JP2008516610A - 酵母を用いた慢性c型肝炎感染の治療 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、概して、C型肝炎ウィルス(HCV)に対するワクチンを動物に接種する組成物および方法、並びにC型肝炎ウィルスの動物への感染を予防もしくは治療する組成物および方法に関する。
C型肝炎ウィルス(HCV)は、世界的に、急性慢性肝炎の主要な原因因子である。慢性的にHCVに感染している人は、世界中に2億人おり、そのうち、400万人がアメリカ合衆国に在住していると見積もられている。最も主要な感染源は、輸血や静脈注射麻薬(IV drug)の使用を含む非経口的な経路を介するものである。現在の血液バンクの手順は、高度に安全であるにも関わらず、感染速度は上昇し続けている。これは、おそらく、静脈注射麻薬の使用およびその他の形態の被爆によるものである。
本発明の一実施形態は、(a)酵母ビヒクル(yeast vehicle)、および(b)HCV融合タンパク質を含むワクチンに関する。該ワクチンにおいて、酵母ビヒクルは、組換え的に上記融合タンパク質を発現する。上記HCV融合タンパク質は、以下に述べるHCV融合タンパク質のいずれかから選択することができる。上記HCV融合タンパク質は、HCV Core配列の少なくとも一部分に連結された、HCV NS3プロテアーゼの少なくとも一部分を含むことが特に好ましい。
図1Aおよび1Bは、本発明にかかる酵母ビヒクルにおける、切断NS3−Core融合タンパク質、および不活性化されたHCV NS3融合タンパク質の発現を示すウエスタンブロット(図1A)およびクーマシー染色(図1B)のデジタル画像である。図1Cは、本発明にかかる酵母ビヒクルにおける、切断HCV E1−E2融合タンパク質の発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像である。図1Dは、本発明にかかる酵母ビヒクルにおける、膜貫通(TM)ドメインが欠失したHCV NS4b融合タンパク質の発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像である。図2は、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、NS3およびCoreに特異的なリンパ球増殖を誘導することを説明するグラフである。図3A〜3Cは、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、NS3に特異的な細胞傷害性エフェクタ細胞を誘導することを説明するグラフである。図4Aおよび4Bは、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、HCV NS3またはCoreをコードする組換えワクシニアウィルスに感染した腫瘍細胞を死滅させる細胞傷害性エフェクタ細胞を誘導することを証明するグラフである。図5は、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、マウス脾細胞による炎症誘発性サイトカインの分泌を誘導することを説明するグラフである。図6は、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、1、2、または3週間免疫されることによって誘導されるリンパ球の増殖を示すグラフである。図7A〜7Dは、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、1、2、または3週間免疫されることによって誘導される細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を示すグラフである。図8Aおよび8Bは、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、1、2、または3週間免疫されることによって誘導される、炎症誘発性で、酵母特異的なサイトカインを分泌する細胞を示すグラフである。図9は、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、異なる免疫方法で免疫および追加免疫されたBALB/cマウス由来の脾臓細胞における、リンパ球増殖を説明するグラフである。図10は、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、異なる免疫方法で免疫および追加免疫されたBALB/cマウス由来の脾臓エフェクタ細胞における、細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。図11Aおよび11Bは、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、誘導されたリンパ球増殖応答の持続性を証明するグラフである。図12Aおよび12Bは、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞応答の持続性を示すグラフである。図13A〜13Dは、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された酵母およびNS3に特異的なサイトカインを分泌する細胞の持続性を示すグラフである。図14A〜14Iは、異なる量の切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。図15A〜15Cは、異なる量の切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された炎症誘発性サイトカインを分泌する細胞を示すグラフである。図16は、切断NS3−Core融合タンパク質もしくは不活性化されたHCV NS3プロテアーゼ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、HCV NS3を発現する同系の腫瘍細胞を用いたチャレンジ(challenge)に対して、BALB/cマウスにおいて、感染防御免疫を誘導することを示すグラフである。図17は、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、HCV NS3を発現する同系の腫瘍細胞を用いたチャレンジに対して、C57BL/6マウスにおいて、感染防御免疫を誘導することを示すグラフである。図18は、防御されたマウス由来の脾臓細胞におけるリンパ球増殖活性を示すグラフである。図19は、防御されたマウス由来の脾臓細胞における細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を示すグラフである。図20は、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、腫瘍をもったナイーブマウスから単離された脾臓細胞における細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を刺激することを示すグラフである。図21は、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、HCV NS3を発現する同系のB細胞リンパ腫をもつBALB/cマウスにおいて、治療的な免疫を誘導することを示すグラフである。図22Aおよび22Bは、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、HCV NS3を発現する同系のB細胞リンパ腫をもつBALB/cマウスにおいて、治療的な免疫を誘導することを示すグラフである。図23Aおよび23Bは、切断NS3−Core融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ニュージーランドホワイトラビット(New Zealand White rabbit)のオス及びメスにおいて、酵母に特異的なリンパ球増殖を誘導することを示すグラフである。
