CN101730542A - 用于靶向消除癌症靶向疗法的突变逃逸的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于靶向消除针对癌症治疗剂的突变逃逸的组合物和方法。组合物包括与其它癌症治疗剂组合使用的基于酵母的运载体。

Description

用于靶向消除癌症靶向疗法的突变逃逸的组合物和方法

技术领域

一般而言，本发明涉及组合物及其与癌症治疗剂组合使用的方法，来实现对突变逃逸的靶向消除。

发明背景

癌症生物学领域的新发现提供了设计靶向特异性抗癌剂的机会，以及药物开发中有希望的进展。这些发现使得能够设计出具有针对癌细胞中特定靶标的高选择性的分子。Segota & Bukowski，Cleveland Clinic J.Med.，71(7)：551-560(2004)。例如，Bcr-Ab1酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(格列卫(Gleevec))在治疗慢性髓性白血病(CML)中的成功激发了人们对于这种靶向手段的极大期望。Capdeville等人，Nature Reviews，1：493-502(2002)。靶向癌症疗法带来了一个关键问题：靶标发展出逃逸突变，最终导致药物抗性。例如，已有报道称，已在最初应答格列卫治疗的患者中发现了突变，这些突变的结果导致患者对格列卫的进一步治疗没有反应。Gorre等人，Science，293：876-880(2001)；Shah等人，Cancer Cell，2：117-125(2002)；Branford等人，Blood，99(9)：3742-3745(2002)；Deininger等人，Blood，105(7)：2640-263(2005)；Walz等人，Critical Reviews inOncology/Hematology 57：145-164(2006)；和Burgess等人，TheScientificWorldJOURNAL，6：918-930(2006)。类似地，已在非小细胞肺癌(NSCCL)患者中发现了表皮生长因子受体(EGFR)的突变，其被报道为使得患者对特异性靶向EGFR的治疗剂(例如吉非替尼(gefitnib)(易瑞沙(Iressa))或埃罗替尼(erlotinib)(特罗凯(Tarceva)))的作用产生抗性。Kobayashi等人，N.Engl.J.Med.，352(8)：786-792(2005)。因此，这些癌症药物的有效性受到逃逸突变出现的显著限制。

因此，至少使随着治疗和/或预防剂的施用而出现的突变体的发生最小化将是理想的。

引发免疫应答的方法公开在，例如Thyphronitis等人，AnticancerResearch，第24卷：2443-2454(2004)和Plate等人，Journal of Cell Biology，第94卷：1069(2005)。酵母系统公开在例如，美国专利号5,830,463，Stubbs等人，Nature Med.5：625-629(2001)；Lu等人，Cancer Research64：5084-5088(2004)；和Franzusoff等人，Expert Opin.Bio.Ther.第5卷：565-575(2005)。

本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请和公开文本，都通过引用全文整合至本文中。

发明概述

本文提供了用于靶向消除与癌症相关的突变逃逸的组合物和方法。在一个方面，发明提供了在需要其的个体中靶向消除突变逃逸的方法，这是通过向个体施用有效量的靶向治疗剂和组合物，其中，治疗剂选自：酪氨酸激酶抑制剂、Src激酶抑制剂、影响Bcr-Abl稳定性的活性剂，和在Bcr-Abl的下游信号通路中发挥作用的活性剂，组合物包括一种或多种下列物质：(i)包含核酸的酵母运载体，所述核酸编码至少一种与癌症相关的突变多肽，其包含突变的片段，或模拟物(mimetope)；(ii)包含至少一种与癌症相关的突变多肽、其包含突变的片段、或模拟物的酵母运载体；(iii)与至少一种与癌症相关的突变多肽、其包含突变的片段，或模拟物关联的酵母运载体；(iv)细胞内装载入树突细胞的酵母运载体，其包含下述核酸，所述核酸编码至少一种与癌症相关的突变多肽、其包含突变的片段、或模拟物；或者(v)细胞内装载入树突细胞的酵母运载体，和至少一种与癌症相关的突变多肽，其包含突变的片段，或模拟物，其中，所述突变多肽已知将或已经响应癌症的靶向治疗和/或预防剂的施用而出现，并具有至少一种特定的突变。在一些方面，靶向治疗剂是酪氨酸激酶抑制剂。在一个方面，酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼。在另一个方面中，酪氨酸激酶抑制剂选自伊马替尼、尼罗替尼(nilotinib)、PD1866326、PD180970、AP23464、BMS-354825、ON012380、VX-680和BIRB-796。

