KR101492524B1 - 면역 반응 유도를 위한 효모-기반 백신 - Google Patents

Abstract

여기에서 제공되는 본 발명은 원하는 면역 반응을 달성할 수 있도록 맞춰질 수 있는 백신에 관한 것이다. 여기에서 제공되는 일부 조성물들은 우선적으로 체액성 면역 반응을 유도하기 위해 사용되는 반면, 다른 조성물들은 우선적으로 세포-매개 반응을 유도하기 위해 사용된다. 백신 조성물의 조합은 유도되는 면역 반응의 종류를 조절하거나 두 종류 모두의 반응을 유도하기 위해 또한 유용하다. 본 발명은 또한 여기에 개시된 조성물을 투여함으로써 개체에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법을 제공한다. 이들 면역 반응은 다양한 타입의 질환, 감염 및 원치않는 상태로부터 개체를 보호하기 위해 유용하다.

Description

면역 반응 유도를 위한 효모-기반 백신{Yeast-based Vaccine for Inducing an Immune Response}

본 발명은 일반적으로 세포-매개 및/또는 체액성 면역 반응을 포함하는 다양한 종류의 예방 및 치료성 면역 반응을 유도할 수 있는 효모-기반 백신에 관한 것이다. 그러한 효모-기반 백신을 포함하는 조성물 및 다른 타입의 백신과 조합하여 사용하는 것을 포함하는 그러한 백신을 사용하는 방법이 여기에 개시된다. 인플루엔자 감염에 대해 동물을 백신화하기 위한, 그리고 동물에서의 인플루엔자 감염을 치료 또는 예방하기 위한 다양한 조성물 및 방법이 또한 개시된다.

백신은 질환의 예방 및 치료를 위한 건강 관리 산업에 유용한 가장 비용 효율이 높은 수단 중 하나이다. 그러나, 병원체성 감염원에 의한 감염에 의해 야기되는 질환 또는 그와 연관된 질환, 암, 유전적 결손 및 면역계의 다른 장애를 포함한 다양한 질환에 대한 안전하고 효과적인 백신 및 애주번트를 개발할 시급한 필요가 있다. 백신에 대한 문헌들, 예를 들어, Rabinovich et al., Science 265, 1401-1404 (1994)은, 바람직하게는 삶의 이른 시기에, 적은 횟수만으로 투여될 필요가 있으며, 경구적으로 투여할 수 있는 안전하고 열-안정적인 백신에 대한 필요가 여전히 존재한다고 언급하고 있다. 또한, 애주번트를 필요로 하지 않으며, 세포-매개 성, 체액성, 및 점막성 면역성을 유도할 수 있는 백신 뿐만 아니라 하나 이상의 질환으로부터 개체를 보호할 수 있는 복합 백신이 바람직하다. 지금까지는, 있다면, 아주 적은 수의 백신만이 이러한 모든 범주를 만족시킨다.

사멸 또는 약독화된 병원체는 통상적인 백신, 특히 바이러스 감염에 대한 백신에서 빈번히 사용된다. 예를 들어, 두 가지 종류의 인플루엔자 백신이 현재 사용되고 있다. 보다 통상적인 백신은 전형적으로 팔에 주사하는 (사멸 바이러스를 함유하는) 불활성화된 백신이다. 비강-스프레이 플루 백신으로 불리는 (때때로 생 약독화된 인플루엔자 백신(Live Attenuated Influenza Vaccine)에 대해 LAIV로 불리기도 하는) 두 번째 백신은, 2003년에 승인되었으며, 비강 스프레이에 의해 투여되는 약독화된(약화된) 살아있는 바이러스를 함유한다. 세계보건기구(WHO)에 의하면, 인플루엔자 바이러스 타입 A 및 B는 급성 호흡기병의 공통적 원인이다. 두 바이러스 타입 모두 고려할만한 이환률 및 사망률의 전염병을 야기할 수 있지만, 인플루엔자 B 감염은 종종 지역화된 발생에 제한되는 반면, 인플루엔자 A 바이러스는 전세계적 전염병을 포함한 보다 큰 전염병의 주요한 원인이다. 인플루엔자 바이러스는 오소믹소 바이러스(Orthomyxo virus) 패밀리의 일원으로, 인간, 말, 개, 새 및 돼지를 포함한 넓은 숙주 범위를 갖고 있다. 그것은 10개의 바이러스 단백질을 코딩하는 8개의 RNA 단편으로 생산되는, 껍질로 둘러싸인 음성-센스 RNA 바이러스이다. 상기 바이러스는 감염된 숙주 세포의 핵에서 복제된다. 인플루엔자 바이러스는 유년층 및 노령층, 또는 면역손상된 개체들에게 가장 위험하다. 상기 바이러스는 인플루엔자 백신의 생산을 위한 바이러스의 생성을 위해 비히클로서 제공되는 계란 에서 높은 역가로 증식될 수 있다.

인플루엔자 A 바이러스는 그들의 표면 항원이 빈번한 변화를 겪는 반면, 인플루엔자 B 바이러스는 덜 빈번하게 변화한다. 하나의 균주에 의한 감염에 따른 면역성은 계속적인 항원 변이체에 대해 완전히 보호할 수 없다. 결과적으로, 인플루엔자에 대한 새로운 백신은 다음 전염병을 가장 야기할 것 같은 유행하는 균주와 매치되도록 각 해 마다 디자인되어야 한다. 그러므로, WHO는 매년 사람들 사이에서 돌고 있는 가장 널리 퍼진 인플루엔자 균주의 감시에 기초한 데이터를 수집하고 인플루엔자 백신 조성물에 대한 권고를 하고 있다. 현재, 백신은 두 가지 아형의 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스를 백신 중에 포함한다. 백신은 전형적으로 임상적 질환에 대해 건강한 성인의 대략 50% 내지 80%를 보호하고 있다.

재조합 DNA 기술에 의해 그의 개발이 가능해진 서브유닛 백신은 제한된 면역원성을 나타내기 때문에 현재까지는 실망적이다. 한 가지 예는 여러 HIV(인간 면역결핍성 바이러스) 서브유닛 백신에 대한 최근의 임상 시험으로, 이는 백신의 제한된 효능 뿐만 아니라, 일부 케이스에서 면역화된 개체들이 그들이 계속적으로 HIV에 노출되었을 때 가속화된 질환의 진전을 보였기 때문에 중단되었다; 예를 들어, Cohen, Science 264:1839 (1994); 및 Cohen, Science 264: 660 (1994)를 참고. 서브유닛 백신뿐만 아니라 사멸 바이러스 및 재조합 생 바이러스 백신의 한 가지 단점은 그들이 강력한 체액성 면역 반응을 자극하는 동안 보호적 세포-매개 면역성을 유도하는데 실패한다는 점이다. 1994년 국제 AIDS 컨퍼런스에서의 주요한 결론은 현재까지 임상에서 백신에 결여되어 있는 HIV 감염력을 예방하거나 감소시키는 세 포독성 T 세포-매개 반응에 대한 필요가 있다는 것이다. 또한, 현재까지 시험된 HIV 백신은 일차적인 HIV 감염이 발생하는 점막 표면에 면역성을 유도하는데 실패했다.

더욱이, 미국에서 사용 승인 받은 애주번트인 알루미늄 염, 알루미늄 하이드록사이드 및 알루미늄 포스페이트 중 어떤 것도 세포-매개 면역성을 자극하지 못 했다. 또한, 알루미늄 염 제제는 동결 또는 감압동결건조될 수 없고, 그러한 애주번트가 모든 항원에 효과적인 것은 아니다.

전술한 HIV 백신 시험에서 시험된 것들을 포함한 효모 세포 중 일부를 포함한, 효모 세포는 서브유닛 단백질 백신의 생산에 이용되고 있다. 효모는 또한 비특이적인 방식으로 면역 반응을 프라이밍(priming)시키기 위하여(즉, 식세포작용 뿐만 아니라 보체 및 인터페론의 생산을 촉진하기 위하여) 면역화시키기 전에 동물에게 주입된다. 결과는 모호하고 그러한 프로토콜은 보호적 세포성 면역을 생성시키지 못한다; 예를 들면, Fattal-German et al. 1992, Dev. Biol. Stand. 77, 115-120; Bizzini et al. 1990, FEMS Mircobiol. Immunol. 2, 155-167(1990)을 참조.

이전의 연구들은 재조합 S. 세레비지에 효모를 백신 및 면역치료 벡터로서 이용하는 것에 대한 가능성을 보여준다. 예컨대, 미국 특허 5,830,463 및 7,083,787, 및 미국 특허공개공보 2004-0156858 A1 및 2006-0110755 A1 참조. 이들 효모-기반 면역치료 제품은 항원-특이적, CD8⁺ CTL-매개된 방식으로, 다양한 종류의 동물 종에서 인 비보에서 다양한 바이러스 및 암 항원을 발현하는 타겟 세포를 죽 일 수 있는 면역 반응을 유도하는 것으로 확인되었다. Stubbs et al ., Nat . Med . 7:625-629 (2001) 및 Lu et al., Cancer Research 64:5084-5088 (2004) 참조. 보다 구체적으로, 다른 연구들은 사카로마이세스 세레비지에가 수지상 세포에 의해 식균되고, 수지상 세포를 직접 활성화하며, 이어서 상기 수지상 세포는 매우 효율적인 방식으로 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에 효모 연관 단백질을 제시한다는 것을 보여주었다. 예컨대, Stubbs et al. Nature Med . 5:625-629 (2001) 및 U.S. Patent No. 7,083,787 참조.

수지상 세포와 직접적으로 반응할 수 있는 것과 더불어, 효모는 그들을 면역치료를 위한 이상적인 플랫폼을 만들어주는 다양한 다른 특성이 있다. 첫번째, 다중 항원은 단일 효모 균주 내에서 발현을 위해 조작될 수 있다(예컨대, Pichuantes et al., "Expression of heterologous gene products in yeast. In Protein Engineering - Principles and Practice, pp.129-162, J. L. Cleland and C. S. Craik, eds., Wiley-Liss, NewYork (1996) 참조). 이들 제제는 구성의 용이성 및 다중 항원을 타겟팅할 수 있는 능력을 포함하여, DNA 백신과 많은 이점을 공유한다. DNA 백신과 달리, 효모-기반 면역 치료 제제는 잠재적으로 독성이 있는 오염물을 제거하기 위한 강도 높은 정제를 요구하지 않는다. 미국 식품의약청(FDA)은 효모를 GRAS (Generally Recognized as Safe)로서 지정하고 있다. 이와 같이, 다른 백신 벡터들에 존재하는 독성과 안전성에 대한 우려는 효모-기반 운반 비히클에는 적용되지 않는다.

효과적인 백신을 생산하기 위한 모든 노력에도 불구하고, 다양한 면역 반응을 자극하기에 효과적인 백신 조성물에 대한 필요는 여전히 남아 있다. 인플루엔자 백신과 관련하여, 어린이, 노인 및 특정 고-위험 그룹에서 발병률은 여전히 심각하며, 개발 도상국에서는 백신 접종이 단발적이거나 거의 존재하지 않는다. 산업화된 국가에서는, 현재의 기술을 이용한 백신 생산에 요구되는 생산 문제, 고 비용 및 시간으로 인해, 피접종 인구를 수용할 수 있는 충분한 인플루엔자 백신의 생산이 저해되고 있다. 또한, 새로운 바이러스 균주의 위협 및 미래 전염병의 가능성은 보다 효과적이고 효율적으로 생산되는 인플루엔자 백신에 대한 관심을 증가시키고 있다. 그러므로, 다양한 인플루엔자 균주에 대한 장기 지속적이고 효과적인 보호를 제공해 주며, 신속하게 생산될 수 있고 인간 및 다른 동물에서 안전하게 사용될 수 있는 개선된 백신에 대한 필요가 있다. 그러나 이러한 우려와 필요는 비단 인플루엔자 백신에 한정되는 것이 아니라, 다른 바이러스 및 다른 감염성 병원체에 관련된 백신을 포함하여 다른 종류의 백신에 확장된다.

실로, 박테리아 및 기생충을 포함한 많은 병원체가 각 단계에 임하여 면역계에 대해 다른 서브세트의 항원을 제시하면서 단계적으로 개체를 감염시킨다. 또한, 많은 병원체는 면역계에 대해 병원체를 숨기거나 다르게는 면역계를 회피하는 일련의 전략을 발달시켜 왔다. 마지막으로 상술된 바이러스와 같이, 많은 병원체는 항원, 특히 그들의 표면에 존재하거나 표면에서 발현하는 항원을 발달 및 변이시켜왔으며, 이는 동시에 다중 종 또는 균주의 병원체에 의한 감염을 가능하게 하며, 이들은 백신화 전략을 복잡하게 한다. 한 가지 예로서, 말라리아를 야기할 수 있는 기생충(예컨대, Plasmodium falciparum 또는 Plasmodium vivax)에의 감염은 처음에는 감염된 모기에 물려 혈류를 통해 종충으로서 몸에 들어오나, 뒤이어 종충이 낭충으로의 급격한 변화를 겪는 간 세포를 순식간에 감염시킨다. 낭충은 간세포로부터 유리되어 신속하게 적혈구를 감염시키고, 기생충은 증식하고, 분화하고, 계속적으로 다른 세포를 감염시킨다. 따라서, 이상적인 백신은 혈액에서든지, 간에서든지, 또는 적혈구에서든지, 기생충의 모든 단계를 인식하고 파괴할 수 있도록 면역계를 프라이밍시킬 수 있는 것이다. 그러나 대부분의 백신은 모든 감염을 예방하거나 근절시킬 수는 없으며, 대신 생활사의 다른 단계 및 무활동의 감염이 정지되어 있는 동안, 질환을 야기하거나 개체에게 독성이 있는 병원체의 능력을 제한하는데 초점이 맞춰져 있다.

그러므로 감염성 질환 또는 다른 병원균에 의해 야기되는 질환의 전염과 싸우기 위해서는, 예방 또는 치료될 질환 또는 용태, 및/또는 주어진 시점에서의 특정 항원 또는 병원체에 대한 개체의 면역 상태에 따라, 우선적으로 세포-매개 면역 반응(예컨대, 세포독성 T 세포 (CTLs)의 생성)을 유도하거나, 우선적으로 체액성 반응(예컨대, 항체 반응)을 유도하거나, 또는 두 종류 모두의 면역 반응을 유도하는 것과 같이, 유도되는 면역 반응의 종류를 제어하거나 움직일 능력을 갖는 것이 바람직하다. 나아가, 적은 수의 투여로 효과적인 면역 반응을 자극할 수 있으며, 낮은 수준의 항원에의 노출로 면역 반응을 효과적으로 자극할 수 있는 (투여량-절약) 조성물을 제공하는 것이 유용할 것이다.

발명의 요약

여기에서 개시된 본 발명은 상기 기술된 요구에 대해 초점을 맞춘 조성물 및 방법을 제공한다. 효모-기반 백신 플랫폼 기술에 기초한 면역치료 제품(예컨대, 백신)은 간단하게 생산되고, 숙주 면역 반응에 의해 중성화되지 않으며, 반복적으로 투여하여 항원-특이적 면역 반응을 부스팅(boosting)할 수 있으며, 제작을 위해 환자-특이적 접근을 요구하지 않는다.

본 발명의 한 구체예는 백신에 관한 것이다. 한 측면에서, 백신은 (a) 하나 이상의 이종성 세포내 항원을 포함하는 제1 효모 비히클; 및 (b) 하나 이상의 이종성 세포외 항원을 포함하는 제2 효모 비히클을 포함한다. 한 측면에서, 백신은 (a) 하나 이상의 이종성 세포내 항원 및 하나 이상의 이종성 세포외 항원을 포함하는 제1 효모 비히클; 및 (b) 하나 이상의 이종성 세포내 항원 또는 하나 이상의 이종성 세포외 항원을 포함하는 제2 효모 비히클을 포함한다. 다른 측면에서, 백신은 (a) 하나 이상의 이종성 세포내 항원 및 하나 이상의 이종성 세포외 항원을 포함하는 효모 비히클; 및 (b) (a)의 효모 비히클에 포함된 하나 이상의 항원 또는 동일한 병원체 또는 질환으로부터 유래한 항원을 포함하는, DNA 백신, 단백질 서브유닛 백신, 및 사멸 또는 불활성화 병원체로부터 선택되는 비-효모-기반 조성물을 포함한다.

본 발명의 상기 구체예에서, (a)의 효모 비히클은 (b)의 비-효모-기반 조성물과 동일하거나 상이한 경로에 의해 전달되도록 제제화될 수 있다. 한 측면에서, 세포내 항원은 병원체에 의해 내적으로 발현되는 항원이다. 한 측면에서, 세포외 항원은 동일한 종류의 병원체 중 구조적으로 보존된 항원이다. 한 측면에서, 세포외 항원은 병원체의 표면에서 발현되는 항원이다. 한 측면에서, 세포외 항원은 동일한 종류의 병원체 중 구조적으로 가변적인 항원이다. 한 측면에서, 항원은 감염성 병원체로부터 유래한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 하나 이상의 인플루엔자 항원을 포함하는 백신에 관한 것이다. 한 측면에서, 백신은 (a) 효모 비히클; 및 (b) 인플루엔자 매트릭스 (M1) 단백질 및 인플루엔자 이온 채널 단백질 (M2)로 구성된 군으로부터 선택되는 인플루엔자 단백질의 적어도 일부분을 포함하고, 상기 효모 비히클에 의해 발현되거나 제공되는 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, 백신은 (a) 인플루엔자 매트릭스 (M1) 단백질, 인플루엔자 이온 채널 단백질 (M2) 및 뉴클레오캡시드 (NP) 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 인플루엔자 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 발현하는 제1 효모 비히클; 및 (b) 헤마글루티닌 (HA) 단백질 및 뉴라미니다제 (NA) 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 인플루엔자 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 발현하는 하나 이상의 추가의 효모 비히클을 포함한다. 한 측면에서, 백신은 (a) 효모 비히클; 및 (b) 인플루엔자 매트릭스 (M1) 단백질, 인플루엔자 이온 채널 단백질 (M2) 및 뉴클레오캡시드 (NP) 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제1 인플루엔자 단백질의 적어도 일부분; 및 헤마글루티닌 (HA) 단백질 및 뉴라미니다제 (NA) 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제2 인플루엔자 단백질의 적어도 일부분을 포함하고, 상기 효모 비히클에 의해 발현되는 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 포함한다. 다른 측면에서, 백신은 (a) 효모 비히클; (b) 인플루엔자 매트릭스 (M1) 단백질, 인플루엔자 이온 채널 단백질 (M2) 및 뉴클레오캡시드 (NP) 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인플루엔자 단백질의 적어도 일부분을 포함하고, 효모 비히클에 의해 발현되는 제1 인플루엔자 바이러스 융합 단백질; 및 (c) 헤마글루티닌 (HA) 단백질 및 뉴라미니다제 (NA) 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인플루엔자 단백질의 적어도 일부분을 포함하고, 효모 비히클에 의해 발현되는 제2 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 포함한다. 또 다른 측면에서, 백신은 (a) 효모 비히클; 및 (b) 인플루엔자 매트릭스 (M1) 단백질, 인플루엔자 이온 채널 단백질 (M2) 및 뉴클레오캡시드 (NP) 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제1 인플루엔자 단백질의 적어도 일부분; 및 (c) 헤마글루티닌 (HA) 단백질 및 뉴라미니다제 (NA) 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제2 인플루엔자 단백질의 적어도 일부분을 포함한다.

상기 구체예에서, 한 측면에서, 상기 HA 단백질은 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 및 H16으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 측면에서, 상기 HA 단백질은 H1, H2 및 H3으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 측면에서, 상기 HA 단백질은 H5이다. 한 측면에서, 상기 NA 단백질은 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 및 N9로부터 선택된다. 한 측면에서, 상기 NA 단백질은 N1 및 N2로부터 선택된다. 한 측면에서, M1 단백질은 효모 비히클에 대해 세포 내에 존재한다. 한 측면에서, M2 단백질은 효모 비히클에 대해 세포내, 세포외, 또는 세포내 및 세포외 양쪽에 존재한다. 한 측면에서, M2 단백질은 M2e이다. 한 측면에서, NP 단백질은 효모 비히클에 대해 세포내에 존재한다. 한 측면에서, 상기 HA 단백질 또는 NA 단백질은 효모 비히클에 대해 세포외에 존재한다. 이러한 측면에서, NA 단백질은 또한 효모 비히클에 대해 세포내에 존재할 수 있다.

상기 구체예에서, 한 측면에서, 상기 인플루엔자 바이러스 융합 단백질은 그의 N-말단 또는 C-말단에 효모 비히클의 세포벽에 융합 단백질을 타겟팅하기에 충분한 Aga2 단백질의 적어도 일부분을 포함한다. 한 측면에서, 상기 인플루엔자 바이러스 융합 단백질은 그의 N-말단 또는 C-말단에 효모 비히클의 세포벽에 융합 단백질을 타켓팅하기에 충분한 Cwp2 단백질의 적어도 일부분을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예는 (a) 효모 비히클; 및 (b) 상기 효모 비히클에 의해 단일 세포내 융합 단백질로서 발현되는 M1 항원을 포함하고, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 포함하는 백신을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예는 (a) 효모 비히클; 및 (b) 상기 효모 비히클에 의해 단일 세포내 융합 단백질로서 발현되는 H1 항원을 포함하고, 서열번호 6 및 서열번호 20으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 포함하는 백신을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 (a) 효모 비히클; 및 (b) 상기 효모 비히클에 의해 단일 세포외 융합 단백질로서 발현되는 H1 항원을 포함하고, 서열번호 10, 서열번호 26, 서열번호 28 및 서열번호 36으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 (a) 효모 비히클; 및 (b) 상기 효모 비히클에 의해 단일 세포외 융합 단백질로서 발현되는 H5 항원을 포함하고, 서열번호 14, 서열번호 22 및 서열번호 24로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 (a) 효모 비히클; 및 (b) 상기 효모 비히클에 의해 단일 세포내 융합 단백질로서 발현되는 M1 항원, N1 항원 및 4개의 M2e 항원을 포함하고, 서열번호 16의 아미노산 서열로 구성되는 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 (a) 효모 비히클; 및 (b) 상기 효모 비히클에 의해 단일 세포내 융합 단백질로서 발현되는 N1 항원 및 2개의 M2e 항원을 포함하고, 서열번호 18의 아미노산 서열로 구성되는 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 (a) 효모 비히클; 및 (b) 상기 효모 비히클에 의해 단일 세포내 융합 단백질로서 발현되는 H3 항원 및 N2 항원을 포함하는 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 포함하는 백신에 관한 것이다.

상기 구체예 중 어느 하나에 있어서, 한 측면에서, 상기 융합 단백질의 발현은 유도성 프로모터에 의해 제어된다. 상기 구체예 중 어느 하나의 한 측면에서, 상기 프로모터는 CUP1 및 TEF2로 구성된 군으로부터 선택된다.

상기 구체예 중 어느 하나의 한 측면에서, 상기 효모 비히클은 전효모(whole yeast), 효모 스페로플라스트(yeast spheroplast), 효모 세포질체(yeast cytoplast), 효모 고스트(yeast ghost), 효모 세포벽 제제(yeast cell wall preparation), 및 아세포 효모 막 추출물(subcellular yeast membrane extract) 또는 그의 분획으로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 구체예 중 어느 하나의 한 측면에서, 상기 효모 비히클의 제조를 위해 사용되는 효모 세포 또는 효모 스페로플라스트는 융합 단백질이 효모 세포 또는 효모 스페로플라스트에 의해 재조합적으로 발현되도록 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질전환된 것이다. 상기 구체예 중 어느 하나의 한 측면에서, 상기 융합 단백질을 발현하는 효모 세포 또는 효모 스페로플라스트는 효모 세포질체, 효모 고스트, 효모 세포벽 제제 또는 아세포 효모 막 추출물 또는 그의 분획을 포함하는 효모 비히클을 생산하기 위해 사용되는 것이다. 상기 구체예 중 어느 하나의 한 측면에서, 상기 효모 비히클은 비-병원성 효모로부터 유래한 것이다. 상기 구체예 중 어느 하나의 한 측면에서, 상기 효모 비히클은 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 클루베로마이세스(Kluveromyces), 한세눌라(Hansenula), 캔디다(Candida), 및 피치아(Pichia)로 구성된 군으로부터 선택되는 효모로부터 유래한 것이다. 상기 구체예 중 어느 하나의 한 측면에서, 상기 사카로마이세스는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)이다.

상기 구체예 중 어느 하나의 한 측면에서, 상기 백신은 효모 비히클과 함께 세포내로 로딩되는 수지상 세포를 추가로 포함한다.

상기 구체예 중 어느 하나의 한 측면에서, 상기 백신은 하나 이상의 생물학적 반응 조정제를 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 구체예는 항원-특이적 면역 반응을 유도하기 위한 제제의 제조를 위한 여기에서 기술된 임의의 백신의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 인플루엔자 감염에 대해 동물을 보호하기 위한 제제에서의 여기에서 기술된 임의의 백신의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 인플루엔자 항원에 대한 항원-특이적, 세포-매개 면역 반응을 유도하기 위한 제제의 제조를 위한 여기에서 기술된 임의의 백신의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 질환 또는 용태를 치료 또는 예방하기 위한 제제의 제조를 위한 여기에서 기술된 임의의 백신의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 인플루엔자에 감염될 위험에 처한 개체들의 집단을 면역화시키기 위한 제제의 제조를 위한 여기에서 기술된 임의의 백신의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 인플루엔자에 감염된 개체들의 집단을 치료하기 위한 제제의 제조를 위한 여기에서 기술된 임의의 백신의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 pH 5.5 이상의 pH에서 백신 내의 효모 비히클을 배양하는 것을 포함하는 여기에서 기술된 임의의 효모-기반 백신(효모 비히클을 포함하는 백신)을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 인플루엔자 매트릭스 (M1) 단백질, 인플루엔자 이온 채널 단백질 (M2), 인플루엔자 바이러스 뉴클레오캡시드 (NP) 단백질, 헤마글루티닌 (HA) 단백질 및 뉴라미니다제 (NA) 단백질로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 인플루엔자 항원 융합 단백질로 효모 비히클을 형질감염하는 것을 포함하는, 인플루엔자 백신을 생산하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 방법은 pH 5.5 이상의 pH에서 효모 비히클을 배양하는 것을 포함한다. 추가적 측면은, 인플루엔자 바이러스 단백질을 효모 비히클에 로딩하고, 인플루엔자 바이러스 항원과 상기 효모 비히클을 함께 혼합하고, 인플루엔자 바이러스 항원을 효모 비히클에 물리적으로 결합시키고, 주사에 의한 개체로의 투여를 위해 상기 형질감염된 효모 비히클을 제제화하거나 비내 투여에 의한 개체로의 투여를 위해 상기 형질감염된 효모 비히클을 제제화하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예는 인플루엔자 감염에 대해 동물을 보호하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 인플루엔자에 감염되거나 인플루엔자에 감염될 위험에 처한 동물에게 인플루엔자 항원을 포함하는 여기에서 개시된 임의의 백신을 투여하는 것을 포함하며, 상기 백신의 투여는 동물에서의 인플루엔자 감염 또는 인플루엔자 감염으로부터 생기는 하나 이상의 증상을 감소시키거나 예방한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 인플루엔자 항원을 포함하는 여기에서 개시된 임의의 백신을 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 항원에 대한 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 인플루엔자 항원을 포함하는 여기에서 개시된 임의의 백신을 인플루엔자에 감염된 개체들의 집단에 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자에 감염된 개체들의 집단에서 인플루엔자 항원에 대한 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 인플루엔자 항원을 포함하는 여기에서 개시된 임의의 백신을 인플루엔자에 감염될 위험에 처한 개체들의 집단에 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자에 감염될 위험에 처한 개체들의 집단을 인플루엔자 항원에 대해 면역화시키는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 백신은 다른 인플루엔자 백신으로 부스팅하기 이전에 면역계를 프라이밍하기 위해 투여된다.

본 발명의 또 다른 구체예는 (a) 질환 또는 용태와 연관된 하나 이상의 이종성 세포내 항원을 포함하는 제1 효모 비히클을 포함하는 제1 백신을 개체에게 투여하고 (b) (a)를 투여한 지 적어도 2주 후, 세포외 단백질, 또는 세포내 및 세포외 단백질로서의 이종성 항원을 포함하는 제2 효모 비히클을 포함하는 제2 백신을 투여하는 것을 포함하는 질환 또는 용태에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 제1 백신의 효모 비히클은 또한 하나 이상의 세포외 항원을 포함한다. 이러한 측면에서, 상기 항원은 상기 세포내 항원과 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 (a) 질환 또는 용태와 연관된 하나 이상의 이종성 세포내 항원 및 하나 이상의 이종성 세포외 항원을 포함하는 제1 효모 비히클을 포함하는 제1 백신을 개체에 투여하고; (b) (a)의 투여와 함께 또는 순차적으로 i) 단계 (a)에서 사용된 하나 이상의 이종성 항원 또는 동일한 병원체 또는 질환으로부터 유래한 항원으로서, 제2 효모 비히클에 대해 세포외, 또는 세포내 및 세포외에 존재하는 항원을 발현 또는 제공하는 제2 효모 비히클; ii) 단계 (a)에서 사용된 하나 이상의 이종성 항원 또는 동일한 병원체 또는 질환으로부터 유래한 항원을 포함하는 효모막 또는 세포벽 입자; iii) 단계 (a)에서 사용된 하나 이상의 이종성 항원 또는 동일한 병원체 또는 질환으로부터 유래한 항원과 혼합된 효모 비히클; iv) 단계 (a)에서 사용된 하나 이상의 이종성 항원 또는 동일한 병원체 또는 질환으로부터 유래한 항원을 코딩하는 DNA 백신; v) 단계 (a)에서 사용된 하나 이상의 이종성 항원 또는 동일한 병원체 또는 질환으로부터 유래한 항원을 포함하는 단백질 서브유닛 백신; 또는 vi) 단계 (a)에서 사용된 하나 이상의 이종성 항원을 포함하는 사멸 또는 불활성화된 병원체로부터 선택되는 제2 백신을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 질환 또는 용태에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 세포내 항원은 세포외 항원과 동일하다. 한 측면에서, 상기 세포내 항원은 세포외 항원과 상이하다. 한 측면에서, 상기 세포내 항원은 병원체에 의해 내적으로 발현된 항원이다. 한 측면에서, 상기 세포외 항원은 동일한 종류의 병원체 중 구조적으로 보존된 항원이다. 한 측면에서, 상기 세포외 항원은 병원체의 표면에 발현되는 항원이다. 한 측면에서, 상기 세포외 항원은 동일한 종류의 병원체 중 구조적으로 가변적인 항원이다. 한 측면에서, 상기 항원은 감염성 병원체로부터 유래한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 각각의 효모 비히클이 하나 이상의 세포내 이종성 항원 또는 하나 이상의 세포외 이종성 항원을 포함하고 있는 다수개의 효모 비히클 및 제제를 제조하기 위한 효모 비히클의 사용에 대한 지시서를 포함하는 개체 내에서 세포-매개 면역 반응, 체액성 면역 반응, 또는 그의 복합을 유도하기 위한 키트에 관한 것이다. 한 측면에서, 효모 비히클은 항원들을 발현한다. 한 측면에서, 상기 키트는 또한 a) 하나 이상의 이종성 항원 또는 동일한 병원체 또는 질환으로부터 유래한 항원을 포함하는 효모막 또는 세포벽 입자; b) 하나 이상의 이종성 항원 또는 동일한 병원체 또는 질환으로부터 유래한 항원과 혼합된 효모 비히클; c) 하나 이상의 이종성 항원 또는 동일한 병원체 또는 질환으로부터 유래한 항원을 코딩하는 DNA 백신; d) 하나 이상의 이종성 항원 또는 동일한 병원체 또는 질환으로부터 유래한 항원을 포함하는 단백질 서브유닛 백신; 및 e) 하나 이상의 이종성 항원을 포함하는 사멸 또는 불활성화된 병원체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가적 조성물을 포함한다. 한 측면에서, 상기 세포내 항원은 병원체에 의해 내적으로 발현된 항원이다. 한 측면에서, 상기 세포내 항원은 동일한 종류의 병원체 중 구조적으로 보존된 항원이다. 한 측면에서, 상기 세포외 항원은 병원체의 표면에 발현되는 항원이다. 한 측면에서, 상기 세포외 항원은 동일한 종류의 병원체 중 구조적으로 가변적인 항원이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 일반적으로 세포-매개 면역 반응, 체액성 면역 반응, 및 그의 조합을 포함하는 다양한 종류의 면역 반응을 효율적으로 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 (병원체를 포함한) 매우 다양한 항원에 대한 보호성 및/또는 치료성 면역 반응을 유도하기 위해 유용하며, 상기 반응은 우선적으로 세포-매개 면역 반응, 체액성 면역 반응, 또는 세포-매개 및 체액성 면역 반응 모두를 유도하기 위해 (또는 그의 유도를 보장하기 위해) 최적화될 수 있다. 또한, 본 발명의 백신 및 백신 전략에 의해 유도되는 면역 반응은 동시에 다중 종 또는 균주들로 개체를 감염시키고/거나 빈번히 변이되는 병원체, 다른 생활사 단계에서 개체를 감염시키거나 개체 내에 존재하는 병원체, 및 타겟 세포의 감염을 포함한 다양한 작용에 의해 면역계를 회피하는 병원체에 대한 효과적인 반응을 제공하도록 최적화될 수 있다. 본 발명에 의해 유도되는 면역 반응은 체액성 면역 반응이 적어도 질환을 야기하는 병원체의 능력을 제한하는데에는 다소 효과적이나, 그럼에도 불구하고 면역반응을 회피하거나 면역반응을 잘못 유도할 수 있는, 병원체의 교체 형태 (돌연변이 또는 생활사 형태) 및/또는 병원체에 의한 숙주세포의 감염 또는 차지를 막거나 탐지하는데 실패하는 경우의 시나라오에서 특히 효과적이다. 본 발명의 백신 및 백신 전략에 의해 유도되는 면역 반응은 특정 질환 또는 용태에 대해 가장 유익할 수 있는 면역 반응의 종류에 따라, 그리고 주어진 시점에서의 주어진 항원 또는 병원체에 대한 환자의 면역 상태에 따라, 질환 또는 용태를 갖는 개체를 보호 또는 치료하기 위해 최적화될 수 있다. 마지막으로, 본 발명의 백신 또는 백신 전략은, 적은 횟수의 투여로 효과적인 면역 반응을 자극할 수 있으며, 또한 낮은 수준의 항원으로 노출시켜 면역 반응을 자극하는데 효과적이다(투여량-절약).

본 발명은 보호성 또는 치료성 면역화 및/또는 백신화 목적을 위해 유용한 다양한 항원에 대해 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 체액성 면역 반응 및 세포-매개 면역 반응 모두를 유도할 수 있는 조성물을 제공하며, 추가적 측면에서, 관심 있는 하나 이상의 항원과 직결된 항원-특이적 항체 생산에 대한 프라이밍을 포함한, 체액성 면역 반응을 우선적으로 유도 또는 프라이밍하기 위한, 또는 세포독성 T 세포 반응을 포함한, 세포-매개 (세포성) 면역 반응을 우선적으로 유도 또는 프라이밍하기 위한 조성물 및 백신 전략을 제공한다. 우선적으로 유도한다는 것은, 본 발명의 효모-기반 백신을 이용하여 어떻게 항원이 면역계에 유용하게 만들어지는지에 일차적으로 기초하여, 면역 반응이 특정한 종류의 면역 반응을 향해 추진되거나 지시됨을 의미한다. 본 발명은 또한, DNA 백신과 같은 비-효모-기반 백신을 이용한 성공적인 면역화 또는 면역원성을 향상 또는 보완할 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다.

보다 특히, 본 발명은 미국특허 5,830,463 및 7,083,787, 및 미국특허공개공보 2004-0156858 A1 및 2006-0110755 A1에서 기술하고 있는 효모-기반 면역치료 제품에 관련된 플랫폼 기술의 개선과 직결되어 있으며, (병원체를 포함한) 매우 다양한 항원에 대한 보호성 및/또는 치료성 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 신규한 효모-기반 백신을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 항원이 세포내로, 세포외로(즉, 효모 표면 발현), 또는 양자 모두로 발현 또는 제공되도록 선택적으로 효모-기반 백신 조성물을 디자인할 수 있는 능력, 그리고 특정 항원(들)에 대해 우선적으로 유도되는 면역 반응의 종류를 조작하기 위해, 그리고 또한 특정 항원 또는 항원들에 대해 개체를 가장 효과적으로 면역화시키고 항원 또는 항원들과 연관된 질환 또는 용태를 가장 효과적으로 예방 또는 치료하는 면역 반응의 능력을 조작하기 위해, 세포내 및/또는 세포외 발현/정주를 위한 상이한 항원 및 항원의 배합을 선택할 수 있는 능력을 이용한다.

