taso voi olla hyvin matala. Vi-5 rusantigeeniä käytetään merkkinä viruksen läsnäolosta ja infektiivisyyden indikaattorina. Viruksesta riippuen näytteessä esiintyvän antigeenin määrä voi olla hyvin matala ja vaikea havaita. Vasta-aineen havaitseminen on melko suoraviivaista, koska itse asiassa isännän immuunijärjestelmä 10 vahvistaa vastetta infektiolle tuottamalla suuria määriä vasta-ainetta verenkiertoon. Vasta-ainevasteen laatu voi olla usein kliinisesti hyödyllinen, esimerkiksi ennemmin igM- kuin IgG-luokan vasta-aineet viittaavat äskettäiseen infektioon, tai vaste tietylle virusantigeenille voi liit-15 tyä viruksen poistumiseen. Siten virusinfektion diagnoosiin käytetty tarkka lähestymistapa riippuu kulloisistakin olosuhteista ja haetusta tiedosta. HCV:n kohdalla diagnostinen määritys voi käsittää minkä tahansa näistä kolmesta lähestymistavasta.
20 Missä tahansa HCV:n diagnoosia varten tehdyssä mää- , rityksessä, johon kuuluu viruksen nukleiinihapon havaitse- *·** minen, menetelmä voi käsittää testinäytteessä esiintyvän • · · *·*· viruksen RNA:n tai tällaisesta virus-RNA:sta syntetisoidun • · *.**: cDNA: n hybridi soimi sen sellaisen DNA-sekvenssin kanssa, jo- • · ·.· ; 25 ka vastaa tämän keksinnön mukaisia nukleotidisekvenssejä jtj : tai koodittaa keksinnön mukaista peptidiä, ja saatujen nuk- ·*·*: leiinihappohybridien seulonnan HCV-viruksen nukleiinihapon tunnistamiseksi. Tämän menetelmän soveltaminen rajoittuu ;·. yleensä testinäytteeseen sopivasta kudoksesta, kuten maksa- S··, 30 biopsiaan, jossa virus-RNA:ta on todennäköisesti esiintyy • · "* runsaasti. DNA-sekvenssi, joka vastaa tämän keksinnön mu- • · kaista nukleotidisekvenssiä tai koodittaa keksinnön mukais- "**ϊ ta peptidiä, voi olla oligonukleotidina tai cDNA-sek- .·*·. venssinä, joka mahdollisesti sisältyy plasmidiin. Nukle- • * · 35 iinihappohybridien seulonta suoritetaan edullisesti leimat- e tua DNA-sekvenssiä käyttäen. Tämän keksinnön mukainen pep- 11 118688 tidi on edullisesti osa oligonukleotidia, jossa leima sijaitsee riittävällä etäisyydellä peptidistä, niin ettei peptidin sitoutumista viruksen nukleiinihappoon häiritse leiman oleminen liian lähellä sitoutumiskohtaa. Yksi tai 5 useampi uusi seulontakierros tavalla tai toisella voidaan suorittaa hybridien luonnehtimiseksi edelleen ja mahdollisen HCV-viruksen nukleiinihapon tunnistamiseksi näin. Hybridisaatio- ja seulontavaiheet suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla.
10 Vielä erääseen viruksen nukleiinihapon havaitsemis- menetelmään kuuluu virus-DNA:n monistus polymeraasiketjureaktiota (PCR) käyttäen. Valitut alukkeet voivat olla spesifisiä kiinnostuksen kohteena olevan HCV-tyypin sekvenssille siten, että monistuminen tapahtuu vain kyseiselle HCV-15 tyypille. Myös monistettujen sekvenssikopioiden koko ja lukumäärä voi olla tunnusomainen tietyille HCV-tyypeille, ja niillä voi olla tunnusomaiset restriktiokuviot valituilla endonukleaaseilla.
HCV:n diagnoosia varten tehdyssä määrityksessä, jo-20 hon kuuluu virusantigeenin tai -vasta-aineen havaitseminen, . menetelmä voi käsittää testinäytteen saattamisen yhteyteen 999 keksinnön mukaisen peptidin tai peptidin vastaisen polyklo- * · · *· " naalisen tai monoklonaalisen vasta-aineen kanssa ja sen • * *.**: määrittämisen, onko testinäytteessä antigeenin ja vasta- • · ·.· · 25 aineen välistä sitoutumista. Tähän tarkoitukseen voidaan ij*: tuoda tarjolle testitarvikesarja, joka käsittää tässä mää- :*·*: ritellyn mukaisen peptidin tai sellaisen vastaisen polyklo- 9 naalisen tai monoklonaalisen vasta-aineen sekä keinon, jol-j·. la määritellään, tapahtuuko sitoutumista testinäytteen si- 9 ·· #···, 30 sältämän vasta-aineen tai vastaavasti antigeenin kanssa im- • · *!* muunikompleksin tuottamiseksi. Testinäyte voidaan ottaa • · ·.*·: mistä tahansa asianmukaisesta kudoksesta tai fysiologisesta "**ί nesteestä, kuten verestä (seerumista tai plasmasta) , syl- .V. jestä, virtsasta, selkäydinnesteestä, hiestä, kyynelistä • · · 35 tai kudosvisvasta. Jos saadaan fysiologista nestettä, se 9 9 12 118688 voidaan mahdollisesti konsentroida mahdollisen siinä olevan virusantigeenin tai -vasta-aineen suhteen.
Joukkoa erilaisia määritysmuotoja voidaan käyttää. Peptidiä voidaan käyttää pyydystämään selektiivisesti HCV:n 5 vastainen vasta-aine liuoksesta, leimaamaan selektiivisesti jo pyydystetty vasta-aine, tai sekä pyydystämään että leimaamaan vasta-aine. Lisäksi peptidiä voidaan käyttää joukossa erilaisia homogeenisia määritysmuotoja, joissa peptidin kanssa reaktiivinen vasta-aine havaitaan liuoksessa il-10 man faasien erottamista.
Sentyyppisiin määrityksiin, joissa peptidiä käytetään pyydystämään vasta-aine liuoksesta, kuuluu peptidin immobilisointi kiinteälle pinnalle. Tämän pinnan pitäisi olla pestävissä jollakin tavalla. Esimerkkeihin sopivista 15 pinnoista kuuluvat erityyppiset polymeerit (valettuina mik-rotiitterikuopiksi, helmiksi, erityyppisiksi kastettaviksi liuskoiksi, imukärjiksi, elektrodeiksi ja optisiksi laitteiksi) , partikkelit (esimerkiksi lateksi, stabiloidut punasolut, bakteeri- tai sienisolut, itiöt, kulta tai muut 20 metalliset tai metallia sisältävät soolit, ja proteiinikol- , loidit) , joissa partikkelin tavallinen koko on 0,02 - 5 μπι, • · · kalvot (esimerkiksi nitroselluloosa, paperi, selluloosa- • · i *. *ϊ asetaatti sekä orgaanista tai epäorgaanista materiaalia • !.**i olevat kalvot, joilla on suuri huokoisuus/suuri pinta-ala) .
t · ·,* · 25 Peptidin kiinnittyminen pinnalle voi olla passiiviini*: sella adsorptiolla liuoksesta, jossa on optimikoostumus, ·*·*· joka voi sisältää pinta-aktiivisia aineita, liuottimia, suoloja ja/tai kaotrooppeja, tai aktiivisella kemiallisella ;·, sitoutumisella. Aktiivinen sitoutuminen voi olla joukon eri • ·« [.··, 3 0 reaktiivisia tai aktivoitavia funktionaalisia ryhmiä väli- • · *" tyksellä, jotka voivat olla esillä pinnalla (esimerkiksi • « kondensoivia aineita, aktiivisia happoestereitä, -halideja *i*“ ja -anhydridejä, amino-, hydroksyyli- tai karboksyyliryh- .·*·. miä, sulfhydryyliryhmiä, karbonyyliryhmiä, diatsoryhmiä tai φ · · 35 tyydyttymättömiä ryhmiä). Mahdollisesti aktiivinen sitoutu- minen voi olla proteiinin välityksellä (joka itse on kiin- • · 13 118688 nittynyt pintaan passiivisesti tai aktiivisella sitoutumisella) , kuten albumiinin tai kaseiinin, johon viruspeptidi voidaan sitoa kemiallisesti millä tahansa joukosta erilaisia menetelmiä. Proteiinin käyttö tällä tavalla voi olla 5 edullista johtuen isoelektrisestä pisteestä, varauksesta, hydrofiilisyydestä tai muusta fysikaalis-kemiallisesta ominaisuudesta. Viruspeptidi voidaan myös kiinnittää pintaan (tavallisesti mutta ei välttämättä kalvoon), sen jälkeen kun reaktioseos, kuten immunopresipitaatio, on erotettu 10 elektroforeesilla.
Tässä keksinnössä on edullista tuoda käytettäviksi estäviä peptidejä, jotka estävät mahdollisen ristireagoi-vuuden ja jättävät näytteeseen vain ne HCV-vasta-aineet, jotka reagoivat yksinomaan sentyyppisen antigeenin kanssa, 15 joka on kyseisessä testikohdassa läsnä. Esimerkiksi HCV-6:ta havaitsemaan tarkoitettu testikohta estetään estoseok-sella, joka käsittää HCV-1-peptideistä HCV-5-peptideihin, joka reagoi kaikkien vasta-aineiden kanssa, joilla on reaktiivisuutta HCV-tyyppien 1-5 kanssa, ja jättää vasta-20 aineet, joilla on vain tyypin 6 reaktiivisuus.
, Sen jälkeen kun pinta, jossa peptidiä on, on saa- •;**t tettu yhteyteen testinäytteen kanssa (haluttessa estoseok- « · · * *j sen ollessa läsnä) , annettu aikaa reaktiolle ja tarpeen ·.**: tullen poistettu ylimäärä näytettä jollakin joukosta eri • # ·,; j 25 keinoja (kuten pesu, sentrifugointi, suodatus, magnetismi ;j*j tai kapillaarivaikutus), pyydystetty vasta-aine havaitaan :*·*: millä tahansa keinolla, joka antaa havaittavan signaalin.
Tämä voidaan saada aikaan esimerkiksi käyttäen edellä kuva- tun mukaista leimattua molekyyliä tai partikkelia, joka I*··. 30 reagoi pyydystetyn vasta-aineen kanssa (esimerkiksi prote- • · *!* iini A:ta tai proteiini G:tä tai vastaavaa, tietyn lajin • · :.*·ϊ tai tietyn alatyypin immunoglobuliinin vastaista vas- ta-ainetta, reumafaktoria tai peptidin vastaista vasta-.V. ainetta, jota käytetään kilpailevalla tai estävällä taval- t · * 35 la), tai mitä tahansa molekyyliä, joka sisältää peptidin sisältämän epitoopin. Tässä keksinnössä on edullista lisätä • · 118688 14 piparjuuren peroksidaasiin konjugoitua ihmisen IgG:n vastaista vasta-ainetta ja sitten havaita sitoutunut entsyymi reaktiolla substraatin kanssa, joka tuottaa väriä.
Havaittava signaali voidaan tuottaa millä tahansa 5 alalla tunnetuilla keinoilla, kuten optisilla tai radioaktiivisilla tai fysikaalis-kemiallisilla ja voidaan tuoda tarjolle suorasti leimaamalla molekyyli tai partikkeli esimerkiksi väriaineella, radioleimalla, fluoresoivalla, lu-minesoivalla, kemiluminesoivalla tai elektroaktiivisella 10 molekyylilajilla, magneettisesti resonoivalla molekyylila-jilla tai fluoroforilla, tai epäsuorasti leimaamalla molekyyli tai partikkeli entsyymillä, joka itse kykenee aikaansaamaan minkä tahansa laatuisen mitattavan muutoksen. Vaihtoehtoisesti havaittava signaali voidaan saada käyttäen 15 esimerkiksi agglutinaatiota, taikka diffraktion tai kah-taistaittoefektin välityksellä, jos pinta on partikkelien muodossa.
