JP2013075899A - 治療用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】所望の免疫反応を達成するために調整することが可能なワクチンを提供する。
【解決手段】ａ）少なくとも１つの異種細胞内抗原を備えた第１酵母運搬体と、ｂ）少なくとも１つの異種細胞外抗原を備えた第２酵母運搬体とを備えたワクチンが提供される。このワクチンは、個体において免疫反応を誘導し、様々な型の病気、感染及び望ましくない状態から個体を保護するために有用である。
【選択図】図１

Description

本発明は概して、細胞性免疫反応及び／又は体液性免疫反応を含む、様々なタイプの防御免疫反応及び治療免疫反応を誘導することが可能な酵母ベースワクチンに関する。当該酵母ベースワクチンを含む組成物、及び他のタイプのワクチンとの組合せを含む当該ワクチンの使用方法をここに記載する。組成物の多様性、ならびにインフルエンザ感染に対する動物へのワクチン接種の方法、及び動物におけるインフルエンザ感染の治療又は予防方法もまた記載する。

ワクチンは、ヘルスケア産業において、病気の予防及び治療に対する最も費用対効果の高い方法の１つである。しかしながら、病原因子、癌、遺伝子欠陥、及び免疫システムの他の欠陥による、感染が原因となる又は感染と結びつく様々な病気に対する安全で効果的なワクチン及び補助剤の開発は、依然として切迫して必要とされるままである。例えば、Ra binovichらによる Science 265, 1401-1404 (1994)のようなワクチンに関する論文には、安全で熱に安定なワクチンが依然として必要とされていることが示されている。また、経口投与可能で、好ましくは若年時にほんの２、３回の投与でよいようなワクチンが必要とされていることが示されている。また、補助剤を要求しないワクチン、ならびに細胞性免疫、体液性免疫及び粘膜免疫を誘導することが可能なワクチンと同様に、１つ以上の病気から個体を防御可能なワクチンの組合せが好ましい。今までのところ、あるとしても、かなり少ないワクチンがこれらの全ての基準を満たしている。

病原体の死滅又は弱毒化が、特にウイルス感染に対するワクチンのような、従来のワクチンにおいて頻繁に用いられている。例えば、二種類のインフルエンザワクチンが現在用いられている。より従来型のワクチンは、典型的には腕への注射により与えられる不活化（死滅したウイルスを含む）ワクチンである。第２ワクチンは、鼻内噴霧インフルエンザワクチン（弱毒化インフルエンザワクチン（ＬＡＩＶ：Live Attenuated Influenza Vaccine）と称することもある）と呼ばれ、２００３年に承認された。この第２ワクチンは、スプレー式点鼻薬によって導入され、弱毒化（衰弱化）ウイルスを含むものである。世界保健機構（ＷＨＯ）によると、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスは、いずれも急性呼吸器疾患の主な原因である。両方のウイルス型は相当な疾病率及び死亡率の伝染病を引き起こすが、Ｂ型インフルエンザの感染は地域的な発生に限定されることが多い一方で、Ａ型インフルエンザウイルスは、世界的な流行を含むより大きな伝染病の基本的な原因となる。インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルスファミリーの一員であり、ヒト、ウマ、イヌ、トリ及びブタを含む広大な宿主範囲を有する。インフルエンザウイルスは、外皮で包まれた、ネガティブセンスＲＮＡウイルスである。このＲＮＡウイルスは、１０個のウイルスタンパク質をコードする８個のＲＮＡ断片中に生成される。ウイルスは、感染した宿主細胞の核において複製する。インフルエンザウイルスは、若年者及び高齢者、又は免疫傷害を有する個体にとって最も危険である。ウイルスはトリの卵に高濃度に伝播され得る。この卵は、インフルエンザワクチン生産のために、ウイルス生成の媒体として提供される。

Ｂ型インフルエンザウイルスはあまり改変を受けないが、Ａ型インフルエンザウイルスは、その表面の抗原において頻繁に改変を受ける。１つの株による感染に従って起こる免疫は、後の抗原変異体に対して完全には防御しない可能性がある。結果として、次の伝染病を最も引き起こしそうな流布株に適した、インフルエンザに対する新たなワクチンが毎年設計される必要がある。それゆえに、ＷＨＯは、人々の間に流布され、最も流行したインフルエンザ株の調査に基づいたデータを毎年収集し、インフルエンザワクチン組成のための提言を作成している。近年、ワクチンは、その内部にＡ型インフルエンザウイルスの２つのサブタイプと、１つのＢ型インフルエンザウイルスを含んでいる。このワクチンは、典型的には、臨床疾患に対して健康な成人者の約５０％〜８０％を防御する。

組換えＤＮＡ技術によって生成され得た開発品であるサブユニットワクチンは、限定された免疫原性のみ発現するため、これまで期待はずれになっている。１つの例として、いくつかのＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）サブユニットワクチンに対する最近の臨床試験が挙げられる。ＨＩＶサブユニットワクチンは、ワクチンの効果が制限されるだけでなく、免疫された個体において、後にＨＩＶが発症したときに、加速された病気の進行が見られる場合があるため（例えば、Cohen, Science 264:1839 (1994)及びCohen, Science 264: 660 (1994)）、使用が中止されている。サブユニットワクチンの１つの欠点は、ウイルス及び組換えウイルスワクチンを殺傷するのと同様に、サブユニットワクチンは、体液性免疫反応の刺激を示す一方で、防御細胞性免疫の誘導に失敗することである。１９９４年の国際ＡＩＤＳ会議における主な結論は、ＨＩＶ感染の抑制又は減少のために、細胞傷害性Ｔ細胞による反応が引き続き必要であり、臨床において現状ワクチンが不足しているというものであった。加えて、現在試験されているＨＩＶワクチンは、初期ＨＩＶ感染が生じた粘膜表面における免疫の誘導に失敗している。

さらに、米国において使用認可された唯一の補助剤は、アルミニウム塩、アルミニウム水酸化物及びアルミニウムリン酸塩であるが、これらはいずれも細胞性免疫を刺激しない。加えて、形成されたアルミニウム塩は、凍結又は凍結乾燥することができない。さらに、このような補助剤は、全ての抗原に効果的ではない。

酵母細胞は、上述したＨＩＶワクチン試験において試験されたものをいくつか含む、タンパク質ワクチンサブユニットの生成に用いられている。酵母はまた、非特異的方法において、主要な免疫反応を試験するための免疫前に動物に与えられている（例えば、補体及びインターフェロンの生成と同様に、ファゴサイトーシスを刺激するため）。結果は、不明瞭であり、このようなプロトコルによっては防御細胞性免疫が引き起こされてない（例えば、Fattal-GermanらによるDev. Biol. Stand. 77: 115-120 (1992)及びBizziniらによるFEMS Microbiol. Immunol. 2: 155-167 (1990)を参照のこと）。

以前の研究は、ワクチン及び免疫療法ベクターとしての、組換えＳ．セレビジアエ（S. cerevisiae）酵母の可能性を示している（例えば、米国特許5,830,463及び7,083,787参照のこと、同様に米国特許公報2004-0156858 A1及び2006-0110755 A1参照のこと）。これらの酵母に基づく免疫療法産物は、in vivoで免疫反応の誘導を示している。この免疫反応は、様々な動物種において、様々なウイルス抗原及び癌抗原を発現する標的細胞を殺傷することが可能である。また、抗原特異的ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による方式においても同様に使用されることを示している。より具体的には、他の研究は、サッカロマイス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、樹上細胞によって激しく捕食され、樹状細胞を直接活性化することによって、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞に高精度に酵母に関連したタンパク質が存在することが示された（例えば、Stubbs et al. Nature Med. 5:625-629 (2001)及び米国特許7,083,787参照のこと）。

樹状細胞に直接相互作用し得ることに加えて、酵母は、免疫療法のための理想的な基本骨格となる他の特性の多様性を有している。第１に、複数の抗原を単一の酵母菌株内において発現させるように設計できることである（例えば、 Pichuantesらによる“Expression of heterologous gene products in yeast.” In Protein Engineering - Principles and Practice, pp. 129-162, J. L. Cleland and C. S. Craik, eds., Wiley-Liss, NewYork (1996)参照のこと）。これらの構築物は、構築の容易性及び複数の抗原を標的とし得る点を含む、多くの利点をＤＮＡワクチンと共有する。ＤＮＡワクチンと異なり、酵母を構成要素とする免疫療法構築物は、潜在的な毒物汚染物質を除去するための甚大な精製を要求しない。米国食品医薬品庁（ＦＤＡ）は、酵母をＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）として示している。したがって、他のワクチンベクターに存在する毒性及び安全性に対する問題は、酵母を構成要素とする運搬媒体には適用されない。

効果的なワクチンの生成に対して存在する全ての試みにも関わらず、種々の免疫反応を刺激する効果的なワクチン組成物が依然として、必要である。インフルエンザワクチンに関して、子供、高齢者及びある高リスクなグループ間における疾患率は、未だに非常に高く、発展途上国においては、ワクチン接種は時々行われるか、全く存在していないかである。先進国においては、高コスト及び現在の技術を用いたワクチン製造に要求される時間という製造の問題によって、患者人口に対応する十分なインフルエンザワクチンの製造が妨げられている。加えて、新たなウイルス株の恐怖及び未来の伝染病の可能性が、より効果的で、効率よく製造されたインフルエンザワクチンに対する関心を高めている。それゆえに、長期間持続し、インフルエンザの様々な菌株に対して効果的に防御する、進歩したワクチンのための技術が必要である。さらに、迅速に製造され、ヒトや他の動物に安全に使用できるワクチンのための技術も必要である。しかしながら、これらの問題及び必要性は、インフルエンザワクチンに特異的ではなく、他のウイルス及び他の感染因子に対するワクチンも含み、他の種類のワクチンにまで広がるものである。

実際には、バクテリア及び寄生動物を含む多くの病原体は、段階的に個体に感染し、各段階に対処する免疫システムのために、抗原の異なるサブセットが存在する。加えて、多くの病原体は、病原体が免疫システムから「隠れる」又は逃げるために、一連の戦略を展開させる。最後に、上述したウイルスと同様に、多くの病原体が進化し、特にその表面に発現する又は位置する抗原を変異している。さらにまた、複雑なワクチン戦略の全てによって、複数の病原体種又は株に同時に感染することが可能である。一例として、寄生動物（例えば、プラスモディウム ファルシパラム（Plasmodium falciparum） 又はプラスモディウム ビバックス（Plasmodium vivax））の感染は、マラリアを引き起こす。マラリアに感染した蚊にかまれた結果、まずスポロゾイトとして血流を通過して体内に浸入する。そして、スポロゾイトがメロゾイトに急激に変化し、迅速に肝細胞が感染する。メロゾイトは肝細胞から放出され、血液細胞に迅速に感染する。そしてそこで、寄生動物が増殖し、分化し、他の細胞への感染が続く。その結果、典型的なワクチンは、血液中、肝臓中、又は赤血球中の何れであろうと、寄生動物の全ての段階を認識し破壊するための免疫システムを準備することができる。しかしながら、ワクチンの多大部分は、病気又は個体の中毒化の原因となる病原体の可能性を制限することに焦点を当てる代わりに、全ての感染を妨害又は根絶することができない。その上、ライフサイクルの他の段階及び非活動期の感染が対処されないままで残ることになる。

それゆえに、感染病又は他の因子が原因となる病気の伝染を治療するために、病気又は予防する或いは治療する状態に応じて、及び／又は与えられた時点における特定の抗原或いは病原体に対する個体の免疫段階に応じて、細胞性免疫反応を優先的に誘導する（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）の生成）、体液性免疫反応を優先的に誘導する（例えば、抗体反応）、又は両方の免疫反応を誘導するような型の免疫反応の誘導を制御又は支配する可能性を有することが望まれている。加えて、わずかな投与で効果的な免疫反応を刺激する組成物が提供されれば有益である。また、低レベルの抗原の暴露による免疫反応の刺激は、投与量の節約に効果的である。

ここに記載された本発明は、上述した必要性を対処するための組成物及び方法を提供する。酵母ベースワクチンを基本骨格とする技術に基づく免疫療法製品（例えば、ワクチン）は直接的に製造され、宿主免疫反応によって無効化されず、抗原特異的免疫反応を増強するために繰り返し投与されることが可能であり、製造時に患者に特異的な取り扱いが要求されない。

本発明の一実施形態は、ワクチンに関する。ある局面において、ワクチンは、（ａ）少なくとも１つの異種細胞内抗原を含む第１酵母運搬体と、少なくとも１つの異種細胞外抗原を含む第２酵母運搬体とを含む。ある局面において、ワクチンは、（ａ）少なくとも１つの異種細胞内抗原及び少なくとも１つの異種細胞外抗原を含む第１酵母運搬体と、（ｂ）少なくとも１つの異種細胞内抗原又は少なくとも１つの異種細胞外抗原を含む第２酵母運搬体とを含む。他の局面において、ワクチンは、（ａ）少なくとも１つの異種細胞内抗原及び少なくとも１つの異種細胞外抗原を含む酵母運搬体と、（ｂ）上記（ａ）の酵母運搬体に包含される少なくとも１つの抗原又は同様の病原体若しくは病気からの抗原を含む非酵母組成物とを含み、非酵母組成物が、ＤＮＡワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、及び殺傷された又は不活化された病原体から選択される。

本発明の上述した実施形態において、（ａ）の酵母運搬体は、（ｂ）の非酵母組成物と比べて同一の又は異なる投与経路によって運搬されるように形成されることができる。ある局面において、細胞内抗原は、病原体によって細胞内に発現される抗原である。ある局面において、細胞外抗原は、いくつかの型の病原体に亘って構造的に保存された抗原である。ある局面において、細胞外抗原は、病原体の表面に発現する抗原である。ある局面において、細胞外抗原は、同様の型の病原体に亘って構造的に可変の抗原である。ある局面において、抗原は感染性の病原体由来である。

本発明の他の実施形態は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含むワクチンに関する。ある局面において、ワクチンは（ａ）酵母運搬体、及び（ｂ）酵母運搬体によって発現する又は提供されるインフルエンザウイルス融合タンパク質を含み、インフルエンザウイルス融合タンパク質は、インフルエンザマトリックス（Ｍ１）タンパク質及びインフルエンザイオンチャネル（Ｍ２）タンパク質から選択されるインフルエンザタンパク質の少なくとも一部を含む。ある局面において、ワクチンは、（ａ）インフルエンザマトリックス（Ｍ１）タンパク質、インフルエンザイオンチャネル（Ｍ２）タンパク質及びヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）から選択されるインフルエンザタンパク質の、少なくとも一部を含むインフルエンザウイルス融合タンパク質を発現する第１酵母運搬体と、（ｂ）血球凝集素（ＨＡ）タンパク質及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質から選択されるインフルエンザタンパク質の、少なくとも一部を含むインフルエンザウイルス融合タンパク質を発現する、少なくとも１つの追加酵母運搬体とを含む。ある局面において、ワクチンは、（ａ）酵母運搬体と（ｂ）酵母運搬体によって発現された又は提供されたインフルエンザウイルス融合タンパク質とを含み、インフルエンザウイルス融合タンパク質は、インフルエンザマトリックス（Ｍ１）タンパク質、インフルエンザイオンチャネル（Ｍ２）タンパク質、及びヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）から選択される少なくとも１つの第１インフルエンザタンパク質の少なくとも一部と、血球凝集素（ＨＡ）タンパク質及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質から選択される少なくとも１つの第２インフルエンザタンパク質の少なくとも一部とを含んでいる。他の局面において、ワクチンは、（ａ）酵母運搬体と、（ｂ）酵母運搬体によって発現される又は提供される第１インフルエンザウイルス融合タンパク質であって、インフルエンザマトリックス（Ｍ１）タンパク質、インフルエンザイオンチャネル（Ｍ２）タンパク質、及びヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）から選択される、少なくとも１つのインフルエンザタンパク質の、少なくとも一部を含むインフルエンザウイルス融合タンパク質と、（ｃ）酵母運搬体によって発現される第２インフルエンザウイルス融合タンパク質であって、血球凝集素（ＨＡ）タンパク質及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質から選択される少なくとも１つのインフルエンザタンパク質の、少なくとも一部を含む第２インフルエンザウイルス融合タンパク質とを含む。さらに他の局面において、ワクチンは、（ａ）酵母運搬体と、（ｂ）インフルエンザマトリックス（Ｍ１）タンパク質、インフルエンザイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）、及びヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）から選択される少なくとも１つの第１インフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも一部と、（ｃ）血球凝集素（ＨＡ）タンパク質及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質から選択される、少なくとも１つの第２インフルエンザタンパク質の少なくとも一部とを含む。

上述した実施形態において、ある局面においては、ＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６から選択される。ある局面において、ＮＡタンパク質は、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８及びＮ９から選択される。ある局面において、ＮＡタンパク質はＮ１及びＮ２から選択される。ある局面において、Ｍ１タンパク質は、酵母運搬体に関して細胞内にある。ある局面において、Ｍ２タンパク質は、酵母運搬体に関して、細胞内、細胞外、又はその両方にある。ある局面において、Ｍ２タンパク質は、Ｍ２ｅである。ある局面において、ＮＰタンパク質は、酵母運搬体に関して細胞内にある。ある局面において、ＨＡタンパク質又はＮＡタンパク質は、酵母運搬体に関した細胞外にある。ある局面において、ＮＡタンパク質は、酵母運搬体に関して細胞内にもあることができる。

上述した実施形態において、ある局面においては、インフルエンザウイルス融合タンパク質は、そのＮ末端に配列番号１（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列を含んでいる。ある局面において、インフルエンザウイルス融合タンパク質は、そのＮ末端又はＣ末端に、融合タンパク質が酵母運搬体の細胞壁を標的とするのに十分な、Ａｇａ２タンパク質又はＣｗｐ２タンパク質の少なくとも一部を含んでいる。

本発明の他の実施形態は、（ａ）酵母運搬体と、（ｂ）単一の細胞内融合タンパク質として酵母運搬体に発現したＭ１抗原を含むインフルエンザウイルス融合タンパク質とを含み、当該融合タンパク質が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる、ワクチンを含んでいる。

本発明の他の実施形態は、（ａ）酵母運搬体と、（ｂ）単一の細胞内融合タンパク質として酵母運搬体に発現したＨ１抗原を含むインフルエンザウイルス融合タンパク質とを含み、当該融合タンパク質が配列番号６及び２０から選択されるアミノ酸配列からなる、ワクチンを含んでいる。

本発明のさらに他の実施形態は、（ａ）酵母運搬体と、（ｂ）単一の細胞外融合タンパク質として酵母運搬体に発現したＨ１抗原を含むインフルエンザウイルス融合タンパク質とを含み、当該融合タンパク質が配列番号１０、２６、２８及び３６から選択されるアミノ酸配列からなる、ワクチンを含んでいる。

本発明のさらに他の実施形態は、（ａ）酵母運搬体と、（ｂ）単一の細胞外融合タンパク質として酵母運搬体に発現したＨ５抗原を含むインフルエンザウイルス融合タンパク質とを含み、当該融合タンパク質が配列番号１４、２２及び２４から選択されるアミノ酸配列からなる、ワクチンに関する。

本発明のさらに他の実施形態は、（ａ）酵母運搬体と、（ｂ）単一の細胞内融合タンパク質として酵母運搬体に発現したＭ１抗原、Ｎ１抗原及び４つのＭ２ｅ抗原を含むインフルエンザウイルス融合タンパク質とを含み、当該融合タンパク質が配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる、ワクチンに関する。

本発明の他の実施形態は、（ａ）酵母運搬体と、（ｂ）単一の細胞内融合タンパク質として酵母運搬体に発現したＮ１抗原及びＭ２ｅ抗原を含むインフルエンザウイルス融合タンパク質とを含み、当該融合タンパク質が配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる、ワクチンに関する。

本発明の他の実施形態は、（ａ）酵母運搬体と、（ｂ）単一の細胞外融合タンパク質として酵母運搬体に発現したＨ３抗原及びＮ２抗原を含むインフルエンザウイルス融合タンパク質とを含むワクチンに関する。

上記実施形態のいずれかにおいて、ある局面においては、融合タンパク質の発現が、誘導し得るプロモータに制御される。上記実施形態のいずれかのある局面において、このプロモータは、ＣＵＰ１及びＴＥＦ２から選択される。

上記実施形態のいずれかのある局面において、酵母運搬体は、酵母全体、酵母スフェロプラスト、酵母細胞質体、酵母ゴースト（ｇｈｏｓｔ）、酵母細胞壁調製品及び亜細胞酵母膜抽出物又はその小断片から選択される。上記実施形態のいずれかのある局面において、酵母運搬体を準備するために用いられる酵母細胞又は酵母スフェロプラストは、融合タンパク質をコードする組換え核酸分子で形質転換されたものであり、これにより融合タンパク質が酵母細胞又は酵母スフェロプラストに発現する。上記実施形態のいずれかのある局面において、融合タンパク質を発現した酵母細胞又は酵母スフェロプラストは、酵母細胞質体、酵母ゴースト、酵母細胞壁調製品又は亜細胞酵母膜抽出物若しくはその小断片を含む酵母運搬体を生成するために用いられる。上記実施形態にいずれかのある局面において、酵母運搬体は、非病原酵母である。上記実施形態のいずれかのある局面において、酵母運搬体は、サッカロマイス（Saccharomyces）、スキゾサッカロマイス（Schizosaccharomyces）、クルベロマイス（Kluveromyces）、ハンセヌラ（Hansenula）、カンジダ（Candida）及びピチア（Pichia）から選択される酵母運搬体である。上記実施形態のいずれかのある局面において、サッカロマイスはＳ．セレビジアエ（S. cerevisiae）である。

上記実施形態のいずれかのある局面において、ワクチンはさらに、樹状細胞を備えており、当該樹状細胞は、細胞内に酵母運搬体が積載されている。
上記実施形態のいずれかのある局面において、ワクチンはさらに、少なくとも１つの生物反応修飾物質を備えている。

本発明の他の実施形態は、抗原特異的免疫反応を誘導するための構築物の調整における、ここに記載されたいずれかのワクチンの使用方法に関連する。
本発明のさらに他の実施形態は、インフルエンザ感染に対する動物の防御のための構築物の調整における、ここに記載されたいずれかのワクチンの使用方法に関連する。

本発明の他の実施形態は、インフルエンザ抗原に対する抗原特異的細胞性免疫反応を誘導するための構築物の調整における、ここに記載されたいずれかのワクチンの使用方法に関連する。

本発明のさらに他の実施形態は、病気又は症状の治療又は予防のための構築物の調整における、ここに記載されたいずれかのワクチンの使用方法に関連する。
本発明の他の実施形態は、インフルエンザに感染する危険にさらされた個体群を免疫するための構築物の調整における、ここに記載されたいずれかのワクチンの使用方法に関連する。

本発明の他の実施形態は、インフルエンザに感染した個体群を治療するための構築物の調整における、ここに記載されたいずれかのワクチンの使用方法に関連する。
本発明の他の実施形態は、ここに記載したいずれかの酵母ベースワクチン（酵母運搬体を含有するワクチン）を製造するための方法に関し、ｐＨ５．５よりも高いｐＨでワクチン内の酵母運搬体を培養する工程を包含している。

本発明のさらに他の実施形態は、インフルエンザワクチンの製造方法に関し、酵母運搬体をインフルエンザ抗原融合タンパク質で形質転換する工程を包含し、インフルエンザ抗原融合タンパク質は、インフルエンザ細胞間質（Ｍ１）タンパク質、インフルエンザイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）、インフルエンザウイルスヌクレオカプシド（ＮＰ）タンパク質、血球凝集素（ＨＡ）タンパク質、及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質から選択されるインフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも一部を包含している。ある局面において、上記方法は、ｐＨ５．５よりも大きいｐＨで酵母運搬体を培養する工程を包含する。さらなる局面は、インフルエンザウイルスタンパク質を酵母運搬体に積載する工程、インフルエンザウイルス抗原と上記酵母運搬体とを共に混合して、インフルエンザウイルス抗原を酵母運搬体に物理的に付着させる工程、注入によって個体に導入するために上記形質転換酵母運搬体を形成する工程、又は鼻内導入によって個体に導入するために上記形質転換酵母運搬体を形成する工程を含んでいる。

本発明の他の実施形態は、インフルエンザ感染に対して動物を防御するための方法に関する。当該方法は、インフルエンザに感染している動物又はインフルエンザに感染する危険性のある動物に、ここに記載した、インフルエンザ抗原を含むワクチンのいずれかを導入する工程を包含し、動物へのワクチンの導入が、インフルエンザ感染又は動物のインフルエンザ感染の結果として生じる、少なくとも１つの症状を、減少又は回避する。

本発明のさらに他の実施形態は、インフルエンザ抗原に対する抗原特異的免疫反応を誘導するための方法に関し、ここに記載した、インフルエンザ抗原を含むワクチンのいずれかを動物に導入する工程を含む。

本発明の他の実施形態は、インフルエンザに感染した個体群において、インフルエンザ抗原に対する抗原特異的免疫反応を誘導するための方法に関し、ここに記載した、インフルエンザ抗原を含むワクチンのいずれかを個体群に導入する工程を含む。

本発明の他の実施形態は、インフルエンザに感染する危険性のある個体群に、インフルエンザに対して免疫にするための方法に関し、ここに記載した、インフルエンザ抗原を含むワクチンのいずれかを個体群に導入する工程を含む。ある局面において、ワクチンは、異なるインフルエンザワクチンで増強させる前に免疫システムを引き出すために導入される。

本発明のさらに他の実施形態は、個体を病気又は症状に対して免疫するための方法に関し、（ａ）病気又は症状に関連する少なくとも１つの異種細胞内抗原を含む酵母運搬体を含む、第１ワクチンを個体に導入する工程と、（ｂ）（ａ）の導入後少なくとも２週間に、細胞外異種抗原と細胞外及び細胞内の両方の抗原とを含む酵母運搬体を含む、第２ワクチンを個体に導入する工程と、を包含する。ある局面において、第１ワクチンの酵母運搬体は、少なくとも１つの細胞外抗原もまた含んでいる。この局面において、抗原は、細胞内抗原と同一の抗原又は異なる抗原であってもよい。

本発明に係る他の実施形態は、病気又は症状に対する個体を免疫するための方法に関し、（ａ）病気又は症状に関連する少なくとも１つの異種細胞内抗原を細胞内に含み、病気又は症状に関連する少なくとも１つの異種細胞外抗原を含む、第１ワクチンを個体に導入する工程と、（ｂ）（ａ）の導入工程と共に又は（ａ）の導入工程に続けて、第２ワクチンを個体に導入する工程とを包含する。当該方法において、第２ワクチンは、（ｉ）工程（ａ）で用いられた異種抗原、又は同一の病原体あるいは病気からの抗原であって、酵母に対して細胞外、若しくは細胞内及び細胞外の両方にある抗原、の少なくとも１つを発現する又は提供する酵母運搬体、（ｉｉ）工程（ａ）で用いられた異種抗原又は同一の病原体若しくは病気からの抗原の少なくとも１つ含む、酵母膜又は酵母細胞壁微粒子、（ｉｉｉ）工程（ａ）で用いられた異種抗原、又は同一の病原体若しくは病気からの抗原の少なくとも１つの混合物における酵母運搬体、（ｉｖ）工程（ａ）で用いられた抗原、又は同一の病原体若しくは病気からの抗原の少なくとも１つをコードするＤＮＡワクチン、（ｖ）工程（ａ）で用いられた抗原、又は同一の病原体若しくは病気からの抗原の少なくとも１つを含むタンパク質サブユニットワクチン、ならびに（ｖｉ）工程（ａ）で用いられた異種抗原の少なくとも１つを含む、殺傷された若しくは不活化された病原体から選択される。ある局面において、細胞内抗原は、細胞外抗原と同一の抗原である。ある局面において、細胞内抗原は、細胞外抗原と異なっている。ある局面において、細胞内抗原は病原体の内部に発現した抗原である。ある局面において、細胞外抗原は、同型の病原体間において構造的に保存された抗原である。ある局面において、細胞外抗原は、病原体の表面に発現した抗原である。ある局面において、細胞外抗原は、同型の病原体間において構造的に変異可能な抗原である。ある局面において、抗原は、感染性の病原体からの抗原である。

本発明の他の実施形態は、個体における、細胞性免疫反応、体液性免疫反応、又はこれらの組合せを誘導する構造物を調整するためのキットに関する。当該キットは、少なくとも１つの細胞内異種抗原又は少なくとも１つの細胞外異種抗原を、それぞれ含む複数の酵母運搬体と、構造物を調整するために当該酵母運搬体を使用するための使用説明書とを備えている。ある局面において、酵母運搬体は抗原を発現する。ある局面において、キットはまた、（ａ）異種抗原又は同一の病原体若しくは病気からの抗原の少なくとも１つを含む酵母膜又は酵母細胞壁微粒子、（ｂ）異種抗原又は同一の病原体若しくは病気からの抗原の少なくとも１つの混合物中の酵母運搬体、（ｃ）少なくとも１つの抗原又は同一の病原体若しくは病気からの抗原の少なくとも１つをコードするＤＮＡワクチン、（ｄ）少なくとも１つの抗原又は同一の病原体若しくは病気からの抗原の少なくとも１つを含むタンパク質サブユニットワクチン、及び／又は（ｅ）異種抗原の少なくとも１つを含む、殺傷された又は不活化された病原体から選択される、少なくとも１つの追加構成物を備えている。ある局面において、細胞内抗原は、病原体内に発現した抗原である。ある局面において、細胞外抗原は、同型の病原体間において構造的に保存された抗原である。ある局面において、細胞外抗原は、病原体の表面に発現した抗原である。ある局面において、細胞外抗原は、同型の病原体間において構造的に変異可能な抗原である。

インフルエンザウイルス及びそのいくつかの構成要素を示す概略図である。より高度に保存された抗原のいくつかを円で囲んだ。 酵母内における、インフルエンザ細胞間質タンパク質１（Ｍ１、又はＭＰあるいはＭＰ１と称することもある）の細胞内発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像である。 インフルエンザ感染標的細胞を殺傷する、Ｍ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞（図３Ａ）及びインフルエンザウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞（図３Ｂ）の両方を、細胞内において誘導する、インフルエンザ細胞間質タンパク質（Ｍ１）を発現した酵母運搬体で免疫したマウスにおける、ＣＴＬ分析の結果を示している。 インフルエンザ感染標的細胞を殺傷する、Ｍ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞（図３Ａ）及びインフルエンザウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞（図３Ｂ）の両方を、細胞内において誘導する、インフルエンザ細胞間質タンパク質（Ｍ１）を発現した酵母運搬体で免疫したマウスにおける、ＣＴＬ分析の結果を示している。 インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４に感染したＰ８１５細胞からの溶解物のウエスタンブロットのデジタル画像を示し、Ｐ８１５細胞がインフルエンザウイルスに感染可能であり、ＣＴＬ分析の標的細胞として使用可能であることを示している。 Ｍ１特異的Ｔ細胞反応を細胞内において誘導する、インフルエンザ細胞間質タンパク質（Ｍ１又はＭＰ）を発現する酵母運搬体で免疫したマウスにおける、Ｔリンパ球の増殖分析の結果を示している。 インフルエンザ特異的Ｔ細胞反応を細胞内において誘導する、インフルエンザ細胞間質タンパク質（Ｍ１）を発現する酵母運搬体で免疫したマウスにおける、Ｔリンパ球の増殖分析の結果を示している。 ウエスタンブロットのデジタル画像（上図）、及び融合構築物の概略図（下図）であり、Ａｇａ２（Ａｇａ２−ＨＡ）に融合したインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）の、酵母内における細胞内発現を示している。 インフルエンザウイルス特異的ＣＴＬ反応を細胞内で誘導する、Ａｇａ２に融合したインフルエンザ血球凝集素（Ａｇａ２−ＨＡ）を発現した酵母運搬体を用いて、２つの異なる導入経路により免疫したマウスにおけるＣＴＬ分析の結果を示している。 インフルエンザウイルス特異的Ｔリンパ球増殖反応を細胞内で誘導する、Ａｇａ２に融合したインフルエンザ血球凝集素（Ａｇａ２−ＨＡ）を発現した酵母運搬体を用いて、２つの異なる導入経路により免疫したマウスにおける、Ｔリンパ球増殖分析の結果を示している。 酵母運搬体の表面において、目的とする標的抗原のいずれかの発現及び局在を可能にする、タルモゲン（Tarmogen）を構築する仕組みを示している（上部パネル）。下部パネルは、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４を細胞外に提示する（その表面において提示する）ように構築された酵母運搬体であり、ＧＩ−８００３としても知られる特定のタルモゲン（Tarmogen）を示している。 抗原が酵母表面に提示されるように構築された、模範的な構築物を示している。この図は、どれほど様々な酵母タンパク質がスペーサーアームとして使用され得るかの例を、概略的に示している。 細胞壁タンパク質２（ｃｗｐ２）を介してインフルエンザＨＡタンパク質を酵母表面に発現した、図１０ＢのＶＫ８として参照された融合タンパク質を発現するタルモゲン（Tarmogen）を示している。また、図１１は、酵母運搬体単独（ＧＩ−１００１又はＹＶＥＣ）と比較した、正常細胞のフローサイトメトリー分析による、酵母表面ＨＡ（ＧＩ−８０００−Ｓとしても知られているタルモゲン（Tarmogen））発現のヒストグラムを示している。 インフルエンザＨＡタンパク質を表面に局在させるために、様々なアプローチを活用した、ヒストグラムを示しており、図１２Ｂ及び１２Ｃのためのコントロールの酵母（ＹＥＸ）を示している。 インフルエンザＨＡタンパク質を表面に局在させるために、様々なアプローチを活用した、ヒストグラムを示しており、タルモゲン（Tarmogen）を発現するＶＫ４による発現を示している。 インフルエンザＨＡタンパク質を表面に局在させるために、様々なアプローチを活用した、ヒストグラムを示しており、タルモゲン（Tarmogen）を発現するＴＫ７５−１５による発現を示している。 インフルエンザＨＡタンパク質を表面に局在させるために、様々なアプローチを活用した、ヒストグラムを示しており、図１２Ｅ〜１２Ｇのためのコントロール酵母（ＹＥＸ）を示している。 インフルエンザＨＡタンパク質を表面に局在させるために、様々なアプローチを活用した、ヒストグラムを示しており、酵母をグリコシル化したときの、酵母によるＨＡ ＶＫ８の発現を示している。 インフルエンザＨＡタンパク質を表面に局在させるために、様々なアプローチを活用した、ヒストグラムを示しており、酵母を脱グリコシル化したときの、酵母によるＨＡ ＶＫ８の発現を示している。 インフルエンザＨＡタンパク質を表面に局在させるために、様々なアプローチを活用した、ヒストグラムを示しており、Ｌｕ００２発現スフェロプラスト調製物の原形質膜上におけるＨＡの発現を示している。 細胞内インフルエンザ結集凝集素（ＨＡ）を発現するための構築物の概略図であり、図１３Ａに示すように、保存されたインフルエンザ抗原Ｍ１、ＮＰ及びＭ２の細胞内発現に結合され得る。 細胞外インフルエンザ結集凝集素（ＨＡ）を発現するための構築物の概略図であり、図１３Ａに示すように、保存されたインフルエンザ抗原Ｍ１、ＮＰ及びＭ２の細胞内発現に結合され得る。 ３つの投与計画を用いたときの抗体生成を示している。投与計画ＡはＰＢＳのみを用いている（コントロール）。投与計画Ｂは、プライミングのために、０日目及び２８日目にＰＢＳを使用し、増強するために、５６日目に水溶性オボアルブミンタンパク質（ｏｖａ）を使用した。投与計画Ｃは、プライミングのために、オボアルブミンを発現した酵母運搬体（ＯＶＡＸ）を使用し、増強するために、水溶性オボアルブミンタンパク質を用いた。 ３つの投与計画を用いたときのＴ細胞プライミングを示している。上述した３つの投与計画のそれぞれにより免疫したマウスから回収したＴ細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける再刺激のために、様々な量の水溶性オボアルブミンタンパク質を用いたＴ細胞活性分析の結果を示している。 何もコードしていない生ワクチンウイルス、又はＨＩＶ−Ｇａｇタンパク質（ウイルス）をコードする生ワクチンウイルスに感染した直後に観察された体液性反応と比較した、ＨＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現するタルモゲン（Tarmogen）であるＧＩ−２０１０の、抗体反応を引き起こす可能性を試験した実験結果を示している。塩及びコントロールの曲線は、ＧＩ−２０１０及びＹＶＥＣの線の下である（例えばＧＩ−２０１０及びＹＶＥＣの線は、塩及びコントロールの線上に重なっている）。 Ｂ細胞活性と、抗体反応に要求される抗原由来ペプチドに対するヘルパーＴ細胞反応由来シグナルとの合成の要求を示す概略図である（シグナル１を示す）。 Ｂ細胞活性と、抗体反応に要求される抗原由来ペプチドに対するヘルパーＴ細胞反応由来シグナルとの合成の要求を示す概略図である（シグナル２を示す）。 Ａｇａ２に融合したインフルエンザＨＡ１ドメイン（Ａｇａ２−ＨＡ１）の細胞表面発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像である。