本発明の一実施形態は、HCV感染もしくはそれを原因とする病気から動物を予防する方法、またはHCV感染の結果生じる少なくとも1つの症状を緩和する方法に用いることができる組成物(ワクチン)に関する。組成物またはワクチン。上記ワクチンは、(a)酵母ビヒクルと、(b)該酵母ビヒクルによって発現される異種融合タンパク質とを含む。上述したように、本発明は、いくつかの改良されたHCV融合タンパク質を含み、該HCV融合タンパク質は、本発明のワクチンにおいて抗原として用いられる。本発明において、上記ワクチンは、酵母ビヒクルを含むが、酵母ビヒクルを含まない他のワクチンもまた意図される(以下を参照)。特に、本発明は、(A)酵母ビヒクルにおける異種タンパク質の発現を安定させる、(B)発現された異種タンパク質の翻訳後修飾を防止する、および/または、(C)本明細書に述べる酵母ビヒクルを含まないときに(すなわち、従来のワクチン組成物もしくは非酵母ベースのワクチン組成物において)ワクチン抗原として用いることができる、新しい融合タンパク質の構造物を提供する。また、ある実施形態において、上記新規な融合タンパク質は、単一のワクチンにおいて複数の選択された抗原を用いることによって、広範囲の細胞性免疫応答を引き起こす。本発明の実施形態では、上述したように、そのような融合タンパク質の1種もしくはそれ以上を、酵母ビヒクルに搭載したり、さもなければ、酵母ビヒクルと複合体化させたり、混合させたりして、本発明のワクチンを形成する。しかし、これらの融合タンパク質は、上記酵母ビヒクルと共同して、最も典型的には、該酵母ビヒクル(例えば、無傷酵母または酵母スフェロプラスト)によって組換えタンパク質として発現される。なお、無傷酵母または酵母スフェロプラストは、酵母の細胞質体、酵母ゴースト、または酵母膜もしくはその画分にさらに処理してもよい。
(1)該融合タンパク質の第1位のアミノ酸残基はメチオニンである。すなわち、上記合成ペプチドの1番目のアミノ酸はメチオニンである。
(2)該融合タンパク質の第2位のアミノ酸残基は、グリシンもしくはプロリンではない。すなわち、上記合成ペプチドの2番目のアミノ酸は、グリシンもしくはプロリンではない。
(3)該融合タンパク質の第2位〜第6位のアミノ酸残基は、メチオニンではない。すなわち、上記合成ペプチド、または、該合成ペプチドが6アミノ酸よりも短い場合には上記タンパク質の2番目〜6番目のアミノ酸は、メチオニンではない。
(4)該融合タンパク質の第2位〜第6位のアミノ酸残基は、リジンもしくはアルギニンではない。すなわち、上記合成ペプチド、または該合成ペプチドが5アミノ酸よりも短い場合には上記タンパク質の2番目〜6番目のアミノ酸は、リジンもしくはアルギニンではない。
1)プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列MADEAP(配列番号9)(配列番号2の第1位〜第6位)
2)HCV NS3プロテアーゼタンパク質の第89位〜第350位(配列番号20の第1115位〜第1376位)(配列番号2の第6位〜第268位)
3)クローニングにおいて導入された1つのスレオニンアミノ酸残基(配列番号2の第269位)
4)HCV Coreタンパク質の第2位〜第140位のアミノ酸(配列番号20の第2位〜第140位)(配列番号2の270位〜第408位)
5)Core変異体の親水性を向上させるための配列E−D(配列番号2の第409位〜第410位)
本明細書において、配列番号2の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1に示される。
1)プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列MADEAP(配列番号9)(配列番号4の第1位〜第6位)
2)HCV NS3プロテアーゼタンパク質の第1位〜第631位のアミノ酸(配列番号20の第1027位〜第1657位)(配列番号4の第7位〜第637位)(但し、HCVポリペプチドの第1165位の残基は、タンパク質分解活性を不活性化するためにセリンからアラニンに置換されている。)
本明細書において、配列番号4の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号3に示される。
1)プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列MADEAP(配列番号9)(配列番号6の第1位〜第6位)
2)HCVタンパク質E1の第1位〜第156位のアミノ酸(配列番号20の第192位〜第347位)(配列番号6の第7位〜第162位)
3)HCVタンパク質E2の第1位〜第334位のアミノ酸(配列番号20の第384位〜第717位)(配列番号6の第163位〜第446位)
なお、この特定の融合タンパク質において、E1のC末端の疎水性の36個のアミノ酸、およびE2のC末端の疎水性の29個のアミノ酸は、酵母における細胞質への蓄積を促進させるために、欠失された。本明細書において、配列番号6の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号5に示される。
1)プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列MADEAP(配列番号9)(配列番号8の第1位〜第6位)
2)HCVタンパク質NS4bの第1位〜第69位のアミノ酸(配列番号20の第1712位〜第1780位)(配列番号8の第7位〜第75位)
3)HCVタンパク質NS4bの第177位〜第261位のアミノ酸(配列番号20の第1888位〜第1972位)(配列番号8の第76位〜第160位)
複数の膜貫通ドメインを含む、NS4bの第70位〜第176位(配列番号20の第1781位〜第1887位)のアミノ酸に対応する107個のアミノ酸領域は、酵母における細胞質への蓄積を促進させるために欠失された。本明細書において、配列番号8の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号7に示される。
1)プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列MADEAP(配列番号9)(配列番号12の第1位〜第6位)