Määritykset, joissa peptidiä itseään käytetään leimaamaan jo pyydystetty vasta-aine, vaativat jonkinlaisen 20 peptidin leimauksen, joka mahdollistaa sen havaitsemisen. Leimaus voi olla suora kiinnittämällä peptidiin kemialli- ·*··, sesti tai passiivisesti esimerkiksi radioleima, magneetti- • « · *· " sesti resonoiva molekyylilaji, partikkeli tai entsyymi- " leima, tai epäsuora kiinnittämällä minkä tahansa kaltainen • ·.: : 25 leima molekyyliin, joka itse reagoi peptidin kanssa. Leiman • · •#j j peptidiin sitomisen kemiallinen menetelmä voi olla suora :T: peptidissä jo esiintyvän rakenneosan kautta, kuten amino- ryhmän, tai välille tulevan rakenneosan kautta, kuten ma- # leimidiryhmän. Vasta-aineen pyydystäminen voi tapahtua mil- .··. 30 le tahansa jo mainituille pinnoille missä tahansa reagens- • · *** sissa, mukaan luettuina passiivinen ja aktivoitu adsorptio, *.*·: minkä tuloksena spesifinen vasta-aine tai immuunikompleksit ***** sitoutuvat. Erityisesti vasta-aineen pyydystäminen voisi tapahtua lajin tai immunoglobuliinialatyypin vastaisen vas- .],*· 35 ta-aineen, reumafaktorin, proteiini A:n tai G:n tai vastaa- • · 15 118688 van tai minkä tahansa molekyylin, joka sisältää peptidin sisältämän epitoopin, vaikutuksesta.
Leimattua peptidiä voidaan käyttää kilpailevassa sitoutumistavassa, jossa näytteessä oleva antigeeni estää 5 sen sitoutumisen mihin tahansa spesifiseen molekyyliin millä tahansa pinnoista, joista edellä annettiin esimerkkejä. Vaihtoehtoisesti sitä voidaan käyttää ei-kilpailevalla tavalla, jossa näytteessä oleva antigeeni sitoutuu spesifisesti tai epäspesifisesti mihin tahansa em. pinnoista ja 10 sitoutuu myös spesifiseen bi- tai polyvalenttiseen molekyyliin (esim. vasta-aineeseen), jonka jäljellä olevia valens-seja käytetään pyydystämään leimattu peptidi.
Usein homogeenisissa määrityksissä peptidi ja vasta-aine ovat erikseen leimattuja sillä tavalla, että kun 15 vasta-aine reagoi rekombinanttipeptidin kanssa vapaassa liuoksessa, nämä kaksi leimaa ovat vuorovaikutuksessa siten, että mahdolliseksi tulee esimerkiksi säteilyä tuottamaton toisen leiman sieppaaman energian siirto toiselle leimalle, jossa havaitaan sopivasti virittynyt toinen leima 20 tai vaimentunut ensimmäinen leima (esim. fluorimetriällä, . magneettisella resonanssilla tai entsyymimittauksella). Jo-
• M
”·*. ko viruspeptidin tai -vasta-aineen lisääminen näytteeseen • « · ’· " johtaa leimatun parin vuorovaikutuksen rajoittamiseen ja • · · *. *t siten eri signaalitasoon detektorissa.
• · ·,* : 25 Vielä eräs mahdollinen määritysmuoto HCV-vasta- f · jt· i aineen havaitsemiseksi on suora entsyymi-immunologisen mää- ϊ*;*ϊ rityksen (EIA) kerrosmääritysmuoto ("sandwich assay"). Mik- rotiitterikuoppia pinnoitetaan antigeenisellä peptidillä.
j*. ^ Testinäyte ja peptidi, johon on kytketty entsyymi, lisätään ,···, 30 samanaikaisesti. Testinäytteessä mahdollisesti oleva HCV- • · *“ vasta-aine sitoutuu sekä kuopan pinnalla olevaan peptidiin • · ·/*: että entsyymiin kytkettyyn peptidiin. Tyypillisesti samaa *!'” peptidiä käytetään kerroksen molemmilla puolilla. Pesun « jälkeen sitoutunut entsyymi havaitaan käyttäen spesifistä 35 siabstraattia, josta aiheutuu värin muutos.
• · 16 118688
On myös mahdollista käyttää IgG/IgM-vasta-aine-sieppaus-ELISA:a, jossa ihmisen IgG:n ja/tai lgM:n vastainen vasta-aine on pinnoitettu kiinteälle alustalle. Kun testinäytettä lisätään, silloin näytteessä oleva IgG ja/tai 5 IgM sitoutuu ihmisen vasta-aineen vastaiseen vasta-aineeseen. Sitoutunut IgG ja/tai IgM edustaa näiden vasta-aineiden koko populaatiota. Tämän keksinnön mukainen peptidi sitoutuu vain niihin IgG- ja/tai IgM-vasta-aineisiin, jotka muodostuivat vasteena sille/niille antigeenisille de-10 terminanteille, joita peptidissä esiintyy, ts. niihin vasta-aineisiin, jotka muodostuivat sentyyppisellä HCV:llä infektion tuloksena kuin mistä peptidi on peräisin. Peptidi/ vasta-aine-kompleksin havaitsemiseksi peptidi on voitu itse leimata suoraan, tai siepattujen vasta-aineiden kanssa vuo-15 rovaikutukseen joutumisen jälkeen peptidi voidaan saattaa reagoimaan sellaisen leimatun molekyylin kanssa, joka sitoutuu peptidiin.
Täten voidaan nähdä, että tämän keksinnön mukaisia peptidejä voidaan käyttää HCV-infektion havaitsemiseen mo-20 nissa muodoissa, nimittäin vapaina peptideinä, määrityksissä, joihin kuuluvat klassinen ELISA, kilpailu-ELISA, kalvoon sidottu E IA ja immunopresipitaatio. Peptidikonjugaat-teja voidaan käyttää vahvistetuissa määrityksissä ja ..li* IgG/IgM-sieppaus-ELISA: ssa.
• · ϊ.*·ϊ 25 Tämän keksinnön mukaista määritystä voidaan käyttää esimerkiksi luovutetun veren seulontaan tai kliinisiin tar- • φ • koituksiin, esimerkiksi HCV-infektioiden havaitsemiseen, φφφ · : .*. tyypittämiseen ja seurantaan. Seulontatarkoituksiin edulli- φφφ * siä määritysmuotoja ovat sellaiset, jotka voidaan automati- Φ · * 30 soida, erityisesti mikrotiitterilevymuoto ja helmimuoto.
.. Kliinisiin tarkoituksiin voidaan käyttää tällaisten muoto- • · *..* jen lisäksi sellaisia, jotka soveltuvat pienempään skaalaan * *"·* tai yksittäiskäyttöön, esimerkiksi lateksimäärityksiä. Seu- lontamenettelyissä käytettäviä varmistusmäärityksiä varten • * .;··· 35 antigeenejä voidaan tuoda tarjolle sellaisen liuskan pin- • • φ φ φ φ φ φ φ φ # φ · 118688 17 nalla, joka on sovelias Western-blottaus- tai muissa immu-noblottaustesteissä käytettäväksi.
Kuten edellä on viitattu, nykyisin käytetyissä määrityksissä, joilla havaitaan HCV:n vastaisten vasta-5 aineiden esiintyminen testinäytteissä, erityisesti luovutetun veren seulonnassa, käytetään antigeenisiä peptidejä, jotka on saatu vain tyypin 1 HIVrstä, eivätkä tällaiset antigeenit luotettavasti havaitse muita HCV:n genotyyppejä. Niinpä on selvästi toivottavaa täydentää HIV-l:n testaus 10 kaikkien muiden genotyyppien testauksella, esimerkiksi tyyppien 2, 3, 4, 5 ja 6 ja myös muiden genotyyppien, joita voidaan keksiä.
Erityisesti keksintö mahdollistaa sen, että verenluovuttajien seulonta tavanomaisilla menetelmillä (käyttäen 15 tyypin 1 HCV:n koodittamia antigeenejä) täydennetään toisella testillä, joka sisältää oligopeptidejä, jotka vastaavat esimerkiksi HCV-4:n, HCV-5:n tai HCV-6:n NS4-sekvenssissä tavattavia antigeenisiä alueita.
Eri genotyyppien kirjon testaamiseksi voidaan tuoda 20 tarjolle sarja määrityskeinoja, joista kukin käsittää yhden tai useampia antigeenisiä peptidejä yhdestä HCV:n genotyypistä, esimerkiksi sarja kuoppia mikrotiitterilevyllä, tai yhtäläinen sarja helmimuotoa käyttäen. Tällaista määritys-muotoa voidaan käyttää näytteessä esiintyvän HCV:n tyypin • · !.*·· 25 määrittämiseksi. Vaihtoehtoisesti tai tämän lisäksi määri- :\i tyskeino voi käsittää antigeenisiä peptidejä useammasta • :*; kuin yhdestä tyypistä, esimerkiksi mikrokuoppa tai helmi • · · * | ;*. voi olla pinnoitettuna peptideillä useammasta kuin yhdestä • · · » tyypistä.
30 HCV-4:n, HCV-5:n tai HCV-6:n antigeenisiä alueita .. vastaavia oligopeptidejä voidaan myös käyttää erikseen sel- laisten yksilöiden tunnistamiseksi, jotka ovat infektoitu- • * *·;** neet näillä eri HCV-tyypeillä. Tällainen määritys voisi ol- la epäsuoran entsyymi-immunologisen määrityksen (EIA) muo-·;··· 35 dossa, jossa käytetään HCV-tyyppien 4, 5 ja 6 antigeenisten alueiden oligopeptideillä pinnoitettuja kuoppien tai helmi- • · ♦ • · · • · « · 18 en sarjoja. Vähäiset ristireagoivuudet, jos niitä esiintyy, voidaan saada poistetuksi laimentamalla testattava seerumi laimennusaineeseen, joka sisältää estäviä määriä liukoisia, tyyppiltään heterologisia oligopeptidejä sen varmistamisek-5 si, että vain vasta-aine, jolla on tyyppispesifinen vasta-ainereaktiivisuus, sitoutuu kiinteään faasiin.
Voi olla edullista käyttää useampia kuin yhtä HCV-antigeeniä testaukseen, erityisesti yhdistelmää, joka käsittää ainakin yhden antigeenisen peptidin, joka on peräi-10 sin genomin rakenteelliselta alueelta ja ainakin yhden antigeenisen peptidin, joka on peräisin ei-rakenteelliselta alueelta, erityisesti yhdistelmää, jossa on ydinantigeeni ja ainakin yksi antigeeni, joka voi olla NS3-, NS4- tai NS5-alueilta. Kuopat tai helmet voidaan pinnoittaa yksit-15 täisillä antigeeneillä. Voi kuitenkin olla edullista fuusioida kaksi tai useampi antigeenistä peptidiä yhdeksi poly-peptidiksi, edullisesti rekombinanttifuusipolypeptidinä.
Tällaisen lähestymistavan etuja ovat, että yksittäisiä antigeenejä voidaan yhdistää kiinteässä, ennalta määrätyssä 20 suhteessa (yleensä ekvimolaarisessa), ja että vain yksi po-lypeptidi tarvitsee tuottaa, puhdistaa ja karakterisoida. Yhtä tai useampaa tällaista fuusiopolypeptidiä voidaan käyttää määrityksessä, haluttaessa yhden tai useamman fuu-sioimattoman peptidin lisäksi. On ymmärrettävä, että fuu- • · :.*·· 25 siopolypeptidissä on monia mahdollisia antigeenien yhdis- telmiä, esimerkiksi fuusiopolypeptidi voi käsittää halutun • valikoiman antigeenejä vain yhdestä tyypistä, tai voi kä- **· · I ·*; sittää antigeenejä useammasta kuin yhdestä tyypistä.
