ES2311478T3 - Composiciones de vacuna contra el hcv. - Google Patents

Abstract

Un complejo inmunogénico que comprende un complejo orgánico con carga negativa y un antígeno cargado, cuyo complejo orgánico y antígeno están asociados electrostáticamente, en donde el complejo orgánico es un adyuvante con carga negativa y comprende una saponina y un colesterol y en donde el antígeno cargado comprende (i) uno o más polipéptidos inmunogénicos a partir de una región del Virus de la Hepatitis C (HCV) seleccionados de Core, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b, o (ii) una proteína de fusión que comprende un polipéptido inmunogénico a partir de la región Core del HCV y un segundo polipéptido inmunogénico seleccionado de las regiones E1, E2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b del HCV.

Description

Composiciones de vacuna contra el HCV.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona generalmente con una composición de vacuna y con un complejo inmunogénico para utilizar en la composición de vacuna. En particular, la invención se relaciona con un complejo inmunogénico que comprende un portador orgánico cargado, más particularmente un portador orgánico con carga negativa, y un antígeno cargado, más particularmente un antígeno cargado positivamente, en donde el antígeno cargado es una poliproteína, preferiblemente la proteína del núcleo, del Virus de la Hepatitis C (HCV) o un fragmento de este, o una proteína de fusión que comprende dicha poliproteína o un fragmento de esta. Las composiciones de vacunas y complejos inmunogénicos de la presente invención son útiles, inter alia, como agentes terapéuticos y/o profilácticos para facilitar la inducción de respuestas inmunes, y en particular una respuesta de linfocitos-T citotóxicos, en el tratamiento de una condición patológica que resulta de una infección por HVC.

Antecedentes de la invención

El virus de la hepatitis C (HCV) actualmente se reconoce como la principal causa de la enfermedad del hígado crónica y se estima que 170 millones de personas están infectadas actualmente con el virus (Armstrong, G. L., M. J. Alter, G. M. McQuillan, and H. S. Margolis. 2000. Hepatology 31:777, Cohen, J. 1999. Science 285:26). A pesar de estos números alarmantes, muy pocas terapias están disponibles para el tratamiento y aquellas disponibles son de baja eficacia. Las terapias mejoradas se necesitan desesperadamente pero su desarrollo ha sido obstaculizado por la falta de un modelo de animal pequeño para la infección y enfermedad, y sistemas ineficientes para cultivar el virus. Muchos estudios han sugerido que las respuestas inmunes mediadas de la célula T para la infección por HVC pueden afectar el resultado de infección por HCV y la enfermedad (Missale, G., R. Bertoni, V. Lamonaca, A. Valli, M. Massari, C. Mori, M. G. Rumi, M. Houghton, F. Fiaccadori, and C. Ferrari. 1996. J. Clin. Invest. 98:706., Cooper, S. L., A. L. Erickson, E. J. Adams, J. Kansopon, A. J. Weiner, D. Y. Chien, M. Houghton, P. Parham, and C. M. Walker. 1999. Immunity 10:439, Lechner, F., D. K. Wong, P. R. Dunbar, R. Chapman, R. T. Chung, P. Dohrenwend, G. Robbins, R. Phillips, P. Klenerman, and B. D. Walker. 2000. J. Exp. Med. 191:1499). Adicionalmente existe una correlación inversa entre la frecuencia de las células T citotóxicas específicas de HCV (CTLs) y la carga viral y la presencia de CTLs específicas del HCV Core antes del tratamiento con el interferón se ha asociado con la consiguiente respuesta de pacientes a esta terapia (Nelson, D., C. Marousis, G. Davis, C. Rice, J. Wong, M. Houghton, and J. Lau. 1997. J. Immunol. 158:1473. Nelson, D. R., C. G. Marousis, T. Ohno, G. L. Davis, and J. Y. Lau. 1998. Hepatology 28:225). Por lo tanto, una vacuna capaz de producir CTLs puede ser útil en el control de HCV particularmente como un complemento para las terapias actuales. El uso de las proteínas de HCV para el desarrollo de la vacuna se ha descrito previamente (Houghton, EP Patent No. 0318216).

Las propiedades del adyuvante de saponina se han conocido durante mucho tiempo, como su capacidad para incrementar los títulos de anticuerpos a inmunógenos. Según se utiliza aquí, el término "saponina" se refiere a un grupo de glucósidos de superficie activa de origen vegetal compuestos de una región hidrofílica (usualmente varias cadenas de azúcar) en asociación con una región hidrofóbica de ya sea una estructura esteroide o triterpenoide. Aunque la saponina está disponible de un número de diversas fuentes, las saponinas con actividad adyuvante útil, han sido obtenidas del árbol de América del Sur Quillaja saponaria (Molina). La saponina obtenida de esta fuente se utilizó para aislar una fracción "homogénea" denominada "Quil A" (Dalsgaard, K., (1974), Arch. Gesamte Virusforsch. 44:243).

La reactividad en el sitio de dosificación es una preocupación importante para el uso tanto veterinario como humano de Quil A en preparaciones de vacuna. Una manera de evitar esta toxicidad de Quil A es el uso de un complejo de inmunoestimulación (conocido como un ISCOM^{TM}, una abreviatura para Immuno Stimulating COMplex). Esto es ante todo porque, Quil A es menos reactivo cuando se incorpora en los complejos de inmunoestimulación, porque su asociación con el colesterol en el complejo, reduce su capacidad de enlace al colesterol en membranas celulares y por lo tanto sus efectos líticos de la célula. Además, se necesita una menor cantidad de Quil A para generar un nivel similar de efecto adyuvante.

Las propiedades inmunomodulatorias de las saponinas Quil A y los beneficios adicionales que se derivan a partir de estas saponinas, cuando se incorporan en un complejo de inmunoestimulación han sido descritos en varias publicaciones, por ejemplo Cox and Cox, J.C. and Coulter, A.R. Advances in Adyuvante Technology and Application in Animal Parasite Control Utilising Biotechnology, Chapter 4, Editor Yong, W.K. CRC Press (1992); Cox, J.C. and Coulter, A.R. (1997) Vaccine, 15(3):248-256; Cox, J.C. and Coulter, A.R. (1999) BioDrugs 12(6):439-453); Dalsgaard, (1974) (supra); Morein et al., (1989) "Immunostimulating complejo (ISCOM)", In "Vaccines: Recent Trends and Progress". G. Gregoriadis, A.C. Allison and G. Poster (Eds). Plenium Press, New York, p.153; Australian Patent Specifications Nos. 558258, 589915, 590904 and 632067.

Los ISCOMs clásicos se forman por combinación del colesterol, la saponina, fosfolípido, e inmunógenos, tales como proteínas cubiertas virales. Las composiciones matriz ISCOM (conocidas como ISCOMATRIX^{TM}) se forman idénticamente, pero sin proteínas virales. Los ISCOMs parecen estimular ambas respuestas inmunes celulares y humorales. Los ISCOMs se han fabricado con proteínas de varios virus, incluyendo HSV-1, CMV, EBV, virus de la hepatitis B (HBV), virus de la rabia, y virus de la influenza, ver por ejemplo, I.G. Barr et al., Adv. Drug Delivery Reviews, 32:247-271 (1998). Se ha observado que cuando el ADN desnudo o los polipéptidos a partir de agentes infecciosos son pobremente inmunogénicos cuando se dan por ellos mismos, la inclusión dentro de los ISCOMs ha incrementado su inmunogenicidad. Se ha demostrado que varias proteínas formuladas con los ISCOMs inducen la CTL, principalmente en modelos de roedores. Berzofsky, (1991), Biotechnol. Ther. 2:123-135; Hsu et al., (1996), Vaccine 14:1159-1166; Lipford et al., (1994), Vaccine 12:73-80; Mowat et al., (1991), Immunology 72:317-322; Osterhaus et al., (1998), Dev. Biol. Stand. 92:49-58; Rimmelzwaan et al., (1997), J. Gen. Virol. 78 (pt.4):757-765; Sambhara et al., (1998), J. Infect. Dis. 177: 1266-1274; Sambhara et al., (1997), Mech. Aging Dev. 96:157-169; Sjolander et al., (1997), Vaccine 15:1030-1038; Sjolander et al., (1998), J. Leukoc. Biol.. 64:713-723; Takahashi et al., (1990), Nature 344:873-875; Tarpey et al., (1996), Vaccine 14:230-236; Trudel et al., (1987), Vaccine 10:107-112; Verschoor et al., (1999), J. Virol. 73:3292-3300; Villacres- Eriksson, (1995), Clin. Exp. Immunol. 102:46-52; Zugel et al., (1995), Eur. J. Immunoll. 25:451-458.

Se piensa que, la asociación entre el antígeno y el adyuvante es importante para la inducción óptima de respuestas inmunes en CTL particular (Cox, J.C. and Coulter, A.R. (1999) BioDrugs, 12(6):439-445). Se ha hecho un número de estudios, que confirma esta hipótesis incluyendo el trabajo con virosomas y ISCOMs^{TM} (Ennis, F. A., Crux, J., Jameson, J., Klein, M., Burt, D. and Thipphawong, J. 1999. Virology 259: 256-261., Zurbriggen, R., Novak-Hofer, I., Seelig, A. and Gluck, R. (2000), Progress in lípido Research 39: 3-18. Usualmente la asociación entre ISCOM^{TM} y el antígeno se ha logrado por la incorporación de antígenos anfipáticos en la estructura ISCOM^{TM} durante la formación (Morein, B., B. Sundquist, S. Hoglund, K. Dalsgaard, and A. Osterhaus. 1984. Nature 308:457). La incorporación fue por interacciones hidrofóbicas. Sin embargo muchos antígenos, tales como la proteína del núcleo HCV, fueron capaces de ser incorporados en los ISCOMs^{TM} por el método clásico. Los métodos más recientemente asociados con los antígenos con un preformado complejo libre de proteínas de inmunoestimulación (ISCOMATRIX ^{TM}) utilizando interacciones de quelación y electrostático han sido desarrollados (Aplicaciones de Patentes Internacionales Nos. PCT/AU98/00080 - WO 98/36772, y PCT/AU00/00110).

La proteína del núcleo de HCV, lo mismo que las proteínas de membrana E1 y E2, se ha demostrado que es útil en la inmunización contra HCV (ver, por ejemplo, co-pendiente de la Aplicación de la Patente U.S. Serie No. 08/823,980). Las secuencias para las proteínas de membrana también contienen ciertas regiones conservadas, aún en los dominios hipervariables de estas, que proporcionan utilidad incrementada para la inmunización contra los diversos mutantes de escape responsables de infecciones crónicas. Permanece una necesidad, sin embargo, de métodos y composiciones que incrementen la capacidad de estas proteínas y polipéptidos de ser inmunogénico y estimular el desarrollo de amplio y durable CTL activo contra la infección por HVC. En el trabajo que condujo a la presente invención, los inventores han desarrollado un complejo inmunogénico basándose en la asociación electrostática de un antígeno del HCV y un portador orgánico, tal como un adyuvante. Esta asociación electrostática permite la co-entrega del antígeno y el portador orgánico para el sistema inmune, para el propósito de inducir una respuesta inmune, particularmente una respuesta de linfocitos-T citotóxicos, en el antígeno.

Resumen de la invención

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto demande otra cosa, la palabra "comprende", y las variaciones tales como "comprende" y "que comprende" se entiende que implican la inclusión de un indicado número entero o grado o grupo de números enteros o grados, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grado de grupo de números enteros o grados.

Un aspecto de la presente invención se relaciona con un complejo inmunogénico que comprende un complejo orgánico con carga negativa y un antígeno cargado, complejo orgánico y antígeno que están asociados electrostáticamente, en donde el complejo orgánico es un adyuvante con carga negativa y comprende una saponina y colesterol y en donde el antígeno cargado comprende (i) uno o más polipéptidos inmunogénicos de una región del Virus de la Hepatitis C (HCV) seleccionado de Core, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b, o (ii) una proteína de fusión que comprende un polipéptido inmunogénico de la región Core del HCV y un segundo polipéptido inmunogénico seleccionado de las regiones E1, E2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b del HCV.