2)Core、E1、およびE2タンパク質の全長をコードする修飾されていないHCVポリタンパク質の第1位〜第746位のアミノ酸(配列番号20の第2位〜第746位)(配列番号12の第7位〜第751位;第7位〜第196に延びたCore、第197位〜第387位に延びたE1、および第388位〜第751位に延びたE2)
配列番号12の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号11に示される。
1)プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列MADEAP(配列番号9)
2)HCV Coreタンパク質の第2位〜第140位のアミノ酸(配列番号20の第2位〜第140位)(配列番号14の第7位〜第145位)
3)HCVタンパク質E1の第1位〜第156位のアミノ酸(配列番号20の第192位〜第347位)(配列番号14の第146位〜第301位)
4)HCVタンパク質E2の第1位〜第334位のアミノ酸(配列番号20の第384位〜第717位)(配列番号14の第302位〜第635位)
Coreタンパク質のC末端の疎水性の51個のアミノ酸、E1のC末端の疎水性の36個のアミノ酸、およびE2のC末端の疎水性の29個のアミノ酸は、酵母における細胞質への蓄積を促進させるために、欠失された。本明細書において、配列番号14の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号13に示される。
1)プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列MADEAP(配列番号9)(配列番号16の第1位〜第6位)
2)全長のHCV NS3タンパク質(但し、第139位のセリン(配列番号20の第1165位)はNS3のタンパク質分解能を不活性化するためにアラニンに置換されている)に対応する第1位〜第631位のアミノ酸(配列番号20の第2位〜第140位)(配列番号16の第7位〜第634位)
3)NS4aタンパク質の第1位〜第54位のアミノ酸(配列番号20の第1658位〜第1711位)(配列番号16の第635位〜第691位)
4)HCVタンパク質NS4bの第1位〜第69位のアミノ酸(配列番号20の第1712位〜第1780位)(配列番号16の第692位〜第776位)
5)HCVタンパク質NS4bの第177位〜第261位のアミノ酸(配列番号20の第1888位〜第1972位)(配列番号16の第777位〜第845位)
複数の膜貫通ドメインを含む、NS4bの第70位〜第176位(配列番号20の第1781位〜第1887位)のアミノ酸に対応する107個のアミノ酸領域は、酵母における細胞質への蓄積を促進させるために欠失された。本明細書において、配列番号16の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号15に示される。
1)プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列MADEAP(配列番号9)(配列番号18の第1位〜第6位)
2)第1位〜第448位のアミノ酸(配列番号20の第1973位〜第2420位)に対応するNS5aタンパク質全体(配列番号18の第7位〜第454位)
3)NS5bの第1位〜第539位のアミノ酸(配列番号20の第2421位〜第2959位)(配列番号18の第455位〜第993位)
HCV複製にかかるNS5bの活性に必要となるC末端の52個の残基は、タンパク質を不活性化するために欠失された。本明細書において、配列番号18の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号17に示される。
本発明の別の実施形態は、動物をHCV感染、もしくはそれにより生じる疾患から保護するための方法に関する。該方法には、HCV感染している、もしくはHCV感染する危険がある動物に、本明細書に記載した本発明のワクチンもしくは組成物を投与する工程を含む。これにより、該動物におけるHCV感染もしくは、HCVによって引き起こされる少なくとも1つの症状を軽減もしくは抑制する。
本発明の別実施形態は、本明細書に記載されているように、HCV抗原を含む単離された融合タンパク質のいずれかを含む単離されたタンパク質を含有する。また、本発明には、そのようなタンパク質のいずれかをコードする単離された核酸分子、そのようなタンパク質をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子、並びに、そのような核酸分子もしくは組換え核酸分子を含有する、またはこれら核酸分子が形質移入/形質転換された細胞、およびベクター(ウィルスベクターを含む)が含まれる。
〔実施例1〕
以下の実施例はGI−5005、すなわち、本発明に係る切断NS3−Core融合タンパク質酵母ワクチンの設計について説明する。
以下の実施例はGI−5003、すなわち、本発明に係る不活性化NS3酵母ワクチンの設計について説明する。
HCV NS3タンパク質の発現は、銅により誘導され、熱により不活性化されたGI−5003酵母からのライセートをウエスタンブロット法により分析することにより確認された。タンパク質の検出には、HCV NS3に特異的なモノクローナル抗体(Virostat)を用いた(図1Aおよび図1B参照)。
以下の実施例は本発明に係るGI−5000シリーズ、すなわち、切断HCV E1−E2融合タンパク質酵母ワクチンの設計について説明する。
以下の実施例は本発明に係るGI−5000シリーズ、すなわち、TMドメインが欠失したHCV NS4b融合タンパク質酵母ビヒクルの設計について説明する。
以下の実施例では、HCV抗原を発現するGI−5005酵母ビヒクル(TarmogenTMとも称される)を用いたマウスの非臨床薬理学試験:免疫原性テストを説明する。
・GI−5003:HCV−NS3タンパク質発現酵母株。GI−5003は、触媒ドメインが単一の点変異によって不活性化されている全長NS3を発現する
・GI−5005−L:50ng/YUより少ないHCV−NS3−Core融合タンパク質を発現するGI−5005酵母株
・GI−5005−M:約500ng/YUのHCV−NS3−Core融合タンパク質を発現するGI−5005酵母株
・GI−5005−H:約1400ng/YUのHCV−NS3−Core融合タンパク質を発現するGI−5005酵母株
・EL4−NS3:HCV NS3をコードするDNAを安定に形質移入したC57BL/6由来のEL4リンパ腫細胞(H−2b)
・A20−NS3:HCV NS3をコードするDNAを安定に形質移入したBALB/c由来のA20リンパ腫細胞(H−2d)
・P815−NS3:HCV NS3をコードするDNAを安定に形質移入したDBA/2由来のP815白血病細胞(H−2d)
・組換えワクシニアウィルス(rVV):β−ガラクトシダーゼをコードする組換えワクシニアウィルス(rVV−lac)、HIV−1Gagをコードする組換えワクシニアウィルス(rVV−Gag)、HCV NS3をコードする組換えワクシニアウィルス(rVV−NS3)、およびHCVCoreタンパク質をコードする組換えワクシニアウィルス(rVV−Core)。