··· *
Useampia peptidiantigeenejä käsittävän polypeptidin 30 saamiseksi ekspressiotekniikalla eräs lähestymistapa on fuusioida yksittäiset koodittavat sekvenssit yhdeksi avoi- *,,, meksi lukukehykseksi. Fuusio täytyisi tietysti suorittaa • ♦ *···* sillä tavalla, ettei minkään komponenttipeptidin anti- geeniaktiivisuudesta tingitä merkittävästi johtuen sen ase- ·;··· 35 masta suhteessa toiseen peptidiin. Erityistä huolta pitäisi tietysti pitää sekvenssien luonteesta peptidien välisessä • ♦ t • ♦ ♦ • · • · 118688 19 varsinaisessa liitoskohdassa. Saatua koodittavaa sekvenssiä voidaan ekspressoida esimerkiksi sen mukaisesti kuin edellä kuvattiin rekombinanttipeptidien kohdalla yleensä. Menetelmiä, joilla tällaisia fuusiopolypeptidejä voidaan saada, 5 tunnetaan alalla, ja useampia HCV-tyyppi l:n erään kannan antigeenejä käsittävän rekombinanttifuusiopolypeptidin tuotto kuvataan GB-hakemusjulkaisussa 2 239 245. Peptidi-konjugaatteja voidaan käyttää vahvistusta käyttävissä määrityksissä ja lgG:n/IgM:n sieppaus-ELISA:ssa.
10 Piirustusten kuvaus
Esimerkkejä keksinnöstä kuvataan nyt vain esimerkkeinä.
Kuvio 1 on esimerkistä 1 olevien HCV-tyyppien 4 ja 6 NS5-alueen osan pääteltyjen aminohapposekvenssien vertai-15 lu (tyyppiin la verrattuna). Vertailtujen sekvenssien lukumäärät esitetään toisessa palstassa. Yksittäiset aminohap-pokoodit ovat käytössä. Muuntelun asemat ja frekvenssit HCV-tyypin sisällä ilmaistaan alaindeksillä,
Kuviossa 2 annetaan vastaavat DNA-nukleotidi-sek-20 venssit HCV-4:n (kolme sekvenssiä) ja HCV-6:n (yksi sekvenssi) NS5-alueessa,
Kuvio 3 on NS5-sekvenssien fylogeneettinen analyysi 67:stä HCV-isolaatista, jossa nähdään HCV:n päätyypit (nu- ...i meroitu 1 - 6) ja alatyypit (merkitty a, b, c) ja joka • · 25 osoittaa, että HCV-4 ja HCV-6 ovat erillisiä tyyppejä. Sek-venssien etäisyys on esitetyn mittakaavan mukaisessa suh- • :*: teessä välimatkaan puussa.
• · · · • ;*; Kuviossa 4 nähdään sen mukaiset DNA-alukesekvenssit ··· * kuin esimerkissä 2 käytettiin HCV-4:n, HCV-5:n ja HCV-6:n 30 NS4-alueen kahden alueen PCR-monistukseen, ja .. Kuviossa 5 nähdään HCV-4:n, HCV-5:n ja HCV-6:n NS4- • · • ·· alueen kahden osittaisen alueen esimerkissä 2 selvitetyt, • · *"·* nukleotidisekvensseistä päätellyt aminohapposekvenssit; vertailun vuoksi annetaan vastaavat alueet HCV-l:ssä, • · ····· 35 -2:ssa ja -3:ssa HCV-3:n alueiden 1 ja 2 vastatessa amino- .*, happoja 1691 - 1708 ja vastaavasti 1710 - 1728 julkaisun • · · • · · • · · 1 1 8688 20 WO93/10 239 kuviossa 9b (ks. myös Simmonds ym., J. Clin. Microb. 31:1493).
Esimerkki 1 HCV-4 ja HCV-6; NS5-alueen sekvenssit 5 Näytteet. Plasmaa yhteensä 16 HCV-infektoituneesta verenluovuttajasta Skotlannista, Egyptistä ja Hong Kongista ja yhdestä potilaasta Libanonista, jolla oli krooninen hepatiitti, käytettiin tyyppien 4 ja 6 NS5-sekvenssien analyysiin.
10 Nukleotidisekvenssianalyysi. NS5-alueen sekvenssien saamiseksi virus-RNA:ta kopioitiin käänteistranskriptaasil-la ja monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) yhdessä reaktiossa käyttäen aikaisemmin julkaistuja alukkeita, joiden ajateltiin olevan erittäin konservoituneita eri HCV-
15 varianttien välillä (Enomoto ym. 1990). Joillekin sekvensseille tehtiin toinen PCR alukkeilla 554 ja 555 (Chan ym., 1992b) yhdessä kahden uuden alukkeen, 122 ("sense"-suunta, 5' CTC AAC CGT CAC TGA GAG AGA CAT 3') ja 123 ("anti-sense", 5' GCT CTC AGG TTC CGC TCG TCC TCC 3')· Tuote-DNA
20 fosforyloitiin, puhdistettiin ja kloonattiin pUC19:n (Ya-nisch-Perron ym. 1985) Smal-kohtaan noudattaen julkaisussa Simmonds & Chan, 1993, kuvattuja menettelyjä. Vaihtoehtoisesti monistettu DNA puhdistettiin ja sekvenssoitiin suo- ...! raan, kuten on kuvattu julkaisuissa Simmonds ym., 1990, ja • · 25 Cha ym., 1992. Nämä menetelmät sallivat sellaisen 222 bp:n ί/.j DNA-fragmentin vertailun, joka on homologinen prototyyppi- i viruksen asemien 7975 - 8196 kanssa (numeroitu kuten jul- M» · • kaisussa Choo ym. , 1991) . Tulokset esitetään kuvioissa 1 ja i«« *
··* O
· · * • t t • 30 Nukleotidisekvenssivertailut. Nukleotidisekvenssit kohdennettiin käyttäen ohjelmaa CLUSTAL V (Higgins ym., • ·· *... 1992) GDE-sekvenssianalyysipaketissa toteutetun mukaisesti.
« · *·;** Etäisyydet sekvenssien välillä parittain arvioitiin käyttä- en tri J. Felsensteinin ystävällisesti toimittaman PHYLIP- ·;··; 35 paketin (versio 3,4) (Felsenstein, 1991) DNADIST-ohjelmaa ,*. käyttäen mallia, joka sallii eri transitio- ja transversio- • S · • · • · 118688 21 nopeudet ja neljän nukleotidin eri frekvenssit (Felsen-stein, 1991). Fylogeneettiset puut muodostettiin käyttäen edellisiin parittaisten etäisyyksien sarjoihin naapuriin-liittämisalgoritmiä (Saitou ym., 1987) PHYLIP-ohjelmaa 5 NEIGHBOR käyttäen. Kuviossa 3 esitetty fylogeneettinen puu on juureton. Yhtäläiset fylogeneettiset suhteet saatiin myös maksimitodennäköisyysanalyysissä (PHYLIP-ohjelma DNA-MI, tuloksia ei esitetä) ja naapuriliitettyjen puiden 200 "bootstrap"-replikaatissa (PHYLIP-ohjelmat SEQBOOT ja CON-10 SENSE).
Esimerkki 2 HCV-4, -5 ja -6; NS4-alueen sekvenssit
Hepatiitti C -viruksen (HCV) tyyppien 4, 5 ja 6 NS4-alueesta on yritetty eristää DNA-sekvenssejä PCR-15 monistusta käyttäen. Päätettiin käyttää restriktiokohtia sisältäviä alukkeita, millä mahdollistetaan PCR-tuotteiden kloonaus koheesiivisia päitä käyttävän kloonauksen avulla. Myös uusia alukkeita suunniteltiin HCV:n NS4-geenin suhteellisen konservoituneilta alueilta. Kloonausstrategiaan 20 sisältyi useita erityisiä vaiheita seuraavasti: (i) Klenow-korjaus. Monistetun DNA:n päät korjattiin Klenowin DNA-polymeraasilla sen varmistamiseksi, että restriktiokohdat sisältävät päät olivat täydelliset.
(ii) Päiden kinaasikäsittely. PCR-tuotteiden päät • · !,1·: 25 fosforyloitiin käyttäen T4:n polynukleotidikinaasia. Tämä :\j mahdollisti tuotteiden itseensäligaation konkatemerisaatio- • :1· vaiheessa.
··· · : (iii) PCR-tuotteiden konkatemerisaatio. DNA-frag- ··· · mentit ligatoitiin yhteen pitkien ketjumaisten ("konkate-30 meeristen") muodostelmien saamiseksi. Tämä vaihe saattoi .. alukkeiden päissä kooditetut restriktiokohdat ketjun sisäi- siksi, mikä nosti runsaasti katkaisuvaiheen tehoa.
• · *···1 (iv) Restriktiodigestio. PCR-tuotteita digestoitiin yön yli halutulla restriktioentsyymillä koheesiivisten päi-····· 35 den esiin saamiseksi.
.1, (v) Ligaatio plasmidivektoriin.
• 1 · • m · • · • · 22 118688
Yleisiä menettelyjä ja reagensseja kuvataan teoksessa Maniatis ym. "Molecular Cloning: A Laboratory Man ual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor: New York.
5 a) NS4-sekvenssien PCR-monistus cDNA-synteesin, aluketta 007 käyttäen, jälkeen suoritettiin kolme kierrosta PCR-monistusta. Tyyppejä 4 ja 5 monistettiin yksi kierros käyttäen 007:ää ja 435:tä ja sen jälkeen kaksi kierrosta käyttäen 5351:tä ja 5943:a (jotka 10 molemmat koodittavat BamHI-restriktiokohtia. Tyypin 6 sekvenssejä monistettiin yksi kierros käyttäen 007:ää, sekä 253:a, 281:tä ja 221:tä ja sen jälkeen kaksi kierrosta käyttäen 5351 :tä ja 59431.a. Vähintään viiden kolmikierroksisen reaktion tuotteet yhdistettiin kloonausvaiheita var-15 ten. Lopullisen vektoriin ligaation tehokkuus näytti riippuvan monistetun DNA:n korkeasta pitoisuudesta. Alukese-kvenssit luetellaan kuviossa 4.
b) Kloonaus PCR-tuotteet eristettiin leikkaamalla irti tavan-20 omaisesta agaroosigeelistä [0,5x Tris-asetaatti-EDTA (TAE)]. DNA saatiin eroon agaroosista sentrifugoimalla lasivillan läpi. Eluaatit yhdistettiin DNA:n kokonaismäärän lisäämiseksi. DNA saatiin talteen TAE-eluaatista etano- e ..)·1 lisaostuksella. (DNA-sakka sisälsi jonkin verran kemialli- ϊ]1.ί 25 sesti inerttejä agaroosimurusia, mutta tämä ei häirinnyt ;1·.· seuraavia vaiheita ennen vektoriin ligaatiota. "Magic prep" * · I ·1. -pylväitä (Promega) voitaisiin käyttää, mutta etanolisaos- ··· i ϊ .·. tus on yksinkertaisempi, halvempi ja tehokkaampi, jos käsi- ]···] teilaan suurta tilavuutta TAE-eluaattia.) « · · 30 c) Klenow-korjaus „ Saostetut DNA-napit suspendoitiin uudelleen 50 μΐ: aan • · * Klenow-reaktioseosta, joka käsitti: • · *···1 5 μΐ polynukleotidikinaasipuskuria (lOx) , ·1·,· 0,5 μΐ 3,3 iriM dNTP:itä (lopullinen konsentraatio 33 μΜ) , • · 35 ainakin 100 ng puhdistettua PCR-fragmenttia, · • · · a · · a · • • · 23 118688 tislattua vettä 50 μ! tilavuuteen asti ja 5 yksikköä Klenowin DNA-polymeraasia.
(lOx tarkoittaa, että reagenssi lisättiin halutusta lopullisesta pitoisuudesta kymmenkertaisena reaktioseok-5 seen) Inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 °C:n lämpötilassa, minkä jälkeen lämpöinaktivoitiin 10 minuuttia 75 °C:n lämpötilassa.