本発明は、概して、細胞性免疫反応、体液性免疫反応及びこれらの組合せを含む、様々な型の免疫反応を効果的に誘導するための組成物及び方法に関する。本発明は、広範な種類の抗原（病原体を含む）に対する防御的免疫反応及び／又は治療上の免疫反応を誘導するために有用である。また、本発明における反応は、細胞性免疫反応、体液性免疫反応、又は細胞性免疫反応と体液性免疫反応との両方を、優先的に誘導する（又は確実に誘導する）ために最適化され得る。加えて、本発明に係るワクチン及びワクチン戦略によって誘導された免疫反応は、病原体に対して有効な反応を提供するために最適化され得る。この病原体は、頻繁に変異する、及び／又は同時に複数の種若しくは株で個体に感染する病原体、異なるライフサイクルステージにおいて個体に感染又は存在する病原体、ならびに標的細胞の感染を含む様々な作用による免疫システムを回避する病原体を含む。免疫反応が、病原体の変化型（変異体又はライフサイクル型）及び／又は病原体による宿主細胞の感染若しくは占領を、抑制又は検出できず、免疫反応が回避される又は誤誘導されるにも関わらず、病気の原因となる病原体の可能性を制限するために、体液性免疫反応が少なくともいくらか効果的である場合に、本発明により誘導された免疫反応は特に効果的である。本発明に係るワクチン及びワクチン戦略によって誘導された免疫反応は、病気又は症状を有する個体を防御又は治療するために最適化され得る。この最適化は、特定の病気又は症状に最も有益な免疫反応の型、及び与えられた抗原又は病原体に対する、これらが与えられた時点での患者の免疫状態に依存する。最後に、本発明に係るワクチン及びワクチン戦略は、わずかな導入で効果的な免疫反応を刺激することができる。さらに、本発明に係るワクチン及びワクチン戦略は、低レベルの抗原への露出で免疫反応を刺激するのにも効果的である（投与量の節約）。

本発明は、防御免疫若しくは治療免疫、及び／又はワクチン接種目的に有用であり、様々な抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物及び方法の両方を提供する。ある局面において、本発明は、体液性免疫反応及び細胞性免疫反応の両方を誘導することが可能な組成物を提供する。さらなる局面において、本発明は、目的とする１つ若しくはそれ以上の抗原に対する抗原特異的抗体生成を含む、体液性免疫反応を優先的に誘導する若しくは導くため、又は細胞傷害性Ｔ細胞反応を含む、細胞性（細胞の）免疫反応を優先的に誘導する若しくは導くための組成物及びワクチン戦略を提供する。優先的な誘導によって、免疫反応を特定の免疫反応に押し進める又は向けることが意図される。主として、どのようにして、本発明に係る酵母ベースワクチンを用いた免疫システムに利用可能なように抗原が作製されるのかに基づいている。組成物及び免疫付与戦略は、上述したように、免疫反応の最適化を提供するために特に設計されている。本発明は、また、ＤＮＡワクチンのような非酵母ベースワクチンを用いた、免疫原性又は成功する免疫付与を強調又は捕捉することが可能な組成物及び方法を提供する。

より詳細には、本発明は、米国特許5,830,463及び7,083,787ならびに米国特許公報2004-0156858 A1及び2006-0110755 A1に記載されているように、酵母を基づく免疫治療製品に関するプラットフォーム技術の進歩を導く。また、本発明は、広範な種類の抗原（病原体を含む）に対する防御及び／又は治療免疫反応を誘導するときに用いられる、新規酵母ベースワクチンを提供する。ある局面において、本発明は、特定の抗原に対する優先的に誘導される免疫反応の型を操作するため、ならびに特定の抗原又は複数の抗原に対して個体を最も効果的に免疫するための、及び抗原又は複数の抗原に関連する病気又は症状を最も効果的に抑制又は治療するための免疫反応の可能性を操作するために、細胞内、細胞外（例えば酵母表面発現）又はその両方に抗原を発現又は提供する、酵母ベースワクチン組成物を選択的に設計する可能性、ならびに異なる抗原、ならびに細胞内及び／又は細胞外発現及び／又は局在した抗原の組合せを選択する可能性、を上手く利用している。

例えば、ここに記載された発明を使用する一実施形態において、組成物及び方法は、抗原又は複数の抗原に対する、交差防御、長期間続く免疫を提供するための「一般的な」ワクチンアプローチ、及び重要な細胞性免疫を提供することが記載されている。本発明の要素は、病原体、例えばある抗原が、異なる株又は異なる種の病原体間において、高度に保存されていることに関する事実を上手く利用している。加えて、標的となり得る免疫反応に対するある細胞（例えば腫瘍細胞）が、特定の保存された抗原に共有され得る。このような抗原は、病原体又は細胞の内部に頻繁に発現する（例えば、病原体又は細胞の内部の抗原が、株と株との間、種と種との間、又は細胞と細胞との間で、より保存されやすい一方で、病原体又は細胞の表面に提示された抗原は、免疫検出を回避し逃れるために、より即座に変化又は変異しやすい。）。このような保存された抗原（ウイルスのような病原体内に発現したときに、細胞内抗原として一般に参照され得る。）は、交差防御及び抗原（それゆえに、病原体に感染した又は病原体に占められた細胞に対する抗原）に対する効果的な細胞性（細胞の）免疫を誘導可能な酵母ベースワクチンの基礎を提供する。この局面において、保存された抗原又は内部抗原は、主として、本発明に係る酵母運搬体によって、細胞内に発現又は提供される。この型の抗原の発現は細胞内発現に限定されないが、保存された抗原又は内部抗原は、以下に示すように、本発明に係る酵母運搬体によって、細胞外（酵母の表面上）にもまた、若しくは代替的に発現又は提供され得る。

本発明に係る酵母運搬体における、抗原の細胞内発現又は局在（例えば、発現、細胞内組み込み、又は酵母の細胞内環境内に含まれる酵母を提供するいずれかの他の方法）は、一般に、いずれかの抗原に対する細胞性免疫反応を優先的に誘導するのに有用であり、より詳細には、細胞性免疫反応が即座に誘導される状況において、抗原を提供する。一方、特に、細胞外環境において野生型の抗原が生じる、又は生じる可能性があるとき（例えば、先行感染、病気又は予防接種）体液性免疫反応もまた、このアプローチによって導かれる又は引き起こされる。酵母運搬体による抗原の細胞内発現又は供給は、抗原の導入又は初期ワクチン接種に特に有用である。これにより、強力な細胞性免疫反応の提供により、及び好ましくは免疫記憶により、（例えば、免疫作用の増幅、感染又は病気を通した）抗原による将来の攻撃に対する細胞性及び体液性の両方を目的とする免疫反応を強調し得るからである。抗原の細胞内発現又は供給は、上述した保存された抗原又は内部抗原、及び以下に示す可変の又は外部抗原を含む、いずれかの抗原に対する免疫反応の誘導に有用である。

他の実施形態において、組成物及び方法は、株、種又は抗原変異体特異的免疫反応を誘導するように設計されて提供される。例えば、このアプローチは、特に病原体の突然変異体、株、種若しくはライフサイクルステージ、又は特に抗原変異体に関連した、より特異的な抗原に対する宿主を免疫する。この変異体は、例えば、表面抗原に基づいて選択された３つのウイルス群を代表する３つのウイルス株をたいてい含む、従来の殺傷されたウイルスワクチンにおいて既に変異したものである。言い換えると、本発明のこの局面はさらに、多くの病原体及び細胞が、特にその病原体又は細胞表面に（表面抗原は一般に外部抗原としてここに参照される）、変化に富んだタンパク質（可変タンパク質）を発現するという事実を上手く利用する。これにより、抗原又は病原体に対して、非常に直接的な免疫、又は周期的な免疫でさえを提供する、酵母ベースワクチンを作製するために用いられ得る。本発明の１つの局面において、このような抗原は、主として、本発明に係る酵母運搬体によって、細胞外（表面上）に発現する。可変の又は外部抗原の発現は、酵母運搬体上における、抗原の細胞外発現又は細胞外供給に限定されず、このような抗原は、以下に示すように、本発明に係る酵母運搬体によって細胞内にもまた、又は代替えとして発現し得る。

本発明に係る酵母運搬体による、細胞外又は表面の抗原の発現又は提供（例えば、表面発現若しくは抗原の酵母運搬体の外側表面への転座の結果として発現することによる、外側表面への抗原の付着による、又は酵母からの抗原の分泌による）は、抗原に対する体液性免疫反応を優先的に誘導する。また、より詳細には、酵母運搬体によって抗原が細胞内に発現したときと比較して、体液性免疫反応の誘導を強調する。一方で、細胞性免疫反応もまた、このアプローチによっても導かれる又は誘導される。確かに、上述した従来の殺傷されたウイルスワクチンと比較して、このようなワクチンの１つの利点は、例えば、ウイルスに対する中和抗体を主として誘導することである。本発明に係るワクチンは、これらの表面抗原に対する細胞性及び体液性の両方の免疫反応を誘導することができる。酵母運搬体による抗原の細胞外発現又は供給は、上述した保存された若しくは内部抗原、及び可変の若しくは外部抗原を含む、いずれかの抗原に対する免疫反応を誘導するために有用である。しかしながら、酵母運搬体における抗原の細胞外発現又は供給は、可溶性抗原、細胞表面発現抗原、又は病原体表面発現抗原のように、免疫システムが細胞外環境における攻撃を予期するような抗原に対する免疫反応の誘導に特に有用である。これにより、このような抗原に対する体液性免疫反応の発展が望まれる。

ある局面において、本発明はまた、細胞性及び体液性の両方の免疫を効果的に誘導する強力な新規ワクチンを提供するために、２つのワクチンを組み合わせて上述のようにアプローチする。これにより、特に抗原突然変異体又は病原体種、病原体株若しくは病原体変異体に対する、交差防御免疫及びより特異的な免疫の両方を提供するように設計することができる。例えば、インフルエンザ感染のようなウイルス感染を参照すると、組合せワクチンアプローチは、ウイルス株特異的抗原アプローチ共に「一般的な」方法である交差防御において、インフルエンザウイルス感染にたいして強力な免疫反応を誘導する。このアプローチは、インフルエンザウイルスに対して、細胞性及び体液性の両方の免疫反応を誘導するだろう。さらに、本発明の好ましい実施形態において、このアプローチは、交差防御及びウイルス株に特異的な方法の両方で行われる。

本発明のこの実施形態において、ワクチンはいずれかの又は複数の方法によって設計されることができる。例えば、ある局面において、病原体からの保存された抗原（例えばウイルス内部抗原）は、酵母運搬体によって細胞内に発現又は供給されることができる。さらに、病原体からの可変抗原（例えばウイルス表面抗原）は、酵母運搬体によって細胞外に発現又は供給されることができる。このような酵母運搬体を用いた免疫付与は、ウイルスに対する細胞性及び体液性の両方の免疫反応を誘導するだろう。また、これらの誘導は、交差防御方法及びウイルス株に特異的な方法の両方によって行われるだろう。このような酵母運搬体を含むワクチンによって免疫した個体は、保存された抗原に対して強力な細胞性免疫を有し、可変の抗原に対して強力な体液性免疫を有している。一方で、両方の型の免疫反応は、両方の型の抗原に対して導かれるだろう。この第１実施例が、ウイルスに対する免疫反応を向上させる又は修飾するためにどのように変更され得るかは、当業者に明白だろう。例えば、保存された抗原及び可変の抗原の両方が、酵母によって細胞内に発現又は供給され得る。また、両方の型の抗原に対して細胞性免疫反応（将来の細胞性及び体液性免疫反応を導くために重要である）を誘導することをより確実にし、可変の抗原に対するより効果的な体液性免疫を即座に供給するために、酵母によって、可変の抗原を細胞外に発現又は供給することができる（図１６及び本明細書における議論を参照のこと）。

ここに記載した実施形態の組合せにおいて、細胞外（酵母運搬体表面上）に抗原を発現又は供給した酵母運搬体は、細胞内に発現又は供給された酵母運搬体と同一又は異なる酵母運搬体であることができる。加えて、細胞内抗原及び／又は細胞外抗原の異なる組み合わせは、異なる酵母運搬体上に発現することができる。また、媒体は、所望のワクチン接種に基づいて、別々に又は一緒に用いることができる。一般に、２つ又はそれ以上の異なる酵母運搬体によって抗原が供給されたとき（例えば、１つの酵母運搬体において全ての抗原を発現又は供給するのに対して）、酵母運搬体を組み合わせて（混合して）単一のワクチンとして投与する（例えば、一度の注入又は他の型の投与）、又は異なる酵母運搬体を連続して投与することができる。連続した投与は、短い時間（秒又は分）に区切ること、及びより長い時間（日、週、月又はさらに年）に区切ることを含む、いずれかの適切な期間によって分割することができる。これらの実施形態において、本発明は、好ましい実施形態における、抗原のいずれかの組合せが、用いられ得る少なくとも１つの細胞内抗原と少なくとも１つの細胞外抗原とを含むことを意図している。また本発明は、そのような抗原を発現又は供給する酵母運搬体（単一の酵母運搬体を含む）のいずれかの組合せを用いて、これらの抗原が供給されることを意図している。

上述したワクチンアプローチは結果的に、細胞外抗原及び／又は細胞内抗原の異なる組合せを含む、抗原の異なる組合せ、さらにある局面において、保存された及び／又は可変の抗原の異なる組み合わせ、が提供される場合において、異なる酵母ベースワクチンの投与の組合せ又は連続した投与（例えば主要な／増強戦略）によって変更され得る。加えて上述した酵母運搬体は、同時に又は順次（たとえば、主要な及び増強プロトコールにおいて）、さらなる免疫反応に向かい、かつ感染及び病気に対する強調された防御を提供するために、ワクチンの他の型と組み合わせることができる。一実施形態において、少なくとも細胞性免疫、またある局面においては、細胞内及び細胞外の両方に抗原を発現又は供給することによって細胞性及び体液性の両方の免疫を提供する、本発明に係る酵母ベースワクチンは、特定の抗原、１組の抗原又は病原体に対する免疫反応を導くために用いられる。そして、免疫の増強は、ＤＮＡワクチン、タンパク質サブユニットワクチン又は殺傷された若しくは不活化された病原体のような従来のワクチンの運搬によって、提供される。また、免疫の増強は、他の酵母ベースワクチン（膜又は細胞壁粒子ワクチンを含む）、又は酵母と従来の抗原調整物との組み合わせ若しくは酵母単独によっても、提供される（例えば、これらの後者の２つの筋書きにおいて、酵母がアジュバントとして先行して提供されている場合）。このような「先導−増強」戦略において、第１免疫（先導）が次の増強の効果を向上させた結果として誘導される、及びある実施形態において誘導される強力な細胞性反応が、実際に相乗作用効果を提供することができる。特に、増強するワクチンが先導するワクチンと異なる型のワクチンであり、先導するワクチンと比較して異なる抗原を含んでいるとき、このような相乗作用効果を提供することができる。

本発明に係る酵母ベースワクチン及び方法を用いて免疫反応を導くことによって、細胞性及び体液性の両方の免疫記憶が生成される（例えば、目的とする抗原を選択的に認識する記憶Ｂ細胞及びＴ細胞が生成される）。結果として、例えば、ワクチン増強、病気又は感染による、後の抗原に対する暴露において、免疫システムはより迅速にかつ効果的に反応するだろう。また、ワクチン増強に対して重要なことに、より引く低い抗原を、非酵母ベースワクチンの増強剤として用いることができる（例えば、実施例２ならびに図１４及び１６）。加えて、酵母運搬体は、非酵母ベースワクチンとの相乗効果において機能し得るので、免疫反応を、酵母ベースワクチンをＤＮＡワクチンと組合わせるような、組合せアプローチによって最適化する。これにより、ワクチンはただ１回及び／又は定量で効果的に投与されればよい。このような投与量節約の特性は、非酵母ベースワクチン供給不足である場合又は物質の公衆衛生が脅かされる戦闘時に望まれる。特に一斉予防注射のように、１以上の個体を免疫することが困難になるからである。

酵母運搬体がやむを得ず、目的とする抗原を組換え発現しない、又は別の方法で供給されない場合、本発明に係る組成物及び方法は、ワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン、サブユニットタンパク質ワクチン、殺傷又は不活化病原体、樹状細胞ワクチン等の従来のいずれかのワクチン）もまた含んでいてもよく、単独で供給される抗原の免疫反応を強調するための、又は非抗原担持酵母運搬体の投入における免疫反応を誘導するのに十分な量の抗原を、個体がすでに保持している場合のアジュバントとして用いられる。このような個体は病原体に感染している個体であり、細胞タンパク質の変異した、又は免疫システムに耐性がない抗原若しくは耐性が破壊された抗原を発現若しくは担持した個体である。このアプローチは、上述したように、細胞内及び／又は細胞外に異種抗原を発現又は供給する酵母運搬体に先行する又は後に続く免疫付与に組合わせることができる。

実際には、本発明に係るワクチンがどのように設計され、用いられるかには、かなりの柔軟性がある。例えば、保存された抗原のような、ある抗原が、発現した又は組み込まれた（例えば、連結された、混合された、含有した、供給された）酵母運搬体を含む「一般的な」ワクチンが、個体において交差防御免疫を向上させるために、周期的な方式で個体に投与され得る。このワクチンを、例えば、個体群の間で広がることが知られている特定のウイルス株に対応するために、例えば１回又は周期的な方式で、可変抗原のような他の抗原が発現した又は組み込まれた酵母運搬体と組み合わせることができる。このような可変抗原が発現した又は組み込まれた酵母運搬体は、与えられた期間の間又は特定の地域のために、目的とする病原体及び／又は最も流行している病原体株を標的とするために、毎年又は他のいずれかの好ましい方式（例えば、緊急又は先行する伝染病若しくは流行病、あるいは他の必要性）で、交替、代替又は選択することができる。ここに提供された記載を考慮すれば、本発明の他の実施形態は明らかになるだろう。

上述したように、酵母運搬体において抗原を発現する又は抗原を連結する型の操作は、特定の免疫結果を達成する。個体群、個体又は特定の病気、症状若しくは病原体感染ための、所望するように「調整」又は「設計」されたワクチンに利用することができる。酵母運搬体による抗原の細胞外発現又は供給の場合、体液性及び細胞性の両方の免疫が誘導されるが、この型の発現又は供給は、酵母による抗原の細胞内発現又は供給の場合と比較して、体液性免疫の誘導に特に効果的である。これは、主に、本実施形態おける、抗原のＢ細胞に対する直接的な暴露によって、Ｂ細胞が活性化、増殖、成熟及び抗体生成がより効果的に行われることが理由である。

より詳細には、酵母表面に発現又は供給された（酵母の側に分泌した）抗原が、Ｂ細胞の側に発現したＢ細胞抗原レセプター（ＢＣＲ）によって認識されることができる。この表面抗原にＢＣＲが結合すると、それからＢ細胞は、結合した抗原発現酵母運搬体を吸収し、抗原が処理されて、抗原からのペプチドの型で、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩレセプターを付随させた複合体として、Ｂ細胞表面に戻される。これらのＭＨＣペプチド複合体は、特定のＭＨＣペプチド複合体を特異的に認識するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を有する。「ヘルパー」Ｔ細胞（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞）に結合する。Ｂ細胞の側に存在するＭＨＣペプチド複合体を認識する、活性化した抗原特異的Ｔ細胞は、順に、このようなＢ細胞にシグナルの型（例えば、サイトカイン）で「救済」を提供する。これにより、Ｂ細胞を増殖させ、その継承細胞を分化させ、抗体分泌細胞に成熟させる。

ヘルパーＴ細胞は、樹状細胞及びマクロファージを含む、他の抗原存在細胞の側に存在するＭＨＣペプチド複合体と接触することと同様に、上述したようなＭＨＣ抗原複合体が存在するＢ細胞にＴ細胞が接触することによって活性化され得る。さらに、本発明に係る酵母運搬体は、樹状細胞のような抗原存在細胞のＭＨＣクラスＩ経路（ＭＨＣクラスＩＩ経路に加えて）の側で熱心に食作用され、当該ＭＨＣクラスＩ経路を直接的に活性化するので、ＣＤ４＋細胞性反応に加えて、ＣＤ８＋細胞性免疫反応が、抗原の細胞外発現又は供給によって誘導される。この方法において、体液性及び細胞性の両方の免疫反応が、酵母の側の抗原の細胞外発現又は供給によって誘導される。そして、発現のこの型は、抗原の細胞内発現又は供給と比較して、体液性免疫反応の誘導により効果的であると確信される。体液性免疫反応には、中和抗体の生成が含まれ得る。中和抗体は、感染性の病気及び他の望ましくない症状の抑制及び治療に有用である。

体液性免疫反応の結果としておこるＢ細胞活性化の様子を、図１６Ａ及び１６Ｂに模式的に示した。図１６Ａを参照して、Ｂ細胞活性化のシグナル１に対して、抗原は、非酵母ベースワクチン若しくは可溶性タンパク質によって、又は酵母発現、酵母提示又はそうでなければ表面上の標的抗原の含有によって、供給される。図１６Ｂを参照して、活性化Ｂ細胞によって行われる、抗原の細胞内処理は、ＭＨＣクラス２レセプターを介して存在し、抗原特異的ヘルパーＴ細胞によって認識され、抗原特異的ヘルパーＴ細胞を活性化する。活性化抗原特異的Ｔ細胞によって伝達されるシグナル及びサイトカインは、Ｂ細胞反応を成熟させ、かつ抗体生成を増強させる。上述し、さらに以下で示すように、細胞内に標的抗原を発現した酵母は、抗原特異的ヘルパーＴ細胞の数を活性化及び増幅させるのに、非常に効果的である。ヘルパーＴ細胞活性化及び増殖が、先行する又はＢ細胞の可溶性標的抗原結合に付随するとき、抗体生成はより効果的に誘導される。

以前に報告されているように、抗原が酵母運搬体の細胞内に発現又は供給されたとき、細胞性免疫反応（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞反応の両方）は、樹状細胞及びマクロファージのような抗原存在細胞の、ＭＨＣクラスＩ制限経路及びＭＨＣクラスＩＩ制限経路の両方を介した抗原の存在によって生成される（例えば、米国特許5,830,463及び7,083,787、ならびにStubbsらのNat. Med. 7:625-629 (2001)及びLuらのCancer Research 64:5084-5088 (2004)参照のこと）。このメカニズムで活性化されたＴ細胞は、非酵母ベースワクチンのような異なるアプローチによって、又は例えば病原体若しくは病気により自然に暴露されることによって、標的抗原に攻撃されたＢ細胞にシグナルを供給することによって、抗体生成にもまた寄与することができる。この概念で実施した実験結果を図１４及び１５に示す。

本発明はこのようなワクチンに限定されないが、本発明の種々の観点は、ここに記載したインフルエンザワクチンの特定の例を通じてよりよく理解されるだろう。ここに提供した情報が与えられたことによって、当業者であれば即座に、本発明に係る酵母運搬体による細胞外及び／又は細胞内抗原発現又は供給される細胞外及び／又は細胞内抗原の操作、保存された抗原及び可変の抗原（又は内部抗原及び外部抗原）の発現又は供給の操作、ならびにここに記載した方法の先導及び増強の操作によって、インフルエンザウイルスのために記載されたワクチン戦略を、他の病原体及び標的抗原が細胞タンパク質である場合の免疫プロトコールに対して推定することが可能であることは明白である。

一実施形態において、本発明は概して、インフルエンザウイルスに対して動物を予防接種するための、及び動物においてインフルエンザ感染を治療又は抑制するための、新規組成物及び方法に関する。本発明は、酵母ベースワクチン又は酵母ベースワクチンの組合せの使用方法を包含し、少なくとも１つの酵母運搬体、及び動物においてインフルエンザ感染に対する免疫反応の誘導が選択された、少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含むワクチンを包含する。特に好ましい実施形態において、本発明は、酵母ベースワクチンにおけるインフルエンザ抗原の組合せの使用方法を包含している。抗原の組合せが、特定のウイルス株に対する特定の防御と同様に、様々なインフルエンザウイルス株に対する交差防御を提供する。本発明は、交差防御、「一般的な」ワクチンアプローチ、ならびに単独及び共同のウイルス株特異的抗原アプローチを利用して、インフルエンザウイルス感染を防ぐために用いられる、新規の酵母ベースワクチンを、特に提供する。このアプローチは、好ましくは交差防御方法及びウイルス株特異的方法の両方によって行われる、インフルエンザウイルスに対する細胞性及び体液性の両方の免疫反応を誘導するだろう。

本実施形態の第１局面において、本発明は、インフルエンザウイルスによって内部に発現したあるタンパク質が、ウイルス株間において高度に保存されているという事実を利用する。これらの抗原（ここで概して、内部ウイルスタンパク質と称する）は、交差防御し、かつウイルスタンパク質（及び、インフルエンザウイルス感染細胞）に対する効果的な細胞性免疫反応を誘導し得る、酵母ベースワクチンのための基礎を提供する。

本実施形態の他の局面において、本発明はさらに、表面タンパク質（ここで概して、外部ウイルスタンパク質と称する）の変異体がインフルエンザウイルス株に発現する事実を利用する。３つのウイルス群を代表する３つのウイルス株を典型的に含む従来の殺傷されたウイルスワクチンにおいて行われたように、表面タンパク質は、表面抗原に基づいて選択された、より特異的なウイルス株に対して宿主を免疫する酵母ワクチンを生成するために用いることができる。

しかしながら、ウイルスに対する中和抗体反応を誘導する、これらの従来の殺傷されたウイルスワクチンと比較して、本発明に係るワクチンは、これらのウイルス表面抗原に対して、細胞性及び体液性の両方の免疫反応を誘導することができる。さらに、本発明は、好ましい局面において、細胞性及び体液性の両方の免疫を含み、交差防御及びウイルス株特異的免疫の両方を誘導する、強力な新規インフルエンザワクチンを提供するために、これらの２つのワクチンを組合せる。

〔一般的な技術〕
本発明の実施は、特に指示がない限り、分子生物学（組み換え技術が挙げられる）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の当業者にとって公知である従来の技術を採用する。当該技術は、Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biology and activities of yeasts, Skinner, et al., eds., Academic Press (1980); Methods in yeast genetics : a laboratory course manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology, Pringle et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997); The Yeast Saccharomyces: Gene Expression, Jones et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993); T he Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, Broach et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), (本明細書においてまとめて「Sambrook」と呼ぶ）;Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987,2001年までの補足を含む); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (本明細書においてまとめて「Harlow and Lane」と呼ぶ), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000); Casarett and Doull‘s Toxicology The Basic Science of Poisons, C. Klaassen, ed., 6th edition (2001), 及びVaccines, S. Plotkin and W. Orenstein, eds., 3rd edition (1999)といった文献において十分に説明されている。

〔一般的な定義〕
「体液性免疫反応」は、一般的に、抗体産生、及び抗体産生に伴って生じる過程のすべて（Ｂリンパ球（Ｂ細胞）の活性化、親和性の成熟、プラズマ細胞への分化、ならびに記憶Ｂ細胞の発生、胚中心形成及びアイソタイプ切り替え、ならびにヘルパーＴ細胞の活性化、シグナル伝達、及びサイトカイン産生が挙げられるが、これらに限定されない）の他に、中和、古典的な（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）補体の活性化及びオプソニン作用を含む抗体のエフェクター機能を指す。

「細胞性」免疫反応（本明細書のどこにおいても「細胞」免疫反応と交換可能に使用され得る）は、一般的に、免疫細胞（Ｔリンパ球（細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ））、樹状細胞、マクロファージ、及びナチュラルキラー細胞が挙げられるが挙げられる）の抗原に対する応答、当該応答に伴って生じる過程（これらの細胞の増殖及び活性化、ＣＴＬエフェクター機能、適応的免疫反応及び先天性免疫反応に関する他の細胞の機能に影響するサイトカイン産生、及び記憶Ｔ細胞生成が挙げられる）のすべてを指す。

本発明によれば、酵母運搬体に関して細胞外における抗原の提供（又は細胞外の抗原の提供）に、本明細書において適用されるときに、用語「細胞外」は、あらゆる多くの方法によって達成され得る、抗原が酵母運搬体の細胞外（表面上又は外側）にあるということを指す。例えば、抗原又はそれらの一部が酵母運搬体の外表面（例えば、完全な酵母、原型を保った酵母にとっての細胞壁、又は、酵母のスフェロプラスト、細胞質体及びゴーストにとっての細胞質膜）に並べられる（位置される、含まれる、局在される）ように酵母運搬体によって発現される場合に、抗原は、酵母運搬体に関して細胞外にある。 抗原は、例えば、酵母の小胞体（ＥＲ）において発現され得、かつそれから酵母の表面に移動され得るが、一般的に組み換え抗原産生に関して、酵母運搬体の表面又は酵母運搬体の細胞外における「発現」という言及は、転写から始まって、翻訳を経て、抗原の標的化、及び酵母運搬体における最後の行き先までの送達若しくは移動を経る、抗原産生の全体の過程を包含することを意図される。また、用語「発現」は、一般的に用語「提供」と交換可能に使用され得、かつもっとも一般的に酵母運搬体の表面上に抗原を提供するあらゆる様式を包含できる（すなわち、他の方法による連携が包含される）。また、例えば、酵母の外表面に、例えば、共有結合又は非共有結合によって（すなわち、酵母によって組み換え発現される必要はない）付着されている場合に、抗原は、酵母運搬体に関して細胞外にある。また、抗原が酵母を有する混合物（混和物、複合した、組成物）の中に単にある場合に、抗原は酵母運搬体に関して細胞外にある。また、抗原が酵母によって分泌される場合に、抗原は、酵母運搬体に関して細胞外にある。

本発明によれば、本明細書において細胞内における抗原の提供（又は細胞内の抗原の提供）に適用されるときに、用語「細胞内」は、あらゆる多くの方法によって達成され得る、抗原が酵母運搬体の細胞内環境の内部に含まれることを意味する。例えば、抗原が酵母運搬体によって発現され（例えば、組み替え産生によって）、かつ産生される少なくともいくつかの抗原が酵母の内部に残っている（すなわち、酵母運搬体の表面に移動若しくは送達されないか、又は酵母運搬体の表面に移動若しくは送達されていない）場合に、抗原は、酵母運搬体に関して細胞内にある。酵母運搬体の細胞内部環境としては、細胞表面を横切っていない、細胞質基質、小胞体、内膜、及び分泌小胞が挙げられる。また、抗原が、酵母の中に添加されている（例えば、輸送の好適な方法（エレクトロポレーション、微粒子銃、微量注入、リポフェクション、吸収、感染及び原形質融合が挙げられる）によって）場合に、抗原は、酵母運搬体に関して細胞内にある。

本発明によれば、用語「抗原」の本明細書における通常の使用は、タンパク質（ペプチド、部分的なタンパク質、全長のタンパク質）のあらゆる部分を指し、ここで、当該タンパク質は、天然に生じているか、又は細胞性組成物（細胞全体、細胞可溶化物又は崩壊した細胞）に対して、生体（生体全体、可溶化物又は崩壊した細胞）に対して又は炭水化物（例えば、がん細胞において発現されたそれら）に対して、又は他の分子かそれらの一部かに対して、合成的に誘導されている。抗原は、当該抗原が投与された個体の細胞及び組織の内部において出くわす同じ又は類似の抗原に対する、抗原特異的免疫反応（例えば、体液性免疫反応及び／又は細胞性免疫反応）を誘発する。代替可能に、抗原は、免疫寛容原として作用可能である。

免疫反応の刺激に言及する場合に、用語「抗原」は、用語「免疫原」と交換可能に使用され得る。本明細書において使用されるときに、免疫原は、動物に対する当該免疫原の投与（例えば、本発明のワクチンを介して）が、組織又は動物の内部において出くわす同じ又は類似の抗原に対して、抗原特異的な免疫反応を起こすように、体液性免疫反応及び／又は細胞性免疫反応を誘発する（すなわち、抗原性である）抗原を表す。

「寛容原」は、免疫原を発現若しくは提示する細胞、又は当該免疫源との接触に応じて、抗原に対する免疫反応が低下又は変化するような、かつ好ましくは実質的に非応答、アネルギー、他の不活化、免疫細胞の消失になるような、投与の形態、量、又は経路において提供される抗原を表すために使用される。

「ワクチン接種抗原」は、免疫原又は寛容原であり得るが、ワクチンにおいて使用される抗原であり、ここで、当該ワクチン抗原に対して生物学的応答（免疫反応、免疫寛容の誘発）が誘発されることである。

所定の抗原の「免疫原性ドメイン」は、動物に投与された場合に免疫原として作用する少なくとも１つのエピトープを含む、抗原のあらゆる部分、断片又はエピトープ（例えば、ペプチド断片又はペプチドサブユニット又は抗体エピトープ又は他の立体構造エピトープ）であり得る。例えば、単一のタンパク質は、複数の異なる免疫原ドメインを含むことができる。免疫原ドメインは、例えば、体液性免疫反応の場合に、タンパク質内の直鎖状配列である必要はない。

エピトープは、本明細書おいて、免疫反応を十分に誘発する所定の抗原内における単一の免疫原性部位、又は免疫反応を十分に抑制、消失若しくは不活化する所定の抗原内における単一の寛容原部位として定義される。当業者は、Ｔ細胞エピトープがＢ細胞エピトープと、大きさ及び組成に関して異なること、ならびにクラスＩのＭＨＣ経路を介して提示されるエピトープが、クラスＩＩのＭＨＣ経路を介して提示されるエピトープと異なることを認識する。エピトープは、直鎖状配列又は立体構造エピトープ（結合領域が保存される）であり得る。抗原は、単一のエピトープほどの大きさであり得るか、又は単一のエピトープより大きくあり得、かつ複数のエピトープを含むことができる。従って、抗原の大きさは、約５−１２アミノ酸（例えば、ペプチド）ほどの大きさであり得、かつ全長のタンパク質（多量体タンパク質及び融合タンパク質か、キメラタンパク質か、完全な細胞か、完全な微生物か、又はこれらの一部（例えば、細胞全体の可溶化物又は微生物の抽出物）が挙げられる）ほどの大きさであり得る。その他に、抗原は、酵母運搬体に、又は本発明の組成物に取り込まれ得る炭水化物を含むことができる。ある実施形態において（例えば、抗原が酵母運搬体によって組み換え核酸分子から発現される場合に）、抗原が、全体の細胞又は微生物であるよりむしろ、タンパク質、融合タンパク質、キメラタンパク質、又はこれらの断片であることを理解される。本発明の好ましいインフルエンザ融合タンパク質が、本明細書に記載されている。