GI−5005の免疫原性を評価する予備的な実験において、C57BL/6マウスに、3週間、週に一度の頻度で5YU(5000万)の熱非働化GI−5005酵母細胞を注射した。マウスには免疫の付与による表面的な悪影響は見られなかった。最終免疫から7日後に脾細胞を採取し、単一の細胞懸濁液を、インビトロで、刺激しないか、あるいはEL4リンパ腫細胞、EL−NS3(安定的にHCV NS3を発現しているEL4)、rVV−NS3(HCV NS3をコードする組換えワクシニアウィルス)またはrVV−Coreで刺激した。5日間培養した後、リンパ球増殖を標準的なチミジン取り込みを用いて評価した。より具体的には、5YUのGI−5005を注射したC57BL/6マウスからの脾細胞を、96ウエルのU型底部を有する組織培養プレート(400000細胞/ウエル)の各ウエルに入れ、インビトロで以下の刺激を与えた:無刺激、マイトマイシンCで処理したEL4(10000細胞/ウエル)、マイトマイシンCで処理したEL4−NS3(10000細胞/ウエル)、rVV−NS3(400000pfu/ウエル)またはrVV−Core(400000pfu/ウエル)。5日目に3HTdRを添加し、その18時間後にプレートから試料を採集した。結果を3つのサンプルの平均CMP+/−S.D.として示す。図2に示される結果は、GI−5005が、NS3特異的なリンパ球増殖およびCore特異的なリンパ球増殖を誘導することを示している。
<GI−5005による、安定的にHVC NS3を発現している腫瘍細胞を殺傷する細胞傷害性エフェクタ細胞の誘導>
図3は、GI−5005による免疫の付与は、HVC NS3を発現している腫瘍細胞を殺傷することができる細胞傷害性エフェクタ細胞を誘導することを示す。具体的には、3週間、週に一度の頻度で5YUのGI−5005を注射したC57BL/6マウス由来の脾細胞を、25cm2の組織培養フラスコ(30×106細胞/フラスコ(図3A−3B))、または、24ウエルの平底組織培養プレート(6×106/ウエル(図3C))のいずれかの各ウエルに入れた。脾細胞に6日間以下のインビトロ刺激(IVS)を与えた:1YU(107酵母細胞)GI−5005/フラスコ(図3A);無刺激、1YU GI−1001/フラスコ、または、1YU GI−5005/フラスコ(図3B);または、6×106pfu/ウエルrVV−lac、または、rVV−NS3(図3C)。rVV−lacまたはrVV−NS3と培養された脾細胞は、さらに3日間、10%のT細胞成長増殖因子源としてのT−stimの存在下で培養を行った。6日(図3A、3B)または9日(図3C)のIVS培養期間終了後、脾細胞培養物の2倍希釈物を51Crでラベルした10000個のEL4細胞または51Crでラベルした10000個のEL4−NS3細胞と混合した。E:T比は、エフェクタ:ターゲット比を示し、IVS培養期間の初期のエフェクタ細胞の濃度に基づいている。結果を6時間後に96ウエルのV底プレートから単離した同時培養された3つのサンプルの平均特異的溶解%+/−S.D.として示す。自然に放出されるクロムの割合は、EL−4に対しては19%(図3A)、EL4−NS3に対しては40%(図3A、図3B)、EL4−NS3に対して29%(図3C)であった。
上記結果は、GI−5005による免疫は、NS3を発現している同系の腫瘍細胞を殺傷することができる細胞障害性エフェクタ細胞を誘導することを示している。しかし、GI−5005はHCV Core抗原をも発現する。安定的に形質移入されたHCVCoreタンパク質を発現する腫瘍細胞株を得る試みは成功しなかった。Coreを発現するターゲット細胞の欠如を克服するために、図4に示す実験を行った。要するに、H−2dを有するP815白血病細胞を、免疫されたBALB/cマウス由来の脾細胞を用いた標準的なクロム放出アッセイに用いる前に、一晩、HCV NS3またはHCV Coreをコードする組換えワクシニアウィルスに感染させた。BALB/cマウスの免疫は、GI−5005またはGI−5003(全長HCV−NS3を発現するがCoreを発現しないTarmogenTM)によって行い、インビトロでGI−5005の存在下5日間刺激した。より、詳しくは、3週間、週に一度の頻度で5YUのGI−5005(GI5005)または週に一度の頻度で5YUのGI−5003(GI5003)を注射したBALB/cマウス由来の脾細胞を24ウエルの平底組織培養プレート(8×106/ウエル)の各ウエルに入れ、インビトロで、GI−5005(1×106/ウエル)により5日間刺激した。IVS培養期間の終了後、脾細胞培養物の2倍希釈物を、一晩HCV NS3(図4A)またはHCVCore(図4B)をコードする組換えワクシニアウィルスに感染させた、51Crでラベルした10000個のP815白血病細胞と混合した。E:T比は、エフェクタ:ターゲット比を示し、IVS培養期間初期の脾臓エフェクタ細胞の濃度に基づいている。結果を6時間後に96ウエルのV底プレートから単離した同時培養された3つのサンプルの平均特異的溶解%+/−S.D.として示す。自然に放出されるクロムの割合は、P815−rVV−NS3に対しては21%、P815−rVV−Core対しては40%であった。
図5は、未処置のC57BL/6マウスまたはGI−5005で免疫したC57BL/6マウスの脾細胞を、GI−5005酵母とともに組織培養したときに、分泌されるサイトカインを示す。無細胞上清を培養開始から48時間後に集め、サイトカイン濃度を、フローサイトメトリーをベースとするLuminexTMアッセイ(Biosource社)を用いて決定した。より具体的には、未処置のC57BL/6マウス、または、3週間、週に一度の頻度で5YUのGI−5005を注射したC57BL/6マウスの脾細胞を、24ウエルの平底組織培養プレート(10×106/ウエル)の各ウエルに入れた。脾細胞を、GI−5005(1×106酵母細胞/ウエル)またはPMA(15ng/mL)+イオノマイシン(750ng/mL)により刺激した。無細胞上清を培養開始から48時間後に集め、サイトカインをコロラド大学ガンセンターフローサイトメーター施設により、フローサイトメーターLuminexTMアッセイ(Biosource社)を用いて定量した。IFN−gはIFN−γを、TNF−aはTNF−αを表す。
図6、7、および8に示されている結果は、C57BL/6マウスおよびBALB/cマウスの両方に施された1回、2回または3回の週ごとのGI−5005による免疫を比較した実験の結果である。図6はNS3特異的なリンパ球増殖およびCore特異的なリンパ球増殖を調べ、図7はNS3特異的な細胞障害性細胞活性およびCore特異的な細胞障害性細胞活性の誘導を示し、図8はサイトカイン分泌のプロファイルを示す。全体的に、これらの結果は、GI−5005の1回の注射は弱い応答を誘導し、その応答は追加的な投与により顕著に増強されることを示している。
GI−5005の免疫により誘導される細胞性免疫応答の堅牢性(robustness)を評価するために、GI−5005を週一度の頻度で3回投与されたC57BL/6マウスおよびBALB/cマウスを、投与後1月目および2月目に屠殺した。図11は、酵母特異的なリンパ球増殖の持続性を試験した結果を、図12はNS3特異的な細胞障害性細胞活性およびCore特異的な細胞障害性細胞活性の持続性を試験した結果を、図13はNS3特異的なサイトカイン分泌および酵母特異的なサイトカイン分泌のプロファイルを示す。全体的に、これらの結果は、GI−5005の投与は、持続する堅牢な(robster)メモリーT細胞応答を誘導することを示唆している。