Preferiblemente, la poliproteína es la proteína del núcleo del HCV.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con una composición de vacuna que contiene como el componente activo un complejo inmunogénico de acuerdo con la invención junto con uno o más portadores o diluentes farmacéuticamente aceptables.

Otro aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el uso de un complejo inmunogénico o una composición de vacuna de acuerdo con la invención en la fabricación de un medicamento para utilizar en un método para el tratamiento o prevención de una infección por HVC en un mamífero causando, induciendo o por otra parte facilitando, una respuesta inmune a un antígeno del HCV.

Todavía un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el uso de un complejo inmunogénico o una composición de vacuna como se describe anteriormente en el texto, en la fabricación de un medicamento para inhibir, detener, retrasar o prevenir el inicio o evolución de una infección por HVC.

Aún otro aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un complejo inmunogénico o composición de vacuna de acuerdo con la invención para utilizar en un método de tratamiento del organismo humano o animal mediante una terapia.

Como se describe adicionalmente a continuación, los complejos inmunogénicos de la presente invención pueden incluir, como el antígeno cargado, una proteína de HCV tal como una proteína de la nucleocápsida del HCV Core, una proteína no-estructural, los fragmentos inmunogénicos de cualquiera de dichas proteínas, o combinaciones de tales proteínas. Dichos fragmentos generalmente incluyen polipéptidos que comprenden epitopes reconocibles por las células T. Los fragmentos preferidos comprenden aquellos fragmentos que son inmunogénicos cuando se suministran por ellos mismos, o cuando se incluyen en un complejo inmunogénico de la presente invención. Como se utiliza a lo largo de la especificación, el término "poliproteína del HCV" o "proteína de HCV" tiene la intención de incluir la proteína de longitud total lo mismo que fragmentos de polipéptidos. Una proteína de HCV tal como una proteína de la nucleocápsida del HCV Core, una proteína no-estructural, la proteína de membrana E1, la proteína de membrana E2, los fragmentos inmunogénicos de cualquiera de dichas proteínas o combinaciones de tales proteínas también pueden estar presentes en los complejos inmunogénicos de la presente invención como proteínas de fusión, dependiendo de cual método de expresión de la proteína de HCV se escoge. Las secuencias para estos polipéptidos y proteínas se conocen (ver, por ejemplo Patente U.S. No. 5,350,671). La invención también proporciona polipéptidos que son homólogos (i.e., tienen identidad de secuencia) a estos fragmentos. Dependiendo del fragmento particular, el grado de identidad de la secuencia preferiblemente es mayor del 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más). Estos polipéptidos homólogos incluyen mutantes y variantes alélicas de los fragmentos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 es una representación gráfica del análisis de gradiente de sacarosa de formulaciones Core-ISCOM^{TM} para la proteína del núcleo (Figura 1A), ISCOMATRIX^{TM} (Figura 1B), y Core-ISCOM^{TM} (Figura 1C).

Figura 2: B-LCLs de los dos animales sin respuesta, inmunizados-ISCOM-HCV Core no pueden presentar los péptidos derivados de Core 121-135 y 86-100. Figura 2A: La línea CTL 121-135-específica, establecida del animal DV037 se probó en un ensayo de liberación ^{51}Cr estándar para su capacidad de lisar las células diana DV037 B-LCL sensibilizadas con el péptido 121-135 (cuadrados sólidos) o un péptido irrelevante (cuadrados abiertos), células diana AY921 B-LCL sensibilizadas con el péptido 121-135 (cuadrados sólidos) o un péptido irrelevante (círculos abiertos), y células diana BB231 B-LCL sensibilizadas con el péptido 121-135 (triángulos sólidos) o un péptido irrelevante (triángulos abiertos). Figura 2B: La línea CTL 86-100-específica se probó en un ensayo de liberación ^{51}Cr estándar para su capacidad de lisar las células diana DV036 B-LCL sensibilizadas con el péptido 86-100 (cuadrados sólidos) o un péptido irrelevante (cuadrados abiertos), células diana AY921 B-LCL sensibilizadas con el péptido 86-100 (círculos sólidos) o un péptido irrelevante (círculos abiertos), y células diana BB231 B-LCL sensibilizadas con el péptido 86-100 (triángulos sólidos) o un péptido irrelevante (triángulos abiertos).

Figura 3 muestra la longevidad de las respuestas de CTL cebado por vacunación. Las PBMCs de DV037 (Figura 3A) y BB232 (Figura 3B) se re-estimularon in vitro con el péptido epitópico 121-135. Después del enriquecimiento del CD8+, las células se ensayaron para la actividad citotóxica contra los B-LCLs autólogas sensibilizadas con el péptido epitópico 121-135 (círculos sólidos) o un péptido irrelevante (círculos abiertos). Figura 3C muestra los resultados de un experimento donde las PBMCs aisladas recientemente de DV037, 51 semanas después de su última inmunización (dos paneles izquierdos), o PBMCsre-estimulados-in vitro desde el mismo punto de tiempo (dos paneles derechos) se re-estimularon por 12 horas con el péptido 121-135 o un péptido control y se tiñe por la CD8 superficial y IFN-\gamma y TNF-\alpha intracelular. Los linfocitos se controlaron por el lado vs. luz de dispersión hacia adelante y luego para CD8-PerCP. Los registros muestran el log de la intensidad de fluorescencia para TNF-\alpha-FITC e IFN-\gamma-PE.

Figura 4 muestra los títulos de anticuerpos contra Core en el suero de animales inmunizados. Las barras abiertas, pre-inmunización; barras a rayas, 2 semanas después de la segunda inmunización; barras rellenas, 2 semanas después de la tercera inmunización.

Figura 5 muestra las citoquinas de tipo Th-1 y Th-2 en Core-ISCOM-animales inmunizados. El nivel de IFN-\gamma (Figura 5A), IL-2 (Figura 5B), IL-5 (Figura 5C) e IL-10 (Figura 5D) se midió por un ELISA específico en el sobrenadante libre de células de PBMCs aisladas recientemente, estimuladas por 48 h como se describe en los ejemplos. Las barras abiertas, la pre-inmunización; barras a rayas, 2 semanas después de la segunda inmunización; barras rellenas, 2 semanas después de la tercera inmunización. NT: No probada.

Figura 6 muestra restricción MHC clase I de los CTLs de los péptidos 121-135 y 86-100. (Figura 6A) muestra los resultados de un experimento donde la línea CTL del péptido 86-100-específica derivada del animal 15864 se probó en un ensayo de liberación ^{51}Cr estándar para su capacidad de lisar las células diana B-LCL del péptido 86-100 -sensibilizadas derivadas de los animales DV036 (cuadrados sólidos), 15864 (círculos sólidos), 15860 (triángulos sólidos) y 15861 (círculos abiertos). Figura 6B muestra los resultados de un experimento donde la línea CTL del péptido 121-135-específico derivada del animal 15862 se probó en un ensayo de liberación ^{51}Cr estándar para su capacidad de lisar células diana B-LCL sensibilizadas del péptido 121-135 derivadas de los animales DV037 (cuadrados sólidos), BB232 (triángulos sólidos),15862 (triángulos sólidos invertidos), 15863 (círculos sólidos), 15861 (cuadrados abiertos) y 15860 (triángulos abiertos invertidos).

Figura 7 muestra una cuantificación de las respuestas de la célula T CD8+ y CD4+ en animales-ISCOM-Core inmunizados. Las PBMCs recientemente aisladas se re-estimularon ex vivo con B-LCLs autólogas rVVC/E1 o VVwt-infectado (Figura 7A) o con la proteína del núcleo recombinante de un E. coli control (Figura 7B). Las células luego se tiñeron para CD8 o CD4 superficial, e IFN-\gamma y TNF-\alpha intracelular como se describe en los ejemplos. Los linfocitos se controlaron por el lado vs. luz de dispersión hacia adelante y luego por CD8-PerCP (Figura 7A) o CD4-APC (Figura 7B). En la Figura 7A, el porcentaje corregido de las células T CD8+ con IFN-\gamma y/o TNF-\alpha detectable se calculó como (% de células T CD8+ re-estimuladas con rVVC/E1 que fueron IFN-\gamma y/o TNF-\alpha+) - (% de células T CD8+ re-estimuladas con VVwt que fueron IFN-\gamma y/o TNF-\alpha+). En la Figura 7B, el porcentaje corregido de las células T CD4+ con IFN-\lambda y/o TNF-\alpha detectable se calculó como (% de células T CD4+ re-estimuladas con Core que fueron IFN-\gamma y/o TNF\alpha-+) - (% de células T CD4+ re-estimuladas con la E. coli que fueron IFN-\gamma y/o TNF-\alpha+). Las barras abiertas, pre-inmunizadas; barras a rayas, 2 semanas después de la segunda inmunización; barras rellenas, 2 semanas después de la tercera inmunización.

Figura 8 muestra que Core-ISCOM puede servir como un adyuvante para E1E2. Los ratones (10 animales por grupo) se inmunizaron con 2g de solamente E1E2 soluble, 2 g de E1E2 soluble + 2g de Core-ISCOM, o 2 g de E1E2 soluble con adyuvante MF59. Los ratones se desangraron dos semanas después de la tercera inmunización. Los títulos anti-E2 (barras rellenas) y anti-CD81 (barras a rayas) se presentan como la media geométrica de los títulos obtenidos de los ratones individuales de cada grupo. NT: No probada.

Figura 9 es una representación esquemática del genoma HCV, que representa las diferentes regiones de la poliproteína a partir de la cual las actuales proteínas para utilizar con el ISCOMs se derivan.

Figura 10 es una representación gráfica del análisis de gradiente de sacarosa de las formulaciones de 121-ISCOM^{TM} NS35 Core para NS35 Core 121-ISCOM^{TM}. (Figura 10A) y proteína 121 NS35 Core (Figura 10B).

Descripción detallada de las modalidades preferidas

La presente invención se basa, en parte, en el desarrollo de una formulación del complejo inmunogénico, el cual utiliza interacciones electrostáticas para asociar un antígeno de HCV y un portador, lo que facilita, inter alia, la co-entrega de estas moléculas con el sistema inmune. Los complejos inmunogénicos de la presente invención son particularmente apropiados para su uso en facilitar la estimulación de respuestas del linfocito-T citotóxico.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se relaciona con un complejo inmunogénico que comprende un portador orgánico cargado y un antígeno cargado, portador orgánico y antígeno que están asociados electrostáticamente, y en donde el antígeno cargado es una poliproteína del Virus de la Hepatitis C (HCV), preferiblemente la proteína del núcleo del HCV, o un fragmento de esta, o una proteína de fusión que contiene dicha poliproteína o un fragmento de esta.

La referencia a un "complejo" se debería entender como la descripción de una entidad de dos o más distintos componentes químicos que interactúan.

La referencia a un portador o antígeno orgánico "cargado" se debería entender como una referencia a un portador o antígeno orgánico que muestra una carga eléctrica positiva completa o una carga eléctrica negativa completa. Por "completa" se entiende la suma de las cargas positiva y negativa individuales que una molécula dada comprende. Donde la suma de las cargas positiva y negativa individual resulta en una neutralidad eléctrica completa, la molécula no se estima como "cargada" dentro del contexto de la presente invención. Preferiblemente, el portador orgánico comprende una carga negativa completa.

Por consiguiente, la presente invención más particularmente proporciona un complejo inmunogénico como se describe anteriormente, en donde el portador orgánico cargado es un portador orgánico con carga negativa.

La referencia a "electrostáticamente asociado" es una referencia al portador orgánico y el antígeno que se liga, une o por otra parte asocia por medio del cual incluyen interacción electrostática. Por consiguiente, debe entenderse que, en algunos casos la interacción electrostática será solo la fuerza atractiva que resulta en los complejantes del antígeno y el portador orgánico. Sin embargo, en otros casos la formación de la interacción electrostática también puede dar lugar a, o ser asociado con, la formación de otras fuerzas interactivas.