예를 들어, 여기에서 개시된 본 발명을 이용한 한 구체예에서, 항원 또는 항원들에 대한 장기-지속 면역성, 및 중요하게는, 세포-매개 면역성을 제공하기 위한 상호-보호적인 "범용의(universal)" 백신 접근법을 제공하는 조성물 및 방법이 개시된다. 본 발명의 이러한 요소는 병원체와 관련하여, 예를 들어, 특정 항원이 병원체 중 상이한 균주 또는 종들에서 높게 보존되어 있다는 사실을 이용한다. 또한, 타겟팅될 수 있는 면역 반응에 대한 타겟 세포, 예컨대, 종양 세포는 또한 특정 보존된 항원을 공유할 수 있다. 그러한 항원은 빈번히 병원체 또는 세포에 의해 내적으로 발현된다(즉, 병원체 또는 세포의 표면상에 디스플레이된 항원은 쉽게 변형되거나 돌연변이되어 면역 탐지 및 제거를 회피하는 경향이 있는 반면 병원체 또는 세포에 대해 내부에 있는 항원은 균주에서 균주, 종에서 종, 또는 세포에서 세포 간에, 보존되어 있는 경향이 있다). 그러한 보존된 항원(바이러스와 같이 병원체에 의해 내적으로 발현된다면,일반적으로 내적 항원이라고 언급될 수 있다)은 상호-보호적이고 항원에 대한 (그리고 이어서 병원체에 감염되거나 차지된 세포에 대한) 효과적인 세포-매개 면역 반응(세포성)을 유도할 수 있는 효모-기반 백신에 대한 근간을 제공한다. 이러한 측면에서, 보존된 항원 또는 내부 항원은 전형적으로 본 발명의 효모 비히클에 의해 세포내로 발현되거나 제공된다. 그러나 이러한 종류의 항원의 발현은 세포내 발현으로 제한되지 않으며; 보존 또는 내적 항원은 또한 이하 기술되는 바와 같이, 대안적으로 효모 비히클에 의해 (효모의 표면 상에서) 세포외로 발현 또는 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 (예컨대, 발현에 의한, 세포내 로딩 또는 효모의 세포내 환경 내에 포함된 항원을 제공하는 임의의 다른 방법에 의한) 효모 비히클에 의한 항원의 세포내 발현 또는 정주는 임의의 항원에 대한 세포-매개 면역 반응을 우선적으로 유도하기 위해 일반적으로 유용하며, 또는 보다 특히, 체액성 면역 반응이 이러한 접근에 의해 프라이밍되거나 유도된다고 하더라도, 특히 자연적으로 발생하는 형태의 항원이 세포외 환경에 의해 이용될 수 있다면(즉, 이전의 감염, 질환 또는 면역화에 의해) 세포-매개 면역 반응이 쉽게 유도되는 상황에서 항원을 제공한다. 효모 비히클에 의한 항원의 세포내 발현 또는 제공은 강력한 세포-매개 면역반응을 제공하고 바람직하게는 면역학적 기억이 (예컨대, 면역화, 감염 또는 질환을 부스팅함을 통해) 미래에 항원과 만나는 것에 대응하는 면역반응의 세포-매개 및 체액성 전투의 능력을 향상시킬 것이므로, 특히 항원으로 프라이밍하거나 최초 백신화하기 위해 유용하다. 항원의 세포내 발현 또는 제공은 상술된 보존 또는 내부 항원, 및 하기 기술되는 가변 또는 외부 항원을 포함하는 임의의 항원에 대한 면역 반응의 유도를 위해 유용하다.

다른 구체예에서, 균주, 종, 또는 항원 변이체-특이적 면역 반응을 유도하기 위해 디자인된 조성물 및 방법이 제공된다. 예를 들어 이러한 접근법은 예를 들어, 표면 항원에 기초한 세 개의 바이러스 그룹을 대표하는 세 개의 선택된 바이러스 균주를 대개 포함하는 통상적인 사멸 바이러스 백신에서 행해지고 있는 것과 같이, 특정 돌연변이, 균주, 종 또는 병원체의 생활사 단계, 또는 특정 항원 변이체와 연관될 수 있는 보다 특이적 항원에 대해 숙주를 면역화시킨다. 다시 말하면 본 발명의 이러한 측면은 많은 병원체 및 세포가 항원 또는 병원체에 대한 보다 직접적인 면역화 또는 보다 정기적인 면역화를 제공하는 효모-기반 백신을 생산하기 위해 사용될 수 있는 단백질의 변형을 특히 그러한 병원체 또는 세포의 표면 상에서 발현한다는 사실을 이용한다. 본 발명의 한 측면에서, 그러한 항원은 본 발명의 효모 비히클에 의해 전형적으로 세포외로(표면 상에) 발현된다. 가변 또는 외부 항원은 효모 비히클 상의 항원의 세포외 발현 또는 세포외 제공에 제한되지 않으며; 그러한 항원은 또한 이하 기술되는 바와 같이 대안적으로 효모 비히클에 의해 세포내로 발현 또는 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 효모 비히클에 의한 항원의 세포외 또는 표면 발현 또는 제공은 (예컨대, 효모 비히클의 외부 표면에 대한 항원의 표면 발현 또는 전달이 이루어지도록 발현함으로써, 외부 표면에 항원을 결합함으로써, 또는 효모로부터 항원을 분비함으로써), 항원에 대한 체액성 면역 반응을 우선적로 유도하거나, 또는 보다 특히, 세포-매개 면역 반응이 또한 이러한 접근법에 의해 프라이밍 또는 유도될 수 있긴 하나, 항원이 효모 비히클에 의해 세포내로 발현될 때와 비교하여 체액성 면역 반응의 유도를 향상시킨다. 실로, 그러한 백신의 한 가지 장점은, 예를 들어, 바이러스에 대한 중성화 항체 반응을 일차적으로 유도하는 상기 언급된 통상적인 사멸 바이러스 백신과 대조적으로, 본 발명의 백신은 이들 표면 항원에 대한 세포-매개 및 체액성 면역 반응 양자 모두를 유도할 수 있다는 것이다. 효모 비히클에 의한 항원의 세포외 발현 또는 제공은 상기 기술한 보존 또는 내부 항원 및 가변 또는 외부 항원을 포함하는 임의의 항원에 대한 면역 반응의 유도를 위해 유용하다. 그러나, 효모 비히클에 의한 항원의 세포외 발현 또는 제공은, 그러한 항원에 대한 체액성 면역 반응의 발달이 바람직하므로, 특히 가용성 항원, 세포-표면 발현 항원, 또는 병원체-표면 발현 항원과 같이 면역계가 세포외 환경에서 접촉할 것이 예상되는 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 유용하다.

한 측면에서, 본 발명은 또한 상술된 두 가지 백신 접근법(효모 비히클에 의한 항원의 세포내 및 세포외 발현 또는 제공)을 복합하여, 특정 항원 변이체 또는 병원체 종, 균주 또는 돌연변이에 대한 상호-보호성 면역성 및 보다 특이적인 면역성을 제공할 수 있도록 디자인될 수 있는, 세포-매개 및 체액성 면역성 양자를 효과적으로 유도하는 강력한 신규 백신을 제공한다. 예를 들어, 인플루엔자 감염과 같은 바이러스성 감염을 언급하면, 복합 백신 접근법은 바이러스 균주-특이적 항원 접근법과 함께 상호-보호적이고, "범용적인" 방식으로, 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 강력한 면역 반응을 유도한다. 이 접근법은 인플루엔자 바이러스에 대한 세포-매개 및 체액성 면역 반응 모두를 유도할 것이며, 본 발명의 바람직한 구체예에서는, 이러한 접근법이 상호-보호적 및 바이러스 균주-특이적 방식으로 행해진다.

본 발명의 이러한 구체예에서, 백신은 임의의 다양한 방식으로 디자인될 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 병원체로부터 보존된 항원(들)(예컨대, 바이러스 내부 항원)은 효모 비히클에 의해 세포내로 발현 또는 제공될 수 있으며, 병원체로부터의 가변 항원(예컨대, 바이러스 표면 항원)은 효모 비히클에 의해 세포외적으로 발현 또는 제공될 수 있다. 그러한 효모 비히클을 이용한 면역화는 바이러스에 대한 세포-매개 및 체액성 면역 반응 모두를 유도할 것이며, 상호-보호적 및 바이러스 균주-특이적 방식으로 행해질 것이다. 그러한 효모 비히클을 포함하는 백신으로 면역화된 개체는, 두 가지 종류의 면역 반응이 두 가지 종류의 항원에 대해 프라이밍되긴 하지만, 보존된 항원(들)에 대한 강력한 세포-매개 면역성 및 가변 항원에 대한 강력한 체액성 면역성을 가질 것이다. 어떻게 이러한 첫번째 예를 바이러스에 대한 면역 반응을 개선 또는 조정하기 위해 조절할 수 있는지는 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 보존된 항원 및 가변 항원 모두를 효모에 의해 세포내로 발현 또는 제공할 수 있으며, 두 가지 종류의 항원에 대해 (미래의 세포-매개 및 체액성 반응의 프라이밍을 위해 중요한) 세포-매개 면역 반응을 보다 더 확실히 하기 위해, 그리고 가변 항원에 대한 보다 효과적인 체액성 면역성을 즉시 제공하기 위해(예컨대, 도 16 및 여기에서의 기술을 참조), 가변 항원을 효모에 의해 세포외로 발현 또는 제공할 수 있다.

여기에서 기술된 복합 구체예들에서, 항원을 세포외로(효모 비히클 표면 상에) 발현 또는 제공하는 효모 비히클은 항원을 세포내로 발현 또는 제공하는 효모 비히클과 동일하거나 상이한 효모 비히클일 수 있다. 또한, 상이한 배합의 세포내 항원 및/또는 세포외 항원이 상이한 효모 비히클 상에서 발현될 수 있으며, 비히클은 요구되는 백신화에 따라 별개로 또는 함께 사용될 수 있다. 일반적으로, 항원이 둘 이상의 상이한 효모 비히클에 의해 제공될 때(즉, 하나의 효모 비히클에서 모든 항원을 발현 또는 제공하는 것과는 반대로), 효모 비히클은 단일 백신으로서의 투여를 위해 복합(혼합)될 수 있거나(예컨대, 단일의 주사 또는 다른 종류의 투여형태), 상이한 효모 비히클이 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적인 투여는 시간의 작은 증가(초 또는 분) 및 시간의 큰 증가(일, 주, 달 또는 년)을 포함한 임의의 적합한 기간으로 분리될 수 있다. 본 발명은 이들 구체예에서, 하나 이상의 세포내 항원 및 하나 이상의 세포외 항원을 포함하는 임의의 복합 항원이 바람직한 구체예에서 사용될 수 있으며, 이들 항원이 그러한 항원을 발현 또는 제공하는 (단일의 효모 비히클을 포함하는) 효모 비히클의 임의의 복합을 이용하여 제공될 수 있음을 예상한다.

따라서 상술된 백신 접근법은 세포외 항원 및/또는 세포내 항원의 상이한 복합 및, 일부 측면에서, 보존 및/또는 가변 항원의 상이한 복합을 포함하는 항원의 상이한 복합이 제공되는 상이한 효모-기반 백신의 복합 또는 순차 투여(예컨대, 프라이밍/부스팅 전략)에 의해 조절될 수 있다. 또한, 여기에서 기술된 효모 비히클은 면역반응과 추가로 직결시키기 위해, 그리고 감염 또는 질환에 대한 향상된 보호를 제공하기 위해 다른 종류의 백신과 동시에 또는 순차적으로(예컨대, 프라이밍 및 부스팅 프로토콜로) 복합될 수 있다. 한 구체예에서, 적어도 세포-매개 면역성을, 한 측면에서 항원을 세포내 및 세포외로 발현 또는 제공함에 의한 것과 같이 세포-매개 및 체액성 면역성을 제공하는 본 발명의 효모 백신은 특정 항원 항원의 세트, 또는 병원체에 대한 면역 반응을 프라이밍 하기 위해 사용된다. 그리고 나서, DNA 백신, 단백질 서브유닛 백신, 또는 사멸 또는 불활성화 병원체과 같은 통상적인 백신의 전달에 의한, 또는(막 또는 세포벽 입자 백신을 포함하는) 또다른 효모-기반 백신 또는 효모 및 통상적인 항원 제제의 복합 또는 효모 단독(예컨대, 이들 후자의 두 시나리오에서, 효모가 일차적인 애주번트로서 제공되는 경우)에 의한 면역화 부스팅이 제공된다. 그러한 "프라이밍-부스팅" 전략에 있어서, 첫번째 면역화(프라이밍)의 결과로서 유도된 강력한 세포-매개 반응은 뒤이은 부스팅의 효능을 개선시키며, 일부 구체예에서는 특히, 부스팅 백신이 프라이밍 백신과는 다른 종류의 백신이고/거나 프라미밍 백신과 비교하여 상이한 항원을 포함할 때, 실질적으로 상승 효과를 제공할 수 있다.

본 발명의 효모-기반 백신 및 방법을 이용하여 면역 반응을 프라이밍함으로써, 세포-매개 및 체액성 면역학적 기억이 생성된다(즉, 관심있는 항원을 선택적으로 인식하는 메모리 B 세포 및 T 세포가 생성된다). 결과적으로, 항원에의 순차적인 노출에서, 예컨대, 백신화 부스팅, 질환 또는 감염을 통해, 면역계는 보다 빠르게, 보다 효과적으로 반응할 것이며, 백신화 부스팅과 관련하여 중요하게는, 낮은 항원 투여량이 비-효모-기반 백신의 부스팅에서 사용될 수 있다(예를 들어, 실시예 2 및 도 14 내지 16 참조). 또한, 효모 비히클은 DNA 백신을 효모-기반 백신과 복합하는 것과 같이, 복합적인 접근법에 의해 면역 반응이 최적화될 수 있도록 비-효모-기반 백신과 함께 상승적으로 작용할 것이다. 그와 같이 백신은 효능을 위해 오직 한번 및/또는 적은 양으로 투여될 필요가 있을 것이다. 이들 투여량-절약 특성은 특히 대량 면역화의 환경에서 개체를 1회 이상 면역화시키는 것이 어려워, 비-효모 기반 백신의 공급량이 적을 때 또는 공중 보건을 위협하는 병원균과 싸울 때 바람직하다.

본 발명의 조성물 및 방법은 또한 관심있는 항원(들)을 필수적으로 재조합적으로 발현하거나 제공하지 않는 백신이 별도로 제공되는, 항원의 면역 반응을 향상시키기 위한 애주번트로서(예컨대, DNA 백신, 서브유닛 단백질 백신, 사멸 또는 불활성화 병원체, 수지상 세포 백신 등을 포함하는 임의의 통상적인 백신으로서) 또는 병원체에 현재 감염된 개체, 세포성 단백질에의 돌연변이를 경험하거나 면역계가 저항적이지 않은 항원 또는 면역계가 깨질 수 있는 항원을 발현 또는 운반하는 개체와 같이 비-항원-운반 효모 비히클의 투여시 항원을 면역 반응을 일으키기에 충분한 양으로 운반하는 개체의 측면에서 사용되는 것을 포함한다. 이 접근법은 상기 기술한 바와 같이 세포내 및/또는 세포외 이종성 항원을 발현 또는 제공하는 효모 비히클로의 우선적 또는 순차적 면역화와 복합될 수 있다.

실로, 본 발명의 백신을 어떻게 디자인하고 사용할지에 대해서는 큰 유연성이 있다. 예를 들어, 보존된 항원과 같은 특정 항원을 발현하거나 특정 항원과 복합되어 있는 (즉, 특정 항원과 연관되거나 혼합되거나 특정 항원을 포함하거나 제공하는) 효모 비히클을 포함하는 "범용적" 백신은 개체에서의 상호-보호성 면역성을 발달시키기 위하여, 주기적인 원칙을 두고 개체에 투여될 수 있다. 이 백신은 예를 들어, 개체의 집단에서 유행하는 것으로 알려져 있는 바이러스의 특정 균주에 접하는, 예를 들어 가변항원과 같은 다른 항원을 발현하거나 또는 그러한 다른 항원과 복합된 추가적인 효모 비히클과 함께 동시에 또는 기간적 원칙을 두고 복합될 수 있다. 그러한 가변 항원을 발현하거나 그러한 가변 항원과 복합된 효모 비히클은 주어진 기간 동안 또는 특정 지리학적 영역에 대해 관심있는 병원체 및/또는 가장 유행하는 병원체 균주(들)를 타겟팅하기 위해, 1년에 한 번씩, 또는 임의의 다른 바람직한 원칙에 근거하여 (예컨대, 긴급 또는 예상되는 전염병 또는 유행병, 또는 다른 식의 필요가 있을 때) 순환되거나, 교대되거나, 선택될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예는 여기에서 제공된 개시의 측면에서 명백할 것이다.

상기 기술한 바와 같이, 효모 비히클과의 항원의 발현 또는 회합의 종류의 조작은 집단, 개체, 또는 특정 질환, 용태 또는 병원체의 감염에 대해 백신을 원하는 대로 "맞춤" 또는 "디자인"하기 위해 활용될 수 있는 특정 면역학적 결과를 달성한다. 효모 비히클에 의한 항원의 세포외 발현 또는 제공의 경우, 효모에 의한 항원의 세포내 발현 또는 제공과 비교하여 이 종류의 발현 또는 제공이 특히 체액성 면역성의 유도에 효과적이긴 하나 체액성 및 세포-매개 면역원성 모두가 유도된다. 이는 일차적으로 이러한 구체예에서 항원이 직접적으로 B 세포에 직접적으로 노출되어, B 세포의 활성화, 증식, 성숙 및 항체 생산이 보다 효과적으로 일어나도록 하기 때문이다.

보다 구체적으로, 효모 표면 상에 발현 또는 제공되는 (또는 효모에 의해 분비되는) 항원은 B 세포 (B 림프구)에 의해 발현되는 B 세포 항원 수용체(BCR)에 의해 인식될 수 있다. 이 표면 항원이 BCR에 결합할 때, B 세포는 결합된 항원-발현 효모 비히클을 흡수하고, 항원을 가공하여 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II 수용체와 복합되는 항원의 펩타이드의 형태로 B 세포의 표면에 돌려놓는다. 이러한 MHC-펩타이드 복합체는 특정 MHC-펩타이드 복합체를 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체(TCR)을 갖는 "헬퍼" T 세포(예컨대, CD4⁺ T 세포)에 의해 둘러싸인다. B 세포에 의해 제시된 MHC-펩타이드 복합체를 인식한 활성화된 항원-특이적 T 세포는 이번에는 그러한 B 세포에게 B 세포를 증식시키고 그의 자손을 분화시키고 항체-분비 세포로 성숙시키는 신호의 형태(예컨대, 사이토카인)의 "도움"을 제공한다. 헬퍼 T 세포는 MHC-항원 복합체를 제시하는 그러한 B 세포와의 접촉에 의해서 뿐만 아니라 수지상 세포 및 마크로파지를 포함하는 다른 항원-제시 세포에 의해 제시되는 MHC-펩타이드 복합체와의 접촉에 의해 활성화될 수 있다. 또한, 본 발명의 효모 비히클은 (MHC 클래스 II 경로와 더불어) 수지상 세포와 같은 MHC 클래스 I 경로의 항원 제시 세포에 의해 탐식되어 직접적으로 활성화시키기 때문에, CD4⁺ 세포-매개 반응과 더불어 CD8⁺ 세포-매개 면역 반응 또한 항원의 세포외 발현 또는 제공에 의해 유도될 수 있다. 이러한 방식에서, 체액성 및 세포-매개 면역 반응 모두가 효모에 의한 항원의 세포외 발현 또는 제공에 의해 유도되며, 이러한 종류의 발현은 항원의 세포내 발현 또는 제공에 비해 체액성 면역 반응을 유도하기에 보다 효과적인 것으로 여겨지고 있다. 체액성 면역 반응은 감염성 질환 또는 다른 원치않는 상태의 예방 및 치료를 위해 유용한 중성화 항체의 생산을 포함한다.

체액성 면역 반응을 만드는 B 세포 활성화의 모습은 도 16A 및 16B에서 개략적으로 볼 수 있다. 도 16A을 참고하면, B 세포 활성화의 신호 1에 대해, 항원은 비-효모 기반 백신 또는 가용성 단백질에 의해, 또는 표면에 타겟 항원을 발현, 제시 또는 다른 방식으로 포함하는 효모에 의해 제공될 수 있다. 도 16B를 참고하면, 활성화된 B 세포에 의해 흡수된 항원의 세포내 가공은 항원-특이적 헬퍼 T 세포에 의해 인식되고 활성화되는 MHC 클래스 2 수용체를 통해 나타난다. 활성화된 항원-특이적 T 세포에 의해 전달되는 신호 및 사이토카인은 B 세포 반응을 성숙시키고 항체 생산을 부스팅시킨다. 타겟 항원을 세포내로 발현하는 효모는 이전에서 그리고 앞으로 기술하는 바와 같이, 항원-특이적 헬퍼 T 세포를 활성화시키고 그 수를 증폭시키기에 매우 효과적이다. 항체 생산은 헬퍼 T 세포 활성화 및 증식이 진행되거나 가용성 타겟 항원의 B 세포에의 결합이 수반된 때 보다 효과적으로 유도된다.

항원이 효모 비히클에 의해 세포내로 발현 또는 제공될 때, 세포-매개 면역 반응(CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 반응)은 상기 기술한 바와 같이, 수지상 세포 및 마크로파지와 같은 MHC 클래스 I-제한 및 MHC 클래스 II-제한 경로의 항원-제시 세포를 통해 항원을 제시함으로써 생성된다(예컨대, 미국 특허 5,830,463 및 7,083,787, Stubbs et al ., Nat . Med . 7:625-629 (2001) 및 Lu et al., Cancer Research 64:5084-5088 (2004) 참조). 이러한 메커니즘에 의해 활성화된 T 세포는 예를 들어, 비-효모-기반 백신과 같은 다른 접근법에 의해, 또는 병원체 또는 질환에의 자연적인 노출에 의해, 타겟 항원과 만나는 B 세포에 신호를 전달함으로써 항체 생산에 공헌할 수 있다. 이러한 개념을 증명하는 실험적 결과는 도 14 및 15에서 볼 수 있다.

본 발명이 인플루엔자 백신에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 다양한 측면은 여기에서 기술된 인플루엔자 백신의 구체적인 예를 통해 보다 잘 이해될 수 있을 것이다. 실제, 여기에서 제공된 정보로, 당업자는 여기에서 기술된 본 발명에 다른 효모 비히클에 의한 세포외 및/또는 세포내 항원 발현 또는 제공의 조작, 보전 및 가변 항원(또는 내부 및 외부 항원)의 발현 및 제공의 조작, 및 프라이밍 및 부스팅 방법의 조작을 이용함으로써, 인플루엔자 바이러스에 대해 기술된 백신 전략에 의거하여 다른 병원체 및 타겟 항원이 세포성 단백질인 면역화 프로토콜에 대해 쉽게 추정할 수 있을 것이다.

한 구체예에서, 본 발명은 일반적으로 인플루엔자 바이러스에 대해 동물을 백신화하기 위한, 그리고 동물에서의 인플루엔자 감염을 치료 또는 예방하기 위한 신규 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 동물에서의 인플루엔자 감염에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 선택된 하나 이상의 인플루엔자 항원 및 하나 이상의 효모 비히클을 포함하는 효모-기반 백신 또는 복합 효모-기반 백신의 용도를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 항원의 복합이 다양한 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 상호-보호 및 특정 바이러스 균주에 대한 특이적 보호를 제공하는, 효모-기반 백신에 있어서의 인플루엔자 항원의 복합 사용을 포함한다. 본 발명은 구체적으로 상호-보호성, "범용적" 백신 접근법 단독 또는 바이러스 균주-특이적 항원 접근법을 함께 이용한 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 보호하기 위해 사용하기 위한 신규 효모-기반 백신을 제공한다. 이 접근법은 바람직하게는 상호-보호성 및 바이러스 특이적 방식으로 인플루엔자 바이러스에 대한 세포-매개 및 체액성 면역 반응 모두를 유도할 것이다.

이러한 구체예의 첫번째 측면에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스에 의해 내적으로 발현되는 특정 단백질이 바이러스 균주 중에 높게 보존되어 있다는 점을 이용한다. (여기에서는 일반적으로 내부 바이러스 단백질로서 언급되는) 이들 항원은 상호-보호적이고 바이러스성 단백질 (및 이어서 인플루엔자 바이러스-감염 세포)에 대해 효과적인 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 효모-기반 백신에 대한 근간을 제공한다. 이 구체예의 다른 측면에서 본 발명은 표면 항원에 기초한 세 개의 바이러스성 그룹을 대표하는 세 개의 선택된 바이러스 균주를 전형적으로 포함하는 통상적인 사멸 바이러스 백신에서 행해지고 있는 바와 같이, 인플루엔자 바이러스 균주가 보다 특이적인 바이러스 균주에 대해 숙주를 면역화시키는 효모-기반 백신을 생성하기 위해 사용될 수 있는 (여기에서는 일반적으로 외적 바이러스 단백질로서 언급되는) 표면 단백질의 변이를 발현한다는 점을 추가적으로 이용한다. 그러나, 바이러스에 대한 중성화 항체 반응을 일차적으로 유도하는 통상적인 사멸 바이러스 백신과는 대조적으로, 본 발명의 백신은 이들 바이러스 표면 항원에 대한 세포-매개 및 체액성 면역 반응 모두를 유도할 수 있다. 뿐만 아니라, 바람직한 측면에서 본 발명은 이들 두가지 백신을 복합하여 세포-매개 및 체액성 면역성을 포함한 상호-보호적 및 바이러스 균주-특이적 면역성을 유도하는 강력하고 새로운 인플루엔자 백신을 제공한다.

일반적 기술

본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 당업자에게 잘 알려져 있는 (재조합 기술을 포함한) 분자 생물학, 미생물학, 세포생물학, 생화학, 핵산 화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 그러한 기술은 다음과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다: Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biology and activities of yeasts, Skinner, et al., eds., Academic Press (1980); Methods in yeast genetics : a laboratory course manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology, Pringle et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997); The Yeast Saccharomyces: Gene Expression, Jones et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993); The Yeast Saccharomyces : Genome Dynamics , Protein Synthesis , and Energetics, Broach et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), (여기서는 공동으로 "Sambrook"으로 언급); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2001); PCR : The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow and Lane (1988) Antibodies , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (여기에서는 공동으로 "Harlow and Lane"으로 언급), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000); Casarett and Doull's Toxicology The Basic Science of Poisons, C. Klaassen, ed., 6th edition (2001), 및 Vaccines, S. Plotkin and W. Orenstein, eds., 3^rd edition (1999).

일반적 정의

"체액성 면역 반응(humoral immune response)"은 일반적으로 항체 생산, 및 이에 제한되는 것은 아니나, B 림프구(B 세포) 활성화, 친화성 성숙, 형질세포로의 분화, 및 메모리 B 세포 생성, 배 중심 형성 및 동형 스위칭, 및 T 헬퍼 세포 활성화, 시그날링, 및 사이토카인 생산을 포함하는 항체 생산을 수반하는 모든 과정 및 중화, 정규 보체 활성화 및 옵소닌화를 포함하는 항체의 작동 기능을 말한다.

(여기에서 어디에서든지 용어 "세포성" 면역 반응으로 대체사용될 수 있는) "세포-매개(cell-mediated)" 면역 반응은 일반적으로 T 림프구 (세포독성 T 림프구 (CTL) 포함), 수지상 세포, 마크로파지, 및 자연 살상 세포를 포함한 면역 세포의 항원에 대한 반응, 및 이에 제한되는 것은 아니나, 이들 세포의 활성화 및 증식, CTL 작동 기능, 적응 면역 반응 및 선천 면역 반응에 관련된 다른 세포의 작동에 영향을 미치는 사이토카인의 생산 및 메모리 T 세포 생성을 포함하는 그러한 반응을 수반하는 모든 과정을 말한다.

본 발명에 따르면, 여기에서 효모 비히클과 관련하여 항원의 세포외 제공(또는 세포외 항원의 제공)에 적용되는 용어 "세포외(extracellular)"는, 효모 비히클에 대해 세포외에 (효모 비히클의 표면 또는 외부에) 존재하는 것을 의미하며, 이는 임의의 많은 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 항원 또는 그의 일부가 효모 비히클의 외부 표면(예컨대, 완전한, 손상되지 않은 세포에 대해서는 세포벽, 또는 효모 스페로플라스트, 세포질체 및 껍질에 대해서는 원형질막) 상에 디스플래이되도록(위치하도록, 포함되도록, 정주하도록) 항원이 효모 비히클에 의해 발현된다면 항원은 효모 비히클에 대해 세포외에 존재한다. 일반적으로, 재조합 항원 생산과 관련한, 효모 비히클의 세포 상에서의 또는 효모 비히클의 세포외에서의 "발현"에 대한 언급은 전사로부터 번역, 타겟팅 및 효모 비히클 내에서의 그의 최종 도착지로의 항원의 운반 또는 이동을 통한 항원의 생산의 전 과정을 포함하는 것으로 여겨지나, 항원은 예를 들어, 효모의 ER에서 발현되어 효모의 표면으로 이동할 수 있다. 용어 "발현(expression)"은 용어 "제공(provision)"과 상호교환가능하게 일반적으로 사용될 수 있으며, 가장 일반적으로는 효모 비히클의 표면 상에 항원을 제공하는 임의의 방법을 포함할 수 있다(즉, 다른 방법에 의한 회합이 포함된다). 예를 들어, 항원이 공유 또는 비공유 결합에 의한 것과 같이 항원이 효모의 외부 표면에 결합하는 경우(즉, 효모에 의해 재조합적으로 발현되는 것이 필수적이지 않은 경우) 또한 항원은 효모 비히클에 대해 세포외에 존재한다. 항원은 또한, 항원이 단순히 효모와의 혼합되어 존재(혼합물, 배합된, 조성물)하는 경우에도 효모 비히클에 대하여 세포외에 존재한다. 항원은 또한 항원이 효모에 의해 분비되는 경우에도 효모에 대하여 세포외에 존재한다.

본 발명에 따르면, 효모 비히클과 관련하여 항원의 세포내 제공(또는 세포내 항원의 제공)에 적용되는 용어 "세포내(intracellular)"는 항원이 효모 비히클의 세포내 환경 내에 포함되어 있는 것을 의미하며, 이는 임의의 많은 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 만일 항원이 효모 비히클에 의해 (예컨대 재조합 생산에 의해) 발현되고, 생산된 항원 중 적어도 일부가 효모 내부에 남아 있다면(즉, 효모 비히클의 표면으로 이동 또는 운반되지 않거나, 효모 비히클의 표면으로 아직 운반 또는 이동되지 않았다면), 항원은 효모 비히클에 대해 세포내에 존재한다. 효모 비히클의 세포내 환경은, 이에 제한되는 것은 아니나, 사이토졸, ER, 내막, 및 세포 표면으로 아직 이동하지 못한 분비 소낭을 포함한다. 항원은 또한 만일 항원이 (예컨대, 일렉트로포레이션, 입자 충격(particle bombardment), 미세주입, 리포펙션, 흡수, 감염 및 프로토플라스트 융합을 포함하는 임의의 적합한 이동 방법에 의해) 효모 내로 로딩되는 경우, 항원은 효모 비히클에 대해 또한 세포내에 존재한다.

본 발명에서 용어 "항원(antigen)"의 일반적인 사용은 천연적으로 존재하거나 합성적으로 유도되는 단백질의 일부(펩타이드, 일부 단백질, 전장 단백질), 또는 세포성 조성물 (전체 세포, 세포 용해질 또는 파쇄된 세포), 유기체 (전체 유기체, 용해질 또는 파쇄된 세포) 또는 (암 세포 상에서 발현되는 것과 같은) 탄화수소 또는 기타 분자 또는 이의 일부를 의미한다. 상기 항원은 항원이 투여되는 개체의 세포 및 조직 내에서 접하는 동일하거나 유사한 항원에 대한 항원 특이적 면역 반응 (예컨대 체액성 및/또는 세포성 면역 반응)을 유도한다. 다르게는, 항원은 용인제(toleragen)로서 작용한다.

면역 반응의 자극을 언급할 때, 용어 "항원"은 용어 "면역원"과 상호 교환적으로 이용될 수 있다. 여기에서 사용된 면역원은 동물에게 (예를 들면, 본 발명의 백신을 통하여) 면역원을 투여하는 것이 동물의 조직 내에서 접하는 동일하거나 유사한 항원에 대한 항원-특이적인 면역 반응을 끌어올리도록 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발하는(즉, 항원성인) 항원을 말한다.

"용인제(toleragen)"는 항원에 대한 감소 또는 변화된 면역 반응이 있도록, 바람직하게는 용인제 또는 그러한 용인제를 발현하거나 제시하는 세포와의 접촉에 대응하여 면역계 세포의 실질적인 비-대응, 면역성 결여(anergy), 다른 불활성화 또는 결실이 있도록 하는 투여의 형태, 양 또는 경로로 제공되는 항원을 기술하기 위해 사용된다.

"백신화 항원(vaccinating antigen)"은 면역원 또는 용인제일 수 있지만, 생물학적 반응 (면역 반응의 유발, 용인)이 백신화 항원에 대하여 유발되는 백신에서 이용되는 항원이다.

주어진 항원의 "면역원성 도메인"은 동물에게 투여되었을 때 면역원으로서 작용하는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 항원의 임의의 일부분, 단편 또는 에피토프(즉, 펩타이드 절편 또는 서브유니트 또는 항체 에피토프 또는 기타 구조형(conformational) 에피토프)일 수 있다. 예를 들어 단일 단백질은 다수의 상이한 면역원성 도메인을 포함할 수 있다. 면역원성 도메인은 체액성 반응의 경우에는 단백질 내에서 선형 서열일 필요는 없다.

에피토프는 면역 반응을 유도하기에 충분한 주어진 항원 내의 단일 면역원성 부위(immunogenic site) 또는 면역 반응을 억제, 결실 또는 불활성화하기에 충분한 주어진 항원 내의 단일 용인제성 부위(toleragenic site)로 정의된다. 당업자는 T 세포 에피토프가 B 세포 에피토프와는 크기 및 조성에서 상이하고, 클래스 I MHC 경로를 통하여 제시되는 에피토프는 클래스 II MHC 경로를 통하여 제시되는 에피토프와 다르다는 것을 인식할 것이다. 에피토프는 선형 서열 또는 구조형 에피토프 (보존된 결합 영역)일 수 있다. 항원은 단일 에피토프 만큼 작거나 그 보다 클 수 있으며, 다수의 에피토프를 포함할 수 있다. 항원의 크기는 약 5-12 아미노산 (예컨대, 펩타이드) 만큼 작거나, 다량체 및 융합 단백질, 키메라 단백질, 전체 세포, 전체 미생물 또는 이의 일부 (예컨대, 전체 세포의 용해질 또는 미생물의 추출물)를 포함하는 전장 단백질만큼 클 수도 있다. 또한, 항원은 탄수화물을 포함할 수 있으며, 이는 효모 비히클 또는 본 발명의 조성물에 로딩될 수 있다. 일부 구체예에서, (즉, 항원이 재조합 핵산 분자로부터 효모 비히클에 의해 발현될 때) 항원은 완전한 세포 또는 미생물이기 보다는 단백질, 융합 단백질, 키메라 단백질 또는 이의 단편이다. 본 발명의 바람직한 인플루엔자 융합 단백질이 여기서 설명된다.

"백신화(vaccination)" 또는 "면역화(immunization)"는 단독으로 또는 애주번트와 함께 항원을 투여한 결과로서 항원 또는 이의 면역원성 또는 이의 용인제성 부분에 대한 면역반응의 유발(유도)를 말한다. 백신화는 바람직하게는 보호 또는 치료 효과로 이어지고, 상기 항원 (또는 상기 항원의 근원)에 대한 뒤이은 노출은 동물에서 질환 또는 용태를 감소 또는 예방하는 상기 항원 (또는 상기 항원의 근원)에 대한 면역 반응을 유발한다. 백신화의 개념은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 조성물(백신)을 투여함으로써 유발되는 면역 반응은 본 조성물의 투여가 부재한 경우와 비교하였을 때 면역 반응(예컨대, 세포성 반응, 체액성 반응, 사이토카인 생산)의 일면에서의 탐지 가능한 변화일 수 있다.

타모젠(Tarmogen)(targeted molecular antigen)은 일반적으로 하나 이상의 이종성 항원을 세포외로(그의 표면 상에), 세포내로(내적으로 또는 사이토졸로) 또는 세포외 및 세포내 모두로 발현하는 효모 비히클을 말한다. 타모젠은 당업계에서 일반적으로 기술되고 있다. 예컨대, 미국 특허 5,830,463 참조.

본 발명의 한 구체예에서, 본 발명에서 기술된 임의의 아미노산 서열은 특정된 아미노산 서열의 C- 및/또는 N-말단 각각의 측면에 적어도 하나 내지 적어도 약 20개까지의 추가 이종성 아미노산 서열이 위치하도록 제조될 수 있다. 이렇게 형성된 단백질 또는 폴리펩타이드는 특정한 아미노산 서열로 "필수적으로 이루어진"이라고 기술될 수 있다. 상술된 바와 같이, 본 발명에서 상기 이종성 아미노산 서열은 특정한 아미노산 서열의 측면에 천연적으로 위치하지 않거나(즉, 천연 생체 내에서 발견되지 않는), 특정한 아미노산 서열의 기능과 관련이 없거나, 천연적으로 발생하는 서열에서 그러한 뉴클레오타이드가 주어진 아미노산 서열이 유래되는 유기체의 표준 코돈 이용(usage)을 사용하여 해독되었다면 유전자에서 발생함에 따라 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 천연적으로 발생하는 핵산 서열 측면에 위치하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는 아미노산 서열이다. 유사하게, "필수적으로 이루어진"이라는 문구가 본 발명에서 핵산 서열과 관련되어서 사용되면 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 5'- 및/또는 3'- 말단 각각에 적어도 하나 내지 약 60개까지 추가 이종성 뉴클레오타이드가 측면에 위치하는 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 이종성 뉴클레오타이드는 천연 유전자에서 발생함에 따라 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 측면에 천연적으로 위치하지 않거나 (즉, 천연 생체 내에서 발견되지 않는) 단백질에 어떠한 추가 기능을 부여하거나 특정한 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능을 변화시키는 단백질을 코딩하지 않는다.

본 발명에서 "이종성 아미노산"은 특정한 아미노산 서열의 측면에 천연적으로 위치하지 않거나 (즉, 생체 내에서 천연적으로 존재하지 않는), 특정한 아미노산 서열의 기능과 관련이 없거나, 천연적으로 발생하는 서열의 뉴클레오타이드가 주어진 아미노산 서열이 유래되는 유기체의 표준 코돈 이용(usage)을 사용하여 해독되었다면 유전자에서 발생함에 따라 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 천연적으로 발생하는 핵산 서열 측면에 위치하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는 아미노산 서열이다. 따라서, 인플루엔자 항원에 이종성인 적어도 두 개의 아미노산 잔기는 인플루엔자 항원의 측면에서 천연적으로 발견되지 않는 두 개의 아미노산 잔기이다.

본 발명에서, 본 발명의 효모 비히클과 관련하여 이종성 융합 단백질을 포함하는 "이종성" 단백질 또는 "이종성" 항원에 대한 언급은, 융합 단백질이 효모에 의해 자연적으로 발현된(예컨대, 여기에서 기술된 바와 같은 Aga 단백질) 효모 서열 또는 단백질 또는 그의 일부분을 포함할 수 있긴 하나, 단백질 또는 항원이 효모에 의해 자연적으로 발현된 것이 아닌 것을 의미한다. 예를 들어, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 및 효모 Aga 단백질의 융합 단백질은 효모에 의해 자연적으로 발현된 것이 아니므로, 본 발명의 목적을 위한 효모 비히클과 관련하여 이종성 단백질로 고려된다.