図11に示される結果は、酵母抗原に対する増殖反応は、週一度の頻度で3回免疫を付与した後少なくとも2月間持続する。要するに、未処置または3週間、週に一度の頻度で5YUのGI−5005で免疫し、その後5週(1月の持続性)または9週(2月の持続性)おいて屠殺したC57BL/6マウス(図11A)またはBALB/cマウス(図11B)の脾細胞を、96ウエルのU型底部を有する組織培養プレート(400000細胞/ウエル)の各ウエルに入れ、インビトロで以下の刺激を与えた:無刺激(Bkgd)、GI−5005(400000酵母細胞/ウエル)。5日目に3HTdRを添加し、その18時間後にプレートからから試料を採集した。結果は、3つのサンプルの平均CMP+/−S.D.として示す。これらの結果は、図2および図6に示されるHCV NS3特異的な増殖反応またはCore特異的な増殖反応と対照的に、酵母特異的な増殖反応を試験していることに留意することが重要である。これらの特別な試験において酵母抗原に対する刺激指数は約11〜77の範囲であった。
図12に示すように、リンパ球増殖応答に関する結果と同様に、GI−5005によって誘導された細胞障害性エフェクタ細胞活性の持続性は少なくとも2月であった。要するに、未処置または3週間、週に一度の頻度で5YUのGI−5005で免疫し、その後5週(1月の持続性)または9週(2月の持続性)おいて屠殺したC57BL/6マウス(図12A)またはBALB/cマウス(図12B)の脾細胞を、24ウエルの平底組織培養プレート(10×106/ウエル)の各ウエルに入れ、インビトロで、GI−5005(1×106/ウエル)により5日間刺激した。IVS培養期間の終了後、脾細胞培養物の2倍希釈物を、51Crでラベルした10000個のEL4−NS3リンパ腫細胞(図12A)、または、51Crでラベルした10000個のP815−NS3白血病細胞(図12B)と混合した。E:T比は、エフェクタ:ターゲット比を示し、IVS培養期間の初期のエフェクタ細胞の濃度に基づいている。結果を6時間後に96ウエルのV底プレートから単離した同時培養された3つのサンプルの平均特異的溶解%+/−S.D.として示す。自然に放出されるクロムの割合は、EL4−NS3に対しては11%、P815−NS3に対して11%であった。
図13は、3週間、週に一度の頻度でGI−5005による免疫を施されたC57BL/6マウスおよびBALB/cマウスの脾細胞が、GI−5005と、rVV−NS3によるインビトロ刺激に応答して分泌するサイトカイン分泌のプロファイルを示す。要するに、未処置または3週間、週に一度の頻度で5YUのGI−5005で免疫し、その5週間後(1ヶ月間の持続性)または9週間後(2ヶ月間の持続性)に屠殺したC57BL/6マウス(図13Aおよび図13B)またはBALB/cマウス(図13Cおよび図13D)の脾細胞を、24ウエルの平底組織培養プレート(10×106/ウエル)の各ウエルに入れ、インビトロで、GI−5005(1×107/ウエル)またはrVV−NS3(1×107pfu/ウエル)により刺激した。無細胞上清を培養開始から48時間後(IVS w/ GI−5005)または120時間後(IVS w/ rVV−NS3)に集めた。サイトカインをLuminexTMアッセイ(Biosource社)を用いて定量した。IFN−gはIFN−γを、TNF−aはTNF−αを表す。これらの結果は、GI−5005による免疫で誘導されるサイトカイン分泌細胞の持続性は少なくとも2月であることを示している。サイトカインの酵母特異的なプロファイルと対照的に、これらのデータは、また、刺激としてrVV−NS3を用いた、抗原特異的な(すなわち、NS3特異的な)応答は、主としてGM−CSFおよびIFN−γに限られることを示している。
図14および15に要約した結果は、GI−5005 TarmogenTMによる、異なる量の抗原を発現する細胞傷害性エフェクタ細胞およびサイトカイン分泌細胞の誘導を比較する。本研究は、有効性(potency)アッセイの開発の一部として理解される。
以下の実施例は、HCV抗原を発現するGI−5005 TarmogenTMを使用する、マウスでの非臨床的な薬理学的試験(腫瘍保護試験および治療試験)を示す。
上記の実験は、C57BL/6マウスおよびBALB/cマウスにおけるGI−5005の免疫原性を示す。GI−5005酵母の注入が保護免疫を惹起するか否かを決定するために、BALB/cマウスに、0.1YU、0.7YUまたは5YUの、GI−5005またはGI−5003(HCV NS3プロテアーゼのみを発現するTarmogenTM)のいずれかを、あるいは、5YUのGI−4014(変異したRasタンパク質を発現するTarmogenTM)をネガティブコントロールとして、あるいは何も用いることなく、週に一度、3週間にわたって皮下注射した。最終免疫の1週間後、マウスを、同系のA20腫瘍細胞を皮下注射することによってチャレンジした。この細胞はmHCV NS3(A20−NS3)で安定に形質移入されている。チャレンジの21日後に腫瘍容量を測定した。図16に示されるデータは、HCV NS3抗原、GI−5005またはGI−5003を発現するTarmogenTMを用いて免疫したマウスが、A20−NS3腫瘍細胞でのチャレンジから保護されたことを示す。一方、免疫しなかったマウスまたはGI−4014を用いて免疫したマウスは保護されなかった。結果を、平均腫瘍容量+/−S.D.として示す。これらの結果は、GI−5005は、容量依存的および抗原依存的な免疫応答を誘導することを示す。この応答は、HCV NS3を発現する同系の腫瘍細胞からマウスを保護する。
HCV NS3を発現する同系の腫瘍細胞を拒絶した「保護」マウスの利用可能性は、保護免疫の準備(setting)における抗原特異的免疫応答を試験する機会を提供した。EL4−NS3腫瘍細胞を拒絶した上記のマウス5匹からの脾細胞をプールし、96ウエルのU底組織培養プレートの個々のウエルに置き(4×105細胞/ウエル)、刺激なし、あるいはGI−1001(2×105酵母細胞/ウエル)、GI−5005(2×105酵母細胞/ウエル)、rVV−Gag(1×105pfu/ウエル)、rVV−NS3(1×105pfu/ウエル)、またはrVV−Core(1×105pfu/ウエル)のいずれかで刺激した。3HTdRを5日目に添加し、その18時間後に細胞を回収した。結果を四連のサンプルについての平均CPM+/−S.D.として示す。図18は、酵母特異的刺激、HCV NS3特異的刺激およびHCV Core特異的刺激に対して保護されたマウス由来の脾細胞の、増殖性の応答を示す。図19は、これらの細胞傷害性エフェクタ細胞活性を試験する。この実験において、EL4−NS3腫瘍細胞を拒絶した免疫化マウス5匹からの脾細胞、または未処置のマウスからの脾細胞を一緒にプールして、24ウエルの平底組織培養プレートの個々のウエルに置き(8×106脾細胞/ウエル)、GI−5005(1×106細胞/ウエル)またはrVV−NS3(8×105pfu/ウエル)のいずれかで5日間インビトロ刺激(IVS)した。IVS培養期間の最後に、脾細胞培養物の二倍希釈物を、rVV−NS3で一晩感染した10,000個の51Cr標識化EL4ターゲット細胞と混合した。E:T比は、IVS培養期間の開始時での脾臓エフェクタ細胞濃度に基づいた、エフェクタ細胞:ターゲット細胞の比をいう。結果を、96ウエルのV底プレートでの同時培養の5時間後に単離した三連のサンプルについての、特異的溶解%の平均+/−S.D.として表す。自発的な51Cr放出%はEL4−rVV−NS3について33%であった。同時に、これらの知見は、保護されたマウス、すなわち、NS3を発現する腫瘍細胞を拒絶した免疫化マウスが、上記実施例5に示したような単純に免疫したマウスと比較して、HCV NS3に対する免疫応答を増強したことを示唆する。