Klenow-reaktio korjaa päät, joissa BamHI-restrik-tiokohdat sijaitsevat. T4:n DNA-polymeraasia ei pidä käyt-10 tää tähän reaktioon, koska se poistaa kohdat eksonukle-aasiaktiivisuudellaan.
d) Päiden kinaasikäsittely
Edeltävään reaktioseokseen lisättiin seuraavat: 5 μΐ 100 mM rATP:tä ja 15 10 yksikköä T4:n polynukleotidikinaasia.
Tätä reaktioseosta inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa 30 - 60 minuuttia ja lämpöinaktivoitiin kuten edellä.
e) Konkatemerisaatio
Sitten PCR-tuotteet konkatemerisoitiin BamHI-res-20 triktiokohtien saamiseksi sisäisiksi pitkiin multimeerei-hin.
Fosforylaatioreaktioseokseen lisättiin seuraavat: 6 μΐ lOx ligaasipuskuria ja ··" 5 yksikköä T4:n DNA-ligaasia.
• · 25 Ligaatiota inkuboitiin yön yli 15 °C:n lämpötilas- • !,*·; sa. Konkatemerisaatioreaktio lämpöinaktivoitiin kuten edel- * · ί ! i lä kuvattiin.
··· · f) Restriktiodigestio ·*·*· Konkatemerisoidut PCR-tuotteet digestoitiin mono- 30 meereiksi käyttäen BamHI-restriktioentsyymiä, joka samanai- ··, kaisesti paljasti kohesiiviset päät. Seuraavat lisättiin * ·· *... lämpöinaktivoituun ligaatioreaktioseokseen: • · *" 6 μΐ lOx B-puskuria (Boehringer) ja !.*·· 10 - 20 yksikköä BamHI:tä.
"**: 35 Digestioseosta inkuboitiin yön yli 37 °C:n lämpöti- t·*·, lassa. Vaikka entsyymi ei inaktivoidu täydellisesti lämmön • e * • t • • t vaikutuksesta, reaktioseos kuitenkin lämpökäsiteltiin kuten edellä.
118688 24 Tässä vaiheessa DNA puhdistettiin "Magic prep" -pylväällä irrotettujen päiden poistamiseksi. DNA eluoitiin 5 "Magic prep" -pylväästä 10 μ1:ΒΞ3. mahdollisimman korkeaa pitoisuutta silmällä pitäen.
g) Ligaatio vektoriin 100 ng bakteeriplasmidivektoria pUC18 käytettiin ligaatioon. Plasmidivektorin DNA oli katkaistu BamHI:llä ja 10 puhdistettu "Genecleania" (Bio 101) käyttäen, mutta ei de-fosforyloitu. (Havaitsimme, että defosforylaatioreaktio alensi vektorin ligaatiotehokkuutta huomattavasti.) Suunniteltiin, että edempänä kuvattava sini-valkoinen väriselek-tio olisi riittävä kloonien tunnistamiseksi. Ligaatioseos 15 sisälsi seuraavat: 10 μΐ edeltävän mukaisesti tuotettua, puhdistettua insertti-DNA:ta 5 μΐ plasmidivektori-DNA:ta, 1,5 μΐ lOx ligaasipuskuria ja 20 1 yksikkö ligaasia.
Reaktioseosta inkuboitiin yön yli 15 °C:n lämpötilassa.
h) E. colin transformaatio • · · ···! Bakteeritransformaatiot suoritettiin käyttäen solu- • · * *,**: 25 kantaa XL-1 Blue (Stratagene) . Solut tehtiin kompetenteiksi • · !.‘*j transformaatiolle tavanomaisilla kalsiumkloridimenetelmillä ja varastoitiin pikajäädytettyinä glyseroli-kalsiumkloridi- • ;*j suspensiossa 200 ul:n erinä. 3 ui ligaatioreaktion tuotetta ·*{*· käytettiin transformoimaan 100 μΐ nopeasti sulatettuja, 30 kompetentteja XL-1 Blue -soluja (10 minuuttia jäillä, 2 mi- ··, nuuttia 42 °C:n lämpötilassa, 1 tunti 37 °C:n lämpötilassa • ·· ravistellen sen jälkeen, kun on lisätty 1 ml L-lientä). So-"* lut maljattiin 200 μ1:η erissä L-agarmaljoille, jotka si- !.*·· sälsivät X-gal:ia (20 μg/ml) , IPTG:tä (0,1 mM) , Ap:tä *ϊ·*ί 35 (50 μg/τnl) ja Tet:iä (12,5 μg/ml) . Kemikaalien IPTG (iso- t.*.t propyyli-p-D-tiogalaktopyranosidi) ja X-gal (5-bromi-4- • · · • ' · •' · 25 118688 kloori-3-indolyyli-p-D-galaktopyranosidi) läsnäolo elatus-aineessa tuottaa sinisen värin pesäkkeisiin, jotka sisältävät sellaisia plasmideja, kuten pUC-sarja, jotka koodattavat IacZ-entsyymipeptidiä. Kloonatun DNA:n sijoittaminen 5 näiden plasmidien polylinkkerialueelle keskeyttää lacZ-entsyymisekvenssin ja siten tuhoaa plasmidin kyvyn tuottaa entsyymiä. Siksi rekombinanttiplasmidin sisältävät pesäkkeet ovat valkoisia.
i) Valkoisten pesäkkeiden analyysi 10 Sini-valkoisella selektiolla tunnistettiin solu- pesäkkeet, jotka sisälsivät rekombinanttiplasmideja. Nämä pesäkkeet poimittiin ja niistä valmistettiin DNA:ta mini-plasmidipreparaateilla. DNA:n digestio BamHI:llä varmisti, että plasmit sisälsivät kloonatut insertit. Plasmidi-DNA 15 puhdistettiin lasijauhesuspensiolla ja sekvenssoitiin käyttäen USB: n Sequenase -tarvikesarjaa M13:n eteenpäin ja taaksepäin suuntautuvilla alukkeilla.
j) Pohdinta
Vaikka tässä menettelyohjeessa on suuri joukko vai-20 heitä, se on yksinkertainen suorittaa. Jatkotöissä on havaittu, että menetelmä on erittäin toistettava. Teoriassa tämän kloonausstrategian ei pitäisi toimia, jos PCR-tuotteen sisällä on BamHI-kohta. Kuitenkin tyypille 6 saatu
«M
···! NS4-sekvenssi sisälsi tällaisen kohdan, eikä ole ilmeisiä • * V*: 25 syitä siihen, mikseivät typistetyt tyypin 6 sekvenssit itse • · *.*·· asiassa olleet kloonauskokeen pääasiallinen tuote, i **: Kuviossa 5 nähdään kahden NS4:n alueen DNA- ja ami- • ·*: nohapposekvenssit HCV-tyypeillä 1-3 (vertailuksi) ja tyy- ··· * .*·** peiliä 4-6.
30 Esimerkki 3 ··. NS4-peptidien synteesi • ··
Seuraavat peptidit HCV-tyyppien 1-6 NS4-alueelta • e "* syntetisoitiin. Tyypit 4-6 ovat uusia, tämän keksinnön e · !.*·; mukaisia sekvenssejä, kun taas tyypit 1-3 esitetään ver- *;··: 35 tailua varten ja käytettäviksi täydellisessä HCV:n sero- t·*·. tyyppimäärityksessä.
e e e e * e e e 26 118688
HCV:n tyyppi 1 [HsN-KPAIIPDREVLYREFDEMj 8K4K2K-COOH
(MDL031)
HCV: n tyyppi 1 [H2N- KPAVIPDREVLYREFDEM] 8 K4 K2 K - COOH
(MDL033)
5 HCV: n tyyppi 1 [H2N-RPAVIPDREVLYQEFDEM] SK4K2K-COOH
(MDL036)
HCV: n tyyppi 1 [H2N-RPAWPDREVLYQEFDEM] elQKaK-COOH
(MDL035)
HCV: n tyyppi 1 [H2N- ECSQHLPYIEQGMMLAEQF] sIQKaK- COOH
10 (MDL037Q)
HCV: n tyyppi 1 [H2N- ECSQHLPYIEQGMALAEQF] eK^K-COOH
(MDL038Q)
HCV: n tyyppi 2 [H2N- RVWTPDKEILYEAFDEM] 8K4K2K-COOH
(MDL039)
15 HCV: n tyyppi 2 [H2N-ECASRAALIEEGQRIAEML] 8K4K2K-COOH
(MDL041)
HCV: n tyyppi 2 [H2N-ECASKAALIEEGQRMAEML] 8K4K2K-COOH
(MDL040)
HCV:n tyyppi 3 [H2N-KPALVPDKEVLYQQYDEM] 8K4K2K-COOH
20 (MDL042)
HCV: n tyyppi 3 [H2N-ECSQAAPYXEQAQVIAHQF] sK^K -COOH
(MDL044)
HCV:n tyyppi 4 [H2N-QPAVIPDREVLYQQFDEM] elQK^K-COOH
··'·? (MDL034) • ·
25 HCVrn tyyppi 4 [H2N-ECSKHLPLVEHGLQLAEQF] sK^K-COOH
0! (MDL028)
jj1: HCVrn tyyppi 5 tH2N-RPAIIPDREVLYQQFDKM] eK^K-COOH
; (MDL024)
HCV:n tyyppi 5 [H2N-ECSTSLPYMDEARAIAGQF] 8K4K2K-COOH
30 (MDL029)
;·, HCVrn tyyppi 6 [H2N-KPAWPDREILYQQFDEM] e^K^K-COOH
(MDL025) • 1
’·;** HCVrn tyyppi 6 [H2N-ECSRHIPYLAEGQQIAEQF] 8K4K2K-COOH
0·| (MDL022) *;·1: 35 Seuraavassa on tyypillinen esimerkki yhden peptize deistä synteesistä.
• · · • « » 27 118688 (a) Moniantigeenisen peptidin MDL029 synteesi
Toimiakseen onnistuneesti serotyyppimääritys vaatii, että peptidit syntetisoidaan erikoishartsikantajan pinnalla, jossa on Tamin kehittämän mukainen (Tam J. P., 5 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:5409:5413) monianti- geenipeptidin ydin (K4K2K). Kaikki peptidit syntetisoitiin Applied Biosystemsin mallin 432A Synergy -peptidisyn-tetisaattorilla, jossa käytettiin FASTmoc™-kemiallisia menetelmiä. Peptidit syntetisoitiin käyttäen standardiajo-10 ohjelmaa ilman muutoksia. Kaikki käytetyt reagenssit toimitti Applied Biosystems Limited (Kelvin Close, Birchwood Science Park, Warrington, UK) . MAP-hartsi oli heptalysyy-liydin (K4K2K) polyoksietyleeni/polystyreenikopolymeerin pinnalla HMP-linkkerin kera, ja β-alaniini sisäisenä stan-15 dardiaminohappona. Kaikkien aminohappojen N-a-aminoryhmä oli suojattu 9-fluorenyylimetoksikarbonyyliryhmällä (Fmoc). Aminohapot, joilla on reaktiivisia sivuryhmiä, oli suojattu seuraavasti:
Aminohappo Koodi Suoj aryhmä 20 glutamiini Q tert-butyyliesteri (OtBu) kysteiini C trityyli (Trt) seriini S tert-butyyli (tBu) treoniini T tert-butyyli (tBu) • t · ...i tyrosiini Y tert-butyyli (tBu) • · !.1·· 25 asparagiinihappo D tert-butyyliesteri (OtBu) • · *t1·· arginiini R 2,2,5,7,8-pentametyylikromaani- : :1: 6-sulfonyyli (Pmc) • :1: Synteesin edistymistä seurattiin mittaamalla kyt- kentä- ja suojaryhmänpoistoseosten johtokykyä. Johtokyky-30 käyrissä ei ole poikkeavuuksia, ja synteesiä pidettiin on- .· nistuneena.