본 발명에서 문구 "선택적으로 결합한다"는 것은 특정한 단백질에 선호하여 결합하는 본 발명의 항체, 항원-결합 단편 또는 결합 파트너의 능력을 의미한다. 보다 구체적으로 용어 "선택적으로 결합한다"는 것은 한 단백질의 다른 단백질에의(예컨대, 항원에 항체, 이의 단편 또는 결합 파트너) 특정한 결합을 의미하는 것으로, 임의의 표준 분석법 (예컨대, 면역 분석법)에 의해 측정된다면 결합의 정도는 분석법에서 백그라운드 대조군보다 통계적으로 상당히 높다. 예를 들어 면역 분석법을 실시할 경우에 대조군은 일반적으로 항체 또는 항원 결합 단편만을 함유하는 (즉, 항원이 부재하는) 반응 웰/튜브를 포함하고, 항원의 부재에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의한 반응성의 양 (예컨대,웰에 대한 비특이적 결합)이 백그라운드로서 간주된다. 결합은 효소 면역 분석법 (예컨대, ELISA), 이뮤노블롯 분석법 등을 포함하여 당업계에 표준적인 다양한 방법을 사용하여 측정될 수 있다.

"개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 포유동물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 가축, 경기용 동물, 애완동물, 영장류, 마우스 및 랫트를 포함한다. 용어 "개체"는 용어 "동물", "대상" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 단리된 단백질 또는 폴리펩타이드는 전장 단백질, 융합 단백질 또는 그러한 단백질의 단편, 도메인, 구조형 에피토프 또는 상동체를 포함한다. 보다 자세하게 본 발명에 따른 분리된 단백질은 그의 천연 환경으로부터 분리된 (즉, 인간의 조작이 가해진) (폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함한) 단백질이며, 예를 들면 정제 단백질, 부분적으로 정제된 단백질, 재조합으로 제조된 단백질, 합성하여 제조된 단백질을 포함할 수 있다. 그에 따라 "단리된"이란 단백질이 분리된 정도까지 반영하지는 않는다. 바람직하게는 본 발명의 단리된 단백질은 재조합으로 생산된다. 본 발명에서 용어 "변형" 및 "돌연변이"는 본 발명에 언급된 단백질 또는 이의 일부의 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 대한 변형/돌연변이의 경우에는상호 교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "상동체"는 천연적으로 존재하는 단백질 또는 펩타이드에 대한 미미한 변형 또는 돌연변이에 의해 상기 천연적으로 존재하는 단백질 또는 펩타이드(즉, "프로토타입"또는 "야생형" 단백질")와 상이하지만, 천연적으로 존재하는 형태의 측쇄(side chain) 구조와 전반적인 기본 단백질 구조를 유지하는 단백질 또는 펩타이드를 언급하는데 이용된다. 그러한 변화는 이에 제한되는 것은 아니지만, 하나 또는 몇 개 아미노산 측쇄에서 변화; 결실(예를 들면 단백질 또는 펩타이드의 절단된 형태), 삽입 및/또는 치환을 포함한 하나 또는 몇 개 아미노산의 변화; 하나 또는 몇 개 원소의 입체화학에서의 변화; 및/또는 이에 제한되는 것은 아니지만, 메틸화, 당쇄화, 인산화, 아세틸화, 미리스틸화, 프레닐화, 팔미토일화, 아미드화 및/또는 글리코실포스파티딜 이노시톨의 첨가를 포함한 미미한 파생화를 포함한다. 상동체는 천연적으로 존재하는 단백질 또는 펩타이드와 비교하였을 때 증진된, 감소된 또는 실질적으로 유사한 성질을 가진다. 상동체는 단백질의 작용제 또는 단백질의 길항제를 포함할 수 있다. 상동체는 단리된 천연적으로 존재하는 단백질에 대한 직접적인 변형, 단백질의 직접 합성 또는 예를 들면 무작위적이거나 표적화된 돌연변이를 일으키기 위한 전통적 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 대한 변형을 포함하여 단백질의 제조를 위해 당업계에 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다.

주어진 단백질의 상동체는 참조 단백질의 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한, 또는 적어도 약 96% 동일한, 또는 적어도 약 97% 동일한, 또는 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 (또는 전체 정수의 증가에 따른 45% 내지 99% 내의 임의의 %) 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 필수적으로 구성되거나, 구성될 수 있다. 한 구체예에서, 상동체는, 참조 단백질의 자연적으로 발생한 아미노산 서열에 대하여, 100% 미만 동일한, 약 99% 미만 동일한, 약 98% 미만 동일한, 약 97% 미만 동일한, 약 96 미만 동일한, 약 95 미만 동일한, 등등, 1%씩, 약 70% 미만까지 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 필수적으로 구성되거나, 구성될 수 있다.

여기에서 사용된 바와 같이, 달리 특정하지 않는다면, 퍼센트(%) 상동성에 대한 언급은 표준 디폴트 파라미터로 아미노산 조사를 위해 blastp을 이용하고 핵산 조사를 위해 blastn을 이용하는 (1) BLAST 2.0 Basic BLAST 상동성 조사(여기에서 쿼리 서열은 디폴트에 의해 낮은 복잡성 영역에 대해 필터링된다)(여기에서 그 전체로서 참조로 포함되는 Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에서 기술됨); (2) (하기 기술된 파라미터를 이용하는) BLAST 2 alignment ; (3) 및/또는 표준 디폴트 파라미터로의 PSI-BLAST (Position-Specific Iterated BLAST를이용하여 수행되는 상동성 평가를 말한다. BLAST 2.0 Basic BLAST 및 BLAST 2 간의 표준 파라미터에는 일부 차이가 존재하기 때문에, 두 개의 특이적 서열이 BLAST 2 프로그램을 이용하여 유의한 상동성을 갖는 것으로 인식되는 반면 쿼리 서열로서 상기 서열 중 하나를 이용하는 BLAST 2.0 Basic BLAST에서 수행된 조사는 탑 매치에서 두번째 서열을 동정할 수 없을 수 있음을 알아야 한다. 또한, PSI-BLAST는 자동화된, 서열 상동체를 찾기 민감한 손쉬운 버전인 "프로파일" 조사를 제공한다. 상기 프로그램은 처음에는 틈이 많은 BLAST 데이터베이스 조사를 수행한다. PSI-BLAST 프로그램은 데이터 베이스 조사의 다음 단계를 위해 쿼리 서열을 교체하는, 구성물 위치-특이적 스코어 매트릭스로 되돌리는 임의의 유의한 배열로부터의 정보를 이용한다. 그러므로, 이러한 프로그램 중 임의의 하나를 이용하여 퍼센트 상동성을 결정할 수 있음을 이해할 것이다.

여기에 참조로서 그의 전체가 포함되는 Tatusova 및 Madden, (1999), "Blast 2 서열s - new tool for comparing proteins and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250에서 기술된 바와 같이, 두 개의 특이적 서열은 BLAST 2 sequence를 이용하여 하나에 대해 다른 하나가 배열될 수 있다. BLAST 2 서열 배열은 BLAST 2.0 알고리즘을 이용하는 blastp 또는 blastn에서 수행하여 얻어진 배열에서 갭의 도입(결실 및 삽입)을 허용하는 두 서열 간의 Gapped BLAST search (BLAST 2.0)를 수행할 수 있다. 여기에서는 명료함의 목적으로, BLAST 2 서열 배열을 다음과 같은 표준 디폴트 파라미터를 이용하여 수행한다.

blastn에 대해서는, 0 BLOSUM62 매트릭스를 이용:

Reward for match = 1

Penalty for mismatch = -2

Open gap (5) and extension gap (2) penalties

gap x_dropoff (50) expect (10) word size (11) filter (on)

blastp에 대해서는, 0 BLOSUM62 매트릭스를 이용:

Open gap (11) and extension gap (1) penalties

gap x_dropoff (50) expect (10) word size (3) filter (on).

단리된 핵산 분자는 이의 천연 환경 즉, 상기 핵산 분자가 천연에서 위치하는 게놈 또는 염색체인 그것의 천연 환경으로부터 분리된 (즉, 인간의 조작이 가해진) 핵산 분자이다. 이에 "단리된"은 핵산 분자가 정제된 정도를 필수적으로 반영하지는 않지만, 상기 분자는 상기 분자가 천연적으로 존재하는 전체 게놈 또는 전체 염색체를 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 단리된 핵산 분자는 유전자를 포함할 수 있다. 유전자를 포함하는 단리된 핵산 분자는 그 유전자를 포함하는 염색체의 단편이 아니라 동일한 염색체에 천연적으로 존재하는 추가 유전자 없이 상기 유전자와 관련된 코딩 영역과 조절 영역을 포함한다. 단리된 핵산 분자는 천연에서 특정된 핵산 서열의 측면에 정상적으로 위치하는 않는 (즉, 이형성의 서열) 추가 핵산이 측면 (즉, 서열의 5'및/또는 3'의 말단)에 위치하는 특정한 핵산 서열을 또한 포함할 수 있다. 단리된 핵산 분자는 DNA, RNA(예컨대, mRNA), 또는 DNA 또는 RNA 중 어느 하나의 유도체(예컨대, cDNA)를 포함할 수 있다. "핵산 분자"는 일차적으로 물리적인 핵산 분자를 의미하는 것이고 "핵산 서열"은 일차적으로 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것이지만, 상기 두 문구는 특히 단백질 또는 단백질의 도메인을 코딩할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열이라는 관점에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

재조합 핵산 분자는 형질감염될 세포내에서 하나 이상의 융합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자의 발현을 효과적으로 조절할 수 있는 적어도 하나의 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된 상기 핵산 분자를 포함할 수 있는 분자이다. "핵산 분자"는 일차적으로 물리적인 핵산 분자를 의미하는 것이고 "핵산 서열"은 일차적으로 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것이지만, 상기 두 문구는 특히 단백질을 코딩할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열이라는 관점에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한 본 발명에서 용어 "재조합 분자"는 일차적으로 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 의미하는 것이지만, 동물에게 투여되는 용어 "핵산 분자"와 상호교환적으로 이용될 수 있다.

재조합 핵산 분자는 상기 재조합 벡터는 융합 단백질의 재조합적 생산을 가능하게 하고, 본 발명에 따라 핵산 분자의 숙주 세포 내로의 운반을 가능하게 하는, 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 작동가능하게 연결된, 임의의 핵산 서열, 일반적으로 이종성 서열인 재조합 벡터를 포함한다. 그러한 백터는 벡터 내로 삽입될 단리된 핵산 분자에 인접한 자연적으로는 발견되지 않는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 RNA 또는 DNA, 원핵 세포성 또는 진핵 세포성일 수 있으며, 본 발명에서 바람직하게는 바이러스 또는 플라스미드이다. 재조합 벡터는 핵산 분자의 클로닝, 시퀀싱, 및/또는 다른 방식으로의 조작에서 사용될 수 있으며, (예컨대, DNA 백신 또는 바이러스 벡터-기반 백신에서와 같이) 그러한 분자들의 운반에서 사용될 수 있다. 재조합 벡터는 바람직하게는 핵산의 발현에서 사용되며, 또한 발현 벡터로서 언급될 수 있다. 바람직한 재조합 벡터는 형질전환된 숙주 세포에서 발현되는 것이 가능하다.

본 발명의 재조합 분자에서, 핵산 분자는 전사 조절 서열, 번역 조절 서열, 복제 기점 및 숙주세포와 양립할 수 있고 본 발명의 핵산 분자의 발현을 조절하는 다른 조절 서열과 같은 조절 서열을 포함하는 발현 벡터에 작동가능하게 연결된다. 특히, 본 발명의 재조합 분자는 하나 이상의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함한다. 문구 "작동가능하게 연결된"은 숙주 세포 내로 형질감염될 때(즉, 형질전환, 형질유도 또는 형질감염될 때) 분자가 발현되도록 하는 방식으로 조절 서열을 발현시키는 핵산 분자를 연결하는 것을 말한다.

본 발명에서 용어 "형질감염"은 외인성 핵산 분자 (즉, 재조합 핵산 분자)를 세포내로 삽입할 수 있는 임의의 방법을 의미한다. 용어 "형질전환"은 이 용어가 핵산 분자를 조류, 박테리아 및 효모와 같은 미생물 또는 식물 세포로 도입하는데 이용할 경우 용어 "형질감염"과 상호교환적으로 이용될 수 있다. 미생물 시스템에서 용어 "형질전환"은 미생물 또는 식물에 의한 외인성 유전자의 습득으로 인한 유전되는 변화를 설명하는데 이용되며 "형질감염"과 본질적으로 같은 의미이다. 따라서, 형질감염 기술은 이에 제한되는 것은 아니지만, 형질전환, 세포의 화학적 처리, 입자 사격(particle bombardment), 전기천공, 미세주입, 리포펙션(lipofection), 흡수, 감염 및 원형질체 융합을 포함한다.

본 발명의 백신 및 조성물

본 발명의 구체예들은 항원 또는 항원들에 대한 세포-매개 및/또는 체액성 면역 반응을 유도하는, 그리고 바람직한 구체예에서는 (병원체에 의한 감염을 포함하는) 질환 또는 용태로부터 동물을 보호하거나 질환 또는 용태로부터 생기는 하나 이상의 증상을 완화하는 방법에서 사용될 수 있는 조성물(백신)에 관한 것이다. 상기 조성물은 일반적으로: (a) 효모 비히클; 및 (b) 효모 비히클에 의해 발현되거나, 회합되거나 복합된 이종성 항원을 포함한다. 다른 조성물은 DNA 백신, 단백질 서브유닛 백신, 또는 사멸 또는 불활성화 병원체과 같은 또다른 백신 조성물의 형태로 제공되는 이종성 항원과 복합된 효모 비히클을 포함할 수 있다. 효모 비히클이 하나 이상의 항원을 발현할 때, 항원은 세포내, 세포외, 또는 둘 다로, 임의의 복합으로 발현 또는 제공된다. 특정 구체예에서, 항원은 효모 비히클 내에서 이종성 단백질의 발현을 안정화시키도록, 발현된 이종성 단백질의 번역 후 변형을 막을 수 있도록, 일부 구체예에서는 (효모 비히클의 표면으로 이동되는 것을 포함하여) 효모 비히클의 표면 상에 융합 단백질이 발현되도록 디자인된 융합 단백질로서 제공된다. 융합 단백질은 또한 넓은 세포-매개 면역 반응을, 일부 구체예에서는 체액성 면역 반응을 제공하며, 바람직하게는 하나 이상의 상이한 항원을 발현하거고/거나 상이한 항원(들)을 발현하는 다른 효모 비히클과 복합된다. 하나 이상의 그러한 융합 단백질이 효모 비히클 내로 로딩되거나(예컨대 단백질로서) 또는 본 발명의 백신을 형성하기 위해 여기에서 기술된 바와 같이 효모 비히클과 다른 방식으로 복합되거나 혼합될 수 있는 것이 본 발명의 한 구체예임에도 불구하고, 이들 융합 단백질은 효모 비히클에 의해(예컨대, 효모 세포질체, 효모 고스트, 또는 효모 막 또는 세포벽 추출물 또는 분획 또는 그의 입자로 선택적으로 추가 가공될 수 있는, 비손상 효모 또는 효모 스페로플라스트에 의해) 재조합 단백질로서 가장 일반적으로 발현된다.

효모 비히클

본 발명의 조성물(예컨대, 백신)에서, 효모 비히클과 관련하여 다음 측면이 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따르면, 효모 비히클은 본 발명의 백신 또는 치료 조성물에서 하나 이상의 항원과 접합함으로서 또는 애주번트(adjuvant)로서 사용될 수 있는 효모 세포 (예컨대, 전체 또는 비손상 세포) 또는 (후술하는) 이들의 유도체이다. 따라서 효모 비히클은 살아있는 비손상 효모 미생물 (즉, 세포벽을 포함한 모든 성분을 가진 효모 세포), 사멸된 (죽은) 비손상 효모 미생물 또는 효모 스페로플라스트 (즉, 세포벽이 결핍된 효모 세포), 효모 사이토플라스트(즉, 세포벽과 핵이 결핍된 효모 세포), 세포 고스트(즉, 세포벽, 핵 및 사이토플라즘이 결핍된 세포) 또는 (효모 막 입자 및 앞서 아세포 효모 입자로서 언급된) 아세포 효모 막 추출물 또는 이의 분획물을 포함한 효모 미생물의 유도체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

효모 스페로플라스트는 통상적으로 효모 세포벽의 효소 분해에 의해 생된다. 그러한 방법은 예를 들면 Franzusoff et al.1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674에 설명되어 있고, 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다.

효모 사이토플라스트는 일반적으로 효모 세포의 탈핵화에 의해 생산된다. 그러한 방법은 예를 들면, Coon, 1978, Natl. Cancer Inst. Monogr.48, 45-55에 설명되어 있고, 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다.

효모 고스트는 일반적으로 투과화되거나 용해된(lysed) 세포를 재봉합하여 생산될 수 있으며, 필수적이지 않지만, 상기 세포의 적어도 일부 세포기관(organelle)을 포함할 수 있다. 그러한 방법은 예를 들면, Franzusoff et al. 1983, J.Biol. Chem., 258,3608-3614 및 Bussey et al. 1979, Biochem. Biophys. Acta 553, 185-196에 기술되어 있으며, 각각 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다.

효모 막 입자(아세포 효모 막 추출물 또는 이의 분획물)은 천연 핵 또는 사이토플라즘(cytoplasm)이 결핍된 효모 막을 의미한다. 상기 입자는 당업계에 알려진 초음파 처리 또는 다른 막 분쇄 방법과 이어지는 재봉합에 의해 생산되는 천연의 효모 막 크기부터 마이크로입자까지를 포함하는 임의의 크기일 수 있다. 아세포 효모 막 추출물을 생산하는 방법은 예를 들면, Franzusoff et al. 1991, Meth.Enzymol. 194, 662-674에 기술되어 있다. 항원이 효모 막 입자의 생성 이전에 효모에 의해 항원이 재조합으로 발현된 경우에는 효모 막 일부분 및 상기 항원을 포함하는 효모 막 추출물의 분획물을 또한 이용할 수 있다. 항원은 막 내부로, 막의 어느 한 막 또는 그들의 조합 상에 운반될 수 있다(즉, 항원은 막의 내외부 양쪽에 있을 수 있으며/거나, 효모 막 입자의 막을 연결할 수 있다). 한 구체예에서는, 효모 막 입자는 막의 표면 상에 또는 상기 막 내에 부분적으로 함몰된 적어도 하나의 원하는 항원을 구비함과 아울러서 온전하거나, 손상되거나, 손상되어 재봉합된 효모 막인 재조합된 효모 막 입자이다.

효모 세포벽 제제(yeast cell wall preparation)의 한 예는 동물에 투여되는 경우에, 효모 세포벽 제제가 감염원에 대해 원하는(예컨대, 보호성의) 면역 반응을 촉진하도록 세포벽의 표면 상에 항원을 운반하거나 세포벽 내에 적어도 부분적으로 함몰된 고립 효모 세포벽들이다.

임의의 효모 균주가 본 발명의 효모 비히클을 생산하는데 이용될 수 있다. 효모는 단일세포성(unicellular) 미생물로서 다음 3개의 부류 중 어느 하나에 속한다: 자낭균(Ascomycete), 담지균류(Basidiomycete) 및 불완전 균류(Fungi Imperfecti). 면역 조절자(modulator)로서 이용을 위한 효모의 타입을 선택하는데 고려되는 주요한 사항은 효모의 병원성이다. 한 구체예에서는, 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 비병원성 균주이다. 비병원성 효모 균주의 선택은 효모 비히클이 투여되는 개체에 미치는 부작용을 최소화하기 위해 이루어질 수 있다. 그러나, 효모의 병원성이 당업자에게 공지된 임의의 수단들(예컨대, 돌연변이 균주)에 의해 부정될 경우에,병원성 효모가 이용될 수 있다.병원성 효모 균주 또는 이의 비병원성 돌연변이체가 이전에 애주번트(adjuvant)로서 또는 생물학적 반응 조정자로서 사용되었고, 본 발명에서도 사용될 수 있으나, 비병원성 효모 균주가 바람직하다.

한 구체예에서는 바람직한 효모 균주 속(genera)에는 사카로마이세스(Saccharomyces), (병원성일 수도 있는) 칸디다(Candida), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 한세눌라(Hansenula), 클루베로마이세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 로도토룰라(Rhodotorula), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 및 야로위아(Yarrowia ) 등이 포함되며, 사카로마이세스, 칸디다, 한세눌라, 피치아 및 스키조사카로마이세스가 보다 바람직하고 사카로마이세스가 더욱 바람직하다. 바람직한 효모 균주 종(species)에는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 칼스버젠시스(Saccharomyces carlsbergensis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 케피르(Candida kefyr), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 크립토코쿠스 라우렌티(Cryptococcus laurentii), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 한세눌라 아노말라(Hansenula anomala), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis),클루베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루베로마이세스 마르크시아누스 바르 락티스(Kluyveromyces marxianus var. lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 로도토룰라 루브라(Rhodotorula rubra), 스키로사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 등을 포함한다. 다양한 이와 같은 종들이 아종(subspecies), 형, 아형(subtype) 등을 포함한다는 것이 자명하며, 그들은 모두 상술한 종 내에 포함된다. 보다 바람직한 효모 종은 S. 세레비지애, C. 알비칸스, H. 폴리모르파, P. 파스토리스 및 S. 폼베를 포함한다. S. 세레비지애는 상대적으로 다루기 용이하고 식품 첨가제로서 이용되는 "Generally Recognized As Safe" 또는 "GRAS"이므로 특히 바람직하다(GRAS, FDA 제안된 Rule 62FR18938, 1997.04. 17). 본 발명의 한 구체예는 S 세레비지애 cir° 균주와 같이 플라스미드를 더욱 높은 카피수(copy number)로 복제할 수 있는 효모 균주이다. S. 세레비지애 균주는 하나 이상의 항원 또는 항원 융합 단백질이 고 레벨에서 발현되는데 기여하는 발현 벡터을 지원할 수 있는 그러한 균주이다. 이에 더하여, 예컨대 N-링크된 당화(glycosylation)를 연장하는 효소들 내의 돌연변이와 같은 발현된 표적 항원에 대한 감소된 번역후 수정을 나타내는 균주들을 포함하는 임의의 돌연변이 효모 균주가 본 발명에서 사용될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 바람직한 효모 비히클은 수지상 세포 또는 대식세포와 같이 효모 비히클과 항원이 전달되는 세포 유형과 융합할 수 있는 것으로, 이에 의하여 효모 비히클을, 많은 구체예에서는 항원을 상기 세포 유형으로 더욱 효과적으로 전달할 수 있다. 본 발명에서 효모 비히클과 표적 세포 유형의 융합은 효모 세포 막 또는 이의 입자가 표적 세포 유형(예컨대, 수지상 세포 또는 대식세포)의 막과 융합하여 합포체(syncytium)를 형성하는 능력을 의미한다. 본 발명에서 합포체는 세포의 통합에 의해 생산된 다핵의 프로토플라즘(protoplasm) 덩어리를 말한다. (HIV, 인플루엔자 바이러스, 폴리오바이러스 및 아데노바이러스와 같은 면역 결핍 바이러스의 표면 단백질을 포함한) 수많은 바이러스의 표면 단백질 및 (난자와 정자 간의 융합에 관여하는 것과 같은) 다른 융합제(fusogen)가 두 막 간의 (즉, 바이러스와 포유동물의 세포 막 간 또는 포유동물의 세포 막 간) 융합을 효율적으로 만들 수 있다. 예를 들면, 표면에 HIV gp120/gp41이라는 이종성의 항원을 생산하는 효모 비히클은 CD4+ T-림프구와 융합할 수 있다. 그러나 효모 비히클로의 타겟팅 부위의 통합은 일부 상황에서는 바람직할 수 있지만, 필수적이지 않다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 효모 비히클이 수지상 세포 (뿐만 아니라 대식세포와 같은 다른 세포)에 의해 용이하게 획득되는 것을 보여주었다.

효모 비히클을 생산하고, 효모 비히클과 항원을 발현하고, 결합하고, 회합하는 방법들은 아래에 서술하도록 한다.

항원

본 발명에 사용되도록 의도된 항원은 면역 반응을 유도시키는데 요구되는 모든 항원이다. 예를 들어, 항원은 병원체와 관련된 모든 항원을 포함할 수 있으며, 바이러스성 항원, 균류 항원, 박테리아 항원, 기생충 항원, 기생체 항원, 체외 기생체 항원, 원생동물체(protozoan) 항원, 또는 모든 다른 감염체로부터 기인되는 항원을 포함할 수 있으나, 상술한 것들에 제한되지 않는다. 또한, 항원은 특이 질환 또는 용태과 관련된 모든 항원, 병원체 또는 세포 소스(source)로부터 유발되는 항원, 암 항원, 자기면역질환과 관련된 항원(예를 들면, 당뇨병 항원(diabetes antigens)), 알레르기 항원(allergens), 하나 이상의 변이된 아미노산을 품는 포유류의 세포 분자들, 포유류의 세포들에 의해 사전 생산(pre-natally) 또는 새로이 생산(neo-natally)되도록 일반적으로 발현되는 단백질, 전염병 원인체(epidemiologic agent; 예컨대, 바이러스)의 유착을 통해 유도되어 발현되는 단백질, 유전자 교대에 의해 유도되어 발현되는 단백질, 및 조절 시퀀스들(regulatory sequences)의 돌연변이에 의해 유도되어 발현되는 단백질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 항원은 본래의 항원 또는 어떤 방법에 의해 조작되어 유전공학적으로 형성된 항원들(예를 들어, 시퀀스(sequence) 변화 또는 융합 단백질(fusion protein)의 생성일 수 있다. 어떤 구체예에서는(즉, 항원이 재조합된 핵산 분자로부터 효모 비히클(vehicle)에 의해 발현된 경우), 항원이 전부 세포 또는 미생물이라기보다는 단백질 또는 그에 관한 면역원 도메인(domain; 영역)의 모든 에피토프(epitope), 융합 단백질, 또는 키메라(chimeric) 단백질로 인식될 수 있을 것이다.

본 발명의 조성물들(백신들)에서 포함하는 다른 바람직한 항원은 원치 않거나, 해로운 반응 또는 면역 반응, 예를 들어, 알레르기 항원, 자기면역 항원, 염증제, GVHD에 수반되는 항원, 임의의 암들, 패혈 쇼크 항원, 및 이식거부에 수반되는 항원에 의해 유발되는 반응을 억제할 수 있는 항원들을 포함한다. 그러한 화합물은 바람직하게는 세포 매개 및/또는 체액성 면역을 증강하거나 억제시키는 생물학적 반응 조정제와 복합되어, 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 항히스타민제, 사이클로스포린(cyclosporin), 코르티코스테로이드(corticosteroids), FK506, 해로운 면역 반응의 생성에 관련된 T 세포 수용체들에 상응하는 펩타이드, Fas 리간드(즉, 세포 Fas 수용체들의 세포외 또는 세포질 도메인에 결합하여 세포자멸사를 유도하는 화합물들), 용인화(tolerization) 또는 무반응(anergy)에 영향을 미치는 방식으로 제시되는 적절한 MHC 복합체들, T 세포 수용체들, 및 자기면역 항원을 포함한다.

본 발명에서 유용한 종양 항원(암 항원)은 종양 세포로부터의 단백질, 당단백질 또는 표면 탄수화물과 같은 종양 항원, 종양 항원으로부터의 에피토프(epitope), 전체 종양 세포, 종양 세포들의 혼합물, 및 그들의 일부들(예컨대, 세포의 용해물)을 포함할 수 있다.

한 측면에서, 항원은 아데노 바이러스(adenoviruses), 아레나 바이러스(arena viruses), 분야바이러스(bunyaviruses), 코로나바이러스(coronaviruses), 콕삭키 바이러스(coxsackie viruses), 사이토메갈로 바이러스(cytomegaloviruses), 엡스타인바 바이러스(Epstein-Barr viruses), 플라비바이러스(flaviviruses), 헤파드나바이러스(hepadnaviruses), 간염 바이러스(hepatitis viruses), 헤르페스 바이러스(herpes viruses), 인플루엔자 바이러스(influenza viruses), 렌티바이러스(lentiviruses), 홍역 바이러스(measles viruses), 멈프스 바이러스(mumps viruses), 믹소바이러스(myxoviruses), 종양 바이러스(oncogenic viruses), 오소믹소바이러스(orthomyxoviruses), 유두종 바이러스(papilloma viruses), 파포바바이러스(papovaviruses), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza viruses), 파라믹소바이러스(paramyxoviruses), 파르보바이러스(parvoviruses), 피코나바이러스(picornaviruses), 폭스 바이러스(pox viruses), 광견병 바이러스(rabies viruses), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial viruses), 레오바이러스(reoviruses), 랍도바이러스(rhabdoviruses), 풍진 바이러스(rubella viruses), 토가바이러스(togaviruses), 및 수두 바이러스(varicella viruses)로부터 형성될 수 있으나, 항원은 반드시 이러한 바이러스들에 의해 제한되는 것은 아니다. 다른 바이러스는 인간 T 세포 림프구 바이러스(HTLV-I 및 HTLV-II와 같은 HTLVs), 소백혈병 바이러스(bovine leukemia viruses) (BLVS) 및 고양이 백혈병 바이러스(feline leukemia viruses) (FLVs)과 같은 T 림프구 바이러스을 포함한다. 렌티바이러스는 인간(HIV-1 또는 HIV-2을 포함하는 HIV), 원숭이(SIV), 고양이(FIV) 및 개(CIV) 면역결핍 바이러스를 포함할 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다.

다른 측면에서, 항원은 아래와 같은 속(genus)으로부터 선택된 감염성 원인체로부터 유래한다. : 아스페르길루스(Aspergillus), 보다텔라(Bordatella), 브루지아(Brugia), 칸디다균(Candida), 클라미디아(Chlamydia), 구포자충 아강(Coccidia), 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 개심장사상충(Dirofilaria), 대장균(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 임균(Gonococcus), 히스토플라스마(Histoplasma), 리슈만편모충(Leishmania), 진균(Mycobacterium), 미코플라스마(Mycoplasma), 파라메시움(Paramecium), 백일해(Pertussis), 열원충(Plasmodium), 폐렴 구균(Pneumococcus), 폐포자충(Pneumocystis), 리케차(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 이질(Shigella), 포도상 구균(Staphylococcus), 연쇄상 구균(Streptococcus), 톡소포자충(Toxoplasma), 콜레라균(Vibriocholerae), 예르시니아(Yersinia). 한 측면에서, 감염체는 열대열원충(Plasmodium falciparum) 또는 삼일열원충(Plasmodium vivax)으로부터 선택된다.

한 측면에서, 항원은 아래와 같은 과(family)로부터 선택된 세균으로부터 기인된다: 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae), 마이크로코카세아(Micrococcaceae), 비브리오나세아(Vibrionaceae), 파스토렐라세아(Pasteurellaceae), 미코플라스마타세아(Mycoplasmataceae), 및 리켓치아세아(Rickettsiaceae). 한 측면에서, 세균은 다음과 같은 속(genus)으로부터 기인된다: 수도모나스(Pseudomonas), 보르데텔라(Bordetella), 미코박테리움(Mycobacterium), 비브리오(Vibrio), 바실러스(Bacillus), 살모넬라(Salmonella), 프란시셀라(Francisella), 스타피로코커스(Staphylococcus), 스트레프토코커스(Streptococcus), 이스케리치아(Escherichia), 엔테로코커스(Enterococcus), 파스토렐라(Pasteurella), 및 어시니아(Yersinia). 한 측면에서, 세균은 다음과 같은 종 들(species)로부터 선택된다: 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 수도모나스 말리아이(Pseudomonas mallei), 수도모나스 수도말리아이(Pseudomonas pseudomallei), 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 미코박테리움 터버커로시스 투버커로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 비브리오 콜레래(Vibrio cholerae), 바실러스 안쓰라시스(Bacillus anthracis), 살모넬라엔테릭(Salmonella enteric), 어시니아 페스티스(Yersinia pestis), 이스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 및 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica).

본 발명에 따르면, 본 조성물 또는 백신에 사용되도록 적절한 항원은 둘 이상의 면역원성 도메인 또는 동일한 항원으로부터의 에피토프, 둘 이상의 항원 면역원성 도메인들, 또는 동일한 세포, 조직 또는 유기체로부터의 에피토프, 또는 둘 이상의 다른 항원, 둘 이상의 면역원성 도메인, 또는 세포, 조직 또는 유기체로부터의 에피토프(epitopes)를 포함할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 백신 및 조성물에 사용되는 융합 단백질은 하나 이상의 동물 백신화 인플루엔자 항원을 포함한다. 조성물 또는 백신은 하나 이상의 인플루엔자 항원을 포함할 수 있고, 바람직하게는 하나 이상의 인플루엔자 항원의 면역원성 도메인들을 포함할 수 있다.

예컨대 인플루엔자 바이러스와 같은 병원체로부터의 항원이 사용되는 경우, 당업자는 병원체의 다른 균주들(strains)에 걸쳐 고도로 보존된 병원균 유전체의 영역들로부터 항원들을 선택함으로써 병원균 항체들을 발현하는 효모 비히클을 포함하는 백신의 효능 기간 지속을 극대화할 수 있다. 이에 더하여, 가변가능한 병원균의 영역들로부터 항원, 예컨대 균주와 다르거나 각 계절마다 또는 지리학적 영역에서 돌연변이되는 항원을 선택함으로써 특이 유행병에 대해 접근하는 성능이 극대화된다. 본 발명의 이러한 측면은 앞서 자세하게 서술하였다.

한 측면에서,병원체는 인플루엔자 바이러스이다. 이러한 측면에서, 보존되거나 내부적으로 발현되는 항원은 매트릭스 단백질(M1), 이온 채널(ion channel; M2) 항원, 뉴클레오캡시드(nucleocapsid; NP) 항원, 폴리머라제 PB1(PB1) 항원, 폴리머라제(PB2) 항원, 및 폴리머라제 PA(PA) 항원을 포함한다. 가변적이거나 외부적으로 발현되는 항원은 M2e라고 불리는 M2의 세포의 부분뿐만 아니라, 헤마글루티닌(hemagglutininl; HA) 항원(하나 이상의 아형들) 및 뉴라미니다제(neuraminidase; NA) 항원(하나 이상의 아형들)을 포함한다. 이러한 항원들은 본 발명에 따른 신규 백신 전략에 사용하기 위해 상술한 바와 같이 선택될 수 있다.

한 측면에서, 병원체는 헤파티티스(hepatitis) 바이러스 C (HCV)와 같은 헤파티티스(hepatitis) 바이러스이다. 이러한 측면에서, 보존되거나 내부적으로 발현되는 항원은 HCV 코어(Core) 단백질, HCV NS2, NS3, NS4, 및 NS5을 포함한다. 가변적이거나 외부적으로 발현되는 항원은 HCV E1 및 E2 (외피(envelope) 단백질). 이러한 항원들은 본 발명에 따른 신규 백신 전략에 사용하기 위해 상술한 바와 같이 선택될 수 있다.

한 측면에서, 병원체는 헤파티티스(hepatitis) 바이러스 B (HBV)와 같은 헤파티티스(hepatitis) 바이러스이다. 이러한 측면에서, 보존되거나 내부 발현된 항원은 코어(core) 항원 HbcAg 및 e 항원 HbeAg를 포함한다. 가변되거나 외부 발현된 항원은 HbsAg(42 nM 비리온 및 22 nM 입자)를 포함한다. 이러한 항원들은 본 발명에 따른 신규 백신 전략에 사용하기 위해 상술한 바와 같이 선택될 수 있다.

한 측면에서, 병원체는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)와 같은 면역결핍 바이러스이다 이러한 측면에서, 보존되거나 내부적으로 발현되는 항원은 Vif, Vpr, Nef, p7, 및 뉴클레오캡시드를 포함한다. 가변적이거나 외부적으로 발현되는 항원은 gp120 및 gp41을 포함한다. 이러한 항원들은 본 발명에 따른 신규 백신 전략에 사용하기 위해 상술한 바와 같이 선택될 수 있다.

일부 구체예들에서, 항원은 융합 단백질이다. 본 발명의 한 측면에서, 융합 단백질은 둘 이상의 항원을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 융합 단백질은 둘 이상의 면역원성 도메인 또는 하나 이상의 항원에 관한 둘 이상의 에피토프(예컨대, 인플루엔자 M1 시퀀스(sequence) 및 인플루엔자 HA 시퀀스)를 포함한다. 그러한 백신은 많은 환자들에게 항원-특이적 면역을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 유용되는 다중 도메인(multiple domain) 융합 단백질은 다중 도메인들을 갖고, 각 도메인은 특이 단백질로부터 형성되는 펩타이드(peptide)로 이루어지고, 펩타이드는 단백질에서 발견되는 돌연변이된 아미노산을 포함함과 아울러서 돌연변이된 아미노산의 어느 한 측에 위치되는 적어도 4개의 아미노산 잔기들(residues)로 이루어지며, 돌연변이는 특정 질환 또는 용태(예컨대, 특정 균주(strain)에 의한 인플루엔자 감염)과 관련된다.

한 구체예에서는, 본 발명의 효모-기반 백신의 성분으로 사용되는 융합 단백질은 효모에서 이종성 항원의 발현을 위해 특히 유용한 구조체들을 사용하여 생산된다. 전형적으로, 바람직한 항원 단백질 또는 펩타이드는 그들의 아미노 말단에서 다음과 같은 것들에 융합되어진다: (a) 효모 비히클 내에서 융합 단백질의 발현을 안정시키고/거나 발현된 융합 단백질의 번역 후 변형(posttranslational modification)을 억제하는 특정 합성 펩타이드(이러한 펩타이드는 예를 들어, 2004. 8. 12에 공표된 미국공개공보 No. 2004-0156858 A1에 상세히 언급되어 있으며, 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다); (b) 내인성(endogenous) 효모 단백질의 적어도 일부(여기에서, 어느 하나의 융합 파트너는 효모에서 단백질의 발현의 유의하게 향상된 안정성을 제공하고/거나 효모 세포에 의한 단백질의 번역 후 변형을 방지한다)(이러한 단백질 역시 예를 들어, 미국공개공보 No. 2004-0156858 A1에 상세히 언급되어 있다); 및/또는 (c) 융합 단백질이 효모의 표면에서 발현되도록 하는 효모 단백질의 적어도 일부(예컨대, Aga 단백질, 상술한 미국공개문헌에 상세히 언급되어 있다).