「ワクチン接種」又は「免疫化」は、抗原を単独に又は補助剤とともに投与した結果として、抗原又はこれらの免疫原性部分又はこれらの寛容原性部分に対する、免疫反応の誘発（誘導）を指す。ワクチン接種は、結果として好ましく予防効果又は治療効果を生じ、ここで、抗原（又は抗原の原料）に対する後のばくろは、動物における疾患又は悪い健康状態を軽減するか又は予防する、抗原（又は原料）に対する免疫反応を誘発する。ワクチン接種の概念は、当該技術において公知である。本発明の組成物（ワクチン）の投与によって誘発される免疫反応は、当該組成物の投与を行っていない場合と比べて、免疫反応のあらゆる様相（例えば、細胞性反応、体液性反応、サイトカイン酸性）のあらゆる検出可能な変化であり得る。

タルモゲン（Ｔａｒｍｏｇｅｎ）（標的分子抗原）は、一般的に、細胞外に（その表面に）、細胞内に（内部に又は細胞質基質に）、又は細胞外と細胞内との両方に１つ以上の異種抗原を発現している酵母運搬体を指す。タルモゲンは、当該技術において一般的に説明されている。例えば、米国特許第５，８３０，４６３号明細書を参照すればよい。

本発明の１つの実施形態において、本明細書に記載のあらゆるアミノ酸配列は、特定のアミノ酸配列のＣ末端及び／又はＮ末端に隣接する、少なくとも１つから２０以下の付加的な異種アミノ酸とともに産生され得る。結果として生じるタンパク質又はポリペプチドは、特定のアミノ酸配列「から必須に構成されるもの」と呼ばれ得る。上述のように、本発明によれば、異種アミノ酸は、特定のアミノ酸配列に隣接して天然に見られない（すなわち、自然に、インビボにおいて見られない）、又は特定のアミノ酸配列の機能と関連しない、又は天然に生じる配列における核酸が所定のアミノ酸配列が得られる生物にとって標準のコドン用法を用いて翻訳される場合に、異種アミノ酸が遺伝子において生じるときに、特定のアミノ酸配列をコードする天然に生じる当該核酸配列と隣接するヌクレオチドにコードされない、アミノ酸の配列である。同様に、本明細書において核酸配列に言及して使用される場合に、表現「から必須に構成されるもの」は、特定のアミノ酸配列をコードする核酸の５’末端及び／又は３’末端において、少なくとも１つから約６０程度までの付加的な異種ヌクレオチドによって隣接される、特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。異種ヌクレオチドは、当該ヌクレオチドが天然の遺伝子において生じるか、又はタンパク質のあらゆる付加的な機能を損なうか、若しくは特定のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能を変えるタンパク質をコードしないときに、特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列に隣接して天然に見られない（すなわち、自然において、インビボにおいて見られない）。

本発明によれば、「異種アミノ酸」は、特定のアミノ酸配列と隣接して天然に見られない（すなわち、自然に、インビボにおいて見られない）、又は特定のアミノ酸配列の機能に関連しない、又は天然に生じる配列におけるヌクレオチドが、所定のアミノ酸配列が得られる生物にとっての標準のコドン用法を用いて翻訳された場合に、当該ヌクレオチドが遺伝子において生じるときに、特定のアミノ酸配列をコードする天然に生じる核酸配列と隣接するヌクレオチドによってコードされない、アミノ酸の配列である。従って、インフルエンザ抗原に対して異種の少なくとも２つのアミノ酸残基は、インフルエンザ抗原と隣接して天然に見られない少なくとも２つのあらゆるアミノ酸残基である。

本発明によれば、本発明の酵母運搬体に関して、「異種」タンパク質又は「異種」抗原（異種の融合タンパク質が挙げられる）に対する言及は、当該タンパク質又は抗原が酵母によって天然に発現されるタンパク質又は抗原ではないが、融合タンパク質が酵母によって天然に発現される酵母の配列又はタンパク質又はこれらの一部（例えば、本明細書に記載のＡｇａタンパク質）を含み得ることを意味する。例えば、インフルエンザのヘマグルチニンタンパク質及び酵母のＡｇａタンパク質の融合タンパク質は、当該融合タンパク質が酵母によって天然に発現されないので、本発明の目的にふさわしい酵母運搬体に関して異種タンパク質とみなされる。

本発明によれば、表現「〜と選択的に結合する」は、特定のタンパク質と差別的に結合する、本発明の抗体、抗原結合断片又は結合相手の能力を指す。より詳細には、表現「選択的に結合する」は、１つのタンパク質をもう１つのタンパク質と（例えば、抗体、これらの断片又は結合相手を抗原と）特異的に結合することを指し、ここで、ここで、あらゆる標準的なアッセイ（例えば、免疫学的検定）によって測定されるような結合の度合いは、当該アッセイ用のバックグラウンド対照より統計的に有為に高い。例えば、免疫学的検定を実施する場合に、対照としては、抗体又は抗原結合断片を単独に含む（すなわち、抗原がない場合の）反応ウェル／チューブが典型的に挙げられ、ここで、抗原の非存在下における抗体又はこれらの抗原結合断片による反応性の総計（例えば、ウェルに対する非特異的結合）は、バックグラウンドとみなされる。結合は、当該技術において標準的な種々の方法（酵素免疫検定（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット法などが挙げられる）を用いて測定され得る。

「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類としては、家畜、競技動物、愛玩動物、霊長類、マウス及びラットが挙げられる。用語「個体」は、用語「動物」、「対象」又は「患者」と交換可能に使用され得る。

本発明における単離されたタンパク質又はポリペプチドに対する言及は、全長タンパク質、融合タンパク質、又は当該タンパク質のあらゆる断片、ドメイン、若しくは立体構造エピトープを含む。より詳細には、本発明に係る単離されたタンパク質は、その天然の環境から取り出されている（すなわち、人の操作を受けている）タンパク質（ポリペプチド又はペプチドが挙げられる）であり、かつ例えば、精製されたタンパク質、部分的に精製されたタンパク質、組み換え的に産生されたタンパク質及び合成的に産生されたタンパク質を含み得る。従って、「単離された」は、タンパク質が精製されている程度を反映しない。好ましくは、本発明の単離されたタンパク質は、組み換え的に産生される。本発明によれば、用語「修飾」及び「変異」は、特に本明細書に記載のタンパク質又はこれらの一部のアミノ酸配列（又は核酸配列）に対する修飾／変異に関して、交換可能に使用され得る。

本明細書において使用されるときに、用語「相同物」は、天然に生じるタンパク質又はペプチド（すなわち、「原型」又は「野性体」のタンパク質）とは、天然に生じる当該タンパク質又はペプチドに対する軽微な修飾によって異なるが、天然に生じる形態の基本的なタンパク質構造及び側鎖構造を維持しているタンパク質又はペプチドを指すために使用される。当該変化としては、１若しくは数個のアミノ酸側鎖の変化；１若しくは数個のアミノ酸の変化（欠失（例えば、当該タンパク質の又はペプチドの切断型）、挿入及び／又は置換が挙げられる）；１若しくは数個の原子の立体化学的な変化；及び／又は軽微な誘導体化（メチル化、糖化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化、アミド化及び／又はグリコシルホスファチジルイノシトールの付加が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。相同物は、天然に生じるタンパク質又はペプチドと比べて、増強された性質、減弱された性質又は同様の性質のいずれかを有し得る。相同物としては、タンパク質のアゴニスト又はタンパク質のアンタゴニストを挙げることができる。相同物は、タンパク質を産生するための当該技術において公知の技術（単離された天然に生じるタンパク質に対する直接的修飾、直接的なタンパク質合成、又は例えば、無作為の若しくは標的化した変異生成をもたらすための古典的ＤＮＡ技術若しくは組み換えＤＮＡ技術を用いた当該タンパク質をコードする核酸配列に対する修飾が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて産生され得る。

所定のタンパク質の相同物は、基準のタンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも約４５％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約５５％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％が同一（又は全整数の変化量の単位において、４５％から９９％の間のあらゆるパーセントの同一性）である、アミノ酸配列を包含し得るか、アミノ酸配列から必須に構成され得るか、又はアミノ酸配列からなり得る。１つの実施形態において、相同物は、基準のタンパク質の天然に生じるアミノ酸配列に対して、１００％未満が同一の、約９９％未満が同一の、約９８％未満が同一の、約９７％未満が同一の、約９６％未満が同一の、約９５％未満が同一の、以下同様に１％の変化量において約７０％未満までが同一の、アミノ酸配列を包含するか、アミノ酸から必須に構成されるか、又はアミノ酸からなる。

本明細書において使用されるときに、特に明記しない限り、同一性のパーセント（％）に対する言及は、（１）標準の初期値の変数を有するアミノ酸検索用のｂｌａｓｔｐ及び核酸検索用のｂｌａｓｔｎを用いたＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴ相同性検索（ここで、照会配列は、初期値によって低い複雑性の領域について取り除かれる）（引用によってその全体が本明細書に組み込まれるAltschul, S.F., Madden, T.L., Schaeaeffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.” Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されている）；（２）（後述の変数を用いた）ＢＬＡＳＴ２整列；及び／又は（３）標準の初期値の変数を有するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｔｅｒａｔｅｄ ＢＬＡＳＴ）を用いて実施される相同性の評価を指す。ここで、ＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ２との間にある標準の変数におけるいくつかの差に起因して、２つの特定の配列が、ＢＬＡＳＴ２プログラムを用いて有為な相同性を有するとして認識されるかもしれないが、一方、照会配列として当該配列の内の１つを用いてＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴにおいて実施した検索は、最上位の一致として第２配列を同定しないかもしれないことを留意すべきである。その他に、ＰＳＩ―ＢＬＡＳＴは、配列相同性を探すための感度の高い手段である、「プロファイル」検索の自動化された使い勝手の良い種類を提供する。当該プログラムは、まずギャップト（ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴデータベース検索を実施する。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、帰ってきたあらゆる有為な整列に由来する情報を用いて、データベース検索の次の一巡にとっての照会配列を差し替える、位置特異的な得点マトリクスを構築する。従って、パーセント同一性がこれらのプログラムのあらゆる１つを用いることによって決定され得ることが、理解される。

Tatusova and Madden, (1999), “Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように、２つの特定の配列は、ＢＬＡＳＴ２配列を用いて互いに整列化され得る。ＢＬＡＳＴ２配列整列は、ＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムを用いたｂｌａｓｔｐ又はｂｌａｓｔｎを実施されて、結果として生じる整列に隙間（欠失及び挿入）の導入を可能にする当該２つの配列間におけるギャップトＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡＳＴ ２．０）を実施する。本明細書における明確さを目的として、ＢＬＡＳＴ２配列整列が、以下の標準的な初期値の変数を用いて実施される。
Ｆｏｒ ｂｌａｓｔｎ， ｕｓｉｎｇ ０ ＢＬＯＳＵＭ６２ ｍａｔｒｉｘ：
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ ＝ １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ ＝ −２
Ｏｐｅｎ ｇａｐ （５） ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ （２） ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ （５０） ｅｘｐｅｃｔ （１０） ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ （１１） ｆｉｌｔｅｒ （ｏｎ）

Ｆｏｒ ｂｌａｓｔｐ， ｕｓｉｎｇ ０ ＢＬＯＳＵＭ６２ ｍａｔｒｉｘ：

Ｏｐｅｎ ｇａｐ （１１） ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ （１） ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ （５０） ｅｘｐｅｃｔ （１０） ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ （３） ｆｉｌｔｅｒ （ｏｎ）。

単離した核酸分子は、その天然の環境から取り出されている（すなわち、人の操作を受けている）核酸分子であり、当該天然の環境は、核酸分子が天然に見られるゲノム又は染色体である。従って、「単離した」は、核酸分子が精製される度合いを反映する必要はないが、当該分子が、当該核酸分子が天然に見られるゲノムの全体又は染色体の全体を含まないことを表す。単離した核酸分子は、遺伝子を含み得る。遺伝子を含む単離した核酸分子は、当該遺伝子を含む（しかし、むしろ当該遺伝子と関連するコード領域及び制御領域を含むが、同じ染色体上に天然に見られる付加的な遺伝子を含まない）染色体の断片ではない。また、単離した核酸分子としては、特定の核酸配列と天然において隣接しない付加的な核酸（すなわち、異種の配列）によって隣接された（すなわち、当該配列の５’末端及び／又は３’末端において）特定の核酸配列を挙げることができる。単離した核酸分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）又はＤＮＡ若しくはＲＮＡのいずれかの誘導体（例えば、ｃＤＮＡ）を挙げることができる。表現「核酸分子」は、主に物質的な核酸分子を指し、かつ表現「核酸配列」は、主に核酸分子のヌクレオチドの配列を指すが、２つの表現は、特にタンパク質又はタンパク質のドメインをコード可能な核酸分子、又は核酸配列に関して、交換可能に使用され得る。

組み換え核酸分子は、トランスフェクトされた細胞において核酸分子の発現を効率的に調節可能なあらゆる転写制御配列の少なくとも１つと作動可能に連結された本明細書に記載のあらゆるタンパク質の１つ以上をコードするあらゆる核酸配列の少なくとも１つを含み得る、分子である。表現「核酸分子」は、主に物質的な核酸分子を指し、かつ表現「核酸配列」は、主に核酸分子のヌクレオチドの配列を指すが、２つの表現は、特にタンパク質をコード可能な核酸分子、又は核酸配列に関して、交換可能に使用され得る。その他に、表現「組み換え分子」は、主に転写制御配列と作動可能に連結された核酸分子を指すが、動物に投与される、表現「核酸分子」と交換可能に使用され得る。

組み換え核酸分子は、本発明に従って融合タンパク質の組み換え産生を実現可能にし、かつ宿主細胞への核酸分子の送達を可能にする、本発明の融合タンパク質をコードする単離した核酸分子を作動可能に連結されたあらゆる核酸配列、典型的に異種配列である組み換えベクターを含む。当該ベクターは、ベクターに挿入される単離した核酸分子と隣接して天然に見られない核酸配列を含み得る。ベクターは、原核生物又は真核生物のいずれかのＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであり得、かつ本発明において好ましくはウイルス又はプラスミドである。組み換えベクターは、クローニング、配列決定、及び／又はそうでなければ核酸分子の他の操作（例えば、ＤＮＡワクチン又はウイルスベクターに基づくワクチンの場合にように）に使用され得る。組み換えベクターは、核酸分子の発現に好ましく使用され、かつ発現ベクターとも呼ばれ得る。好ましい組み換えベクターは、トランスフェクトされた宿主細胞において発現されることできる。

本発明の組み換え分子において、核酸分子は、宿主細胞と適合し、かつ本発明の核酸分子の発現を制御する制御配列（例えば、転写制御配列、翻訳制御配列、複製開始点、及び他の制御配列）を含む発現ベクターと作動可能に連結されている。特に、本発明の組み換え分子は、１つ以上の発現制御配列と作動可能に連結された核酸分子を含む。表現「作動可能に連結された」は、宿主細胞内にトランスフェクトした（すなわち、形質転換した、形質導入した、又はトランスフェクトした）ときに分子が発現されるように、核酸分子を発現制御配列と連結することを指す。

本発明によれば、用語「トランスフェクション」は、外来の核酸分子（すなわち、組み換え核酸分子）が細胞内に挿入され得るあらゆる方法を指す。用語「形質転換」は、用語「トランスフェクション」（当該用語が微生物細胞（例えば、藻類、細菌及び酵母）への核酸分子の導入を指すために使用される場合に）と交換可能に使用され得る。細菌の系において、用語「形質転換」は、微生物による外来の核酸の獲得に起因する遺伝的変化を説明するために使用され、かつ用語「トランスフェクション」と本質的に同義である。従って、トランスフェクション技術としては、形質転換、細胞の化学的処理、粒子銃、エレクトロポレーション、微量注入法、リポフェクション、吸着、感染及び原形質融合が挙げられるが、これらに限定されない。

〔本発明のワクチン及び組成物〕
本発明の実施形態は、単一の抗原又は複数の抗原に対する細胞性免疫反応及び／又は体液性免疫反応を誘発する方法に使用され得る組成物（ワクチン）に関し、好ましい実施形態において、疾患若しくは悪い健康状態（病原体による感染が挙げられる）から動物を予防するか、又は当該疾患又は悪い健康状態から結果として生じる少なくとも１つの症状を軽減する方法に関する。組成物は、一般的に、（ａ）酵母運搬体；及び（ｂ）当該酵母運搬体によって発現されるか、当該酵母運搬体と会合されたか、又は当該酵母運搬体と組み合わせた異種抗原を含む。他の組成物は、ワクチン組成物の他の形態（例えば、ＤＮＡワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、又は殺した病原体若しくは不活化した病原体）において提供される異種抗原と組み合わせた酵母運搬体を含む。酵母運搬体が１つ以上の抗原を発現する場合に、抗原は、あらゆる組み合わせにおいて、細胞内に、細胞外に、又は両方に発現されるか、又は提供される。ある種の実施形態において、抗原は、酵母運搬体における異種タンパク質の発現を安定化するために、発現された異種タンパク質の翻訳後修飾を妨げるために、及び／又はある実施形態において酵母運搬体の表面上に融合タンパク質を発現（転移させることを含む）（細胞外発現）させ得るように、設計された融合タンパク質として提供される。また、融合タンパク質は、広い細胞性免疫反応、及びある実施形態において、体液性免疫反応を提供し、かつ好ましくは、２つ以上の異なる抗原を発現する、及び／又は異なる抗原を発現する他の酵母運搬体と組み合わせられる。これらの融合タンパク質は、酵母運搬体によって（例えば、酵母の細胞質体、酵母のゴースト、又は酵母の膜若しくは細胞壁の抽出物若しくは画分若しくはこれらの粒子にまで、さらに処理され得る、原型を保った酵母又は酵母スフェロプラストによって）組み替えタンパク質としてもっとも典型的に発現されるが、当該融合タンパク質の１つ以上が、酵母運搬体に取り込まれ得るか、又はそうでなければ本明細書に記載の酵母運搬体と複合されるか、若しくは混合されて、本発明のワクチンを形成することは、本発明の実施形態である。

〔酵母運搬体〕
本発明の組成物（例えば、ワクチン）のあらゆるものにおいて、酵母運搬体に関する以下の局面は、本発明に含まれる。本発明によれば、酵母運搬体は、本発明のワクチン若しくは治療組成物において１つ以上の抗原とともに、又は補助剤として使用され得る、あらゆる酵母細胞（例えば、完全な又は原型を保った細胞）又はこれらの誘導物（後述を参照すればよい）である。従って、酵母運搬体としては、生きた原型を保った酵母微生物（すなわち、細胞壁を含めてすべての構成要素を有する酵母細胞）、殺した（死んだ）原型を保った酵母微生物、又はこれらの誘導物（酵母のスフェロプラスト（すなわち、細胞壁を欠く酵母細胞）、酵母の細胞質体（すなわち、細胞壁及び核を欠く酵母細胞）、酵母のゴースト（すなわち、細胞壁、核及び細胞質を欠く酵母細胞）、亜細胞性酵母膜抽出物若しくはそれらの画分（また、酵母膜粒子と呼ばれ、かつ以前は亜細胞性酵母粒子と呼ばれた）、又は酵母細胞壁調整物が挙げられる）が挙げられ得るが、これらに限定されない。

酵母のスフェロプラストは、酵母細胞壁の酵素消化によって典型的に産生される。当該方法は、例えば、引用によってその全体が本明細書に組み込まれる、Franzusoff et al., 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674に記載されている。

酵母の細胞質体は、酵母細胞の除核によって典型的に産生される。当該方法は、例えば、引用によってその全体が本明細書に組み込まれる、Coon, 1978, Natl. Cancer Inst. Monogr. 48, 45-55に記載されている。

酵母のゴーストは、透過化処理された、又は溶解させた細胞を封じ直すことによって産生され、かつ必要ではないが、その細胞の細胞小器官の少なくともいくつかを含むことができる。当該方法は、例えば、いずれも引用によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Franzusoff et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 3608-3614及びBussey et al., 1979, Biochim. Biophys. Acta 553, 185-196に記載されている。

酵母膜粒子（亜細胞性酵母膜抽出物又はこれらの画分）は、天然の核又は細胞質を欠く酵母の膜を指す。当該粒子は、あらゆる大きさ（天然の酵母の膜の大きさから、超音波処理又は当業者に公知の他の膜崩壊法に続いて、封じ直しによって産生される微粒子までの範囲の大きさが挙げられる）であり得る。亜細胞性酵母膜抽出物を産生する方法は、例えば、Franzusoff et al., 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674に記載されている。また、酵母膜部分、及び抗原が酵母膜粒子の調製前に組み替え的に発現される場合に、関心のある抗原を含む酵母膜粒子の画分を使用し得る。抗原は、膜の内部に、膜のいずれかの表面、又はこれらの組み合わせ（すなわち、抗原が、膜の内部及び外部の両方にあり得る、及び／又は酵母膜粒子の膜にまたがり得る）に運ばれ得る。１つの実施形態において、酵母膜粒子は、膜の表面上にあるか、又は膜内に少なくとも部分的に埋まっている少なくとも１つの所望の抗原を含む原型を保った、崩壊した、又は崩壊しかつ封じ直した酵母膜であり得る、組み換え酵母膜粒子である。

酵母細胞壁調製物の例は、当該酵母細胞壁調製物が、動物に投与されたときに感染性因子に対する所望の（例えば、予防的な）免疫反応を刺激するように、表面上に抗原を支持するか、又は少なくとも部分的に抗原が埋め込まれた単離した酵母細胞壁である。

あらゆる酵母株は、本発明の酵母運搬体を産生するために使用され得る。酵母は、３つの分類：子嚢菌類、担子菌及び不完全菌類の１つに属する単細胞微生物である。免疫修飾物質としての使用に関する酵母の種類の選択に関する主な検討材料の１つは、酵母の病原性である。１つの実施形態において、酵母は、サッカロマイスセレシジアエ（Saccharomyces cerecisiae）といった非病原性の株である。非病原性酵母株の選択は、酵母運搬体が投与される個体に対するあらゆる副作用を最小化のためになされる。しかし、病原性のある酵母は、当該酵母の病原性が当業者に公知のあらゆる手段（例えば、変異株）によって打ち消され得る場合に、使用され得る。病原性あるの酵母、又はこれらの非病原性の変異体は、補助剤として又は生物学的反応の修飾物質として過去に使用されており、かつ本発明に従って使用され得るが、非病原性の酵母が好ましい。

酵母株の好ましい属としては、サッカロマイス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）（病原性であり得る）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、ハンセヌラ（Hansenula）、クルイベロマイス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、ロドトルラ（Rhodotorula）、スキゾサッカトマイス（Schizosaccharomyces）及びヤロウィア（Yarrowia）が挙げられ、同時にサッカロマイス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ハンセヌラ（Hansenula）、ピチア（Pichia）及びスキゾサッカトマイス（Schizosaccharomyces）が好ましく、かつ同時にサッカロマイス（Saccharomyces）が特に好ましい。酵母株の好ましい種としては、サッカロマイスセレビジアエ（saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイスカルスバーゲンシス（saccharomyces carlsbergensis）、カンジダアルビカンス（Candida albicans）、カンジダケフィア（Candida kefyr）、カンジダトロピカリス（Candida tropicalis）、クリプトコッカスラウレンティ（Cryptococcus laurentii）、クリプトコッカスネオフォマンス（Cryptococcus neoformans）、ハンセヌラアノマラ（Hansenula anomala）、ハンセヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロマイスフラジリス（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロマイスラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイスマルキアヌスバーラクティス（Kluyveromyces marxianus var. lactis）、ピチアパストリス（Pichia pastoris）、ロドトルラルブラ（Rhodotorula rubra）、スキゾサッカロマイスポムベ（Schizosaccharomyces pombe）、及びヤロウィアリポリティカ（Yarrowia lipolytica）が挙げられる。これらの種が、上述の種の中に含まれることが意図される種々の亜種、類型、亜類型などを含むことは、十分に理解される。より好ましい酵母の種としては、Ｓ．セレビジアエ（S. cerevisiae）、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）、Ｈ．ポリモルファ（H. polymorpha）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）及びＳ．ポムベ（S. pombe）が挙げられる。Ｓ．セレビジアエ（S. cerevisiae）は、操作が比較的に容易であること、及び食品添加物としての利用に関して「安全であると一般に認識されている（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）」こと、若しくは「ＧＲＡＳ」（ＧＲＡＳ、１９９７年４月１７日にＦＤＡが提出したＲｕｌｅ ６２ＦＲ１８９３８）であることによって、特に好ましい。本発明の１つの実施形態は、特に高いコピー数にプラスミドを複製可能な酵母株（例えば、Ｓ．セレビジアエｃｉｒ株（S. cerevisiae cir）である。Ｓ．セレビジアエ（S. cerevisiae）株は、１つ以上の標的抗原及び／又は抗原融合タンパク質を高水準に発現可能にする発現ベクターを維持可能な当該株の１つである。その他に、低下した翻訳後修飾を示す変異（例えば、Ｎ結合型の糖化を延長する酵素における変異）を含む、あらゆる変異酵母株が本発明に使用され得る。

１つの実施形態において、本発明の好ましい酵母運搬体は、樹状細胞又はマクロファージといった酵母運搬体及び抗原が送達される細胞種と融合可能であり、従って、酵母運搬体、及び多くの実施形態において抗原の特に効率的な当該細胞種に対する送達をもたらす。本明細書において使用されるときに、標的細胞種との酵母運搬体の融合は、シンシチウム形成を導く、標的細胞種（例えば、樹状細胞又はマクロファージ）の膜との、酵母細胞膜又はこれらの粒子の融合能を指す。本明細書において使用されるときに、シンシチウムは、細胞の融合によってもたらされる細胞質の多核巨細胞の集団である。ウイルス表面タンパク質（ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス及びアデノウイルスといった免疫不全ウイルスのウイルス表面タンパク質が挙げられる）、及び他の融合誘導因子（例えば、卵子と精子との間における融合に関与する融合誘導因子）の多くは、２つの膜の間（例えば、ウイルスと哺乳類の細胞膜との間、又は哺乳類の膜同士の間）における融合をもたらすことが可能なことが示されている。例えば、表面上にＨＩＶのｇｐ１２０／ｇｐ４１を生じる酵母運搬体は、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球と融合可能である。しかし、ここで留意すべきは、酵母運搬体への標的部分の組み込みは、一方ではある状況下において好ましくあり得るが、必須ではない。細胞外に抗原を発現する酵母運搬体の場合において、これは、本発明の酵母運搬体のさらなる利点であり得る。本発明の酵母運搬体が樹状細胞（これと同様に、他の細胞（例えば、マクロファージ））によって容易に取り込まれることは、以前に示されている。

酵母運搬体の産生、ならびに抗原を有する酵母運搬体の発現、抗原と酵母運搬体の組み合わせ、又は抗原と酵母運搬体の会合に関する方法は、以下に記載されている。
〔抗原〕
本発明における使用に関して検討される抗原としては、免疫反応の誘発に好ましいあらゆる抗原が挙げられる。例えば、抗原としては、病原体と関連したあらゆる抗原（ウイルス抗原、真菌抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、寄生生物抗原、外寄生生物抗原、原虫抗原、又は他のあらゆる感染性因子に由来する抗原が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。また、抗原としては、病原性の原因か、又は細胞性の原因に由来する特定の疾患又は悪い健康状態と関連したあらゆる抗原（がん抗原、自己免疫疾患と関連した抗原（例えば、糖尿病抗原）、アレルギー抗原（アレルゲン）、１つ以上の変異アミノ酸を内部に有する哺乳類細胞分子、出生前若しくは新生児期に哺乳類細胞によって通常に発現されるタンパク質、伝染病因子（例えば、ウイルス）の挿入によって誘導されるタンパク質、遺伝子の転座によって発現が誘導されるタンパク質、及び制御配列の変異によって発現が誘導されるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。これらの抗原は、本来の抗原、又はある方法（例えば、配列の変更又は融合タンパク質の生成）において修飾されている遺伝的に改変された抗原であり得る。ある実施形態において（例えば、抗原が酵母運搬体によって組み換え核酸分子から発現される場合に）、抗原は、全体の細胞又は微生物というよりむしろ、タンパク質若しくはこれらのあらゆる免疫原性ドメイン、融合タンパク質、又はキメラタンパク質であることが理解される。

本発明の組成物に（ワクチン）に含めるための他の好ましい抗原としては、例えば、アレルゲン、自己免疫抗原、発熱因子、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）に関与する抗原、ある種の癌、感染性ショック抗原、及び移植拒否反応に関与する抗原によって、例えば引き起こされる、所望ではない、又は害を及ぼす免疫反応を抑制可能な抗原が挙げられる。当該化合物としては、好ましくは細胞性免疫及び／又は体液性免疫を増強又は抑制できる生物学的反応修飾因子との組み合わせにおいて、抗ヒスタミン、シクロスポリ、副腎皮質ステロイド、ＦＫ５０６、害を及ぼす免疫反応の生成に関与するＴ細胞受容体と対応するペプチド、Ｆａｓリガンド（すなわち、細胞質Ｆａｓ受容体の細胞外ドメイン又は細胞基質ドメインと結合する（従って、アポトーシスを誘導する）化合物）、寛容化又はアネルギーをもたらすように提示される好適なＭＨＣ複合体、Ｔ細胞受容体、及び自己免疫抗原が挙げられる。

本発明において有用な腫瘍抗原（がん抗原）としては、腫瘍抗原（例えば、がん細胞に由来する、タンパク質、糖タンパク質又は表面炭水化物）、腫瘍抗原に由来するエピトープ、全体の腫瘍細胞、腫瘍細胞の混合物、及びこれらの一部（例えば、溶解物）を挙げることができる。

１つの局面において、抗原は、ウイルス（アデノウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、フラビウイルス、ヘパドナウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ミクソウイルス、腫瘍ウイルス、オルトミクソウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、パラインフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス、レオウイルス、桿状ウイルス、風疹ウイルス、トガウイルス、及び水痘ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない）に由来する。他のウイルスとしては、Ｔリンパ球増殖性のウイルス（例えば、ヒトＴリンパ球増殖性ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩといったＨＴＬＶ））、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶＳ）及びネコ白血病ウイルス（ＦＬＶｓ）が挙げられる。レンチウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ（ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２が挙げられる））、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、及びイヌ免疫不全ウイルス（ＣＩＶ）が挙げられる。

他の局面において、抗原は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ボルダテラ（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ）、ブルギア（Ｂｒｕｇｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、コッチジア（Ｃｏｃｃｉｄｉａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジロフィラリア（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランチセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ゴノコッカス（Ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、レイシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、パラメチウム（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）、ペルツシス（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、ニューモキスティス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）、リケットシア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トクソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、ビブリオコレラエイエルシニア（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ Ｙｅｒｓｉｎｉａ）から選択される属からの感染性因子に由来する。１つの局面において、感染性因子は、プラスモジウムフォルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）又はプラスモジウムビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）が選択される。

１つの局面において、抗原は、エンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、マイクトコッカセアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ビブリオナセアエ（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）、パステウレラセアエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、マイコプラズマタセアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）、及びリケットシアセアエ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ）から選択される科からの細菌に由来する。１つの局面において、細菌は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、パステウレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、及びイエーシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）から選択される属である。１つの局面において、細菌は、シュードモナスアエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナスマレイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｌｅｉ）、シュードモナスシュードマレイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、ボルデテラペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、マイコバクテリウムチュバークロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウムレプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、フランシセラチュラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ビブリオコレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、バチルスアンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、サルモネラエンテリック（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃ）、イエーシニアペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、エスケリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びボルデテラブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）から選択される種に由来する。

本発明によれば、本組成物又はワクチンにおける使用に好適な抗原としては、同じ抗原に由来する２つ以上の免疫原性ドメイン若しくはエピトープ、同じ細胞、組織若しくは生物に由来する２つ以上の抗原免疫原性ドメイン、若しくはエピトープ、又は異なる細胞、組織若しくは生物に由来する２つ以上の異なる抗原、免疫原性ドメイン、若しくはエピトープを挙げることができる。

上述のように、本発明のワクチン及び組成物に使用される融合タンパク質は、動物にワクチン接種するための少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含む。組成物又はワクチンは、要望に応じて、１つ、２つ、少数の、いくつもの又は多数のインフルエンザ抗原（１つ以上のインフルエンザ抗原の１つ以上の免疫原性ドメインが挙げられる）を含むことができる。

病原体（例えば、インフルエンザウイルス）に由来する抗原が使用される場合に、当業者は、病原体の異なる種に渡って高度に保存されている病原体遺伝子の領域から抗原を選択することによって、病原体抗原を発現する酵母運搬体を備えるワクチンの長期の有効性を最大化できる。その他に、可変性である病原体の領域（例えば、抗原）、株と株との間において異なる病原体の領域、又は季節ごとに若しくは地理的領域において変異され得る病原体の領域から抗原を選択することによって、例えば、特定の伝染性に対処するワクチンの能力が最大化される。本発明のこの局面は、上述において詳しく述べられている。

１つの局面において、病原体はインフルエンザウイルスである。この局面において、保存された、又は内部に発現される抗原としては、基質タンパク質（Ｍ１）、イオンチャネル（Ｍ２）抗原、ヌクレオカプシド（ＮＰ）抗原、ポリメラーゼＰＢ１（ＰＢ１）抗原、ポリメラーゼ（ＰＢ２）抗原、及びポリメラーゼＰＡ（ＰＡ）抗原が挙げられる。可変性の、又は外部に発現される抗原としては、Ｍ２ｅと呼ばれるＭ２の細胞外部分だけでなく、ヘマグルチニン（ＨＡ）抗原（あらゆる１つ以上のサブタイプ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原（あらゆる１つ以上のサブタイプ）が挙げられる。これらの抗原は、本発明に係る新規のワクチン戦略に使用するために、上述のように選択され得る。

１つの局面において、病原体はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）といった肝炎ウイルスである。この局面において、保存された、又は内部に発現される抗原としては、ＨＣＶ核タンパク質であるＨＣＶ ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５が挙げられる。可変性の又は外部に発現される抗原としては、ＨＣＶ Ｅ１及びＥ２（エンベロープタンパク質）が挙げられる。これらの抗原は、本発明に係る新規のワクチン戦略に使用するために、上述のように選択され得る。

１つの局面において、病原体はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）といった肝炎ウイルスである。この局面において、保存された、又は内部に発現される抗原としては、核抗原であるＨｂｃＡｇ及びｅ抗原であるＨｂｅＡｇが挙げられる。可変性の、又は外部に発現される抗原としては、ＨｂｓＡｇ（４２ｎＭビリオン及び２２ｎＭビリオン）が挙げられる。これらの抗原は、本発明に係る新規のワクチン戦略に使用されるために、上述のように選択され得る。

１つの局面において、病原体はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）といった免疫不全ウイルスである。この局面において、保存された、又は内部に発現される抗原としは、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、ｐ７、ヌクレオカプシドが挙げられる。可変性の、又は外部に発現される抗原としては、ｇｐ１２０及びｇｐ４１が挙げられる。これらの抗原は、本発明に係る新規のワクチン戦略に使用するために、上述のように選択される。

ある実施形態において、抗原は融合タンパク質である。本発明の１つの局面において、融合タンパク質は、２つ以上の抗原を含み得る。１つの局面において、融合タンパク質は、１つ以上の抗原（例えば、インフルエンザのＭ１配列及びインフルエンザのＨＡ配列）の２つ以上の免疫原性ドメイン、又は２つ以上のエピトープを含み得る。当該ワクチンは、広範な患者における抗原特異的な免疫作用を提供し得る。例えば、本発明に有用な複数のドメイン融合タンパク質は、各ドメインが、特定のタンパク質に由来するペプチドであって、当該タンパク質において見られる変異アミノ酸のいずれか一方の側に隣接し、かつ当該変異アミノ酸を含む少なくとも４アミノ酸残基からなるペプチドからなる複数のドメインを有し得る（ここで、当該変異は、特定の疾患又は悪い健康状態（例えば、特定の株によるインフルエンザ感染）に関連する。