• · • 1· *... Synteesin jälkeen täysin suojattu peptidihartsi *"** siirrettiin kartiopohjaiseen 50 ml:n polypropyleeniputkeen • · ϊ/.ϊ ja käsiteltiin tioanisolilla (0,15 ml), etaaniditiolilla ·:··; 35 (0,15 ml) ja trifluorietikkahapolla (TFA, 2,7 ml). Seosta sekoitettiin 3 tuntia huoneenlämpötilassa, sitten suodatet- 5 1 · • · ♦ 28 118688 tiin lasivillan läpi Pasteur-pipetissä, suodoksen tippuessa lasisessa kierrekorkkipullossa olevaan 20 ml:aan tert-butyylimetyylieetteriä (TMBE), jolloin peptidi saostui. Putki sentrifugoitiin ja neste imettiin pois, ja pepti-5 disakka jäi putkeen. Peptidi pestiin vielä kolmella 20 ml:n erällä TMBE:tä käyttäen spaattelia peptidisakan hajottamiseen ja sentrifugointia peptidin talteen saamiseen. Lopuksi peptidi kuivattiin huoneenlämpötilassa alipaineessa.
Peptidin puhtauden analysoimiseksi pieni näyte liu-10 otettiin puhdistettuun veteen ja pantiin analyysiin korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (HPLC). Kään-teisfaasipylväs oli 250 x 4,6 mm ja sisälsi C4-matriisin. Peptidi eluoitiin gradientilla 3,5 - 70-prosenttinen ase-tonitriili 20 minuutin aikana virtausnopeudella 1,5 ml/min. 15 Eluaattia monitoroitiin aallonpituudella 214 nm peptidin havaitsemiseksi.
Esimerkki 4 Määritys HCV:n serotyyppien 1-6 määrittämiseksi
Olemme kehittäneet selektiiviselle kilpailulle pe-20 rustuvan määrityksen, joka kykenee erottamaan sen HCV:n se-rotyypin, jota vastaan biologisessa näytteessä olevat vasta-aineet ovat muodostuneet. Tyypillisesti näyte on seerumia tai plasmaa ihmisestä, jolla on varmistettu hepatiitti ·*· C -infektio.
• · V*: 25 Määritys nojaa 17 eri synteettisen peptidin selek- • · i#··· tiivisyyteen, jotka peptidit kattavat muuntelevia sekvens- : sejä hepatiitti C -viruksen tyyppien 1, 2, 3, 4, 5 ja 6 ··· s • ·*· NS4-proteiinissa. Vaikkakin tietyn HCV-serotyypin NS4:ää ja ··· · toisten serotyyppien homologista aluetta vastaan muodostu-30 neilla antiseerumeilla on jonkin verran ristireagoivuutta, .. tämä voidaan estää poistamatta täysin todellista reaktiivi- • ·· suutta. Pitäen tämän mielessä olemme kehittäneet määritys- • · *·”* muodon, johon kuuluu mikrotiitterilevyn kuoppien pinnoitta- :\i minen yhtä suurella määrällä kutakin 17 peptidiä. Näytteet ····· 35 testataan kahdeksassa rinnakkaisessa kuopassa, joista kukin saa eri seoksen estäviä peptidejä. Vain yhden testikuopan • · · • · · • · 1 • · 29 118688 ja täydentämättömän kontrollikuopan pitäisi olla värjäytynyt määritysmenettelyn lopussa, mikä siten tunnistaa infek-toivan hepatiitti C -viruksen serotyypin.
Levyjä serotyyppimäärityksiin valmistetaan pinnoit-5 tamalla polystyreenisiä mikrokuoppalevyjä likimain yhtä suurilla moolimäärillä kaikkia peptidejä. Peptidit liuotetaan puhdistettuun veteen, ja seos tehdään seuraavissa pitoisuuksissa: MDL031 ) 10 MDL033 ) MDL036 ) 25 ng/ml MDL035 ) MDL037Q) MDL038Q) 15 MDL039 ) MDL041 ) MDL040 ) MDL042 ) MDL044 ) 20 MDL034 ) 50 ng/ml MDL028 ) MDL024 ) MDL029 ) • · MDL025 ) • » : .·. 25 MDL022 ) • · · ··* f : .·. Vaikka tarkkaan ottaen kunkin mikrokuopan tarvitsee • « ]···] sisältää vain sentyyppistä peptidiä, joka sen on tarkoitus • · · havaita, on tarkoituksenmukaisempaa pinnoittaa jokainen ,, mikrokuoppa kaikilla kuudella antigeenityypillä.
• · 30 Peptidien annettiin sitoutua levyihin lisäämällä *···* 100 μΐ peptidiseosta jokaiseen kuoppaan levyllä ja inkuboi- ·*·.· maila 4 °C:n lämpötilassa yön yli.
• ·
Riittävän eron saamiseksi eri serotyyppien välille on tarpeellista lisätä sitten kilpailevia heterologisia • · · ’·*·* 35 peptidejä testattavaan näytteeseen. Kilpailuliuokset teh- *·*" dään määritysnäytteen laimennusliuokseen niin, että saadaan 118688 30 100-kertainen ylimäärä kilpailevaa peptidiä pinnoituspitoi-suuteen verrattuna. Eri kilpailuliuokset luokitellaan sen serotyypin mukaan, jota silmällä pitäen ne estävät, ts. kilpailuliuos 1 sisältää tyyppien 2-5 peptidejä. Kilpai-5 luliuokset tehdään niin, että niissä on haluttu ylimäärä 10 μl:ssa. Kilpailuliuokset ovat seuraavanlaiset: Kilpailuliuos Peptidi Pitoisuus 1 HDL039 50>ig/ml HDLQ41 " KOLO40 " MDL042 XDL044 MDL034 " HDL028 KDL024 KDL029 ” MDL02S , M0L022 2 MDL031 25μ9/η1 MDL033 MDL036 " KOLO35 ” KDL037Q ' MDL038Q * , KDL042 50jig/»l .:. NDL044 " HDL034 ” MDL028 • · HDL024 * * * _ tl *. ·: HDL029 : MDL025 :**.* MDL022 " • · · 3 HDL031 25/ig/ml ·.· * MDL033 " MDL03S " MPL035 '
: *·· MDL037Q
KDL038Q βΛ ’’ .
·...* MDL039 SOpg/nl .·:: ;; *. *: NDL041 ....: MDL034 " HDL028 Κ01Λ24 " HDL029 " ·:··: MDL02S " HDL022 31 118688
Kilpailuliuos Peptidi Pitoisuus 4 MDL031 25pg/ml KOLO33 " HDL036 · MDL035 «
MDL037Q
MDL038Q u HDL039 50pg/ml KDL040 " K0L041 " KOLOA 2 " MDL044 " MDL024 " MDL029 " MDLQ25 " MDL022 " 5 MDL031 2Spg/ml MDIj033 " HDL036 " MDL035 " MDL037Q " MDL03SQ " KDL039 5Opg/ml
KDL040 M
MDL041 " MDL034 " MDL028 « MDL042 " . MDL044 " MDL025 " .1. : KOLO22 n • ·· • · 6 K&&A31 25^sg/ml ; MDL032 " : HDL036 " :1 MDL035 »’ *::/ MDL037Q " ::: MDL03SQ " MDL039 SOpg/ml MDL040 " MDL041 " MDL034 " ϊ.,,ϊ MDL028 ” .· WDL024 " : 1.: HDL029 " .[ · MDL042 »
* " MDL044 M
• · • · 1 • · · * · · 32 118688
Serotyyppimäärityksessä käytetty menettelytapa on seuraavanlainen.
1) Lisää 180 μΐ erä laimennusliuosta joka kuoppaan.
2) Lisää 10 μΐ estäviä peptidejä asiaankuuluviin 5 kuoppiin.
3) Lisää 10 μΐ näytettä jokaiseen kuudesta kuopasta.
4) Sekoita levyä ja inkuboi 37 °C:n lämpötilassa tunnin ajan.
10 5) Pese kuopat kolmesti.
6) Lisää 100 μΐ konjugaattia joka kuoppaan.
7) Inkuboi 37 °C:n lämpötilassa tunnin ajan.
8) Pese kuopat kolmesti.
9) Lisää 100 μΐ TMB-liuosta (joka sisältää 15 3,31,5,5'-tetrametyylibentsidiiniä, vetyperoksidia, pusku reita jne.) 10) Inkuboi 37 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia.
11) Pysäytä reaktio rikkihapolla, ja 12) Mittaa absorbanssi aallonpituuksilla 450 nm/690 nm.
20 Näytteet, joiden tiedetään sisältävän HCV:n vastai sia vasta-aineita, testataan laimennoksessa 1/20 100-ker- M||' täisen estävien peptidien ylimäärän kanssa 200 μΐ-.η koko- naistilavuudessa, kuten edellä on kuvattu. Inkubaation jäi- :1·.· keen näyte poistetaan ja kuopat pestään. Piparjuuren perok- • · : 25 sidaasiin konjugoitu ihmisen immunoglobuliini G:n vastainen ··· · j .·. vasta-aine lisätään, ja se sitoutuu mahdollisiin kiinni » f · *".1 tarttuneisiin HCV:n vastaisiin vasta-aineisiin. Sitten si- • · · • · · toutunut vasta-aine saatetaan näkyväksi poistamalla entsyy- .. mikonjugaatti ja lisäämällä substraatti ja kromogeeni, joka ♦ · i 30 entsyymin läsnä ollessa muuttuu värittömästä värilliseksi • · *...1 liuokseksi. Värin intensiteetti voidaan mitata, ja se on ·1·.· suoraan verrannollinen läsnä olevan entsyymin määrään. Tu- • · lokset eräistä näytteistä annetaan taulukossa 1.
• · • · · • · i • · ♦ 33 118688
Esimerkki 5 Määritys HCV:n serotyyppien 4-6 määrittämiseksi
Esimerkin 4 määritysmuodolle on kehitetty vaihtoehto. Tämä määritys on kattavuudeltaan rajoittuneempi käyttä-5 essään vain tyyppien 4, 5 ja 6 peptidejä. Joillekin näyt teille täydellisempi määritys voi antaa virheellisiä tuloksia johtuen suuremmasta ristireagoivuudesta tyypin 1 peptidien kanssa. Rajoitetumman määrityksen suorituksen menettelyohje on identtinen esimerkissä 4 annetun kanssa.
10 Levyt HCV-tyyppien 4-6 määritystä varten valmis tetaan, kuten esimerkissä 4 on kuvattu, ainoan eron ollessa käytettyjen peptidien pienempi määrä. Peptidit liuotetaan puhdistettuun veteen, ja seos tehdään seuraavassa pitoisuudessa: 15 MDL034 ) MDL028 ) MDL024 ) 50 ng/ml MDL029 ) MDL025 ) 20 MDL022 )
Peptidien annetaan sitoutua levyihin lisäämällä ,,*·* 100 μΐ peptidiseosta levyn jokaiseen kuoppaan ja inkuboi- :\j maila 4 °C:n lämpötilassa yön yli.
;*·.· Riittävän eron saamiseksi eri serotyyppien välille • · j ,*, 25 on tarpeellista lisätä sitten kilpailevia heterologisia • ]·, peptidejä testattavaan näytteeseen. Kilpailuliuokset teh- • · "1/ dään määritysnäytteen laimennusliuokseen niin, että saadaan • · · * 100-kertainen ylimäärä kilpailevaa peptidiä pinnoituspitoi-suuteen verrattuna. Eri kilpailuliuokset luokitellaan sen • · : ** 30 serotyypin mukaan, jota silmällä pitäen ne estävät, ts.