또한, 융합 펩티드 또는 단백질은 항체와 같은 선별 인자(selection agent)에 의해 인지되도록 디자인된 에피토프(epitope)를 제공하거나, 구성체 내에서 백신화 항원에 대한 면역 반응에 부정적인 영향을 미치지 않는 것처럼 나타난다. 이러한 선별 인자는 본 발명에 사용되는 단백질의 식별, 선택, 및 정제에 유용하다.

이에 더하여, 본 발명은 특히, 단백질의 선별 및 동정에서 이용하기 위한 항원 코딩 작제물의 C-말단에 융합되는 펩타이드의 이용을 포함할 수 있다. 그러한 펩타이드는 펩타이드 태그(예컨대, 6X His) 또는 기타 다른 짧은 에피토프 태그와 같은 합성 또는 천연의 펩타이드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 항원의 C-말단에 부착되는 펩타이드는 앞서 설명된 N-말단 펩타이드의 부가 또는 부가 없이 이용될 수 있다.

본 발명에 유용한 융합 작제물은 (a) (여기서 설명된 바와 같이 다양한 융합 단백질과 다수의 항원 작제물 뿐만 아니라 전장 항원의 면역원성 도메인 및 에피토프를 포함한) 적어도 하나의 항원; (b) 합성 펩타이드를 포함하는 융합 단백질이다.

한 구체예에서는, 합성 펩타이드가 인플루엔자의 항원의 N-말단에 연결되는데, 상기 펩타이드는 인플루엔자 항원에 이종성인 적어도 두 개의 아미노산 잔기로 이루어지며, 상기 펩타이드는 효모 비히클에서 융합 단백질의 발현을 안정화시키고 발현된 융합 단백질의 번역후 수정을 방지한다. 합성 펩타이드 및 항원의 N-말단 일부는 함께 다음과 같은 조건을 갖는 융합 단백질을 형성한다: (1) 융합 단백질의 1번 위치에 있는 아미노산 잔기는 메티오닌이다 (즉, 합성 펩타이드의 첫 번째 아미노산은 메티오닌이다); (2) 융합 단백질의 2번 위치에 있는 아미노산 잔기는 글리신 또는 프롤린이 아니다 (즉, 합성 펩타이드의 두 번째 아미노산은 글리신 또는 프롤린이 아니다); (3) 융합 단백질의 2-6번 위치에 있는 아미노산 잔기 중 어떤 것도 메티오닌이 아니다 (즉, 합성 펩타이드가 6개의 아미노산 보다 짧은 경우에는 단백질의 2-6 위치에 있는 아미노산은 합성 펩타이드 또는 단백질의 일부분이라는 여부와 관계없이 메티오닌을 포함하지 않는다); 및 (4) 융합 단백질의 2-6 위치에 있는 아미노산 잔기 중 어떤 것도 리신 또는 아르기닌이 아니다 (즉, 합성 펩타이드가 5개의 아미노산 보다 짧은 경우에는 단백질의 6 위치에 있는 아미노산은 합성 펩타이드 또는 단백질의 일부분이라는 여부와 관계없이 리신 또는 아르기닌을 포함하지 않는다). 합성 펩타이드는 단지 2개의 아미노산으로 짧을 수 있지만, 바람직하게는 (3개, 4개, 5개 아미노산을 포함한) 적어도 2-6개의 아미노산이며, 전체적으로 6개의 아미노산 보다 긴 약 200개, 300개, 400개, 또는 500개 이상의 아미노산에 이르는 전체 정수개의 아미노산까지 길 수 있다.

한 구체예에서는, 펩타이드는 M-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆의 아미노산 서열을 포함하되, M은 메티오닌이고; X₂는 글리신, 프롤린, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이며; X₃은 메티오닌, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이고; X₄는 메티오닌, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이며; X₅는 메티오닌, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이고, X₆은 메티오닌, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이다. 한 구체예에서 X₆ 잔기는 프롤린이다. 효모 세포에서 인플루엔자 항원의 발현 안정성을 증진시키고/거나 효모에서 단백질의 번역후 수정을 방지하는 예시적인 합성 서열은 서열 M-A-D-E-A-P (서열번호(SEQ ID NO: 1)를 포함한다. MADEAP 서열은 인플루엔자 항원에 추가하여 다른 항원들과 사용될 수 있다. 발현 산물의 증진된 안정성에 추가하여, 이러한 융합 파트너는 작제물내 백신화 항원에 대한 면역 반응에 부정적인 영향을 미치지 않을 것이라고 보인다. 또한, 합성 융합 펩타이드는 항체와 같은 선별 인자에 의해 인식될 수 있는 에피토프를 구비하도록 설계될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서는, 본 발명에서 이용되는 합성 펩타이드의 해독 개시 부위를 코딩하는 핵산은 코자크(Kozak) 해독서열 규칙에 따라 A-C-C-A-T-G-G 이다. 상기 서열의 ATG는 초기 해독 개시 부위이고, M-A-D-E-A-P(서열번호(SEQ ID NO): 1)의 메티오닌을 코딩한다. 본 발명에 개시된 다양한 구체예가 조합될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 한 측면에서 합성 펩타이드가 M-A-D-E-A-P (서열번호(SEQ ID NO): 1)일 경우에, 상기 펩타이드의 개시 부위를 코딩하는 핵산 서열은 A-C-C-A-T-G-G 이다. 본 발명의 구체예의 다양한 다른 조합이 당업자에게 명백할 것이다.

본 발명의 한 측면에서, 효모 비히클은 발현된 항원 산물의 운반 또는 전달에 의해 효모 비히클의 표면 상에서(세포외 발현) 부분적으로 또는 전체적으로 항원이 발현 또는 제공되도록 조작된다. 본 발명의 이러한 측면을 달성하기 위한 한 방법은 효모 비히클의 표면 상에 하나 이상의 항원을 위치시키기 위해 스페이서 암(spacer arm)을 사용하는 것이다. 스페이서 암을 사용하는 한 방법은 효모 세포벽에 관심있는 항원을 타겟팅하는 단백질과 관심있는 항원의 융합 단백질을 생산시키는 것이다. 예를 들어, 사용될 수 있는 어떤 단백질은 항원이 효모의 표면상에 위치되도록 효모 세포벽에 타겟팅하는 것을 가능하게 하는 효모 단백질(예컨대, 세포벽 단백질 2(cwp2), Aga2, Pir4 또는 Flo1 단백질)이다. 효모 단백질 이외의 다른 단백질이 스페이서 암으로 사용될 수 있다; 그러나, 임의의 스페이서 암 단백질은 스페이서 암 단백질보다는 타겟 항원에 대해 직결되는 면역 반응을 갖는 것이 가장 바람직하다. 이와 같이, 다른 단백질들이 스페이서 암으로 사용되는 경우에, 사용되는 스페이서 암 단백질은 타겟 항원에 대한 면역 반응이 과도하지 않도록 스페이서 암 단백질 자체에 큰 면역 발생을 초래하지 않아야 한다. 당업자는 타겟 항원에 대한 면역 반응과 관련된 스페이서 암 단백질에 작은 면역 반응을 유발되도록 목표를 삼아야 한다. 면역 반응의 크기를 결정하는 모든 방법이 사용될 수 있으며(예를 들어, 항체 생산, 리틱(lytic) 어세이 등), 당업자에게 이미 알려져 있다.

효모 표면 상에 노출되도록 표적 항원을 위치시키는 다른 방법은 효모 세포벽에 표적을 앵커(anchor)하도록 글리세로포스파티딜 이노시톨(GPI)과 같은 신호 서열들을 사용하는 것이다. 이와는 달리, 위치결정(positioning)은 항원이 세포벽과 결합되는 단백질(예컨대, cwp)에 결합되도록 세포질세망(endoplasmic reticulum (ER)) 내로의 전달(translocation)을 통해 분비 경로 내로 관심있는 항원(들)을 표적으로 삼는 신호 서열들을 부가함으로써 달성될 수 있다.

한 측면에서, 스페이서 암 단백질은 효모 단백질이다. 효모 단백질은 효모 단백질의 약 2 내지 800개의 아미노산들로 이루어질 수 있다. 한 구체예에서는, 효모 단백질은 약 10 내지 700개의 아미노산들이다. 다른 구체예에서는, 효모 단백질은 약 40 내지 600개의 아미노산들이다. 본 발명의 다른 구체예는 적어도 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개 또는 500개의 아미노산으로 이루어지는 효모 단백질을 포함한다. 한 구체예에서는, 효모 단백질은 적어도 450개의 아미노산의 길이이다.

다른 구체예에서는, 효모 단백질은 효모 비히클에서 융합 단백질의 발현을 안정화시키고 발현된 융합 단백질의 번역 후 변형을 방지하고/거나, 효모에서 특정 구획(compartment)에 융합 단백질을 타겟팅한다(예컨대, 효모 세포 표면 상에 발현). 효모 분비 경로 내로 전달하기 위해 이용되는 예시적인 효모 단백질은 Aga (Agal 및/또는 Aga2을 포함하나, 이에 제한되지 않는다); SUC2 (효모 인버타제(invertase)); 알파 인자 신호 리더 서열; CPY; 세포벽에서의 정주(localization) 및 체류(retention)를 위한 Cwp2p; 딸세포 형성의 초기 단계 중에서 효모 세포싹에서의 정주를 위한 BUD 유전자; Flo1p; Pir2p; 및 Pir4p를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면에서, 다른 서열들이 효모 비히클의 다른 부위들, 예컨대 사이토졸 또는 미토콘도리아에 단백질을 타겟팅하고, 체류시키고/거나, 안정화시키는데 사용될 수 있다. 상술한 임의의 구체예에 사용될 수 있는 적합한 효모 단백질의 예는 SEC7; CPY; 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제 PCK1, 포스포글리세로키나제 PGK 및 글루코오스에서의 억제성 발현 및 사이토졸성 정주를 위한 트리오스 포스페이트 이소머라제 TPI 유전자 생산물; 히트 쇼크 단백질 SSA1, SSA3, SSA4, SSC1(열처리에 세포가 노출될 때 이의 발현이 유도되고 이의 단백질은 보다 열에 안정적임); 미토콘드리아로의 운반을 위한 미토콘드리아 단백질 CYC1; ACT1을 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다.

효과적인 체액성 면역 반응을 프라이밍하기 위해, 표적 항원은 효모 표면 상 일부분에 발현 또는 제공되어야 (또는 효모에 의해 분비되어야) 한다. 도 10A, 도 10B, 도 11 및 도 13B와 아울러 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, 효모 세포 표면 상에 항원을 발현시키거나 제공하기 위한 다양한 변이가 가능하다. 당업자는 효모 단백질의 다른 조합들이 상기 표면 상에 하나 이상의 관심있는 항원을 위치시키는데 사용될 수 있음을 예상할 것이다.

당업자는 여러 방법으로 효모 비히클의 표면 상에 항원의 발현 또는 제공을 최적화할 수 있다. 이러한 하나의 방법은 항원 표면 발현을 모니터하고/거나 제어하는 것이다. 이를 달성하는 하나의 가능한 방법은 최대 효과를 유발하도록 항원수준(level)의 발현을 최적화하는 것이다. 어떤 항원들에서는, 항원의 과도한 발현이 효모, 이 이외에도, 면역 세포 및 개체의 면역 시스템에 독성으로 작용한다. 다른 경우로, 과소한 발현은 B 세포와의 항원 상호작용의 결핍에 기인하여 면역 시스템의 프라이밍(priming)이 차선책으로 되게끔 유발한다. 당업자는 유세포측정(flow cytometry; 예컨대, FACS)과 같은 공지된 기술을 사용하고 세포 생존력과 발현 수준(level)을 연관시킴으로써 항원 발현을 모니터할 수 있다.

항원 표면의 발현 또는 제공을 최적화하는 다른 방법은 세포벽 융합 파트너로부터 스페이서 암들을 신중하게 선택하는 것이다. 스페이서 암으로 사용가능한 효모 단백질의 예들이 아래에 기술되고 도 10B에 도시됨에도 불구하고, 스페이서 암의 사이즈는 효모의 표면 상에 결합되기 위해 노출되는 항원의 양들에 영향을 줄 수 있다. 그리고, 어떤 항원이 사용되는지 여부에 따라, 당업자는 효모 표면 상의 항원을 위한 적절한 간격두기(spacing)에 영향을 미치는 스페이서 암을 선택할 것이다. 한 구체예에서, 스페이서 암은 적어도 450 개의 아미노산의 효모 단백질이다.

항원 표면 발현을 최적화하기 위한 다른 고려 사항은 항원 및 스페이서 암 조합이 단량체(예컨대, 도 11에 도시된 HA-cwp2), 이량체, 삼량체(예컨대, 가용성 분비 HA가 첨가된 삼량체 HA-aga2p) 또는 훨씬 많이 결집된 단위체들로서 발현되는지 여부이다. 단량체, 이량체, 삼량체 등의 이러한 사용은 만약 예를 들어, 다량체 형태가 특정 계열의 항체, 예컨대 중화 항체를 유도하는데 요구되는 입체 형태(conformation)을 채택한다면, 전체가 아니라면, 항체의 일부분이 더 면역원성을 갖는 방법으로 효모 비히클의 표면 상에 디스플레이되도록 항원의 적절한 간격두기(spacing) 또는 접기(folding)를 허용한다.

당업자는 5.5(즉, 중성 pH)보다 높은 pH 레벨에서 효모 세포를 성장시킴으로써 효모 비히클 표면의 위와 사이토졸(cytosol) 양쪽에 (이종성 항원 발현을 갖거나 갖지 않는) 효모 비히클의 성능을 최적화할 수 있다. 중성 pH의 이용은 항원 접근성 및 표면 제시(surface presentation)를 최적화하는 것을 돕고, 효모 세포벽이 훨씬 유연한 상태로 있도록 허용하고, 유익한 사이토카인(예컨대, INF-gamma)의 분비 및 최적화된 활성 반응을 갖는 최적화된 면역 반응을 발생시키도록 효모와 결합하는 면역 세포들을 자극한다.

항원 반응을 프라이밍하도록 효모 비히클을 최적화하기 위해 당업자가 사용하는 다른 방법은 효모의 당화(glycosylation)의 양을 조절하는 것이다. 효모 당화의 양은 당 부위(sugar moieties)가 큰 부피를 갖는 것으로 인하여 상기 표면 상에 발현되는 항원의 면역원성 및 항원성에 영향을 미칠 수 있다. 그러한 것으로서, 본 발명을 실행하는 경우에 효모 표면 상의 당 부위의 존재 및 타겟 항원 주위의 삼차원 공간에 미치는 그 영향이 고려되어야 한다. 어떤 방법은 효모의 당화(glycosylation)의 양을 감소시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 어떤 방법은 낮은 당화를 갖도록 선택된 효모 돌연변이 균주(예컨대 mnn1, och1 및 mnn9 돌연변이)를 사용하거나, 돌연변이에 의해 표적 항원 상에 당화 억셉터 서열들을 제거하는 방법을 사용할 수 있다. 이와는 달리, 어떤 방법은 생략된 당화(glycosylation) 패턴을 갖는 효모, 예컨대 Pichia를 사용할 수 있다. 표면 항원 상의 당화의 영향의 예는 실시예 5에 제공된다.

효모의 표면 상의 항원의 제공에 관한 다른 고려 사항은 효모가 어떻게 비활성화되는지와 이것이 상기 표면 상에 발현된 항원의 항원성에 어떤 영향을 주는지와 관련된 잠재적 효과이다. 효모의 열 비활성화는 효모 비활성화의 표준 방법이나, 열 비활성화는 표적 항원의 이차, 삼차 또는 사차 구조를 변형시키는 잠재력을 갖는다. 열 비활성화가 사용되는 경우에, 당업자는 공지된 표준 방법에 의해 표적 항원의 구조적 변화를 모니터하는데 주의를 기울여야 한다. 이와는 달리, 효모를 비활성화하는 다른 방법들로는 화화적 방법, 전기적 방법, 방사능 방법 또는 UV 방법과 같은 것들이 사용될 수 있다. 예를 들어, Methods of Enzymology, Vol. 194, Cold Spring Harbor Publishing (1990)과 같은 표준 효모 배양 문헌에 개시된 방법론을 참고할 수 있다. 최적화 전략의 어떠한 것도 표적 항원의 이차, 삼차, 또는 사차 구조를 고려해야 하며 그 면역원성을 최적화하기 위해 그러한 구조들을 유지하여야 한다.

상술한 구체예들과 유사하고, (필수적이지 않지만) 구체예들의 제한들을 포함할 수 있는 본 발명의 융합 단백질의 구조체들의 다른 특이한 측면은 인플루엔자 항원의 C-말단과 연결된 펩타이드를 포함하는 백신을 포함한다. 상기 펩타이드는 인플루엔자 항원에 이종성인 적어도 두 개의 아미노산 잔기로 이루어지고, 상기 펩타이드는 효모 비히클에서 융합 단백질을 안정화시키거나 발현된 융합 단백질의 번역후 수정을 방지한다. 본 발명의 한 예시적인 측면에서 상기 펩타이드는 아미노산 서열 E-D (Glu-Asp)를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 백신은 인플루엔자 항원의 C-말단과 연결된 펩타이드를 포함할 수 있되, 상기 펩타이드는 상기 펩타이드에 대한 항체에 의한 융합 단백질의 인지를 가능하게 한다. 한 측면에서, 펩타이드는 G-G-G-H-H-H-H-H-H (서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함한다. 이 구체예는 단독으로 또는 전술된 융합 단백질의 다른 구체예와 결합하여 이용될 수 있다.

한 구체예에서, 융합 단백질에서 이용되는 효모 단백질/펩타이드, 스페이서 암 또는 합성 펩타이드는 융합 단백질의 동정 및 정제를 위한 항체 에피토프를 포함한다. 내인성 항원에 선택적으로 결합하는 항체는 입수가능하거나 용이하게 생성할 수 있다. 결국, 특정 세포내 위치로 (예컨대, 분비 경로로, 미토콘드리아로, 핵으로) 단백질을 지시하고자 한다면, 작제물은 세포내 기구가 그 전달 시스템을 최적화하도록 효모 단백질에 대한 내인성 신호를 이용할 수 있다. 그러한 신호들은 앞서 자세히 기술되었다. 바람직하게는 융합 파트너에 선택적으로 결합하는 항체가 입수가능하거나 생산된다.

본 발명의 효모 비히클 , 타모젠 , 및 조성물 (백신)의 생산

본 발명에서 용어 "효모 비히클-항원 복합체" 또는 "효모-항원 복합체"는 효모 비히클과 항원의 회합(association)을 설명하기 위하여 일반적으로 이용된다. 상기 회합은 효모(재조합 효모)에 의한 항원이 발현, 효모로 항원의 도입, 효모와 항원의 물리적 부착 및 완충용액 또는 다른 용액 또는 제형에서와 같이 효모와 항원을 함께 혼합하는 것을 포함한다. 이러한 유형의 복합체는 하기에서 설명된다.

한 구체예에서, 효모 비히클의 제조에 이용되는 효모 세포는 항원을 코딩하는 이종성의 핵산 분자로 형질감염되어 상기 항원은 상기 효모 세포에 의해 발현된다. 그러한 효모는 본 발명에서 재조합 효모 또는 재조합 효모 비히클로서 정의된다. 그 다음 상기 효모 세포는 온전한 세포로서 수지상 세포로 로딩되거나, 사멸되거나, 효모 스페로플라스트, 사이토플라스트,고스트 또는 아세포 입자의 형성과 같은 방법에 의해 유도체화되고, 이어서 상기 유도체는 수지상 세포로 로딩될 수 있다.항원을 발현하는 재조합 스페로플라스트를 생산하기 위하여 효모 스페로플라스트는 재조합 핵산 분자로 직접적으로 형질감염될 수 있다 (예컨대, 스페로플라스트는 전효모로부터 생산되고, 이어서 형질감염된다).

일반적으로, 효모 비히클 및 항원(들)은 여기에서 기술된 임의의 기술에 의해 회합될 수 있다. 한 측면에서, 효모 비히클은 항원(들)과 함께 세포내로 로딩된다. 다른 측면에서, 항원(들)은 효모 비히클과 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 결합된다. 또 다른 측면에서, 효모 비히클 및 항원(들)은 혼합에 의해 회합된다. 다른 측면에서, 그리고 바람직한 구체예에서, 항원은 효모 비히클 또는 효모 비히클이 유도되는 효모 세포 또는 효모 스페로플라스트에 의해 재조합적으로 발현된다.

본 발명의 효모 비히클에 의해 생산되는 항원의 바람직한 숫자는 효모 비히클에 의해 합리적으로 생산가능한 임의의 수의 항원이며, 일반적으로 하나 이상부터 적어도 약 6개 이상의 범위이고, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 6개의 이종성 항원이다.

본 발명의 효모 비히클 내에서의 항원의 발현은 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 수행된다. 요약하면, 하나 이상의 원하는 항원을 코딩하는 핵산 분자는 숙주효모 세포내로 형질감염될 때 핵산 분자의 구조적인 또는 조절된 발현에 영향을 줄 수 있도록 핵산 분자가 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 방식으로 발현 벡터 내로 삽입된다. 하나 이상의 항원을 코딩하는 핵산 분자는 하나 이상의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 벡터 상에 있을 수 있다. 특히 중요한 발현 조절 서열은 프로모터 및 업 스트림 활성화 서열과 같은 전사 개시를 조절하는 서열들이다. 임의의 적합한 효모 프로모터가 본 발명에서 사용될 수 있으며, 다양한 그러한 프로모터가 당업계에 공지되어 있다. 사카로마이세스 세레비지에에서의 발현을 위해 바람직한 프로모터는, 이에 제한되는 것은 아니나, 다음과 같은 효모 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터를 포함한다: 알코올 디하이드로게나아제I (ADH1) 또는 II (ADH2), CUP1, 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK), 트리오스 포스페이트 아이소머라제 (TPI), 전사 연장 인자 EF-1 alpha (TEF2), 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH; 트리오스 포스페이트 디하이드로게나제에 대해, TDH3로도 언급됨), 갈락토키나아제 (GAL1), 갈락토스-1-포스페이트 유리딜-트랜스퍼라제 (GAL7), UDP-갈락토스 에피머라제 (GAL10), 사이토크롬 c₁ (CYC1), Sec7 단백질 (SEC7) 및 산 포스파타제 (PHO5), 보다 바람직하게는 ADH2/GAPDH 및 CYC1/GAL10 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터, 보다 더 바람직하게는 세포내에서 글루코스 농도가 낮을 때 (예컨대, 약 0.1 내지 약 0.2 퍼센트) 유도되는 프로모터인 ADH2/GAPDH 프로모터 및 CUP1 프로모터 및 TEF2 프로모터. 마찬가지로, 인핸서로도 언급되는, 다수의 업스트림 활성화 서열(UAS) 또한 공지되어 있다. 사카로마이세스 세레비지에서의 발현을 위한 바람직한 업스트림 활성화 서열은, 이에 제한되는 것은 아니나, 다음과 같은 단백질을 코딩하는 유전자의 UAS를 포함한다: PCK1, TPI, TDH3,CYC1, ADH1, ADH2, SUC2, GAL1, GAL7 및 GAL10, 및 GAL4 유전자 산물에 의해 활성화되는 다른 UAS, 특히 바람직하게는 ADH2 UAS. ADH2 UAS는 ADR1 유전자 산물에 의해 활성화되므로, 이종성 유전자가 ADH2 UAS에 작동가능하게 연결될 때 ADR1 유전자를 과발현하는 것이 바람직하다. 사카로마이세스 세레비지에서의 발현을 위한 바람직한 전사 종결 서열은 α-인자(α-factor), GAPDH, 및 CYC1 유전자의 종결서열을 포함한다.

메틸트로픽 효모(methyltrophic yeast)에서 유전자를 발현시키는데 바람직한 전사 조절 서열은 알코올 산화효소 및 포르메이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 전사 조절 영역을 포함한다.

효모에 의한 항원의 세포외 발현을 위한 최적화 장치 및 방법은 여기에서 이전에 상세하게 기술된 바 있다.

본 발명에 따른 효모 세포로 핵산 분자의 형질감염은 세포로 핵산 분자를 투입시키는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 확산, 능동 운반(active transport), 초음파 처리, 전기천공, 미세 주입, 리포펙션, 흡착 및 프로토플라스트 융합을 포함한다. 형질감염된 핵산 분자는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 효모 염색체로 통합되거나 염색체외 벡터로서 유지되도록 할 수 있다. 그러한 핵산 분자를 보유하는 효모 비히클의 예가 본 발명에서 상세히 설명된다.상기된 효모 사이토플라스트, 효모 고스트 및 아세포 효모 막 추출물 또는 이의 분획물은 원하는 핵산 분자로 온전한 효모 미생물 또는 효모 스페로플라스트를 형질감염시키고, 항원을 생산한 후 당업계에 공지된 기술을 사용하여 상기 미생물 또는 스페로플라스트를 추가로 조작하여 상기 원하는 항원을 함유하는 사이토플라스트, 고스트 또는 아세포 효모 막 추출물 또는 이의 분획물을 생산함으로써 재조합에 의해 생산될 수 있다.

재조합 효모 비히클의 생산 및 상기 효모 비히클에 의한 항원의 발현에 효과적인 조건은 효모 균주가 배양될 수 있는 효과적인 배지를 포함한다. 효과적인 배지는 일반적으로 동화할 수 있는 탄수화물, 질소 및 포스페이트 원 뿐만 아니라 적합한 염, 미네랄, 금속 및 비타민과 생장 인자와 같은 기타 영양분을 포함하는 수용성의 배지이다. 배지는 복합 영양분을 포함하거나 제한된 최소 배지일 수도 있다. 본 발명의 효모 균주는 이에 제한되는 것은 아니지만, 생물 반응기, 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크, 시험관, 마이크로티터 디쉬 및 페트리 플레이트를 포함한 다양한 용기에서 배양될 수 있다. 배양은 효모 균주에 적합한 온도, pH 및 산소 농도에서 수행한다. 그러한 배양 조건은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면,Guthrie et al. (eds.), 1991, Methods in Enzymolgy, vol.194, Academic Press, San Diego를 참조).

본 발명의 일부 측면에서, 특히 체액성 면역 반응의 유도가 요구되는 경우의 구체예에서 항원의 충분한 표면 발현 또는 제공이 요구될 때, 효모는 적어도 5.5의 pH 수준이 유지된 배지에서 성장, 즉, 배양 배지의 pH는 pH 5.5 밑으로 떨어지는 것이 허용되지 않는다. 다른 측면에서, 효모는 약 5.5에서 유지된 pH 수준에서 성장한다. 다른 측면에서, 효모는 약 5.6, 5.7, 5.8 또는 5.9에서 유지된 pH 수준에서 성장한다. 다른 측면에서, 효모는 약 6에서 유지된 pH 수준에서 성장한다. 다른 측면에서, 효모는 약 6.5에서 유지된 pH 수준에서 성장한다. 다른 측면에서, 효모는 약 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 또는 7.0에서 유지된 pH 수준에서 성장한다. 다른 측면에서, 효모는 약 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0에서 유지된 pH 수준에서 성장한다. pH 수준은 효모의 배양에 있어서 중요하다. 당업자는 배양 과정이 효모 배양의 시작 뿐만 아니라 배양의 유지를 포함한다는 것을 예상할 것이다. 효모 배양은 시간이 지남에 따라 산성으로 변한다고 알려져 있으므로(즉, pH를 낮춤), 배양 과정 동안 pH 수준을 모니터링하기 위한 주의가 필요하다. 배지의 pH 수준이 6 아래로 떨어진 효모 세포 배양 또한 배양 과정 동안 일부 시점에서 배지의 pH가 적어도 5.5까지 이르게 된다면 본 발명의 범위의 포함되는 것으로 예상된다. 이와 같이, 적어도 pH 5.5 또는 그 이상인 배지에서 효모가 성장하는 시간이 길 수록 원하는 특성을 갖는 효모를 얻는 것과 관련하여 더 좋은 결과를 얻어질 수 있을 것이다.

효모를 배양하는데 있어서 중성 pH의 사용은 면역 조절을 위한 비히클로서 효모를 사용하기 위해 요구되는 특성인 여러 생물학적 효과를 증진시킨다. 한 측면에서 중성 pH에서 효모를 배양하는 것은 세포 세대 시간에 어떠한 부정적인 영향(예컨대, 더블링 타임을 늦춤)이 없는 효모의 우수한 성장을 허용한다. 효모는 그들의 세포벽 유연성을 잃지 않고 높은 밀도로 계속 성장할 수 있다. 다른 측면에서, 중성 pH의 사용은 모든 수확 밀도에서 유연한 세포벽을 갖는 효모 및/또는 세포벽 소화 효소(예컨대, 글루카나제)에 민감한 효모의 생산을 허용한다. 이 특성은 효모의 숙주 세포에서 사이토카인(예컨대, 인터페론-γ(IFN-γ)의 분비를 촉진하는 것에 의한 것과 같이 유연한 세포벽을 갖는 효모가 독특한 면역 반응을 발현할 수 있기 때문에 바람직하다. 또한, 세포벽에 위치한 항원에 대한 더 큰 접근성이 그러한 배양 방법에 의해 제공된다. 다른 측면에서, 인플루엔자 HA 항원과 같은 일부 항원에 대한 중성 pH의 사용은 HA-발현 효모가 낮은 pH(예컨대, pH 5)의 배지에서 배양될 때 가능하지 않은 디티오트레이톨(dithiothreitol (DTT))의 처리에 의한 이황화 결합된 HA의 방출을 가능하게 한다. 마지막으로, 다른 측면에서,중성 pH 방법론을 이용하여 배양된 효모에 (예컨대, 식균 작용 또는 다른 로딩에 의해) 노출될 때 Th1-타입의 사이토카인을 생산하는 세포는 이에 제한되는 것은 아니나, IFN-γ, 인터루킨-12 (IL-12), 및 IL-2를 포함하는 Th1-타입의 사이토카인의 증가된 생산을 나타낸다.

여기에서 사용된, 용어 "중성 pH"의 일반적 사용은 약 pH 5.5 내지 약 pH 8, 바람직하게는 약 pH 6 내지 약 pH 8의 pH 범위를 발한다. 당업자는 pH 미터로 측정할 때 (예컨대, 십분의 일 또는 백분의 일의) 사소한 변동이 발생할 수 있음을 예측할 것이다. 이와 같이, 효모 세포의 성장을 위한 중성 pH의 사용은 그들이 배양되는 대부분의 시간 동안 효모가 중성 pH에서 성장함을 의미한다.

본 발명의 한 구체예에서, 효모 비히클에서 재조합적으로 항원이 발현되는 것을 대체하여, 효모 비히클은 항원으로서 단백질 또는 펩타이드 항원, 또는 항원으로서 제공되는 카보하이드레이트 또는 다른 분자들과 함께 세포내로 로딩된다. 계속해서, 세포 내로 항원을 포함하고 있는 효모 비히클은 환자에게 투여되거나 (아래에서 기술되는) 수지상 세포와 같은 운반체 내로 로딩될 수 있다. 여기에서 사용된 펩타이드는 약 30-50 미만의 아미노산 이하의 아미노산 서열을 포함하는 반면 단백질은 약 30-50 아미노산 서열 이상을 포함하고; 단백질은 다중결합적인 것일 수 있다. 항원으로서 유용한 단백질 또는 펩타이드는 T 세포 에피토프만큼 작을 수 있고(즉, 5 아미노산 길이 이상), 다중 에피토프, 단백질 단편, 전장 단백질, 키메라 단백질 또는 융합 단백질을 포함하는 것보다 큰 임의의 적합한 크기일 수 있다. 펩타이드 및 단백질은 자연적으로 또는 합성하여 유도된 것일 수 있으며; 그러한 변형은 이에 제한되는 것은 아니나, 글리코실화, 인산화, 아세틸화, 미리스틸화, 프레닐화, 팔미토일화, 아미드화 및/또는 글리세로포스파티딜 이노시톨의 부가를 포함할 수 있다. 펩타이드 및 단백질은 확산, 능동 수송, 리포좀 융합, 전기 천공, 식균작용, 냉동-해동 사이클 및 초음파처리와 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 본 발명의 효모 비히클로 직접적으로 삽입될 수 있다. 펩타이드, 단백질, 탄수화물 또는 기타 분자에 의해 직접적으로 로딩될 수 있는 효모 비히클은 온전한 효모 뿐만 아니라 생산된 후 수지상 세포로 로딩되기 전에 항원에 의해 로딩될 수 있는 스페로플라스트, 고스트 또는 사이토플라스트를 포함한다. 또한, 온전한 효모가 항원에 의해 로딩되고 그 다음 이로부터 스페로플라스트, 고스트, 사이토플라스트 또는 아세포 입자가 제조될 수 있다. 이러한 구체예에서 효모 비히클로 로딩될 수 있는 항원의 수는 적어도 1, 2, 3, 4 내지 정수로 증가하는 수백 또는 수천개의 항원이며, 예를 들면 이는 미생물의 로딩, 포유동물의 종양 세포 또는 이의 일부의 로딩에 의해 구비될 것이다.

본 발명의 다른 구체예에서, 항원은 효모 비히클에 물리적으로 부착된다. 효모 비히클로 항원의 물리적인 부착은 이에 제한되는 것은 아니지만, 항원과 효모 비히클의 외부 표면간의 화학적인 교차연결 또는 예를 들면 항체 또는 다른 결합 파트너를 사용함에 의한 항원과 효모 비히클의 외부 표면간의 생물학적 연결을 포함한 공유 및 비공유 연관 방법을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 화학적 교차연결은 예를 들면 글루타르알데히드 연결, 광친화 라벨링(photoaffinity labelling), 카르보디이미드로 처리, 디설파이드 결합할 수 있는 화학 물질로 처리 및 당업계에 알려진 표준의 다른 교차연결 화학 물질로 처리를 포함한 방법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 효모 막의 지질 이중층 또는 세포벽 조성물의 전하를 변화시킬 수 있는 화학 물질을 효모 비히클과 접촉시켜 효모의 외부 표면이 특정 전하 특성을 갖는 항원과 융합하거나 결합하도록 할 수도 있다. 항체, 결합 펩타이드, 가용성 수용체와 같은 표적 인자 및 기타 리간드가 융합단백질로서 항원에 통합되거나 효모 비히클로 항원을 결합시키는 항원과 회합될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 효모 비히클과 항원은 완충 용액 또는 다른 적합한 제형(예컨대, 혼합물)에서 효모 비히클과 항원을 적절히 혼합함과 같은 보다 수동적이고, 비특이적 또는 비공유 결합 메커니즘에 의해 서로 회합된다. 본 발명의 한 구체예에서, 효모 비히클과 항원은 수지상 세포 또는 대식세포와 같은 담체로 세포내 로딩되어 본 발명에 따른 치료학적 조성물 또는 백신을 형성할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 항원은(즉, 본 발명의 인플루엔자 융합 단백질)은 효모 비히클이 부재한 상태로 수지상 세포로 로딩될 수 있다.

상기 두 성분의 로딩이 달성될 수 있는 다양한 형태가 이하 상세히 설명된다. 본 발명에서 용어 "로딩" 및 이의 파생어는 임의의 성분(예컨대, 효모 비히클 및/또는 항원)이 세포(예컨대, 수지상 세포)로 삽입, 도입 또는 유입되는 것을 의미한다. 성분을 세포내로 로딩한다는 것은 세포내 구획으로(예컨대, 플라즈마 멤브레인을 통하여 최소한 사이토플라즘, 파고좀, 리소좀 또는 세포의 어떤 세포내 공간 내로) 성분을 삽입 또는 도입하는 것을 의미한다. 성분을 세포로 로딩하는 것은 상기 성분이 세포로 (예컨대, 전기천공에 의해) 유입되도록 하거나 성분이 몇몇 과정에 의해 (예컨대, 식균 작용) 실질적으로 세포로 유입될 수 있도록 하는 환경에 위치시키는 (예컨대, 세포 근처 또는 세포와 접촉하여) 임의의 기술을 의미한다. 로딩 기술은 이에 제한되는 것은 아니지만, 확산, 능동 수송, 리포좀 융합, 전기 천공, 식균 작용 및 소음파 처리를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 효모 비히클 및/또는 항원을 수지상 세포로 로딩하는 수동적 메커니즘이 이용되며, 그러한 수동적 메커니즘은 수지상 세포에 의한 효모 비히클 및/또는 항원의 식세포작용을 포함한다.

한 구체예에서, (이종성 항원의 발현을 갖거나 갖지 않는) 비손상 효모는 효모 세포벽 제제, 효모 막 입자 또는 효모 분획(즉, 손상된)을 만들어 낼 수 있는 방식으로 분쇄되거나 가공될 수 있으며, 일부 구체예에서, 효모 분획은 면역 반응을 향상시키기 위한 항원(예컨대, DNA 백신, 단백질 서브유닛 백신, 사멸 또는 불활성화 병원체)을 포함하는 또다른 조성물과 함께 제공 또는 투여될 수 있다. 예를 들어, 효소 처리, 화학적 처리 또는 물리적 힘(예컨대, 기계적 전단 또는 초음파)가 효모를 애주번트로서 사용되는 부분들로 부수는데 사용될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 조성물 또는 백신은 생물학적 반응 조정제 화합물 또는 그러한 조정제를 생산할 수 있는 능력을 (즉, 그러한 조정제를 코딩하는 핵산 분자로 형질전환됨으로써) 포함할 수 있지만, 그러한 조정제가 본 발명에 따른 강력한 면역 반응을 달성하는데 필수적인 것은 아니다. 예를 들면, 효모 비히클은 적어도 하나의 항원 및 적어도 하나의 생물학적 반응 조정제 화합물로 형질전환 또는 로딩되거나, 본 발명의 백신 또는 조성물은 적어도 하나의 생물학적 반응 조정제와 접합하여 투여될 수 있다. 생물학적 반응 조정제는 면역 반응을 조정할 수 있는 화합물이며, 면역조절 화합물로서 정의될 수 있다. 특정 생물학적 반응 조정제는 보호 면역 반응을 자극하는 반면에 일부는 해로운 면역반응을 억제할 수 있다. 특정 생물학적 반응 조정제는 세포 매개 면역 반응을 선호하여 증진시키는 한편 다른 생물학적 반응 조정제는 체액성 면역 반응을 선호하여 증진시킨다 (즉, 체액성 면역에 비해 증가된 수준의 세포성 면역이 있는 면역 반응을 자극하거나 또는 그와 반대로 자극할 수 있다). 면역 반응의 자극 또는 억제를 측정하고 체액성 면역 반응으로부터 세포성 면역 반응을 구별할 수 있는 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있다.