１つの実施形態において、本発明の酵母を基にしたワクチンの構成要素として使用される融合タンパク質は、酵母において異種の抗原の発現に特に有用な構築物を用いて産生される。典型的に、所望の抗原性のタンパク質又はペプチドは、それらのアミノ末端部において、（ａ）酵母運搬体における融合タンパク質の発現を安定化するか、又は発現された融合タンパク質の翻訳後修飾を妨げる特定の合成ペプチド（当該ペプチドについて、例えば、引用によってその全体が本明細書に組み込まれる、２００４年８月１２日出願の米国出願公開第２００４−０１５６８５８ Ａ１号明細書に詳細に記載されている）；（ｂ）内因性の酵母タンパク質の少なくとも一部（ここで、融合相手のいずれかは、酵母におけるタンパク質の発現の有為に増強された安定性を提供する）及び／又は酵母細胞によるタンパク質の翻訳後修飾を有為に妨げる）（また、当該タンパク質について、例えば、上記の米国出願公開第２００４−０１５６８５８ Ａ１号明細書に詳細に記載されている）；及び／又は（ｃ）融合タンパク質を酵母の表面上に発現させる酵母タンパク質の少なくとも一部（例えば、上述においてより詳細に記載されているＡｇａタンパク質）と融合される。

また、融合ペプチド又は融合タンパク質は、選択因子（例えば、抗体）によって認識されることが所望され得、かつ構築物におけるワクチン接種抗原に対する免疫反応に負の影響を与えないと思われるエピトープを提供し得る。当該因子は、本発明において有用なタンパク質の同定、選択及び精製に有用である。

その他に、本発明は、抗原をコードする構築物のＣ末端に融合されたペプチドの利用、特にタンパク質の選択及び同定における利用を包含する。当該ペプチドとしては、ペプチドタグ（例えば、６×Ｈｉｓ）又はあらゆる他の短いエピトープタグといった、あらゆる合成ペプチド又は天然ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に係る抗原のＣ末端に結合されたペプチドは、上述したＮ末端ペプチドの付加の有無に関わらず、使用され得る。

本発明に有用な融合構築物の１つは、（ａ）少なくとも１つの抗原（本明細書の他の箇所に記載されているような種々の融合タンパク質及び複数の抗原構築物だけでなく、全長の抗原の免疫原性ドメイン及びエピトープが挙げられる）；及び（ｂ）合成ペプチドを含む融合タンパク質である。

１つの実施形態において、合成ペプチドは、インフルエンザ抗原のＮ末端と連結され、当該ペプチドは、当該インフルエンザ抗原とは異種の少なくとも２つのアミノ酸残基から構成される（ここで、当該ペプチドは、酵母運搬体における融合タンパク質の発現を安定化するか、又は発現された融合タンパク質の翻訳後修飾を妨げる）。合成ペプチド及び抗原のＮ末端部分はともに、以下の要求：（１）融合タンパク質の１位における残基がメチオニンである（すなわち、合成ペプチドにおける最初のアミノ酸がメチオニンである）；（２）融合ペプチドの２位におけるアミノ酸残基がグリシン又はプロリンではない（すなわち、合成ペプチドにおける２番目のアミノ酸が、グリシン又はプロリンではない）；（３）融合タンパク質の２から６位におけるアミノ酸残基が１つとしてメチオニンではない（すなわち、合成ペプチドか又はタンパク質の一部である２から６位のアミノ酸は、合成ペプチドが６アミノ酸よりも短い場合に、メチオニンを含まない）
；及び（４）融合タンパク質の２から６位におけるアミノ酸が、１つとしてリジン又はアルギニンではない（すなわち、合成ペプチドか又はタンパク質の一部である２から６位のアミノ酸は、合成ペプチドが５アミノ酸よりも短い場合に、リジン又はアルギニンを含まない）を有する融合タンパク質を形成する。合成ペプチドが２アミノ酸ほどの長さであり得るが、より好ましくは２から６アミノ酸（３、４、５アミノ酸が挙げられる）であり得、６アミノ酸よりも長くて、すべての整数において約２００アミノ酸、３００アミノ酸、４００アミノ酸、５００アミノ酸又はそれ以上までであり得る。

１つの実施形態において、融合タンパク質は、Ｍ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６というアミノ酸配列を備える（ここで、Ｍはメチオニンであり；ここで、Ｘ_２は、グリシン、プロリン、リジン又はアルギニンを除くあらゆるアミノ酸であり；ここで、Ｘ_３は、メチオニン、リジン又はアルギニンを除くあらゆるアミノ酸であり；ここで、Ｘ_４は、メチオニン、リジン又はアルギニンを除くあらゆるアミノ酸であり；ここで、Ｘ_５は、メチオニン、リジン又はアルギニンを除くあらゆるアミノ酸であり；かつここで、Ｘ_６は、メチオニン、リジン又はアルギニンを除くあらゆるアミノ酸である）。１つの実施形態において、Ｘ_６残基はプロリンである。酵母細胞におけるインフルエンザ抗原の発現の安定性を向上する、及び／又は酵母におけるタンパク質の翻訳後修飾を妨げる例示的な合成配列としては、配列Ｍ−Ａ−Ｅ−Ｄ−Ａ−Ｐ（配列番号１）が挙げられる。ＭＡＤＥＡＰ配列は、インフルエンザ抗原の他に、他の抗原とともに使用され得る。発現産物の増強された安定性に加えて、この融合相手は、構築物におけるワクチン接種抗原に対する免疫反応に対して負の影響を与えないと思われる。その他に、合成融合ペプチドは、選択因子（例えば、抗原）によって認識され得るエピトープを提供するために設計され得る。

本発明の他の実施形態において、本発明に使用される合成ペプチドの翻訳開始部位をコードする核酸は、コザックの翻訳配列の法則に従って、Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇである（ここで、この配列におけるＡＴＧは、転写開始部位であり、かつＭ−Ａ−Ｅ−Ｄ−Ａ−Ｐ（配列番号１）のメチオニンをコードする）。本明細書に記載されるような本発明の種々の実施形態がまた、組み合わせられ得ることは、理解されるべきである。例えば、本発明の１つの局面において、合成ペプチドがＭＡ−Ｄ−Ｅ−Ａ−Ｐ（配列番号１）である場合に、このペプチドに関する開始部位をコードする核酸は、Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇであり得る。本発明の実施形態の様々な他の組み合わせは、当業者にとって明らかである。

本発明の１つの局面において、酵母運搬体は、抗原が、部分的に又は全体的に酵母運搬体の表面上に、発現されるか、又は発現された抗原産物の送達若しくは移動によって提供（細胞外に発現）されるように、操作される。本発明のこの局面を達成する方法の１つは、酵母運搬体の表面上に１つ以上の抗原を位置させるためのスペーサアーム（ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ）を用いることである。スペーサアームを用いる方法の１つは、酵母細胞壁に対して関心のある抗原を標的化するタンパク質との、関心のある抗原の融合タンパク質を作り出すことである。例えば、使用され得るタンパク質の１つは、抗原が酵母の表面上に位置されるように、抗原の酵母細胞壁に対する標的化を可能にする酵母タンパク質（例えば、細胞壁タンパク質２（ｃｗｐ２）、Ａｇａ２、Ｐｉｒ４又はＦｌｏ１タンパク質）である。酵母タンパク質以外のタンパク質がスペーサアーム（しかし、あらゆるスペーサアームタンパク質に関して、スペーサアームタンパク質よりむしろ、標的抗原に対して導かれる免疫原性反応を有することが最も所望される）用に使用され得る。従って、他のタンパク質がスペーサアーム用に使用される場合に、使用されるスペーサアームタンパク質は、その結果、標的抗原に対する免疫反応が圧倒されるほどに、スペーサアームタンパク質そのものに対して大きな免疫反応を生成すべきではない。当業者は、標的抗原に対する免疫反応と比べて、スペーサアームに対する免疫反応を小さくすることを目指すべきである。免疫反応の大きさを決定するあらゆる公知の方法は、使用され（例えば、抗体産生、溶菌アッセイなど）、かつ当業者にとって容易に知られる。

標的抗原を配置して酵母表面にさらさせる他の方法は、シグナル配列（例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ））を用いて、酵母細胞壁に対して固着させることである。代替可能に、配置は、抗原が、細胞壁に対して結合されるタンパク質（例えば、ｃｗｐ）と結合するように、関心のある抗原を小胞体（ＥＲ）への移動を介して、分泌経路に標的化するシグナル配列を付けることによって達成され得る。

１つの局面において、スペーサアームタンパク質は、酵母タンパク質である。酵母タンパク質は、酵母タンパク質の約２から約８００のアミノ酸から構成され得る。１つの実施形態において、酵母タンパク質は、約１０から７００のアミノ酸である。本発明の他の実施形態において、酵母タンパク質は、約４０から６００アミノ酸である。本発明の他の実施形態は、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも４５０アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも５５０アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、少なくとも６５０アミノ酸である酵母タンパク質を包含する。１つの実施形態において、酵母タンパク質は、少なくとも４５０アミノ酸の長さである。

他の実施形態において、酵母タンパク質は、酵母運搬体における融合タンパク質の発現を安定化する、発現された融合タンパク質の翻訳後修飾を妨げ、及び／又は酵母における特定の区画に対して融合タンパク質を標的化する（例えば、酵母細胞表面に発現されること）。酵母分泌経路への送達に関して、使用するための酵母タンパク質としては、Ａｇａ（Ａｇａ１及び／又はＡｇａ２が挙げられるが、これらに限定されない）；ＳＵＣ２（酵母転化酵素）；アルファ因子シグナルリーダー配列；ＣＰＹ；細胞壁における局在及び保持に関するＣｗｐ２ｐ；娘細胞形成の初期において母細胞芽における局在に関するＢＵＤ遺伝子；Ｆｌｏ１ｐ；Ｐｉｒ２ｐ；及びＰｉｒ４ｐが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の他の実施形態において、他の配列が使用されて、酵母運搬体の他の部分に（例えば、細胞基質又はミトコンドリアに）標的化され得る、保持され得る、及び／又は安定化され得る。以上のあらゆる実施形態に対して使用され得る好適な酵母タンパク質の例としては、ＳＥＣ７；グルコース及び細胞基質局在における抑制性の発現に関するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ ＰＣＫ１、ホスホグリセロキナーゼ ＰＧＫ及びトリオースリン酸イソメラーゼ ＴＰＩ遺伝子産物；熱処理に対する細胞のばくろによって発現が誘導され、かつタンパク質がより熱安定になる、熱ショックタンパク質 ＳＳＡ１、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１；ミトコンドリアへの取り込みに関する、ミトコンドリアタンパク質 ＣＹＣ１；ＡＣＴ１が挙げられるが、これらに限定されない。

有効な体液性免疫反応の初回刺激に関して、標的抗原は、酵母表面上のある部分に発現される又は提供される（酵母によって分泌される）べきである。図１０Ａ及び１０Ｂ、図１１、ならびに図１３Ｂ、ならびに実施例に示されているように、複数の変種は、酵母細胞表面上に抗原を発現又は提供することが可能である。酵母タンパク質の他の組み合わせが、表面上に１つ以上の関心のある抗原を配置するために使用され得ることを、当業者は十分に理解する。

当業者は、種々の方法において、酵母の表面上における抗原の発現又は提供を最適化可能である。当該方法の１つは、抗原の表面発現を監視及び／又は制御することである。これを達成するために考えられる方法の１つは、最大の影響を与えるような、抗原の発現水準を最適化することである。ある抗原について、抗原の過剰発現は、酵母にとって、又は代わりに個体の免疫細胞と免疫系とにとって、有毒である。他の場合において、表面発現が少なすぎることは、Ｂ細胞との抗原の相互作用の欠如に起因して、免疫系の初回刺激を最適以下にさせる原因になる。当業者は、公知の技術（例えば、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）及び細胞生存率との発現水準の相関）を用いることによって抗原の発現について監視可能である。

抗体の表面発現又は表面提供を最適化する他の方法は、細胞壁の融合相手からスペーサアームを慎重に選択することである。スペーサアームとして使用され得る酵母タンパク質の例は、後に示されており、かつ図１０Ｂに示されているが、スペーサアームの大きさは、どれだけの抗原が酵母の表面に結合するために露出されるかに影響を与える可能性がある。従って、使用される抗原に依存して、当業者は、酵母の表面における抗原の適切な位置決めを達成するスペーサアームを選択する。１つの実施形態において、スペーサアームは、少なくとも４５０アミノ酸の酵母タンパク質である。

抗原の表面発現を最適化する他ための他の検討事項は、抗原及びスペーサアームの組み合わせが、単量体（例えば、図１１に示されるようなＨＡ−ｃｗｐ２）として、又は２量体として、又は３量体（例えば、３量体のＨＡ−ａｇａ２ｐ＋可溶性の分泌されたＨＡ）として、又は互いに接続されたさらに多い単位として発現されるべきか、ということである。例えば、多量体の形態が、抗体の特定の分類（例えば、中和抗体）を誘発するために要求される立体構造を採用する場合に、単量体、２量体、３量体などのこの利用は、抗原をより免疫原性がある状態にする態様において抗原のすべてではないがいくつかの部分が酵母運搬体の表面上に並べられるように、抗原の適切な位置決め及び折りたたみを可能にする。

当業者は、５．５よりも高いｐＨ水準（例えば、中性ｐＨ）において酵母細胞を培養することによって、酵母運搬体の表面上及び細胞質基質の両方における、酵母運搬体の能力を（異種抗原の発現の有無に関わらず）最適化することができる。中性ｐＨの利用は、抗原の接触性よおび表面への表出の最適化を補助し、酵母細胞壁がより柔軟な状態になることを許容し、かつ免疫細胞の酵母に対する結合を引き起こして、最適化された免疫反応（有益なサイトカイン（例えば、ＩＮＦ−ガンマ）の分泌が挙げられる）及び最適化された活性化反応を生成する。

当業者が用いて抗体反応に関する初回刺激を最適化する方法は、酵母の糖化の総量を制御することである。酵母の糖化の総量は、糖部分が大きくなる傾向にあるので、表面上に発現された抗原の免疫原性及び抗原性に影響を与える可能性がある。従って、本発明を実施する場合に、酵母の表面上における糖部分の存在、及び標的抗原の周囲にある三次元空間に対する影響が、考慮されるべきである。あらゆる方法が、酵母の糖化の量を低下させるために使用され得る。例えば、低糖化を有するために選択されている酵母変異体（例えば、ｍｎｎ１、ｏｃｈ１及びｍｎｎ９変異体）を使用可能であるか、又は標的抗原上における糖化受容配列を変異によって除去可能である。代替可能に、短縮型の糖化様式を有する酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ）を使用することができる。表面抗原における糖化の影響の例としては、実施例５に与えられている。

酵母の表面に対する抗原の提供に関する他の検討事項は、どれだけ酵母が不活性であるか、及び酵母の活性状態がどれだけ表面に発現された抗原の抗原性に影響するかという見込まれる結果である。酵母の熱不活化は、酵母を不活化する標準的な方法であるが、熱不活化は、標的抗原の２次、３次又は４次の構造を変える可能性を有する。熱不活化が使用される場合に、それから、当業者は、当該分野に耕地の標準的な方法によって、標的抗原の構造変化を注意深く監視すべきである。代替可能に、酵母を不活化する他の方法（例えば、化学的な、電気的な、放射性の、又は紫外線の方法）が使用され得る。例えば、標準的な酵母培養の教科書（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １９４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ （１９９０））に開示されている方法論を参照すればよい。使用されるあらゆる最適化戦略は、標的抗原の２次、３次又は４次の構造を考慮にいれるべきであり、かつその免疫原性を最適化するように当該構造を保護すべきである。

上記実施形態と同様の、かつ上記実施形態の制限を含み得る（が、これは必要ではない）本発明の融合タンパク質構築物の他の特定の局面としては、インフルエンザ抗原のＣ末端と連結されたペプチドであって、インフルエンザ抗原とは異種の少なくとも２つのアミノ酸配列からなる当該ペプチドを備えるワクチンが挙げられる（ここで、当該ペプチドは、酵母における融合タンパク質の発現を安定化するか、又は発現された融合タンパク質の翻訳後修飾を妨げる）。本発明の１つの例示的な局面において、ペプチドは、Ｅ−Ｄ（Ｇｌｕ−Ａｓｐ）のアミノ酸配列を備える。当該配列は、疎水性の影響を弱めるために働く。

１つの実施形態において、本発明のワクチンは、インフルエンザ抗体のＣ末端と連結されたペプチドを備え得る（ここで、ペプチドは、ペプチドに対して指向された抗体による融合タンパク質の認識を可能にする）。１つの局面において、ペプチドは、Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ（配列番号２）のアミノ酸配列を備える。この実施形態は、単独に使用され得るか、又は上述に記載した融合タンパク質の他の局面と組み合わせて使用され得る。

１つの実施形態において、本明細書の融合タンパク質において使用される酵母タンパク質／ペプチド、スペーサアーム、又は合成ペプチドは、融合タンパク質の同定用及び精製用の抗体エピトープを備える。抗体は、内因性の抗原と選択的に結合するものをすでに利用可能であるか、又は容易に生成され得る。最後に、特定の細胞質の位置（例えば、分泌経路内、ミトコンドリア内、核内）にタンパク質を導くことが好ましく、それから構築物は、細胞機構がその送達系に関して最適化されることが確かな、酵母タンパク質に対する外因性のシグナルを使用可能である。当該シグナルについては、以上においていくらか詳細に記載されている。好ましくは、抗体は、融合タンパク質と選択に結合する利用可能なものであるか、又は産生されるものである。

〔本発明の酵母運搬体、タルモゲン（Ｔａｒｍｏｇｅｎ）、及び組成物（ワクチン）の製造〕
本発明によれば、用語「酵母運搬体−抗原複合体」又は「酵母−抗原複合体」は、抗原との酵母運搬体のあらゆる関連を説明するために、一般的に使用される。当該関連としては、酵母（組み換え酵母）による抗原の発現、酵母への抗原の導入、酵母に対する抗原の物理的な接触、及び例えば、緩衝液又は他の溶液又は調合物における酵母及び抗原の同時の混合が挙げられる。複合体のこれらの種類について、以下に詳細に記載されている。

１つの実施形態において、酵母運搬体を調製するために使用される酵母細胞は、抗原が酵母細胞によって発現されるように、異種の核酸分子を用いてトランスフェクションされている。また、当該酵母は、本明細書において組み換え酵母又は組み換え酵母運搬体と呼ばれる。それから、酵母細胞は、原形を保った細胞として樹状細胞に取り込まれ得るか、又は酵母細胞は、又は殺され得る酵母細胞か、又は例えば、続いて樹状細胞に取り込まれるあらゆるものである、酵母のスフェロプラスト、細胞質体、ゴースト又は亜細胞性粒子の形成によって導かれ得る。また、酵母のスフェロプラストは、組み換え核酸分子を用いて直接にトランスフェクトされて（例えば、当該スフェロプラストは、完全な酵母から産生され、かつそれからトランスフェクトされて）、抗原を発現する組み換えスフェロプラストを産生し得る。

１つの局面において、酵母運搬体を調製するために使用される酵母細胞又は酵母のスフェロプラストは、抗原が酵母細胞又は酵母のスフェロプラストによって組み換え的に発現されるように、抗原をコードする組み換え核酸分子を用いてトランスフェクトされる。この局面において、酵母を組み換え的に発現する酵母細胞又は酵母のスフェロプラストが使用されて、酵母の細胞質体、酵母のゴースト、又は酵母の膜粒子若しくは酵母細胞膜粒子、又はこれらの画分を備える酵母運搬体を産生し得る。

一般的に、酵母運搬体及び抗原は、本明細書に記載のあらゆる技術によって関連され得る。１つの局面において、酵母運搬体は、抗原を細胞内に取り込んだ。他の局面において、抗原は、酵母運搬体と共有結合的に、又は非共有結合的に結合された。さらに他の実施形態において、酵母運搬体及び抗原は、混合によって関連された。他の局面において、及び好ましい実施形態において、抗原は、酵母運搬体によって、又は酵母運搬体が誘導された酵母細胞若しくは酵母のスフェロプラストによって組み換え的に発現される。

本発明の酵母運搬体によって産生されるべき、好ましい抗原の数は、酵母運搬体によって合理的に産生され得るあらゆる抗原の数であり、かつ典型的に少なくとも１から少なくとも約６以上の範囲であると同時に、約２つから６つの異種抗原であることが好ましい。

本発明の酵母運搬体における抗原の発現は、当業者に公知の技術を用いて達成される。要約すれば、少なくとも１つの所望の抗原をコードする核酸分子は、宿主酵母細胞に形質転換される場合に、当該核酸分子の保存された、又は調節された発現に影響を与えることを可能にするために、当該核酸分子が転写制御配列と作動可能に連結されるように、発現ベクターに挿入される。１つ以上の抗原をコードする核酸分子は、１つ以上の発現制御配列と作動可能に連結された１つ以上の発現ベクターであり得る。特に重要な発現制御配列は、翻訳開始を制御する配列（例えば、プロモーター及び活性化配列の上流）である。あらゆる好適な酵母プロモーターが、本発明に使用され得、かつ種々の当該プロモーターは、当業者にとって公知である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現に好適なプロモーターとしては、以下の酵母タンパク質：アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ１）若しくはＩＩ（ＡＤＨ２）、ＣＵＰ１、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、翻訳伸張因子ＥＦ−１アルファ（ＴＥＦ２）、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ；またトリオースリン酸デヒドロゲナーゼに関してＴＤＨ３と呼ばれる）、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、ガラクトース１リン酸ウリジルトランフェラーゼ（ＧＡＬ７）、ＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＧＡＬ１０）、チトクロームｃ_１（ＣＹＣ１）、Ｓｅｃ７タンパク質（ＳＥＣ７）及び酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）、これらと同時に、より好ましいハイブリッドプロモーター（例えば、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨ及びＣＹＣ１／ＧＡＬ１０、及びグルコース濃度が低い（例えば、約０．１から約０．２パーセント）場合に挙げられ得るＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターだけでなく、さらにより好ましいＣＵＰ１プロモーターとＴＥＦ２と）をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、上流活性化配列（ＵＡＳｓ）（エンハンサーとも呼ばれる）の多くは、公知である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現にとって好ましい上流活性化配列としては、以下のタンパク質：ＰＣＫ１、ＴＰＩ、ＴＤＨ３、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＳＵＣ２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０をコードする遺伝子のＵＡＳだけでなく、ＧＡＬ４遺伝子産物によって活性化されるＵＡＳと同時に、特に好ましくはＡＤＨ２のＵＡＳが挙げられるが、これらに限定されない。ＡＤＨ２のＵＡＳが、ＡＤＲ１遺伝子産物によって活性化されるので、異種遺伝子がＡＤＨ２のＵＡＳに対して作動可能に連結されている場合に、ＡＤＲ１遺伝子を過剰発現させることが好ましい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現にとって好ましい転写終結配列としては、α因子、ＧＡＰＤＨ及びＣＹＣ１遺伝子の終結配列が挙げられる。

メチル要求性の酵母において遺伝子を発現するために好ましい転写制御配列としては、アルコール酸化酵素及び蟻酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写制御配列が挙げられる。

酵母による抗原の細胞外発現に関する最適化の重要性及び方法は、本明細書のここまでにおいて、詳細に論じられている。
本発明に係る酵母細胞への核酸分子のトランスフェクションは、核酸分子が細胞に投与されるあらゆる方法（拡散、能動輸送、バスソニケーション（ｂａｔｈ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、微量注入法、リポフェクション、吸着法、及び原形質融合が挙げられるが、これらに限定されない）によって達成され得る。トランスフェクトされた核酸分子は、酵母染色体に組み込まれるか、又は当業者に公知の技術を用いて染色体外ベクターに維持される。当該核酸分子を支持する酵母運搬体の例は、本明細書に詳細に開示されている。また、上記において論じたように、酵母細胞質体、酵母のゴースト、ならびに酵母膜粒子又はは細胞壁調製物は、原型を保った酵母微生物又は酵母スフェロプラストを、所望の核酸分子を用いてトランスフェクトすること、これらにおいて抗原を産生すること、ならびにそれからさらに、当業者に公知の方法を用いて当該微生物又はスフェロプラストを操作して、所望の抗原を含む細胞質体、ゴースト又は亜細胞性酵母膜抽出物又はこれらの画分を産生することによって組み換え的に産生され得る。

組み換え酵母運搬体の産生及び抗原の発現にとって有効な条件としては、酵母株が培養され得る有効な培地が挙げられる。有効な培地は、典型的に、吸収可能な炭水化物源、窒素源及びリン酸源はもちろん、適切な塩、ミネラル、金属及び他の栄養物（例えば、ビタミン及び成長因子）を含む水性の培地である。培地は、複合栄養物を含み得るか、又は決まった最小培地であり得る。本発明の酵母株は、種々の容器（バイオリアクター、三角フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、及びペトリ板が挙げられるが、これらに限定されない）において培養され得る。培養は、酵母株にとって適切な温度、ｐＨ及び酸素含有量において実施される。当該培養条件は、当業者の専門的知識（例えば、Ｇｕｔｈｒｉｅ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， １９９１， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １９４， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照すればよい）の範囲内である。

本発明のある局面において、及び体液性免疫反応の誘導が所望される実施形態において抗原の十分な表面発現若しくは表面提供を有することが所望される場合において、酵母は、少なくとも５．５のｐＨ水準に維持された培地（すなわち、培養培地のｐＨが５．５未満に下がることを許容しない）において培養される。他の局面において、酵母は、約５．５に維持されたのｐＨ水準において培養される。他の局面において、酵母は、約５．６、５．７、５．８又は５．９に維持されたｐＨ水準において培養される。他の局面において、酵母は、約６に維持されたｐＨ水準において培養される。他の局面において、酵母は、約６．５に維持されたｐＨ水準において培養される。他の局面において、酵母は、約６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９又は７．０に維持されたｐＨ水準において培養される。他の局面において、酵母は、約７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０に維持されたｐＨ水準において培養される。ｐＨ水準は、酵母の培養において重要である。当業者は、培養過程が酵母培養の開始だけでなく、同様に培養の維持を含むことを十分に理解する。酵母培養は、時間の経過に伴って酸性に変わること（すなわち、ｐＨが低下すること）が知られているように、培養過程の間において、注意してｐＨ水準を監視しなければならない。培地のｐＨ水準が６未満に下がっている状態における酵母細胞培養は、培地のｐＨが培養過程のある時点において少なくとも５．５にまで到達させるという条件の下に、やはり本発明の範囲内にあると考えられる。従って、酵母が約ｐＨ５．５又はそれ以上である培地において培養される時間が長いほど、所望の特性を有する酵母を得るという点に関して、よりよい結果になる。

酵母の培養における中性ｐＨの利用は、免疫調節用の運搬体として酵母を使用するための所望の特性である種々の生物学的影響を助長する。１つの局面において、中性ｐＨにおいて酵母を培養することは、細胞世代時間に関してあらゆる負の影響（例えば、倍加時間を遅らせること）を与えることなく、酵母の良好な培養を可能にする。酵母は、細胞壁の柔軟性を失うことなく、高密度に増殖し続けることができる。他の局面において、中性ｐＨの利用は、すべての回収密度において、柔軟な細胞壁を有する酵母及び／又は細胞壁消化酵素（例えば、グルクナーゼ）に感受性である酵母の産生を可能にする。この特色は、柔軟性のある細胞壁を有する酵母が、例えば、酵母を受け入れている細胞においてサイトカイン（例えば、インターフェエロン−γ（ＩＦＮ−γ））の分泌を促進することによって、固有の免疫反応を示すので、好ましい。その他に、当該培養方法によって細胞壁に位置される抗原に対するより良好な接近性が与えられる。他の局面において、ある抗原（例えば、インフルエンザＨＡ抗原）にとっての中性ｐＨの使用は、ＨＡ発現酵母が低いｐＨ（例えば、５）にある培地において培養される場合に起こり得ない、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いた処理によって、ジスルフィド結合されたＨＡの放出を可能にする。最後に、他の局面において、中性ｐＨ方法論を用いて培養された酵母に（例えば、食作用又は他の取り込みによって）ばくろされる場合に、Ｔｈ１−タイプサイトカインを産生する細胞は、当該Ｔｈ１−タイプサイトカイン（ＩＦＮ−γ、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、及びＩＬ−２が挙げられるが、これらに限定されない）の増強された産生を発現する。

本発明において使用されるときに、用語「中性ｐＨ」は、約ｐＨ５．５から約ｐＨ８、好ましくは約ｐＨ６から約８の範囲のｐＨを指す。当業者は、軽微な変動（例えば、１０分の１又は１００分の１）がｐＨメーターを用いた測定に場合に生じ得ることを十分に理解する。従って、酵母細胞を培養するための中性ｐＨの使用は、酵母細胞が、培地の中にある時間の大部分に渡って中性ｐＨにおいて増殖されることを意味する。

本発明の１つの実施形態において、酵母運搬体における抗原の組み替え的発現の代替手段として、酵母運搬体は、タンパク質抗原若しくはペプチド抗原、又は抗原として作用する炭水化物若しくは他の分子を細胞内に取り込んでいる。続いて、現在、細胞内に抗原を含む酵母運搬体は、患者に投与され得るか、又は担体（例えば、樹状細胞）に取り込まれ得る（以下に記載されている）。本明細書において使用されるときに、ペプチドは、約３０から５０アミノ酸と同等かそれ未満のアミノ酸配列を備え、一方においてタンパク質は、約３０から５０アミノ酸以上のアミノ酸配列を備え；タンパク質は多量体であり得る。抗原として有用なタンパク質又はペプチドは、Ｔ細胞エピトープほどの大きさ（すなわち、５アミノ酸以上の長さ）であり得、かつ複数のエピトープ、タンパク質断片、全長のタンパク質、キメラタンパク質又は融合タンパク質を包含する抗原よりも大きいあらゆる好適な大きさであり得る。ペプチド及びタンパク質は、天然に、又は合成的に誘導体化され得；当該修飾としては、糖化、リン酸化、アセチル化、ミリスチル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化及び／又はグリセロホスファチジルイノシトールの付加が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド及びタンパク質は、当業者にとって公知の技術（例えば、拡散、能動輸送、リポソーム融合、エレクトロポレーション、食作用、凍結融解循環及びバスソニケーション）によって、本発明の酵母運搬体に直接に挿入され得る。ペプチド、タンパク質、炭水化物又は他の分子を直接に取り込み得る酵母運搬体としては、産生の後であるが、樹状細胞への取り込みの前に、抗原を取り込み得るスフェロプラスト、ゴースト又は細胞質体だけでなく原型を保った酵母が挙げられる。代替可能に、原型を保った酵母は、抗原を取り込み得、かつそれからスフェロプラスト、ゴースト、細胞質体、又は亜細胞性粒子それらから調整され得る。あらゆる数の抗原、例えば、微生物の取り込みによって、哺乳類がん細胞又はそれらの一部の取り込みによって提供される、少なくとも１、２、３、４又は１００若しくは１０００までのあらゆる整数の抗原が、この実施形態における酵母運搬体に取り込まれ得る。

本発明の他の実施形態において、抗原は、酵母運搬体と物理的に付着される。酵母運搬体に対する抗原の物理的な付着は、当該技術において好適なあらゆる方法（共有的な及び非共有的な会合方法（例えば、抗体又は他の結合相手を用いることによって、酵母運搬体の外表面に対して抗原を化学的に架橋すること、又は酵母運搬体の外表面に対して抗原を生物学的に連結することが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）によって達成され得る。化学的な架橋は、例えばグルタルアルデヒド連結、光親和性標識、カルボジイミドを用いた処理、ジスルフィド結合の架橋を可能にする化学物質、及び当該技術において標準的な他の架橋化学物質を用いた処理を含む方法によって達成され得る。代替可能に、化学物質は、特定の電荷特性を有する抗原とより融合又は結合しやすいように、酵母膜又は細胞壁の組成物の電荷を変える酵母運搬体と接触され得る。また、標的因子（例えば、抗体、結合ペプチド、可溶性受容体、及び他のリガンド）は、融合タンパク質として抗原に取り込まれ得るか、又はそうでばければ、酵母運搬体に対する抗原の結合のために、抗原と会合され得る。

さらに他の実施形態において、酵母運搬体及び抗原は、より受動的な、非特異的な又は非共有結合的な機序によって、例えば、緩衝液又は他の好適な調合物（例えば、混和物）において酵母運搬体及び抗原を穏やかに混合することによって、互いに会合される。

１つの実施形態において、酵母運搬体及び抗原は、両方ともが担体（例えば、樹状細胞又はマクロファージ）の細胞内に取り込まれて、本発明の治療組成物又はワクチンを形成する。代替可能に、本発明の抗原（例えば、本発明のインフルエンザ融合タンパク質）は、酵母運搬体の非存在下において樹状細胞に取り込まれ得る。

両方の構成要素の取り込みが達成され得る種々の形態について、以下に詳細に論じられている。本明細書において使用されるときに、用語「取り込んだ」及びこれらの派生物は、構成要素（例えば、酵母運搬体及び／又は抗原）の細胞（例えば、樹状細胞）に対する挿入、導入又は侵入を指す。構成要素を細胞内に取り込むことは、細胞の細胞内区画に対する（例えば、細胞質膜を介して、かつ最低でも細胞質、ファゴソーム、リソソーム、又は細胞のある細胞内空間への）構成要素の挿入又は導入を指す。細胞に構成要素を取り込むことは、構成要素が強制的に細胞に入れる（例えば、エレクトロポレーション）か、又は構成要素がある過程（例えば、食作用）によって細胞に入りやすい環境に（細胞と接触して、又は細胞の近くに）置かれる、あらゆる技術を参照する。取り込み技術としては、拡散、能動輸送、リポソーム融合、エレクトロポレーション、食作用、及びバスソニケーションが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、樹状細胞による酵母運搬体及び／又は抗原の取り込みに関する受動的な機序が使用され、当該受動的な機序としては、樹状細胞による酵母運搬体及び／又は抗原の食作用が挙げられる。

１つの実施形態において、原型を保った酵母は（異種抗原の発現の有無に関係ない）、すりつぶされ得るか、又は酵母細胞壁調製物、酵母膜粒子若しくは酵母断片（すなわち、原型を保っていない）を産生するように処理され得、かつある実施形態において、酵母断片は、免疫反応を増強するための抗原（例えば、ＤＮＡワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、殺した病原体又は不活化した病原体）を含む他の組成物とともに提供され得るか、又は投与され得る。例えば、酵素的処理、化学的処理又は物理的力（例えば、機械的なせん断又は超音波処理）は、酵母を、補助剤として使用される部分にまで壊すために使用され得る。

また、本発明の１つの実施形態において、組成物又はワクチンは、生物学的反応修飾因子化合物、又は（例えば、当該修飾因子をコードする核酸分子を有する酵母運搬体のトランスフェクションによって）当該修飾因子を産生する能力を含み得るが、当該修飾因子は、本発明に係る強い免疫反応を達成するために必ずしも必要ではない。例えば、酵母運搬体は、少なくとも１つの抗原と少なくとも１つの生物学的反応修飾因子化合物とを用いてトランスフェクトされるか、若しくは少なくとも１つの抗原と少なくとも１つの生物学的反応修飾因子化合物とを取り込むか、又は本発明のワクチン若しくは組成物は、少なくとも１つの生物学的反応修飾因子と組み合わせて投与され得る。生物学的反応修飾因子は、免疫修飾化合物と呼ばれ得る免疫反応を修飾可能な化合物を含む。ある種の生物学的修飾因子は、予防的な免疫反応を刺激可能であるが、他の修飾因子は、体液性免疫反応を抑制可能である。ある種の生物学的免疫修飾因子は、細胞性免疫反応を優先的に増強するが、他の修飾因子は、体液性免疫反応を優先的に増強する（すなわち、体液性免疫と比べて細胞性免疫の増強された水準である免疫反応を刺激可能であり、又は逆もまた同様である）。体液性免疫反応と細胞性免疫反応とを識別するだけでなく、免疫反応の刺激又は抑制を測定するための当業者に公知の多くの技術がある。