Los términos "poliproteína", "proteína" y "polipéptido" se utilizan en este documento de forma intercambiable y se refieren a un polímero de residuos de aminoácido y no se limitan a una longitud mínima del producto. Por lo tanto, los péptidos, los oligopéptidos, dímeros, multímeros, y similares, se incluyen dentro de la definición. Ambos proteínas y fragmentos de longitud completa de esta, se abarcan por la definición. Los términos también incluyen modificaciones de pos-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Adicionalmente, para propósitos de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservadores en la naturaleza), a la secuencia nativa, siempre y cuando la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagenesis de sitio dirigido, o pueden ser accidentales, como a través de mutaciones de huéspedes que producen las proteínas o errores debidos a la amplificación PCR.

En particular, como se muestra en la Figura 9, varias proteínas se codifican por el genoma del HCV. El orden y nomenclatura de los productos de división de la poliproteína del HCV es como sigue: NH_{2}-C-E1-E2-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b- COOH. La división inicial de la poliproteína se cataliza por proteasas huésped las cuales liberan tres proteínas estructurales, la proteína N-terminal de la nucleocápsida (denominada "Core") y dos glicoproteínas de membrana, "E1" (también conocidas como E) y "E2" (también conocida como E2/NS1), lo mismo que las proteínas no-estructurales (NS) que contienen las enzimas virales. Las regiones NS se denominan NS2, NS3, NS4 y NS5. La NS2 es una proteína de membrana integral con actividad proteolítica. La NS2, ya sea sola o en combinación con NS3, divide el enlace sissle NS2-NS3 que a su vez genera el N-terminal NS3 y libera una gran poliproteína que incluye ambas actividades serina proteasa y ARN helicasa. La proteasa de NS3 sirve para procesar la poliproteína remanente. La terminación de la maduración de la poliproteína se inicia por división autocatalítica en el empalme NS3-NS4a, catalizada por la proteasa de serina NS3. Las posteriores divisiones NS3-mediadas de la poliproteína del HCV parecen involucrar el reconocimiento de los empalmes de división de la poliproteína por una molécula NS3 de otro polipéptido. En estas reacciones, NS3 libera un co-factor de NS3 (NS4a), dos proteínas con función desconocida (NS4b y NS5a), y una polimerasa de ARN dependiente del ARN (NS5b).

Como se explica anteriormente, cualquiera de un número de polipéptidos del HCV derivado de la poliproteína del HCV se puede utilizar en los complejos inmunogénicos de la presente invención. Por lo tanto, estos complejos pueden contener los polipéptidos derivados de la proteína del HCV Core de la nucleocápsida, una proteína no-estructural, la proteína de membrana E1, la proteína de membrana E2, los fragmentos de polipéptidos de cualquiera de tales proteínas, o combinaciones de tales proteínas. Dichos fragmentos pueden ser polipéptidos que comprenden epitopes reconocibles por las células T. Los fragmentos preferidos comprenden aquellos fragmentos que son inmunogénicos cuando se proporcionan por ellos mismos, o cuando se incluyen en el complejo inmunogénico de la presente invención.

Preferiblemente, el complejo inmunogénico de la presente invención comprende la proteína del núcleo de HCV, o un fragmento inmunogénico de esta. La proteína del núcleo de HCV tiene un pH de 10, logrando una carga altamente positiva en el pH neutro y ácido. La referencia a la "proteína del núcleo" de HCV debe entenderse que incluye una referencia a los derivados y equivalentes de la proteína del núcleo.

El polipéptido para su uso en el complejo inmunogénico de la presente invención no necesita ser derivado físicamente del HCV, pero puede ser producido sintética o recombinantemente utilizando técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, y la inmunología, que están dentro de la habilidad del oficio. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, por ejemplo Sambrook Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition (1989); ADN Cloning, Volumes I and II (D.N. Glovere, ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1986); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 and 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds., (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987), Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986).

Adicionalmente, el polipéptido se puede derivar de cualquiera de las distintas cepas de HCV conocidas, tales como a partir de cepas 1, 2, 3 o 4 de HCV. Un número de regiones conservadas y variables se conocen entre estas cepas y, en general, las secuencias de aminoácidos de epitopes derivados de estas regiones tendrán un alto grado de homología de la secuencia, por ejemplo, homología de la secuencia de aminoácidos de más del 30%, preferiblemente más del 40%, cuando las dos secuencias se alinean. Por lo tanto, por ejemplo, el término polipéptido "Core" se refiere a la proteína del núcleo nativa a partir de cualquiera de las diferentes cepas de HCV, lo mismo que análogos, muteinas y fragmentos inmunogénicos de Core, como se define adicionalmente a continuación.

La referencia a "derivado y equivalentes" debe entenderse como una referencia a equivalentes químicos, mutantes, homólogos y análogos de fuentes naturales, sintéticas o recombinantes. Los derivados se pueden derivar de inserción, deleción o sustitución de aminoácidos. Derivados insercionales del aminoácido incluyen fusiones terminales de amino y/o carboxílico lo mismo que inserciones intrasecuencia de aminoácidos sencillos o múltiples. Las variantes de secuencia de aminoácido insercionales son aquellos en los cuales uno o más residuos de aminoácido se introducen en un sitio predeterminado en la proteína aunque la inserción al azar también es posible con la apropiada selección del producto resultante. Las variantes delecionales se caracterizan por la extracción de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes de aminoácidos sustitucionales son aquellas en los cuales un residuo en la secuencia ha sido extraído y un residuo diferente se inserta en su lugar. "Equivalentes" pueden actuar como un análogo funcional del antígeno sujeto. Los equivalentes químicos no pueden necesariamente ser derivados del antígeno sujeto pero pueden compartir ciertas similaridades adaptativas. De manera alternativa, los equivalentes químicos se pueden diseñar para minimizar ciertas propiedades fisicoquímicas del antígeno en cuestión. Los equivalentes se pueden sintetizar químicamente o se pueden detectar después de, por ejemplo, la selección del producto natural. Los homólogos contemplados aquí incluyen, pero no se limitan a, moléculas derivadas de distintas especies.

La presente invención también se extiende a un complejo inmunogénico como se describe anteriormente en donde el antígeno cargado es un fragmento de una proteína de HCV. Por "fragmento" se entiende un polipéptido que consiste de solo una parte de la secuencia de proteína y estructura intacta de longitud completa. El fragmento puede incluir una deleción C-terminal y/o una deleción N-terminal del polipéptido nativo. Un "fragmento inmunogénico" de una proteína de HCV particular generalmente incluirá al menos aproximadamente 5-10 residuos de aminoácido continuos de la molécula de longitud completa, preferiblemente al menos aproximadamente 15-25 residuos de aminoácido continuos de la molécula de longitud completa, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20-50 o más residuos continuos de aminoácido de la molécula de longitud completa, que define un epitope, o cualquier número entero entre 5 aminoácidos y la secuencia de longitud completa, a condición que el fragmento en cuestión retiene la capacidad de producir una respuesta inmune como se define a continuación. Por ejemplo, los fragmentos inmunogénicos preferidos, incluyen pero no se limitan a fragmentos de la proteína del núcleo del HCV que comprende, por ejemplo, los aminoácidos 10-45, 10-53, 67-88, 81-130, 86-100, 120-130, 121-135 y 121-170 de la poliproteína, numerados en relación con la secuencia del HCV-1a presentada en Choo et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2451, así como se definen los epitopes derivados de la región c33c de la poliproteína del HCV, lo mismo que cualquiera de los otros epitopes identificados de las regiones del HCV core, E1, E2, NS3 y NS4. Ver, por ejemplo, Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al. International Publ. No. WO 93/00365; Chien, D.Y. International Publ. No. WO 94/01778; la autorizada Aplicación de la Patente U.S. Serie Nos. 08/403,590 and 08/444,818.

El término "epitope" como se utiliza aquí se refiere a una secuencia de al menos aproximadamente 3 a 5, preferiblemente aproximadamente 5 a 10 o 15, y no más de aproximadamente 1,000 aminoácidos (o cualquier número entero entre estos), que define una secuencia que por sí misma o como parte de una secuencia más grande, estimulará un sistema inmune del huésped para generar una respuesta inmune específica del antígeno celular cuando el antígeno se presenta, o una respuesta de anticuerpo humoral. Un epitope para su uso en el sujeto de la invención no se limita a un polipéptido que tiene la secuencia exacta de la porción de la proteína patrón a partir del cual se deriva. Ciertamente, los genomas virales están en un estado de flujo constante y contienen varios dominios variables que muestran grados relativamente altos de variabilidad entre aislados. Por lo tanto el término "epitope" abarca las secuencias idénticas a la secuencia nativa, lo mismo que las modificaciones a la secuencia nativa, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservadoras en la naturaleza).

Las regiones de un polipéptido dado que incluyen un epitope, se pueden identificar utilizando cualquier número de técnicas de mapeo de epitopes, bien conocidas en el oficio. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Human Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, los epitopes lineales se pueden determinar por ejemplo, al sintetizar al mismo tiempo una gran cantidad de péptidos en soportes sólidos, los péptidos correspondientes a las porciones de la molécula de la proteína, y hacer reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras que los péptidos están todavía unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en el oficio y se describen en, por ejemplo, Patente U.S. No. 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715, todas se incorporan aquí por referencia en su integridad. De manera similar, Los epitopes conformacionales se identifican fácilmente, determinando la conformación espacial de los aminoácidos tal como por, por ejemplo, cristalografía de rayos-X y resonancia magnética nuclear en 2-dimensiones. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Las regiones antigénicas de las proteínas también se pueden identificar utilizando antigenicidad estándar y perfiles de hidropatía, tal como aquellos calculados utilizando, por ejemplo, el programa software Omiga versión 1.0 disponible de Oxford Molecular Group. Este programa de ordenador emplea el método Hopp/Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828 para determinar los perfiles de antigenicidad, y la técnica Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 para perfiles de hidropatía.

Según se utiliza aquí, el término "epitope conformacional" se refiere a una porción de una proteína de longitud completa, o un análogo o muteina de esta, que tiene características estructurales nativas a la secuencia de aminoácido que codifica el epitope dentro de la proteína natural de longitud completa. Las características estructurales naturales incluyen, pero no se limitan a, glicosilación y la estructura tri-dimensional. Preferiblemente, un epitope conformacional se produce recombinantemente y se expresa en una célula a partir de la cual se extrae bajo condiciones que conserven sus deseadas características estructurales, por ejemplo sin desnaturalización del epitope. Tales células incluyen células de bacterias, de levadura, insecto, y de mamífero. La expresión y aislamiento de los epitopes conformacionales recombinantes a partir de la poliproteína del HCV se describen en por ejemplo, Publicación Internacional Nos. WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734, cuyas aplicaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

Según se utiliza aquí el término "epitope de la célula-T" se refiere a una característica de una estructura peptídica que es capaz de inducir la inmunidad de la célula-T hacia la estructura peptídica o un asociado hapteno. Los epitopes de la célula-T generalmente comprenden péptidos lineales determinantes que asumen las conformaciones extendidas dentro de la fisura del enlace del péptido de las moléculas de MHC, (Unanue et al., Science (1987) 236:551-557). La conversión de los polipéptidos a péptidos lineales determinantes asociados de MHC clase II (generalmente entre 5 - 14 aminoácidos de longitud) se denomina "elaboración del antígeno" que se realiza por las células que presentan antígenos (APCs). Más particularmente, un epitope de la célula-T se define por características locales de una estructura peptídica pequeña, tales como propiedades de secuencia de aminoácido primarias que involucran carga e hidrofobicidad, y ciertos tipos de estructuras secundarias, como helicidad, que no dependen del plegado del polipéptido total. Adicionalmente, se cree que los péptidos pequeños capaces de reconocer mediante la ayuda de las células -T generalmente son estructuras anfipáticas que comprenden un lado hidrófobo (para la interacción con la molécula de MHC) y un lado hidrofílico (para la interacción con el receptor de la célula-T), (Margalit et al., Computer Prediction of T-cell Epitopes, New Generation Vaccines Marcel-Dekker, Inc, ed. G.C. Woodrow et al., (1990) pp. 109-116) y adicionalmente que las estructuras anfipáticas tienen una configuración \alpha-helicoidal (ver, por ejemplo, Spouge et al. J. Immunol. (1987) 138: 204-212; Berkower et al. J. Immunol. (1986) 136:2498-2503).