적합한 생물학적 반응 조정제는 사이토카인, 호르몬, 리피드의 유도체, 소 분자 약물 및 이에 제한되는 것은 아니지만, 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 10(IL-10), 인터루킨 12(IL-12), 인터페론 감마(IFN-gamma), 인슐린 유사 생장 인자 I(IGF-I), 형질전환 생장 인자 베타(TGF-β) 스테로이드, 프로스타글란딘 및 류코트리엔과 같은 다른 생장 조정제를 포함한다. IL-2, IL-12 및/또는 IFN 감마를 생산하는 (즉, 발현하는) 그리고 가능한 분비하는 효모 비히클의 능력은 세포 매개 면역을 증진시키는 한편, IL-4, IL-5 및/또는 IL-10을 발현하고 가능한 분비하는 효모 비히클의 능력은 체액성 면역을 증진시킨다. 다른 적합한 생물학적 반응 조정제는 이에 제한되는 것은 아니지만, 항 CTLA-4 항체 (예컨대, 아네르기 T 세포를 방출하기 위하여); T 세포 공조 자극제 (예컨대, 항-CD137, 항-CD28, 항-CD40); 알렘투주맵 (예컨대, CamPath®), 데니루킨 디프티톡스 (예컨대, ONTAK®), 항-CD4, 항-CD25, 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-PD-L2 또는 FOXP3을 차단하는 인자 (예컨대, CD4+/CD25+ T 제어 세포를 활성의 제거/살상을 위하여); Flt3 리간드, 이미퀴모드 (Aldara®), GM-CSF, 사르그라모스팀 (Leukine®), Toll 유사 수용체 (TLR)-7 작용제 또는 TLR-9 작용제 (예컨대, 수지상 세포, 대식세포 및 기타 전문적인 항원-제시 세포의 개수를 증가시키거나 활성 상태를 증가시키기 위한 인자). 그러한 생물학적 반응 조정제는 당업계에 공지되어 있고 일반적으로 이용 가능하다.

본 발명의 조성물 및 치료 백신은 병원체에 의한 감염을 포함함 특정 질환 또는 용태로부터 대상을 보호하기 위해 유용한 임의의 다른 화합물, 또는 그러한 감염에 이한 임의의 증상을 치료 또는 완화시키는 화합물을 추가로 포함할 수 있다.

여기에서 사용된, 약제학적으로 허용되는 담체는 본 발명의 효모 백신을 적합한 생체내 또는 생체외 부위로 전달하기에 적합한 임의의 물질 또는 비히클을 의미한다. 상기 담체는 이에 제한되는 것은 아니지만, 애주번트, 부형제 또는 임의의다른 종류의 전달 비히클 또는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 애주번트는 일반적으로 특정 항원에 대한 동물의 면역 반응을 증진시키는 성분이다. 적합한 애주번트는 이에 제한되는 것은 아니자만 프로인트 애주번트; 기타 박테리아의 세포벽 성분; 알루미늄계 염; 칼슘계 염; 실리카; 폴리뉴클레오타이드; 유독소; 혈청 단백질; 바이러스의 코트 단백질; 기타 박테리아 유래의 조제물; 감마 인터페론; 헌터 티터맥스 애주번트(Hunter's Titermax Adjuvant, CytRx^TM, Inc. Norcross, GA)와 같은 블록 혼성중합체 애주번트; 리비 애주번트 (Ribi Adjuvant, Ribi ImmunoChem Research, Inc. Hamilton, MT로부터 입수 가능); 및 사포닌과 퀴일 A (Quil A, Superfos Biosector A/S, Denmark로부터 입수 가능함)와 같은 유도체를 포함한다. 본 발명의 효모 백신에서 애주번트의 사용이 필요한 것은 아니나, 그들의 사용이 배제되는 것은 아니다.

담체는 일반적으로 치료되는 동물에서 치료 조성물의 반감기를 증가시키는 화합물이다. 적합한 담체는 이에 제한되는 것은 아니지만, 중합체의 제어 방출 제형, 생분해성 이식물, 리포좀, 오일, 에스테르 및 글리콜을 포함한다.

본 발명의 조성물 및 백신은 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 약제학적으로 허용되는 부형제는 본 발명의 방법에서 이용되는 치료 조성물을 생체내 또는 생체외 부위에 전달하는데 적합한 임의의 성분을 의미한다. 바람직한 약제학적으로 허용되는 부형제는 조성물 (또는 효모 비히클 또는 효모 비히클을 포함한 수지상세포)이 신체내 표적 세포, 조직 또는 부위에 도달하자마자 그 표적 부위에서 면역 반응을 유도할 수 있는 형태로 상기 조성물을 유지할 수 있다. 본 발명의 적합한 부형제는 백신을 한 부위로 특정하게 표적화하지 않지만, 운반하는 부형제 또는 방식을 포함한다 (또한, 비특이적인 담체로 정의된다). 약제학적으로 허용되는 부형제의 예로는 이에 제한되는 것은 아니

지만, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 혈청 함유 용액, 한스 용액, 기타 수용성의 생리학적 평형 용액, 오일, 에스테르 및 글리콜 등이 포함된다. 수용성 담체는 예를 들면 화학적 안정성 및 등장성을 증진시킴으로써 수령자의 생리학적 조건에 근접시키는데 요구되는 적합한 보조 성분을 포함할 수 있다. 보조 성분은 또한 보존제를 포함할 수 있다. 또한 트레할로스, 글라이신, 솔비톨, 락토오스 또는 모노소듐 글루타메이트(MSG)와 같은 안정화제를 가하여 온도 변화 또는 동결 건조과정과 같은 다양한 상태에 대해 백신을 안정화시킬 수 있다. 조성물은 또한 멸균수 또는 식염수(바람직하게는 완충된)와 같은 현택 액체를 포함할 수 있다.

효모 비히클은 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 환자에게 직접 투여되거나 먼저 수지상 세포와 같은 담체 내로 로딩되는 조제물을 포함한 본 발명의 조성물로 제형화될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 구체예로, 효모 비히클은 동결건조법에 의해 건조시킬 수 있다. 항원을 투여 또는 수지상 세포로 로딩하거나 다른 유형의 투여 이전에 효모 비히클은 또한 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합될 수 있다. 예를 들어, 제제는 멸균수, 식염수, 등장성 완충 식염수(예컨대, 생리학적 pH로 완충된 포스페이트)와 같은 적합한 희석제, 또는 다른 적합한 희석제로 희석되거나 재현탁될 수 있다. 동결건조는 인기있는 옵션이다. 효모 비히클을 포함하는 제제는 효모 비히클을 함유하는 제형은 베이킹 또는 양조 공정에서 사용되는 효모에 행해지는 바와 같이 효모를 케이크 또는 정제 형태로 패킹(packing)하여 제조할 수 있다.

본 발명의 키트

본 발명은 본 발명의 임의의 하나 이상의 백신, 및/또는 발명의 임의의 하나 이상의 타모젠 또는 효모 비히클 단독 또는 여기에서 기술된 항원 및 항원 제제와의 배합물을 포함하는 키트를 예상한다. 임의의 종류의 백신 및 특히, 본 발명의 효모 비히클-기반 백신 또는 백신 전략에서의 사용을 위한 세포내 및 세포외 항원의 임의의 배합이 본 발명의 키트에 포함된다. 예를 들어, 여기에서 기술된 임의의 융합 단백질, 또는 여기에서 기술된 세포내 및 세포외 항원을 제공하는 단백질 제제가 키트 내에 포함될 수 있다. 항원은 효모 비히클에 의해 발현되는 형태, 또는 다른 방식으로 효모 비히클에 의해 제공되는 형태(타모젠으로서), DNA 백신으로, 융합 단백질 제제를 포함하는 단백질 제제로서, 또는 사멸 또는 불활성화 병원체로서 등을 포함하는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 항원의 임의의 적합한 형태가 포함된다. 또한, 각각의 항원이 상이한 효모 비히클에 의해 발현되거나 다른 방식으로 제공되는(상이한 효모 비히클과 복합된) 다중 항원 또는 항원제제가 포함된다. 예를 들어, 개체 또는 개체의 집단에의 투여를 위한 바람직한 항원의 배합(예컨대, 보존 또는 내부 및/또는 가변 또는 외부 항원) 및 바람직한 백신 전략(예컨대, 보존 또는 내부 항원으로 프라이밍하고 가변 또는 외부 항원으로 부스팅)을 선택할 수 있도록, 각각의 효모 비히클은 특정 병원체로부터의 상이한 항원을 발현하거나 다른 방식으로 제공할 수 있다. 한 측면에서, 이러한 키트는 추가적으로 프라이밍 또는 부스팅 백신 전략에서 사용될 항원 제제를 단독으로 또는 키트 내에 포함되는 타모젠과 배합물로 포함할 수 있다(여기에서 기술된 바와 같이, 이는 프라이밍/부스팅 전략 등에서 동시에 또는 계속적으로 투여됨). 키트는 또한 여기에서 기술된 애주번트로서의 사용을 위한, 항원을 발현하거나 제공하지 않는 효모 비히클을 포함할 수 있다. 사용을 위한 지시서 세트는 본 발명의 임의의 키트와 함께 포함될 수 있다. 효모 비히클을 위한 배양 시약 또한 포함될 수 있다. 효모 세포는 최초 배양을 위해 냉동된 것이거나, 항원 발현을 위해 선 배양된 후 키트의 일부로서 패키징을 위해 냉동된 것이거나, 동결건조되어 제공되는 것일 수 있다.

본 발명의 방법

본 발명의 한 구체예는 세포-매개 면역 반응, 체액성 면역반응, 및/또는 그의 복합을 포함하는 면역 반응 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 구체예는 병원체에 의한 감염(예컨대, 인플루엔자 바이러스 감염) 또는 그로 인해 발생되는 질환을 포함하는 (용태 또는 질환의 예방 및/또는 치료학적 치료를 포함하는) 상태 또는 질환으로부터 동물을 보호하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 감염의 예방 또는 동물에서 감염으로 인해 발생하는 하나 이상의 증상의 감소를 포함하는 질환 또는 용태의 감소 또는 예방을 위해, (병원체 감염을 포함하는) 질환 또는 용태를 갖고 있거나 질환 또는 용태가 발생할 위험이 있는 동물에 여기에서 기술된 본 발명의 백신 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 개체에게 항원을 포함하는 백신의 적어도 첫번째 투여에서, 하나 이상의 항원에 대한 동물에서의 항원-특이적 세포-매개 반응을 우선적으로 유도한다. 특정 병원체 또는 질환, 및 백신이 투여되는 개체의 면역 상태에 대해 면역 반응을 맞추는 상세한 전략은 상기 기술되고 여기에서 예시되고 있다. 당업자는 원하는 면역 반응을 달성하기 위해, 항원의 상이한 배합, 항원의 발현 또는 제공의 종류, 및 백신 조성물, 및 여기에서 기술된 백신 프로토콜을 쉽게 이용할 수 있을 것이다.

상기 구체예에서, 백신 또는 조성물은 다음을 포함한다: (a) 제1 효모 비히클; 및 (b) 여기에서 기술된 (효모 비히클에 의해 발현되는, 효모 비히클과 복합되어 운반되는, 효모 비히클과 회합되는, 효모 비히클에 의해 분비되고/거나 효모 비히클과 혼합된) 임의의 하나 이상의 항원. 백신은 상술된 바와 같이 상이한 항원을 발현, 운반, 분비하거나, 상이한 항원과 혼합, 회합 또는 복합된 추가적인 효모 비히클을 포함할 수 있으며, 배합 또는 순차적으로 투여되는 효모 비히클의 바람직한 복합이 위에서 상세하게 기술된 바 있다.

한 구체예에서, 백신은 효모에 의해 세포내로 발현 또는 제공되는 하나 이상의 항원을 포함한다. 한 구체예에서, 백신은 효모에 의해 세포내로 발현 또는 제공되는 하나 이상의 항원 및 효모에 의해 세포외로 발현 또는 제공되는 하나 이상의 항원을 포함한다. 이러한 구체예의 한 측면에서, 세포내 및 세포외 항원은 동일한 항원이고, 다른 측면에서, 그들은 상이한 항원이다. 한 구체예에서, 효모에 의해 세포내로 발현 또는 제공되는 항원은 보존된 항원 또는 병원체에 의해 내적으로 발현되는 항원인 하나 이상의 항원을 포함한다. 한 구체예에서, 효모에 의해 세포외로 발현 또는 제공되는 항원은 가변 항원 또는 병원체에 의해 외적으로 (세포 표면 상에) 발현되는 항원인 하나 이상의 항원을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 그러한 가변 또는 외부 항원은 또한 효모에 의해 세포내로 발현 또는 제공된다.

본 발명의 한 구체예에서, 백신은 효모에 의해 세포내로 발현 또는 제공되는 하나 이상의 항원 및 효모에 의해 세포외로 발현 또는 제공되는 하나 이상의 항원을 포함하고, 상기 백신은 항원(들)에 대한 면역계를 프라이밍시키기 위해 사용된다. 프라이밍(priming)은 항원 또는 항원 복합을 이용하여 이전에 면역화된 적이 없는 개체에게 백신을 최초 투여하는 것을 의미한다. 따라서, 면역계는 "프라이밍"되어 (백신의 부스팅에 의한 또는 예를 들어, 병원체로의 감염의 결과로서, 자연적인 항원과의 접촉에 의한) 그 후의 항원과의 접촉에 대해 보다 신속하고 효과적으로 대응하게 된다.

한 구체예에서, 백신은 효모에 의해 세포내로 발현 또는 제공되는 하나 이상의 항원 또는 효모에 의해 세포외로 발현 또는 제공되는 하나 이상의 항원, 또는 효모에 의해 세포내로 발현 또는 제공되는 항원(들) 또는 효모에 의해 세포외로 발현 또는 제공되는 항원(들) 모두를 포함하고, 상기 백신은 부스터 백신(booster vaccine)으로서(즉, 항원 또는 항원들로의 최초의 프라이밍 면역화에 뒤이어) 투여된다.

한 구체예에서는, 항원이 높게 보존되어 있고 쉽게 돌연변이되지 않는 경우 단일 항원의 발현이 바람직할 수 있다. 다른 구체예에서는, 다중 항원의 발현 또는 제공이 단일 항원을 타겟팅함으로써 달성될 수 있는 것보다 넓은 범위의 상호-보호적 반응을 위해 바람직할 수 있다. 그러한 상호-보호적 반응은 넓은 범위의 보호성 면역 반응을 제공하는, 상술된, 항체-생성 백신과 배합될 수 있는 범용 백신의 생성을 위해 유용하다. 범용 항원의 타겟팅은 보호의 메커니즘이 항체-생성 백신으로 유도할 수 있는 것과는 상이하기 때문에 투여량-절약 처방에서 적용될 수 있다.

다른 구체예에서, 부스터 백신은 상이한 종류일 수 있다 (예컨대, 비-효모 기반 백신 (예컨대, 단백질 서브유닛, DNA, 사멸/불활성화 병원체) 또는 단백질, DNA 또는 불활성화/사멸 병원체 백신와 함께 애주번트로서 사용되는 효모 막 또는 세포벽 입자 또는 효모과 같은, 상이한 종류의 효모 비히클을 사용하는 효모-기반 백신). 보다 특히, 본 발명의 한 구체예에서, 여기에서 기술된 본 발명의 백신 또는 조성물은 임의의 통상적인, 비-효모-기반 백신 또는 조성물을 포함하는, 하나 이상의 다른 백신 또는 면역 치료 조성물의 투여를 포함하는 프로토콜로 투여될 수 있다. 예를 들어, 그러한 다른 백신 또는 면역치료 조성물은 DNA 백신, 사멸 또는 불활성화 병원체 백신 또는 단백질 서브유닛 백신 (예컨대, 정제 항원 제제)과 같은 임의의 다른 항원-함유, 항원-코딩, 또는 항원-발현 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명의 효모-기반 백신은 적어도 강력한 세포-매개 반응, 한 구체예에서는 세포-매개 및 체액성 면역 반응 모두를 포함하는 항원-특이적 면역 반응을 프라이밍 하기 위해 사용되며, 바람직하게는 비-효모-기반 백신 또는 대체 형태의 효모-기반 백신이 면역 반응(세포-매개 및/또는 체액성)을 부스팅하기 위해 사용된다. 다르게는, 본 발명의 효모-기반 백신이 투여될 때 비-기반 효모 백신에서 이전에 투여된 항원 또는 항원들에 대해 개체의 면역 반응을 부스팅하는 예들이 있을 수 있다.

한 측면에서,이종성 항원을 발현, 또는 다른 방식으로 함유 또는 제공하지 않는 효모가 관심있는 하나 이상의 항원(들)과 함께 애주번트로서 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 이종성 항원을 발현, 또는 다른 방식으로 함유 또는 제공하지 않는 효모가 DNA 백신의 면역 반응을 향상시키기 위해 비-효모-기반 백신 (예컨대, DNA 백신)과 함께 동시에 사용될 수 있다. 한 대안에서, 이종성 항원을 (표면 상에 또는 내적으로 또는 양자 모두로) 발현 또는 제공하는 효모는 면역 반응을 향상시키기 위해 다른 종류의 백신과 함께 사용된다. 또 다른 대안에서, 이종성 항원을 발현, 다른 방식으로 함유 또는 제공하지 않는 효모는 단독으로 개체에 투여된다(즉, 외인성 항원이 투여되지 않는다). 본 발명의 이러한 측면에서, 병원체로 현재 감염된 개체, 세포성 단백질 내의 돌연변이를 겪거나 면역계에 의해 용인되지 않는 항원 또는 용인성이 깨질 수 있는 항원을 다른 방식으로 발현 또는 운반하는 개체와 같은 개체는 비-항원-운반 효모 비히클의 투여시 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 항원을 운반한다.

보호성 면역 반응을 유도하기 위해서는 효모 비히클 상의 이종성 항원이 비-효모-기반 백신에서 사용된 항원과 동일할 것이 요구되지 않는다. 항원은 두 개의 항원이 서열 유사성을 갖거나, 에피토프를 공유하거나, 또는 타겟 병원체에서 상이한 항원일 수 있도록 선택될 수 있다. 한 측면에서, 효모-기반 및 비-효모-기반 백신에 대해 보충적 또는 보완적 면역 반응을 유도하기 위한 항원이 선택된다. 이는 효모 비히클의 이종성 항원에 대한 면역 반응이 비-효모-기반 백신에서의 항원에 대한 면역 반응에 대해 길항적인 상황을 넘어서기 위해 바람직한것이 자명하다.

본 발명의 치료 조성물 또는 백신의 이용 방법은 바람직하게는 동물이 (감염을 포함한) 질환 또는 용태로부터, 또는 (감염을 포함한) 상기 질환 또는 용태로부터 야기된 증상로부터 보호되도록 동물에서 면역 반응을 유도한다. 여기에서 사용된 "질환으로부터 보호된"이란 질환의 증상이 감소하는 것; 질환의 발병이 감소하는 것 및/또는 질환의 심도가 감소하는 것을 의미한다. 동물을 보호한다는 것은 본 발명에 따른 치료 조성물이 동물에게 투여되었을 때, 질환의 발병을 예방하고/거나 질환의 증상, 신호 또는 원인을 치료하거나 완화시킬 수 있는 능력을 의미할 수 있다. 질환으로부터 동물을 보호한다는 것은 질환의 발병을 예방하고 (예방적 치료 또는 예방적 백신) 질환을 보유하거나 질환의 초기 증상을 가진 동물을 치료하는 (치료적 치료 또는 치료적 백신) 것을 포함한다. 특히, 동물을 질환으로부터 보호한다는 것은 일부 경우에는 과잉반응 또는 해로운 면역 반응을 추가로 억제하는 (즉, 감소, 억제 또는 차단) 이로운 또는 보호적 면역 반응을 유도하여 동물에서 면역 반응을 유발함으로써 달성된다. 용어 "질환"은 동물의 정상적인 건강에서의 이탈을 의미하며, 질환 증상이 존재하는 상태 뿐만 아니라 이탈(예컨대, 감염, 유전자 돌연변이, 유전자 결핍 등)이 일어났지만 증상이 아직 드러나지 않은 용태를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 백신은 인플루엔자 바이러스와 같은 병원체로 감염된 개체 또는 개체의 집단에게 투여된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 백신은 그러한 병원체게 감염될 위험에 처해 있는 개체 또는 개체의 집단에게 투여된다. 상기 개체은 예를 들면 개체의 정상 또는 전체 집단보다 인플루엔자 감염에 더 높은 위험에 있는 것으로 동정된 집단을 포함할 수 있다. 그러한 개체는 또한 집단의 지정학적 위치에서 예상되는 병원체 균주(예컨대, 바이러스 균주)에 기하여 본 발명의 특정 백신에 대해 선택되는 집단을 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 임의의 백신은 공지 또는 예상되는 특정 병원체로의 감염 상태 또는 감염될 감수성에 관계없이 임의의 개체 또는 개체들의 임의의 집단에게 투여된다.

보다 구체적으로, 여기에서 기술된 백신은 본 발명에 따른 방법에 의해 동물에게 투여되었을 때 바람직하게는 병원체 감염의 완화 (예컨대, 감염의 하나 이상의 증상 또는 임상 소견의 감소), 감염의 제거 또는 감염이 제거되는 시간의 감소, 감염 및/또는 그에 관련된 증상의 예방 및 감염에 대한 효과기 세포 면역의 자극 및 체액성 면역성을 포함한 결과를 발생시킨다. 또한, 백신은 바람직하게는 개체의 순환에서 또는 세포에서 또는 조직에서 자유롭던지 아니던지 간에, 병원체의 모든 생활사 형태, 균주 또는 돌연변이를 포함하는 병원체에 의한 모든 감염을 예방 또는 감소시킬 수 있도록 면역계를 프라이밍한다. 백신은 또한 바람직하게는, 새로운 균주 또는 돌연변이체에 의한 미래의 감염이 보다 쉽게 예방 및/또는 제거될 수 있도록 병원체에 대한 장기-지속적인 면역성 또는 적어도 범용의 또는 상호-보호적 면역을 제공한다.

본 발명은 동물에게 본 발명의 조성물 또는 백신을 전달하는 것을 포함한다. 투여 과정은 생체외 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 생체외 투여는 효모 비히클과 항원이 세포에 로딩되도록 특정 용태중인 환자로부터 제거된 세포(수지상 세포)의 집단에게 본 발명의 조성물을 투여하고 그 세포를 환자에게 되돌리는 것과 같은 환자의 외부에서 조절 단계의 일부를 수행하는 것을 의미한다. 본 발명의 치료 조성물은 임의의 적합한 투여 모드에 의해 환자에게 되돌려지거나 환자에게 투여될 수 있다.

백신 또는 조성물의 투여는 단독으로 또는 본 발명의 담체와 배합되어 일반적으로 전신으로, 점막으로 수행될 수 있다. 바람직한 투여의 경로는 당업자에게 자명할 것이다. 바람직한 투여 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 결절내(intranodal) 투여, 치관내 투여, 동맥내 투여 (예컨대, 목동맥으로), 피하내 투여, 경피 전달, 기관내 투여, 피하내 투여, 관절내 투여, 심실내 투여, 흡입 (예컨대, 에어로졸), 두개골내, 척수강내, 안구내, 귀내(aural), 비강내, 경구, 폐포내 투여, 카테터(catheter)의 삽입 및 조직으로의 직접 주입을 포함한다.

특히 바람직한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 피하내, 피내, 결절내, 근육내, 경피, 흡입, 비강내, 경구, 안구내, 관절내, 두개골내 및 척수강내를 포함한다. 비경구 전달은 피내, 근육내, 복강내, 가슴막내, 폐포내, 정맥내, 피하내, 동맥 카테터 및 정맥의 카테터 경로를 포함할 수 있다. 귀내 전달은 이어 드롭(ear drop)을 포함하거나, 비강내 전달은 노즈 드롭(nose drop) 또는 비강내 주입을 포함하거나, 안구내 전달은 아이 드롭(eye drop)을 포함할 수 있다. 에어로졸 (흡입) 전달은 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어 Stribling et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992, 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다). 예를 들면, 한 구체예에서, 본 발명의 조성물 또는 백신은 적합한 흡입 장치 또는 분무기를 이용하는 분무식 전달에 적합한 조성물로 제형화될 수 있다. 구강 전달은 입을 통하여 섭취될 수 있는 고체 및 액체를 포함할 수 있고, 점액 면역의 발달과 효모 비히클을 함유하는 조성물은 예를 들면, 구강 전달용 정제 또는 캡슐로서 용이하게 제조될 수 있을 뿐만 아니라 식품 및 음료 생산물로 제형화될 수도 있기 때문에 유용하다.

점액 면역성을 조정하는 다른 투여 경로는 바이러스에 의한 감염의 치료에 유용하다. 그러한 경로는 기관지내, 경피내, 근육내, 비강내, 다른 흡입식, 직장, 피하내, 국소, 경피, 질 및 요도 경로를 포함한다.

임의의 상기 방법 중 한 구체예에서, 백신은 호흡기 관으로 투여된다. 다른 구체예에서, 백신은 투여의 비경구 경로에 의해 투여된다. 또 다른 구체예에서, 백신은 추가로 수지상 세포 또는 대식세포를 포함하되, 융합 단백질을 발현하는 효모 비히클 또는 비히클들은(상술된 바람직한 조합들을 참고) 생체외에서 수지상 세포 또는 대식세포로 전달되고 효모 비히클을 포함하는 수지상 세포 또는 대식세포가 동물에게 투여된다. 이러한 구체예의 한 측면에서, 수지상 세포 또는 효모 비히클은 자유 항원(free antigen)으로 추가로 로딩되었다. 한 측면에서, 효모-기반 백신은 개체 내에서 또다른 효모-기반 백신 또는 비-효모-기반 백신과 동일한 위치로 투여된다. 또다른 측면에서, 효모-기반 백신은 개체 내에서 또다른 효모-기반 백신 또는 비-효모-기반 백신과 상이한 위치로 투여된다. 한 측면에서, 백신은 치료 백신으로서 투여된다. 다른 측면에서, 백신은 예방 백신으로서 투여된다.

본 발명에서 효과적인 투여 프로토콜 (즉, 효과적인 방식으로 백신 또는 치료 조성물을 투여하는 것)은 질환 또는 용태를 가지고 있거나, 질환 또는 용태로 발전할 위험을 가진 동물에서 면역 반응을 유도하여 바람직하게는 그 결과로 동물이 상기 질환으로부터 보호되는 적합한 용량 변수 및 투여 모드를 포함한다. 효과적인 용량 변수는 특정 질환과 관련하여 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 그러한 방법은 예를 들면, 생존율, 부작용(즉, 독성) 및 질환의 진행 또는 퇴행의 확인을 포함한다.

본 발명에서 적합한 단일 용량은 동물에게 적합한 기간에 걸쳐서 한 차례 이상 투여되었을 때 항원 특이적 면역 반응을 유발할 수 있는 용량이다. 용량은 치료되는 질환 또는 용태에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 본 발명에 따른 효모 비히클의 단일 용량은 조성물이 투여되는 유기체의 체중 1 킬로그램 당 약 1 x 10⁵ 내지 약 5 x 10⁷의 효모 세포 등가물이다. 바람직한 구체예에서 용량당 효모 세포는 유기체의 체중에 맞게 조절되지 않는다. 이러한 구체예에서, 본 발명에 따른 효모 비히클의 단일 용량은 용량당 약 1 x 10⁴ 내지 약 1 x 10⁹의 효모 세포이다. 단일 용량에서 사용되는 효모 비히클의 양은 약 0.0001 효모 유닛 (YU) 내지 약 10,000 YU (1 YU = 10⁷ 효모)일 수 있다. 한 구체예에서, 사용된 효모 비히클의 양은 약 0.001 YU 내지 약 1000 YU이다. 다른 구체예에서, 사용된 효모 비히클의 양은 약 0.01 YU 내지 약 100 YU이다. 다른 구체예에서, 사용된 효모 비히클의 양은 약 0.1 YU 내지 약 10 YU이다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 효모 비히클의 단일 용량은 용량 당 (즉, 유기체 당) 약 0.1 Y.U. (1 x 10⁶ 세포) 내지 약 100 Y.U.(1 x 10⁹ 세포)이며, 0.1 x 10⁶ 세포의 증가분에 의한 임의의 중간 용량(즉, 1.1 x 10⁶, 1.2 x 10⁶, 1.3 x 10⁶...)을 포함한다. 이러한 용량의 범위는 마우스, 원숭이, 사람 등을 포함한 임의의 크기의 임의의 유기체에서 효과적으로 이용될 수 있다.

백신이 효모 비히클과 항원이 수지상 세포로 로딩됨으로써 투여되는 경우에 본 발명에 따른 백신의 바람직한 단일 용량은 1회 투여시 개인당 약 0.5 x 10⁶ 내지 약 40 x 10⁶의 수지상 세포이다. 바람직하게는 단일 용량은 개인당 약 1 x 10⁶ 내지 20 x 10⁶의 수지상 세포이고, 보다 바람직하게는 개인당 1 x 10⁶ 내지 10 x 10⁶의 수지상 세포이다.

치료 조성물의 "부스터(booster)" 또는 "부스트(boost)"는 항원에 대한 면역 반응이 특정 항원 또는 항원에 대한 면역 반응을 제공하거나 기억 반응(memory response)을 유도하는 것이 요구되거나 필요한 경우에 바람직하게 투여된다. 부스터는 최초 투여 후 약 2주 내지 여러 해에 걸쳐서 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 투여 스케줄은 유기체의 체중 1kg 당 조성물 중 약 1 x 10⁵ 내지 약 5 x 10⁷의 효모 세포 등가물이 약 1 개월 내지 약 6개월의 기간에 걸쳐서 약 1 회 내지 약 4회 투여되는 것이다.

본 발명의 한 구체예에서, 효모 비히클 또는 비히클 및 상술된 하나 이상의 항원의 투여량을 포함하는, 한 측면에서, 바람직하게는 효모 비히클 또는 비히클 및 단독 또는 하나 이상의 세포외 항원과의 배합된 하나 이상의 세포내 항원의 투여량을 포함하는 제1 백신이 개체 또는 개체의 집단에 투여된다. 인플루엔자의 경우, 백신은 바람직하게는 적어도 하나 이상의 내부 인플루엔자 항원을 포함한다. 이 백신은 항원이 항원에 대한 체액성 면역성을 유지 또는 유도하는 세포외 항원일 때, 항원에 대한 세포-매개 면역성을 유지 또는 유도하기에 필요한 개체에 대한 임의의 적합한 규칙적인 원칙을 두고 투여될 수 있다. 인플루엔자와 같은 병원체의 경우에서, 백신은 바람직하게는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 적어도 세포-매개 면역성을 유지 또는 유도한다. 예를 들어, 백신은 매년, 2년마다, 매 수년마다, 또는 다른 필요에 따라 부스터와 함께 투여될 수 있다. 상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 이러한 구체예는 범용적, 상호 보호적 백신으로서 사용될 수 있으며, 통상적인 백신 보다 여러 종류의 병원체 감염에 대한 더 긴 지속성의 면역성을 제공할 수 있다.

추가적인 구체예에서, 효모 비히클 또는 비히클 및 하나 이상의 항원 (상기 제1 백신에 포함된 것과 동일 또는 상이한 항원)의 투여량을 포함하는, 바람직하게는 효모 비히클 또는 비히클 및 단독 또는 하나 이상의 세포내 항원과 함께 하나 이상의 세포외 항원의 투여량을 포함하는 제2 백신이 상기 제1 백신을 받은 개체 또는 개체의 집단에 투여된다. 이러한 제2 백신은 제1 백신과 함께 (예컨대, 상이한 효모 비히클의 배합물을 포함하는 단일 백신으로서) 또는 제1 백신과는 별도로 투여될 수 있다. 후자의 시나리오에서, 제2 백신은 다양한 백신에 의해 유도되는 면역 반응을 조종하기 위해, 제1 백신과 순차적으로, 그러나 동시점으로(예컨대, 수초, 수분 또는 수시간으로 간격으로 투여하는 경우) 또는 제1 백신과는 다른 스케줄로 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 백신은 가능하다면 범용의, 상호-보호적 세포-매개 면역 반응의 유도를 목표로, 그리고 적용가능하다면 백신 디자인, 체액성 면역 반응에 기초하여, 일년에 한 번 또는 더 긴 증가분 내에 투여될 수 있다. 제2 백신은 또한 그 시기에 집단에서 가장 유행하거나 병원체에 의한 유행병성 및 전염병성 감염을 조절 또는 예방할 필요가 있을 때 개체를 시기적절하게 면역화시키기 위해 일년에 한번 또는 필요한 때(즉, 한번, 일년 당 한번, 또는 면역화 전략과 관련하여) 투여될 수 있다. 인플루엔자 백신에 적용되는 것과 같은 이러한 전략은 여기에서 특히 상세하게 기술되나, 본 발명이 인플루엔자 백신에 제한되는 것은 아니다. 상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 백신 전략은 이전에 공지된 것보다 병원체에 대해 보다 유연하고 효과적인 면역화를 제공할 것으로 여겨지는, 세포-매개 및 체액성 면역성을 포함하는 상호-보호적 및 병원체 균주/돌연변이-특이적 면역성을제공하도록 디자인될 수 있다. 이러한 전략은 예를 들어, 암 세포에 의해 발현되는 항원과 같은, 세포성 항원에 쉽게 적응시킬 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서 백신 및 치료 조성물은 임의의 척추동물, 특히, 척추동물 강의 임의의 일원인, 특별한 제한 없이 영장류, 설치류, 가축 및 애완 동물을 포함한 포유동물에 투여할 수 있다. 가축은 소비되거나 유용한 생산물을 생산하는 동물(예컨대, 울을 생산하는 양)을 포함한다. 보호될 바람직한 포유동물은 사람, 개, 고양이, 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말 및 돼지를 포함하며, 사람이 특히 바람직하다.

일차 및 이차 의학적 용도

본 발명은 임의의 용도, 특히 병원체에 의한 감염, 암, 자가면역 질환 등을 포함한 질환 또는 용태의 치료 또는 예방을 위한 제제 또는 의약의 제조를 위한, 세포외 및/또는 세포내 항원(들) (타모젠), 복합 세포외 및 세포내 항원, 융합 단백질, 애주번트로서의 효모 비히클을 발현 또는 제공하는 임의의 효모 비히클, 및/또는 여기에서 기술된 항원 제제, 및/또는 그들의 임의의 배합물의 용도를 예상하고 있다. 제제 또는 의약은 투여의 경로의 복합(예컨대, 비강내 및/또는 비경구)를 포함한, 임의의 종류의 투여에 대해 제제화될 수 있다. 제제 또는 의약은 여기에서 기술된 임의의 종류의 투여 프로토콜을 위해 제조될 수 있다. 한 측면에서, 제제 또는 의약은 항원-특이적 면역 반응(세포-매개 및/또는 체액성)의 유도를 위한, 인플루엔자 감염에 대해 동물을 보호하기 위한, 질환 또는 용태를 치료 또는 예방하기 위한, 인플루엔자 바이러스와 같은 병원체에 감염될 위험에 처한 개체의 집단을 면역화하기 위한, 인플루엔자 바이러스와 같은 병원체에 감염된 개체의 집단을 치료하기 위한, 또는 인플루엔자 바이러스를 포함한 병원체 감염에 대해 동물을 보호하기 위한 것이다.

인플루엔자 조성물 및 백신

임의의 항원에 대해 연관되고 상술된 본 발명의 다양한 측면이 인플루엔자 바이러스 및 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 대해 본 발명의 구체예 및 개념의 적용의 상세한 논의에 의해 설명되고 예시될 것이다. 본 발명은 항원 또는 항원의 근원으로서의 인플루엔자 바이러스에 제한되지 않는다.

본 발명자들은 효모 비히클 및 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 포함하는 효모-기반 백신 및 그의 사용 방법을 개발하였다. 하나 이상의 인플루엔자 항원을 발현하거나 다른 방식으로 그와 복합되는 그러한 효모 비히클은 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 인플루엔자 바이러스 융합 단백질을 발현하거나 다른 방식으로 그와 복합되는 하나 이상의 추가적인 비히클과 함께 사용될 수 있으며, 상기 효모 비히클은 임의의 비-효모-기반 백신 (예컨대, DNA 백신, 단백질 서브유닛 백신, 또는 사멸 또는 불활성화 인플루엔자 바이러스)을 포함하는 인플루엔자 항원의 다른 형태와 복합될 수 있다.

한 구체예에서, 백신은 매트릭스 단백질 (M1), 이온 채널 (M2) 항원, 뉴클레오캡시드 (NP) 항원, 폴리머라제 PB1 (PB1) 항원, 폴리머라제 (PB2) 항원, 및 폴리머라제 PA (PA) 항원으로부터 선택되는 하나 이상의 내부 인플루엔자 항원을 발현 또는 제공하는 효모 비히클을 포함한다. 또다른, 백신은 헤마글루티닌 (HA) 항원 (임의의 하나 이상의 서브타입) 및 뉴라미니다제 (NA) 항원 (임의의 하나 이상의 서브타입)으로부터 선택되는 하나 이상의 외부 인플루엔자 항원을 발현하는 효모 비히클을 포함한다. 내부 항원은 전형적으로 효모에 의해 세포내로 발현된다. 외부 인플루엔자 항원은 전형적으로 세포의 표면 상에 발현 또는 제공되며(세포외 항원), 또한 효모에 의해 세포 내로 발현 또는 제공될 수도 있다. 일부 구체예에서, 두 종류(세포내 및 세포외)의 항원들의 발현이 바람직하다. 특히 바람직한 구체예에서, 외부 인플루엔자 단백질(들)은 주어진 기간(예컨대, 1년 내)에서 동물(예컨대, 인간)의 종들 중에서 가장 현저하게 유행하고 있는 바이러스의 종류 또는 그룹을 대표할 수 있도록 선택되거나, 또는 유행성 또는 전염성 인플루엔자를 포함한 특정 종류의 잠재적이거나, 의심되거나, 예상되는 인플루엔자 발생에 대응하여 선택된다.