好適な生物学的修飾因子としては、サイトカイン、ホルモン、脂質の誘導体、小分子薬物及び他の成長修飾因子（例えば、これらに限定されないが、インターロイキン ２（ＩＬ−２）、インターロイキン ４（ＩＬ−４）、インターロイキン １０（ＩＬ−１０）、インターロイキン １２（ＩＬ−１２）、インタフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）、インシュリン様成長因子 Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）ステロイド、プロスタグランジン及びロイコトリエン）が挙げられる。酵母運搬体がＩＬ−２、ＩＬ−１２及び／又はＩＦＮ−ガンマを発現（例えば、産生）し、かつおそらく分泌する能力は、細胞性免疫を優先的に増強するが、酵母運搬体がＩＬ−４、ＩＬ−５及び／又はＩＬ−１０を発現（例えば、産生）し、かつおそらく分泌する能力は、体液性免疫を優先的に増強する。好適な他の生物学的反応修飾因子としては、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、アネルギー性のＴ細胞放出するため）；Ｔ細胞同時刺激因子（例えば、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０）；アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（例えば、キャンパス（ＣａｍＰａｔｈ）（登録商標））、デニロイキン ジフチトックス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）（例えば、オンタック（ＯＮＴＡＫ）（登録商標））、抗ＣＤ−４、抗ＣＤ−２５、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ２又はＦＯＸＰ３を遮断する因子（例えば、ＣＤ４陽性／ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の活性化／殺害を阻害するため）；Ｆｌｔ３リガンド、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（アルダラ（Ａｌｄａｒａ）（商標））、ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）（ロイキン（Ｌｅｕｋｉｎｅ）（登録商標））、トール様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＴＬＲ）−７ アゴニスト、又はＴＬＲ−９ アゴニスト（例えば、樹状細胞、マクロファージ及び他の専門の抗原提示細胞の、数を増やすか、又は活性化状態を増強する因子）が挙げられるが、これらに限定されない。当該生物学的反応修飾因子は、当該技術において公知であり、かつ公然に利用可能である。

本発明の組成物及び治療ワクチンは、特定の疾患若しくは悪い健康状態（病原体による感染が挙げられる）から対象を保護するために有用なあらゆる他の化合物、又は当該感染のあらゆる症状を処置若しくは寛解するあらゆる化合物をさらに含み得る。

本明細書において使用されるときに、薬学的に受容可能な担体は、本発明の酵母ワクチンを、適切にインビボ又はエキソビボに送達するために好適なあらゆる物質又は運搬体を指す。当該担体としては、補助剤、賦形剤、又は送達運搬体若しくは担体のあらゆる他の種類が挙げられる。

本発明によれば、補助剤は、典型的に、特定の抗原に対する動物の免疫反応を一般に増強する物質である。好適な補助剤としては、フロインドのアジュバント；他の細胞壁組成物；アルミニウムに基づく塩；カルシウムに基づく塩；シリカ；ポリヌクレオチド；変性毒素；血清タンパク質；ウイルス被覆タンパク質；他の細菌由来調整物；ガンマインターフェロン；ブロック共重合体補助剤（例えば、ハンターのタイターマックス補助剤（ＣｙｔＲｘ（商標）、Ｉｎｃ． Ｎｏｒｃｒｏｓｓ， ＧＡ））；リビ（Ｒｉｂｉ）補助剤（Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴから入手可能である）；ならびにサポニン及びそれらの誘導体（例えば、クイル（Ｑｕｉｌ） Ａ（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ Ａ／Ｓ, Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能である）が挙げられるが、これらに限定されない。補助剤は、本発明の酵母運搬体に要求されないが、それらの利用は、除外されない。

担体は、典型的に、処理された動物における治療組成物の半減期を増強する化合物である。好適な担体としては、多量体化徐放性調合物、生物分解性植込錠、リポソーム、油、エステル、及びグリコールが挙げられるが、これらに限定されない。

また、本発明の組成物及びワクチンは、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。本明細書において使用されるときに、薬学的に受容可能な賦形剤は、本発明の方法に有用な組成物を、適切にインビボ又はエキソビボに送達するために好適なあらゆる物質を指す。好ましい薬学的に受容可能な賦形剤は、身体における標的細胞、標的組織又は標的部位に組成物が到達したときに、化合物が標的部位における免疫反応を誘引可能である（ここで、標的部位が全身であり得ることに注意されたい）形態に、組成物（例えば、酵母運搬体又は酵母運搬体を含む樹状細胞）を維持可能である。本発明の好ましい賦形剤としては、ワクチンを輸送するが、特にある部位に対してワクチンを標的化しない賦形剤又は調合物（また、本明細書において非標的化担体と呼ぶ）が挙げられる。薬学的に受容可能な賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス液、他の水性の生理学的平衡溶液、油、エステル及びグリコールが挙げられるが、これらに限定されない。水性担体は、例えば、化学的安定性及び等張性を増強することによって、受給者の生理学的条件に近づけるために要求される、好適な補助物質を含むことができる。また、補助物質は、防腐剤を含み得る。安定化剤（例えば、トレハロース、グリシン、ソルビトール、乳糖又はグルタミン酸１ナトリウム（ＭＳＧ））が、加えられて、種々の条件（例えば、温度の変動又は凍結融解過程）に対してワクチン調合物を安定化し得る。また、組成物は、懸濁液（例えば、無菌水又は生理食塩水（好ましくは緩衝化されている））を含み得る。

酵母運搬体は、本発明の組成物（当業者に公知の多くの技術を用いて、患者に直接に投与されるか、又はまず担体（例えば、樹状細胞）に取り込まれる調製物が挙げられる）に配合され得る。例えば、酵母運搬体は、１つの好ましい実施形態である凍結乾燥によって乾燥され得る。また、投与若しくは樹状細胞への取り込み、又は抗原を用いた他種類の投与の前に、酵母運搬体は、薬学的に受容可能な賦形剤と混合され得る。例えば、調合物は、好適な希釈剤（例えば、無菌水、生理食塩水、等張化緩衝生理食塩水（例えば、生理学的ｐＨに緩衝化されている）又は他の好適な希釈剤）において再懸濁され得るか、又は希釈され得る。凍結乾燥（凍結乾燥法）は、好ましい選択肢である。また、酵母運搬体を備える調合物は、ケーク（ｃａｋｅ）又は錠剤に酵母を詰め込むこと（例えば、焼成運用又は浸出運用において使用される酵母に対してなされる）によって調製され得る。

〔本発明のキット〕
本発明は、本発明のあらゆる１つ以上のワクチン、及び／又はタルモゲン若しくは本発明の酵母運搬体を備える単独のキットか、本明細書に記載の抗原及び抗原調整物との組み合わせた当該キットを意図する。本発明のキットに包含されるのは、あらゆる種類のワクチンに、及び特に本発明の酵母運搬体に基づくワクチン若しくはワクチン戦略に使用する、細胞内抗原及び細胞外抗原のあらゆる組み合わせである。例えば、本明細書に記載のあらゆる融合タンパク質、又は本明細書に記載されているような細胞内抗原及び細胞外抗原を提供するタンパク質調整物は、キットに提供され得る。抗原は、あらゆる形態（酵母運搬体によって発現された形態に（タルモゲンとして）若しくはそうでなければ酵母運搬体に提供された形態に、ＤＮＡワクチンの形態に、タンパク質調製物として、又は死んだ若しくは不活化した病原体として、が挙げられる）において提供され得る。抗原のあらゆる好適な形態が包含される。また、包含されるのは、複数の抗原又は抗原調製物であり、ここで、抗原のそれぞれは、異なる酵母運搬体によって発現されるか、又はそうでなければ異なる酵母運搬体（例えば、異なる酵母運搬体との複合体）に提供される。例えば、酵母運搬体のそれぞれは、個体又は個体の集団に投与するための抗原の好ましい組み合わせ（例えば、保存された抗原若しくは内部抗原及び／又は可変抗原若しくは外部抗原）、及び好ましいワクチン戦略（例えば、保存された抗原若しくは内部抗原を用いた初回刺激及び可変抗原若しくは外部抗原を用いた追加免疫）を選択できるように、特定の病原体に由来の異なる抗原を発現するか、又はそうでなければ提供することができる。１つの局面において、このキットは、ワクチン戦略に使用される初回刺激又は抗原調製物を、単独に又は当該キットに含まれるタルモゲンと組み合わせて、付加的にさらに含むことができる（本明細書に記載のように、初回刺激／追加免疫戦略などにおいて同時に投与されるか、続けて投与される）。また、キットは、本明細書に記載のように補助剤として使用するための、抗原を発現しないか、又は提供しない酵母運搬体を含み得る。使用のための取扱説明書の一揃えは、本発明のあらゆるキットに含まれ得る。また、酵母運搬体用の培養試薬は、包含され得る。酵母細胞は、培養を始めるために凍結され得るか、又はあらかじめ培養されて抗原を発現し、かつキットの一部として詰め込みのために凍結され得るか、又は凍結乾燥されて提供され得る。

〔本発明の方法〕
本発明の一実施形態は、細胞性免疫反応、体液性免疫反応及び／又はそれらの組み合わせなどの、免疫反応を引き出す方法に関する。本発明の別の実施形態は、病原体の感染（例えば、インフルエンザウイルスの感染）又はそれにより生じる病気などの、病状又は病気から、動物を守る方法（その病状又は病気の予防及び／又は治療も含む）に関する。本方法は、病気若しくは病状にかかっている（病原体の感染も含む）動物、又は病気若しくは病状が発症する危険性のある動物に、本明細書に記載されている本発明のワクチン又は組成物を投与する工程を包含し、それにより、感染の予防又は動物への感染により生じる少なくとも１つの症状の緩和など、病気又は病状を緩和又は予防するものである。本発明の方法は、好ましくは、動物において、少なくとも１つの抗原に対する抗原特異的細胞性免疫反応を、少なくとも、その抗原を含むワクチンを個体に対して最初に投与したときに、引き出す。特定の病原体又は病気に対する免疫反応、及びワクチンを投与される個体の免疫状態を調整するための詳細な方法は、既に上述しており、また本明細書に例示されている。当業者であれば、所望の免疫反応を実現させるために、抗原、抗原の発現形式又は供給方式、及びワクチン組成物の異なる組み合わせを容易に用いることができ、また本明細書に記載のワクチンプロトコールを容易に用いることができるであろう。

上記実施形態において、ワクチン又は組成物は、（ａ）第１酵母運搬体、及び（ｂ）本明細書に記載の１以上の何れかの抗原（酵母運搬体が発現する抗原、酵母運搬体が輸送する抗原、酵母運搬体と複合体を形成している抗原、酵母運搬体に結合している抗原、酵母運搬体が分泌する抗原、及び／又は酵母運搬体と混合されている抗原）である。ワクチンは、上述した抗原とは異なる抗原を発現、輸送、若しくは分泌している、又は上述した抗原とは異なる抗原と混合され、結合し若しくは複合体を形成しているさらなる酵母運搬体を含むものであってもよい。本発明の酵母運搬体が発現、輸送、分泌し、又は本発明の酵母運搬体と混合され、結合し若しくは複合体を形成している抗原の好ましい組み合わせ、及び、組み合わされる又は連続して投与される酵母運搬体の好ましい組み合わせは、上記に詳細に記載されている。

一実施形態において、ワクチンは、酵母が細胞内に発現又は供給する少なくとも１つの抗原である。一実施形態において、ワクチンは、酵母が細胞内に発現又は供給する少なくとも１つの抗原、及び酵母が細胞外に発現又は供給する少なくとも１つの抗原である。この実施形態の一態様において、細胞内及び細胞外の抗原は同一の抗原であり、別の態様においては、それらは異なる抗原である。一実施形態において、酵母が細胞内に発現又は供給する抗原は、保存されている抗原又は病原体が内部に発現している抗原の少なくとも１つの抗原である。一実施形態において、酵母が細胞外に発現又は供給する抗原は、変化しやすい抗原又は病原体が外部に（表面上に）発現している抗原の少なくとも１つの抗原である。別の実施形態において、酵母は、上記変化しやすい抗原又は外部抗原も、細胞内に発現し又は供給する。

本発明の一実施形態において、ワクチンは、酵母が細胞内に発現又は供給する少なくとも１つの抗原、及び酵母が細胞外に発現又は供給する少なくとも１つの抗原である。また、ワクチンは、抗原に対する免疫システムを誘導する（prime）ために用いられる。誘導による（by priming）とは、そのワクチンがある個体に対するワクチンの最初の投与であることが意図されており、抗原又は抗原混合物を用いての免疫付与がなされていない個体のような場合が意図されている。したがって、その後にその抗原に遭遇したときに（例えば、ワクチンを追加免疫したとき、又は例えば病原体の感染の結果として、天然抗原に遭遇したときに）、より迅速にかつ効率よく応答するよう、免疫システムが「誘導」される。

一実施形態において、ワクチンは、酵母が細胞内に発現若しくは供給する少なくとも１つの抗原、酵母が細胞外に発現若しくは供給する少なくとも一つの抗原、又は酵母が細胞内に発現若しくは供給する抗原及び酵母が細胞外に発現若しくは供給する抗原の両方である。また、ワクチンは、追加免疫ワクチンとして（すなわち、１又は複数の抗原による第一免疫の最初の誘導免疫の後に）投与される。

一実施形態において、抗原が高度に保存されており、変異がなさそうな場合には、単一の抗原の発現であることが望ましい。別の実施形態において、単一の抗原を標的として実現し得るよりも広範囲の交差防御応答を得るためには、複数の抗原を発現及び供給することが望ましい。このような交差防御応答は、共通（universal）ワクチンの創出に有用であり、広範な範囲の防御免疫反応を提供するために、上述したような抗体産生ワクチンと組み合わせてもよい。防御のメカニズムは抗体産生ワクチンにより引き出されるメカニズムと異なるため、共通抗原のターゲティングを投与量倹約（dose-sparing）の投薬計画に利用し得る。

別の実施形態において、追加免疫ワクチンは、異なるタイプのワクチン（例えば、非酵母ベースワクチン、例えば、タンパク質サブユニット、ＤＮＡ、死／不活化病原体）又は異なるタイプの酵母運搬体を用いている酵母ベースワクチンである。例えば、酵母膜粒子若しくは細胞壁粒子、又はタンパク質、ＤＮＡ若しくは不活化／死病原体ワクチンと共にアジュバントとして用いられる酵母である。さらにとりわけ、本発明の一実施形態では、本明細書に記載されている本発明のワクチン又は組成物は、１以上の他のワクチン又は免疫療法組成物（従来のあらゆる非酵母ベースワクチン又は組成物など）の投与を含むプロトコールによって投与できる。例えば、このような他のワクチン又は免疫療法組成物としては、例えばＤＮＡワクチン、死若しくは不活化病原体ワクチン又はタンパク質サブユニットワクチン（例えば、精製抗原調製物）などの、抗原含有、抗原コード又は抗原発現組成物が挙げられる。本発明の酵母ベースワクチンは、少なくとも強力な細胞性免疫反応である抗原特異的免疫反応を誘導するために好んで用いられる。また一実施形態では、細胞性免疫反応及び体体液性免疫反応両方の抗原特異的免疫反応を誘導するために好んで用いられる。また非酵母ベースワクチン又は別の形態の酵母ベースワクチンは、免疫反応（細胞性及び／又は液性）を高める（boost）ために好んで用いられる。あるいは、以前に非酵母ベースワクチンにより投与されている１又は複数の抗原に対する個体の免疫反応を高めるために、本発明の酵母ベースワクチンを投与するものであってもよい。

一態様において、異種抗原を発現しない又は別の方法で含んでいない若しくは供給しない酵母は、興味を引くもう１つの（複数の）抗原と併せてアジュバントとして用いることができる。一実施形態において、異種抗原を発現しない又は別の方法で含んでいない若しくは供給しない酵母は、ＤＮＡワクチンによる免疫反応を亢進させるために、非酵母ベースワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン）と同時に用いられる。一代替形態において、異種抗原を（表面上に、又は内部に、又はその何れにも）発現又は供給する酵母は、免疫反応を亢進させるために他の型のワクチンと併せて用いられる。別の代替形態において、異種抗原を発現しない又は別の方法で含んでいない若しくは供給しない酵母は、個体に単独で投与される（すなわち、外因性抗原は投与されない）。本発明のこの態様では、個体は既に、抗原非保有酵母運搬体の投与に対して免疫反応を引き出すのに十分な量の抗原を保有している。例えば、最近病原体に感染した個体、細胞内タンパクに変異が入った個体、又は別の方法で免疫システムに耐性がない抗原若しくは耐性を破壊し得る抗原を発現若しくは保有している個体が挙げられる。

防御免疫反応を引き出すためには、酵母運搬体における異種抗原を、非酵母ベースワクチンに使用される抗原と同一にする必要はない。抗原の選択は、２つの抗原が配列類似性を共有するように、共通のエピトープを保持するように、又は標的病原体において異なる抗原であるように、選択すればよい。一態様において、抗原は、補助的又は相補的な免疫反応を引き出すための、酵母ベースワクチン用及び非酵母ベースワクチン用に選択される。このことは、酵母運搬体の異種抗原に対する免疫反応が、非酵母ベースワクチンにおける抗原に対する免疫反応に拮抗する状況である場合には、明らかに好ましい。

本発明の治療用組成物又はワクチンの使用方法では、好ましくは動物の免疫反応を引き出し、それにより、その動物を、病気若しくは病状（感染を含む）から、又はその病気若しくは病状（感染を含む）による症状から守る。本明細書において用いられる場合、語句「病気から守る」とは、病気の症状を緩和する、病気の発病を低減させる、及び／又は病気の重症度を低減させることをいう。動物を守ることには、本発明の組成物を動物に投与した場合の、本発明の組成物における、病気の発症を防ぐ能力及び／又は病気の症状、兆候若しくは原因を治癒する若しくは和らげる能力を参照できる。そのようなものとして、動物を病気から守ることには、病気の発病を予防すること（予防治療又は予防ワクチン）及び病気を患っている動物若しくは病気の初期症状が現れている動物を治療すること（治療上の処置又は治療ワクチン）が含まれる。特に、場合によっては過剰な又は有害な免疫反応を追加的に抑制（例えば、低減、阻害又は阻止）し得る有益な免疫反応又は防御免疫反応の誘導により、免疫反応を動物に引き出すことによって、動物を病気から守ることができる。用語「病気」は、動物の正常な健康状態からのあらゆる逸脱を指し、病気の症状が現れている状態と同様に、逸脱（例えば、感染）はすでに生じているものの症状がまだ現れていない状態も含むものである。

一実施形態において、本発明の任意のワクチンは、インフルエンザウイルスなどの病原体に感染している個体又は個体群に投与される。別の実施形態において、本発明のワクチンの任意のものが、上記病原体に感染する危険性のある個体又は個体群に投与される。上記個体らは、例えば通常の個体群又は全個体群よりもインフルエンザの感染の危険性が高いことが確認されている集団であり得る。上記個体らはまた、その集団の地理的な居場所から予測される病原体株（例えば、ウイルス菌株）の故に、本発明の特定のワクチンのために選択された個体群であり得る。このような集団は、あらゆる適したパラメータによって定義することが可能である。別の実施形態では、既に知られている若しくは予測される感染状況又は特定の病原体に対する感染のしやすさに関係なく、本発明のワクチンの任意のものが、あらゆる個体又はあらゆる個体群に投与される。

より具体的には、本発明の方法により本明細書に記載のワクチンを動物に投与したときに、このワクチンは、好ましくは、病原体の感染の軽減（例えば、感染による少なくとも１つの症状又は臨床症状の減少）、感染の排除又は感染を排除するときの時間の減少、感染及び／又は感染に関連した症状の予防、並びに感染に対するエフェクター細胞免疫及び液性免疫の刺激であり得る結果を生じさせる。さらには、ワクチンは、好ましくは、病原体の全ての感染を防止する又は減少させる免疫システムを誘導し、この病原体は、病原体の全ての生活環形態、菌株又は変異株を含み、個体の血液の循環内に遊離しているか又は個体の細胞内若しくは組織内に遊離しているかを問わない。ワクチンはまた、好ましくは、病原体に対しての免疫が長続きする免疫、又は少なくとも共通免疫若しくは交差防御免疫も付与し、それにより、新しい菌株又は変異株のさらなる感染をより容易に予防及び／又は排除する。

本発明は、本発明の組成物又はワクチンの動物への送達を含む。投与工程は、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおいて行い得る。ｅｘ ｖｉｖｏ投与は、調節工程の一部を患者の体外において行うことを指す。例えば、患者から取り除いた細胞（樹状細胞）集団に、酵母運搬体及び抗原が細胞内に取り込まれる条件のもと本発明の組成物を投与し、患者に細胞を戻すことが挙げられる。本発明の治療用組成物は、あらゆる適した投与様式により、患者に戻すことができ、又は患者に投与することができる。

キャリアと組み合わせての又は単独での、本発明に係るワクチン又は組成物の投与は、通常は全身性投与又は粘膜投与である。好ましい投与経路は、当業者にとって明白であろう。好ましい投与方法としては、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、結節内（intranodal）投与、冠動脈内投与、動脈内投与（例えば、頚動脈への投与）、皮下投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、心室内投与、吸入（例えば、エアロゾル）、頭蓋内、髄腔内、眼内、経耳、鼻腔内、経口、経肺投与、カテーテル注入、及び組織への直接注射が挙げられるが、これらに限定されない。

特に好ましい投与経路は、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、結節内、筋肉内、経皮、吸入、鼻腔内、経口、眼内、関節内、頭蓋内及び髄腔内である。非経口送達としては、皮内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、肺内、静脈内、皮下、心房カテーテル及び静脈カテーテルが挙げられる。経耳送達としては点耳が挙げられ、鼻腔内送達としては点鼻又は鼻腔内注射が挙げられ、また眼内送達としては点眼が挙げられる。エアロゾル（吸入）送達は、この分野において標準的な方法（例えば、本明細書にそのまま参考として援用される、Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 189:11277-11281を参照）を用いて行うことも可能である。例えば、一実施形態において、本発明の組成物又はワクチンは、適した吸入器具又は噴霧器を用いての噴霧送達に適した組成物に調剤し得る。経口送達では、口から摂取し得る固体及び液体が挙げられる。経口送達は粘膜免疫の発現に有用であり、また、酵母運搬体を含んで構成される組成物を、例えば錠剤若しくはカプセルとして、同様に食品及び飲料製造物内に調剤して経口送達用に容易に調製できることから有用である。

粘膜免疫を調節する他の投与経路は、ウイルス感染及び他の病原体による感染の治療においてとりわけ有用である。このような経路としては、気管支、皮内、筋肉内、鼻腔内、他の吸入、直腸、皮下、局所性、経皮、膣及び尿道口経路が挙げられる。

上記に特定した方法の任意のものの一実施形態では、ワクチンは呼吸器管に投与される。別の実施形態では、ワクチンは投与の非経口経路により投与される。さらに別の実施形態では、ワクチンは樹状細胞又はマクロファージをさらに含んでいる。ここで、融合タンパク質を発現している単独又は複数の酵母運搬体（上述の好ましい組み合わせを参照）がｅｘ ｖｉｖｏで樹状細胞又はマクロファージに送達され、抗原を発現している酵母運搬体を含む樹状細胞又はマクロファージが動物に投与される。この実施形態の一態様においては、樹状細胞又は酵母運搬体に遊離抗原がさらに取り込まれている。一態様において、酵母ベースワクチンは、一個体において別の酵母ベースワクチン又は非酵母ベースワクチンの投与部位と同じ部位に投与される。別の態様において、酵母ベースワクチンは、一個体において別の酵母ベースワクチン又は非酵母ベースワクチンの投与部位と異なる部位に投与される。一態様において、ワクチンは治療ワクチンとして投与される。別の態様において、ワクチンは予防ワクチンとして投与される。

本発明によれば、効果的な投与プロトコール（すなわち、効果的な手段によりワクチン又は治療用組成物を投与する方法）は、好ましくは動物が病気から守られるように、病気若しくは病状を患っている動物又は病気若しくは病状にかかる危険性のある動物に免疫反応を結果として引き出す、適した投与量パラメータ及び投与様式を含む。効果的な投与量パラメータは、特定の病気に対して、この分野において標準的な方法により決定できる。このような方法としては、例えば、生存率、副作用（すなわち、毒性）及び病気の進行又は退行の判定が挙げられる。

本発明によれば、適した単回投与量は、適した期間にわたって１回以上投与することによって、動物に抗原特異的免疫反応を引き出すことができる量である。投与量は治療すべき病気又は病状によって異なり得る。例えば、一実施形態において、本発明の酵母運搬体の単回投与量は、組成物が投与される生物の体重１ｋｇあたり約１×１０^５から約５×１０^７酵母細胞相当物である。好ましい実施形態では、投与量あたりの酵母細胞は、生物の体重に合わせては調整されていない。この実施形態において、本発明の酵母運搬体の単回投与量は、投与量あたり約１×１０^４から約１×１０^９酵母細胞である。単回投与に用いられる酵母運搬体の量は、約０．０００１酵母ユニット（ＹＵ）から約１０，０００ＹＵの間であり得る（１ＹＵ＝１０^７酵母）。一実施形態において、用いられる酵母運搬体の量は、約０．００１ＹＵから約１０００ＹＵである。他の実施形態において、用いられる酵母運搬体の量は、約０．０１ＹＵから約１００ＹＵである。他の実施形態において、用いられる酵母運搬体の量は、約０．１ＹＵから約１０ＹＵである。一実施形態において、本発明の酵母運搬体の単回投与量は、投与量あたり（すなわち、生物あたり）約０．１ＹＵ（１×１０^６細胞）から約１００ＹＵ（１×１０^９細胞）であり、０．１×１０^６細胞単位で（すなわち、１．１×１０^６，１．２×１０^６，１．３×１０^６...）、その間のあらゆる投与量を含んでいる。投与量のこの範囲は、マウス、サル、ヒトなど、あらゆる大きさのあらゆる生物に効果的に使用し得るものである。

酵母運搬体及び抗原を樹状細胞に取り込ませることによってワクチンを投与する場合には、本発明のワクチンの好ましい単回投与量は、投与ごとの生物あたり約０．５×１０^６から約４０×１０^６樹状細胞である。単回投与量は、好ましくは、個体あたり約１×１０^６から約２０×１０^６樹状細胞であり、より好ましくは、個体あたり約１×１０^６から約１０×１０^６樹状細胞である。

治療用組成物の「追加免疫（booster）」又は「ブースト（boost）」は、抗原に対する免疫反応が弱まったとき、又は免疫反応の供給若しくは特定の単一若しくは複数の抗原に対する記憶応答の誘導が必要なときに、好ましくは投与される。追加免疫は、はじめの投与から約２週間から数年経過後に投与可能である。一実施形態において、投与スケジュールは、生物の体重１ｋｇあたり、組成物の約１×１０^５から約５×１０^７酵母細胞相当物を、約１月から約６月の期間にわたって、約１回から約４回投与するスケジュールである。

本発明の一実施形態において、第１ワクチンは個体又は個体群に投与される。この第１ワクチンは、詳細に上述している単一又は複数の酵母運搬体の投与量及び１以上の抗原を含んで構成される。一態様において、この第１ワクチンは、好ましくは、単一又は複数の酵母運搬体及び１以上の細胞内抗原を、単独で又は１以上の細胞外抗原と組み合わせて含んで構成される。インフルエンザの場合には、ワクチンは、好ましくは、少なくとも１以上の内部インフルエンザ抗原を含んで構成されている。このワクチンは、抗原に対する細胞性免疫の維持又は誘発が必要なとき、また抗原が外因性である場合に抗原に対する液性免疫の維持又は誘発が必要なときに、個体ごとにあらゆる適した間隔で定期的に投与され得る。インフルエンザなどの病原体の場合には、ワクチンは、好ましくは、少なくとも１以上のインフルエンザウイルス株に対する細胞性免疫を維持するか又は引き出す。例えば、ワクチンは、追加免疫、１年ごと若しくは半年ごと、数年ごと、又はその他必要により、投与され得る。上述のように、本発明のこの実施形態は、共通の、交差防御ワクチンとして用いられる。また、従来のワクチンよりも、様々なタイプの病原体感染に対して、より長続きする免疫を付与し得る。

さらなる実施形態では、第２ワクチンは、単一又は複数の酵母運搬体の投与量及び１以上の抗原（上記の第１ワクチンに含まれている抗原と同じ抗原又は異なる抗原）を含んで構成され、好ましくは、単一又は複数の酵母運搬体の投与量及び１以上の細胞外抗原単独若しくは１以上の細胞内抗原と組み合わせた細胞外抗原を含んで構成される。第２ワクチンは上記の第１ワクチンを接種した同じ個体又は個体群に投与される。この第２ワクチンは、第１ワクチンと一緒に（例えば、異なる酵母運搬体の組み合わせを含んで構成される単一のワクチンとして）、又は第１ワクチンとは別に投与され得る。後者の計画では、様々なワクチンにより引き出される免疫反応をうまく操るために、第２ワクチンは、第１ワクチンと同じときに第１ワクチンに続けて（例えば、投与の間隔を、数秒、数分又は数時間あけて）、又は第１ワクチンとは異なる日程で投与され得る。例えば、第１ワクチンは、１年に１回又はより長期の単位ごとに、可能であれば、共通の、交差防御細胞性免疫反応を引き出すことを目的として、また適用可能であればワクチン設計に基づいて体体液性免疫反応を引き出すことを目的として、投与され得る。第２ワクチンもまた、そのときに個体群の間で最も流行している病原体株に対して適時にかなって個体群を免疫するために、１年に１回又は必要に応じて（すなわち、１回限りの方法で、１年に２回以上、又は免疫計画に関連させて）投与され得、又は病原体による感染の一時的な流行若しくは全地域にわたる流行を制御若しくは予防するために、必要に応じて投与され得る。インフルエンザワクチンに適用しているこの計画は、本明細書においては特定のものについて詳細に記述されているが、本発明はインフルエンザワクチンに限定されるものではない。上述の通り、本発明のワクチン計画は、交差防御免疫及び病原体株／変異株特異的免疫の両方をもたらすよう設計されている。これらの免疫は、細胞性免疫及び液性免疫の両方を含み、これまでに記載されてきているものよりもより柔軟で有効な、病原体に対する免疫付与をもたらすと考えられている。この計画は、例えば腫瘍細胞が発現している抗原などの細胞抗原に合うように、容易に改編される。

本発明の方法では、ワクチン及び治療用組成物を、動物（対象、個体、患者）に投与することができる。このような動物としては、あらゆる脊椎動物であり、とりわけ脊椎動物の中の、哺乳類のあらゆる動物であり、特にこれらに限定されないが、霊長類、げっ歯類、家畜及び家庭内のペットである。家畜とは、食用の哺乳動物又は有用産物を産出する哺乳動物（例えば、ウール生産のためのヒツジ）である。守るべき動物として好ましいものは、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ及びブタであり、特に好ましくはヒトである。

〔第１及び第２医療利用〕
本発明はまた、細胞外及び／又は細胞内抗原（ターモゲン（Ｔａｒｍｏｇｅｎ））を発現又は供給する酵母運搬体；細胞外及び細胞内抗原、融合タンパク質、アジュバントとしての酵母運搬体及び／又は本明細書に記載の抗原調製物を組み合わせたもの；並びに／又は、あらゆる利用のための、とりわけ、病原体による感染、癌、自己免疫疾患などの病気又は病状の治療又は予防のための製剤又は薬剤の調製のためにそれらを組み合わせたもの、のあらゆる利用を意図する。製剤又は薬剤は、投与経路の組み合わせ（例えば、鼻腔内及び／又は非経口）を含む、あらゆる投与形態用に調剤し得る。製剤又は薬剤は、本明細書に記載の任意の投与プロトコール用に調製し得る。一態様において、製剤又は薬剤は、抗原特異的免疫反応（細胞性及び／又は液性）を引き出すため、インフルエンザの感染から動物を守るため、病気又は病状を治療又は予防するため、インフルエンザウイルスなどの病原体に感染する危険性のある個体群を免疫するため、インフルエンザウイルスなどの病原体に感染している個体群を治療するため、又はインフルエンザウイルスなどの病原体感染から動物を守るためのものである。

〔インフルエンザ組成物及びワクチン〕
あらゆる抗原に向けられている、上述されている本発明の様々な態様は、インフルエンザウイルス及び組成物並びにインフルエンザウイルスに対して免疫反応を引き出す方法への本発明の概念及び実施形態の適用に関する詳細な議論により、説明及び例証されるであろう。本発明は、抗原又は抗原源としてのインフルエンザウイルスに限定されるものではない。

本発明者らは、酵母運搬体及び１以上のインフルエンザウイルス融合タンパク質を含んで構成される、酵母ベースワクチン及びこれの使用方法を開発した。１以上のインフルエンザ抗原を発現する又は他の方法により当該抗原と複合体を形成する上記酵母運搬体は、単独で、又は１以上のさらなるインフルエンザウイルス融合タンパク質を発現する又は他の方法により当該タンパク質と複合体を形成する１以上のさらなる酵母運搬体と組み合わせて、使用することができる。あるいはこの酵母運搬体は、任意の非酵母ベースワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、又は死／不活化インフルエンザウイルス）など、他の形態のインフルエンザ抗原と組み合わせて使用することができる。

一実施形態において、ワクチンは、マトリックスタンパク質（Ｍ１）、イオンチャネル（Ｍ２）抗原、ヌクレオキャプシド（ＮＰ）抗原、ポリメラーゼＰＢ１（ＰＢ１）抗原、ポリメラーゼ（ＰＢ２）抗原及びポリメラーゼＰＡ（ＰＡ）抗原から選択される１以上の内部インフルエンザ抗原を発現又は供給する酵母運搬体である。別の実施形態において、ワクチンは、血球凝集素（ＨＡ）抗原（任意の１以上のサブタイプ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原（任意の１以上のサブタイプ）から選択される１以上の外部インフルエンザ抗原を発現する酵母運搬体である。内部抗原は、通常、酵母が細胞内に発現する。外部インフルエンザ抗原は、通常、酵母が細胞表面（細胞外抗原）に発現又は供給し、また酵母が細胞内に発現する。いくつかの実施形態においては、抗原の何れの供給方法（細胞内及び細胞外）も好ましい。特に好ましい実施形態では、外部インフルエンザ抗原は、所定の期間（例えば、１年間）、ある動物種（例えば、ヒト）の間で最も著しく広まっているウイルス型又はウイルス集団を提示するために選択される。又は、見込まれる、疑われる又は予期される特定の型のインフルエンザの発生、例えば、インフルエンザの一時的な流行又は全地域的な流行、に対応するために選択される。

さらなる、またとりわけ好ましい本発明の実施形態は、外部及び内部インフルエンザ抗原両方の使用の組み合わせをうまく利用するワクチンに関する。この実施形態において、ワクチンは、マトリックスタンパク質（Ｍ１）、イオンチャネル（Ｍ２）、ヌクレオキャプシド（ＮＰ）抗原、ポリメラーゼＰＢ１（ＰＢ１）抗原、ポリメラーゼ（ＰＢ２）抗原及びポリメラーゼＰＡ（ＰＡ）抗原から選択される少なくとも１以上の内部インフルエンザ抗原を発現又は供給する酵母運搬体である。これらのタンパク質の組み合わせの使用もまた、本発明に包含されるものである。内部インフルエンザ抗原は好ましくは、酵母が細胞内に発現するが、抗原は細胞外に供給されてもよい。ワクチンはまた、酵母運搬体による、血球凝集素（ＨＡ）抗原（任意の１以上のサブタイプ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原（任意の１以上のサブタイプ）から選択される少なくとも１つの外部インフルエンザ抗原の発現又は供給である。外部インフルエンザ抗原は、酵母の表面（細胞外）に発現又は供給されるが、酵母が細胞内に発現又は供給してもよい。いくつかの実施形態において、外部インフルエンザ抗原については、何れの発現方法又は抗原供給方法も好ましい。