Por consiguiente, los segmentos de las proteínas que incluyen el epitope de la células-T se pueden predecir fácilmente utilizando numerosos programas de ordenador. (Ver por ejemplo, Margalit et al., Computer Prediction of T-cell Epitopes, New Generation Vaccines Marcel-Dekker, Inc, ed. G.C. Woodrow et al., (1990) pp. 109-116). Tales programas generalmente comparan la secuencia de aminoácido de un péptido con las secuencias conocidas para inducir una respuesta de célula-T, y búsqueda para patrones de aminoácidos que se cree que se requieren para un epitope de la célula-T.

En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta nucleótido-a-nucleótido o aminoácido-a-aminoácido de dos secuencias de polinucleótidos o polipéptido, respectivamente. El porcentaje de identidad se puede determinar por una comparación directa de la información de la secuencia entre dos moléculas por alineación de las secuencias, el conteo del número exacto de equivalencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta, y multiplicando el resultado por 100. Los programas de ordenador disponibles, fácilmente se pueden utilizar para ayudar en el análisis, tal como ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, which adapts the local homology algorithm of Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 para el análisis de péptidos. Los programas para determinar la identidad del nucleótido de la secuencia son disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también dependen del Smith y Waterman algoritmo. Estos programas fácilmente se utilizan con los parámetros de defecto recomendado por el fabricante y se describen en el Wisconsin Sequence Analysis Package referido anteriormente. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótido particular con una secuencia referencia se puede determinar utilizando la homología del algoritmo de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización por hueco de seis posiciones de nucleótido.

Otro método para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es utilizar el paquete MPSRCH de programas derechos de autor por la University of Edinburgh, desarrollado por John F. Collins and Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). De este juego de paquetes el algoritmo de Smith-Waterman se puede emplear cuando los parámetros por defecto se utilizan para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalización de hueco abierto de 12, penalización de extensión de hueco de uno, y un hueco de seis). A partir de los datos generados el valor "Equivalente" refleja la "identidad de la secuencia." Otros programas apropiados para calcular el porcentaje de identidad o similaridad entre las secuencias generalmente son conocidos en el oficio, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, utilizado con parámetros de defecto. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP se pueden utilizar utilizando los siguientes parámetros de defecto: código genético = estándar; filtro = ninguno; cadena = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; ordenar por = ALTO PUNTAJE; Base de datos = no-repetitivo, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss proteína + Spupdate + PIR. Detalles de estos programas se pueden dar en la siguiente dirección de internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-binBLAST.

Las secuencias para estos polipéptidos y proteínas se conocen (ver, por ejemplo, Patente U.S. No. 5,350,671). Por ejemplo, un número de polipéptidos inmunogénicos generales y específicos, derivados de la poliproteína del HCV, ha sido descrito. Ver, por ejemplo, Houghton et al., European Publ. Nos. 318,216 and 388,232; Choo et al. Science (1989) 244: 359-362; Kuo et al. Science (1989) 244:362-364; Houghton et al. Hepatology (1991) 14:381-388; Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., International Publ. No. WO 93/00365; Chien, D.Y., International Publ. No. WO 94/01778. Estas publicaciones proporcionan un fondo de gran alcance en HCV generalmente, lo mismo que en la fabricación y usos de reactivos inmunológicos del polipéptido de HCV.

Cabe señalar, que para mayor comodidad, las diferentes regiones de HCV generalmente se definen con respecto al número de aminoácidos relativo a la poliproteína codificada por el genoma de HCV-1a, como se describe en Choo et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2451, con el iniciador metionina que se designa en la posición 1. Sin embargo, los polipéptidos para su uso con la presente invención no se limitan a aquellos derivados de la secuencia de HCV-1a. En este sentido, las regiones correspondientes en otro aislado de HCV, se pueden determinar fácilmente por secuencias de alineación a partir de los dos aislados de una manera que llevan las secuencias en una alineación máxima.

Por ejemplo, los polipéptidos del HCV derivados de la región Core, tal como los polipéptidos derivados de la región encontrados entre los aminoácidos 1-191; aminoácidos 10-53; aminoácidos 10-45; aminoácidos 67-88; aminoácidos 86-100; 81-130; aminoácidos 121-135; aminoácidos 120-130; aminoácidos 121-170; y cualquiera de los epitopes Core identificados en, por ejemplo, Houghton et al., Patente U.S. No. 5,350,671; Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., International Publ. No. WO 93/00365; Chien, D.Y., international Publ. No. WO 94/01778; y la autorizada Aplicación de la Patente U.S. Serie Nos. 08/403,590 y 08/444,818 encuentra su uso en los complejos inmunogénicos de la presente invención.

Los polipéptidos del HCV derivados de la membrana del HCV, incluyendo los polipéptidos derivados de las regiones E1 y E2, lo mismo que las fusiones entre E1 y E2 también encontrarán su uso aquí. Particularmente, las glicoproteínas de membrana del HCV E1 y E2 forman un complejo estable que es co-inmunoprecipitable (Grakoui et al. (1993) J. Virol. 67:1385-1395; Lanford et al. (1993) Virology 197:225-235; Ralston et al. (1993) J. Virol. 67:6753-6761). Se ha demostrado que las glicoproteínas del HCV E1 y E2 son protectoras en estudios en primates. (Choo et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1294-1298). La región E1 madura de HCV1 comienza aproximadamente en el aminoácido 192 de la poliproteína y continúa aproximadamente en el aminoácido 383. La región E2 madura del HCV1 comienza aproximadamente en el aminoácido 384-385 y se extiende hasta aproximadamente el residuo del aminoácido 746 (ver, Lin et al. J. virol. (1994) 68:5063-5073).

Adicionalmente, los polipéptidos derivados de las regiones no-estructurales del virus también encontrarán su uso aquí. La región NS3/4a de la poliproteína del HCV ha sido descrita y la secuencia de aminoácido y la estructura completa de la proteína se revelan en Yao et al. Structure (November 1999) 7:1353-1363. Ver, también, Dasmahapatra et al., Patente U.S. No. 5,843,752. Como se explica anteriormente, tanto la secuencia nativa como los análogos inmunogénicos se pueden utilizar en las formulaciones en cuestión. Dasmahapatra et al., Patente U.S. No. 5,843,752 y Zhang et al., Patente U.S. No. 5,990,276, ambas describen los análogos de NS3/4a y los métodos para elaborarlos.

Adicionalmente, los antígenos de fusión del epitope múltiples (denominados "MEFAs"), como se describe en International Publ. No. WO 97144469, se pueden asociar con los complejos inmunogénicos. Dichos MEFAs incluyen epitopes múltiples derivados de dos o más de las diversas regiones virales. Los epitopes son preferiblemente a partir de más de una cepa del HCV, de esta manera proporciona la capacidad adicional de proteger contra varias cepas del HCV en una sola vacuna.

Adicionalmente, los polipéptidos para su uso en los complejos inmunogénicos de esta invención se pueden derivar de la región NS3 de la poliproteína del HCV. Un número de dichos polipéptidos se conoce, incluyendo, pero no limitando a los polipéptidos derivados de las regiones c33c y c100, lo mismo que las proteínas de fusión que comprenden un epitope NS3, tal como c25. Estos y otros polipéptidos NS3 son útiles en las presentes composiciones y se conocen en el oficio y se describen en, por ejemplo, Houghton et al, Patente U.S. No. 5,350,671; Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., International Publ. No. WO 93/00365; Chien, D.Y., International Publ. No. WO 94/01778; y la autorizada Aplicación de la Patente U.S. Serie Nos. 08/403,590 y 08/444,818.

Es evidente que una multitud de polipéptidos del HCV se puede utilizar en las formulaciones del complejo inmunogénico o se pueden co-administrar con estas, con el fin de proporcionar una respuesta inmune celular contra el antígeno del HCV en cuestión.

La presente invención adicionalmente se extiende con un complejo inmunogénico como se describe anteriormente en donde, la proteína cargada es una proteína de fusión que comprende el núcleo u otra proteína del HCV o un fragmento de esta. La referencia a una "proteína de fusión" debe entenderse como una referencia a una fusión en la cual el núcleo del HCV u otra proteína o fragmento se liga operativamente a otro péptido, polipéptido o proteína. El término "ligado operativamente" se entiende para indicar que el núcleo del HCV u otra proteína o fragmento y el otro péptido, polipéptido o proteína se funden en marco a cada uno, ya sea directa o indirectamente a través de un péptido o polipéptido conector, con la fusión ya sea esta en el final N-terminal o en el final C-terminal del núcleo del HCV u otra proteína o fragmento.

La proteína de fusión puede comprender una proteína tag o fracción del péptido tal como una fracción hexa-his (His)6, fracción glutatión-S-transferasa (GST) o una fracción FLAG.

Preferiblemente, sin embargo, la proteína de fusión comprende un segundo péptido, polipéptido o proteína activo inmunogénicamente, el cual se puede derivar del HCV, o algún otro organismo viral, bacteriano, fúngico o similar.

El conector péptido o polipéptido, cuando se presenta en la proteína de fusión, puede comprender una secuencia a partir de 1 a 50, preferiblemente 1 a 20, y más preferiblemente 1 a 5 residuos de aminoácido.

La referencia a lo largo de esta especificación al "portador orgánico" debe entenderse como una referencia a cualquier molécula, agregado o complejo de moléculas, compuesto u otra entidad que, cuando un antígeno se asocia con esta, facilita la inducción de una respuesta inmune, y en particular una respuesta de linfocitos-T citotóxicos, con el antígeno. El sujeto portador es "orgánico" y, en este sentido, "orgánico" debe entenderse como un compuesto de carbono si se obtiene de manera natural, recombinante o sintéticamente o si es derivado. En una modalidad preferida particularmente el portador orgánico es un adyuvante. Por "adyuvante" se entiende cualquier molécula, agregado o complejo de moléculas, compuesto u otra entidad, que funciona para estimular, mejorar o por otra parte favorecer la expresión de cualquiera o más aspectos de la respuesta inmune. Por ejemplo, el adyuvante puede inducir la inflamación por consiguiente atrayendo las células de respuesta inmune al sitio de localización del antígeno. De manera alternativa, el adyuvante puede liberar lentamente el antígeno, proporcionando por consiguiente que suceda la estimulación del sistema inmune.

Ejemplos de portadores orgánicos cargados, los cuales son adyuvantes apropiados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, saponina, complejos de saponina, cualquiera o más componentes del complejo de inmunoestimulación de la saponina, el colesterol y el lípido conocido como ISCOMATRIX^{TM} (por ejemplo el componente de saponina y/o el componente de fosfolípido), liposomas o emulsiones aceite-en-agua. [La composición y preparación del ISCOMATRIX^{TM} se describen con detalle en la Aplicación de la Patente Internacional Número PCT/SE86/00480, patente Australiana Números 558258 y 632067 y Publicación de la Patente Europea No. 0 180 564]. Ejemplos adicionales de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, aquellos detallados en las publicaciones de Cox y Coulter, 1992, 1997 y 1999. Debe entenderse que el portador orgánico en cuestión puede ser de origen natural o se puede derivar sintética o recombinantemente.

Por consiguiente, la presente invención todavía más preferiblemente proporciona un complejo inmunogénico como se describe anteriormente, en donde el portador orgánico cargado es un adyuvante con carga negativa.