본 발명의 추가적인 특히 바람직한 구체예는 외부 및 내부 인플루엔자 항원의 복합 사용을 이용하는 백신에 관한 것이다. 이러한 구체예에서, 백신은 매트릭스 단백질 (M1), 이온 채널 (M2), 뉴클레오캡시드 (NP) 항원, 폴리머라제 PB1 (PB1) 항원, 폴리머라제 (PB2) 항원, 및 폴리머라제 PA (PA) 항원로부터 선택되는 하나 이상의 내부 인플루엔자 항원을 발현 또는 제공하는 효모 비히클을 포함한다. 이들 단백질의 복합 사용 또한 본 발명에 포함된다. 내부 인플루엔자 항원은 바람직하게는 효모에 의해 세포내로 발현되나, 항원은 또한 세포외로 제공될 수도 있다. 백신은 또한 헤마글루티닌 (HA) 항원 (임의의 하나 이상의 서브타입) 및 뉴라미니다제 (NA) 항원 (임의의 하나 이상의 서브타입)으로부터 선택되는 하나 이상의 외부 인플루엔자 항원의 효모 비히클에 의한 발현 또는 제공을 포함한다. 외부 인플루엔자 항원은 효모의 표면 상에(세포외) 발현 또는 제공되며, 또한 효모에 의해 세포내로 발현 또는 제공될 수도 있다. 일부 구체에에서, 두 종류의 항원 발현 또는 제공 모두 외부 인플루엔자 항원에 대해 바람직하다.

다양한 균주의 인플루엔자 바이러스로부터 유래한 단백질에 대한 핵산 및 아미노산 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 균주 A/PR/8/34의 H1N1에 대한 서열이 NCBI 데이터베이스 기탁 번호. M38279 (서열번호 30을 코딩하는 서열번호 29의 핵산서열) 및 NC_002019 (서열번호 32를 코딩하는 서열번호 31의 핵산서열) 하에 공개되어 있다. 예를 들어, 조류 인플루엔자 균주 A/Vietnam/1203/04의 서열 또한 공지되어 있다. 예를 들어, A/Vietnam/1203/04 의 H5N1의 핵산 서열(예컨대, NCBI 데이터베이스 기탁 번호. AY818135)이 서열번호 34를 코딩하는 서열번호 33으로서 나타난다. 여기에서 기술된 특정 서열들은 이들 균주의 공지 또는 보고된 서열로부터 유도한 것이지만, 당업자는 쉽게 다른 균주를 선택하거나 동일한 균주로부터 보고된 서열를 선택할 수 있으며, 개시된 서열에 대해 기술된 동일한 방식으로 본 발명에서 그것을 사용할 수 있을 것이다. 당업자는 다른 균주 또는 보고된 바이러스 서열에서 여기에서 기술된 단백질에 대해 상응하는 서열을 동정하고 임의의 다양한 서열 소프트웨어 프로그램을 이용하여 서열을 용이하게 배열할 수 있을 것이다. 또한, 공개된 데이터 베이스에서 다양한 균주 또는 서열의 보고에서 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 약간씩 다를 수 있음을 인지할 것이다. 그러한 사소한 차이는 본 발명에 따른 면역 반응을 유도하는 능력에 유의한 영향을 미칠 것으로 예상되지 않는다. 본 발명은 여기에서 기술된 서열에 제한되지 않는다. 이러한 구체예에서, 외부 인플루엔자 항원(들)을 발현 또는 제공하는 효모 비히클은 내부 인플루엔자 항원(들)을 발현 또는 제공하는 효모 비히클과 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 내부 인플루엔자 항원 및/또는 외부 인플루엔자 항원의 상이한 복합은 상이한 효모 비히클 상에서 발현 또는 제공될 수 있으며, 상기 비히클은 원하는 백신화에 따라 별도로 또는 함께 이용될 수 있다. 일반적으로 인플루엔자 항원이 두 개 이상의 상이한 효모 비히클에 의해 제공될 때(즉, 하나의 효모 비히클 내에 모든 인플루엔자 항원을 제공하는 것과는 반대로), 효모 비히클은 단일 백신(단일 주사 또는 다른 종류의 투여형태)으로서 투여를 위해 복합(혼합)될 수 있거나, 상이한 효모 비히클이 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여는 시간의 작은 증가분(수초 또는 수분) 및 시간의 긴 증가분(수일, 수주, 수달 또는 수 년)을 포함한 임의의 적합한 기간을 두고 분리될 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 내부 인플루엔자 단백질 및 하나 이상의 외부 인플루엔자 단백질을 포함하는 인플루엔자 단백질의 임의의 복합이 사용되고, 이들 반백질이 그러한 단백질을 발현 또는 다른 방식으로 그와 복합된 임의의 복합 효모 비히클(단일 효모 비히클 포함)을 이용하여 제공될 수 있다.

본 발명의 백신을 어떻게 디자인하고 사용할지는 큰 유연성이 있다. 예를 들어, 내부 인플루엔자 항원을 제공하는 효모 비히클을 포함하는 "범용" 백신은 세포-매개성인 개체에서의 상호-보호적 면역성을 발달시키기 위하여, 주기적 원칙 상에서 개체에 투여될 수 있다. 이들 백신은, 예를 들어, 외부 인플루엔자 항원을 제공하는 추가적인 효모 비히클과 함께, 1회 또는 주기적 원칙을 두고 배합될 수 있다.

외부 인플루엔자 항원을 제공하는 효모 비히클은 흥미있는 바이러스 균주 및/또는 주어진 시간 동안 또는 특정 지정학적 영역에 대해 가장 유행하고 있는 바이러스 균주(들)를 타겟팅하기 위해 매년 또는 임의의 다른 바람직한 원칙으로 (예컨대, 긴급 또는 예상되는 유행성 또는 전염성, 또는 다른 방식으로 필요한 때) 순환, 교대, 또는 선택될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예들는 여기에서 제공된 개시의 측면에서 명백할 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 내부 항원을(단독으로 또는 하나 이상의 외부 항원과 함께) 발현 또는 제공하는 효모 비히클은 프라이밍 백신으로서 투여될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 부분적으로 정제된 또는 정제된 인플루엔자 단백질 제제, 인플루엔자 단백질을 발현하는 효모 비히클의 용해물, DNA 인플루엔자 백신, 사멸 (또는 불활성화) 바이러스, 또는 (이종성 항원을 제공 또는 제공하지 않는) 효모 비히클 및 비-효모 기반 백신의 배합물을 포함하는, 다른 내부 및/또는 외부 항원 제제 또는 추가적인 효모-기반 백신의 부스터가 뒤따를 수 있다. 본 발명의 효모-기반 백신은 면역 반응을 유도하는데 굉장히 효과적이므로 부스터 백신이 필요하지 않을 수 있으나 본 발명의 구체예에서 그들은 포함됨을 주지할 것이다.

인플루엔자 M1, M2 및 NP 단백질은 인플루엔자에 의해 발현되는 내부 단백질이고, 인플루엔자 바이러스 균주들 중에서 높은 정도의 서열 보존성을 나타내므로, 이들은 면역치료를 위해 훌륭한 타겟이 된다. 본 발명의 백신의 투여는 인플루엔자-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 증대시키며, 인플루엔자-감염 개체에서의 바이러스 제거를 궁극적으로 향상시킨다. 효모-기반 포맷에서 외부 인플루엔자 항원 (예컨대, HA, M2e (M2 단백질의 외부 펩타이드) 및/또는 NA 항원)과 배합될 때, 백신은 추가로 인플루엔자-특이적 세포-매개 및 체액성 면역성을 증대시켜, 현재 백신 수요에 대해 맞출 수 있는 균주-특이적 접근법(외부 항원을 통한) 뿐만 아니라, 장기-지속적 효과를 갖는 (내부 항원으르 통한) 상호-보호적 백신화 접근법을 포함하는 백신화 플랫폼을 제공한다. 또한, 본 발명의 백신은 달걀(egg)-기반이 아니어서, 통상적인 인플루엔자 백신에 비해 보다 넓은 범위의 수령자에서 사용이 허용된다. 백신은 또한 현재의 인플루엔자 백신과 비교하여 보다 효과적이고 빠르게 생산됨이 예상된다. 마지막으로, 상술된 바와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 백신 디자인에서의 유연성은 필요에 따라 바이러스 서브타입을 타겟팅하면서 범용 면역성을 수립할 수 있다는 측면에서, 통상적인 인플루엔자 백신에 비해 유의한 개선이다.

본 발명의 한 구체예는 인플루엔자 감염에 대해 동물을 보호하는 방법 또는 인플루엔자 감염으로부터 야기된 하나 이상의 증상을 완화하는 방법에서 사용될 수 있는 조성물(백신)에 관한 것이다. 상기 백신은 (a) 효모 비히클; 및 (b) 효모 비히클에 의해 발현 또는 제공되는 이종성 인플루엔자 융합 단백질을 포함한다. 상술된 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 백신에서 항원으로서 사용하기 위한 여러가지 상이한 인플루엔자 융합 단백질을 포함한다. 이들 융합 단백질은 이종성 단백질의 발현을 안정화하고 발현된 이종성 단백질의 번역 후 변형을 방지하도록 디자인되며/거나, 일부 구체예에서는, 효모 비히클의 표면 상에 융합 단백질이 발현되되도록 디자인된다. 융합 단백질은 또한 넓은 세포-매개 면역 반응 및 일부 구체예에서는, 체액성 면역 반응을 제공하며, 바람직하게는 하나 이상의 상이한 인플루엔자 항원을 발현 또는 제공하며/거나 상이한 인플루엔자 항원(들)을 발현 또는 제공하는 다른 효모 비히클과 배합된다. 바람직하게는, 항원의 복합은 하나 이상의 내부 인플루엔자 항원 및 하나 이상의 외부 인플루엔자 항원을 포함한다. 본 발명의 한 구체예는 하나 이상의 그러한 융합 단백질은 (예컨대, 단백질로서) 효모 비히클 내로 로딩될 수 있거나 여기에서 기술된 다른 방식으로 복합되거나 혼합되어 본 발명의 백신을 형성할 수 있으나, 이들 융합 단백질은 대부분 전형적으로 (예컨대, 선택적으로 효모 세포질체, 효모 고스트, 또는 효모 막 추출물 또는 그의 분획로 추가적으로 가공될 수 있는 효모 스페로 플라스트 또는 비손상 효모에 의해) 효모 비히클에 의해 재조합 단백질로서 발현 또는 제공된다.

상술된 바와 같이, 본 발명의 백신 및 조성물에서 사용된 융합 단백질은 동물을 백신화시키기 위한 하나 이상의 인플루엔자 항원을 포함한다. 조성물 또는 백신은, 원하는 대로의 하나 이상의 인플루엔자 항원 중 하나 이상의 면역원성 도메인들을 포함하는, 하나, 둘, 소수의, 수 개의, 또는 다수개의 인플루엔자 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 여기에서 기술된 임의의 융합 단백질은 인플루엔자 매트릭스 단백질 (M1), 인플루엔자 이온 채널 단백질 (M2), 또는 인플루엔자 뉴클레오캡시드 단백질 (NP), 폴리머라제 PB1 (PB1) 항원, 폴리머라제 (PB2) 항원, 및 폴리머라제 PA (PA) 항원으로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 내부 인플루엔자 단백질 및/또는 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 또는 인플루엔자 뉴라미니다제 (NA)로부터 선택되는 하나 이상의 외부 인플루엔자 단백질의 적어도 일부분을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 문구 "내부 인플루엔자 단백질"은 전체적으로, 또는 대부분, 바이러스의 코어 또는 매트릭스 단백질 막 내의 바이러스 입자 내부에 포함된 인플루엔자 바이러스(임의의 종류 또는 균주)에 의해 발현되는 단백질을 말한다. 그러한 단백질은 전형적으로 바이러스 종류 및 균주들 중에서 높게 보존되어 있으며, 바이러스에 의해 풍부하게 생산될 수 있다. 여기에서 기술된 "외부 인플루엔자 단백질"은 지질막을 통해 제공되고 바이러스 입자의 표면 상에 대개 발현되는(예컨대, 바이러스 표면 단백질인) 인플루엔자 바이러스에 의해 발현되는 단백질을 말한다. 그러한 단백질은 항체에 의해 인식될 수 있으며, 그러므로 바이러스에 대한 체액성 면역 반응을 유도하기 위해 유용하다. 인플루엔자 이온 채널 단백질 (M2)은, 인플루엔자 바이러스 내에 일차적으로 함유되어 있긴 하나 (M2e로서 당업계에 알려진) 인플루엔자 바이러스의 표면상에 발현되는 작은 세포외 도메인을 갖는다. 그러므로, 본 발명의 목적을 위해, M2 단백질은 또한, 그것이 일반적으로 내부 인플루엔자 단백질로서 고려되긴 하나, 인플루엔자 바이러스에 의해 또는 그의 표면상에 적어도 세포외 도메인에 발현 또는 디스플레이하는 세포에 의해 발현될 때 항에 의해 인식될 수 있는 범위까지, 외부 인플루엔자 단백질이라고 고려될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 백신 중의 인플루엔자 항원 일부는 둘 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질로서 생산된다. 한 측면에서, 융합 단백질은 둘 이상의 면역원성 도메인 또는 하나 이상의 항원의 둘 이상의 에피토프(예컨대, 인플루엔자 M1 서열 및 인플루엔자 HA 서열)를 포함할 수 있다. 그러한 백신은 넓은 범위의 환자에서 항원-특이적 면역화를 제공할 수 있다. 예를 들어서, 본 발명에서 유용한 다중 도메인 융합 단백질은 다수의 도메인을 가질 수 있으며, 상기 각각의 도메인은 특정 단백질로부터의 펩타이드로 구성되어 있고, 상기 펩타이드는 상기 단백질 내에서 발견되는 돌연변이된 아미노산을 포함하고 그의 양 측면에 있는 적어도 4개의 아미노산 잔기로 이루어지며, 상기 돌연변이는 특정 질환 또는 용태(예컨대, 특정 균주에 의한 인플루엔자 감염)과 연관된다.

인플루엔자 유전자에 대한 핵산 및 아미노산 서열 및 그에 따라 다양한 인플루엔자 종류, 서브타입 및 균주로부터 코딩되는 폴리단백질은 당업계에 공지되어 있다. 그러므로, 여기에서 제공된 안내 및 특정 예시적인 인플루엔자 항원에 대한 언급을 이용하여, 당업자는 쉽게 본 발명의 조성물 및 백신에서 임의의 인플루엔자 균주로부터 다양한 인플루엔자-기반 융합 단백질을 생산하고 사용할 수 있을 것이다.

본 발명에서, 발명자들은 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 저해를 위해 사용하기 위한 신규한 재조합 효모 면역치료제를 만들어 냈다. 효모 면역치료제 중 하나는 유도가능한 프로모터의 조절 하에서 융합 단백질로서 인플루엔자 매트릭스 단백질 (M1)을 발현한다. 히스티딘 태그에 대한 항체를 이용한 효모 백신 세포 용해물의 이뮤노블롯 분석은 재조합 효모가 단백질을 발현하였음을 보여주었다. 림프구 증식 및 세포 독성 어세이에서 볼 수 있는 바와 같이, BALB/c 마우스에서의 M1-발현 효모 백신의 주사는 강력한 M1 항원-특이적 헬퍼 및 세포독성 T 세포 면역 반응의 유도를 나타냈다. 또다른 효모 면역치료제는 헤마글루티닌 항원 (HA) 단백질을 세포내로 발현하고, 또다른 효모 면역치료제는 헤마글루티닌 항원 (HA) 단백질을 세포외로 제공한다. 일부 면역치료제는 구성 프로모터의 조절 하에서 항원을 제공한다. 본 발명에 포함되는 다른 효모 백신은 아래에서 상세히 기술될 것이다.

본 발명의 한 측면에서, 인플루엔자 항원은 내부 인플루엔자 단백질, 매트릭스 단백질 (M1)이다. 본 발명의 한 측면에서, 인플루엔자 항원은 2 내지 252개의 아미노산의 인플루엔자 M1 단백질로 필수적으로 구성되어 있다. M1은 인플루엔자 바이러스 내의 매트릭스 단백질 막을 형성하는 대략 27 kD의 인플루엔자 단백질이다(도 1 참조). M1은 구조 단백질이고, 바이러스 어셈블리 및 리보뉴클레오단백질(RNP)의 세포질로의 핵외수송에 관여한다. M1은 인플루엔자 바이러스 중에서 높게 보존된 단백질이고, 총 바이러스 단백질의 대략 47%를 포함하는 풍부한 바이러스 단백질이다. 임의의 M1 단백질 또는 그의 일부 및 그러한 M1 단백질의 임의의 돌연변이 또는 변이체가 본 발명에서의 사용을 위해 의도된다.

실시예 1은 본 발명의 예시적인 백신 또는 백신의 성분을 생산하기 위한 매트릭스 단백질 (M1 또는 MP) 내부 인플루엔자 단백질의 이용(즉, 효모 비히클이 상이한 단백질을 발현하는 다른 효모 비히클과 복합되거나 또는 여기에서 기술된 추가적인 인플루엔자 단백질을 발현하도록 추가로 변형된다는 점에서의 성분에 대한 언급)를 기술한다. 이러한 구체예에서, 효모(예컨대, 사카로마이세스 세레비지에 W303α)는 구리-유도성 프로모터, CUP1의 조절 하에서 A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 인플루엔자 M1 융합 단백질를 발현하도록 조작되었다. 융합 단백질은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 코딩되는, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단일 폴리펩타이드이다.

본 발명의 다른 측면에서, 인플루엔자 항원은 외부 인플루엔자 단백질인, 헤마글루티닌 (HA)이다. 본 발명의 한 측면에서, 인플루엔자 항원은 2 내지 530개의 아미노산의 인플루엔자 HA 단백질로 필수적으로 구성되어 있으며, 이는 HA의 N-말단 ER-타겟팅 신호 서열을 포함하나, HA의 36개의 C-말단 잔기는 배제되어 그의 C-말단 막 앵커 및 세포질 꼬리가 제거되어 있다. 다른 측면에서, 인플루엔자 항원은 17 내지 342개의 아미노산의 인플루엔자 HA 단백질로 필수적으로 구성되며, 이는 HA의 16 개의 N-말단 ER-타겟팅 신호 서열 및 그의 C-말단 막 앵커 및 세포질 꼬리를 포함하는 HA의 36개의 C-말단 잔기를 포함하지 않는다. HA는 인플루엔자 바이러스 입자의 표면 상에서 발현되는 내부 막 단백질이다(도 1 참조). 헤마글루티닌은 바이러스가 엔도사이토시스에 의해 흡수된 후 엔도좀에서의 바이러스와 숙주 막의 뒤이은 융합 뿐만 아니라 타겟 세포 표면 상의 글리코실화된 수용체 단백질의 시알산 잔기를 통한 숙주 세포 결합을 초래한다. HA는 적어도 4 개의 주요 항원성 부위을 함유하며, 이들 4개의 영역 중 하나에서의 단일 아미노산의 치환만으로도 바이러스가 면역 감시를 피하고 매년 전세계로 퍼져나갈 수 있도록 한다. H1, H2 및 H3로 언급되는 3개의 뚜렷한 HA 단백질이 인간 감염에서 발견되며; 조류 인플루엔자 바이러스에서 발견되는 H5를 포함한, 13개의 다른 것들이 동물 인플루엔자 바이러스에서 발견된다. 임의의 HA 단백질 또는 그의 일부분 및 임의의 그러한 HA 단백질의 임의의 돌연변이 또는 변이체가 본 발명에서의 사용을 위해 예상된다. 한 구체예에서, HA를 발현하는 본 발명의 효모 비히클은 하나 이상의 HA 단백질(예컨대, H1, H2 등)을 발현하거나, 상이한 HA 단백질을 발현하는 효모 비히클과 한 백신에서 복합된다(예컨대, 하나의 비히클은 HA를 발현하고 하나의 비히클은 H2 또는 또다른 HA 단백질을 발현한다).

실시예 2는 본 발명의 또다른 예시적인 백신 또는 백신의 성분을 생산하기 위한 헤마글루티닌 (HA) 외부 인플루엔자 단백질의 이용을 기술한다. 이러한 구체예에서, 효모(예컨대, 사카로마이세스 세레비지에 W303α)는 TEF2 프로모터의 조절 하에서 융합 단백질을 발현하도록 조작되었다. A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 인플루엔자 HA 항원(H1)을 포함하는 융합 단백질은 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 코딩되는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 단일 폴리펩타이드이다.

실시예 2는 또한 또다른 헤마글루티닌 (HA) 외부 인플루엔자 단백질의 이용을 기술하며, 이 경우에서, 조류 인플루엔자 균주로부터의 H5 HA는, 본 발명의 또다른 예시적 백신 또는 백신의 성분을 생산하기 위해 사용된다. 이 구체예에서, 효모(예컨대, 사카로마이세스 세레비지에 W303α)는 융합 단백질을 발현하도록 조작되었다. A/Vietnam/1203/04 인플루엔자 바이러스로부터 유래하는 인플루엔자 HA 항원(H5)를 포함하는 융합 단백질은 서열번호 19의 핵산 서열에 의해 코딩되는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 단일 폴리펩타이드이다.

상술된 모든 융합 단백질은 효모에 의한 HA 융합 단백질의 세포내 발현을 제공하도록 디자인되었다. 요약하면, 이러한 융합 단백질은 Aga2 및HA를 위한 N-말단 신호 서열을 포함한다. Aga2의 신호 서열은 ER내로의 정좌를 위해 융합을 타겟팅하나, HA의 신호 서열은 스탑 트랜스퍼(stop transfer)로서 작용한다. 이 때문에, 융합 단백질은 분비 경로를 통해 이를 만들지 않는다. 이는 HA 일부분이 원형질막의 세포질쪽에 남는 통합 막 단백질이 된다.

실시예 2는 본 발명의 또 다른 예시적인 백신 또는 백신의 성분을 생산하기 위한 헤마글루티닌 (HA) 외부 인플루엔자 단백질의 이용을 기술한다. 이러한 구체예에서, (예컨대, 사카로마이세스 세레비지에 W303α)는 TEF2 프로모터의 조절 하에서 융합 단백질을 발현하도록 조작되었다. 이러한 융합 단백질은 효모에 의해 A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스로부터 유도되는, HA1로 언급되는 HA (H1) 항원의 N-말단 일부의 세포외 발현을 제공하도록 디자인되었다. 이러한 단백질은, Aga1p를 또한 발현하는 세포 내에서 발현될 때, 효모 세포의 외부 세포벽에 위치하나, 또한 세포내에 함유된다. 상기 융합 단백질은 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 코딩되는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 측면에서, 인플루엔자 항원은 외부 인플루엔자 단백질인 뉴라미니다제 (NA)이며, 또다른 구체예에서, NA의 면역원성 부분이 예상된다. NA는 인플루엔자 바이러스 입자의 표면 상에 발현되는 통합 막 단백질이다(도 1 참조). 뉴라미니다제는 대부분의 세포가 그들의 표면에 갖고 있는 시알산(뉴라민산)을 분해한다. 시알산은 바이러스 수용체의 일부이므로, 바이러스가 세포에 결합할 때 그것은 내면화(엔도사이토시스)될 것이다.

시알산은 뉴라미니다제에 의해 감염된 세포로부터 제거될 것이며, 이는 자손 바이러스가 확산되어 세포를 빠져나가기 쉽게 만들어준다. 뉴라미다제는 또한 호급기관에서 점막 층의 통과에 관여한다. N1 및 N2로 언급되는 두 개의 뚜렷한 NA 단백질이 인간 감염에서 발견되며, 7개의 다른 NA 단백질들이 동물 인플루엔자 바이러스에서 발견되었다. 임의의 NA 단백질 또는 그의 일부분, 및 임의의 그러한 NA 단백질의 임의의 돌연변이 또는 변이체가 본 발명에서의 사용을 위해 예상된다. 바람직한 구체예에서, NA 단백질을 발현하는 본 발명의 효모 비히클은 하나 이상의 NA 단백질(예컨대, N1, N2 등)을 발현하거나 상이한 NA 단백질을 발현하는 효모 비히클과 한 백신 내에서 복합된다(예컨대, 하나의 비히클은 NA를 발현하고 하나의 비히클은 NA 또는 또다른 NA 단백질을 발현한다).

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 백신에서 사용되는 인플루엔자 항원은 내부 또는 외부 인플루엔자 단백질인, 이온 채널 단백질 (M2)이다. 본 발명의 한 측면에서, 인플루엔자 항원은 M2e로서 알려진, 인플루엔자 M2 단백질의 세포외 부분으로 필수적으로 구성된다. 한 측면에서, M2e는 NP 인플루엔자 단백질의 C-말단 또는 그의 일부에 융합된다. 이 단백질(M2e)은 세포내(사이토졸) 발현을 위해 디자인될 수 있다. 또다른 구체예에서, M2e는 효모의 세포외 표면 상의 발현을 위한 세포벽 단백질(예컨대, Aga2)에 융합된다. M2는 매트릭스 단백질이며 매트릭스 단백질 막 및 지질 이중층을 연결하는 통합 막 단백질이며 바이러스 입자의 표면 상에서 발현된다(도 1 참조). M2는 엔도좀에서의 바이러스의 외피 제거 동안 양자가 바이러스 입자로 들어가도록 하는 이온 채널이며, 이는 또한 바이러스-감염된 세포에서의 트랜스-골지 네트워크(trans-Golgi network)의 pH를 조정한다. M2는 그의 잔기가 채널의 구멍 영역을 포함하는 단일 막관통(TM) 도메인을 갖는 97개의 호모-올리고머이다. 채널의 생물학적으로 활성인 형태는 호모테트라머(homotetramer)이다. 본 발명에서, 바이러스 상에서 외부적으로 발현되는 (즉, M2의 세포외 도메인으로 알려진) M2 단백질의 일부분은 여기에서 M2e로서 언급될 수 있다. M2e는 인플루엔자 바이러스 종류 중에서 높게 보존되어 있는 것으로 알려져 있다. 상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 한 구체예에서, 일차적으로 또는 독점적으로 M2e를 포함하는 M2 단백질의 일부분이 효모 비히클에 의해 발현된다. 이 구체예에서, M2 단백질은 외부 인플루엔자 단백질로서 고려된다. 다른 구체예에서, M2 단백질의 매트릭스 단백질 막 일부분이 발현될 때, M2 단백질은 내부 인플루엔자 단백질로서 고려될 수 있다. 임의의 M2 단백질 또는 그의 일부분 및 임의의 그러한 M2 단백질의 임의의 돌연변이 또는 변이체가 본 발명에서의 사용을 위해 예상된다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 백신에서 사용되는 인플루엔자 항원은 내부 인플루엔자 단백질인, 뉴클레오단백질로도 언급되는, 뉴클레오캡시드 단백질 (NP)이다. 본 발명의 한 측면에서, 인플루엔자 항원은 효모의 사이토졸 내에서 발현하고 면역원성인 인플루엔자 NP 단백질의 일부로 필수적으로 구성된다. NP는 매트릭스 단백질 막에 의해 형성된 쉘의 내부에 위치하는 단백질이다 (도 1 참조). NP의 일차적인 기능은 RNA 전사, 복제 및 패키징의 목적을 위해 리보뉴클레오단백질(RNP)를 형성하는 바이러스 게놈을 캡슐화하는 것이나, NP는 또한 바이러스 생활사를 통해 다른 필수적인 기능도 수행한다. NP는 타입 A, B 및 C로의 인플루엔자의 분류의 원인이 되나, 이는 바이러스 종류들 간에, 특히, 타입 A 및B 간에 여전히 매우 높게 보존되어 있다. 임의의 NP 단백질 또는 그의 일부분 및 임의의 그러한 NP 단백질의 임의의 돌연변이 또는 변이체가 본 발명에서의 사용을 위해 예상된다. 바람직한 구체예에서, NP 단백질을 발현하는 본 발명의 효모 비히클은 하나 이상의 NP 단백질 (예컨대, 타입 A 인플루엔자로부터의 NP 및 타입 B 인플루엔자로부터의 NP)을 발현하거나 상이한 NP 단백질를 발현하는 효모 비히클과 하나의 백신 내에서 복합된다 (예컨대, 한 비히클은 인플루엔자 A 타입으로부터의 NP를 발현하고 한 비히클은 인플루엔자 타입 B로부터의 NP를 발현한다).

실시예 4는 본 발명의 또다른 예시적 백신 또는 백신의 성분을 생산하기 위한 헤마글루티닌 (HA) 외부 인플루엔자 단백질의 이용을 기술한다. 이러한 구체예에서, 효모 (예컨대, 사카로마이세스 세레비지에)는 TEF2 프로모터의 조절 하에서 융합 단백질을 발현하도록 조작되었다. 이러한 융합 단백질은 효모에 의해 A/Vietnam/1203/04 인플루엔자 바이러스 균주로부터 유도된 HA (H5) 항원의 세포외 발현을 제공하도록 디자인되었다. 이 단백질은, Aga1p를 또한 발현하는 세포 내에서 발현될 때, 효모 세포의 외부 세포벽에 위치한다. 융합 단백질은 서열번호 13의 핵산 서열에 의해 코딩되는, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 5는 본 발명의 효모 비히클에 의해 발현되고, 효모 스페로플라스트(spheroplast) 상에서의 표면 발현을 포함한 표면 발현을 위한 다양한 작제들을 설명하고, 표면 발현에 대한 당화(glycosylation)의 효과를 추가로 설명하는 여러가지 HA-함유 융합 단백질들의 조작을 기술한다.

TK75-15로 표시되는 융합 단백질은 본 발명에서 서열 번호 35에 의해 코딩되며, 서열 번호 36에 의해 참조되는 융합 단백질이고, C 말단을 Aga2 서열에 두는 HA 서열을 가진 융합 단백질의 작제를 예시한다. 이 단백질은 (이 경우에, CUP 프로모터(promoter)에 의해 작동되는) Aga1p를 발현하는 효모 세포에서 발현되는 경우에, 도 10B(상부 좌측)에 도시된 바와 같이, 사이토졸(cytosol)에서 뿐만 아니라, 효모 세포의 외부 세표벽에 국한된다.

실시예 5는 또한 도 10B에 개략적으로 도시된 바와 같이, TEF2 프로모터에 의해 작동되는 Aga2 서열을 사용하여 세포벽에 인플루엔자 HA 단백질(H1)을 국한시키도록 조작되었으며, VK4라고 표시된 융합 단백질을 서술한다. 이 작제에서 단백질은 Aga2 서열에 N 말단을 위치하는 HA 서열을 가진 채 제작되었다. 이 단백질은, 천연(native) Aga1p(이 경우에, 그의 천연 프로모터)를 발현하는 효모마다 Mat에서 발현되는 경우에, 효모 세포의 외부 세포벽에 국한되고, 또한 세포내에 존재한다. 융합 단백질은 서열 번호 25의 핵산 서열에 의해 코딩되는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 5는 또한 융합 단백질이 TEF2 프로모터에 의해 작동되는 Aga2 서열을 사용하여 세포벽에 인플루엔자 H5 HA 단백질을 국한시키도록 조작되었는 점을 제외하고, 상술한 VK4와 유사한 VK 11이라고 표시되는 융합 단백질을 서술한다. 이 작제에서 단백질은 또한 Aga2 서열에 N 말단을 위치하는 HA 서열을 가진 채 제작되었다. 융합 단백질은 서열번호 21의 핵산 서열에 의해 코딩되는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 5는 또한 도 10B(하부 좌측)에 개략적으로 도시된 바와 같이, TEF2 프로모터에 의해 작동되는 Cwp2 서열을 사용하여 세포벽에 인플루엔자 HA 단백질(H1)을 국한시키도록 조작되었으며, VK8이라고 표시된 융합 단백질을 서술한다. 이 작제에서 단백질은 또한 Cwp2 서열에 N 말단을 위치하는 HA 서열을 가진 채 제작되었다. 이 단백질은 효모 세포의 외부 세포벽에 국한되고, 또한 세포내에 존재한다. 융합 단백질은 서열 번호 27의 핵산 서열에 의해 코딩되는 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 5는 또한 융합 단백질이 TEF2 프로모터에 의해 작동되는 Cwp2 서열을 사용하여 세포벽에 인플루엔자 H5 HA 단백질을 국한시키도록 조작되었는 점을 제외하고, 상술한 VK8과 유사한 VK 12라고 표시되는 융합 단백질을 서술한다. 이 작제에서 단백질은 또한 Cwp2 서열에 N 말단을 위치하는 HA 서열을 가진 채 제작되었다. 융합 단백질은 서열 번호 23의 핵산 서열에 의해 코딩되는 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 5는 또한, 도 10B(하단 우측)에서 개략적으로 보여주고 있는 Lu002로서 나타낸 융합 단백질을 기술한다. 상기 융합 단백질은 TEF2 프로모터에 의해 유도된, 효모 스페로플라스트의 원형질막 상에 손상되지 않은 막 관통 도메인을 갖는 인플루엔자 HA 단백질 서열을 발현하도록 내인성 α-인자 신호 및 리더 서열로 조작되었다. 이러한 단백질은, α-인자 신호 및 리더 서열이 골지체에서 자연적으로 절단되는 것으로부터, 효모 스페로플라스트의 막에 위치하게 되고, 또한 세포내에 존재하게 된다. 효모 분비 경로에서의 외부 단백질에 연관된 내인성 α-인자 신호 및 리더 서열의 사용은 종래에 기술되어 있다(예컨대, 미국 특허 5,413,914; 또는 Franzusoff et al J. Biol . Chem . 270, 3154-3159 (1995) 참조).

실시예 6은 본 발명의 또다른 예시적인 타모젠 또는 타모젠의 성분을 생산하기 위한 여러가지 내부 인플루엔자 단백질의 사용을 기술한다. 이러한 구체예에서, 효모(예컨대, 사이로마이세스 세레비지에)는 TEF2 프로모터의 조절 하에서 융합 단백질을 발현하도록 조작된다. 이러한 융합 단백질은 효모에 의해 A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 M1 항원 및 NP 항원, 및 A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스 균주 및 A/Vietnam/1203/04 인플루엔자 바이러스 균주로부터 유도되는 M2e 항원을 포함하는 M2e 항원의 세포내 발현을 제공하도록 디자인되었다. 본 발명의 이러한 효모-기반 백신은 인플루엔자 균주 간에 보존된 항원에 대한 상호-보호적 면역성의 유도를 위해 유용하다. 상기 융합 단백질은 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 코딩되는, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 7은 본 발명의 또다른 예시적인 타모젠 또는 타모젠의 성분을 생산하기 위한 여러 내부 인플루엔자 단백질의 사용을 기술한다. 이러한 구체예에서, 효모(예컨대, 사카로마이세스 세레비지에)는 TEF2 프로모터의 조절 하에서 발현되도록 조작되었다. 이러한 융합 단백질은 A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 NP 항원 및 A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 M2e 항원의 세포내 발현을 제공하도록 디자인되었다. 본 발명의 이러한 효모-기반 백신은 인플루엔자 균주 간에 보존된 항원에 대한 상호-보호적인 면역성의 유도를 위해 유용하다. 상기 융합 단백질은 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 코딩되는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 한 구체예에서,상술된 임의의 인플루엔자 바이러스 항원은 하나 이상의 다른 인플루엔자 바이러스 항원과 함께 본 발명의 효모 비히클 내에서 발현된다. 바람직하게는, 내부 인플루엔자 항원 (예컨대, M1, M2 또는 NP)은 외부 인플루엔자 항원 (예컨대, HA, NA, 또는 M2e)과 함께 발현된다. 인플루엔자 항원은 동일 또는 상이한 구조물을 이용하여 발현될 수 있다. 외부 인플루엔자 항원은 효모에 의해 세포외로 및/또는 세포내로 제공될 수 있다. 효모 비히클에 의해 발현될 항원의 바람직한 복합은, 이에 제한되는 것은 아니나, M1 및 HA; M1 및 NA; M1, HA 및 NA; NP 및 HA; NP 및 NA; NP, HA 및 NA; M2 및 HA; M2 및 NA; M2 및 M1; M2, HA 및 NA; 및 M1, M2 및 NA을 포함한다. M2를 포함하는 임의의 이들 복합 중에서, M2는 전장 M2 또는 M2e, 또는 효모 내에서 발현 또는 제공될 수 있고 면역원성인 M2의 임의의 일부분일 수 있다. 유사하게, 다른 단백질 또한 임의의 형태, 일부분 또는 여기에서 기술된 변이체로서 발현될 수 있다. 이들 복합에서, 단백질의 임의의 하나 이상의 서브타입,특히, HA 또는 NA의 임의의 하나 이상의 서브타입이 발현 또는 제공될 수 있다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 하나 이상의 인플루엔자 항원 또는 그러한 항원의 복합을 발현하거나 제공하는 상술된 임의의 효모 비히클은 효모 백신을 형성하는 하나 이상의 상이한 항원 또는 항원의 복합을 발현 또는 제공하는 효모 비히클과 함께 복합된다. 다르게는, 하나 이상의 인플루엔자 항원을 발현 또는 제공하는 상술된 임의의 효모 비히클은 하나 이상의 상이한 항원 또는 항원의 복합을 발현하는 효모 비히ㅋ르과 함께 순차적으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 하나 이상의 내부 인플루엔자 항원을 발현 또는 제공하는 효모 비히클은 하나 이상의 외부 인플루엔자 항원을 발현 또는 제공하는 인플루엔자 항원과 함께 복합되거나 순차적으로 투여될 수 있다. 효모 비히클의 바람직한 복합은 이에 제한되는 것은 아니나, HA, NA, 또는 그의 복합(이들 항원의 하나 이상의 서브타입 포함)을 발현 또는 제공하는 효모 비히클과 함께 또는 순차적으로 투여되는 M1을 발현 또는 제공하는 효모 비히클; HA, NA, 또는 그의 복합(이들 항원의 하나 이상의 서브타입 포함)을 발현 또는 제공하는 효모 비히클과 함께 또는 순차적으로 투여되는 NP를 발현 또는 제공하는 효모 비히클; 및 HA, NA, 또는 그의 복합(이들 항원의 하나 이상의 서브타입 포함)을 발현 또는 제공하는 효모 비히클과 함께 또는 순차적으로 투여되는 M2를 발현 또는 제공하는 효모 비히클을 포함한다. 또다른 구체예에서는, 임의의 2이상의 NP 및/또는 M2를 발현 또는 제공하는 효모 비히클은 HA, NA, 또는 그의 복합(이들 항원의 하나 이상의 서브타입 포함)을 발현 또는 제공하는 효모 비히클과 함께 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

단리된 융합 단백질, 핵산 분자 및 세포

본 발명의 다른 구체예는 명세서에 기술된 인플루엔자 항원을 포함하는 임의의 단리된 융합 단백질을 포함하는, 단리된 단백질을 포함한다. 또한, 본 발명에서는 상기 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 재조합 핵산 분자, 그러한 핵산 분자 또는 재조합 핵산 분자를 포함하거나 형질감염/형질전환된 세포 및 바이러스 벡터를 포함한 벡터를 포함한다.