上記にて示した結果は、HCV抗原の二次的供給源(すなわちHCV NS3を発現する腫瘍細胞)へのGI−5005マウスの曝露が、増強された増殖および細胞傷害性エフェクタ細胞応答によって裏付けられるような追加免疫効果(ブースト効果)を生じる事を示唆する。GI−5005酵母が抗原保持マウスからのT細胞活性をさらに刺激し、その結果、慢性のHCV感染患者におけるT細胞活性を模倣することができるか否かを決定するために、未処置のC57BL/6マウスに、EL4−NS3腫瘍細胞を皮下注射した。3週間後、腫瘍容量は約2500mm3に達し、マウスを屠殺し、脾細胞をベクターコントロール(GI−1001)またはGI−5005酵母のいずれかとインキュベートした。EL4ターゲット細胞を感染したrVV−NS3に対する細胞傷害性エフェクタ細胞活性を、インビトロ刺激開始6日後に評価した。詳細には、21日前にEL4−NS3腫瘍細胞を注射した未処置のマウス5匹からの脾細胞を一緒にプールし、24ウエルの平底組織培養プレートの個々のウエルに置き(8×106脾細胞/ウエル)、GI−1001またはGI−5005(1×106酵母細胞/ウエル)のいずれかで6日間インビトロ刺激(IVS)した。IVS培養期間の終了時に、脾細胞培養物の二倍希釈物を、rVV−NS3を一晩感染した10,000個の51Cr標識化EL4ターゲット細胞と混合した。E:T比は、IVS培養期間の開始時での脾臓エフェクタ細胞濃度に基づいた、エフェクタ細胞:ターゲット細胞の比をいう。結果を、96ウエルのV底プレートでの同時培養の5時間後に単離した三連のサンプルについての、特異的溶解%の平均+/−S.D.として表す。自発的な51Cr放出%はEL4−rVV−NS3について33%であった。図20に示した結果は、GI−5005が、HCV−NS3を発現する腫瘍を保有するマウス由来の細胞傷害性エフェクタ細胞を刺激し得ることを示す。
図20に示した結果は、GI−5005が、EL4−NS3を発現する腫瘍を保持するC57BL/6マウスの脾細胞からのNS3特異的細胞傷害性エフェクタ活性を再度刺激し得ることを示す。このことは、治療効果もまた達成され得ることを示唆する。この可能性を評価するために、BALB/cマウス(一群あたり5匹)に、HCV NS3をコードするDNAで安定的に形質移入した同系のA20−NS3 Bリンパ球1.25×105個を、皮下注射した。腫瘍移植の7日後に開始して、マウスを3週間にわたって週1回、PBSまたはYU GI−5005のいずれかを用いて免疫した。腫瘍増殖をモニタリングし、腫瘍移植28日後にマウスを屠殺した。このとき、PBS群における腫瘍は2500mm3に達した。図21における結果は、平均腫瘍容量+/−S.D.として示され、数値は、測定可能な腫瘍を有する動物の数をいう(*腫瘍を保有する全てのマウスから摘出した腫瘍はなおNS3を発現していることがわかった)。
以下の実施例は、本発明の酵母ワクチンを用いた毒性試験を記載する。
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本発明の種々の実施形態が詳細に記載されているが、これらの実施形態の変更および適合が当業者になされ得ることは明らかである。しかし、このような変更および適合が、添付の特許請求の範囲に従って本発明の範囲内であることは、明らかに理解されるべきである。
Claims (84)
- (a)酵母ビヒクルと、
(b)該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたHCV融合タンパク質とを含み、
上記HCV融合タンパク質は、HCV Core配列の少なくとも一部分に連結された、HCV NS3プロテアーゼの少なくとも一部分を含む、ワクチン。 - 上記HCV NS3プロテアーゼは、天然のHCV NS3プロテアーゼの触媒ドメインを欠失している請求項1に記載のワクチン。
- 上記HCV NS3プロテアーゼは、本質的に、NS3全長タンパク質のN末端の88アミノ酸の後に続く、262アミノ酸(配列番号20の第1115位〜第1378位)からなる請求項1に記載のワクチン。
- 上記HCV Coreの疎水性のC末端配列は切断されている請求項1に記載のワクチン。
- 上記HCV Core配列は、本質的に、HCV Coreの全長配列の第2位〜第140位のアミノ酸(配列番号20の第2位〜第140位)からなる請求項5に記載のワクチン。
- 上記HCV Core配列は、グルタミン酸およびアスパラギン酸の2つのアミノ酸を含むように付加されている請求項1に記載のワクチン。
- 上記HCV Core配列は、アミノ酸配列G−G−G−H−H−H−H−H−H(配列番号10)を含むように付加されている請求項1に記載のワクチン。
- 上記HCV NS3プロテアーゼは、N末端に、配列番号9(MADEAP)に示されるアミノ酸配列が連結されている請求項1に記載のワクチン。
- 上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号2からなる請求項1に記載のワクチン。
- (a)酵母ビヒクルと、
(b)該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたHCV融合タンパク質とを含み、
上記融合タンパク質は、不活性化された、全長のHCV NS3タンパク質を含む、ワクチン。 - 上記HCV NS3タンパク質は、配列番号20のHCV ポリタンパク質配列の第1165位の残基に変異を含み、タンパク質分解活性が不活性化している請求項10に記載のワクチン。
- 上記HCV NS3プロテアーゼは、N末端に、配列番号9(MADEAP)に示されるアミノ酸配列が連結されている請求項10に記載のワクチン。
- 上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号4からなる請求項10に記載のワクチン。
- (a)酵母ビヒクルと、
(b)該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたHCV融合タンパク質とを含み、
上記HCV融合タンパク質は、切断HCV E2タンパク質に融合された、切断HCV E1タンパク質を含む、ワクチン。 - 上記切断HCV E1タンパク質は、本質的に、HCV E1の第1位〜第156のアミノ酸(配列番号20の第192位〜第347位)からなる請求項14に記載のワクチン。