Preferiblemente, el citado adyuvante comprende la saponina o un complejo de saponina. Más preferiblemente, dicho complejo de saponina es el ISCOMATRIX^{TM}.

El portador orgánico de la presente invención también puede ser, en su forma inicial o natural, con carga negativa, cargado positivamente o neutral. El incremento del grado de carga negativa (por ejemplo, cuando el portador orgánico es solo débilmente con carga negativa) o la conversión a neutro o portador orgánico cargado positivamente a un portador orgánico con carga negativa también se puede lograr por cualquier método apropiado conocido por aquellos de habilidad en el oficio. Por ejemplo, cuando el portador orgánico es una emulsión aceite-en-agua, la incorporación de cualquier agente tensoactivo aniónico con un residuo non-polar impartirá una carga negativa completa a la emulsión debido a la inserción del residuo del agente tensoactivo en la gotita de aceite que por consiguiente deja el grupo principal con carga negativa expuesto. La carga negativa de un adyuvante complejo de saponina se puede incrementar, por ejemplo, por la adición de un lípido con carga negativa durante la formación del complejo.

Ejemplos de detergentes que pueden incrementar la carga negativa de un portador incluyen, pero no se limitan a un ácido cólico, ácido deoxicólico, ácido taurocólico y ácido taurodeoxicólico. Ejemplos de lípidos que pueden incrementar la carga negativa de un portador incluyen, pero no se limitan a, fosfolípidos (preferiblemente fosfatidil inositol, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol y ácido fosfatídico y más preferiblemente cardiolipina) y lípidos bacterianos (preferiblemente monofosforil lípido A(MPL) y más preferiblemente difosforil lípido A, tal como OM174 como se describe en Publicación de la Patente Internacional No. WO 95/14026).

Sin limitar, de ninguna manera la presente invención, los inventores han determinado, que cuando el portador orgánico cargado en cuestión y el antígeno cargado, naturalmente se cargan negativa y positivamente, respectivamente, el objetivo de la invención se puede lograr. Sin embargo, un complejo inmunogénico aún más efectivo se puede lograr, si el naturalmente portador en cuestión orgánico con carga negativa se suministra más con carga negativa (preferiblemente por adición de cardiolipina o difosforil lípido A).

Por consiguiente, en una modalidad preferida se proporciona un complejo inmunogénico como se describe anteriormente, en donde el adyuvante con carga negativa es un adyuvante con carga negativa natural que ha sido modificado para incrementar el grado de su carga negativa.

La referencia a un adyuvante con carga negativa "naturalmente", debe entenderse como una referencia a la carga que la molécula lleva bajo su creación - Ya sea por medio natural, recombinante o sintético. La modificación para incrementar el grado de carga se puede lograr por cualquier técnica apropiada como se discute anteriormente. Preferiblemente, el adyuvante objeto se hace más negativo vía la adición de la cardiolipina o el difosforil lípido A.

La presente invención se basa, en parte, en la formación de los complejos inmunogénicos vía la asociación electrostática, preferiblemente, de un portador orgánico con carga negativa con un antígeno cargado positivamente. La administración de dicho complejo a un sujeto facilita la inducción de una respuesta inmune significativamente mejor que se debería lograr fueron el adyuvante y antígeno administrado simultáneamente pero de manera no-asociada. En particular, la administración de un antígeno asociado con un adyuvante, de acuerdo con la presente invención, facilita la inducción de una respuesta del linfocito-T citotóxico con el antígeno. Sin embargo, también se pueden mejorar otras respuestas humorales y celulares.

Generalmente, en el complejo inmunogénico de la presente invención, la relación del portador orgánico cargado con el antígeno cargado, en peso, está en el rango de 5:1 a 0.5:1. Preferiblemente, la relación en peso es aproximadamente 3:1 a 1:1, y más preferiblemente la relación en peso es 2:1.

Sin limitar la presente invención a cualquier teoría o modo de acción, se piensa que el acomplejante del adyuvante con el antígeno facilita la co-entrega del adyuvante y el antígeno con el mismo antígeno que presenta la célula, lo que facilita la inducción de respuestas inmunes que ya sea podrían no ocurrir como podrían no ocurrir como efectivamente fueron estas moléculas no co-entregadas. Por ejemplo, la inducción de algunas respuestas del linfocito-T citotóxico CD8+ se opina que ocurren cuando el adyuvante induce el escape endosomal del antígeno en la célula que presenta el antígeno. Esto necesariamente requiere la co-entrega del antígeno y el adyuvante con la célula que presenta el antígeno.

Un aspecto adicional de la presente invención, por consiguiente se relaciona con el uso de la invención para inducir una respuesta inmune en un mamífero incluyendo, pero no limitando a, una respuesta inmune mediada humoral y/o celular.

Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención se relaciona a una composición de vacuna que comprende como el componente activo de un complejo inmunogénico que comprende un portador orgánico cargado y un antígeno cargado, cuyo portador orgánico y antígeno están asociados electrostáticamente, y en donde el antígeno cargado es una poliproteína del Virus de la Hepatitis C (HCV) o un fragmento de este, o una proteína de fusión que comprende dicha poliproteína o un fragmento de esta, junto con uno o más portadores o diluentes farmacéuticamente aceptables.

Preferiblemente, dicho portador orgánico es un adyuvante, y aún más preferiblemente una saponina o un complejo de saponina. Preferiblemente dicho complejo de saponina es el ISCOMATRIX^{TM}.

Preferiblemente dicho portador orgánico es con carga negativa.

Las composiciones de vacuna de acuerdo con este aspecto de la invención puede ser ya sea profiláctico (i.e. utilizado para prevenir la infección) o terpéutico (i.e. utilizado para tratar la enfermedad después de la infección). Las composiciones de vacunas convencionalmente se administran vía parenteral, por ejemplo por inyección, ya sea vía subcutánea, intramuscular, o transdérmica/transcutánea. Las formulaciones apropiadas adicionales para otros modos de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios, y aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Las composiciones de vacunas se pueden administrar en conjunto con otros agentes inmunoreguladores.

Estas composiciones de vacunas comprenden un complejo inmunogénico de la presente invención en combinación con uno o más portadores o diluentes farmacéuticamente aceptables, dichos portadores incluyen cualquier portador que no induce por sí mismo la producción de una respuesta adversa al individuo que recibe la composición. Los portadores apropiados son usualmente grandes macromoléculas, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, lípidos agregados (tales como gotitas de aceite o liposomas), y partículas de virus inactivos. Tales portadores son bien conocidos por aquellos de ordinaria habilidad en el oficio. Adicionalmente, estos portadores pueden funcionar como agentes o adyuvantes inmunoestabilizantes en adición con el efecto adyuvante del complejo inmunogénico por sí mismo. Adicionalmente, el antígeno se puede conjugar con un toxoide bacteriano, tal como un toxoide diftérico, tetánico, cólera, H. pylori y agentes patógenos.

Las composiciones de vacunas también pueden incluir adicionalmente adyuvantes para mejorar la efectividad de la composición. Adyuvantes apropiados incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc; (2) formulaciones de emulsión aceite-en-agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como muramil péptidos (ver a continuación) o componentes de la pared celular bacteriana), como por ejemplo (a) MF59 (PCT Publ. No. WO 90/14837), que contiene 5% de Escualeno, 0.5% de Tween 80, y 0.5% de Span 85 (opcionalmente que contiene varias cantidades de MTP-PE (ver a continuación), aunque no se requiere) formulada en partículas de submicrones, (b) SAF, que contiene 10% de Escualeno, 0.4% de Tween 80,5% de polímero pluronico-bloqueado, y thr-MDP (ver a continuación) ya sea microfluidizadas en una emulsión de submicrones o agitada en un vórtex para generar una emulsión con tamaño de partículas grande, y (c) sistema de adyuvante Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene 2% de Escualeno, 0.2% Tween 80, y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste de monofosforil lípido A (MPL), trehalosa dimicolato (TDM), y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL+CWS (Detox^{TM}); (3) adyuvantes de saponina, tales como Stimulon^{TM} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA); (4) Adyuvante de Freund Completo (CFA) y Adyuvante de Freund Incompleto (IFA); (5) citoquinas, tales como interleuquinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc), interferones (por ejemplo gamma Interferon), factor estimulante de la colonia de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; (6) mutantes desintoxicados de una toxina ADP-ribosilación bacteriana tal como una toxina del cólera (CT), una toxina de Tos ferina (PT), o una toxina lábil al calor de E. coli (LT), particularmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129; ver, por ejemplo WO 93/13302 y WO 92/19265; (7) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la efectividad de la composición; y (8) micropartículas con macromoléculas adsorbentes, como se describe en la Aplicación de la Patente Internacional No. PCT/US99/17308. Se prefieren Alum y MF59.

Como se menciona anteriormente, apropiados muramil péptidos incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normauramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-s n-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE),
etc.

Las composiciones de vacunas usualmente también contendrán diluentes, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes de humectación o emulsificantes, sustancias reguladoras del pH pueden estar presentes en las composiciones.

Las formas apropiadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles. Deben ser estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y se deben preservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. La prevención de la acción de microorganismos se puede realizar, mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal. En muchos casos, Será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede realizar por el uso en las composiciones de agentes para retrasar la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan, mediante la incorporación de los compuestos activos en la cantidad necesaria en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se necesite, seguido por la esterilización con filtro. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diferentes ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios a partir de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y la técnica de liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de la solución estéril-filtrada previamente de este.

Cuando los ingredientes activos se protegen apropiadamente, se pueden administrar vía oral, por ejemplo, con un diluente inerte o con un portador comestible asimilable, o se pueden adjuntar en cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimir en tabletas, o se incorpora directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con los excipientes y utilizar en la forma de tabletas que se puedan ingerir, tabletas bucales, comprimidos medicinales, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, galletas. Tales composiciones y preparaciones deberían contener al menos 1% en peso del compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, ser variado y convenientemente puede estar entre aproximadamente 5 a aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad del compuesto activo en las indicadas composiciones útiles terapéuticamente, es tal, que una dosificación apropiada se obtendrá. Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo con la presente invención se preparan, de tal manera que una forma por unidad de dosificación oral contiene entre aproximadamente 0.1 \mug y 2000 mg del compuesto activo.

Las tabletas, comprimidos medicinales, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener los componentes que se enumeran a continuación, un aglutinante tal como goma, acacia, almidón com o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente desintegrante tal como almidón com, almidón de patata, ácido algínico; un lubricante tal como magnesio estearato; y un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina se puede adicionar o un agente aromatizante tal como hierbabuena, aceite de especie de planta, o aromatizantes de cereza. Cuando la forma de unidad de dosificación es una cápsula, esta puede contener, además de los materiales del tipo mencionado antes, un portador líquido. Otros diversos materiales pueden estar presentes como cubiertas o de otro modo para modificar la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, tabletas, píldoras, o cápsulas se pueden cubrir con goma laca, azúcar o ambas. Un jarabe o elixir pueden contener el compuesto activo, la sacarosa como un agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y aromatizante tal como sabor a cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma de unidad de dosificación debe ser puro farmacéuticamente y sustancialmente no-tóxico en las cantidades empleadas. Además, el o los compuestos activos se pueden incorporar en las preparaciones y formulaciones de liberación
controlada.

Sin limitar la operación de la presente invención de ninguna manera, la co-entrega del complejo inmunogénico de la presente invención es particularmente útil para inducir una respuesta inmune y, en particular, una respuesta de linfocitos-T citotóxicos a un antígeno. Dicha respuesta inmune puede ser una respuesta inmune específica (célula T y/o célula B) y/o no-específica.

Por consiguiente, aún otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método para producir, inducir o por otra parte facilitar, en un mamífero, una respuesta inmune a un antígeno, dicho método que comprende la administración a dicho mamífero de una cantidad efectiva de un complejo inmunogénico o una composición de vacuna como se describe anteriormente en el texto.

Preferiblemente dicha respuesta inmune comprende una respuesta de linfocitos-T citotóxicos.