インフルエンザウイルスの様々な株に由来するタンパク質についての核酸配列及びアミノ酸配列は公知である。例えば、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４株のＨ１Ｎ１の配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいて、アクセッション番号Ｍ３８２７９（本明細書において配列番号２９で示されるヌクレオチド配列であり、配列番号３０の配列をコードしている）、ＮＣ＿００２０１９（本明細書において配列番号３１で示されるヌクレオチド配列であり、配列番号３２の配列をコードしている）として、公開されている。例えば、鳥インフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４株の配列もまた公知である。例えば、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４由来のＨ５Ｎ１をコードするヌクレオチド（例えば、ＮＣＢＩデータベースにおけるアクセッション番号ＡＹ８１８１３５）は、本明細書において配列番号３３として表されており、配列番号３４の配列をコードしている。本明細書に記載されている特定の配列は、これらの株の知られている又は報告されている配列に由来するものであるが、当業者であれば容易に別の株又は同一の株において報告されている別の配列を選びだすことができ、また公開されている配列について述べられている手法と同一の手法を用いて、それを本発明に使用することができることは理解されるであろう。様々な配列ソフトウェアプログラムの任意のものを用いて配列を整列させることが容易にでき、また本明細書に記載のタンパク質と対応する配列を、他の株又は報告されているウイルス配列内において容易に特定できる。さらに、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、様々な株又は公のデータベースにおける配列の報告との間で僅かに異なってもよいことも着目される。このような些細な差異が本発明における免疫反応を引き出す能力に重大な影響を及ぼすということは、予期されていない。本発明は、本明細書に記載されている配列に限定されるものではない。この実施形態では、外部インフルエンザ抗原を発現又は供給する酵母運搬体は、内部インフルエンザ抗原を発現又は供給する酵母運搬体と同じか又は異なる酵母運搬体であり得る。さらに、内部インフルエンザ抗原及び／又は外部インフルエンザ抗原の異なる組み合わせを、異なる酵母運搬体に発現又は供給させることができる。また、所望するワクチン接種に応じて、当該運搬体を、別個に、又は一緒に用いることができる。通常、インフルエンザ抗原が２以上の異なる酵母運搬体によって供給される場合（すなわち、全てのインフルエンザ抗原を１つの酵母運搬体において供給することとは対照的に）、１つのワクチンとして投与（例えば、一度の注射又は調剤の他の形態）するためにこの酵母運搬体らを組み合わせる（混合する）ことが可能であり、又は、異なる酵母運搬体を順次投与することが可能である。順次投与する場合、任意の適した期間をあけることが可能であり、短い時間増加単位（秒単位又は分単位）及び長い時間増加単位（日単位、週単位、月単位またさらには年単位）が可能である。本発明は、これらの実施形態において、少なくとも１つの内部インフルエンザタンパク質及び少なくとも１つの外部インフルエンザタンパク質を含むインフルエンザタンパク質のあらゆる組み合わせを用いることができるということ、また、このようなタンパク質を発現する又は他の方法により当該タンパク質と複合体を形成している酵母運搬体のあらゆる組み合わせ（単一の酵母運搬体も含む）を用いて、これらのタンパク質を供給することができるということを意図している。

本発明のワクチンをどのように設計し、使用するかということについては極めて柔軟性がある。例えば、一個体において細胞性の交差防御免疫を生じさせるために、内部インフルエンザ抗原を供給する酵母運搬体を含んで構成される「共通」ワクチンを、定期的に一個体に投与できる。例えば、次いで、このワクチンを、外部インフルエンザ抗原を供給するさらなる酵母運搬体と、一回限り又は定期的に組み合わせることができる。外部インフルエンザ抗原を供給する酵母運搬体は、毎年、又は着目されるウイルス株及び／又は所定の期間若しくは特定の地理的領域において最も流行しているウイルス株を標的とするために、他のあらゆる好ましい理由のときに（例えば、緊急時、予期される一時的な流行又は全地域的な流行時、その他必要なときに）、循環（rotate）、交代（alternate）、選択できる。本発明の他の実施形態は、本明細書における開示に照らせば明らかであろう。

本発明のさらに別の実施形態では、１以上の内部抗原（単独で、又は１以上の外部抗原と組み合わせて）を発現又は供給する酵母運搬体を、誘導ワクチンとして投与でき、その後に、さらなる酵母ベースワクチンによる追加免疫又は他の内部及び／若しくは外部抗原調製物による追加免疫を行うことが可能である。他の内部及び／又は外部抗原調製物としては、部分的に精製した若しくは精製したインフルエンザタンパク質調製物、インフルエンザタンパク質を発現する酵母運搬体の溶解物、ＤＮＡインフルエンザワクチン、死滅（若しくは不活化）ウイルス、又は酵母運搬体（異種抗原を供給するもの若しくは供給しないもの）と非酵母ベースワクチンとを組み合わせたものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施形態には追加免疫ワクチンを含めているが、本発明の酵母ベースワクチンは免疫反応の誘発に極めて有効であるため、追加免疫ワクチンを必要としなくてもよいだろう。

インフルエンザＭ１，Ｍ２及びＭＰタンパク質は、インフルエンザが発現する内部タンパク質であり、インフルエンザウイルス菌株間で配列が高度に保存されており、免疫療法の優れた標的となっている。本発明のワクチンの投与は、インフルエンザ特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増大させ、結果としてウイルスによる負荷が減少することが期待され、最終的には、インフルエンザに感染した個体におけるウイルスの除去を亢進させる。酵母ベースの構成において外部インフルエンザ抗原（例えば、ＨＡ，Ｍ２ｅ（Ｍ２タンパク質の外部ペプチド）及び／又はＮＡ抗原）を複合させた場合には、ワクチンは、ワクチン接種の基板を提供するためのインフルエンザ特異的細胞性免疫及び液性免疫をさらに増大させる。また、このワクチンは、そのときのワクチンの必要性に合うように調整し得る。基板が提供されるワクチン接種には、効果が長続きする、交差防御ワクチン接種アプローチ（内部抗原を介する）、及び菌株特異的アプローチ（外部抗原を介する）が包含される。さらには、本発明のワクチンは卵ベースではないため、従来のインフルエンザワクチンと比べて、幅広い範囲の受容者に対してこのワクチンを用い得る。このワクチンは、現行のインフルエンザワクチンに比べて、より効率よく、より迅速に生産されることもまた予想される。最終的に、上述の通り、必要に応じてウイルスのサブタイプを標的にしながら共通免疫を確立できる観点から、本発明によりもたらされるワクチン設計における柔軟性が、従来のインフルエンザワクチンから大きく改良された点である。

本発明の一実施形態は、動物をインフルエンザの感染から守るための方法又はインフルエンザの感染により生じる少なくとも１つの症状を緩和する方法に用い得る組成物（ワクチン）に関する。ワクチンは、（ａ）酵母運搬体、及び（ｂ）酵母運搬体が発現又は供給する異種インフルエンザ融合タンパク質を含んで構成される。上述の通り、本発明は、本発明のワクチンにおいて抗原として使用する複数の異なるインフルエンザ融合タンパク質を包含している。これらの融合タンパク質は、酵母運搬体において異種タンパク質の発現が安定化するように、また発現される異種タンパク質の翻訳後修飾が起こらないように設計されており、及び／又はいくつかの実施形態では、酵母運搬体の表面に発現するようにできる。この融合タンパク質は、広範な細胞性免疫反応及びいくつかの実施形態では体体液性免疫反応をもたらし、１以上の異なるインフルエンザ抗原を好ましくは発現又は供給し、及び／又は異なるインフルエンザ抗原を発現又は供給している他の酵母運搬体と組み合わされる。抗原の組み合わせでは、少なくとも１つの内部インフルエンザ抗原及び少なくとも１つの外部インフルエンザ抗原を含んでいることが好ましい。本発明のワクチンを形成させるために、１以上のこれら融合タンパク質を酵母運搬体に詰め込む（例えば、タンパク質として）ことができ、又は、このタンパク質を本明細書に記載の酵母運搬体と組み合わせる若しくは混合させることができるということは本発明の一実施形態ではあるが、最も一般的には、酵母運搬体（例えば、無傷酵母又は酵母スフェロプラストであり、これらは、任意でさらにサイトプラスト、酵母ゴースト、酵母膜抽出物又はこれらの分画に処理し得る）が、組み換えタンパク質としてこれらの融合タンパク質を発現又は供給している。

上述の通り、本発明のワクチン及び組成物に用いる融合タンパク質は、動物のワクチン接種ための少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含む。組成物又はワクチンは、１つの、２つの、いくつかの、複数の又は多数のインフルエンザ抗原を含むことができ、これらには、１以上のインフルエンザ抗原の１以上の免疫原性ドメインが所望の通りに含まれている。例えば、本明細書に述べられているいかなる融合タンパク質も、インフルエンザマトリックスタンパク質（Ｍ１）、インフルエンザイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）、インフルエンザヌクレオキャプシドタンパク質（ＭＰ）、ポリメラーゼＰＢ１（ＰＢ１）抗原、ポリメラーゼ（ＰＢ２）抗原及びポリメラーゼＰＡ（ＰＡ）抗原から選択される１以上の内部インフルエンザタンパク質、及び／又はインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）又はインフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）から選択される１以上の外部インフルエンザタンパク質の少なくとも一部を含み得る。

本発明によれば、「内部インフルエンザタンパク質」は、インフルエンザウイルス（任意の型又は菌株）が発現し、その全て又はほとんどがウイルス粒子の内部に含まれ、ウイルスのコア又はマトリックスタンパク質膜にあるタンパク質をいう。このようなタンパク質は、一般的にはウイルスの型及び菌株間で高度に保存されており、ウイルスによって豊富に生産される。本明細書において「外部インフルエンザタンパク質」は、インフルエンザウイルス（任意の型又は菌株）が発現し、脂質膜を通り抜けて外部に延びており、ほとんどがウイルス粒子の外部に発現しているタンパク質（例えば、ウイルス表面タンパク質）をいう。このようなタンパク質は抗体によって認識されるものであり、それゆえ、ウイルスに対する体体液性免疫反応を引き出すのに有用である。インフルエンザイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）が主にはインフルエンザウイルス内部に含まれている一方で、インフルエンザウイルスの表面に発現している細胞外小ドメイン（Ｍ２ｅとして知られている）を有している点は着目される。したがって、Ｍ２タンパク質は一般的には内部インフルエンザタンパク質としてみられているが、インフルエンザウイルスが発現する場合に、又は少なくともその細胞外ドメインを細胞表面に発現している若しくは提示している細胞が発現している場合に抗体によって認識され得る限りにおいて、本発明の目的のために、外部インフルエンザタンパク質とみることもできる。

本発明の一実施形態において、ワクチンのインフルエンザ抗原部分は、２以上の抗原を含んで構成される融合タンパク質として生産される。一態様において、融合タンパク質は、１以上の抗原の２以上の免疫原性ドメイン又は２以上のエピトープ（例えば、インフルエンザＭ１配列及びインフルエンザＨＡ配列）を含み得る。このようなワクチンは、広範な範囲の患者に対して抗原特異的免疫をもたらす。例えば、本発明に有用な複数ドメイン融合タンパク質は複数のドメインを有しており、各ドメインは特定のタンパク質由来のペプチドからなり、このペプチドは、タンパク質中に存在する変異アミノ酸の一方の側に位置しこの変異アミノ酸を含む少なくとも４アミノ酸残基からなり、この変異は特定の病気又は病状（例えば、特定菌株のインフルエンザ感染）と関連しているものである。

様々なインフルエンザの型、サブタイプ及び菌株に由来するインフルエンザ遺伝子の核酸配列及びアミノ酸配列並びにこれらによってコードされているポリタンパク質は、この技術分野において公知である。したがって、本明細書により提供されている手引き及びインフルエンザ抗原の特定の例示への言及を用いることにより、当業者は、本発明の組成物及びワクチンにおいて、あらゆるインフルエンザ菌株から様々なインフルエンザベースの融合タンパク質を容易に生産し、用いることができる。

本発明において、発明者らは、インフルエンザウイルス感染を予防し又は阻止することに用いられる新規組み換え酵母免疫療法（yeast immunotherapeutics）を創出した。酵母免疫療法のうちの１つでは、誘導プロモータ制御下において融合タンパク質としてインフルエンザマトリックスタンパク質（Ｍ１）が発現する。ヒスチジンタグに対する抗体を用いた酵母ワクチン細胞溶解物のイムノブロット解析では、組み換え酵母がタンパク質を発現していることが示されている。Ｍ１発現酵母ワクチンをＢＡＬＢ／ｃマウスに注射すると、リンパ球の増殖及び細胞毒性活性が示され、強力なＭ１抗原特異的ヘルパー及び細胞傷害性Ｔ細胞免疫反応が誘導される。別の酵母免疫療法では細胞内に血球凝集素抗原（ＨＡ）タンパク質を発現し、また別の酵母免疫療法では細胞外に血球凝集素抗原（ＨＡ）タンパク質を供給する。いくつかの免疫療法では構成的プロモータの制御下において抗原を供給する。本発明に包含される他の酵母ワクチンは以下に詳細に説明されるであろう。

本発明の一態様において、インフルエンザ抗原は、内部インフルエンザタンパク質であるマトリックスタンパク質（Ｍ１）である。本発明の一態様において、インフルエンザ抗原は、原則的に、インフルエンザＭ１タンパク質の２から２５２番目のアミノ酸からなる。Ｍ１はインフルエンザウイルスにおいてマトリックスタンパク質膜を形成するおよそ２７ｋＤのインフルエンザタンパク質である（図１参照）。Ｍ１は構造タンパク質であり、ウイルスのアセンブリ及び細胞質へのリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）の核酸の運び出しに関わっている。Ｍ１はインフルエンザウイルス間で高度に保存されており、また多量に存在するウイルスタンパク質であり、全ウイルスタンパク質のおよそ４７％を占める。あらゆるＭ１タンパク質又はその部分は、本発明に使用されることが意図されており、このようなＭ１タンパク質の任意のもののあらゆる変異体又は変形体もまた同様である。

実施例１は、本発明の典型的なワクチン又はワクチンの成分を生産するための、内部インフルエンザタンパク質であるマトリックスタンパク質（Ｍ１又はＭＰ）の使用について説明するものである（すなわち、本明細書に記載されているように、酵母運搬体が、異なるタンパク質を発現している他の酵母運搬体と組み合わされている限り、又は付加的なインフルエンザタンパク質を発現するようさらに形質転換されている限りにおける成分への言及である）。この実施形態において、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）Ｗ３０３α）は、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４に由来するインフルエンザＭ１融合タンパク質を銅誘導プロモータＣＵＰ１制御下で発現するように人工的に改変されている。融合タンパク質は配列番号４のアミノ酸配列を有する単一のポリペプチドであり、配列番号３に示される核酸配列によりコードされているものである。

本発明の別の態様において、インフルエンザ抗原は外部インフルエンザタンパク質である血球凝集素（ＨＡ）である。本発明の一態様において、インフルエンザ抗原は、原則的にインフルエンザＨＡタンパク質の２から５３０番目のアミノ酸からなり、これはＮ末端のＨＡのＥＲ−ターゲティングシグナル配列を含むものであるが、ＨＡのＣ末端の３６残基は取り除かれている。したがって、Ｃ末端の膜アンカー及び細胞質テール（cytoplasmic tail）は取り除かれている。別の態様において、インフルエンザ抗原は、原則的にインフルエンザＨＡタンパク質の１７から３４２番目のアミノ酸からなり、これはＮ末端にあるＨＡのＥＲ−ターゲティングシグナル配列である１６アミノ酸を除いたものであり、またＣ末端の膜アンカー及び細胞質テールを含んで構成されるＨＡのＣ末端の３６残基を除いたものである。ＨＡは内在性膜タンパク質であり、インフルエンザウイルス粒子の表面に発現している（図１参照）。血球凝集素は、標的細胞表面にあるグリコシル化されたレセプタータンパク質のシアル酸残基を介しての宿主細胞への結合を担っている。また同様に、それに続く、ウイルスがエンドサイトーシスによって取り込まれた後のエンドソーム内でのウイルス膜と宿主膜との融合を担っている。ＨＡは少なくとも４つの主要抗原性部位を含んでいる。これら４つの領域のうちの１つにおける単一のアミノ酸置換により、ウイルスは、免疫の監視から逃れ、毎年世界規模で広がる能力を獲得し得る。人への感染においては３種の相違するＨＡタンパク質が見つかっており、Ｈ１，Ｈ２及びＨ３と称されている。また、鳥インフルエンザウイルスにおいて見つかっているＨ５を含め、動物のインフルエンザウイルスではさらに他の１３種が見つかっている。あらゆるＨＡタンパク質又はその部分は、本発明に使用されることが意図されており、このようなＨＡタンパク質の任意のもののあらゆる変異体又は変形体もまた同様である。一実施形態において、ＨＡタンパク質を発現している本発明の酵母運搬体は１以上のＨＡタンパク質（例えば、Ｈ１，Ｈ２など）を発現しているか、又は異なるＨＡタンパク質を発現している酵母運搬体（例えば、一方の運搬体はＨ１、もう一方の運搬体はＨ２又は他のＨＡタンパク質）とワクチンにおいて組み合わされている。

実施例２は、本発明の他の典型的なワクチン又はワクチンの成分を生産するための、外部インフルエンザタンパク質である血球凝集素（ＨＡ）の使用について説明するものである。この実施形態において、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビジエＷ３０３α）は、融合タンパク質をＴＥＦ２プロモータ制御下で発現するように人工的に改変されている。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４に由来するインフルエンザＨＡ抗原（Ｈ２）を含んで構成される融合タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含んで構成される単一のポリペプチドであり、配列番号５に示される核酸配列によりコードされているものである。

実施例２はまた、本発明の他の典型的なワクチン又はワクチンの成分を生産するための、外部インフルエンザタンパク質である血球凝集素（ＨＡ）、この場合は、鳥インフルエンザ菌株由来のＨＡであるＨ５の使用についても説明するものである。この実施形態において、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビジエＷ３０３α）は、融合タンパク質を発現するように人工的に改変されている。インフルエンザウイルスＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４に由来するインフルエンザＨＡ抗原（Ｈ５）を含んで構成される融合タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列を含んで構成される単一のポリペプチドであり、配列番号１９に示される核酸配列によりコードされているものである。

上述した融合タンパク質の何れも、酵母がＨＡ融合タンパク質を細胞内に発現するように設計されている。簡単に言えば、これらの融合タンパク質は、Ａｇａ２及びＨＡの両方のＮ末端シグナル配列を含んでいる。Ａｇａ２のシグナル配列はＥＲ内に転移するための融合を標的としているが、ＨＡのシグナル配列は移動を停止するためのものとして機能している。このため、融合タンパク質は分泌経路をうまく切り抜けられない。ＨＡ部分が原形質膜の細胞質側に留まっている内在性膜タンパク質となる。

実施例３は、本発明のさらに他の典型的なワクチン又はワクチンの成分を生産するための、外部インフルエンザタンパク質である血球凝集素（ＨＡ）の使用について説明するものである。この実施形態において、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビジエＷ３０３α）は、融合タンパク質をＴＥＦ２プロモータ制御下で発現するように人工的に改変されている。この融合タンパク質は、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４に由来する、ＨＡ１として参照されるＨＡ（Ｈ１）抗原のＮ末端部分が酵母により外部発現されるように設計されている。Ａｇａｌｐも発現している細胞においてこのタンパク質が発現すると、このタンパク質は酵母細胞の外部細胞壁に局在するが、細胞内にもまた含まれる。融合タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含んで構成され、配列番号９に示される核酸配列によりコードされているものである。

本発明の別の態様では、インフルエンザ抗原は外部インフルエンザタンパク質であるノイラミニダーゼ（ＮＡ）であり、別の実施形態においては、ＮＡの免疫原性部分が意図される。ＮＡはインフルエンザウイルス粒子の表面に発現する内在性膜タンパク質である（図１参照）。ノイラミニダーゼは、シアル酸（ノイラミン酸）を消化するものである。殆どの細胞はシアル酸をその表面に有している。シアル酸はウイルスレセプターの一部であるため、ウイルスが細胞に結合すると、シアル酸は内部に吸収される（エンドサイトーシスにより取り込まれる）。感染の後期までに、シアル酸はノイラミニダーゼにより感染細胞表面から取り除かれる。これにより、子ビリオンが細胞から出たときにその拡散が容易になるだろう。ノイラミニダーゼは、呼吸器管における粘液層への侵入にも関与している。人の感染においては２種の相違するＮＡタンパク質が見つかっており、Ｎ１及びＮ２と称されている。動物のインフルエンザウイルスにおいては、他に１３種が見つかっている。あらゆるＮＡタンパク質又はその部分は、本発明に使用されることが意図されており、このようなＮＡタンパク質の任意のもののあらゆる変異体又は変形体もまた同様である。好ましい実施形態では、ＮＡタンパク質を発現している本発明の酵母運搬体は１以上のＮＡタンパク質（例えば、Ｎ１，Ｎ２など）を発現しているか、又は異なるＮＡタンパク質を発現している酵母運搬体（例えば、一方の運搬体はＮＡ、もう一方の運搬体はＮＡ又は他のＮＡタンパク質）とワクチンにおいて組み合わされている。

本発明のさらに別の態様において、本発明のワクチンに用いられているインフルエンザ抗原は、内部又は外部インフルエンザタンパク質であるイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）である。本発明の一態様では、インフルエンザ抗原は、原則的に、インフルエンザＭ２タンパク質の細胞外部分（Ｍ２ｅとしても知られている）からなる。一態様において、Ｍ２ｅは、ＮＰインフルエンザタンパク質のＣ末端又はこのタンパク質の一部分のＣ末端と融合している。このタンパク質（Ｍ２ｅ）は細胞内（細胞質ゾル）発現用にも設計できる。別の実施形態では、Ｍ２ｅは、酵母の細胞外表面に発現するように細胞壁タンパク質（例えば、Ａｇａ２）に融合している。Ｍ２はマトリックスタンパク質であり、マトリックスタンパク質膜及び脂質二重層に及ぶ内在性膜タンパク質であり、ウイルス粒子の表面上に発現している（図１参照）。Ｍ２は、エンドソーム内でビリオンがコートされていない間、プロトンをウイルス粒子内に入れるイオンチャネルである。Ｍ２はまた、ウイルス感染細胞においてトランスゴルジネットワークのｐＨを調節している。Ｍ２は、単一の膜貫通（ＴＭ）ドメインを有する９７残基のホモ多量体であり、このドメインの残基にチャネルの孔領域が含まれる。このチャネルの生物学的活性型はホモ四量体である。本発明によれば、Ｍ２タンパク質のウイルス外部に発現している部分（すなわち、Ｍ２の細胞外ドメインとしても知られている部分）は、本明細書においてＭ２ｅとしても称され得る。Ｍ２ｅはＡ型インフルエンザウイルスの間で高度に保存されていることが知られている。上述の通り、本発明の一実施形態においては、主として又は独占的にＭ２ｅを含んで構成されるＭ２タンパク質の一部分は、酵母運搬体が発現する。この実施形態では、Ｍ２タンパク質は外部インフルエンザタンパク質とみなされる。他の実施形態において、Ｍ２タンパク質のマトリックスタンパク質膜部分が発現する場合には、Ｍ２タンパク質は内部インフルエンザタンパク質とみなされ得る。あらゆるＭ２タンパク質又はその部分は、本発明に使用されることが意図されており、このようなＭ２タンパク質の任意のもののあらゆる変異体又は変形体もまた同様である。

本発明の別の態様において、本発明のワクチンに用いられているインフルエンザ抗原は、内部インフルエンザタンパク質であるヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）であり、ヌクレオタンパク質とも称されている。本発明の一態様では、インフルエンザ抗原は、原則的に、酵母の細胞質に発現し免疫原性であるインフルエンザＮＰタンパク質の一部分からなる。ＮＰは、マトリックスタンパク質膜により形成されるシェルの内側に局在している（図１参照）。ＮＰの主たる機能は、ＲＮＡの転写、複製及びパッケージングのためにウイルスゲノムをキャプシドに包んでリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成することである。しかしＮＰはウイルスの生活環を通して他の必須な機能もまた果たしている。ＮＰは、インフルエンザをＡ型、Ｂ型及びＣ型へ分類するために用いられるが、ウイルス型間でさえも、とりわけＡ型及びＢ型間で、高度に保存されている。あらゆるＮＰタンパク質又はその部分は、本発明に使用されることが意図されており、このようなＮＰタンパク質の任意のもののあらゆる変異体又は変形体もまた同様である。好ましい実施形態では、ＮＰタンパク質を発現している本発明の酵母運搬体は１以上のＮＰタンパク質（例えば、Ａ型インフルエンザ由来のＮＰ、Ｂ型インフルエンザ由来のＮＰなど）を発現しているか、又は異なるＮＰタンパク質を発現している酵母運搬体（例えば、一方の運搬体はＡ型インフルエンザ由来のＮＰを発現しており、もう一方の運搬体はＢ型インフルエンザ由来のＮＰを発現しエチル）とワクチンにおいて組み合わされている。

実施例４は、本発明のさらに他の典型的なワクチン又はワクチンの成分を生産するための、外部インフルエンザタンパク質である血球凝集素（ＨＡ）の使用について説明するものである。この実施形態において、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビジエ）は、融合タンパク質をＴＥＦ２プロモータ制御下で発現するように人工的に改変されている。この融合タンパク質は、インフルエンザウイルスＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４株に由来するＨＡ抗原（Ｈ５）を酵母が細胞内に発現するように設計されている。Ａｇａｌｐも発現している細胞においてこのタンパク質が発現すると、このタンパク質は酵母細胞の外部細胞壁に局在する。この融合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列を含んで構成され、配列番号１３に示される核酸配列によりコードされているものである。

実施例５は、本発明の酵母運搬体が発現するいくつかのＨＡ含有融合タンパク質の設計について説明するものである。また、酵母スフェロプラスト上など、表面発現用の様々なコンストラクトを例証するものであり、さらに、表面発現でのグリコシル化の効果を例証するものである。

ＴＫ７５−１５と名づけられた一融合タンパク質は、本明細書において配列番号３６として参照され、配列番号３５によりコードされる融合タンパク質であり、Ａｇａ２配列のＣ末端にＨＡ配列が配置されている融合タンパク質のコンストラクションを例証するものである。Ａｇａｌｐも発現（この場合、ＣＵＰ１プロモータにより動かされる）している細胞においてこのタンパク質が発現すると、図１０Ｂ（上部左）に示すように、このタンパク質は酵母細胞の外部細胞壁及び細胞質に局在する。

実施例５は、図１０Ｂ（上部右）に模式的に示すＶＫ４と名づけられた融合タンパク質についてもまた説明するものである。ＶＫ４は、Ａｇａ２配列を用いてインフルエンザＨＡタンパク質（Ｈ１）が細胞壁に局在するように設計されたものであり、ＴＥＦ２プロモータにより動かされる。このコンストラクトでは、ＨＡ配列がＡｇａ２配列のＮ末端に配置するように構築されている。自身のＡｇａｌｐも発現（この場合、自身のプロモータを使用）しているＭａｔ ａ酵母においてこのタンパク質が発現すると、このタンパク質は酵母細胞の外部細胞壁に局在し、また細胞内にも存在する。この融合タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列を含んで構成され、配列番号２５に示される核酸配列によりコードされているものである。

実施例５は、ＶＫ１１と名づけられた融合タンパク質についてもまた説明するものである。ＶＫ１１は、上記ＶＫ４の類似体であり、Ａｇａ２配列を用いてＨＡタンパク質であるインフルエンザＨ５が細胞壁に局在するように設計されている点が異なり、ＴＥＦ２プロモータにより動かされる。このコンストラクトでは、タンパク質は、Ａｇａ２配列のＮ末端にＨＡ配列が配置されるようにも構築されている。この融合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列を含んで構成され、配列番号２１に示される核酸配列によりコードされているものである。

実施例５は、図１０Ｂ（下部左）に模式的に示すＶＫ８と名づけられた融合タンパク質についてもまた説明するものである。ＶＫ８は、Ｃｗｐ２配列を用いてインフルエンザＨＡタンパク質（Ｈ１）が細胞壁に局在するように設計されたものであり、ＴＥＦ２プロモータにより動かされる。このコンストラクトでは、ＨＡ配列がＣｗｐ２配列のＮ末端に配置するようにも構築されている。このタンパク質は、酵母細胞の外部細胞壁に局在し、細胞内部にも存在する。この融合タンパク質は、配列番号２８のアミノ酸配列を含んで構成され、配列番号２７に示される核酸配列によりコードされているものである。

実施例５は、ＶＫ１２と名づけられた融合タンパク質についてもまた説明するものである。ＶＫ１２は、上記ＶＫ８の類似体であり、Ｃｗｐ２配列を用いてＨＡタンパク質であるインフルエンザＨ５が細胞壁に局在するように融合タンパク質が設計されている点で異なり、ＴＥＦ２プロモータにより動かされる。このコンストラクトでは、タンパク質は、Ｃｗｐ２配列のＮ末端にＨＡ配列が配置されるようにも構築されている。この融合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含んで構成され、配列番号２３に示される核酸配列によりコードされているものである。

実施例５は、図１０Ｂ（下部右）に模式的に示すＬｕ００２と名づけられた融合タンパク質についてもまた説明するものである。Ｌｕ００２は、内在性α−因子シグナル及びリーダー配列を用いて、膜貫通ドメインを有するインフルエンザＨＡタンパク質を無傷の状態で酵母スフェロプラストの原形質膜上に発現するように設計されており、ＴＥＦ２プロモータにより動かされる。このタンパク質は、ゴルジにおいてα−因子シグナル及びリーダー配列が自然に切り離され、酵母スフェロプラストの原形質膜に局在し、細胞内にも存在する。外来性タンパク質を酵母の分泌経路に向かわせるために内在性α−因子シグナル及びリーダー配列を用いることは、既に記載されている（例えば、米国特許第５，４１３，９１４号；又は、Franzusoff et al J. Biol. Chem. 270, 3154-3159 （1995）を参照）。

実施例６は、本発明のさらに他の典型的なターモゲン又はターモゲンの成分を生産するための、いくつかの内部インフルエンザタンパク質の使用について説明するものである。本実施形態では、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビジエ）は、融合タンパク質をＴＥＦ２プロモータ制御下で発現するように人工的に改変されている。この融合タンパク質は、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４に由来するＭ１抗原及びＮＰ抗原、並びにインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４株及びインフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４株の両方に由来するＭ２ｅ抗原を含むＭ２ｅ抗原を酵母が細胞内に発現するように設計されている。本発明のこの酵母ベースワクチンは、インフルエンザ菌株間で保存されている抗原に対する交差防御免疫を誘導するのに有用である。この融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列を含んで構成され、配列番号１５に示される核酸配列によりコードされているものである。

実施例７は、本発明のさらに他の典型的なターモゲン又はターモゲンの成分を生産するための、いくつかの内部インフルエンザタンパク質の使用について説明するものである。この実施形態では、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビジエ）は、融合タンパク質をＴＥＦ２プロモータ制御下で発現するように人工的に改変されている。この融合タンパク質は、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４に由来するＮＰ抗原及びインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４に由来するＭ２ｅ抗原が細胞内に発現されるように設計されている。本発明のこの酵母ベースワクチンは、インフルエンザ菌株間で保存されている抗原に対する交差防御免疫を誘導するのに有用である。この融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含んで構成され、配列番号１７に示される核酸配列によりコードされているものである。

本発明の一実施形態においては、上述したインフルエンザウイルス抗原の任意のものが、本発明の酵母運搬体において、少なくとも１つの他のインフルエンザ抗原と共に発現する。好ましくは、内部インフルエンザ抗原（例えば、Ｍ１，Ｍ２又はＮＰ）が外部インフルエンザ抗原（例えば、ＨＡ，ＮＡ，又はＭ２ｅ）と共に両方とも発現する。インフルエンザ抗原は、同一の又は異なるコンストラクトを用いて発現し得る。外部インフルエンザ抗原は、酵母により細胞外に及び／又は細胞内にもたらされ得る。酵母運搬体に発現させる抗原の好ましい組み合わせは、Ｍ１及びＨＡ；Ｍ１及びＮＡ；Ｍ１，ＨＡ及びＮＡ；ＮＰ及びＨＡ；ＮＰ及びＮＡ；ＮＰ，ＨＡ及びＮＡ；Ｍ２及びＨＡ；Ｍ２及びＮＡ；Ｍ２及びＭ１；Ｍ２，ＨＡ及びＮＡ；並びに、Ｍ１，Ｍ２及びＮＡであるが、これらに限定されない。Ｍ２を含むこれら組み合わせの任意のものにおいて、Ｍ２は、全長のＭ２若しくはＭ２ｅであることができ、又は酵母内で発現若しくは供給でき、免疫原性を有するＭ２の任意の部分であることができる。同様に、他のタンパク質は、本明細書に記載されている任意の形態、部分、及び変異形として発現され得る。これらの組み合わせにおいて、タンパク質の任意の１以上のサブタイプ、とりわけ、ＨＡ又はＮＡの任意の１以上のサブタイプが発現又は供給され得る。

本発明の別の実施形態においては、１以上のインフルエンザ抗原又はこれらの抗原の組み合わせを発現又は供給する上述の酵母運搬体の任意のものと、１以上の異なる抗原又は抗原の組み合わせを発現又は供給する酵母運搬体とが組み合わされ、酵母ワクチンを形成している。あるいは、１以上のインフルエンザ抗原を発現又は供給する上述の酵母運搬体の任意のものと、１以上の異なる抗原又は抗原の組み合わせを発現する酵母運搬体とを連続して投与できる。１以上の内部インフルエンザ抗原を発現又は供給する酵母運搬体は、１以上の外部インフルエンザ抗原を発現又は供給する酵母運搬体と組み合わされるか、これと連続して投与されることが好ましい。酵母運搬体の好ましい組み合わせは、ＨＡ、ＮＡ又はこれらの組み合わせ（これら抗原の１以上のサブタイプを含む）を発現又は供給している酵母運搬体とともに投与される、又はこの酵母運搬体と連続して投与される、Ｍ１を発現又は供給している酵母運搬体；ＨＡ，ＮＡ又はこれらの組み合わせ（これら抗原の１以上のサブタイプを含む）を発現又は供給している酵母運搬体とともに投与される、又はこの酵母運搬体と連続して投与される、ＮＰを発現又は供給している酵母運搬体；及び，ＨＡ，ＮＡ又はこれらの組み合わせ（これら抗原の１以上のサブタイプを含む）を発現又は供給している酵母運搬体とともに投与される、又はこの酵母運搬体と連続して投与される、Ｍ２を発現又は供給している酵母運搬体、であるがこれらに限定されない。別の実施形態では、Ｍ１，ＮＰ及び／又はＭ２の任意の２以上のものを発現又は供給している酵母運搬体を、ＨＡ，ＮＡ又はこれらの組み合わせ（これら抗原の１以上のサブタイプを含む）を発現又は供給している酵母運搬体と共に、又はこの酵母運搬体と連続させて投与し得る。

〔単離した融合タンパク質、核酸分子及び細胞〕
本発明の別の実施形態は、単離したタンパク質である。このタンパク質は、本明細書に記載されているようなインフルエンザ抗原を含んで構成される単離融合タンパク質の任意のものを含むものである。本発明は、上記タンパク質の任意のものをコードする単離核酸分子、上記タンパク質をコードする核酸配列を含んで構成される組み換え核酸分子、並びに、上記核酸分子若しくは組み換え核酸分子を含む又はこれら核酸分子を用いてトランスフェクト／形質転換される細胞及びベクター（ウイルスベクターを含む）もまた包含している。

本発明に係る好ましい融合タンパク質は、本明細書に記載されている融合タンパク質の任意のものである。本発明に包含される典型的な融合タンパク質は、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８及び配列番号３６から選択されるアミノ酸配列を含んで構成される、又は原則的にこれらからなる、又はこれらからなるものである。様々なインフルエンザタンパク質の配列はこの技術分野において周知であるため、本明細書により提供される手引きを参照する当業者にとっては、他の融合タンパク質の配列も明白になるであろう。

本発明は、本明細書に記載されている融合タンパク質の任意のものをコードする核酸配列を含んで構成される、又は原則的にこの配列からなる、又はこの配列からなる任意の核酸分子もまた包含する。