- 上記HCV E2タンパク質は、本質的に、HCV E2の第1位〜第334位のアミノ酸(配列番号20の第384位〜第717位)からなる請求項14に記載のワクチン。
- 上記切断HCV E1タンパク質は、N末端に、配列番号9(MADEAP)に示されるアミノ酸配列が連結されている請求項14に記載のワクチン。
- 上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号6からなる請求項14に記載のワクチン。
- (a)酵母ビヒクルと、
(b)該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたHCV融合タンパク質とを含み、
上記HCV融合タンパク質は、膜貫通ドメインが欠失したHCV NS4bタンパク質を含む、ワクチン。 - 上記膜貫通ドメインが欠失したHCV NS4bタンパク質は、本質的に、HCV NS4bの第1位〜第69位のアミノ酸(配列番号20の第1712位〜第1780位)と、第177位〜第261位のアミノ酸(配列番号20の第1888位〜第1972位)とが連結されている請求項19に記載のワクチン。
- 上記膜貫通ドメインが欠失したHCV NS4bタンパク質は、N末端に、配列番号9(MADEAP)に示されるアミノ酸配列が連結されている請求項19に記載のワクチン。
- 上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号8からなる請求項19に記載のワクチン。
- (a)酵母ビヒクルと、
(b)該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたHCV融合タンパク質とを含み、
上記HCV融合タンパク質は、HCV E2全長タンパク質に融合されたHCV E1全長タンパク質に融合されたHCV Core全長タンパク質を含む、ワクチン。 - 上記HCV Core全長タンパク質は、N末端に、配列番号9(MADEAP)に示されるアミノ酸配列が連結されている請求項23に記載のワクチン。
- 上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号12からなる請求項23に記載のワクチン。
- (a)酵母ビヒクルと、
(b)該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたHCV融合タンパク質とを含み、
上記HCV融合タンパク質は、膜貫通ドメインが欠失したHCV E1タンパク質と、膜貫通ドメインが欠失したHCV E2タンパク質とに融合された、切断HCV Coreタンパク質を含む、ワクチン。 - 上記切断HCV Coreタンパク質は、本質的に、HCV Coreタンパク質の第2位〜第140位(配列番号20の第2位〜第140位)からなる請求項26に記載のワクチン。
- 上記膜貫通ドメインが欠失したHCV E1タンパク質は、本質的に、HCV E1タンパク質の第1位〜第156位(配列番号20の第192位〜第347位)からなる請求項26に記載のワクチン。
- 上記膜貫通ドメインが欠失したHCV E2タンパク質は、本質的に、HCV E2タンパク質の第1位〜第334位(配列番号20の第384位〜第717位)からなる請求項26に記載のワクチン。
- 上記切断HCV Coreタンパク質は、N末端に、配列番号9(MADEAP)に示されるアミノ酸配列が連結されている請求項26に記載のワクチン。
- 上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号14からなる請求項26に記載のワクチン。
- (a)酵母ビヒクルと、
(b)該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたHCV融合タンパク質とを含み、
上記HCV融合タンパク質は、HCV NS4bに融合されたHCV NS4aに融合されたHCV NS3を含み、
該HCV NS3は、不活性化されており、
該HCV NS4aは、膜貫通ドメインを欠失している、ワクチン。 - 上記HCV NS3タンパク質は、本質的に、HCV HS3の第1位〜第631位(配列番号20の第1027位〜第1657位)からなり、
配列番号20の第1165位のセリンがアラニンに置換され、プロテアーゼが不活性化している請求項32に記載のワクチン。 - 上記HCV NS4aタンパク質は、本質的に、HCV NS4aタンパク質の第1位〜第54位(配列番号20の第635位〜第691位)からなる請求項32に記載のワクチン。
- 上記HCV NS4bタンパク質は、本質的に、HCV NS4bの第177位〜第261位(配列番号20の第1888位〜第1972位)に融合されたHCV NS4bの第1位〜第69位(配列番号20の第1712位〜第1780位)からなる請求項32に記載のワクチン。
- 上記HCV NS3タンパク質は、N末端に、配列番号9に示されるアミノ酸配列(MADEAP)が連結されている請求項32に記載のワクチン。
- 上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号16からなる請求項32に記載のワクチン。
- (a)酵母ビヒクルと、
(b)該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたHCV融合タンパク質とを含み、
上記HCV融合タンパク質は、HCV NS5bタンパク質に融合されたHCV NS5aタンパク質を含み、
上記NS5bタンパク質は、NS5bのC末端が欠失しており、不活性化されている、ワクチン。 - 上記HCV NS5aタンパク質は、本質的に、HCV NS5aの第1位〜第448位(配列番号20の第1973位〜第2420位)からなる請求項38に記載のワクチン。
- 上記HCV NS5bタンパク質は、本質的に、HCV NS5bの第1位〜第539位(配列番号20の第2421位〜第2959位)からなる請求項38に記載のワクチン。
- 上記HCV NS5aタンパク質は、N末端に、配列番号9に示されるアミノ酸配列(MADEAP)が連結されている請求項38に記載のワクチン。
- 上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号18からなる請求項38に記載のワクチン。
- 上記融合タンパク質の発現は、誘導プロモーターの制御下にある請求項1〜42にいずれか1項に記載のワクチン。
- 上記誘導プロモーターは、CUP1である請求項43に記載のワクチン。
- 樹状細胞をさらに含み、
該樹状細胞は、HCV融合タンパク質を組換え的に発現する酵母ビヒクルが、細胞内に搭載されている請求項1〜42のいずれか1項に記載のワクチン。 - 少なくとも1つの生物学的応答の修飾因子をさらに含む請求項1〜45のいずれか1項に記載のワクチン。
- 上記生物学的応答の修飾因子は、サイトカイン、ホルモン、脂質誘導体、および低分子薬剤からなる群より選択される請求項46に記載のワクチン。