Debe entenderse que la respuesta del linfocito citotóxico en cuestión puede ocurrir ya sea en aislamiento o junto con una respuesta de célula T auxiliar, una respuesta humoral u otra respuesta inmune específica o no-específica.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el uso del complejo inmunogénico de la invención en relación con el tratamiento terpéutico y/o profiláctico de condiciones patológicas. Ejemplos de las condiciones patológicas que se pueden tratar de acuerdo con el método de la presente invención incluyen cualquier condición patológica que resulta de la infección por HVC.

Por consiguiente, aún otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método de tratamiento para una condición patológica en un mamífero, dicho método que comprende la administración al indicado mamífero de una cantidad efectiva de un complejo inmunogénico o una composición de vacuna como se describe anteriormente en el texto, en donde la administración de la indicada composición produce, induce o por otra parte facilita una respuesta inmune que inhibe, frena, retrasa o previene el inicio o evolución de la condición patológica.

La entrega directa de las composiciones generalmente se logra por la inyección, ya sea vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular o se entrega al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar dentro de una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple.

Una "cantidad efectiva" significa una cantidad necesaria al menos parcialmente para alcanzar la respuesta inmune deseada, o para retrasar el inicio o inhibir la evolución o detener del todo, el inicio o la evolución de una condición particular que se tratará. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo que se tratará, el grupo taxonómico del individuo que se tratará, la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar los anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración de la situación médica, y otro factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un rango amplio relativamente, que se pueda determinar a través de ensayos de rutina.

El término "mamífero" incluye humanos, primates, animales de cría (por ejemplo, caballos, ganado, ovejas, cerdos, burros), animales de ensayos de laboratorio (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, conejillos de Indias), animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos) y animales salvajes cautivos (por ejemplo, canguros, ciervos, zorros). Preferiblemente, el mamífero es un humano o animal de pruebas de laboratorio. Aún más preferiblemente, el mamífero es un humano.

El mamífero sometido al tratamiento puede ser humano o un animal en necesidad del tratamiento terpéutico o profiláctico de una condición patológica o una condición patológica potencial.

En aún otro aspecto la presente invención se relaciona con el uso de un complejo inmunogénico o composición de vacuna como se describe anteriormente en el texto en la fabricación de un medicamento para inhibir, detener, retrasar o prevenir el inicio o evolución de una condición patológica.

Aún otro aspecto de la presente invención se relaciona con un agente para su uso en inhibir, detener, retrasar o prevenir el inicio o evolución de una condición patológica. El indicado agente que comprende un complejo inmunogénico o composición de vacuna como se describe anteriormente en el texto.

Adicionalmente, las características de la presente invención se describen más completamente en los siguientes Ejemplos no-limitantes.

La referencia al "ISCOPREP^{TM} 703" debe entenderse como una referencia a una preparación de saponina que comprende de 50-90% en peso de la Fracción A de Quil A y 50% a 10% en peso de la Fracción C de Quil A. Las Fracciones A y C se preparan a partir de la fracción lipofílica de Quil A. Las Fracciones "A" y "C", su método de preparación y el método de preparación ISCOPREP^{TM} 703 se detallan en la Publicación de la Patente Internacional No. WO96/11711.

A continuación están los ejemplos de modalidades específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para solo propósitos ilustrativos, y no tienen la intención de limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera. Aquellos de habilidad en el oficio, apreciarán fácilmente que la invención puede ser practicada en una variedad de modos dados de las enseñanzas de esta divulgación.

Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas), pero algún error experimental y desviación deberían, por supuesto, ser permitidos.

Materiales y métodos Animales

Los macacos Rhesus (Macaca mulatta) se alojaron en Southwest Foundation for Biomedical Research (SFBR, San Antonio, TX). Los estudios se llevaron a cabo bajo NIH Guidelines for Care and Use of Laboratory Animals (National Institute of Health. (1985) Guide for the care and use of laboratory animals. US department of Health and Human services. publication No 82-23. National Institute of Health, Bethesda, MD). La tipificación del complejo de histocompatibilidad principal Clase I de los animales se realizó como se describe en (Urvater et al. (2000) J. Immunol. 164:1386.).

Los ratones hembras C57BU6 (H-2b) se compraron en Charles River Laboratories y se utilizaron entre 8 y 10 semanas de edad. Los ratones se alojaron en un ambiente libre de patógeno y se manipularon de acuerdo con las directrices internacionales para la experimentación con animales.

Inmunógenos y Adyuvantes

La proteína recombinante HCV-1a Core derivada de E. coli de longitud completa (aa: 1-191) fue producida y purificada bajo condiciones de GMP y tiene más del 98% de pureza. La proteína recombinante HCV-1a E1 E2_{809} fue producida en las células CHO. Esta proteína E1E2 modificada contenia aminoácidos 192 a 809. La proteína recombinante NS35Core121 fue producida en células de levadura. El adyuvante LTK63 es un mutante desintoxicado genéticamente de la enterotóxina lábil al calor de Escherichia coli, en el cual la Serina en la posición 63 se reemplaza por una Lisina (Partidos et al. (1999) Immunol. Lett. 67:209.). Las formulaciones Core-ISCOM se prepararon mezclando la proteína del núcleo con un ISCOMATRIX^{TM} preformado (ISCOMs^{TM} vacío) utilizando interacciones iónicas para maximizar la asociación entre el antígeno y el adyuvante. ISCOMATRIX^{TM} se preparó esencialmente por los métodos descritos previamente excepto que se utilizó diafiltración en lugar de la diálisis (Coulter et al. (1998) Vaccine 16:1243). El adyuvante aceite-en-agua MF59 ha sido descrito en (Ott et al. (1995) Pharm. Biotechnol.
6:277).

Análisis de gradiente Sacarosa de Core-I SCOM

Después de la formulación, las preparaciones se purificaron en un gradiente de sacarosa (10 a 50% peso/volumen) y las fracciones analizadas para ISCOMATRIX^{TM} y proteína para determinar la cantidad de asociación. ISCOMATRIX^{TM} se analizó utilizando difenilhexatrieno (DPH) el cual tiene fluorescencia cuando se asocia con un lípido. En resumen, DPH se disolvió a 1 mg/ml en acetona luego se diluyó 1 en 50 en PBS pH 7.2, luego 50 \mul se mezclaron con 50 \mul de cada fracción en una placa de microtitulación. Después de la incubación por 150 minutos a 20-25ºC la placa se leyó en un fluorómetro utilizando excitación 355nm y emisión 460nm. La proteína se detectó utilizando Pierce Coomassie de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, 50 \mul de solución de Coomassie se adicionaron a 50 \mul de cada fracción en una placa de microtitulación. La placa se mezcló y la absorbancia se lee a 595nm.

Análisis del Tamaño de Partícula

Las formulaciones se analizaron por tamaño de partícula, mediante la dispersión de la luz dinámica utilizando un Nicomp Submicron Particle Sizer Model 370.

Péptidos y Virus de Vacuna

Los péptidos (15 o 20mer traslapados por 10 aa) que abarcan la longitud total de la proteína Core (aa: 1-191) del HCV-1a (Choo et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2451) se sintetizaron con N-terminal amina libre y C-terminal ácido libre por Research Genetics (Huntsville, AL). El virus de la vacuna recombinante (rVV) que expresa Core y E1 (aa: 1-384; rWC/E1) y de tipo salvaje VV (VVwt) se ha descrito (Cooper et al. (1999) Immunity 10:439).

Inmunización

Los macacos Rhesus se inmunizaron bajo anestesia. El primer estudio se compuso de nueve animales divididos en tres grupos de tres animales cada uno. El primer grupo (animales BB228, BB232 y DV036) se infectaron con 2 x 10^{8} unidades que forman la placa (pfu) (1 x 10^{8} vía intradérmica y 1 x 10^{8} por escarificación) de rVVC/E1 en el mes 0. Este grupo sirvió como un control positivo para la imprimación de CTL. Los animales del segundo grupo (AY921, BB231 y DV037) se inmunizaron con 25 \mug de Core-ISCOM, mediante inyección intramuscular (IM) en los cuádriceps izquierdos en el mes 0, 1, 2 y 6. Los animales del tercer grupo (AY922, BB227 y BB230) se inmunizaron por inyección IM con 200 \mug de HCV-proteína del núcleo son 200 \mug del adyuvante de LTK63 en el mes 0, 1, 2 y 6. Para el segundo estudio, cinco animales (15860, 15861, 15862, 15863 y 15864) se inmunizaron con 50 \mug de Core-ISCOM por inyección IM en los cuádriceps izquierdo en el mes 0, 1 y 2. Algunos animales inmunizados con Core (ver Tabla I) también recibieron 2 x 10^{8} pfu (1 x 10^{8} vía intradérmica y 1 x 10^{8} por escarificación) de rVVC/E1 nueve u once semanas después de su última inmunización con vacuna.

Los ratones (10 animales por grupo) se inmunizaron en los músculos tibiales anterior (50 \mul por músculo) con 2 \mug por dosis de proteína recombinante E1 E2 sola o 2 \mug por dosis de proteína recombinante E1 E2 en la presencia de MF59 (vol: vol), o 2 \mug por dosis de proteína recombinante E1 E2 + 2 \mug por dosis de Core-ISCOM en las semanas 0, 4 y 8.

Las células y líneas celulares

La sangre periférica se extrajo de la vena femoral mientras que los animales estaban bajo anestesia. Las PBMCs se obtuvieron después de la centrifugación sobre un gradiente Ficoll-hypaque y se cultivó en placas de 24-pozos a 5 x 10^{6} células por pozo. De aquellas células, 1 x 10^{6} se sensibilizaron con 10 \muM de una mezcla de péptidos (que consiste de péptidos individuales) por una hora a 37ºC, se lavaron y adicionaron a las remanentes 4 x 10^{6} PBMCs sin tratar en 2 ml de medio de cultivo (RPMI 1640, 10% de suero fetal bovino inactivado por el calor, y 1% de antibióticos) suplementado con 10 ng/ml de IL-7 (R&D, Minneapolis, MN). Después de 48 horas, 5% (final) de sobrenadante que contiene interleucina-2 (T-STIM sin PHA, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) y 50 U/ml (final) de IL-2 recombinante (Chiron Corporation, Emeryville, CA) se adicionaron a los cultivos. Los cultivos se alimentaron cada 3-4 días. Después de 10 días en el cultivo, las células T CD8+ se aislaron utilizando los anticuerpos anti-CD8 unidos a cuentas magnéticas (Dynal, Oslo, Norway) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células CD8+purificadas (>93% puro según se determina por citometría de flujo) se cultivaron por otros 2-3 días antes de que se analizaran para la actividad citotóxica. Las líneas CD8+ péptido específicas se obtuvieron, mediante la restimulación periódica de estas células T CD8+ con B-LCLs autólogas y el péptido.

Las B-LCLs se derivaron de cada animal utilizando los sobrenadantes a partir de H. papio productor de la línea celular S394.

Ensayo CTL

La actividad citotóxica se probó en un ensayo de liberación ^{51}Cr estándar como se describe en otro lugar (Paliard et al. (2000) AIDS Res. Hum. Retroviruses 16:273). En resumen, las B-LCLs se incubaron con 10 \muM de péptidos y 50 \muCi de ^{51}Cr por 1 h, se lavaron tres veces y se sembraron en placas a 5 x 10^{3} células por pozo en una placa de 96 pozos. De manera alternativa, las B-LCLs se infectaron en una multiplicidad de infección (MOI) de 10:1 con rVVC/E1 o VVwt por 1 h, se lavaron y se cultivaron durante la noche antes de la marcación con ^{51}Cr. Las células CD8+ se sembraron en placas por duplicado a tres distintas relaciones E:T y se incubaron con células diana por 4 horas en la presencia de 2 x 10^{5} por pozo de células diana sin marcar (dianas frías), que se adicionaron para minimizar la lisis del B-LCLs por el H. papio o virus endógeno (por ejemplo virus espumoso)-CTLs específicas. Las respuestas del CTL se puntearon positivas cuando el porcentaje de lisis específica en las dos relaciones E:T más altas, fueron mayor a o igual al porcentaje de lisis de las dianas control más 10.