本発明に係る組み換え核酸分子を用いてトランスフェクトされることに適した宿主細胞は、トランスフェクト又は形質転換が可能なあらゆる細胞であり、あらゆる動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、真菌細胞（酵母細胞を含む）である。一実施形態において、宿主細胞は、本発明の融合タンパク質をトランスフェクトされ、これを発現している動物細胞である。このような細胞は〔実施例〕の項において実証される。また、このような細胞は、例えば、本発明のワクチン又は組成物により誘導される抗原特異的Ｔ細胞反応を評価するのに有用である。インフルエンザ抗原に対する他のワクチン又は組成物もまた、このトランスフェクト細胞により評価され得る。

以下の実験結果は、例証の目的で提供されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
〔実施例〕
（実施例１）
以下の実施例は、本発明のインフルエンザＭ１融合タンパク質酵母ワクチンである、ＧＩ−８００１（いくつかの図面においては、ＧＩ−８０００としても通常称されている）の設計について説明するものである。

銅誘導プロモータＣＵＰ１の制御下でインフルエンザＭ１融合タンパク質を発現するように、サッカロミセス・セレビジエを人工的に改変した。この融合タンパク質は、以下の配列要素がＮ末端側からＣ末端側にかけて、機能し得る形でフレームがつながっている単一のポリペプチド（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号４に示されている）であり、その配列要素は、１）プロテアソームによる分解に対する耐性を付与するための配列ＭＡＤＥＡＰ（配列番号１）；２）Ｍ１タンパク質の２から２５２番目のアミノ酸（配列番号４の７番目から２５７番目の位置）；３）Ｍ１タンパク質をヒスチジンタグから離すために導入されるトリグリシンスペーサ（配列番号４の２５８番目から２６０番目の位置）；及び４）Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号４の２６１番目から２６６番目の位置）である。配列番号２の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１に示されている配列である。この典型的な酵母ベースワクチンにおいて、Ｍ１遺伝子は、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４／Ｈ１Ｎ１感染培養細胞からＲＴ−ＰＣＲによりクローニングしたものであり、これがコードするアミノ酸配列は、この菌株／遺伝子型から得られる理論Ｍ１アミノ酸配列と完全に一致している。

インフルエンザＭ１融合タンパク質を発現している酵母（サッカロミセス・セレビジエＷ３０３）の増殖及び誘導は、ＵＬＤＭ培地中で行った。本明細書に記載しているように、この培地のｐＨを中性ｐＨには調整しなかった（すなわち、通常の酵母増殖条件を用いた）。０．２ＹＵ／ｍｌにおいて０．３７５ｍＭの硫酸銅により、インフルエンザＭ１融合タンパク質の発現を誘導した。対数増殖中期（mid-exponential phase）において酵母を集菌し、熱により死滅させた。Ｍ１融合タンパク質の発現を、銅誘導、熱不活化ＧＩ−８００１酵母由来の溶解物のウェスタンブロット解析により確認した（図２参照）。タンパク質の検出には、ヒスチジンタグに特異的なモノクローナル抗体を用いた。
ＵＬＤＭ培地の標準的な調製法は以下の通りである。

雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１週間ごとで計３週間（3 weekly）、ＰＢＳのみ、又は、Ｍ１を発現している１ＹＵ若しくは１０ＹＵのＧ１−８００１酵母ベースワクチン（図３Ａ及び３Ｂにおいて、それぞれ、「１ＹＵ Ｍ１」及び「１０ＹＵ Ｍ１」と表示している）を注射した。最後の投与から１６日後にマウスを屠殺した。ＣＴＬ反応及びリンパ球増殖を評価するために、ターゲットとしてＭ１発現酵母を用いて（ＩＶＳ−Ｍ１）、又はターゲットとして弱毒化インフルエンザウイルスを用いて（ＩＶＳ−ｆｌｕ）、インビトロ刺激アッセイを実施した。また、サイトカイン分析のために上清を回収した。これらのアッセイにおける標的細胞として、Ｐ８１５腫瘍細胞に、インフルエンザＭ１融合タンパク質又はインフルエンザをトランスフェクトした。ＣＴＬアッセイの結果を図３に示す。この結果から、ＧＩ−８００１ワクチンによりマウスを免疫すると、抗原特異的（Ｍ１及びインフルエンザウイルス）ＣＴＬ反応が誘導されることが示されている。

図４は、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４に感染しているＰ８１５細胞由来の溶解物のウェスタンブロットを示している。ＨＡが上清物として確認される。これにより、Ｐ８１５細胞は、インフルエンザウイルスに感染し得、本明細書に記載のアッセイにおいて標的細胞として用い得ることが例証されている。

図５及び６は、リンパ球増殖アッセイの結果を示している。図５において、刺激抗原は、Ｍ１融合タンパク質を発現している酵母（ＭＰ yeast）の溶解物である。図６において、刺激抗原は、死菌インフルエンザ（Ａ／ＰＲ８）である。この結果から、ＧＩ−８００１（ＧＩ−８０００、Ｍ１発現酵母）が酵母特異的増殖応答を誘導することが示されている。

（実施例２）
以下の実施例は、血球凝集素（ＨＡ）を細胞内に発現する本発明の２つの酵母ベースワクチンの設計について説明するものであり、Ｈ１ ＨＡ（本明細書の他の箇所では、ＧＩ−８００２又はＧＩ−８０００−Ｉとも称されている）を用いており、また第２ものには、Ｈ５ ＨＡ（ＧＩ−８１０２とも称する）を用いている。

＜細胞内発現用Ｈ１−ＨＡ＞
転写伸長因子２プロモータＴＥＦ２の制御下でＨＡ（Ｈ１又はＨＡ１）融合タンパク質を細胞内に発現するように、サッカロミセス・セレビジエを人工的に改変した（図７下部参照）。インフルエンザＨＡ抗原を含んで構成されるこの融合タンパク質は、以下の配列要素がＮ末端側からＣ末端側にかけて、機能し得る形でフレームがつながっている単一のポリペプチド（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号６に示されている）であり、その配列要素は、１）元来有している１８アミノ酸のＥＲ−ターゲティングシグナル配列（配列番号６の１番目から１８番目の位置）を含む、サッカロミセス・セレビジエの全長Ａｇａ２タンパク質配列（配列番号６の１番目から８７番目の位置）；２）インフルエンザＨＡタンパク質の２番目から５３０番目までのアミノ酸（配列番号６の８８番目から６１６番目の位置）であり、これは、ＨＡのＮ末端ＥＲ−ターゲティングシグナル配列（配列番号６の８８番目から１０５番目の位置）を含むが、ＨＡのＣ末端の３６残基は除かれており、したがってＣ末端膜アンカー及び細胞質テールは取り除かれている；３）ＨＡタンパク質の本体をヒスチジンタグから離すためのトリグリシンスペーサ（配列番号６の６１７番目から６１９番目の位置）；及び４）Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号６の６２０番目から６２５番目の位置）である。配列番号６の融合タンパク質をコードしている核酸配列は、配列番号５により示されている。この融合タンパク質及びこれを発現しているターモゲンは、ＧＩ−８０００ Ａｇａ２−ＨＡ又はＧＩ−８００２と呼ばれ得る。

この典型的な酵母ベースワクチンにおいて、ＨＡ遺伝子は、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４／Ｈ１Ｎ１感染培養細胞からクローニングされたものであり、これがコードするアミノ酸配列は、この菌株／遺伝子型から理論上得られるＨＡアミノ酸配列とは完全には一致していない。実際の配列と理論配列とのアライメントを表１に示す（実施例２参照）。

ＴＥＦ::Ａｇａ２−ＨＡプラスミドを保有する酵母を対数増殖中期までＵＤＭ中で増殖させた。この培地を用いた増殖条件では、中性ｐＨ条件には調整しなかった。細胞を洗浄し、熱により死滅させ、全タンパク質を細胞から抽出した。タンパク質を発現していた熱不活化酵母由来の溶解物のウェスタンブロット分析により、ＨＡ融合タンパク質の発現を確認した（図７）。ｈｉｓタグｍＡｂ（図７右）又はＨＡ特異的ｍＡｂ（不図示）をプローブに用いた全タンパク質のウェスタンブロットから、酵母内にＡｇａ２−ＨＡタンパク質が高レベルで蓄積していることが示されている。
ＵＤＭ培地の標準的な調製法は以下の通りである。

５−１０週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＰＢＳ、０．５ＹＵのＧＩ−８０００ Ａｇａ２−ＨＡ（ＧＩ−８００２）又は５ＹＵのＧＩ−８０００ Ａｇａ２−ＨＡ（ＧＩ−８００２）を、それぞれ皮下投与（１００μｌ）又は経鼻投与（５０μｌ）により、１週間に１度で計３週間、投与した。３度目の投与から２週間後にマウスを屠殺した。分析のために血清を集めた。また、ＣＴＬ反応（Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスを一晩感染させた^５１Ｃｒ標識した同系のＰ８１５腫瘍細胞を使用）及びリンパ球増殖を評価するために、脾細胞に対してインビトロ刺激アッセイを実施した。増殖アッセイのために、脾細胞をＧＩ−８０００ Ａｇａ２−ＨＡ（ＧＩ−８００２）又はＵＶ不活化Ａ／ＰＲ８インフルエンザウイルスと共に５日間培養した。抗体分析のためにも血清を集めた。

図８はＣＴＬアッセイの結果を示し、図９はリンパ球増殖アッセイの結果を示している。この結果から、ＧＩ−８０００ Ａｇａ２−ＨＡはインフルエンザウイルス特異的ＣＴＬ反応を誘導することが示されている。皮下経路により投与した場合には、全体として経鼻投与よりも強いＣＴＬ反応が誘導される。しかしながら、低用量の経鼻投与でも高レベルのＣＴＬ反応を誘導する。増殖アッセイでは、両方の投与経路いずれにおいてもインフルエンザウイルス特異的リンパ球増殖が誘導されることが示された。しかし、皮下投与と比較すると、経鼻投与がもたらす増殖反応は低レベルであった。

上述のように細胞内抗原としてＨＡを発現しているターモゲンについても、アジュバントとして液性免疫を誘導する能力を評価した。具体的には、０日目及び２１日目に、アジュバント（アジュバントは、この実施例中に説明されているＧＩ−８０００−Ｉターモゲン）若しくはミョウバンと共に又はこれらを用いずに、抗原（Ａ／ＰＲ／８／３４由来のＨＡ）を２回投与した。抗原の２回目の投与から３週間後に、ＨＡ中和抗原力価を測定した。表２はこの実験の結果を示している。このデータから、ＧＩ−８０００−Ｉは、Ｂ細胞応答に対してアジュバントとしての役目を果たす、優れた能力を有していることが示された。事実、ＧＩ−８０００−Ｉは、ミョウバン添加の有無に関わらず、精製タンパク質と同等によく、又は精製タンパク質よりもよく、アジュバントとして機能する。そのようなものであるため、抗体応答の生成において同じ有効性を達成させることに、低用量の非酵母ベースワクチンを用い得る（すなわち、投与量倹約）。

上述のように細胞内抗原としてＨＡを発現しているターモゲンについても、インフルエンザに対して免疫反応を誘導する能力を評価した。１０μｇのＨＡを供給するために十分な量の不活化Ａ／ＰＲ／８／３４ビリオンにより、誘導を行った。５ＹＵのＧＩ−８０００−Ｉを使用した。約１月後に追加免疫した。さらに１月後にＨＩ（ＨＡ中和阻害）力価を測定した。ＨＩ力価を測定すると同時に病原菌接種を実施した。５日後にウイルス力価を測定した。表３は、インフルエンザに対して免疫誘導するためにＧＩ−８０００−Ｉを用いた場合の結果を示している。

この型のターモゲンを用いると、複数抗原に対するＴ細胞がインフルエンザ感染細胞において作り出される。複数抗原に対する免疫反応を引き出すことの利点は、これにより、交差防御免疫が可能になること、また、複数抗原のターモゲン発現が共通ワクチンとして機能できるようになることである。効率的な免疫反応を作り出すことにより、鳥インフルエンザ又は季節的インフルエンザに対する従来のワクチンと比較して、投与量倹約できる（すなわち、効果を得るために必要な用量が小さい）。

＜細胞内発現用Ｈ５ ＨＡ＞
細胞内にＨＡ（Ｈ５）融合タンパク質を発現するようにサッカロミセス・セレビジエを人工的に改変した（本明細書においてはＧＩ８１０２とも称する）。インフルエンザＨ５抗原を含んで構成されるこの融合タンパク質は、以下の配列要素がＮ末端側からＣ末端側にかけて、機能し得る形でフレームがつながっている単一のポリペプチド（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号２０に示されている）であり、その配列要素は、１）元来有している１８アミノ酸のＥＲ−ターゲティングシグナル配列（配列番号２０の１番目から１８番目の位置）を含む、サッカロミセス・セレビジエの全長Ａｇａ２タンパク質配列（配列番号２０の１番目から８７番目の位置）；２）Ｈ１ ＨＡの１番目から１６番目の残基に対応するＮ末端ＥＲ−ターゲティングシグナル配列（配列番号２０の８８番目から１０５番目の位置）；３）鳥インフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４菌株由来のＨ５ ＨＡ（配列番号２０の１０６番目から６２０番目の位置）であり、これは、ＨＡのＣ末端の３６残基は除かれており、したがってＣ末端膜アンカー及び細胞質テールは取り除かれている；及び４）Ｃ末端のヘキサヒスチジンタグ（配列番号２０の６２１番目から６２６番目の位置）である。配列番号２０の融合タンパク質をコードしている核酸配列は、配列番号１９により示されている。

（実施例３）
以下の実施例は、本発明の酵母運搬体（本明細書において通常ＧＩ−８０００−Ｓとして参照され得る）における、本明細書においてＨＡ１と称されている、別のＨＡ融合タンパク質の設計について説明するものである。

この融合タンパク質は、酵母がＨＡ融合タンパク質を細胞外及び細胞内に発現するように設計されている。インフルエンザＨＡ抗原のＮ末端部分（ＨＡ１）を含んで構成されるこの融合タンパク質は、以下の配列要素がＮ末端側からＣ末端側にかけて、機能し得る形でフレームがつながっている単一のポリペプチド（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１０に示されている）であり、その配列要素は、１）元来有している１８アミノ酸のＥＲ−ターゲティングシグナル配列（配列番号１０の１番目から１８番目の位置）を含む、サッカロミセス・セレビジエＡｇａ２タンパク質全長配列（配列番号１０の１番目から８９番目の位置）；２）インフルエンザＨＡタンパク質の１７番目から３４２番目のアミノ酸（配列番号１０の９０番目から４１５番目の位置）であり、これは、ＨＡのＮ末端ＥＲターゲティングシグナル配列である１６アミノ酸が除かれており、またＣ末端膜アンカー及び細胞質テールを含むＨＡのＣ末端３６残基が除かれている；３）ＨＡ１タンパク質本体をヒスチジンタグから離すためのトリグリシンスペーサ（配列番号１０の４１６番目から４１８番目の位置）；及び４）Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１０の４１９番目から４２４番目の位置）である。Ａｇａｌｐも発現している細胞にこのタンパク質を発現させると、このタンパク質は酵母細胞の外部細胞壁に局在する（この技術を用いての細胞外への発現を模式的に説明するための図１０Ａを参照）。このタンパク質は細胞内にも発現するだろう。配列番号１０の融合タンパク質をコードしている核酸配列は、配列番号９により示されている。

この典型的な酵母ベースワクチンにおいて、ＨＡ遺伝子は、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４／Ｈ１Ｎ１卵ストックからクローニングされたものであり、この菌株／遺伝子型における理論ＨＡアミノ酸配列とは完全には一致しないアミノ酸配列をコードしていた。実際の配列と理論配列とのアライメントを表４に示す。両配列間には１０アミノ酸のミスマッチが存在する。

銅誘導、熱不活化酵母由来の溶解物のウェスタンブロット分析により、融合タンパク質の発現を確認した（図１７参照）。ＵＤＭ中での銅誘導の後、Ａｇａ１合成を誘導するための通常条件（中性ｐＨではない）下で、構成的に発現しているＡｇａ２−ＨＡ１を５０ｍＭのＤＴＴにより生細胞の細胞表面にてＡｇａ１から解放させた。ＤＴＴ溶出物について、グリコシダーゼ酵素ＰＮＧａｓｅＦ又はＥＮＤＯ−ｈを用いた処理を１時間行った。ウェスタンブロットによりＡｇａ−ＨＡ１量について反応の解析を行った（図１７）。細胞内及び細胞表面両方でのＨＡ１の発現が観察された。

（実施例４）
以下の実施例は、本発明の別のＨＡ融合タンパク質酵母ワクチンの設計について説明するものである。

鳥インフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５−Ｎ１）菌株由来の血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を、酵母細胞表面（細胞外）タンパク質として発現するように別の酵母運搬体を設計した。このタンパク質は、ＴＫ８８（Ａｇａ２−Ｈ５ ＨＡ）とも称され、細胞内にも局在するだろう。図１０Ａの上部パネルを再び参照すれば、表面での発現の構成が図解されている。インフルエンザＨＡ抗原（Ｈ５）を含んで構成されるこの融合タンパク質は、以下の配列要素がＮ末端側からＣ末端側にかけて、機能し得る形でフレームがつながっている単一のポリペプチド（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１４に示されている）であり、その配列要素は、１）元来有している１８アミノ酸のＥＲ−ターゲティングシグナル配列を含む、サッカロミセス・セレビジエＡｇａ２タンパク質全長配列（配列番号１４の１番目から８７番目のアミノ酸）；２）インフルエンザＨ５ ＨＡタンパク質の２番目から５３０番目のアミノ酸（配列番号１４の８８番目から６１６番目の位置）であり、これは、ＨＡのＮ末端ＥＲターゲティングシグナル配列が欠失しており、またＨＡのＣ末端３６残基も除かれており、したがってＣ末端膜アンカー及び細胞質テールが取り除かれている；３）ＨＡタンパク質本体をヒスチジンタグから離すためのトリグリシンスペーサ（配列番号１４の６１７番目から６１９番目の位置）；及び４）Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１４の６２０番目から６２５番目までの位置）である。Ａｇａｌｐも発現している細胞にこのタンパク質を発現させると、このタンパク質は酵母細胞の外部細胞壁に局在し、また細胞質及びＥＲにも局在する。配列番号１４の融合タンパク質をコードしている核酸配列は、配列番号１３により示されている。

このターモゲンは、本明細書に記載の中性ｐＨ条件及び通常の酵母増殖条件下の両方で発現してきている。中性ｐＨ条件を用いて発現させると、このタンパク質は細胞壁上（表面）に検出される。中性ｐＨ条件ではタンパク質の発現効率が上昇する。また中性ｐＨ条件では、細胞壁上でのｐＨ効果のため表面上のタンパク質の存在を検出する能力が向上し、また表面に発現しているタンパク質を検出するためのＨＡ特異的抗体の能力が向上する。

（実施例５）
以下の実施例は、抗原が酵母表面にターゲットされるように設計されている追加のコンストラクト（細胞外コンストラクト）の生成について説明するものである。

インフルエンザ由来の血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を酵母細胞表面（細胞外）タンパク質として発現するように、追加のターモゲンを設計した。このタンパク質は酵母の細胞質内にも発現する。図１０Ａの上部パネルを再び参照すれば、表面での発現の構成が図解されている。

図１０Ｂは、抗原を表面に発現しているいくつかの特定の構成を模式的に図解しており、様々な酵母タンパク質がどのようにスペーサアーム（spacer arm）として用いられ得るかを示している。コンストラクトはインフルエンザＨＡを発現させるために用いられているが、これらの方法及びコンストラクトを用いればあらゆるタンパク質を発現させ得る。

＜Ａｇａ２−ＨＡ Ｈ１融合タンパク質（表面）＞
図１０Ｂ（上部左）に模式的に示されている、ＴＫ７５−１５と名づけられた融合タンパク質は、Ａｇａ２配列を用いて、インフルエンザＨＡタンパク質を細胞壁上に発現させるように設計されており、ＴＥＦ２プロモータによって動かされる。このコンストラクトにおいて、タンパク質は、ＨＡ配列がＡｇａ２配列のＣ末端にくるように、構築されている。Ａｇａｌｐも発現している（この場合、ＣＵＰ１プロモータにより動かされる）細胞にこのタンパク質を発現させると、図１０Ｂ（上部左）に示すように、このタンパク質は酵母細胞の外部細胞壁に局在し、また細胞質ゾルにも局在する。インフルエンザＨＡ抗原を含んで構成されるこの融合タンパク質は、以下の配列要素がＮ末端側からＣ末端側にかけて、機能し得る形でフレームがつながっている単一のポリペプチド（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号３６に示されている）であり、その配列要素は、１）元来有している１８アミノ酸のＥＲ−ターゲティングシグナル配列（配列番号３６の１番目から１８番目の位置）を含む、サッカロミセス・セレビジエＡｇａ２タンパク質全長配列（配列番号３６の１番目から８７番目の位置）；２）Ａｇａ２をＨＡ本体から離すためのスペーサ（８８番目及び８９番目の位置）；３）シグナル配列が欠失しているインフルエンザＨＡタンパク質（配列番号３６の９０番目から６００番目の位置）であり、これはＨＡのＣ末端３６残基を欠いており、したがってＣ末端膜アンカー及び細胞質テールが取り除かれている；４）ＨＡタンパク質本体をヒスチジンタグから離すためのトリグリシンスペーサ（配列番号３６の６０１番目から６０３番目の位置）；及び５）Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号３６の６０４番目から６０９番目の位置）である。配列番号３６の融合タンパク質をコードしている核酸配列は、配列番号３５により示されている。このタンパク質及びこれを発現しているターモゲンは、７５−１５と呼ばれ得る。

＜ＨＡ Ｈ１−Ａｇａ２融合タンパク質（表面）＞
図１０Ｂ（上部右）に模式的に示されている、ＶＫ４と名づけられた融合タンパク質は、Ａｇａ２配列を用いてインフルエンザＨＡタンパク質が細胞壁上に発現するように設計されており、ＴＥＦ２プロモータによって動かされる。このコンストラクトにおいて、タンパク質は、ＨＡ配列がＡｇａ２配列のＮ末端にくるように構築されている。自身のＡｇａｌｐも発現している（この場合、自身のプロモータによる）酵母でこのタンパク質を発現させると、このタンパク質は、酵母細胞の外部細胞壁に局在し、また細胞内にも存在する。インフルエンザＨＡ抗原（Ｈ１）を含んで構成されるこの融合タンパク質は、以下の配列要素がＮ末端側からＣ末端側にかけて、機能し得る形でフレームがつながっている単一のポリペプチド（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号２６に示されている）であり、その配列要素は、１）Ａｇａ２ ＥＲ−ターゲティングシグナル配列（配列番号２６の１番目から１９番目のアミノ酸）；２）シグナル配列及びＣ末端膜貫通ドメインを欠いている、Ａ／ＰＲ／８／３４由来のＨ１ ＨＡ（配列番号２６の２０番目から５３３番目の位置）；３）ＨＡタンパク質本体をヒスチジンタグから引き離すためのスペーサ（配列番号２６の５３４番目から５３５番目の位置）；４）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号２６の５３６番目から５４１番目の位置）；５）エンテロキナーゼ切断部位（配列番号２６の５４２番目から５４８番目の位置）；及び６）シグナル配列を欠くＡｇａ２（配列番号２６の５４９番目から６１４番目の位置）である。配列番号２６の融合タンパク質をコードしている核酸配列は、配列番号２５により示されている。

＜ＨＡ Ｈ５−Ａｇａ２融合タンパク質（表面）＞
ＶＫ１１と名づけられた融合タンパク質は、Ａｇａ２配列を用いて細胞壁上にインフルエンザＨＡ Ｈ５タンパク質が発現するように設計されており、上述のＶＫ４と類似しているが、鳥インフルエンザ（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）由来のＨ５ ＨＡタンパク質を含んでいる点で異なる。このコンストラクトにおいて、タンパク質は、ＨＡ配列がＡｇａ２配列のＮ末端にくるように、構築されている。このタンパク質を酵母で発現させると、このタンパク質は、酵母細胞の外部細胞壁に局在し、また細胞内にも存在する。インフルエンザＨＡ抗原（Ｈ５）を含んで構成されるこの融合タンパク質は、以下の配列要素がＮ末端側からＣ末端側にかけて、機能し得る形でフレームがつながっている単一のポリペプチド（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号２２に示されている）であり、その配列要素は、１）Ａｇａ２ ＥＲ−ターゲティングシグナル配列（配列番号２２の１番目から１９番目のアミノ酸）；２）シグナル配列及びＣ末端膜貫通ドメインを欠いている、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４由来のＨ５ ＨＡ（配列番号２２の２０番目から５３６番目の位置）；３）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号２２の５３７番目から５４２番目の位置）；４）エンテロキナーゼ切断部位（配列番号２２の５４３番目から５４８番目の位置）；及び５）シグナル配列を欠いているＡｇａ２（配列番号２２の５４９番目から６１６番目）である。配列番号２２の融合タンパク質をコードしている核酸配列は、配列番号２１により示されている。

＜ＨＡ Ｈ１−Ｃｗｐ２融合タンパク質（表面）＞
図１０Ｂ（下部左）に模式的に示されている、ＶＫ８と名づけられた融合タンパク質は、Ｃｗｐ２配列を用いてインフルエンザＨＡタンパク質が細胞壁上に発現するように設計されており、ＴＥＦ２プロモータによって動かされる。このタンパク質は酵母細胞の外部細胞壁に局在し、また細胞内にも存在する。インフルエンザＨＡ抗原（Ｈ１）を含んで構成されるこの融合タンパク質は、以下の配列要素がＮ末端側からＣ末端側にかけて、機能し得る形でフレームがつながっている単一のポリペプチド（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号２８に示されている）であり、その配列要素は、１）Ｓｕｃ２転化酵素シグナル配列（配列番号２８の１番目から２１番目のアミノ酸）；２）シグナル配列及びＣ末端膜貫通ドメインを欠いている、Ａ／ＰＲ／８／３４由来のＨ１ ＨＡ（配列番号２８の２２番目から５３５番目の位置）；３）ＨＡタンパク質本体をヒスチジンタグから引き離すためのスペーサ（配列番号２８の５３６番目から５３７番目の位置）；４）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号２８の５３８番目から５４３番目の位置）；５）エンテロキナーゼ切断部位（配列番号２８の５４４番目から５４９番目の位置）；及び６）シグナル配列を欠いているＣｗｐ２（配列番号２８の５５０番目から６１７番目）である。配列番号２８の融合タンパク質をコードしている核酸配列は、配列番号２７により示されている。

＜ＨＡ Ｈ５−Ｃｗｐ２融合タンパク質（表面）＞
ＶＫ１２と名づけられた融合タンパク質は、Ｃｗｐ２配列を用いて細胞壁上にインフルエンザＨＡ Ｈ５タンパク質が発現するように設計されており、上述のＶＫ８と類似しているが、鳥インフルエンザ（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）由来のＨ５ ＨＡタンパク質を含んでいる点で異なる。このタンパク質は酵母細胞の外部細胞壁に局在しており、また細胞内にも存在する。インフルエンザＨＡ抗原（Ｈ５）を含んで構成されるこの融合タンパク質は、以下の配列要素がＮ末端側からＣ末端側にかけて、機能し得る形でフレームがつながっている単一のポリペプチド（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号２４に示されている）であり、その配列要素は、１）Ｓｕｃ２転化酵素シグナル配列（配列番号２４の１番目から２１番目のアミノ酸）；２）シグナル配列及びＣ末端膜貫通ドメインを欠いている、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４由来のＨ５ ＨＡ（配列番号２４の２２番目から５３６番目の位置）；３）ＨＡタンパク質本体をヒスチジンタグから引き離すスペーサ（配列番号２４の５３７番目から５３８番目の位置）；４）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号２４の５３９番目から５４４番目の位置）；５）エンテロキナーゼ切断部位（配列番号２４の５４５番目から５５０番目の位置）；及び６）シグナル配列を欠いているＣｗｐ２（配列番号２４の５５１番目から６１８番目の位置）である。配列番号２４の融合タンパク質をコードしている核酸配列は、配列番号２３により示されている。

＜スフェロプラスト発現用ＨＡ−融合タンパク質（表面）＞
図１０Ｂ（下部右）に模式的に示すＬｕ００２と名づけられた融合タンパク質は、膜貫通ドメインを保持するインフルエンザＨＡタンパク質が無傷の状態で酵母スフェロプラスト原形質膜上に発現するように設計されており、ＴＥＦ２プロモータによって動かされる。このタンパク質は酵母スフェロプラストの細胞質に局在しており、細胞内にも存在している。

図１１は、細胞壁タンパク質２（ｃｗｐ２）を介してインフルエンザＨＡタンパク質を酵母表面上に発現させる融合タンパク質（ＶＫ８として上述している）を発現する、別のターモゲンを表している。酵母表面のＨＡ発現についてのフローサイトメトリー分析のヒストグラムを下部右側に示す。ヒストグラムでは、この特定のコンストラクトは、酵母運搬体単独（ＧＩ−１００１又はＹＶＥＣ）と比して、細胞表面にＨＡを非常によく発現させることが示されている。

図１２Ａから１２Ｇは、酵母運搬体の表面上にインフルエンザＨＡタンパク質を発現させるために様々なアプローチ（上述し、図１０Ｂに図解している）を利用した場合のヒストグラムを示している。これらの実験は全て通常の酵母増殖条件にて実施した（すなわち、中性ｐＨ条件は用いなかった）。図１２Ａから１２Ｃは、ＶＫ４を発現しているターモゲン及びＴＫ７５−１５を発現しているターモゲンによる発現を表すものであり、これらは上述したように２つの異なる配向で融合しているものであり、Ａｇａ２スペーサアーム又はリンカーを用いている。図１２Ａは、コントロールの（非形質転換）酵母（ＹＥＸ）による発現を示している。図１２Ｂは、ＶＫ４の発現を示している。また図１２Ｃは、ＴＫ７５−１５の発現を示している。図１２Ｄから１２Ｇは、ＨＡを表面に発現する他の可能な形態を示している。図１２Ｄもまた酵母コントロール（ＹＥＸ）である。図１２Ｅ及び１２Ｆは、ＶＫ８を発現しているターモゲンを示しており、ＶＫ８はＨＡの発現のためのスペーサアームとしてＣｗｐ２を用いている。これらの図では、タンパク質の発現における、酵母のグリコシル化を調節する効果も表している。脱グリコシル化ＶＫ８発現ターモゲン（図１２Ｆ）では、グリコシル化ＶＫ８発現ターモゲン（図１２Ｅ）と比較して、ＨＡの表面発現が向上している。最後に、図１２Ｇは、ＨＡを原形質膜上に発現しているスフェロプラストである、Ｌｕ００２発現ターモゲンによるＨＡの発現を示している。

これらの結果は、本発明の酵母運搬体の表面に（細胞外に）抗原をうまく発現させるために、様々なコンストラクトを用い得ることを表している。
（実施例６）
以下の実施例は、本発明の別のインフルエンザ融合タンパク質酵母ワクチンの設計について説明するものであり、酵母運搬体がインフルエンザタンパク質の組み合わせを細胞内に発現しているものである。

ターモゲンは、細胞内融合タンパク質として、マトリックスタンパク質（Ｍ１）ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）及びイオンチャネルタンパク質細胞外配列（Ｍ２ｅ）を、ＴＥＦ２プロモータ制御下で発現するように設計されている（この融合タンパク質の発現が、同一のプラスミド上にあるＨＡコンストラクトの第２発現と共に図解されている図１３参照）。Ｍ１及びＮＰ（Ｎ１）配列は、Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザ菌株由来のものである。４×Ｍ２ｅは、Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザ菌株由来のＭ２ｅ配列が２コピー及びＡ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１２０３／２００４インフルエンザ菌株由来のＭ２ｅ配列が２コピーであること表している。Ｍ１−Ｎ１−４×Ｍ２ｅタンパク質を含んで構成されるこの融合タンパク質は、以下の配列要素がＮ末端側からＣ末端側にかけて、機能し得る形でフレームがつながっている単一のポリペプチド（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１６に示されている）であり、その配列要素は、１）プロテアソームによる分解に対する耐性を付与する配列ＭＡＤＥＡＰ（配列番号１）（配列番号１６の１番目から６番目の位置）；２）インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４のＭ１タンパク質（配列番号１６の７番目から２６０番目の位置）；３）Ｍ１タンパク質をＮＰタンパク質から離すためのスペーサ（配列番号１６の２６１番目から２６２番目の位置）；４）インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４のＮＰタンパク質（配列番号１６の２６３番目から７６０番目の位置）；５）ＮＰタンパク質をＭ２ｅタンパク質から離すためのスペーサ（配列番号１６の７６１番目から７６２番目の位置）；６）インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４のＭ２タンパク質由来の第１Ｍ２ｅ（細胞外）タンパク質（配列番号１６の７６３番目から７８７番目の位置）；７）インフルエンザＡ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１２０３／２００４のＭ２タンパク質由来の第２Ｍ２ｅ（細胞外）タンパク質（配列番号１６の７８８番目から８１１番目の位置）；８）第２Ｍ２ｅタンパク質を第３Ｍ２ｅタンパク質から離すためのスペーサ（配列番号１６の８１２番目から８１３番目の位置）；９）インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４のＭ２タンパク質由来の第３Ｍ２ｅ（細胞外）タンパク質（配列番号８１４番目から８３８番目の位置）；１０）インフルエンザＡ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１２０３／２００４のＭ２タンパク質由来の（細胞外）タンパク質からなる第４Ｍ２ｅタンパク質（配列番号１６の８３９番目から８６２番目の位置）；及び１１）Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１６の８６４番目から８６９番目の位置）である。配列番号１６の融合タンパク質をコードしている核酸配列は、配列番号１５により示されている。

図１３Ａ及び１３Ｂを参照すれば、追加のコンストラクトと共にＭ１−ＮＰ−４×Ｍ２ｅ融合タンパク質（配列番号１６）を発現しているターモゲンの使用を模式的に表す図が示されている。具体的に、配列番号１６で表される融合タンパク質は、ＣＵＰ１プロモータ制御下でＨＡタンパク質をコードする第２コンストラクトも含む単一のプラスミドとしても作製されている。このプラスミドの発現により、Ｍ１−ＮＰ−４×Ｍ２ｅ融合タンパク質及びＨＡタンパク質が細胞内に発現される結果となる。第２独立コンストラクトを使用しても、ＨＡを発現させることができる。生産される追加のターモゲンは、図１３Ｂに表されているコンストラクト（上述のＶＫ８に対応）を使用している。このコンストラクトによりＨＡタンパク質が細胞外（表面）に発現する。この融合タンパク質は、上述のＭ１−Ｎ１−４×Ｍ２ｅ融合タンパク質を含むターモゲンと同一のターモゲン内に、単独で又は内部に発現する上述のＨＡコンストラクトと組み合わせられて、発現し得る。ＶＫ８（表面ＨＡ）融合タンパク質を発現する別のターモゲンもまた、上述のＭ１−Ｎ１−４×Ｍ２ｅ融合タンパク質を発現しているターモゲンと共に、単独で又は内部に発現するＨＡと組み合わせられて、ワクチンに供給され得る。内部に発現するタンパク質と外部に発現するタンパク質とを別個の融合タンパク質として供給する１つの利点は、Ｂ細胞応答と細胞性免疫反応のための樹状細胞などの抗原提示細胞による取り込みとの両方に利用可能な十分な抗原を確保できることである。

（実施例７）
以下の実施例は、本発明の別のインフルエンザ融合タンパク質酵母ワクチンの設計について説明するものであり、酵母運搬体がインフルエンザタンパク質の組み合わせを細胞内に発現しているものである。

ＮＰ−２×Ｍ２ｅ融合タンパク質を発現するターモゲンが作り出され、またＮＰ−４×Ｍ２ｅ融合タンパク質を発現するターモゲンが作り出されている。
ＮＰ−４×Ｍ２ｅ融合タンパク質は、Ｍ１部分を含んでいないという点以外は、実施例６に記載され配列番号１６に示されているＭ１−Ｎ１−４×Ｍ２ｅ融合タンパク質と同一の手法により構築されている。