본 발명에 따른 바람직한 융합 단백질은 본 발명에서 설명된 융합 단백질을 포함한다. 본 발명에 의해 포함되는 예시적 융합 단백질은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 10, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 이루어지는 융합 단백질을 포함한다. 다양한 융합 단백질 서열이 당업계에 공지되어 있으므로 다른 융합 단백질은 본 발명에서 제공된 지침이 주어진 바 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 이루어지는 핵산분자를 포함한다.

본 발명에 따른 재조합 핵산 분자로 형질감염할 적합한 숙주 세포는 동물, 곤충, 박테리아, (효모를 포함한) 균류 세포를 포함하여 형질감염 또는 형질전환될 세포를 포함한다. 한 구체예에서는, 숙주 세포는 본 발명의 융합 단백질로 형질감염되고 발현하는 동물 세포이다. 그러한 세포는 실시예 부분에서 예시되며, 예를 들어, 본 발명의 백신 또는 조성물에 의해 유도된 항원 특이적 T 세포 반응을 평가하는데 유용하다. 인플루엔자 항원에 대한 다른 백신 또는 조성물도 그러한 형질감염된 종양 세포에서 검사될 수 있다.

하기 실험 결과들은 예시의 목적으로 제공된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하도록 의도된 것이 아니다.

도 1은 인플루엔자 바이러스 및 그의 여러 구성 성분을 설명해 주는 개략도이다. 보다 높게 보존된 일부 항원이 동그라미로 표시되어 있다.

도 2는 효모에서의 인플루엔자 매트릭스 단백질 1 (M1, MP 또는 MP1로도 언급)의 세포내 발현을 보여주는 웨스턴 블롯의 디지털 이미지이다.

도 3A 및 3B는 인플루엔자 매트릭스 단백질 (M1)을 발현하는 효모 비히클로 마우스를 면역화시켜 인플루엔자 감염된 타겟 세포들을 죽이는 M1-특이적 (도 3A) 및 인플루엔자 바이러스-특이적 (도 3B) 세포독성 T 세포 (CTL)를 세포내적으로 유도한 CTL 어세이의 결과를 보여준다.

도 4는 P815 세포가 CTL 어세이에서 타겟 세포로서 사용되고 인플루엔자 바이러스로 감염될 수 있음을 설명해 주는, 인플루엔자 A/PR/8/34로 감염된 P815 세포의 용해물의 웨스턴 블롯의 디지털 이미지이다.

도 5는 인플루엔자 매트릭스 단백질 (M1 또는 MP)을 발현하는 효모 비히클로의 마우스를 면역화시켜 M1-특이적 T 세포 반응을 세포내적으로 유도한 T 림프구 증식 어세이의 결과를 보여준다.

도 6은 인플루엔자 매트릭스 단백질 (M1) 을 발현하는 효모 비히클로 마우스를 면역화시켜 인플루엔자-특이적 T 세포 반응을 세포내적으로 유도한 T 림프구 증식 어세이의 결과를 보여준다. .

도 7은 효모에서 Aga2 (Aga2-HA)에 융합된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)의 세포내 발현을 설명해 주는, 웨스턴 블롯의 디지털 이미지(위)와 융합 구조체의 개략도(아래)이다.

도 8은 Aga2에 융합된 인플루엔자 헤마글루티닌(HA)(Aga2-HA)을 발현하는 효모 비히클를 두 가지 다른 경로로 투여하여 마우스를 면역화시켜 인플루엔자 바이러스-특이적 CTL 반응을 세포내적으로 유도한 CTL 어세이의 결과를 보여준다.

도 9는 Aga2에 융합된 인플루엔자 헤마글루티닌(HA)(Aga2-HA)을 발현하는 효모 비히클을 두 가지 다른 경로로 투여하여 마우스를 면역화시켜 인플루엔자 바이러스-특이적 T 림프구 증식 반응을 세포내적으로 유도한 T 림프구 증식 어세이를 보여준다.

도 10A는 효모 비히클의 표면에 관심있는 임의의 타겟 항원을 위치시키고 발현시키는 타모젠(Tarmogen) 구조체의 개략도를 묘사한 것이다(상단). 하단은 GI-8003로서 알려져 있는 특이적 타모젠을 보여준다. GI-8003은 Aga2-HA 융합 단백질로서 인플루엔자 A/PR/8/34 HA (H1)을 세포외적으로 디스플레이(그의 표면 상에 디 스플레이)하도록 조작되어 있는 효모 비히클이다. 웨스턴 블롯의 디지털 이미지는 Aga2-HA 단백질의 발현이 나타남을 보여준다.

도 10B는 효모 표면에 항원이 디스플레이될 수 있도록 조작된 예시적 구조체를 묘사하고 있다. 이 도면은 다양한 효모 단백질이 어떻게 스페이서 암(spacer arms)으로서 사용될 수 있는지에 대한 예를 보여주는 개략도이다.

도 11은 세포벽 단백질 2(cwp2)를 통해 효모 표면에서 인플루엔자 HA 단백질을 발현하는, 도 10B에서 VK8로 언급된 융합 단백질을 발현하는 타모젠을 묘사하고 있으며, 효모 비히클 단독(GI-1001 또는 YVEC)과 비교한, 손상되지 않은 세포의 유세포측정분석으로부터의 효모 표면 HA (또한 GI-8000-S로서 알려져 있는 타모젠) 발현의 히스토그램을 보여준다.

도 12A-12G는 (상기 기술되고 도 10B에서 설명된) 표면 상에 인플루엔자 HA 단백질을 위치시키기 위한 다양한 접근법이 사용된 히스토그램을 보여준다. 도 12A는 도 12B 및 12C에 대한 효모 대조군(YEX) 을 보여준다. 도 12B-12C는 타모젠을 발현하는 VK4 (도 12B) 및 TK75-15 (도 12C)에 의한 발현을 보여준다. 도 12D는 도 12E-12G에 대한 효모 대조군(YEX)을 보여준다. 도 12E 및 12F는 효모가 글리코실화 (도 12E) 및 탈글리코실화 (도 12F)될 때, 효모에 의한 HA VK8의 발현을 보여준다. 도 12G는 Lu002-발현 스페로플라스트 작제물의 원형질막 상의 HA의 발현을 보여준다.

도 13A 및 13B는 보존된 인플루엔자 항원 M1, NP 및 M2 (도 13A)과 결합할 수 있는 세포외(도 13B) 및 세포내(도 13A) 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)의 발현 을 위한 구조물의 개략도이다.

도 14A 및 14B는 사용된 세 가지 처방에 대한(도 14A) T 세포 프라이밍(priming)(도 14B) 및 항체 생산(도 14A)을 보여준다. 처방 A는 오직 PBS만을 사용한다(대조군). 처방 B는 0일 및 28일에 프라이밍을 위해 PBS를 사용하고, 56일에 부스팅을 위해 가용성 오브알부민 단백질 (ova)을 사용하다. 처방 C는 프라이밍을 위해 오브알부민(OVAX)을 발현하는 효모 비히클을 사용하고, 가용성 오브알부민을 부스팅을 위해 사용하였다. 도 14B는 상술된 세 개의 처방 각각에 의해 면역화된 마우스로부터 수확한 T 세포의 인 비트로 재자극을 위해 가용성 오브알부민 단백질의 다양한 양을 이용한 T 세포 활성화 어세이의 결과를 보여준다.

도 15는 HIV Gag 단백질을 발현하는 타모젠 GI-2010을 그의 항체 반응을 준비하는 능력에 대해 아무 것도 코딩하지 않는 생 백시나 바이러스(대조군) 또는 HIV-Gag 단백질을 코딩하는 생 백시나 바이러스(바이러스)로 감염 후 관찰된 체액성 반응과 비교하여 실험한 실험 결과를 보여준다. 식염수 및 대조군 곡선은 GI-2010 및 YVEC 선 아래에 있다(즉, GI-2010 및 YVEC 선은 식염수 및 대조군 선 상에 포개져 있다).

도 16A 및 16B는 항체 반응이 시도되는 항원으로부터 유도된 펩타이드에 대한 헬퍼 T 세포 반응으로부터 유도된 신호 및 B 세포 활성화를 결합하기 위한 요구를 보여주는 개략도이다(신호 1은 도 16A에서 볼 수 있고, 신호 2는 도 16B에서 볼 수 있다).

도 17은 Aga2에 융합된 인플루엔자 HA1 도메인(Aga2-HA1)의 세포 표면 발현 을 보여주는 웨스턴 블롯의 디지털 이미지이다.

<실시예 1>

하기 실시예에는 본 발명의 인플루엔자 M1 융합 단백질 효모 백신, GI-8001(또한 도면 일부에서 언급된 GI-8000)를 설계하는 기술이 기재되어 있다.

구리 유도성 프로모터, CUP1의 조절 하에서 인플루엔자 M1 융합 단백질을 발현하기 위한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 설계하였다. 상기 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 골격 내에 융합된 다음의 서열 요소들을 갖는 단일 폴리펩타이드이다(융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 4로 나타냄):

1) 프로테오좀에 의한 분해(proteasomal degradation) (서열번호 4의 1 내지 6번 위치)에 내성을 갖는 서열 MADEAP(서열번호 1);

2) M1 단백질의 2 내지 252번까지의 아미노산(서열번호 4의 7 내지 257번 위치);

3) 히스티딘 태그로부터 M1 단백질을 분리하기 위해 도입된 트리글리신 스페이서(서열번호 4의 258 내지 260번 위치); 및

4) C-말단의 6개의 히스티딘(hexahistidine) 태그(서열번호 4의 261 내지 266번 위치).

서열번호 2의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1로 나타내었 다.

이러한 전형적인 효모-기반 백신에서, M1 유전자는 인플루엔자 A/PR/8/34/H1N1에 의해 감염된 배양 세포로부터 RT-PCR을 이용하여 클로닝하였고, 코딩된 아미노산 서열은 상기 균주/유전자형으로부터 얻을 수 있는 이론상의 M1 아미노산 서열과 정확히 일치하였다.

인플루엔자 M1 융합 단백질을 발현하는 효모(사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) W303) 의 성장 및 유도는 ULDM 배지에서 수행하였다. 상기 배지의 pH는 본 실시예에서 기재된 바와 같이 중성의 pH 조건으로 조정하지는 않았다(즉, 통상의 효모 성장 조건을 이용함). 0.375 mM 황산구리를 0.2 YU/mL 첨가한 조건에서 인플루엔자 M1 융합 단백질의 발현을 유도하였다. 중기 지수기(mid-exponential phase)에서 효모를 수확하고 열을 가하여 사멸하였다. 구리에 의해 유도되고, 열에 의해 불활성화된 GI-8001 효모 파쇄물의 웨스턴 블롯 어세이를 통해 M1 융합 단백질의 발현을 확인하였다(도 2 참조). 단백질 검출을 위해 단클론성 항체 특이적 히스티딘 태그를 사용하였다. ULDM 배지의 일반 조성은 다음과 같다.

PBS 만, 또는 M1 단백질을 발현하는 GI-8001 효모-기반 백신 1YU 또는 10YU(도 3A 및 3B에서 각각 "1YU M1" 및 "10YU M1"로 나타냄)를 BALB/c 암컷 마우스에 3주간 주사하였다. 마지막 주사 후 16일째에 상기 마우스를 희생시켰다. CTL 반응 및 림프구 증식을 평가하기 위해 표적(IVS-M1)으로서 M1 단백질을 발현하는 효모를 이용하거나, 표적(IVS-flu)으로서 감작된 flu 바이러스를 이용하여 생체외 자극 어세이(In vitro stimulation assays)를 실시하였고, 사이토카인 어세이를 위해 상등액을 수집하였다.

P815 종양세포에 인플루엔자 M1 융합 단백질을 감염시키거나, 또는 이들 분석 시 표적 세포로 인플루엔자를 감염시켰다. CTL 어세이 결과는 도 3에 나타내었다. GI-8001 백신을 마우스에 처리할 경우 항원-특이적(M1 및 인플루엔자 바이러스) CTL 반응이 유도되었다.

도 4는 인플루엔자 A/PR/8/34에 의해 감염된 P815 세포 파쇄물에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다. HA는 상등액에서 동정되었는데, 이는 P815 세포가 인플루엔자 바이러스에 감염될 수 있고, 상기 어세이 시 표적 세포로 이용될 수 있 음을 예증하는 것이다.

도 5 및 도 6은 림프구 증식 어세이 결과를 나타낸 것이다. 도 5에서, 자극 항원은 M1 융합 단백질을 발현하는 효모(MP 효모) 파쇄물에 존재하였다. 도 6에서, 자극 항원은 인플루엔자(A/PR8)를 죽였다. 이 결과는 GI-8001(GI-8000, M1 단백질을 발현하는 효모)이 효모-특이적 증식 반응을 유도함을 나타내는 것이다.

<실시예 2>

하기 실시예는 첫째로, H1 HA(또한, GI-8002 또는 GI-8000-I로 표시됨), 둘째로, H5 HA(또한, GI-8102로 표시됨)를 이용하여 헤마글루티닌(HA)을 세포 내에서 발현하는 본 발명의 두 개의 효모-기반 백신을 설계하는 기술이 기재되어 있다.

세포 내 발현을 위한 H1 - HA 의 제조

전사 신장 인자 2 프로모터 TEF2(도 7의 하단 참조)의 조절 하에서 HA(H1 또는 HA1) 융합 단백질을 세포 내에서 발현하기 위한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 설계하였다. 인플루엔자 HA 항원을 포함하는 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 골격 내에 융합된 다음의 서열 요소들을 갖는 단일 폴리펩타이드이다(융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 나타냄):

1) ER-타겟팅 시그널 서열의 본래의 18개의 아미노산(서열번호 6의 1 내지 18번 위치)을 포함하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Aga2 단백질 서열의 전장(서열번호 6의 1 내지 87번 위치);

2) HA의 N-말단의 ER-타겟팅 시그널 서열(서열번호 6의 88 내지 105번 위치)을 포함하나, HA의 C-말단 잔기의 36번 아미노산이 제외되어 C-말단 멤브레인 앵커(anchor) 및 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)가 제거된 인플루엔자 HA 단백질의 2 내지 530번까지의 아미노산(서열번호 6의 88 내지 616번 위치);

3) 히스티딘 태그로부터 HA 단백질 체를 분리하기 위한 트리글리신 스페이서(서열번호 6의 617 내지 619번 위치); 및

4) C-말단의 6개의 히스티딘(hexahistidine) 태그(서열번호 6의 620 내지 625번 위치).

서열번호 6의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 5로 나타내었다. 상기 융합 단백질 및 그것을 발현하는 타모젠(Tarmogen)을 GI-8000 Aga2-HA 또는 GI-8002라 하였다.

이러한 전형적인 효모-기반 백신에서, HA 유전자는 인플루엔자 A/PR/8/34/H1N1에 감염된 배양 세포로부터 클로닝하였고, 코딩된 아미노산 서열은 균주/유전자형으로부터 얻을 수 있는 이론상의 HA 아미노산 서열과 정확히 일치하지는 않는다. 실제 및 이론상의 서열 배열은 표 1에 나타내었다(실시예 2 참조).

TEF2::Aga2-HA 플라스미드가 탑재된 효모를 UDM 배지에서 중기-지수기까지 배양하였다. 상기 배지를 이용한 배양 조건은 중성의 pH 조건으로 조정하지는 않았다. 세포를 세척하고, 열처리한 다음, 세포로부터 총 단백질을 추출하였다. 상기 단백질을 발현하고, 열에 의해 불활성화된 효모 파쇄물에 대한 웨스턴 블롯 어세이를 통해 HA 융합 단백질의 발현을 확인하였다(도 7). 총 단백질의 웨스턴 블롯 시 프로브로 상기 단백질의 태그 mAb(도 7의 우측) 또는 HA-특이적 mAb(미도시됨)를 사용하였으며, Aga2-HA 단백질은 효모에서 높은 수준으로 축적되었다. UDM 배지의 일반 조성은 다음과 같다.

5 내지 10 주령된 BALB/c 암컷 마우스에 피하(100㎕) 또는 비강 투여(50㎕) 중 어느 하나를 이용하여 1주에 한 번씩 3주 동안 PBS, 0.5YU의 GI-8000 Aga2-HA (GI-8002) 또는 5YU의 GI-8000 Aga2-HA (GI-8002)를 투여하였다. 세 번째 투여 후 2주째에 마우스를 희생시켰다. 어세이를 위해 혈청을 수집하고, CTL 반응(A/PR/8/34 flu 바이러스로 오버나이트 동안 감염시킨 ⁵¹Cr로 표지된 동계 P815 종양세포를 이용함) 및 림프구 증식을 평가하기 위해 비장세포에서 생체외 자극 어세이(In vitro stimulation assays)를 실시하였다. 증식 어세이를 위해, 비장세포를 GI-8000 Aga2-HA (GI-8002) 또는 UV에 의해 불활성화된 A/PR8 인플루엔자 바이러스와 함께 5일간 배양하였다. 혈청을 수집하여 항체 분석에 사용하였다.

도 8은 CTL 어세이 결과를 나타낸 것이고, 도 9는 림프구 증식 어세이 결과를 나타낸 것이다. 이들 결과로부터, GI-8000 Aga2-HA는 인플루엔자 바이러스-특이적 CTL 반응을 유도함을 알 수 있었다. 피하 경로를 통한 투여가 비강 투여보다 대체로 더욱 강한 CTL 반응을 유도하였다. 그러나, 적은 함량의 비강 투여는 CTL 반응을 높은 수준으로 유도하였다. 증식 어세이 결과, 비강 투여 경로가 피하 투여와 비교하여 더 낮은 수준으로 증식 반응을 생산하긴 하였으나, 두 가지 투여 경로 모두 인플루엔자 바이러스-특이적 림프구 증식을 유도하였다.

또한, 애주번트로서 체액성 반응을 유도할 수 있는 능력을 평가하기 위해 상기에서 기재된 세포 내 항원으로 HA를 발현하는 타모젠을 평가하였다. 특히, 애주번트(애주번트는 본 실시예에서 기재된 GI-8000-I 타모젠임) 또는 Alum을 첨가하거나, 또는 첨가하지 않고 0일과 21일째에 두 가지 용량의 항원(A/PR/8/34 유래의 HA)을 제공하였다. 두 번째 항원 첨가 후 3주 동안 HA 중화항체 역가를 측정하였다. 실험 결과는 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타난 바와 같이, GI-8000은 B 세포 반응을 위한 애주번트로서 제공할 수 있는 우수한 능력이 있다. 사실 애주번트로서 alum을 첨가하거나 또는 그렇지 않은 경우에서 분리한 단백질과 비교하면 비슷하거나 더 낫다. 따라서, 항체 반응에서 동일한 효율에 도달하기 위해 낮은 함량의 비효모-기반 백신이 사용될 수 있다(즉, 용량 절감).

또한, 인플루엔자에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는 능력을 평가하기 위해 상기에서 기재된 세포 내 항원으로서 HA를 발현하는 타모젠을 평가하였다. 10㎍의 HA를 제공하기 위해 충분한 수의 불활성화된 A/PR/8/34 비리온을 이용하여 프라이밍을 수행하였다. 부스트(boost)는 한 달 후에 제공하였다. 다음 한 달 후에 HI 역가(HA 중화항체에 대한 억제능)를 측정하였다. HI 역가를 측정한 시간과 동일한 시간대에 테스트를 실시하였다. 바이러스 역가는 5일 후에 측정하였다. flu에 대한 프라이밍에 GI-8000-I를 이용한 결과는 표 3에 나타내었다.

이러한 타입의 타모젠을 이용하여, flu에 의해 감염된 세포에서 복수의 항원에 대한 T 세포를 생산하였다. 복수의 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 장점은 교차 보호 반응이 가능하고, 만능 백신으로 작용하는 복수의 항원의 타모젠 발현이 가능하다는 점이다. 효과적인 면역 반응을 도출함으로써, 이러한 타입의 백신은 조류 또는 계절 인플루엔자의 flu에 대한 종래의 백신과 비교하여 용량 절감형일 수 있다(즉, 효능에 필요한 최소 용량).

세포내 발현을 위한 H5 HA 제조

HA(H5) 융합 단백질(GI8102로 언급됨)의 세포 내 발현을 위한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 설계하였다. 상기 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 골격 내에 융합된 다음의 서열 요소들을 갖는 단일 폴리펩타이드이다(융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 20으로 나타냄):

1) ER-타겟팅 시그널 서열의 본래의 18개의 아미노산(서열번호 20의 1 내지 18번 위치)을 포함하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Aga2 단백질 서열의 전장(서열번호 20의 1 내지 87번 위치);

2) H1 HA의 1 내지 16번 잔기에 해당하는 N-말단의 ER-타겟팅 시그널 서열(서열번호 20의 88 내지 105번 위치);

3) HA의 C-말단 잔기의 36번 아미노산이 제외되어 C-말단 멤브레인 앵커 및 세포질 꼬리가 제거된 조류의 flu 균주 A/Vietnam/1203/2004 의 H5 HA(서열번호20의 106 내지 620번 위치) 아미노산 서열; 및

4) C-말단의 6개의 히스티딘(hexahistidine) 태그(서열번호 20의 621 내지 626번 위치).

서열번호 20의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 19로 나타내었다.

<실시예 3>

하기 실시예는 효모 백신(일반적으로 GI-8000-S로 언급될 수 있음)에서 HA1으로 언급되는 본 발명의 다른 HA 융합 단백질을 설계하는 기술이 기재되어 있다.

상기 융합 단백질은 효모에 의한 HA 융합 단백질의 세포 내뿐만 아니라 세포 외 발현이 가능하도록 디자인하였다. 인플루엔자 HA 항원(HA1)의 N-말단 부분을 포함하는 상기 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 골격 내에 융합된 다음의 서열 요소들을 갖는 단일 폴리펩타이드이다(융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 나타냄):

1) ER-타겟팅 시그널 서열의 본래의 18개의 아미노산(서열번호 10의 1 내지 18번 위치)을 포함하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Aga2 단백질 서열의 전장(서열번호 10의 1 내지 89번 위치);

2) HA의 N-말단 ER-타겟팅 시스널 서열인 16개의 아미노산, 및 HA의 C-말단 잔기의 36번 아미노산이 제외되어 C-말단 멤브레인 앵커 및 세포질 꼬리를 포함하는 인플루엔자 HA 단백질의 17 내지 342번까지의 아미노산(서열번호 10의 90 내지 415번 위치);

3) 히스티딘 태크로부터 HA1 단백질 체를 분리하기 위한 트리글리신 스페이서(서열번호 10의 416 내지 418번 위치); 및

4) C-말단의 6개의 히스티딘(hexahistidine) 태그(서열번호 10의 419 내지 424번 위치).

Aga1p를 발현하는 세포에서 발현되는 경우, 상기 단백질은 효모 세포의 외벽에 위치한다(본 기술을 이용한 세포 외 발현을 도시한 도 10A 참조). 상기 단백질은 또한 세포 내에서 발현될 것이다. 서열번호 10의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 9로 나타내었다.

이러한 전형적인 효모-기반 백신에서, HA 유전자는 인플루엔자 A/PR/8/34/H1N1 에그 스톡(egg stock)으로부터 클로닝하였고, 코딩된 아미노산 서열은 이 균주/유전자형으로부터 얻을 수 있는 이론상의 HA 아미노산 서열과 정확히 일치하는 것은 아니다. 실제 및 이론상의 서열 배열은 표 4에 나타내었다. 두 개의 서열 간에는 10개의 아미노산의 불일치가 발견되었다.

구리에 의해 유도되고, 열에 의해 불활성화된 효모 파쇄물의 웨스턴 블롯 어세이를 통해 융합 단백질의 발현을 확인하였다(도 17 참조). UDM 배지에서 구리 유도 후, Aga1 합성을 유도하기 위한 통상의 조건(중성 pH는 아님) 하에서, 구성적으로 발현되는 Aga2-HA1는 50mM DTT 처리 시 생존 세포의 세포 표면에서 Aga1로부터 방출되었고, DTT 용출물에 글리코시다아제 효소 PNGase F 또는 ENDO-h를 1시간 동안 처리하였다. 웨스턴 블롯을 통해 상기 반응을 어세이하여 Aga-HA1 함량을 측정하였다(도 17 참조). 세포 내 및 세포 표면 HA1 발현이 둘 다 관찰되었다.

<실시예 4>

하기 실시예에는 본 발명의 다른 HA 융합 단백질 효모 백신을 설계하는 기술이 기재되어 있다.

효모 세포 표면(세포 외) 단백질로서 조류의 flu 균주 A/Vietnam/1203/2004 유래의 헤마글루티닌(HA) 단백질, H5(H5-N1)를 발현하기 위해, 세포 내에 위치할 TK88 (Aga2-H5 HA)로 언급되는 다른 효모 비히클을 설계하였다.

도 10A의 상단 패널에 표면 발현을 위한 구조물을 예시하였다. 인플루엔자 HA 항원(H5)을 포함하는 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 골격 내에 융합된 다음의 서열 요소들을 갖는 단일 폴리펩타이드이다(융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 14에 나타냄):

1) ER-타겟팅 시그널 서열의 본래의 18개의 아미노산을 포함하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Aga2 단백질 서열의 전장(서열번호 14의 1 내지 87번 위치);

2) HA의 N-말단 ER-타겟팅 시스널 서열이 없고, HA의 C-말단 잔기의 36번 아미노산이 제외되어 C-말단 멤브레인 앵커 및 세포질 꼬리가 제거된 인플루엔자 H5 HA 단백질의 2 내지 530번까지의 아미노산(서열번호 14의 88 내지 616번 위치);

3) 히스티딘 태그로부터 HA 단백질 체를 분리하기 위한 트리글리신 스페이서(서열번호 14의 617 내지 619번 위치); 및

4) C-말단의 6개의 히스티딘(hexahistidine) 태그(서열번호 14의 620 내지 625번 위치).

또한, Aga1p를 발현하는 세포에서 발현되는 상기 단백질은 세포질 및 ER 뿐만 아니라 효소 세포의 외벽에도 위치한다. 서열번호 14의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 13에 나타내었다.

여기에서 기재된 중성 pH 조건 및 정상 효모 성장 조건 하에서 상기 타모젠을 발현시켰다. 중성 pH 조건에서 발현될 때, 융합 단백질은 세포벽(표면)에서 검출된다. 중성 pH 조건은 단백질의 발현 효율을 증가시키고, 세포벽에 대한 pH 효과로 인해 표면에서 단백질의 존재를 검출할 수 있는 능력과 표면 발현된 단백질을 검출하기 위한 HA-특이적 항체의 능력을 개선한다.

<실시예 5>

하기 실시예에는 항원이 효모 표면에 표적화되도록 설계된 부가적인 구조물(세포 외 구조물)의 생산이 기재되어 있다.

효모 세포 표면(세포 외) 단백질로서 인플루엔자 유래의 헤마글루티닌(HA) 단백질을 발현하는 부가적인 타모젠을 설계하였다. 상기 단백질은 또한 효모의 세포 내에서도 발현된다. 도 10A의 상단 패널에 표면 발현을 위한 구조물을 예시하였다.

도 10B는 항원의 표면 발현을 위한 몇 개의 특이 구조물을 도식적으로 예시하였고, 다양한 효모 단백질들이 어떻게 스페이서 암으로 이용될 수 있는 지를 나타내고 있다. 상기 구조물들은 인플루엔자 HA를 발현하는데 이용되는 한편, 이들 방법 및 구조물을 이용하여 임의의 단백질이 발현될 수 있다.

Aga2 - HA H1 융합 단백질(표면)

도10B의 상단 좌측에 있는 융합 단백질 TK75-15는 TEF2 프로모터의 조절을 받는 Aga2 서열을 이용하여 세포벽에 인플루엔자 HA 단백질을 발현하기 위해 설계되었다. 이 구조물에서, 단백질은 Aga2 서열에 대해 HA 서열 C-말단을 갖도록 구축되었다. 도 10B의 상단 좌측에 나타난 바와 같이, 이 단백질은 Aga1p를 발현하는 세포에서 발현될 때(이 경우, CUP1 프로모터 조절을 받음) 세포질뿐만 아니라 효모 세포의 외벽에도 위치한다. 인플루엔자 HA 항원을 포함하는 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 골격 내에 융합된 다음의 서열 요소들을 갖는 단일 폴리펩타이드이다(융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 36으로 나타냄):

1) ER-타겟팅 시그널 서열의 본래의 18개의 아미노산(서열번호 36의 1 내지 18번 위치)을 포함하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Aga2 단백질 서열의 전장(서열번호 36의 1 내지 87번 위치);

2) HA단백질 체로부터 Aga2를 분리하기 위한 스페이서(88 및 89번 위치);

3) 시그널 서열이 없고, HA의 C-말단 잔기의 36번 아미노산이 제외되어 C-말단 멤브레인 앵커 및 세포질 꼬리가 제거된 인플루엔자 HA 단백질(서열번호 36의 90 내지 600번 위치);

4) 히스티딘 태그로부터 HA 단백질 체를 분리하기 위한 트리글리신 스페이서(서열번호 36의 601-603 위치); 및

5) C-말단의 6개의 히스티딘(hexahistidine) 태그(서열번호 36의 604 내지 609번 위치).

서열번호 36의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 35에 나타내었다. 상기 융합 단백질 및 이를 발현하는 타모젠을 75-15라 한다.

HA H1 - Aga2 융합 단백질(표면)

도 10B의 상단 우측에 있는 융합 단백질 VK4는 TEF2 프로모터의 조절을 받는 Aga2 서열을 이용하여 세포벽에 인플루엔자 HA 단백질을 발현하기 위해 설계되었다. 이 구조물에서, 단백질은 Aga2 서열에 대해 HA 서열 N-말단을 갖도록 구축되었다. 이 단백질은 또한 원래의 Aga1p를 발현하는 효모에서 발현될 때(이 경우, 원래의 프로모터의 조절을 받음) 효모 세포의 외벽에 위치하며, 또한 세포 내에서도 발견된다. 인플루엔자 HA 항원(H1)을 포함하는 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 골격 내에 융합된 다음의 서열 요소들을 갖는 단일 폴리펩타이드이다(융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 26으로 나타냄):

1) Aga2 ER-타겟팅 시그널 서열(서열번호 26의 1 내지 19번까지의 아미노산);

2) 시그널 서열 및 C-말단 트랜스멤브레인 도메인이 없는 A/PR/8/34 유래의 H1 HA(서열번호 26의 20 내지 533번 위치);

3) 히스티딘 태그로부터 HA 단백질 체를 분리하기 위한 스페이서(서열번호 26의 534 및 535번 위치);

4) 6개의 히스티딘 태그(서열번호 26의 536 내지 541번 위치);

5) 엔테로키나아제 분할 사이트(서열번호 26의 542 내지 548번 위치);

6) 시그널 서열이 없는 Aga2(서열번호 26의 549 내지 614번 위치).

서열번호 26의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 25로 나타내었다.

HA H5 - Aga2 융합 단백질(표면)

조류 인플루엔자(A/Vietnam/1203/04) 유래의 H5 HA 단백질을 포함하고 있는 점을 제외하고는 상기에서 기술한 VK4와 유사한 융합 단백질 VK11은 Aga2 서열을 이용하여 세포벽에서 인플루엔자 HA H5 단백질을 발현하기 위해 설계되었다. 이 구조물에서, 단백질은 Aga2 서열에 대해 HA 서열 N-말단을 갖도록 구축되었다. 이 단백질은 효모에서 발현될 때 효모 세포의 외벽에 위치하며, 또한 세포 내에서도 발견된다.

인플루엔자 HA 항원(H5)을 포함하는 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 골격 내에 융합된 다음의 서열 요소들을 갖는 단일 폴리펩타이드이다(융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 22로 나타냄):

1) Aga2 ER-타겟팅 시그널 서열(서열번호 22의 1 내지 19번까지의 아미노산)

2) 시그널 펩타이드 및 C-말단 트랜스멤브레인 도메인이 없는 A/Vietnam/1203/04 유래의 H5 HA (서열번호 22의 20 내지 536번 위치);

3) 6개의 히스티딘 태그(서열번호 22의 537 내지 542번 위치);

4) 엔테로키나아제 분할 사이트(서열번호 22의 543 내지 548번 위치); 및

5) 시그널 서열이 없는 Aga2(서열번호 22의 549 내지 616번 위치)

서열번호 22의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 21로 나타내었다.

HA H1 - Cwp2 융합 단백질(표면)

도 10B의 하단 좌측에 도시된 융합 단백질 VK8은 TEF2 프로모터의 조절을 받는 Cwp2 서열을 이용하여 세포벽에서 인플루엔자 HA 단백질을 발현하도록 설계되었다. 이 단백질은 효모 세포의 외벽에 위치하며, 또한 세포 내에서도 발견된다. 인플루엔자 HA 항원(H1)을 포함하는 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 골격 내에 융합된 다음의 서열 요소들을 갖는 단일 폴리펩타이드이다(융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 28로 나타냄):

1) Suc2 인버타아제 시그널 서열(서열번호 28의 1 내지 21의 아미노산);

2) 시그널 서열 및 C-말단 트랜스멤브레인 도메인이 없는 A/PR/8/34 유래의 H1 HA(서열번호 28의 22 내지 535번 위치);

3) 히스티딘 태그로부터 HA 단백질 체를 분리하기 위한 스페이서(서열번호 28의 536 및 537번 위치);

4) 6개의 히스티딘 태그(서열번호 28의 538 내지 543 번 위치);

5) 엔테로키나아제 분할 사이트(서열번호 28의 544 내지 549번 위치); 및

6) 시그널 서열이 없는 Cwp2 (서열번호 28의 550 내지 617번 위치).

서열번호 28의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 27로 나타내었다.

HA H5 - Cwp2 융합 단백질(표면)

조류 인플루엔자(A/Vietnam/1203/04) 유래의 H5 HA 단백질을 포함하는 것을 제외하고는 상기에서 기술된 VK8과 유사한 융합 단백질 VK12은 Cwp2 서열을 이용하여 세포벽에서 인플루엔자 HA H5 단백질을 발현하도록 설계되었다. 이 단백질은 효모 세포의 외벽에 위치하며, 또한 세포 내에서도 발견된다. 인플루엔자 HA 항원(H5)을 포함하는 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 골격 내에 융합된 다음의 서열 요소들을 갖는 단일 폴리펩타이드이다(융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 24로 나타냄):

1) Suc2 인버타아제 시그널 서열(서열번호 24의 1 내지 21번까지의 아미노산);

2) 시그널 서열 및 C-말단 트랜스멤브레인 도메인이 없는 A/Vietnam/1203/04 유래의 H5 HA(서열번호 24의 22 내지 536번 위치);

3) 히스티딘 태그로부터HA 단백질 체를 분리하기 위한 스페이서(서열번호 24의 537 및 538번 위치);

4) 6개의 히스티딘 태그(서열번호 24의 539 내지 544번 위치);

5) 엔테로키나아제 분할 사이트(서열번호 24의 545 내지 550번 위치); 및

6) 시그널 서열이 없는 Cwp2(서열번호 24의 551 내지 618번 위치).

서열번호 24의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 23으로 나타내었다.

스페로플라스트 발현을 위한 HA -융합 단백질(표면)

도 10B의 하단 우측에 도시된 융합 단백질 Lu002는 TEF2 프로모터의 조절을 받는 효모 스페로플라스트의 원형질막에서 트랜스멤브레인 도메인 자체를 갖는 인플루엔자 HA 단백질이 발현되도록 설계되었다. 이 단백질은 효모 스페로플라스트의 원형질막에 위치하며, 또한 세포 내에서도 발견된다.

도 11은 세포벽 단백질 2(cwp2)에 의해 효모의 표면에서 인플루엔자 HA 단백질을 발현하는 융합 단백질 VK8을 발현하는 다른 종류의 타모젠을 나타낸 것이다. 플로우 사이토메트리 어세이에 따른 효모 표면 HA 발현에 대한 그래프는 하단 우측구석부분에 도시하였다. 상기 그래프에 따르면, 이 특정 구조물은 효모 비히클 자체(GI-1001 또는 YVEC)와 비교하여 세포 표면에서 HA를 확실히 발현한다.

도 12A-12G는 효모 비히클의 표면에서 인플루엔자 HA 단백질을 발현하기 위해 다양한 접근들(상기에서 기재되어 있으며 도 10B에 도시됨)이 어디에서 이용되는 지를 그래프로 나타낸 것이다. 이들 실험들은 모두 정상적인 효소 성장 조건(즉, 중성 pH 조건들이 이용된 것은 아님)에서 실시되었다. 도 12A-12C는 Aga2 스페이서 아암 또는 링커를 이용하고, 상기에서 기술한 두 개의 다른 기원에서 융합된 VK4 및 TK75-15를 발현하는 타모젠에 의한 발현을 도시한 것이다. 도 12B는 VK4의 발현을, 도 12C는 TK75-15의 발현을 나타낸 것이다. 도 12D-12G는 HA 표면 발현에 대한 다른 가능한 구성을 나타낸 것이다. 도 12D는 또한 효모 조절(YEX)을 나타낸 것이다. 도 12E 및 12F는 HA 발현을 위한 스페이서 아암으로서 Cwp2를 이용하는 VK8을 발현하는 타모젠을 나타낸 것이다. 이들 도면들은 또한 단백질의 발현 시 효모의 당화를 조절하는 효과를 도시하였다. 탈당화된 VK8을 발현하는 타모젠(도 12F)은 당화된 VK8을 발현하는 타모젠(EH 12E)과 비교하여 HA의 표면 발현을 개선하였다. 마지막으로, 도 12G는 원형질막에서 HA를 발현하는 스페로플라스트인 Lu002를 발현하는 타모젠에 의한 HA의 발현을 나타낸 것이다.