Ensayo de linfoproliferación

Este ensayo ha sido descrito previamente (Hong et al. (1997) J. Virol. 71:6427). En resumen, recientemente los PBMCs aislados se sembraron en placas por triplicado a 2 x 10^{5} células por pozo en 96 pozos placas de fondo redondo y se cultivaron en la presencia de 5 \mug/ml de la proteína del núcleo recombinante o 0.05 \mug/ml de E. coli control. Las placas se pulsaron con 1 \muCi por pozo de ^{3}H-timidina en el día 5 y se cosechan 6-8 horas más tarde. Los resultados se presentan como índice de estimulación (SI) calculado como (media experimental cpm)/(media cpm en la presencia del control E. coli). Un Sl \geq3.0 fue registrado positivo.

Análisis FACS

Las PBMCs recientemente aisladas o PBMCs que han sido re-estimuladas in vitro con un péptido, se cultivaron en medio solo o re-estimulado con 5 \mug/ml de proteína del núcleo, 0.05 \mug/ml de control E. coli, 5 \mug/ml de péptido, o VV-infectado o péptido-sensibilizado B-LCLs autólogos (1:1) por 12 horas en medio de cultivo que contiene 50 U/ml de rIL-2 (Chiron Corporation, Emeryville, CA) y 3 \muM monensina (Pharmingen, San Diego, CA). Las células se tiñeron de acuerdo con Pharmingen's protocol para la superficie CD4 y CD8 con APC-conjugado anti-humano CD4 y PerCP-conjugado anti-humano CD8, y para IFN-\gamma y TNF-\alpha intracelular con PE-conjugado anti-humano IFN-\gamma y FITC-conjugado anti-humano TNF-\alpha. Los anticuerpos fueron de Pharmingen and Becton-Dickinson (San Jose, CA). Las células se analizaron en un FACScalibur. Los archivos de los datos se analizaron utilizando el software CellQuest.

ELISA de la citoquina

Las PBMCs del macacos Rhesus aisladas recientemente se re-estimularon con péptidos que abarcan la proteína del núcleo completa. Los niveles de IL-2, IL-5, IL-10 y IFN-\gamma del mono Rhesus presentan en 48 horas sobrenadantes de cultivo libre de células, se determinaron por ELISA específica (U-Cytech, Utrecht, The Netherlands) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Anticuerpos HCV

Los niveles de suero de los anticuerpos de HCV Core y HCV E2 se cuantificaron por ELISA como se describe (Chien et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:10011). Los niveles de suero de anticuerpos para inhibir el enlace de E2 con el receptor CD81 del HCV putativo (Pileri et al. (1998) Science 282:938) se determinaron por inmunoensayo.

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Ejemplo 1

Análisis de Gradiente de Sacarosa de Core-ISCOM

La Proteína Core se encontró en las fracciones 5 a 11 (Figura 1A) mientras que ISCOMATRIX® se encontró en las fracciones 9 a 13 (Figura 1B). El Core-ISCOM se encontró en las fracciones 14-17 con ambos picos traslapados de ISCOM^{TM} y la proteína, lo que indica la asociación (Figura 1 C).

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Ejemplo 2

Estabilidad de Core-ISCOM

La estabilidad de la formulación Core-ISCOM^{TM} se evaluó por 11 meses. Ambos el tamaño de partícula y la asociación permanecen consistentes por al menos 11 meses a 2-8ºC (Tabla I).

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Ejemplo 3

Cebado de CTLs-Core específicas en Animales Vacunados

Como se explica anteriormente, dos distintas vacunas prototipos (Core-ISCOM y Core + LTK63) lograron inducir la respuesta de las HCVCTLs-Core específicas cada una se administró a tres macacos Rhesus HCV-naive (ver Tabla II para el programa de asignación, dosificación e inmunización del animal). Dado que era desconocido si la moléculas clase I MHC del macacos Rhesus se puede unir y presentar péptidos derivados de HCV-Core y si el repertorio de la célula T CD8+ seleccionado positivamente en estos animales puede reconocer tal como complejos de péptidos derivados de Core-MHC clase I, tres animales adicionales se inocularon con 2 x 10^{8} pfu de rVVC/E1 para servir como controles positivos (Tabla II).

Ninguno de los nueve animales tuvo ninguna CTLs detectable en el tiempo de inmunización (semana 0; Tabla III y datos no mostrados). Esto confirma que estos animales no han sido expuestos previamente a HCV Core y que la re-estimulación de PBMCs bajo las condiciones descritas en Materiales y Métodos no resultó en la imprimación de respuestas primarias de CTL in vitro. Dos semanas después de la infección de rVVC/E1, dos (BB232 y DV036) de los tres animales tuvo CTLs detectables contra la mezcla de los péptidos Core 4 (aa: 121-170) y la mezcla 3 (aa: 81-130), respectivamente (Tabla III). Mediante la deconvolución de estas mezclas de péptidos, se determinó que las CTLs de BB232 reconocieron el péptido epitópico 121-135 y que CTLs de DV036 reconocieron el péptido 86-100. La presencia de 121-135 y 86-100-CTLs específicas en estos animales inoculados con rVVC/E1 indicaron que ambos péptidos se procesaron naturalmente. Ninguna respuesta de CTL fue detectable en el otro animal inoculado con rVVC/E1 (BB228). Esto indicó que las CTLs-Core específicas se pueden producir en al menos algún mono Rhesuss. Fuera de los tres animales que recibieron Core con el adyuvante LTK63 (Tabla II), solo un animal (BB230) mostró una respuesta CTL contra Core. Esta respuesta, dirigida contra la mezcla 2 (aa: 41-90), se transfirió, sin embargo, como fue detectable dos semanas después de la tercera inmunización, pero fue indetectable seis semanas después de la tercera inmunización. Adicionalmente, estas CTLs no se aumentaron por una cuarta inmunización (Tabla III) y el péptido individual reconocido podría no ser identificado. Dos de los tres animales inmunizados con Core-ISCOM (AY921 y BB231; Tabla II) no acumularon una respuesta de CTL específica-Core detectable. En contraste, en el otro animal inmunizado con Core-ISCOM (DV037), la mezcla 4 (aa: 121-170) que reconoce las CTLs, fue detectable ya a las dos semanas después de la segunda inmunización. Esta respuesta se dirigió contra el péptido epitópico aa: 121-135 y también se presentó después de la tercera y después de la cuarta inmunización (Tabla III).

En contraste con los animales que recibieron el prototipo de la vacuna Core + LTK63, los animales inmunizados con el prototipo de la vacuna Core-ISCOM tuvieron CTLs detectables después de la segunda inmunización y estas CTLs también se presentaron después de la tercera y cuarta inmunización (Tabla III). Por lo tanto, esta última vacuna parece más potente en la producción de respuestas de CTL en macacos Rhesus que la anterior. Sin embargo, esta formulación CTLs-Core específicas cebadas en solo uno de los tres animales. Esto podría ser debido al hecho, que las moléculas MHC clase I de los animales que no responden, fueron incapaces de unir y presentar los péptidos derivados de esta proteína relativamente pequeña (191 aa). Para probar esta hipótesis, las líneas CTL específicas para el péptido 121-135 y 86-100 se establecieron a partir de los animales que responden. Como se muestra en la Figura 2A, la línea CTL del péptido 121-135-específico lisada péptido-sensibilizada B-LCLs derivada de DV037, pero no mata las B-LCLs-sensibilizadas-péptido 121-135 a partir de los dos animales que no responden (AY921 y BB231). de manera similar, las B-LCLs derivadas de DV036 pero no AY921 o BB231 fueron capaces de presentar el péptido 86-100 con CD8+ CTLs (Figura 2B). Estos datos indicaron que las moléculas de AY921 y de BB231 MHC clase I podrían no presentar estos péptidos con las células T CD8+, y sugirieron que los haplotipos de MHC clase I determinaron si el mono Rhesuss podría acumular una respuesta CTL con el HCV-Core.

Dado que distintos alelos de MHC clase I se pueden unir y presentar distintos conjuntos de péptidos, estos datos no descartaron que la formulación Core-ISCOM no fue sub-óptima, i.e. sigue siendo posible que estos animales pudieran acumular una respuesta de CTL Core-específica dirigida contra los péptidos diferentes de 86-100 y 121-135. Para hacer frente a esta posibilidad, AY921 y BB231 se desafiaron con 2 x 10^{8} pfu de rVVC/E1 once semanas después de su cuarta inmunización con Core-ISCOM. Contrariamente a BB232 y DV036 que tuvieron CTLs-Core específicas dos semanas después de la infección con rVVC/E1 (Tabla III), ninguno AY921 o BB231 tuvo ninguna CTLs detectable después de la inoculación de rVVC/E1. Esto sugiere firmemente que la ausencia de CTLs-Core específicas detectables después de la inmunización con Core-ISCOM de estos animales no se debió a una sub-óptima formulación de la vacuna, sino a una incapacidad intrínseca de estos animales para acumular dicha respuesta, es de suponer que una consecuencia de su haplotipo MHC clase I.

Para investigar si la inmunización con Core-ISCOM indujo CTLs de larga-vida, monitoreamos DV037 por un máximo de 51 semanas (1 año) después de su cuarta inmunización. Las CTLs específicas del péptido 121-135 se detectaron 10, 15, 31, 38, 45 y 51 semanas después de la última inmunización (Figura 3A). En contraste, la respuesta 121-135-específica de la CTL cebada por rVVC/E1 en BB232 fue apenas detectable 14 semanas después de la vacunación y fue indetectable 18 semanas después de la vacunación (Figura 3B). De manera similar, las CTLs 86-100-específicas cebadas en DV036 por la vacunación con rVVC/E1 llegaron a ser indetectables 14 semanas después de la vacunación.

En un esfuerzo por cuantificar el número de CTLs específicas del péptido 121-135 presente en DV037 1 año después de que habían recibido su último refuerzo, las PBMCs del animal se re-estimularon ex vivo con 121-135 y el porcentaje de células T CD8+ específicas se analizó por tinción intracelular para IFN-\gamma y TNF-\alpha. Como se ilustra en la Figura 3C (paneles izquierdos), 121-135-CTLs específicas representaron el 0.49% de las células T CD8+ periféricas (o 490 células por 10^{5} células T CD8+) IFN-\gamma y/o TNF-\alpha secretadas después de la estimulación del péptido ex vivo por 12 horas. En contraste, después de la re-estimulación in vitro con el péptido 121-135, 71% de estas células T CD8+ fueron específicas para este péptido como se determina por su capacidad para secretar IFN-\gamma y/o TNF-\alpha (Figura 3C, paneles derechos).

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Ejemplo 4

Caracterización de Respuestas Inmunes Celulares y Humorales en Monos Rhesus Inmunizados con Core-ISCOM

Aunque solo uno de cada tres animales inmunizados Core-ISCOM tuvo CTLs detectables, el hecho de que en el animal que responde, las CTLs-Core específicas se detectaron después de solo dos inmunizaciones (Tabla III) y fueron de larga-vida (Figura 3A) formó la base para inmunizar a cinco animales más (15860-4) con Core-ISCOM (ver Tabla II para la dosificación y el programa de inmunización). Todos los animales fueron naive en el tiempo de vacunación. En este estudio, la imprimación de ambas CTLs-Core específicas y las células T CD4+ Core-específicas y los anticuerpos se monitorearon.