··· ·...· kilpailuliuos 4 sisältää tyyppien 5 ja 6 peptidejä. Kilpai- .*. : luliuokset tehdään niin, että niissä on haluttu ylimäärä • · 10 μ1:ΒΒ8ί. Kilpailuliuokset ovat seuraavanlaiset: • · * · • · · • · · t * *««·· • ♦ 118688 34
Kilpailu!iuos Peptidi Pitoisuus 4 KDL024 50 »g/ml HDL029 " HDL025 " KDL022 " s MDL034 so ug/ml KOLO28 " MDL025 " KOLO22 " 6 MDL034 50 »g/ml HDL028 11 MDL024 ” KOLO29 " Näytteet, joiden tiedetään sisältävän HCV:n vastaisia vasta-aineita, testataan laimennoksessa 1/20 100- 5 kertaisen estävien peptidien ylimäärän kanssa 200 μ1:η kokonaistilavuudessa, kuten esimerkissä 4 on kuvattu. Inku-baation jälkeen näyte poistetaan ja kuopat pestään. Piparjuuren peroksidaasiin konjugoitu ihmisen immunoglobuliini G:n vastainen vasta-aine lisätään, ja se sitoutuu mahdolli-10 siin kiinni tarttuneisiin HCV:n vastaisiin vasta-aineisiin. „··* Sitten sitoutunut vasta-aine saatetaan näkyväksi poistamal- :\j la entsyymikonjugaatti ja lisäämällä substraatti ja kromo- :*·,· geeni, joka entsyymin läsnä ollessa muuttuu värittömästä : värilliseksi liuokseksi. Värin intensiteetti voidaan mitä- • · * ··· # j ,·, 15 ta, ja se on suoraan verrannollinen läsnä olevan entsyymin « · i \·\·' määrään. Tulokset eräistä näytteistä annetaan taulukossa 2.
* · · • i • • »» • · e • · • · ·♦· • · • · · • · • · «··«· • # • » • « » • · · • · ···*· • · 118688 35
Taulukko 1
EI KAIKKI TYYPPI TYYPPI TYYPPI TYYPPI TYYPPI TYYPPI NXYTE ESTOA ESTETTY I 2 3156 TULOS
Kontrolli 1 0,515 0,049 0,530 0,053 0,038 0,038 0,03 ( 0,029 1
Kontrolli 2 1,821 0,010 0,028 1,916 0,004 -0,007 0,040 0,005 3
Kontrolli 3 2,035 0,066 0,048 0,046 1,933 0,<J4g 0,067 0,044 3
Egypti 3 yli 0,372 0,346 0,478 0,322 yli 0,256 0,430 4 CI016I16 yli 0,456 0,635 0,480 0,533 0,533 yli 0,617 5
Kontrolli 6 0,082 0,004 0,007 -0,003 -0,004 -0,012 -0,011 0f067 6 PD372 vli 0,076 1,497 0,081 0,072 0,040 0,057 0,075 1 PD513 ta 0.548 0,467 yli o,553 0,470 0,525 0,582 2 AD558 yli 0,031 0,064 0,044 yli 0,035 0,054 0,048 3
Egypti 37 yli 0,034 0,064 0,039 0,045 1,473 0,047 0,037 4 C1015921 0,1T3 0,010 .0,017' 0,008 0,0ll 0,005 0,182 0,012 5 . Positiiviset tulokset esitetään lihavoidulla tekstillä.
«M
···· • · • 6 ·
• M
• t • · 6 4« 4 ·1 • · • · • · · • 4 4 ··· · • · • 1 ♦ • · · • S· · *·· • · · • · · ·· • 1 • ·· 4 t·· • · « · ·«· 6 · · • · · « ·· • 6 • · • · • · · 6 6· • · 118688 36
Taulukko 2
e KAIKKI TYYPPI TYYPPI TYYPPI
KÄYTE estoa ESTETTY 45«
Egypti i YLI 0,109 U» 0,18* 0,0*8
Egypti 2 0,525 0,010 ^514 0,001 "0,006
Egypti 3 YLI 0.26» Ϊ1*1 °'229 0,201
Egypti 4 0,266 *0,001 0,2W ^006 ^002
Egypti S l,67T 0,090 1,274 0,09* 0,086
Egypti 6 YLI «*» 0jJl7 0,041 0,022
Egypti 7 YLI 0,115 YLI 0,1*3 0,204
Egypti 8 yli 0,891 0fl0S 0,098
Egypti ® Q,Q$I 0,009 «,055 0,014 0,022
Egypti 10 yli 0,021 2,023 0,0*3 0,073
Egypti n 0,0r 0,024 0,095 0,032 0,048 CIP161I6 yli 0,6*7 0,778 yli 0,513 c 1015921 0,196 0,014 0.0°9 °r222 0,009 a · VI Cl 132558 0,015 0,007 0,008 0,015 0,OQ7 • · · ί*.·ί K 91X836 yli 0,073 0,101 yli °»°71 a · « ; ·*· Kontrolli 6 0,433 0,029 0,013 0,015 M14 *·· ·
:Ti HKT3950 0,*28 0,034 0,017 0,027 0,JW
HKT394J yli 0,3*8 0,424 0,3*2 M<* a a • aa • .***. Positiiviset tulokset esitetään lihavoidulla tekstillä.
• · · .* . 5 Huom: Tyypin 4 tulosten vallitsevuus heijastaa suh- • · · *· *i teellistä esiintyvyyttä ja näytteiden saatavuutta tyypeille • aa·· tyypeille 4, 5 ja 6.
• · a · · a · · • · a a 37 118688
Kirjallisuusviitteet BROWN, E.A., ZHANG, H.,PING, H.-L. & LEMON, 5.M. (1992). Secondary structure of the 5' nontranslated region of hepatitis c virus and pestivirus genomic RNAs. Nucleic Acids Research 20, 5041-9045.
BUKH, J,, PURCELL, R.H. & MILLER, R.H. (1992a). Importance of primer selection for the detection of hepatitis C virus RNA vith the polymerase chain reaction assay. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 89, 187-191. BUKH, 3., PURCELL, R.H. (MILLER, R.H. (1992b). Sequence analysis of the 5' noncoding region of hepatitis C virus, proceedings of the National Academy of Sciences, U.s.A.
89, 4942-4946.
CHA, T.A., BEALL, E., IRVINE, B., KOLBERG, J., 0ΗΓΕΝ, D., KUO, G. & URDEA, M.S. (1992). At least five related, but distinct, hepatitis c viral genotypes exist. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A.39, 7144-7148.
• * V·: CHAN, S.w. SXMMONDS, ?,, MCOHISH, Γ. , YAP, F.L. , MITCHELL, • · • e v // R., DOW, B. S FOLLETT, I. (1991). Serological reactivity • · * • · · j’V of blood donors infected with three different types of * · · [···] hepatitis C virus. Lancet 338, 1391.
« e · CHAN, S.W., HOLMES, E.C.. MCCOMISH, 7., FOLI£TT, E. , YAP, P.i. & SIMMONDS, p. (1992a). Phylogenetic analysis of a *„/ new, highly divergent HCV type (type 3): effect of :/.: sequence variability on serological responses to infection. Hepatitis c virus and related viruses, e
Molecular virology and pathogenesis. First Abstract D5, * e *:**: 73 (Abstract).
38 1 1 8688 CHAN, S. N., MCCOMISH, F., HO IKES, E.C., DON, B., PEUTKERER, J.IT, FOLLETT, £., YAF, P.I. & SIMMONDS, P. (1992b). Analysis of a new hepatitis C virus type and its phylogenetio relationship to existing variants. Journal of general Virology 73, 1131*1141.
CHOO, Q.L,, KUO, 6., WEINER, A.J., OVERBY, L.R., BRADLEY, D.W. & HOUGHTON, K. (1989). Isolation of a cDNA derived from a blood-borne non-A, non-B hepatitis genome. Science 244, 359-362.
CHOO, Q.L., RICHMAN, R.H., HAN, J.H. , BERGER, K., LEE, C., DONG, C., GALLEGOS, C., COXT, D,, MEDINA SELBY, R., BARR, P.J., WEINER, A.J., BRADLEY, D.W., KUO, G. & HOUGHTON, M. (1991). Genetic organisation and diversity of the hepatitis C virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. U.S.A. 88, 24S1-2455.
ENOMOTO, N., TAKADA, A., NAKAO, T, & DATE, T. (1990).
e
Thera are two major types of' hepatitis c virus in Japan.
• · • φ · *i Biochemical and Biophysical Research communications 170, • · · I ·· •V! 1021-1025.
• · · FELSENSTEIN, J. (1991). In PHYLIP manual version 3,4 ··· · :V: Berkeleys University Herbarium, University of California.
HAN. J.K., SHYAMALA, V., RICHMAN, K.H. , BRAUER, M.J. , • · ί *" IRVINE, 3., URDEA, M.S., TEKAMP OLSON, , KUO, G. , CHOO, • « · • · *"* Q.L., s HOUGHTON, M. (1991). characterization of the * f ’· " terminal regions of hepatitis c viral RNAs identification of conserved sequences in the 5' untranslated region and • · ‘»'«I poly (A) tails at the 2· end. Proceedings of the National
Academy cf Sciences, U.S.A.88, 1711-1715, 118688 39 HIGGINS, D.G., BLEASBY, A.J. & FUCHS, K. (1992). Clustal V: improved software for multiple sequence alignments. CABIOS 8, 189*191.
HUIKATA, H., KATO, N., OOTSUYAMA, Y., NAKAGAKA, Ä., OHKOSHI, 5 & 3HIMOTOHNO, K. (1991). Hypervariatole regions in the putative glycoprotein of hepatitis C virus* Biochemical and Biophysical Research Communications 175, 220-228 HOUGHTON, M,, WEINER, A., HAN, J., KUO, G, t CHOO, Q.L. (1991) . Molecular biology of the hepatitis c viruses: implications for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatology 14, 381-388, INCHAUSPE, G., ZEBEDEE, S., LEE, D., SUGITANI, K., NASOFF, H. & PRINCE, A.M. (1991). Genomic structure of the human prototype strain K of hepatitis C virus: Comparison with
American and Japanese isolates, proceedings of the * ·«··
National Academy of Sciences, U.S-A.88, 10292-10296.
• · :\j KANAX, K., ΚΑΚΟ, Μ. & ΟΧΑΜΟΤΟ,Η. (1992). HCV Genotypes in • · :.:: chronic Hepatitis-c and Response to Interferon. Lancet • · ll\} 339, 1543.
• · · KATO, N., HUIKATA, M., 00TSUYAMA, Y., NAKAGAWA, M, , j*·., OHKOSHI, S., SUGXMURA, T. S SHIKOTOHNO, K. (1990).
O Molecular cloning of the human hepatitis c virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A.
:Vt! 87, 9524-9528.
·«··« • « 40 118688 KATO, N., OOTSUYAMA, Y., OHKOSHX, S., NAKAZAWA, T., KORI, 3., HUIKATA/ Ή. & SHIMOTOHNO, K. (1991). Distribution of plural H CV types in Japan, Biochemical and Biophysical Research Communications 181, 279*285.
KUO, <5. i CHOO, Q.I., ALTER, H.J., GITNICK, G.I., REDEKER, A. G., PURCELL, R.H., MIYAMURA, T., DXENSTAG, J.X., ALTER, M.J., STEVENS, C.E., TEGTMEIER, F., BONINO, F., COLOMBO, M., LEE, W.S., KUO, C., BERGER, K. SCHUSTER, J.R., OVERBY, L.R., BRADLEY, D.W. & HOUGHTON, M. (1989). An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of huaan non-A, non-B hepatitis. Science 244, 362*364.
MC0KX5H, F., CHAN, S.W., DON, B.C., GILLON, J., FRAME, W.D., CRAWFORD, R.J., YAP, P.L-, FOLLETT, E.A.C. & SIMMONDS, P. (1992). Detection of three types of hepatitis c virus in blood donors: investigation of type-specific differences in serological reactivity and ··· rate of alanine aminotransferase abnormalities.
··♦·
Transfusion in press.