이들 결과들은 다양한 구조물들이 본 발명의 효모 비히클의 표면(세포 외)에서 항원을 성공적으로 발현하는데 이용될 수 있음을 입증하는 것이다.

<실시예 6>

하기 실시예에는 둘 이상의 인플루엔자 단백질이 효모 비히클에 의해 세포 내에서 발현되는 본 발명의 다른 인플루엔자 융합 단백질 효모 백신을 설계하는 기술이 기재되어 있다.

TEF2 프로모터 조절 하에서 매트릭스 단백질(M1) 뉴클레오캡시드 단백질(NP) 및 세포 내 융합 단백질로서 이온 채널 단백질 세포 외 서열(M2e)을 발현하는 타모젠을 설계하였다(동일한 플라스미드에서 상기 융합 단백질의 발현과 두 번째, 즉 HA 구조물의 발현이 함께 도시되어 있는 도 13A 참조). M1 및 NP(N1) 서열은 A/PR/8/34 인플루엔자 균주로부터 유래한 것이다. 4xM2e는 A/PR/8/34 인플루엔자 균주 유래의 2 카피의 M2e 서열과 A/Viet Nam/ 1203/2004 인플루엔자 균주 유래의 2 카피의 M2e 서열을 나타낸다. M1-N1-4xM2e 단백질을 포함하는 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 골격 내에 융합된 다음의 서열 요소들을 갖는 단일 폴리펩타이드이다(융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 나타냄):

1) 프로테오좀에 의한 분해(서열번호 16의 1 내지 6번 위치)에 내성을 갖는 서열 MADEAP(서열번호 1);

2) 인플루엔자 A/PR/8/34 M1 단백질(서열번호 16의 7 내지 260번 위치);

3) NP 단백질로부터 M1 단백질을 분리하기 위한 스페이서(서열번호 16의 261 및 262번 위치);

4) 인플루엔자 A/PR/8/34 NP 단백질(서열번호 16의 263 내지 760번 위치);

5) M2e 단백질로부터 NP 단백질을 분리하기 위한 스페이서(서열번호 16의 761 및 762번 위치);

6) 인플루엔자 A/PR/8/34 M2 단백질 유래의 첫 번째 M2e 단백질(세포 외)(서열번호 16의 763 내지 787번 위치);

7) 인플루엔자 A/Viet Nam/1203/2004 M2 단백질 유래의 두 번째 M2e 단백질(세포 외)(서열번호 16의 788 내지 811번 위치);

8) 세 번째 M2e 단백질로부터 두 번째 M2e 단백질을 분리하기 위한 스페이서(서열번호 16의 812 및 813번 위치);

9) 인플루엔자 A/PR/8/34 M2 단백질 유래의 세 번째 M2e 단백질(세포 외)(서열번호 16의 814 내지 838번 위치);

10) 인플루엔자 A/Viet Nam/1203/2004 M2 단백질 유래의 (세포 외) 단백질로 구성된 네 번째 M2e 단백질(서열번호 16의 839 내지 862번 위치);

11) C-말단의 6개의 히스티딘 태그(서열번호 16의 864 내지 869번 위치).

서열번호 16의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 15로 나타내었다.

도 13A 및 도 13B는 부가적인 구조물을 연결하여 M1-NP-4xM2e 융합 단백질(서열번호 16)을 발현하는 타모젠의 이용을 도시하였다. 특히, 서열번호 16의 융합 단백질은 또한 CUP1 프로모터 조절 하에서 HA 단백질을 코딩하는 두 번째 구조물을 포함하는 단일 플라스미드에서 생산되었다. 이 플라스미드의 발현은 M1-NP-4xM2e 융합 단백질과 HA 단백질이 세포 내에서 발현토록 한다. 또한, HA 발현은 두 번째 독립적인 구조물의 이용을 통해 달성될 수 있다. 생산되는 부가적인 타모젠은 도 13B에 도시된 구조물(VK8 구조물에 해당함)의 이용을 포함하여 HA 단백질의 세포 외(표면) 발현을 유발한다. 이 융합 단백질은 상기에서 기술된 M1-N1-4xM2e 융합 단백질을 갖는 같은 타모젠에서 단독으로, 또는 상기에서 기술된 세포 내에서 발현되는 HA 구조물과 협력하여 발현될 수 있다. VK8(표면 HA) 융합 단백질을 발현하는 개개의 타모젠은 또한 상기에서 기술된 M1-N1-4xM2e 융합 단백질을 발현하는 타모젠과 더불어 백신에서 단독으로, 또는 세포 내에서 발현되는 HA와 협력하여 제공될 수 있다. 세포 내 및 세포 외 발현을 위해 개개의 융합 단백질을 제공함으로써 충분한 능력이 있는 항원이 B 세포 반응에 이용될 수 있고, 세포 매개 면역 반응을 위해 수지상세포와 같은 항원 전달 세포에 의한 흡수에 이용될 수 있다.

<실시예 7>

하기 실시예에는 두 개 이상의 인플루엔자 단백질들이 효모 비히클에 의해 세포 내에서 발현되는 본 발명의 다른 인플루엔자 융합 단백질 효모 백신을 설계하는 기술이 기재되어 있다.

NP-2xM2e 융합 단백질을 발현하는 타모젠과 NP-4xM2e 융합 단백질을 발현하는 다른 타모젠이 생산되었다.

NP-4xM2e 융합 단백질은 구조물의 M1 부분이 포함되지 않는 것을 제외하고는 실시예 6에서 기재된 M1-N1-4xM2e 융합 단백질과 동일한 방법으로 구축되며, 서열번호 16으로 나타내었다.

NP-2xM2e 융합 단백질에서, NP (N1) 및 2 카피의 M2 서열은 모두 A/PR/8/34 인플루엔자 균주에서 유래한 것이다. N1-2xM2e 단백질을 포함하는 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 골격 내에 융합된 다음의 서열 요소들을 갖는 단일 폴리펩타이드이다(융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 18로 나타냄):

1) 프로테오좀에 의한 분해(서열번호 18의 1 내지 6번 위치)에 대한 내성을 갖는 MADEAP 서열(서열번호 1);

2) 인플루엔자 A/PR/8/34 NP 단백질(서열번호 18의 7 내지 503번 위치);

3) M2e 단백질로부터 NP 단백질을 분리하기 위한 스페이서(서열번호 18의 504 및 505번 위치;

4) 인플루엔자 A/PR/8/34 M2 단백질 유래의 첫 번째 M2e (세포 외) 단백질(서열번호 18의 506 내지 530번 위치);

5) 두 번째 M2e 단백질로부터 첫 번째 M2e 단백질을 분리하기 위한 스페이서(서열번호 18의 531번 위치);

6) 인플루엔자 A/PR/8/34 M2 단백질 유래의 두 번째 M2e (세포 외) 단백질(서열번호 18의 532 내지 555번 위치; 및

7) C-말단 쪽에 6개의 히스티딘 태그가 연결되어 있는 트리글리신 스페이서(서열번호 18의 556 내지 564번 위치).

서열번호 18의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 17에 나타내었다.

타모젠을 생산하는 효모 비히클에서 발현되는 이 융합 단백질은 세포 내에서 발현되며, 다른 구조물(예를 들어, 상기 실시예 6에서 기술된 HA-표면 또는 HA-세포 내 발현 전략)의 발현과 협력할 수 있다.

<실시예 8>

하기 실시예는 체액성 면역반응을 유발하는 세포 외 단백질로서 인플루엔자 HA를 발현하는 타모젠의 면역을 입증하고 있다.

본 실시예에서, Cwp2를 갖는 융합 단백질로서 효모 세포 표면에서 HA를 발현하는 GI-8000-S(도 10B, VK8 참조) 1회 용량을 마우스에 피하투여하거나, 저 용량의 flu 생 바이러스를 정맥주사를 통해 마우스에 주사하였다. 면역 후 1주일째에 HI 역가를 측정하였다. 다른 실험군은 5YU의 GI-8000-S를 투여하였다. 면역 후 1주일째에 HI 역가를 측정하였다. 실험 결과는 표 5에 나타내었다.

표 5에 나타난 바와 같이, GI-8000-S 백신의 1회 투여로 수용성 분리 단백질을 첨가하지 않거나, 또는 비 효모-기반 백신을 추가로 첨가하지 않고서도 HA 중화항체 반응을 유도할 수 있었다.

<실시예 9>

항체 생산을 유발하기 위해 관심 있는 다양한 항원들을 발현하는 타모젠을 이용하였다. 아래에서 설명하듯이, 본 발명은 항체 반응을 포함하는 체액성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

전체 효모 세포막 단백질로서 HIV-1 gp160 외막 단백질을 생산하는 GI-2001 (HIVAX-1)를 이용하여 실험하였다(Franzusoff et al J. Biol . Chem . 270, 3154-3159 (1995)). 살아있는, 완전한 형태의 효모세포 또는 스페로플라스트에 의해 투여되는 2×10⁷ (2YU) 의 YVEC 또는 HIVAX-1 균주 중 어느 하나를 3주 동안 매주 주사한 마우스 혈청에 대한 웨스턴 블롯 어세이는 완전한 형태의 효모 또는 스페로플라스트의 전체 파쇄물에 대해 실시하였다. 웨스턴 블롯 결과, 마우스는 다양한 효모 유래의 단백질에 대한 항체를 만들었으며, 얻어진 항체 패턴은 마우스에 완전한 형태의 효모를 주사하였는지 또는 스페로플라스트를 주사하였는지에 따라 달랐다. 마우스 혈청은 gp160에 특이적인 항체를 포함하는 것으로 보여 HIVAX-1 스페로플라스트로 면역되었지만, 완전한 형태의 HIVAX-1 효모, 또는 YVEC 효모 또는 스페로플라스트에 의해서는 면역되지 않았다. 이론과는 달리, 이는 완전한 형태의 막 단백질로서 HIVAX-1에서 gp160의 발현으로 인한 것으로 사료되며, 완전한 형태의 효모의 표면에서는 B 세포에 노출되지 않지만, 스페로플라스트의 외부 표면에는 노출될 것이다.

HIVAX-1의 결과와는 대조적으로, 닭의 난백알부민을 생산하는 타모젠인 OVAX 백신을 처리한 마우스 혈청에서는 항-OVA 항체의 역가가 입증되었다. 이 결과는 닭의 난백알부민이 OVAX 효모 균주에서 막주위 공간(Periplasmic space)에서 우세하게 분비되고, 어떤 수용성 단백질은 완전한 형태의 효모로부터 세포벽을 통해 방출되기 때문인 것으로 보인다. 따라서, 재조합 효모-기반 백신 내 이종성 항원의 위치는 항체가 생산되는 지를 결정하는 것으로 보인다.

OVAX 효모의 항-OVA 항체 유도능을 조사하기 위해, BALB/c 마우스에 하기 표에 나타난 항원들을 두 달 동안 한 달에 한 번씩 백신처리하였다. 두 번째 백신 처리 후 한 달째에, 닭의 수용성 난백알부민을 백신처리하였다(애주번트 무첨가). PBS로 모형 백신을 처리한 마우스는 56일째에 수용성 OVA를 한 번 처리하여도 항-OVA 항체 반응을 나타내지 않았다. 대조적으로, 2×10⁷ (2YU) OVAX 효모로 두 번 백신처리한 마우스는 애주번트를 첨가하지 않고 수용성 OVA(비효모-기반 백신의 예)로 면역증강한 후 높은 역가의 항-OVA 항체 반응을 나타내었다. 이 결과는 수용성 OVA로 면역증강하기 전에 OVAX를 투여하거나, 또는 수용성 OVA로 면역증강하기 전에 특히 OVAX 및 OVA-Alum을 1회 투여한 후 OVAX 및 OVA-Alum을 함께 투여하여 면역된 마우스에서 항-OVA 항체들의 높은 역가가 관찰되는 타모젠에서 항원-절감 효과가 달성됨을 나타내는 것이다. 도 14A 및 14B는 또는 유사한 실험 결과들을 도시한 것이다.

도 14A 및 14B는 3 종류의 투여안에 따른 T 세포 초회항원자극(priming) 결과(도 14B) 및 항체 생산(도 14A) 결과를 나타낸 것이다.

도 14A에서, PBS만을 투여한 투여안 A(대조군)는 PBS를 면역증강을 위해 사용하였을 때 난백알부민-특이적 항체 역가가 관찰되지 않았다. 초회항원자극을 위해 0일째 및 28일째에 PBS를 투여하고, 면역증강을 위해 수용성 난백알부민 단백질(ova)을 56일째에 이용한 투여안 B에서, 난백알부민-특이적 항체 역가는 65일까지 검출되지 않았다. 난백알부민(OVAX)을 발현하는 효모 비히클을 초회면역자극을 위해 사용하고, 면역증강을 위해 수용성 난백알부민을 사용한 투여안 C에서, 고 항체 역가의 빠른 생산이 관찰되었다.

도 14B는 상기의 3 종류의 투여안 각각에 의해 면역된 마우스에서 수집한 T세포의 인비트로 재 자극을 위해 다양한 함량의 수용성 난백알부민 단백질을 이용하여 T 세포를 활성화한 결과를 나타낸 것이다. 투여안 C는 세포 매개 면역 반응을 유도하는데 효과적이었다.

<실시예 10>

하기 실시예에는 Gag를 생산하는 타모젠이 항원-특이적 헬퍼 T 세포를 초회면역자극함을 입증하고 있다.

하기 실시예의 목적은 항체 생산을 위한 항원-특이적 헬퍼 T 세포를 초회면역자극 하기 위하여 세포질 단백질로서 HIV-1 Gag 단백질을 생산하는 타모젠인 GI-2010의 능력을 확인하는 것이다. 5마리의 BALB/c 마우스로 구성된 실험군에 식염수, 2YU YVEC 또는 2YU GI-2010(0, 7, 및 21일째에 피하주사함) 또는 1×10⁷ pfu MVA-대조군 또는 1×10⁷ MVA-UGD(HIV-1 Gag를 코딩하는 재조합 변형 백신 앙카라 바이러스; 0 및 21일째에 복강주사함) 중 어느 하나를 주사하였다. 다음으로, 식염수 또는 효모로 면역시킨 마우스에 28일째에 식염수에 녹인 재조합 p24 Gag 단백질 5㎍을 애주번트 없이 주사하였다. 마우스 혈청 시료로부터 ELISA를 이용하여 항-p24 Gag 항체 역가를 측정하였다.

도 15에 나타난 바와 같이, GI-2010로 면역된 마우스는 수용성 Gag 단백질에 의해 면역증강되지 않는다면 p24 Gag-특이적 항체를 검출가능한 정도로 발현시키지는 않았다. 식염수 또는 YVEC를 주사한 마우스에서는 항체가 생산되지는 않아, 이 결과는 GI-2010이 백신처리된 마우스에서 애주번트 없이 수용성 Gag 단백질에 의해 유발된 B 세포 반응을 증강시키기 위해 헬퍼 T 세포를 초회면역자극시킴을 가리키는 것이다.

본 실시예는 타모젠이 항체 생산을 위해 헬퍼 T 세포를 유도하고, 효모 내 항원의 위치는 생산되는 항체의 함량에 중요한 영향을 미친다는 것을 지시하는 것이다. 예를 들어, 이들 연구들은 효모 세포의 표면 단백질로서 HBsAg를 발현하는 효모가 항-HBsAg 항체를 유도한다는 것을 가리킨다. 예를 들어, M.P. Schreuder et al., Vaccine, 14(5):383-8 (1996)를 참조할 것.

<실시예 11>

하기 실시예는 비 효모 항원 제조를 혼합할 때 본 발명의 효모-기반 백신이 애주번트 효과를 가짐을 입증하고 있다.

본 실험에서, 세포질 단백질로서 A/PR/8/34 HA를 생산하는 타모젠인 GI-8002를 이용하였다(실시예 2 참조). 간단히 말해서, BALB/c 마우스(실험군 당 5마리)에 5YU (5×10⁷) GI-8002 효모 세포 자체, 1㎍ 또는 10㎍의 BPL 에 의해 불활성화된 인플루엔자 바이러스(A/PR/8/34) 자체, 또는 5YU GI-8002 및 상기 함량의 BPL에 의해 불활성화된 인플루엔자 바이러스의 혼합물 중 어느 하나를 1일 및 22일째에 피하주사하여 면역시켰다.

두 번째 주사 후 4주째에 혈청을 수집하고, 중화항체(neutralizing antibodies)의 존재를 측정하기 위해 HI 어세이를 실시하였다. 실험 결과, 중화항체를 유도하기 위해 BPL에 의해 불활성화된 바이러스를 단순히 혼합처리한 경우 효모는 애주번트 효과를 가지고 있었다.

* N.D. = not determined due to technical problems with retro-orbital bleeding

본 발명에서 인용된 특허, 특허출원, 및 공개공보의 내용은 사실상 전체를 참조하여 포함되어 있다.

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U.S. Provisional Application Serial No. 60/765,025, filed February 2, 2006

본 발명의 다양한 구체예들은 구체적으로 기술되어 있으나, 당업자 수준에서 그들 구체예들의 변형 및 개조가 있을 수 있다. 그러나, 그러한 변형 및 개조는 하기 청구항에 청구된 바와 같이 본 발명의 권리범위 내에 있음은 자명하다.

SEQUENCE LISTING <110> Globeimmune, Inc. Duke, Richard C. Franzusoff, Alex Haller, Aurelia King, Thomas H. Lu, Yingian Hodson, Victoria Kelley <120> Yeast-Based Vaccine for Inducing an Immune Response <130> 3923-18-PCT <150> 60/765,025 <151> 2006-02-02 <160> 36 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 1 Met Ala Asp Glu Ala Pro 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 2 Gly Gly Gly His His His His His His 1 5 <210> 3 <211> 801 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 3 atggccgacg aggcaccaag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct ctctatcatc 60 ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt tgcagggaag 120 aacaccgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct gtcacctctg 180 actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg aggactgcag 240 cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa catggacaaa 300 gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc caaagaaatc 360 tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata caacaggatg 420 ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga acagattgct 480 gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaacccact aatcagacat 540 gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat ggctggatcg 600 agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctaggcaaat ggtgcaagcg 660 atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga tcttcttgaa 720 aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa gggtggcggg 780 catcaccatc accatcacta g 801 <210> 4 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 4 Met Ala Asp Glu Ala Pro Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val 1 5 10 15 Leu Ser Ile Ile Pro Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg 20 25 30 Leu Glu Asp Val Phe Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met 35 40 45 Glu Trp Leu Lys Thr Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile 50 55 60 Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln 65 70 75 80 Arg Arg Arg Phe Val Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn 85 90 95 Asn Met Asp Lys Ala Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile 100 105 110 Thr Phe His Gly Ala Lys Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala 115 120 125 Leu Ala Ser Cys Met Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr 130 135 140 Thr Glu Val Ala Phe Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala 145 150 155 160 Asp Ser Gln His Arg Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro 165 170 175 Leu Ile Arg His Glu Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys 180 185 190 Ala Met Glu Gln Met Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met 195 200 205 Glu Val Ala Ser Gln Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile 210 215 220 Gly Thr His Pro Ser Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu 225 230 235 240 Asn Leu Gln Ala Tyr Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe 245 250 255 Lys Gly Gly Gly His His His His His His 260 265 <210> 5 <211> 1878 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 5 atgcagttac ttcgctgttt ttcaatattt tctgttattg cttcagtttt agcacaggaa 60 ctgacaacta tatgcgagca aatcccctca ccaactttag aatcgacgcc gtactctttg 120 tcaacgacta ctattttggc caacgggaag gcaatgcaag gagtttttga atattacaaa 180 tcagtaacgt ttgtcagtaa ttgcggttct cacccctcaa caactagcaa aggcagcccc 240 ataaacacac agtatgtttt tactagtaag gcaaacctac tggtcctgtt atgtgcactt 300 gcagctgcag atgcagacac aatatgtata ggctaccatg cgaacaattc aaccgacact 360 gttgacacag tactcgagaa gaatgtgaca gtgacacact ctgttaacct gctcgaagac 420 agccacaacg gaaaactatg tagattaaaa ggaatagccc cactacaatt ggggaaatgt 480 aacatcgccg gatggctctt ggggaatcca gaatgcgacc cactgcttcc agtgagatca 540 tggtcctaca ttgtagaaac accaaactct gagaatggaa tatgttatcc aggagatttc 600 atcgactatg aggagctgag ggagcaattg agctcagtgt catcattcga aagattcgaa 660 atatttccca aagaaagctc atggcccaac cacaacacaa acggagtaac ggcagcatgc 720 tcccatgagg ggaaaagcag tttttacaga aatttgctat ggctgacgga gaaggagggc 780 tcatacccaa agctgaaaaa ttcttatgtg aacaaaaaag ggaaagaagt ccttgtactg 840 tggggtattc atcacccgtc taacagtaag gaacaacaga atctctatca gaatgaaaat 900 gcttatgtct ctgtagtgac ttcaaattat aacaggagat ttaccccgga aatagcagaa 960 agacccaaag taagagatca agctgggagg atgaactatt 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agcaaaagca gggtagataa tcactcactg agtgacatca aaatcatggc gtctcaaggc 60 accaaacgat cttacgaaca gatggagact gatggagaac gccagaatgc cactgaaatc 120 agagcatccg tcggaaaaat gattggtgga attggacgat tctacatcca aatgtgcacc 180 gaactcaaac tcagtgatta tgagggacgg ttgatccaaa acagcttaac aatagagaga 240 atggtgctct ctgcttttga cgaaaggaga aataaatacc ttgaagaaca tcccagtgcg 300 gggaaagatc ctaagaaaac tggaggacct atatacagga gagtaaacgg aaagtggatg 360 agagaactca tcctttatga caaagaagaa ataaggcgaa tctggcgcca agctaataat 420 ggtgacgatg caacggctgg tctgactcac atgatgatct ggcattccaa tttgaatgat 480 gcaacttatc agaggacaag agctcttgtt cgcaccggaa tggatcccag gatgtgctct 540 ctgatgcaag gttcaactct ccctaggagg tctggagccg caggtgctgc agtcaaagga 600 gttggaacaa tggtgatgga attggtcaga atgatcaaac gtgggatcaa tgatcggaac 660 ttctggaggg gtgagaatgg acgaaaaaca agaattgctt atgaaagaat gtgcaacatt 720 ctcaaaggga aatttcaaac tgctgcacaa aaagcaatga tggatcaagt gagagagagc 780 cggaacccag ggaatgctga gttcgaagat ctcacttttc tagcacggtc tgcactcata 840 ttgagagggt cggttgctca caagtcctgc ctgcctgcct gtgtgtatgg acctgccgta 900 gccagtgggt acgactttga aagggaggga tactctctag tcggaataga ccctttcaga 960 ctgcttcaaa acagccaagt gtacagccta atcagaccaa atgagaatcc agcacacaag 1020 agtcaactgg tgtggatggc atgccattct gccgcatttg aagatctaag agtattaagc 1080 ttcatcaaag ggacgaaggt gctcccaaga gggaagcttt ccactagagg agttcaaatt 1140 gcttccaatg aaaatatgga gactatggaa tcaagtacac ttgaactgag aagcaggtac 1200 tgggccataa ggaccagaag tggaggaaac accaatcaac agagggcatc tgcgggccaa 1260 atcagcatac aacctacgtt ctcagtacag agaaatctcc cttttgacag aacaaccgtt 1320 atggcagcat tcagtgggaa tacagagggg agaacatctg acatgaggac cgaaatcata 1380 aggatgatgg aaagtgcaag accagaagat gtgtctttcc aggggcgggg agtcttcgag 1440 ctctcggacg aaaaggcagc gagcccgatc gtgccttcct ttgacatgag taatgaagga 1500 tcttatttct tcggagacaa tgcagaggaa tacgataatt aaagaaaaat acccttgttt 1560 ctact 1565 <210> 30 <211> 498 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 30 Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met 20 25 30 Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys 35 40 45 Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu 50 55 60 Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile 85 90 95 Tyr Arg Arg Val Asn Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp 100 105 110 Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp 115 120 125 Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn 130 135 140 Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 145 150 155 160 Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser 165 170 175 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu 180 185 190 Leu Val Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg 195 200 205 Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn 210 215 220 Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Lys Ala Met Met Asp 225 230 235 240 Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu 245 250 255 Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His 260 265 270 Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly 275 280 285 Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe 290 295 300 Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu 305 310 315 320 Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala 325 330 335 Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Lys Gly Thr Lys Val 340 345 350 Leu Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn 355 360 365 Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg 370 375 380 Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg 385 390 395 400 Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg 405 410 415 Asn Leu Pro Phe Asp Arg Thr Thr Val Met Ala Ala Phe Ser Gly Asn 420 425 430 Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met 435 440 445 Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe 450 455 460 Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Ala Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp 465 470 475 480 Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr 485 490 495 Asp Asn <210> 31 <211> 1565 <212> DNA <213> Influenza virus <400> 31 agcaaaagca gggtagataa tcactcactg agtgacatca aaatcatggc gtcccaaggc 60 accaaacggt cttacgaaca gatggagact gatggagaac gccagaatgc cactgaaatc 120 agagcatccg tcggaaaaat gattggtgga attggacgat tctacatcca aatgtgcaca 180 gaacttaaac tcagtgatta tgagggacgg ttgatccaaa acagcttaac aatagagaga 240 atggtgctct ctgcttttga cgaaaggaga aataaatacc tggaagaaca tcccagtgcg 300 gggaaggatc ctaagaaaac tggaggacct atatacagaa gagtaaacgg aaagtggatg 360 agagaactca tcctttatga caaagaagaa ataaggcgaa tctggcgcca agctaataat 420 ggtgacgatg caacggctgg tctgactcac atgatgatct ggcattccaa tttgaatgat 480 gcaacttatc agaggacaag ggctcttgtt cgcaccggaa tggatcccag gatgtgctct 540 ctgatgcaag gttcaactct ccctaggagg tctggagccg caggtgctgc agtcaaagga 600 gttggaacaa tggtgatgga attggtcagg atgatcaaac gtgggatcaa tgatcggaac 660 ttctggaggg gtgagaatgg acgaaaaaca agaattgctt atgaaagaat gtgcaacatt 720 ctcaaaggga aatttcaaac tgctgcacaa aaagcaatga tggatcaagt gagagagagc 780 cgggacccag ggaatgctga gttcgaagat ctcacttttc tagcacggtc tgcactcata 840 ttgagagggt cggttgctca caagtcctgc ctgcctgcct gtgtgtatgg acctgccgta 900 gccagtgggt acgactttga aagagaggga tactctctag tcggaataga ccctttcaga 960 ctgcttcaaa acagccaagt gtacagccta atcagaccaa atgagaatcc agcacacaag 1020 agtcaactgg tgtggatggc atgccattct gccgcatttg aagatctaag agtattgagc 1080 ttcatcaaag ggacgaaggt ggtcccaaga gggaagcttt ccactagagg agttcaaatt 1140 gcttccaatg aaaatatgga gactatggaa tcaagtacac ttgaactgag aagcaggtac 1200 tgggccataa ggaccagaag tggaggaaac accaatcaac agagggcatc tgcgggccaa 1260 atcagcatac aacctacgtt ctcagtacag agaaatctcc cttttgacag aacaaccgtt 1320 atggcagcat tcactgggaa tacagagggg agaacatctg acatgaggac cgaaatcata 1380 aggatgatgg aaagtgcaag accagaagat gtgtctttcc aggggcgggg agtcttcgag 1440 ctctcggacg aaaaggcagc gagcccgatc gtgccttcct ttgacatgag taatgaagga 1500 tcttatttct tcggagacaa tgcagaggag tacgacaatt aaagaaaaat acccttgttt 1560 ctact 1565 <210> 32 <211> 498 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 32 Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met 20 25 30 Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys 35 40 45 Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu 50 55 60 Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile 85 90 95 Tyr Arg Arg Val Asn Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp 100 105 110 Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp 115 120 125 Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn 130 135 140 Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 145 150 155 160 Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser 165 170 175 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu 180 185 190 Leu Val Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg 195 200 205 Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn 210 215 220 Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Lys Ala Met Met Asp 225 230 235 240 Gln Val Arg Glu Ser Arg Asp Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu 245 250 255 Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His 260 265 270 Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly 275 280 285 Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe 290 295 300 Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu 305 310 315 320 Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala 325 330 335 Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Lys Gly Thr Lys Val 340 345 350 Val Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn 355 360 365 Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg 370 375 380 Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg 385 390 395 400 Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg 405 410 415 Asn Leu Pro Phe Asp Arg Thr Thr Val Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn 420 425 430 Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met 435 440 445 Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe 450 455 460 Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Ala Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp 465 470 475 480 Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr 485 490 495 Asp Asn <210> 33 <211> 1707 <212> DNA <213> Influenza virus <400> 33 atggagaaaa tagtgcttct ttttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagaaacaca acgggaagct ctgcgatcta 180 gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagcgtag ctggatggct cctcggaaac 240 ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300 ccagtcaatg acctctgtta cccaggggat ttcaatgact atgaagaatt gaaacaccta 360 ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccagt 420 catgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccatacc agggaaagtc ctcctttttc 480 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaggagctac 540 aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600 gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aagaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt 840 atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900 ataaactcta gcatgccatt ccacaatata caccctctca ccattgggga atgccccaaa 960 tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020 agaagaagaa aaaagagagg attatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080 cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtgggtac 1140 gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg 1200 atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa caacttagaa 1260 aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacgggt tcctagatgt ctggacttat 1320 aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat 1380 gtcaagaacc tttacgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440 aacggttgtt tcgagttcta tcataaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaagaaat 1500 ggaacgtatg actacccgca gtattcagaa gaagcgagac taaaaagaga ggaaataagt 1560 ggagtaaaat tggaatcaat aggaatttac caaatactgt caatttattc tacagtggcg 1620 agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctatcct tatggatgtg ctccaatgga 1680 tcgttacaat gcagaatttg catttaa 1707 <210> 34 <211> 568 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 34 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 340 345 350 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 355 360 365 Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 370 375 380 Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 385 390 395 400 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 405 410 415 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430 Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 435 440 445 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 450 455 460 Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 465 470 475 480 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 485 490 495 Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala 500 505 510 Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly 515 520 525 Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 530 535 540 Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly 545 550 555 560 Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 35 <211> 1833 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 35 atgcagttac ttcgctgttt ttcaatattt tctgttattg cttcagtttt agcacaggaa 60 ctgacaacta tatgcgagca aatcccctca ccaactttag aatcgacgcc gtactctttg 120 tcaacgacta ctattttggc caacgggaag gcaatgcaag gagtttttga atattacaaa 180 tcagtaacgt ttgtcagtaa ttgcggttct cacccctcaa caactagcaa aggcagcccc 240 ataaacacac agtatgtttt tactagtgac acaatatgta taggctacca tgcgaacaat 300 tcaaccgaca ctgttgacac agtactcgag aagaatgtga cagtgacaca ctctgttaac 360 ctgctcgaag acagccacaa cggaaaacta tgtagattaa aaggaatagc cccactacaa 420 ttggggaaat gtaacatcgc cggatggctc ttggggaatc cagaatgcga cccactgctt 480 ccagtgagat catggtccta cattgtagaa acaccaaact ctgagaatgg aatatgttat 540 ccaggagatt tcatcgacta tgaggagctg agggagcaat tgagctcagt gtcatcattc 600 gaaagattcg aaatatttcc caaagaaagc tcatggccca accacaacac aaacggagta 660 acggcagcat gctcccatga ggggaaaagc agtttttaca gaaatttgct atggctgacg 720 gagaaggagg gctcataccc aaagctgaaa aattcttatg tgaacaaaaa agggaaagaa 780 gtccttgtac tgtggggtat tcatcacccg tctaacagta aggaacaaca gaatctctat 840 cagaatgaaa atgcttatgt ctctgtagtg acttcaaatt ataacaggag atttaccccg 900 gaaatagcag aaagacccaa agtaagagat caagctggga ggatgaacta ttactggacc 960 ttgctaaaac ccggagacac aataatattt gaggcaaatg gaaatctaat agcaccaatg 1020 tatgctttcg cactgagtag aggctttggg tccggcatca tcacctcaaa cgcatcaatg 1080 catgagtgta acacgaagtg tcaaacaccc ctgggagcta taaacagcag tctcccttac 1140 cagaatatac acccagtcac aataggagag cgcccaaaat acgtcaggag tgccaaattg 1200 aggatggtta caggactaag gaacattccg tccattcaat ccagaggtct atttggagcc 1260 attgccggtt ttattgaagg gggatggact ggaatgatag atggatggta tggttatcat 1320 catcagaatg aacagggatc aggctatgca gcggatcaaa aaagcacaca aaatgccatt 1380 aacgggatta caaacaaggt gaacactgtt atcgagaaaa tgaacattca attcacagct 1440 gtgggtaaag aattcaacaa attagaaaaa aggatggaaa atttaaataa aaaagttgat 1500 gatggatttc tggacatttg gacatataat gcagaattgt tagttctact ggaaaatgaa 1560 aggactctgg acttccatga ctcaaatatg aagaatctgt atgagaaagt aaaaagccaa 1620 ttaaagaata atgccaaaga aatcggaaat ggatgttttg agttctacca caagtgtgac 1680 aatgaatgca tggaaagtgt aagaaatggg acttatgatt atcccaaata ttcagaagag 1740 tcaaagttga acagggaaaa ggtagatgga gtgaaattgg aatcaatggg gatctatcag 1800 ggtggcgggc atcaccatca ccatcactag tga 1833 <210> 36 <211> 609 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 36 Met Gln Leu Leu Arg Cys Phe Ser Ile Phe Ser Val Ile Ala Ser Val 1 5 10 15 Leu Ala Gln Glu Leu Thr Thr Ile Cys Glu Gln Ile Pro Ser Pro Thr 20 25 30 Leu Glu Ser Thr Pro Tyr Ser Leu Ser Thr Thr Thr Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Lys Ala Met Gln Gly Val Phe Glu Tyr Tyr Lys Ser Val Thr Phe 50 55 60 Val Ser Asn Cys Gly Ser His Pro Ser Thr Thr Ser Lys Gly Ser Pro 65 70 75 80 Ile Asn Thr Gln Tyr Val Phe Thr Ser Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr 85 90 95 His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn 100 105 110 Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly 115 120 125 Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys 130 135 140 Asn Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Glu Cys Asp Pro Leu Leu 145 150 155 160 Pro Val Arg Ser Trp Ser Tyr Ile Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn 165 170 175 Gly Ile Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu 180 185 190 Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys 195 200 205 Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Asn Thr Asn Gly Val Thr Ala Ala Cys 210 215 220 Ser His Glu Gly Lys Ser Ser Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr 225 230 235 240 Glu Lys Glu Gly Ser Tyr Pro Lys Leu Lys Asn Ser Tyr Val Asn Lys 245 250 255 Lys Gly Lys 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Thr Val Ile Glu Lys Met Asn Ile Gln Phe Thr Ala 465 470 475 480 Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn 485 490 495 Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu 500 505 510 Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser 515 520 525 Asn Met Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn 530 535 540 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp 545 550 555 560 Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 565 570 575 Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Val Asp Gly Val Lys 580 585 590 Leu Glu Ser Met Gly Ile Tyr Gln Gly Gly Gly His His His His His 595 600 605 His

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11. a) 효모 비히클; 및

    b) 상기 효모 비히클에 의해 발현되는 하기의 인플루엔자 바이러스 융합단백질;을 포함하는 백신:

    상기 융합단백질은 상기 효모 비히클에 의해 하나의 세포 내 융합 단백질로 발현되고, M1 단백질, NP 단백질 및 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래되는, 적어도 두 가지 M2e 단백질로 구성되는 인플루엔자 서열을 포함한다.
12. 제11항에 있어서, 상기 상이한 인플루엔자 균주는 A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스 균주 및 A/Vietnam/1203/04 인플루엔자 바이러스 균주인, 백신.
13. 제11항에 있어서, 상기 인플루엔자 서열은 M1 단백질, NP 단백질, 및 4 가지 M2e 단백질로 구성되는, 백신.
14. 제11항에 있어서, 상기 융합단백질은 다음의 서열 요소들이 N-말단으로부터 C-말단까지 인 프레임으로 융합되어 있는 하나의 폴리펩티드로 구성되는, 백신:

    (1) 효모 비히클 내의 융합단백질의 발현을 안정화시키거나, 발현된 융합단백질의 번역후 변형을 방지하는 N-말단 합성 펩티드; (2) M1 단백질; (3) 스페이서 펩티드; (4) NP 단백질; (5) 스페이서 펩티드; (6) 제1 M2e 단백질; (7) 제2 M2e 단백질; (8) 스페이서 펩티드; (9) 제3 M2e 단백질; (10) 제4 M2e 단백질; 및 (11) C-말단 펩티드 태그.
15. 제11항에 있어서, 헤마글루티닌 (HA) 단백질 및 뉴라미니다아제 (NA) 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 인플루엔자 단백질의 적어도 하나의 면역원성 도메인을 포함하는 인플루엔자 바이러스 융합단백질을 세포 외 발현하는, 적어도 하나의 부가적인 효모 비히클을 추가적으로 포함하는 백신.
16. 제11항에 있어서, 상기 효모 비히클에 의해 세포 외 발현되는 제2 인플루엔자 바이러스 융합단백질을 추가적으로 포함하는 백신으로서,

    상기 제2 인플루엔자 바이러스 융합단백질은 헤마글루티닌 (HA) 단백질 및 뉴라미니다아제 (NA) 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 인플루엔자 단백질의 적어도 하나의 면역원성 도메인을 포함하는 것인, 백신.
17. 제11항에 있어서, 상기 효모 비히클이 전효모(whole yeast), 효모 스페로플라스트(yeast spheroplast), 효모 세포질체(yeast cytoplast), 효모 고스트(yeast ghost), 효모 세포벽 제제(yeast cell wall preparation), 및 아세포 효모 막 추출물(subcellular yeast membrane extract) 또는 그의 분획으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 백신.
18. 제11항에 있어서, 상기 효모 비히클이 사카로마이세스 유래인 것인 백신.
19. a) 효모; 및

    b) 상기 효모에 의해 세포 내 하나의 융합 단백질로서 발현되는 M1 항원, N1 항원 및 4가지 M2e 항원을 포함하며, 서열번호 16으로 구성되는 인플루엔자 바이러스 융합 단백질;을 포함하는, 백신.
20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항의 백신을 포함하는, 인플루엔자로 감염될 위험이 있는 개체 집단의 면역화용 또는 인플루엔자로 감염된 개체 집단의 치료용 제형.
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