Ninguno de los animales tuvo ninguna Core-específicas CD4+ o células T CD8+ detectable en el tiempo de inmunización (semana 0, Tabla IV). Las células T CD4+Core-específicas, como se determina por ensayo de linfoproliferación, se detectaron en todos los animales excepto el 15861 después de la segunda inmunización, pero este animal tuvo una respuesta CD4+ detectable después de la tercera inmunización (Tabla IV). Para los animales 15862 y 15863, es improbable que el SI bajo observado después de la tercera inmunización (Tabla IV) fue debido a la ausencia de una respuesta de la célula T CD4+, ya que se observó una fuerte proliferación en estos animales y en este punto de tiempo particular para el control E. coli (ver a continuación). Ninguno de los animales tuvo anticuerpos contra Core antes de la inmunización. Sin embargo, todos los animales se han seroconvertido a Core después de dos inmunizaciones, y el nivel de anticuerpos contra Core se reforzó por una tercera inmunización (Figura 4). Notablemente, el título del anticuerpo Core medio entre estos animales fue comparable después de dos inmunizaciones (1,931) y más alto después de tres inmunizaciones (4,566) (Figura 4) a aquel presente en el suero de pacientes infectados crónicamente con un título del anticuerpo anti-Core inusualmente alto (2,358; no se muestra) corrido en el mismo
ensayo.

Para investigar si el Core-ISCOM produjo un respuesta del tipo Th1 o Th2 en estos monos, recientemente las PBMCs aisladas antes de la vacunación lo mismo que dos semanas después de la segunda y tercera inmunización se ensayaron para su capacidad, para producir citoquinas a las 48h en respuesta a la estimulación con los péptidos Core que abarcan la longitud total de la proteína del núcleo. Como se muestra en las Figuras 5A y 5B, un incremento significante en las citoquinas Th1 (IFN-\gamma y IL-2) se observó después de la inmunización en todos los animales, aunque la magnitud de respuesta observada para 15860, 15861 y 15862 fue inferior que aquella observada para los animales 15863 y 15864. La analogía, un incremento en las citoquinas tipo Th2 (IL-5 y IL-10) se observó en todos los animales después de la vacunación, con la mayor cantidad de IL-5 y IL-10 también detectadas en 15863 y 15864 (Figuras 5C y 5D). Aunque la cantidad de citoquinas tipo Th2 secretadas fue inferior que aquella detectada para las citoquinas del tipo Th1, estos datos indicaron que Core-ISCOM indujo una respuesta del tipo similar a Th0 en el mono
Rhesuss.

Después de dos y tres inmunizaciones, tres animales (15862, 15863 y 15864) tuvieron, detectables respuestas de CTL dirigidas contra la mezcla B (aa: 60-140), mientras que las otras dos no (15860 y 15861) (Tabla IV). Esta respuesta de CTL se dirigió contra el péptido 86-100 para el animal 15864 y contra el péptido 121-135 para los animales 15862 y 15863. Dado que CTLs 86-100 y 121-135- específicas, también se cebaron en DV036 (86-100), DV037 (121-135) y BB 232 (121-135) (Tabla III), esto fue de importancia para determinar si todas las CTLs 86-100 y 121-135-específicas se restringieron respectivamente por un alelo sencillo MHC clase I. La línea CTL 86-100-específica derivada del animal 15864 eficientemente lisó las B-LCLs- del péptido 86-100- sensibilizado, derivadas del 15864 pero no las B-LCLs-péptido-sensibilizadas derivadas del animal DV036, indicando que un alelo distinto (no-identificado) MHC clase I presentó este péptido para la CTL (Figura 6A y Tabla II). En contraste, las CTLs específicas para el péptido 121-135 a partir del animal 15862, 15863, BB232 y DV037 se restringieron por un alelo sencillo, aún no-identificado, MHC clase I compartido por todos estos animales (Figura 6B y Tabla II). Estos datos también indicaron que las moléculas MHC clase I de 15860 y 15861 podrían no presentar cualquier péptido (86-100 y 121-135) para las CTLs específicas (Figuras 6A y 6B). Como se observó en el primer estudio, la infección rVVC/E1 de los dos animales que no responden (15860 y 15861) nueve semanas después de la tercera inmunización con Core-ISCOM no condujo a la imprimación de las CTLs-Core específicas en estos animales. Tomados en conjunto, esto sugiere, una vez más, que el haplotipo MHC clase I de los animales fijados, si podrían acumular las CTLs-Core
específicas.

En un esfuerzo para cuantificar el número de CD8+ Core-específicas y células T CD4+ cebadas en los animales descritos antes, las PBMCs aisladas recientemente se tiñeron para INF-\gamma y TNF-\alpha intracelular después de la re-estimulación ex vivo. Las respuestas de la célula T CD8+, a los péptidos procesados naturalmente se cuantificaron después de la re-estimulación ex vivo con B-LCLs autólogas infectadas con rVVC/E1 o VVwt, como un control. Las respuestas de la célula T CD4+, a los péptidos procesados naturalmente se cuantificaron después de la re-estimulación ex vivo con la proteína del núcleo recombinante o un control E. coli. Las respuestas de la tinción intracelular, revelaron que mientras ninguno de los animales tuvo detectables células T CD8+ Core-específicas en el tiempo de inmunización, entre 0.30 y 0.71% de las células T CD8+ periféricas de 15862, 15863 y 15864, fueron específicas para el o los péptidos Core-derivados procesados naturalmente después de 2 inmunizaciones (Figura 7A). El número de CTLs específicas, sin embargo, no incrementó después de la tercera inmunización, como se discrimina por las respuestas de tinción intracelular. Notablemente, ninguna de las células T CD8+ que secretan IFN-\gamma y/o TNF-\alpha en respuesta a Core se detectaron en los dos animales (15860 y 15861) para los cuales no se observó actividad de CTL Core-específica por el ensayo de liberación ^{51}Cr (Figura 7A y Tabla IV). La cuantificación de las células T CD4+ Core-específicas confirmó que los datos obtenidos por el ensayo de linfoproliferación (Tabla IV) en el que entre 0.32 y 2.21% de las células T CD4+ a partir de los cinco animales fueron específicas para los péptidos Core procesados naturalmente (Figura 7B). Adicionalmente, el hecho que 0.53 y 0.28% de las células T CD4+ a partir de los animales 15862 y 15863 fueron positivos para las citoquinas después de la tercera inmunización (Figura 7B), sugiere fuertemente que la SI negativo observado para este punto de tiempo (Tabla IV) fue ciertamente un "falso negativo", muy probablemente debido a la alta proliferación observada en respuesta al control E. coli. Esto sugiere que la tinción intracelular para IFN-\gamma y TNF-\alpha es un ensayo más sensible, que la linfoproliferación para evaluar las respuestas de la célula T CD4+. antígeno-específica. De hecho, para el animal 15861, no se detectaron células T CD4+ por la linfoproliferación 2 semanas después de la segunda inmunización (Tabla IV). En contraste, las células T CD4+ Core-específicas se detectaron es este animal (2 semanas después de la segunda) por tinción intracelular para IFN-\gamma y TNF-\alpha (Figura
7B).

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Ejemplo 5

El uso de Core-ISCOMs como Adyuvante para los Polipéptidos HCV

Dado que la vacunación con proteína recombinante de HCVs de membrana y adyuvante puede, al menos en algunas instancias, influenciar el resultado de infección y enfermedad (Choo et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1294), investigamos si el Core-ISCOM anterior podría servir como un adyuvante para otros polipéptidos del HCV, tal como la proteína de membrana E1 E2 heterodimérica. Con ese fin, los ratones (10 animales por grupo) se inmunizaron con 2 \mug de proteína E1 E2 soluble sola, o 2 \mug de E1 E2 soluble en la presencia del adyuvante MF59, o en la presencia de 2 \mug de Core-ISCOM. Como se muestra en la Figura 8, los ratones inmunizados con E1 E2 sola, no tuvieron significante título del anticuerpo anti-E2. En contraste, los ratones inmunizados con E1E2 + Core-ISCOM tuvieron un significante título del anticuerpo anti-E2, después de tres inmunizaciones, y estos títulos fueron comparables a aquellos observados en ratones inmunizados con E1 E2 + MF59. Adicionalmente, la "calidad" del anticuerpo produjo en los ratones inmunizados por E1 E2 + MF59 y E1 E2 + Core-ISCOM parecía ser comparable con los títulos de anticuerpos que podrían inhibir el enlace de HCV-1a E2 con el receptor putativo del HCV CD81 en ambos grupos de ratones (Figura 9).

Los ejemplos anteriores demostraron que la vacunación con ISCOMs del polipéptido de HCV son capaces para cebar fuertemente las células T CD8+ y CD4+ HCV polipéptido-específicas lo mismo que los anticuerpos del polipéptido anti-HCV. Adicionalmente estas formulaciones ISCOM son capaces para servir como adyuvantes para producir los anticuerpos contra otras proteínas de HCV. Por lo tanto, las ISCOMs del HCV pueden prevenir el establecimiento de cronicidad, y/o incrementar la velocidad de respuesta a una terapia anti-viral.

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Ejemplo 6

Análisis de Gradiente de Sacarosa de NS35Core121-ISCOM

La proteína NS35Core121 se encontró en un amplio pico a través del gradiente (Figura 10A). La proteína
NS35Core121 ISCOM esencialmente se encontró en las fracciones 15 a 20 que correspondían a un pico
ISCOMATRIX^{TM} indicando que la asociación ha ocurrido (Figura 10B). Curiosamente un ISCOMATRIX^{TM} también se encontró en las fracciones 5 a 10, lo que indica que hubo una proporción del ISCOMATRIX^{TM} con proteínas no asociadas.

Por consiguiente, las composiciones HCV/ISCOM novedosas y los métodos de uso de las mismas han sido revelados.

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TABLA I Estabilidad de Formulaciones Core-ISCOM^{TM}

1

TABLA II Resumen de Inmunización y tipo MHC-I

2

TABLA III Cebado de CTLs-Core específicas en macacos Rhesus

3

TABLA IV Cebado de CD8+ y CT4+Core-específicas en macacos Rhesus inmunizados con core-ISCOMs

4

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citadas en la descripción

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Claims (13)

1. Un complejo inmunogénico que comprende un complejo orgánico con carga negativa y un antígeno cargado, cuyo complejo orgánico y antígeno están asociados electrostáticamente, en donde el complejo orgánico es un adyuvante con carga negativa y comprende una saponina y un colesterol y en donde el antígeno cargado comprende (i) uno o más polipéptidos inmunogénicos a partir de una región del Virus de la Hepatitis C (HCV) seleccionados de Core, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b, o (ii) una proteína de fusión que comprende un polipéptido inmunogénico a partir de la región Core del HCV y un segundo polipéptido inmunogénico seleccionado de las regiones E1, E2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b del HCV.

2. El complejo inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el grado de carga negativa del complejo orgánico se incrementa adicionando un detergente o lípido con carga negativa.

3. El complejo inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en donde dicho complejo orgánico adicionalmente comprende un fosfolípido.

4. El complejo inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 3 en donde dicho fosfolípido es un fosfoglicérido.

5. El complejo inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 4 en donde el fosfoglicérido se selecciona del fosfatidil inositol, fosfatidil glicerol, ácido fosfatídico y la cardiolipina.

6. El complejo inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 3 en donde dicho fosfolípido es el lípido A.

7. El complejo inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 6 en donde el lípido A se selecciona de difosforil lípido A y mono-fosforil lípido A.

8. El complejo inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde dicho complejo induce una respuesta de linfocitos-T citotóxicos.

9. Una composición de vacuna que comprende como el componente activo un complejo inmunogénico como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes junto con uno o más portadores y/o diluentes farmacéuticamente aceptables.

10. Uso de un complejo inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 en la fabricación de un medicamento para uso en un método para el tratamiento o prevención de una infección por HVC en un mamífero causando, induciendo o por otra parte facilitando, una respuesta inmune a un antígeno de HCV.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha respuesta inmune comprende una respuesta de linfocitos-T citotóxicos.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10 en donde dicha respuesta inmune inhibe, frena, retrasa o previene el inicio o evolución de una condición patológica que resulta de una infección por HVC.

13. Un complejo inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 para su uso en un método de tratamiento del organismo humano o animal mediante terapia.