\**i HILLER, R.H. 6 PURCELL, R.H. (1990). Hepatitis C virus • · • I · shares amino acid sequence similarity with pestiviruses * * # *".* and f lavi viruses as well as members of two plant virus • a · • · · supergroups. Proceedings of the National Academy of !\ Sciences, U.S.A. 87, 2057-2061.
e ee MORI, s., KATO, N., YAGYU, A., TANAKA, T., IJEEDA, Y. , « : PETCHCLAI, B., CHIEWSLIP, P., KURIMURA, T & SHIMOTOHHO, K.
« e (1992) . A new type of hepatitis C virus in patients in e V*: Thailand. Biochemical and Biophysical Research * ' communications 183, 334-342.
118688 41 OGATA, K., ALTER, H.J., HILLER, R.H. & PURCELL,R.H.
(1991). Nucleotide sequence and mutation rate of the H strain of hepatitis c virus. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A.88, 3392-3396.
OKAMOTO, H., OKADA, S., SUGΙΪΑΜΑ, Y., YOTSUHOTO, S,, TANAKA, T., YOSHIZAWA, H., T6UDA, F., MXYAXAWA, Y ft MAYUMI, H. (1990). The 5'-terminal sequence of the hepatitis C virus genome. Japanese journal of Experimental Medicine so, 167-177.
OKAMOTO, H., OKADA, S., SUGXYAHA, Y., KURAT, K., XXZUKA, H., MACHIDA, A., MIYAXAtfA, Y & MAYUHX, H. (1991). Nucleotide sequence of the genomic SNA of hepatitis C virus isolated from a human carrier: comparison with reported isolates for conserved and divergent regions. Journal of General Virology 72, 2697-2704.
OKAMOTO, H.r KURAI, K., OKADA, S., YAMAMOTO, K., LZZUKA, H., TANAKA, T., FUKUDA, S., TSUDA, F & HISHIRO, S. (1992).
«·♦ ***:. Full-length sequence of a hepatitis C virus genome having • · · • ·· : poor homology to reported isolates: comparative study of • · four distinct genotypes, virology 188, 331-341.
• · POZZATO, g>, MORETTI, M., FRANZIN, F., CROCE, L.5., φ«» * * · TIRIBELLI, C., MAS A YU, 7., KANEKO, S. , UNOUSA, K. & :·, KOBAYASHI, K. (1991). Severity of liver disease with • ·· :***: different hepatitis c viral clones. Lancet 338,509.
* · · SAITOU, n. , & NEI, M. (19B7). The neighbor-joining method: • · ""I a new method for reconstructing phylogenetic trees.
:Y: Molecular Biological Evolution 4, 406-425.
* • 42 118688 SIKMONDS, F., WCOKISH, F,, YAP, P.I. CHAN, S.W., LXN, C.X., DUSHZIKcT, G. SAEED, A.A. 6 HOLMES, E.C. (1993), Sequence variability In the 5' non coding region of hepatitis C virus: identification of a new virus type and restrictions on sequence diversity. Journal of General Virology 74, 661-668.
SIMMONDS, P., HOLMES, E.C., CHA, T.A., CHAN, S.W.,
HcOMXSH, F. , IRVINE, B., BEALL, E., YAP, P.L., KOL8ERG, J. and URDEA, M.S. (1993) Classification of hepatitis c virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the ns-5 region. Journal of General virology 7$, 2391-2399.
SXMMONDS, P., BALFE, p., LUDLUM, C.A., BISHOP, J.O. and BROWN, A.J, (1990) Analysis of sequence diversity in hypervariable regions of the external glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology 64, 5840-5850.
SIMMONDS, p,, and CHAN, S.W., (1993) Analysis of viral ·· ·
sequence variation by PCR, In Molecular Virology: A
• ·
Practical Approach, pp. 109-138. Edited by A.J. Davidson :,: j and R.M. Elliot. Oxford 1RL Press.
# · :.:: sxmmonds, f., rose, k.a., graham, s., chan, s.w., mcokish, • · · : F., DOW, B.C., FOLLETT, E.A.C., YAP, P.L., and KARS DEN, .., H., J. Clin. Microb. 31: 1493.
• ·· *.*··. TAKADA, N. , TAXASE.S. ENOMOTO, N., TAKADA, A. & DATE, • * · ,/. 1.(1992). clinical backgrounds of the patients having • ♦· • · **»·· • · * · • · ♦ • ♦ ♦ • · MM* • · 118688 43 different types of hepatitis C virus genomes. J.Hepatol. 14, 35-40.
TAKAKIZAWA, A., MORI, C., ΤΌΚΕ, X., ΚΑΝΑΒΕ, S., MCKAKAKX, S., FUJITA, J. / ONISHI, E., ANDOH, T., YOSHIDA, I 6 OKAYAMA, H. (1991). structure and organisation of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers. Journal of Virology 65, 1105-1113.
TANAKA, T., KATO, N,, NAKAGAWA, H., OOTSUYAMA, Y., CHO, M.J., NAXAZAWA, T,, HUIKATA, M., ISHIMURA, Y. 6 SHXMOTOHNO, K. (1992). Molecular cloning of hepatitis c virus genome from a single Japanese carrier: sequence variation within the same individual and among infected individuals, virus Tes. 23, 39-53.
WEINER, U,, BRAUER, M.J., ROSENBLATT, J., RICKMAN, K.K., TUNG, J., CRAWFORD, K., BONINO, F., SARACCO, G., CHOO,
Q.L., HOUGHTON, M & IT AL. (1991). Variable and hypervariable domains are found in the regions of HCV
• · • · 1 *| corresponding to the flavivirus envelope and NSl proteins • · · • ·1 :'/t and the pestivirus envelope glycoproteins. Virology 180, • · 1 ··· « .1 .1. 842-848, * · · « a · a :T: yanisch-perRon, c., vieira, j. and messing, j. (ises)
Improved M13 phage cloning vectors and host strains: • · • · :t" nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors.
• ·
Gene 33, 103-107.
• a a a · • ·« • · a a a a · * · a • · · t · · a a • ··#· • a 118688 44 YOSHIOKA, K., KAKÖKU, S.f WAKITA, T., XSHIKAWA, T., ΙΤΟΗ, Y., TAKAYANAGl7 h. , HIGASHI, Y., SHIBATA, H. & MORISHEHA, τ. (1992). Detection of hepatitis c virus by polymerase ebain reaction and response to interferon-alpha therapy: relationship to genotypes of hepatitis C virus.
Hepatology 16, 293-299.
• · · • ·· « • · • · · · « • · • · · • · · * · • · · · « · · ··· · • · • · · • · · ··· · • · · · · • · · • · • · • « « ·1· • · • · ··· • · • · · • «ft • · ····· • · • · « · · • · • « · · · • ·

Claims (30)

45 1 1 8688
1. HCV-peptidi, jolla on antigeeninen NS4-sekvens-si, joka voi olla jokin seuraavista:
2. CAGCCTGCTGTTATCCCTGACCGCGAGGTGCTCTACCAGCAGTTCGACGAAATG AGACCTGCCATCATTCCCGATAGAGAGGTGTTGTACCAGCAATTTGATAAGATG AAGCCTGCTGTTGTCCCTGATCGCGAGATCTTATACCAGCAGTTTGACGAGATG GAGTGTTCCAAACACCTTCCACTAGTCGAGCACGGGTTGCAACTTGCTGAGCAATTC • · ·! ’ GAGTGCTCGACCTCGCTCCCCTATATGGACGAGGCACGTGCTATTGCCGGGCAATTC • · \**i 25 GAGTGCTCTAGGCACATCCCCTACCTCGCTGAGGGCCAGCAGATCGCCGAACAGTTC • ·
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, joka on sitoutunut moniantigeenipeptidin ytimeen.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen peptidi, jolla on sekvenssi, joka voi olla jokin seuraavista:
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, joka on fuusioitu toiseen peptidiin fuusiopeptidin muodostamiseksi.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen peptidi fuusioi- • · :.**i 25 tuna toiseen peptidiin, joka voi olla β-galaktosidaasin, :\i glutationi-S-transferaasin, trpE:n tai polyhedriinin koo- | dittava sekvenssi. ··· · • ;1·
6. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mu- ··· ♦ kainen peptidi, joka on leimattu.
5 HCV:n tyyppi 4 QPÄVIPDREVLYQQFDEM HCV:n tyyppi 4 ECSKHLPLVEHGLQLAEQF HCV:n tyyppi 5 RPAIXPDREVLYQQFDKM HCV:n tyyppi 5 ECSTSLPYMDEARAIAGQF HCV:n tyyppi 6 KPAWPDREILYQQFDEM 10 HCV:n tyyppi 6 ECSRHIPYLAEGQQIAEQF.
7. Vasta-aine minkä tahansa edeltävän patenttivaa- timuksen mukaista antigeenistä peptidiä vastaan. φ ·»
8. Sellainen laite immunologista määritystä varten, • « *·"1 joka käsittää kiinteä alustan, johon on kiinnitettynä minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-6 mukainen antigeeninen ···· 35 peptidi. • · • · · * · · • · · 118688
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen laite, jossa kiinteään alustaan on kiinnitettynä HCV:n tyypin 4, tyypin 5 tai tyypin 6 antigeenisten peptidien seosta.
10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen laite, jossa 5 kiinteään alustaan on kiinnitettynä HCV: n tyypin 4, tyypin 5 ja tyypin 6 antigeenisten peptidien seosta.
11. Patenttivaatimuksen 8, 9 tai 10 mukainen laite, jossa seos käsittää lisäksi HCV:n tyyppien 1-3 yhtä tai useampaa antigeenistä NS4-peptidiä.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen laite, jossa seos on HCV:n tyyppien 1, 2, 3, 4, 5 ja 6 antigeenisten peptidien seos.
13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen laite HCV-tyypi-tystä varten, tunnettu siitä, että se käsittää kiinteän 15 alustan, jossa on sarja kohtia, jotka sisältävät HCV-4:n, HCV-5:n ja vastaavasti HCV-6:n antigeenisiä peptidejä.
14. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 8-13 mukainen laite, tunnettu siitä, että kiinteässä alustassa on sarja kohtia, joista kuhunkin kohtaan on kiinnitettynä an- 20 tigeeninen peptidi tai antigeenisten peptidien seos.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen laite, tunnettu siitä, että kukin kohta sisältää seoksen ei-kiinni-tettyjä antigeenisiä, estäviä HCV-peptidejä, josta kussakin ··· ..·ί kohdassa olevasta seoksesta puuttuu sen HCV-tyypin peptidi, • · *.1: 25 jota sen kohdan on tarkoitus havaita. • · !,1:
16. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13 - 15 mull*: kainen laite HCV:n tyyppien 1-6 havaitsemiseksi. • :'j
17. Immunologinen testitarvikesarja, tunnettu • t · siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 14 mukaisen * 30 laitteen ja sarjan liuoksia, joista kukin käsittää anti- .·. geenisten, estävien HCV-peptidien seosta, josta puuttuu sen • ·· HCV-tyypin peptidi, jota kyseisen kohdan on tarkoitus ha- **"* väitä. • ·
15 HCV:n tyyppi 4 [H2N-QPAVIPDREVLYQQFDEM] 8K4K2K-COOH HCV:n tyyppi 4 [H2N-ECSKHLPLVEHGLQLAEQF] 8K4K2K-COOH HCV:n tyyppi 5 [H2N-RPAIIPDREVLYQQFDKM] 8K4K2K-C00H HCV:n tyyppi 5 [H2N-ECSTSLPYMDEARAIAGQF] sK^K-COOH HCV: n tyyppi 6 [H2N-KPAWPDREILYQQFDEM] eK^K-COOH 20 HCV:n tyyppi 6 [H2N-ECSRHIPYLAEGQQIAEQF] 8K4K2K-COOH joissa K4K2K on moniantigeenipeptidin ydin.