ＮＰ−２×Ｍ２ｅ融合タンパク質において、ＮＰ（Ｎ１）及び２コピーあるＭ２ｅ配列は全て、Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザ菌株由来のものである。Ｎ１−２×Ｍ２ｅタンパク質を含んで構成されるこの融合タンパク質は、以下の配列要素がＮ末端側からＣ末端側にかけて、機能し得る形でフレームがつながっている単一のポリペプチド（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１８に示されている）であり、その配列要素は、１）プロテアソームによる分解に対する耐性を付与する配列ＭＡＤＥＡＰ（配列番号１）（配列番号１８の１番目から６番目の位置）；２）インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４のＮＰタンパク質（配列番号１８の７番目から５０３番目の位置）；３）ＮＰタンパク質をＭ２ｅタンパク質から離すためのスペーサ（配列番号１８の５０４番目から５０５番目の位置）；４）インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４のＭ２タンパク質由来の第１Ｍ２ｅ（細胞外）タンパク質（配列番号１８の５０６番目から５３０番目の位置）；５）第１Ｍ２ｅタンパク質を第２Ｍ２ｅタンパク質から離すためのスペーサ（配列番号１８の５３１番目の位置）；６）インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４のＭ２タンパク質由来の第２Ｍ２ｅ（細胞外）タンパク質（配列番号１８の５３２番目から５５５番目の位置）；並びに７）トリグリシンスペーサ及びすぐその後に続くＣ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１８の５５６番目から５６４番目の位置）である。配列番号１８の融合タンパク質をコードしている核酸配列は、配列番号１７により示されている。

ターモゲンを作り出すために酵母運搬内に発現しているこの融合タンパク質は、細胞内に発現しており、他のコンストラクトの発現と組み合わされることも可能である（例えば、上記実施例６に説明されているようなＨＡ表面又はＨＡ細胞内発現計画によって）。

（実施例８）
以下の実施例は、細胞外タンパク質としてインフルエンザＨＡを発現しているターモゲンによる免疫付与が体体液性免疫反応を誘導することを示すものである。

この実施例では、ＧＩ−８０００−Ｓの単回投与量をマウスに皮下投与しているか、又は生インフルエンザウイルスの低用量を経静脈的にマウスに感染させている。ＧＩ−８０００−Ｓは、Ｃｗｐ２を含む融合タンパク質として酵母細胞表面にＨＡを発現するものである。免疫から１週間後、ＨＩ力価を測定した。別のマウスのグループに、５ＹＵのＧＩ−８０００−Ｓを与えた。免疫から１週間後、ＨＩ力価を測定した。この実験の結果を表５に示す。このデータから、ＧＩ−８０００−Ｓワクチンの単回投与により、可溶性精製タンパク質を加えることなく、又は非酵母ベースワクチンを加えることなく、ＨＡ中和抗体応答を引き出せることが示されている。

（実施例９）
着目される様々な抗原を発現するターモゲンは、抗体の産生を誘導するために用いられている。後述するように、本明細書に開示されている本発明は、抗体応答である、体液性免疫反応を誘導する方法を提供する。

一実験において、ＧＩ−２００１（ＨＩＶＡＸ−１）を用いて実施した。これは、内在性酵母細胞膜タンパク質としてＨＩＶ−１ ｇｐ１６０エンベロープタンパク質を生産する（Franzusoff et al J. Biol. Chem. 270, 3154-3159 （1995））ものである。生酵母細胞、無傷酵母細胞又はスフェロプラストとして投与されるＹＶＥＣ及びＨＩＶＡＸ−１株の何れか２×１０^７（２ＹＵ）を、１週間ごと計３週間、マウスに注射し、このマウスの血清について、無傷酵母又はスフェロプラストの全溶解物に対するウェスタンブロット分析を実施した。ウェスタンブロットから、マウスは酵母由来の様々なタンパク質に対する抗体を産生しており、得られる抗体のパターンはマウスが無傷酵母及びスフェロプラストのいずれに感染しているかに依存していることが示された。ＨＩＶＡＸ−１スフェロプラストを用いて免疫し、無傷ＨＩＶＡＸ−１酵母又はＹＶＥＣ酵母若しくはスフェロプラストを用いては免疫していないマウスの血清は、ｇｐ１６０に特異的な抗体を含んでいるようであった。理論にとらわれなければ、この結果は、おそらく、無傷酵母の表面上でＢ細胞にさらされるのではなく、スフェロプラストの外部表面上でさらされるであろう内在性膜タンパク質として、ＨＩＶＡＸ−１内にｇｐ１６０が発現していることによるものである。

ＨＩＶＡＸ−１から得られた結果とは異なり、ニワトリ卵白アルブミンを産生するターモゲンであるＯＶＡＸを用いてワクチン接種したマウスの血清は、抗ＯＶＡ抗体の力価を示している。この結果は、ニワトリ卵白アルブミンの大部分はＯＶＡＸ酵母株においてペリプラズム空間に分泌されているという事実、及びいくつかの可溶性タンパク質が細胞壁を通って無傷酵母から放出されているという事実によるものであるようである。それゆえ、組み換え酵母ベースワクチン内に含まれる異種抗原の局在は、抗体が産生されているかどうかに左右されるようである。

ＯＶＡＸ酵母における抗ＯＶＡ抗体を誘導する能力をさらに調べるために、下記の表に示す抗原を用いて、一ヶ月に一度で二が月間、ＢＡＬＢ／ｃマウスにワクチン接種した。二回目のワクチン接種から一ヶ月後、マウスに可溶性ニワトリ卵白アルブミンをワクチン接種した（アジュバントは非添加）。ＰＢＳを用いてモックをワクチン接種したマウスでは、５６日目に可溶性ＯＶＡを単回接種した後、抗ＯＶＡ抗体応答を開始しなかった。これに対し、２×１０^７（２ＹＵ）のＯＶＡＸにより二度ワクチン接種したマウスでは、アジュバント非添加の可溶性ＯＶＡにより追加免疫をした後、高力価の抗ＯＶＡ抗体応答を開始した。この実験結果から、ＯＶＡＸにより免疫したマウスにおいて、その後の可溶性ＯＶＡによる追加免疫より前に、又はＯＶＡＸ及びＯＶＡ−ミョウバンを共投与したマウスにおいて、可溶性ＯＶＡによる追加免疫より前、特にＯＶＡ−ミョウバン追加ＯＶＡＸの単回投与の後に、高力価の高ＯＶＡ抗体が観察されるという点において、ターモゲンは抗原倹約効果を実現させることが、示されている。図１４Ａ及び１４Ｂもまた、同様の実験の結果を示している。

図１４Ａ及び１４Ｂを参照すれば、用いた３つの投与計画について、Ｔ細胞誘導（図１４Ｂ）及び抗体産生（図１４Ａ）の結果が示されている。図１４Ａにおいて、ＰＢＳのみを投与する計画Ａ（コントロール）では、追加免疫にＰＢＳを使用したときに卵白アルブミン特異的抗体の力価は検出されなかったことが示されている。誘導のために０日目及び２８日目にＰＢＳを投与し、５６日目の追加免疫に可溶性卵白アルブミンタンパク質（ｏｖａ）を用いる計画Ｂでは、６５日目までに卵白アルブミン特異的抗体力価は検出されなかった。卵白アルブミンを発現している酵母運搬体（ＯＶＡＸ）を免疫誘導のために使用し、追加免疫に可溶性卵白アルブミンタンパク質を用いる計画Ｃでは、抗体力価が急速に生じることが観察された。図１４Ｂは、上述の３つの計画のそれぞれにより免疫されたマウスから回収したＴ細胞のインビトロ再刺激を行う、可溶性卵白アルブミンタンパク質の様々な量を用いてのＴ細胞活性化アッセイの結果を示している。計画Ｃは、細胞性免疫反応の誘導に効果的である。

（実施例１０）
以下の実施例は、Ｇａｇ産生ターモゲンが抗原特異的ヘルパーＴ細胞を誘導することを示すものである。

以下の実施例の目的は、細胞質タンパク質としてＨＩＶ−１ Ｇａｇタンパク質を産生しているターモゲン、ＧＩ−２０１０における、抗体産生のために抗原特異的ヘルパーＴ細胞を誘導する能力を確かめることである。５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループに対して、生理食塩水、２ＹＵのＹＶＥＣ及び２ＹＵのＧＩ−２０１０のいずれかを（０、７及び２１日目に皮下に）注射し、又は１×１０^７ｐｆｕのＭＶＡコントロール及び１×１０^７のＭＶＡ−ＵＧＤ（ＨＩＶ−１ Ｇａｇをコードしている組み換え修飾ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara）ウイルス）のいずれかを（０日及び２１日目に腹腔内に）注射した。生理食塩水又は酵母を用いて免疫したマウスに対して、その後、２８日目に、５μｇの組み換えｐ２４ Ｇａｇタンパク質を含む生理食塩水を注射した。実験を通じて単離したマウスの血清サンプルについて、ＥＬＩＳＡにより、抗ｐ２４ Ｇａｇ抗体の力価を測定した。図１５に示す結果は、可溶性Ｇａｇタンパク質により追加免疫しない限り、ＧＩ−２０１０を用いて免疫したマウスは検出可能なｐ２４ Ｇａｇ特異的抗体を発現しなかったことを示している。生理食塩水又はＹＶＥＣを注射されたマウスは抗体を産生しなかったため、このデータから、ＧＩ−２０１０は、アジュバントを含まない可溶性Ｇａｇタンパク質により引き出されるＢ細胞応答を高めるために、ワクチン接種されたマウスにおいてヘルパーＴ細胞を誘導することが示されている。

この実施例から、抗体産生のためにターモゲンがヘルパーＴ細胞を誘導できること、及び酵母内における抗原の局在は産生される抗体量に重要な役割を果たすことが示される。例えば、酵母細胞表面タンパク質としてＨＢｓＡｇを発現している酵母は抗ＨＢｓＡｇ抗原を誘導するという研究例がある。例えば、M.P. Schreuder et al., Vaccine, 14（5）:383-8 （1996）を参照のこと。

（実施例１１）
以下の実施例は、非酵母ベース抗原調製物と混合すると、本発明の酵母ベースワクチンがアジュバント効果を有することを示すものである。

この実験では、細胞質タンパク質としてＡ／ＰＲ／８／３４のＨＡを産生するターモゲン、ＧＩ−８００２を用いた（実施例２を参照）。簡単にいうと、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１グループあたり５匹）を、１日目及び２２日目に、５ＹＵ（５×１０^７）のＧＩ−８００２酵母細胞単独、１μｇ又は１０μｇのＢＰＬ不活化インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４）単独、及び指定量のＢＰＬ不活化インフルエンザウイルスを追加された５ＹＵのＧＩ−８００２のいずれかを用いて経皮下で免疫した。２回目の投与から４週間後に血清を回収し、中和抗体の存在を測定するためにＨＩアッセイを実施した。この実験の結果から、中和抗体を誘導するために酵母をＢＰＬ不活化ウイルスと単純に混合した場合、酵母がアジュバント効果を有することが示されている。

本明細書に挙げられている、全ての特許、特許出願及び公報の開示内容は、全ての目的に関して、本出願にそのまま参考として援用される。

〔参考文献〕
１． Kiyosawa et al., Hepatology 12 (1990):671-675.
２． Tong et al., NEJM 332 (1995):1463-1466.
３． Yano et al., Hepatology 23 (1996):1334-1340.
４． Gordon et al., Hepatology 28 (1998) 2:562-567.
５． Di Bisceglie et al., Hepatology 14 (1991):969-974.
６． Koretz et al., Ann Intern Med 119 (1993):110-115.
７． Mattson et al., Liver 13 (1993):274-276.
８． Tr emolada et al., J Hepatol 16 (1992):273-281.
９． Fattovich et al., Gastroenterology 112 (1997):463-472.
１０．Serfaty et al., Hepatology 27 (1998):1435-1440.
１１．Armstrong et al., Hepatology 31 (2000):777-82.
１２．Shiratori et al., Annals of Internal Medicine, 142 (2005):105-114.
１３．Yoshida et al., IHIT Study Group (Inhibition of Hepatocarcinogenesis by Interferon Therapy). Ann. Intern. Med 131 (1999):174-81.
１４．Okanoue et al., Viral hepatitis therapy study group. J Hepatol 30 (1999): 653-9.
１５．Shoukry et al., Annual Rev. Microbiol 58 (2004):391-424.
１６．Stubbs et al., Nat Med 7 (2001):625-629.
１７．Lu et al., Cancer Research 64 (2004):5084-5088.
１８．Haller et al., Abstract, “A novel yeast-based immunotherapeutic product for chronic hepatitis C virus infection”. AASLD Meeting, March 4-5, 2005, CityCityplaceChicago, StateIL
１９．Mondelli et al., Journal of Hepatology 31 (1999):65-70.
２０．Day et al., Journal of Virology (2002):12584-12595.
２１．Lauer and Walker, New England Journal of Medicine 345 (2001) 1:41-52.
２２．Grakoui et al., Science Mag. Report 342 (2003).
２３．Yewdell et al., Adv. Immunol 73 (1999):1-77.
２４．Shoukry et al., The Journal of Experimental Medicine 197 (2003):1645-1655.
２５．Matzinger, Science 296 (2002):301-305.
２６．Fa lo et al., Nat Med 1 (1995):649-53.
２７．Kikuchi et al., Int. Immunopharmacol, 2 (2002):1503-1508.
２８．Tada et al., Microbio.l Immunol. 46 (2002):503-512.
２９．Pichuantes et al., “Expression of heterologous gene products in yeast. In Protein Engineering - Principles and Practice. J. L. Cleland and C. S. Craik, editors.” CityplaceWiley-Liss, StateNew York (1996):129-162.
３０．Underhill, Eur. J. Immunol. 33 (2003):1767-1775.
３１．Ozinsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (2000):13766-13771.
３２．Akira et al., Nat. Immunol. 2 (2001):675-680.
３３．Medzhitov et al., Science 296 (2002):298-300.
３４．Gantner et al., J. Exp. Med. 197 (2003):1107-1117.
３５．Huang et al., Science. 294 (2001):870-875.
３６．Savolainen et al., Allergy 53 (1998):506-512.
３７．Mari et al., Clin. Exp.Allergy. 33 (2003):1429-1438.
３８．Kortekangas-Savolainen et al., Clin Exp Allergy 24 (1994):836-842.
３９．Belchi-Hernandez et al., Allergy Clin. Immunol. 97 (1996):131-134.
４０．Dentico et al., Eur J Epidemiol. 8 (1992):650-655.
４１．Joossens et al., Gastroenterology 122 (2002):1242-7.
４２．Sandborn et al., Inflammatory Bowel Dis. 7 (2001):192-201.
４３．Ponton et al., Med. Mycology 38 (2000):225-236.
４４．Wheeler et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (2003):2766-2770.
４５．Haller et al., Vaccine 25 (2007): 1452-1463
米国仮出願６０／７６５，０２５号、２００６年２月２日出願。

本発明の様々な実施形態について詳細に述べてきたが、これらの実施形態の修飾及び改編を当業者であれば思いつくであろうことは明らかである。しかしながら、そのような修飾及び改編は以下の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内であることは、明白に理解されるべきである。

Claims (91)

1. ａ）少なくとも１つの異種細胞内抗原を備えた第１酵母運搬体と、
   ｂ）少なくとも１つの異種細胞外抗原を備えた第２酵母運搬体と
   を備えた、ワクチン。
2. （ａ）少なくとも１つの異種細胞内抗原及び少なくとも１つの異種細胞外抗原を備えた第１酵母運搬体と、
   （ｂ）少なくとも１つの異種細胞内抗原又は少なくとも１つの異種細胞外抗原を備えた第２酵母運搬体と
   を備えた、ワクチン。
3. （ａ）少なくとも１つの異種細胞内抗原及び少なくとも１つの異種細胞外抗原とを備えた第１酵母運搬体と、
   （ｂ）上記（ａ）の酵母運搬体が備えた少なくとも１つの抗原、又は当該抗原と同一の病原体若しくは同一の病気由来の抗原を備えた非酵母組成物とを備え、
   上記非酵母組成物は、ＤＮＡワクチン、タンパク質サブユニットワクチン及び殺傷又は不活化病原体からなる群より選択される、ワクチン。
4. 上記（ａ）の酵母運搬体が、上記（ｂ）の非酵母組成物とは異なる投与経路によって運搬されるように形成されている、請求項３に記載のワクチン。
5. 上記細胞内抗原は、病原体の内部に発現した抗原である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
6. 上記細胞外抗原は、同じ型の病原体間において構造的に保存された抗原である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
7. 上記細胞外抗原は、病原体の表面に発現した抗原である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
8. 上記細胞外抗原は、同じ型の病原体間において構造的に可変の抗原である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
9. 上記抗原は感染性の病原体由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
10. （ａ）酵母運搬体と、
    （ｂ）上記酵母運搬体によって発現したインフルエンザウイルス融合タンパク質とを備え、
    上記インフルエンザウイルス融合タンパク質は、インフルエンザ細胞間質（Ｍ１）タンパク質及びインフルエンザイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質の、少なくとも一部を備えた、ワクチン。
11. （ａ）インフルエンザ細胞間質（Ｍ１）タンパク質、インフルエンザイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）及びヌクレオカプシド（ＮＰ）タンパク質からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質の、少なくとも一部を備えたインフルエンザウイルス融合タンパク質を発現した、第１酵母運搬体と、
    （ｂ）血球凝集素（ＨＡ）タンパク質及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質の、少なくとも一部を備えたインフルエンザウイルス融合タンパク質を発現した、少なくとも１つの追加酵母運搬体と
    を備えた、ワクチン。
12. （ａ）酵母運搬体と、
    （ｂ）上記酵母運搬体によって発現したインフルエンザウイルス融合タンパク質とを備え、
    上記インフルエンザウイルス融合タンパク質は、インフルエンザ細胞間質（Ｍ１）タンパク質、インフルエンザイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）及びヌクレオカプシド（ＮＰ）タンパク質からなる群より選択される、少なくとも１つの第１インフルエンザタンパク質の少なくとも一部と、血球凝集素（ＨＡ）タンパク質及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質からなる群より選択される、少なくとも１つの第２インフルエンザタンパク質の少なくとも一部とを備えた、ワクチン。
13. （ａ）酵母運搬体と、
    （ｂ）上記酵母運搬体によって発現した第１インフルエンザウイルス融合タンパク質であって、インフルエンザ細胞間質（Ｍ１）タンパク質、インフルエンザイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）及びヌクレオカプシド（ＮＰ）タンパク質からなる群より選択される、少なくとも１つのインフルエンザタンパク質の少なくとも一部を備えた、第１インフルエンザウイルス融合タンパク質と、
    （ｃ）上記酵母運搬体によって発現した第２インフルエンザウイルス融合タンパク質であって、血球凝集素（ＨＡ）タンパク質及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質からなる群より選択される、少なくとも１つのインフルエンザタンパク質の少なくとも一部を備えた、第２インフルエンザウイルス融合タンパク質と
    を備えたワクチン。
14. （ａ）酵母運搬体と、
    （ｂ）インフルエンザ細胞間質（Ｍ１）タンパク質、インフルエンザイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）及びヌクレオカプシド（ＮＰ）タンパク質からなる群より選択される、少なくとも１つの第１インフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも一部と、
    （ｃ）血球凝集素（ＨＡ）タンパク質及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質からなる群より選択される、少なくとも１つの第２インフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも一部と
    を備えたワクチン。
15. 上記ＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６からなる群より選択されるものである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
16. 上記ＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３からなる群より選択されるものである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
17. 上記ＨＡタンパク質はＨ５である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
18. 上記ＮＡタンパク質は、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８及びＮ９からなる群より選択されるものである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
19. 上記ＮＡタンパク質は、Ｎ１及びＮ２からなる群より選択されるものである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
20. 上記Ｍ１タンパク質は、上記酵母運搬体に関して細胞内にある、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
21. 上記Ｍ２タンパク質は、上記酵母運搬体に関して、細胞内、細胞外、又は細胞内と細胞外との両方にある、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
22. 上記Ｍ２タンパク質はＭ２ｅである、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
23. 上記ＮＰタンパク質は、上記酵母運搬体に関して細胞内にある、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
24. 上記ＨＡタンパク質又は上記ＮＡタンパク質は、上記酵母運搬体に関して細胞外にある、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
25. 上記ＨＡタンパク質又は上記ＮＡタンパク質はさらに、上記酵母運搬体に関して細胞内にある、請求項２４に記載のワクチン。
26. 上記インフルエンザウイルス融合タンパク質は、そのＮ末端に、配列番号１に示されるアミノ酸配列（MADEAP)を備えた、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
27. 上記インフルエンザウイルス融合タンパク質は、そのＮ末端又はＣ末端に、上記インフルエンザウイルス融合タンパク質が上記酵母運搬体の細胞壁を標的とするのに十分なＡｇａ２タンパク質の、少なくとも一部を備えた、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
28. 上記インフルエンザウイルス融合タンパク質は、そのＮ末端又はＣ末端に、上記インフルエンザウイルス融合タンパク質が上記酵母運搬体の細胞壁を標的とするのに十分なＣｗｐ２タンパク質の、少なくとも一部を備えた、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
29. （ａ）酵母運搬体と、
    （ｂ）上記酵母運搬体によって単一の細胞内融合タンパク質として発現する、Ｍ１抗原を備えたインフルエンザウイルス融合タンパク質とを備え、
    上記融合タンパク質は、配列番号４に示された配列からなる、ワクチン。
30. （ａ）酵母運搬体と、
    （ｂ）上記酵母運搬体によって単一の細胞内融合タンパク質として発現する、Ｈ１抗原を備えたインフルエンザウイルス融合タンパク質とを備え、
    上記融合タンパク質は、配列番号６及び２０からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ワクチン。
31. （ａ）酵母運搬体と、
    （ｂ）上記酵母運搬体によって単一の細胞外融合タンパク質として発現する、Ｈ１抗原を備えたインフルエンザウイルス融合タンパク質とを備え、
    上記融合タンパク質は、配列番号１０、２６、２８及び３６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ワクチン。
32. （ａ）酵母運搬体と、
    （ｂ）上記酵母運搬体によって単一の細胞外融合タンパク質として発現する、Ｈ５抗原を備えたインフルエンザウイルス融合タンパク質とを備え、
    上記融合タンパク質は、配列番号１４、２２及び２４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ワクチン。
33. （ａ）酵母運搬体と、
    （ｂ）上記酵母運搬体によって単一の細胞内融合タンパク質として発現する、Ｍ１抗原、Ｎ１抗原及び４つのＭ２ｅ抗原を備えたインフルエンザウイルス融合タンパク質とを備え、
    上記融合タンパク質は、配列番号１６に示される配列からなる、ワクチン。
34. （ａ）酵母運搬体と、
    （ｂ）上記酵母運搬体によって単一の細胞内融合タンパク質として発現する、Ｎ１抗原及び２つのＭ２ｅ抗原を備えたインフルエンザウイルス融合タンパク質とを備え、
    上記融合タンパク質は、配列番号１８に示される配列からなる、ワクチン。
35. （ａ）酵母運搬体と、
    （ｂ）上記酵母運搬体によって単一の細胞外融合タンパク質として発現する、Ｈ３抗原及びＮ２抗原を備えたインフルエンザウイルス融合タンパク質とを備えた、ワクチン。
36. 上記融合タンパク質の発現は、誘導可能なプロモーターに制御されている、請求項１〜３、１０〜１４、又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチン。
37. 上記プロモーターは、ＣＵＰ１及びＴＥＦ２からなる群より選択されるものである、請求項１〜３、１０〜１４、又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチン。
38. 上記酵母運搬体は、酵母全体、酵母のスフェロプラスト、酵母の細胞質体、酵母のゴースト（ｇｈｏｓｔ）、酵母の細胞壁調整物、及び亜細胞酵母膜の抽出物若しくはその画分からなる群より選択される、請求項１〜３、１０〜１４、又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチン。
39. 上記酵母運搬体を調整するために用いられる酵母細胞又は酵母のスフェロプラストは、上記酵母細胞又は上記酵母のスフェロプラストによって組換え的に発現する融合タンパク質のような、融合タンパク質をコードする組換え核酸分子を用いて形質転換されている、請求項１〜３、１０〜１４、又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチン。
40. 酵母運搬体を生成するために用いられる、融合タンパク質を発現した上記酵母細胞又は上記酵母のスフェロプラストは、酵母のゴースト、酵母の細胞壁調整物又は亜細胞酵母膜抽出物若しくはその画分を備えた、請求項１〜３、１０〜１４、又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチン。
41. 上記酵母運搬体は、非病原酵母である、請求項１〜３、１０〜１４、又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチン。
42. 上記酵母運搬体は、サッカロマイス（Saccharomyces）、スキゾサッカロマイス（Schizosaccharomyces）、クルベロマイス（Kluveromyces）、ハンセヌラ（Hansenula）、カンジダ（Candida）及びピチア（Pichia）からなる群より選択される酵母由来である、請求項１〜３、１０〜１４、又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチン。
43. 上記サッカロマイスはＳ．セレビジアエ（S. cerevisiae）である、請求項１〜３、１０〜１４、又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチン。
44. 上記ワクチンはさらに、樹状細胞を備え、上記樹状細胞は、上記酵母運搬体の細胞内に組み込まれている、請求項１〜３、１０〜１４、又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチン。
45. 少なくとも１つの免疫反応調整剤をさらに備えた、請求項１〜３、１０〜１４、又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチン。
46. 抗原特異的免疫反応を誘導するための構成物の調整における、請求項１〜３、１０〜１４、又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチンの使用方法。
47. インフルエンザ感染に対して動物を保護するための構成物における、請求項１０〜１４又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチンの使用方法。
48. インフルエンザ抗原に対する抗原特異的細胞性免疫反応を誘導するための構成物の調整における、請求項１０〜１４又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチンの使用方法。
49. 病気又は症状を治療又は抑制するための構成物の調整における、請求項１０〜１４又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチンの使用方法。
50. インフルエンザに感染する危険性のある個体群を免疫するための構成物の調整における、請求項１０〜１４又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチンの使用方法。
51. インフルエンザに感染した個体群を治療するための構成物の調整における、請求項１０〜１４又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチンの使用方法。
52. インフルエンザに感染した又は感染する危険性のある動物に、請求項１０〜１４又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチンを投与する工程を包含し、上記動物に対する上記ワクチンの投与は、動物に対するインフルエンザ感染、又は動物においてインフルエンザ感染の結果として起こる少なくとも１つの症状、を減少させる又は抑制する、インフルエンザ感染に対する動物の防御方法。
53. 請求項１０〜１４又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチンを動物に投与する工程を包含する、インフルエンザ抗原に対する抗原特異的免疫反応を誘導するための方法。
54. インフルエンザに感染した個体群に請求項１０〜１４又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチンを投与する工程を包含する、インフルエンザに感染した個体群におけるインフルエンザ抗原に対する抗原特異的免疫反応を誘導するための方法。
55. インフルエンザに感染する危険性のある個体群に請求項１０〜１４又は２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチンを投与する工程を包含する、インフルエンザに感染する危険性のある個体群をインフルエンザに対して免疫するための方法。
56. 上記ワクチンは、異なるインフルエンザワクチンによって増強する前に、免疫システムを導くために投与されるものである、請求項５５に記載の方法。
57. 上記異なるインフルエンザワクチンは、
    （ａ）少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含む酵母運搬体であって、上記抗原が上記酵母運搬体に関して細胞外、又は細胞内と細胞外との両方のいずれかにある、酵母運搬体と、
    （ｂ）少なくとも１つのインフルエンザ抗原を備えた酵母膜分子又は細胞壁分子と、
    （ｃ）少なくとも１つのインフルエンザ抗原を備えた混合物中の酵母運搬体と、
    （ｄ）少なくとも１つのインフルエンザ抗原をコードするＤＮＡワクチンと、
    （ｅ）少なくとも１つのインフルエンザ抗原を備えたタンパク質サブユニットワクチンと、
    （ｆ）死又は不活化インフルエンザウイルス
    とからなる群より選択されるものである、請求項５６に記載の方法。
58. （ａ）個体に第１ワクチンを投与する工程であって、第１ワクチンは少なくとも１つの異種細胞内抗原を備えた第１酵母運搬体を備え、当該抗原は病気又は症状に関連している、工程と、
    （ｂ）上記（ａ）の投与後少なくとも２週間に、上記個体に第２ワクチンを投与する工程であって、第２ワクチンは、細胞外タンパク質又は細胞内及び細胞外タンパク質の両方として異種抗原を備えた第２酵母運搬体を備えた、工程と
    を包含する、抗原特異的免疫反応を誘導するための方法。
59. 第１酵母運搬体はさらに、少なくとも１つの細胞外抗原を備えた、請求項５８に記載の方法。
60. 上記細胞外抗原は、上記細胞内抗原と同一の抗原である、請求項５９に記載の方法。
61. （ａ）個体に第１ワクチンを投与する工程であって、第１ワクチンは、少なくとも１つの異種細胞内抗原及び少なくとも１つの異種細胞外抗原を備えた第１酵母運搬体を備え、上記抗原は病気又は症状に関連している、工程と、
    （ｂ）上記（ａ）の投与と同時に又は上記（ａ）の投与に続けて、上記個体に第２ワクチンを投与する工程であって、第２ワクチンは、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）の１つ以上を備えた、工程とを包含する、抗原特異的免疫反応を誘導するための方法：
    （ｉ）上記工程（ａ）において用いられる異種抗原、又は同一の病気若しくは症状由来の抗原の少なくとも１つを備えた第２酵母運搬体であって、当該抗原が第２酵母運搬体に関して細胞外又は細胞内及び細胞外の両方にある、第２酵母運搬体；
    （ｉｉ）上記工程（ａ）において用いられる異種抗原、又は同一の病気若しくは症状由来の抗原の少なくとも１つを備えた酵母膜分子又は細胞壁分子；
    （ｉｉｉ）上記工程（ａ）において用いられる異種抗原、又は同一の病気若しくは症状由来の抗原の少なくとも１つとの混合物中の酵母運搬体；
    （ｉｖ）上記工程（ａ）において用いられる異種抗原、又は同一の病気若しくは症状由来の抗原の少なくとも１つをコードするＤＮＡワクチン；
    （ｖ）上記工程（ａ）において用いられる異種抗原、又は同一の病気若しくは症状由来の抗原の少なくとも１つを備えたタンパク質サブユニットワクチン；
    （ｖｉ）上記工程（ａ）において用いられる少なくとも１つの異種抗原を備えた死又は不活化抗原。
62. 上記工程（ａ）における上記細胞内抗原は、上記工程（ａ）における上記細胞外抗原と同一の抗原である、請求項６１に記載の方法。
63. 上記工程（ａ）における上記細胞内抗原は、上記工程（ａ）における上記細胞外抗原と異なる抗原である、請求項６１に記載の方法。
64. 上記免疫反応は、病気又は症状に対して個体を免疫するために効果的である、請求項５８又は６１に記載の方法。
65. 上記工程（ａ）における上記細胞内抗原は、病原体の内部に発現する抗原である、請求項５８又は６１に記載の方法。
66. 上記工程（ａ）における上記細胞内抗原は、同じ型の病原体間において構造的に保存された抗原である、請求項５８又は６１に記載の方法。
67. 上記工程（ａ）における上記細胞外抗原は、病原体表面に発現する抗原である、請求項５８又は６１に記載の方法。
68. 上記工程（ａ）における上記細胞外抗原は、同じ型の病原体間において構造的に可変の抗原である、請求項５８又は６１に記載の方法。
69. 上記工程（ａ）における上記抗原は、感染性の病原体由来である、請求項５８又は６１に記載の方法。
70. 個体に酵母運搬体を投与する工程を包含し、当該投与の前に又は当該投与と同時に、上記個体は、免疫反応を誘導する上記酵母運搬体の投与に対して１以上の抗原を備える、個体において抗原特異的免疫反応を誘導するための方法。
71. 上記個体を、１以上の上記抗原を発現する病原体に感染させる、請求項７０に記載の方法。
72. 上記個体は、１以上の上記抗原を発現する癌を有している、請求項７０に記載の方法。
73. 上記個体は、免疫反応を誘導する上記酵母運搬体の投与に対して、細胞タンパク質に変異を有している、請求項７０に記載の方法。
74. 上記酵母運搬体は、異種抗原を発現していない又は供給されていない、請求項７０に記載の方法。
75. 上記抗原を備えた上記酵母運搬体をｐＨ５．５より高いｐＨで培養する工程を包含する、請求項１〜３、１０〜１４又は２９〜３５のいずれか１項に記載の酵母ワクチンを製造するための方法。
76. 少なくとも１つの細胞内インフルエンザ抗原と、少なくとも１つの細胞外インフルエンザ抗原とを備えた酵母運搬体を製造する工程を包含し、
    上記細胞内インフルエンザ抗原は、インフルエンザ細胞間質（Ｍ１）タンパク質、インフルエンザイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）及びインフルエンザウイルスヌクレオカプシド（ＮＰ）タンパク質からなる群より選択されるインフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも一部を備え、
    上記細胞外インフルエンザ抗原は、血球凝集素（ＨＡ）タンパク質及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質の少なくとも一部を備える、インフルエンザワクチンを製造するための方法。
77. 上記酵母運搬体を、ｐＨ５．５よりも高いｐＨで培養する工程をさらに包含する、請求項７６に記載の方法。
78. 上記酵母運搬体は、上記細胞内インフルエンザ抗原を１つ又は複数組換え的に発現する、請求項７６に記載の方法。
79. 上記酵母運搬体は、上記細胞外インフルエンザ抗原を１つ又は複数組換え的に発現する、請求項７６に記載の方法。
80. 上記酵母運搬体は、上記細胞内インフルエンザ抗原、若しくは上記細胞外インフルエンザ抗原、又はその両方の抗原が組み込まれている、請求項７６に記載の方法。
81. 上記酵母運搬体において、上記細胞内インフルエンザ抗原、若しくは上記細胞外インフルエンザ抗原、又はその両方の抗原が共に混合されている、請求項７６に記載の方法。
82. 上記細胞内インフルエンザ、抗原若しくは上記細胞外インフルエンザ抗原、又はその両方の抗原は、上記酵母運搬体に物理的に付着している、請求項７６に記載の方法。
83. 上記酵母運搬体は、注入によって個体に投与するために形成されている、請求項７６に記載の方法。
84. 上記酵母運搬体は、鼻内投与によって個体に投与するために形成されている、請求項７６に記載の方法。
85. 複数の酵母運搬体と、構築物を準備するために当該酵母運搬体を使用するための使用説明書とを備え、上記酵母運搬体のそれぞれが、少なくとも１つの細胞内異種抗原又は少なくとも１つの細胞外異種抗原を備えた、細胞性免疫反応、体液性免疫反応又はこれらを組合せた反応を個体内で誘導するためのキット。
86. 上記酵母運搬体は、上記抗原を組換え的に発現する、請求項８５に記載のキット。
87. 以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される、少なくとも１つの追加組成物をさらに備えた、請求項８５に記載のキット：
    （ａ）異種抗原又は同一の病原体若しくは病気由来の抗原の少なくとも１つを含む酵母膜又は酵母細胞壁分子；
    （ｂ）異種抗原又は同一の病原体若しくは病気由来の抗原の少なくとも１つとの混合物中の酵母媒体；
    （ｃ）抗原又は同一の病原体若しくは病気由来の抗原の少なくとも１つをコードするＤＮＡワクチン；
    （ｄ）抗原又は同一の病原体若しくは病気由来の抗原の少なくとも１つを備えたタンパク質サブユニットワクチン；
    （ｅ）少なくとも１つの異種抗原を備えた、死又は不活化病原体。
88. 上記細胞内異種抗原は、病原体によって内部に発現した抗原である、請求項８５に記載のキット。
89. 上記細胞外異種抗原は、同じ型の病原体間において構造的に保存された抗原である、請求項８５に記載のキット。
90. 上記細胞外異種抗原は、病原体の表面に発現する抗原である、請求項８５に記載のキット。
91. 上記細胞外異種抗原は、同じ型の病原体間において構造的に可変の抗原である、請求項８５に記載のキット。