- 上記生物学的応答の修飾因子は、抗CTLA−4、抗CD137、抗CD28、抗CD40、アレムツズマブ、デニロイキンジフチトクス、抗CD4、抗CD25、抗PD1、抗PD−L1、抗PD−L2、FOXP3の遮断薬、Flt−3リガンド、イミキモド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、サルグラモスチム、Toll様受容体(TLR)−7アゴニスト、およびTLR−9アゴニストからなる群より選択される請求項46に記載のワクチン。
- 請求項1〜48のいずれか1項に記載のワクチンの使用方法であって、
HCV感染から、動物を保護する製剤において、上記ワクチンを使用する使用方法。 - 請求項1〜48のいずれか1項に記載のワクチンの使用方法であって、
HCV抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発させる製剤において、上記ワクチンを使用する使用方法。 - 請求項1〜48のいずれか1項に記載のワクチンの使用方法であって、
疾患もしくは異常を治療または予防するための製剤において、上記ワクチンを使用する使用方法。 - 請求項1〜48のいずれか1項に記載のワクチンの使用方法であって、
HCVに感染する危険がある個体群を免疫するための製剤において、上記ワクチンを使用する使用方法。 - 請求項1〜48のいずれか1項に記載のワクチンの使用方法であって、
HCVに感染している個体群を治療するための製剤において、上記ワクチンを使用する使用方法。 - C型肝炎ウィルス(HCV)感染から動物を保護する方法であって、
請求項1〜48のいずれか1項に記載のワクチンを、HCVに感染している動物もしくは、HCVに感染する危険がある動物に投与することを含み、
該ワクチンの該動物への投与により、HCV感染もしくは該動物へのHCV感染の結果生じる少なくとも1つの症状を、軽減または抑制する、方法。 - HCV抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発させる方法であって、
請求項1〜48のいずれか1項に記載のワクチンを動物に投与することを含む、方法。 - HCVに感染している個体群において、HCV抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発させる方法であって、
請求項1〜48のいずれか1項に記載のワクチンを、該個体群に投与することを含む、方法。 - HCVに感染する危険がある個体群を、HCVに対して免疫する方法であって、
請求項1〜48のいずれか1項に記載のワクチンを該個体群に投与することを含む、方法。 - 上記ワクチンは、HCV抗原をコードするウィルスベクターを含むワクチンに加えて、追加免疫として投与される、請求項53〜57のいずれか1項に記載の方法。
- 上記ワクチンは、異なるHCVワクチンで追加免疫する前に、上記の免疫系を初回刺激ために投与される、請求項53〜57のいずれか1項に記載の方法。
- HCV Core配列の少なくとも一部分に連結された、HCV NS3プロテアーゼの少なくとも一部分を含み、
上記HCV NS3プロテアーゼは、天然のHCV NS3プロテアーゼの触媒ドメインが欠失している、単離されたHCV融合タンパク質。 - 上記HCV NS3プロテアーゼは、本質的に、NS3全長タンパク質のN末端の88アミノ酸に後に続くHCV NS3の262アミノ酸(配列番号20の第1115位〜第1376位)からなる請求項60に記載の単離された融合タンパク質。
- 上記HCV Coreの疎水性のC末端配列は、切断されている請求項60に記載の単離された融合タンパク質。
- 上記HCV Coreの配列は、本質的に、HCV Coreの全長配列の第2位〜第140位のアミノ酸(配列番号20の第2位〜第140位)からなる請求項62に記載の単離された融合タンパク質。
- 上記HCV Coreの配列は、グルタミン酸およびアスパラギン酸の2つのアミノ酸を含むように付加されている請求項60に記載の単離された融合タンパク質。
- 上記HCV Coreの配列は、G−G−G−H−H−H−H−H−Hのアミノ酸配列(配列番号10)を含むように付加されている請求項60に記載の単離された融合タンパク質。
- 上記HCV NS3プロテアーゼは、N末端に、配列番号9に示されるアミノ酸配列(MADEAP)が連結されている請求項60に記載の単離された融合タンパク質。
- 本質的に、配列番号2からなる請求項60に記載の単離された融合タンパク質。
- 本質的に、配列番号4、6、8、12、14、16、および18からなる群より選択される核酸配列からなる核酸配列によってコードされる、単離された融合タンパク質。
- 請求項60〜68のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
- 請求項69に記載の単離された核酸分子を含む、組換え核酸分子。
- ウィルスベクターである請求項70に記載の組換え核酸分子。
- 請求項71に記載の組換え核酸分子が導入された、組換え細胞。
- 腫瘍細胞である請求項72に記載の組換え細胞。
- 酵母細胞である請求項72に記載の組換え細胞。
- (a)請求項60〜68のいずれか1項に記載のHCV融合タンパク質と、
(b)薬学的に許容可能な担体とを含む、ワクチン。 - 請求項60〜68のいずれか1項に記載のHCV融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む、ワクチン。
- HCV抗原から動物を保護するための製剤において、請求項60〜68のいずれか1項に記載のワクチンを使用する方法。
- HCV抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発するための製剤において、請求項60〜68のいずれか1項に記載のワクチンを使用する方法。
- HCVに感染する危険がある個体群を免疫するための製剤において、請求項60〜68のいずれか1項に記載のワクチンを使用する方法。
- HCVに感染している個体群を治療するための製剤において、請求項60〜68のいずれか1項に記載のワクチンを使用する方法。
- C型肝炎ウィルス(HCV)感染から動物を保護する方法であって、
HCVに感染している動物、またはHCVに感染する危険がある動物に、請求項60〜68のいずれか1項に記載のワクチンを投与することを含み、
上記ワクチンの上記動物への投与により、HCV感染もしくは該動物へのHCV感染により生じる少なくとも1つの症状を軽減または抑制する、方法。 - HCV抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発するための方法であって、
請求項60〜68のいずれか1項に記載のワクチンを動物に投与することを含む、方法。 - HCVに感染している個体群において、HCV抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発するための方法であって、
請求項60〜68のいずれか1項に記載のワクチンを上記個体群に投与することを含む、方法。 - HCVに感染する危険がある個体群をHCVに対して免疫する方法であって、
請求項60〜68のいずれか1項に記載のワクチンを、上記個体群に投与することを含む、方法。
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