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen immunologinen *ϊ1ί 35 testitarvikesarja, tunnettu siitä, että laite immunolo- t gista määritystä varten käsittää kiinteän alustan, jossa on • · · * · M · • · 118688 sarja kohtia, joista kuhunkin on kiinnitetty HCV-tyypin 1, 2, 3, 4, 5 ja 6 antigeenisten peptidien seosta; ja kuuden liuoksen sarjan, joista kukin käsittää seoksen eri antigeenisiä, estäviä HCV-peptidejä, jotka on valittu HCV:n 5 tyypin 1, 2, 3, 4, 5 ja 6 antigeenisten peptidien joukosta, ja kuudesta seoksesta puuttuu vastaavasti sen tyypin antigeeninen peptidi, jota tietyn kohdan, johon kyseistä liuosta laitetaan, on tarkoitus havaita.
19. Sellainen laite immunologista määritystä var-10 ten, joka käsittää kiinteän alustan, johon on kiinnitettynä patenttivaatimuksen 6 mukaista vasta-ainetta.
20. Menetelmä näytteen HCV-vasta-aineiden in vitro -seulontaa varten, tunnettu siitä, että suoritetaan immunologinen määritys käyttäen minkä tahansa patenttivaati- 15 muksen 1-6 mukaista antigeenistä peptidiä ja havaitaan mahdollisesti muodostunut vasta-aine-antigeeni-kompleksi.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeeninen peptidi on kiinnitettynä kiinteään alustaan, ja näytteessä mahdollisesti oleva 20 havaittavaksi tarkoitettu HCV-vasta-aine sitoutuu pepti diin.
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, , tunnettu siitä, että antigeenisten peptidien seosta on ·;·* kiinnitettynä kiinteään alustaan. " 25
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, • · ·.**: tunnettu siitä, että seos on HCV:n tyyppien 1, 2, 3, 4, • * |t| ! 5 ja 6 antigeenisten peptidien seosta. j
:*: 24. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 21 - 23 mu- **·*· kainen menetelmä, tunnettu siitä, että seos antigeeni- 30 siä, estäviä HCV-peptidejä viedään kiinteään alustaan kiin- ··, nitetylle antigeeniselle peptidille yhdessä näytteen kans- • ·* sa, josta estävien peptidien seoksesta puuttuu sen HCV-tyy- • · "* pin peptidi, jota on tarkoitus havaita.
• * !,*·· 25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, *Γ*Ϊ 35 tunnettu siitä, että kiinteässä alustassa on sarja koh-tia, joista kuhunkin kohtaan on kiinnitettynä antigeenisten • Λ ft m · * ♦ * 118688 peptidien seosta; ja kiinteälle alustalle vietävästä antigeenisten, estävien HCV-peptidien seoksesta puuttuu sen HCV-tyypin peptidit, jota tietyn kohdan on tarkoitus havaita.
26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alusta käsittää kuuden kohdan sarjan, joista kuhunkin kohtaan on kiinnitettynä HCV:n tyypin 1, 2, 3, 4, 5 ja 6 antigeenisten peptidien seosta; ja kuhunkin kohtaan vietävästä antigeenisten, estävien peptidien 10 seoksesta puuttuu sen HCV-tyypin antigeeniset peptidit, jota kohdan on tarkoitus havaita.
27. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näytteessä mahdollisesti esiintyvät HCV-vasta-aineet saadaan tarttumaan alustaan, ja sitten 15 patenttivaatimuksen 6 mukaista antigeenistä peptidiä viedään siihen kiinni tarttuneiden HCV-vasta-aineiden havaitsemiseksi .
28. Eristetty HCV-polynukleotidi, jolla on NS4-sekvenssi, joka voi olla jokin seuraavista sekvensseistä:
29. Patenttivaatimuksen 1 mukaista peptidiä koodaa- • · jj · va polynukleotidi. ί
30. Menetelmä HCV:n testaamiseksi näytteestä in »M · .1;1· vitro, tunnettu siitä, että kopioidaan käänteistran- 30 skriptaasilla näytteessä mahdollisesti esiintyvä HCV:n po- ··. lynukleotidi, monistetaan polymeraasiketjureaktiolla ja ha- • ΙΦ *..t> vaitaan monistettu HCV:n polynukleotidi käyttämällä koetti- "1 mena patenttivaatimuksen 28 tai 29 mukaista polynukleoti- :/1 dia. «1··· • · * * · • · · • · · • · · 9 · • · 118688
FI955224A 1993-05-05 1995-11-01 Hepatiitti-C-virustyypit 4,5 ja 6 FI118688B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9309237 1993-05-05
GB939309237A GB9309237D0 (en) 1993-05-05 1993-05-05 Hepatitis-c virus type 4 and 6
GB9400263 1994-01-07
GB9400263A GB9400263D0 (en) 1994-01-07 1994-01-07 Hepatitis-C virus type 4,5 & 6
GB9400957 1994-01-19
PCT/GB1994/000957 WO1994025602A1 (en) 1993-05-05 1994-05-05 Hepatitis-c virus type 4, 5 and 6

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI955224A0 FI955224A0 (fi) 1995-11-01
FI955224A FI955224A (fi) 1995-12-20
FI118688B true FI118688B (fi) 2008-02-15

Family

ID=26302858

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI955224A FI118688B (fi) 1993-05-05 1995-11-01 Hepatiitti-C-virustyypit 4,5 ja 6

Country Status (9)

Country Link
US (4) US6881821B2 (fi)
EP (1) EP0698101B1 (fi)
JP (3) JP3751315B2 (fi)
AT (1) ATE281526T1 (fi)
AU (1) AU695259B2 (fi)
DE (1) DE69434116T2 (fi)
ES (1) ES2231773T3 (fi)
FI (1) FI118688B (fi)
WO (1) WO1994025602A1 (fi)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3751315B2 (ja) * 1993-05-05 2006-03-01 コモン サーヴィシス エージェンシー Ｃ型肝炎ウイルス４、５及び６型
WO1994027153A1 (en) 1993-05-10 1994-11-24 Chiron Corporation Methods of typing hepatitis c virus and reagents for use therein
GB2294690B (en) * 1994-11-01 1998-10-28 United Biomedical Inc Peptides effective for diagnosis and detection of hepatitis C infection
EP0904365A1 (en) 1996-04-19 1999-03-31 The Government of the United States Of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Antigenically reactive regions of the hepatitis-a virus polyprotein
CA2303123C (en) * 1997-09-22 2006-04-11 Chiron Corporation Method for detecting antibodies in a sample
EP2204186B1 (en) 1999-02-17 2016-04-06 CSL Limited Immunogenic complexes and methods relating thereto
ES2311478T3 (es) * 1999-11-19 2009-02-16 Csl Limited Composiciones de vacuna contra el hcv.
WO2002089731A2 (en) * 2001-05-03 2002-11-14 Stanford University Agents for treatment of hcv and methods of use
DK2014671T3 (da) * 2002-03-11 2010-09-20 Lab 21 Ltd Fremgangsmåder og sammensætninger til identificering og karakterisering af hepatitis C
JP5138230B2 (ja) * 2004-01-07 2013-02-06 サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型の決定方法
AU2005250170A1 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Genimmune N.V. Peptides for inducing a CTL and/or HTL response to hepatitis C virus
EP2527474A1 (en) * 2006-10-20 2012-11-28 Innogenetics N.V. Methodology for analysis of sequence variations within the HCV NS3/4A genomic region
CA2580589C (en) 2006-12-19 2016-08-09 Fio Corporation Microfluidic detection system
US8360321B2 (en) 2007-04-02 2013-01-29 Fio Corporation System and method of deconvolving multiplexed fluorescence spectral signals generated by quantum dot optical coding technology
JP2010530912A (ja) 2007-06-22 2010-09-16 フィオ コーポレイション 量子ドットをドープしたポリマーマイクロビーズの製造システム及び方法
WO2009006739A1 (en) 2007-07-09 2009-01-15 Fio Corporation Systems and methods for enhancing fluorescent detection of target molecules in a test sample
WO2009012585A1 (en) * 2007-07-23 2009-01-29 Fio Corporation A method and system for collating, storing, analyzing and enabling access to collected and analyzed data associated with biological and environmental test subjects
CN101861203B (zh) 2007-10-12 2014-01-22 Fio公司 用于形成浓缩体积的微珠的流动聚焦方法和系统以及形成的微珠
WO2009155704A1 (en) 2008-06-25 2009-12-30 Fio Corporation Bio-threat alert system
BRPI0917839A2 (pt) 2008-08-29 2015-11-24 Fio Corp dispositivo de teste de diagnóstico portátil de uso único, e um sistema associado e método para teste de amostras de teste ambientais e biológicas
CA2749660C (en) 2009-01-13 2017-10-31 Fio Corporation A handheld diagnostic test device and method for use with an electronic device and a test cartridge in a rapid diagnostic test
AU2013341227A1 (en) * 2012-11-07 2015-05-07 Gilead Sciences, Inc. HCV genotype 6 replicons

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1049686C (zh) * 1987-11-18 2000-02-23 希龙股份有限公司 非ａ和非ｂ肝炎病毒的诊断及疫苗
US6027729A (en) * 1989-04-20 2000-02-22 Chiron Corporation NANBV Diagnostics and vaccines
JP3114731B2 (ja) * 1990-08-14 2000-12-04 国立感染症研究所長 Ｃ型肝炎ウイルス抗体検出用ペプチド抗原及びその使用方法
CA2070952A1 (en) * 1991-06-11 1992-12-12 Makoto Seki Gene of hepatitis c virus or fragment thereof, polypeptide encoded by the same
DE4209215A1 (de) * 1991-07-04 1993-01-07 Boehringer Mannheim Gmbh Hcv peptidantigene und verfahren zur bestimmung von hcv
DE610436T1 (de) * 1991-11-21 1995-08-03 Common Services Agency Detektion des Hepatis-C Virus.
SG50563A1 (en) * 1993-04-27 1998-07-20 Innogenetics Nv New sequences of hepatitis c virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents
JP3751315B2 (ja) * 1993-05-05 2006-03-01 コモン サーヴィシス エージェンシー Ｃ型肝炎ウイルス４、５及び６型
AU8003894A (en) * 1993-10-29 1995-05-22 Srl Inc. Antigen peptide compound and immunoassay method

Also Published As

Publication number Publication date
US7198892B2 (en) 2007-04-03
JP3895747B2 (ja) 2007-03-22
FI955224A (fi) 1995-12-20
EP0698101B1 (en) 2004-11-03
ES2231773T3 (es) 2005-05-16
US6881821B2 (en) 2005-04-19
US20070160630A1 (en) 2007-07-12
ATE281526T1 (de) 2004-11-15
JP3751315B2 (ja) 2006-03-01
US20080262211A1 (en) 2008-10-23
JP2007075119A (ja) 2007-03-29
AU695259B2 (en) 1998-08-13
EP0698101A1 (en) 1996-02-28
DE69434116D1 (en) 2004-12-09
US7402315B2 (en) 2008-07-22
JPH09500009A (ja) 1997-01-07
WO1994025602A1 (en) 1994-11-10
JP4171508B2 (ja) 2008-10-22
JP2005124585A (ja) 2005-05-19
US20050221296A1 (en) 2005-10-06
US7728121B2 (en) 2010-06-01
AU6579794A (en) 1994-11-21
FI955224A0 (fi) 1995-11-01
DE69434116T2 (de) 2005-10-27
US20050032047A1 (en) 2005-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI118688B (fi) Hepatiitti-C-virustyypit 4,5 ja 6
JP3171793B2 (ja) Ｎａｎｂｖの診断用薬
FI113967B (fi) Hepatitis-C-virustesti
EP0698216B2 (en) Methods of typing hepatitis c virus and reagents for use therein
CA2162134C (en) Hepatitis-c virus type 4,5 and 6
SI8812138A (sl) Nanbv diagnostiki in cepiva

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 118688

Country of ref document: FI

MA Patent expired