在另一个方面，靶向治疗剂是Src激酶抑制剂。在一些实例中，Src激酶抑制剂选自PD166326、PD180970、AP23464、BMS-354825、AZM475271、PP1、PP2、AP-23236、CGP76030和PD173955。在另一个方面，靶向治疗剂是PKC412或SU11248。在其它方面，靶向治疗剂影响Bcr-Abl稳定性。在一些实例中，所述活性剂靶向与Bcr-Abl相关的热休克蛋白或其它伴侣蛋白质。在其它实例中，所述活性剂是格尔德霉素/17-AAG或NVP-LAQ824。

在另一个方面，靶向治疗剂在Bcr-Abl的下游信号通路中发挥作用。在一些实例中，所述治疗剂选自SCH66336、BAY-439006、CI-1040、LY294002、渥曼青霉素(wortmannin)、OSU-03012、CCI-779、R115777、BMS-214662、U0126、PD184352、雷帕霉素(rapamycin)、RAD001、CCI-779和AP23573。

发明还提供了用于在个体中靶向消除与癌症相关的突变逃逸的试剂盒，其中，所述突变逃逸已知将或已经响应靶向治疗和/或预防剂的施用而出现，并具有至少一种特定的突变，并且其中试剂盒包括任一种上述治疗剂的组合物。

发明还提供了用于在个体中靶向消除与癌症相关的突变逃逸的试剂盒，其中，所述突变逃逸已知将或已经响应靶向治疗和/或预防剂的施用而出现，并具有至少一种特定的突变，并且其中试剂盒包括酵母运载体和至少一种突变多肽，其包含突变的片段，或模拟物。在一个方面，试剂盒还包括靶向治疗和/或预防剂。在另一个方面，试剂盒还包括用于试剂盒用途的说明材料。

附图的简要说明

图1描述了抗野生型BCR-ABL白血病(用于对照vs接种疫苗的小鼠)的存活曲线。

图2描述了抗突变的白血病(用于对照vs接种疫苗的小鼠)的存活曲线。

图3描述了用两种不同的Tarmogen构建体免疫的小鼠的存活曲线：GI-10,001(含有三个逃逸突变的Tarmogen(E255K、T315I和M351T))和GI-10,002(含有一个逃逸突变的Tarmogen(T315I))。

图4描述了在对照和接种疫苗的小鼠中的白血病细胞计数。小鼠用含有T315I逃逸突变的Tarmogen接种。Y轴表示GFP阳性细胞的百分比。靠近0的两个空心圆圈表示接种疫苗的小鼠表现出非常低的白血病细胞负荷。

图5描述了在不接受疫苗接种、接受GI-10,001(含有三个逃逸突变(E255K、T315I和M351T)的Tarmogen)或GI-10,002(含有一个逃逸突变(T315I)的Tarmogen)接种的小鼠中的白血病细胞计数。

发明的详细描述

需要能特异性靶向肿瘤细胞独特通路的预防性和治疗性药物活性剂(drug agent)，但是存在这样的缺点，因为肿瘤细胞会经历突变，使其逃避药物活性剂和/或成为具有抗性的。本文提供了用于靶向消除与预防或治疗剂相关的突变逃逸(本文中也称为突变多肽)的组合物和方法。这些组合物和方法可用于引发对突变多肽，或对表达突变多肽的细胞的免疫应答，所述突变多肽是已知将或已经响应靶向药物活性剂而出现。在一些实例中，免疫应答是细胞免疫应答，在一些实例中，免疫应答是体液应答，而在其它实例中，免疫应答既是细胞免疫应答也是体液应答。在一些实例中，细胞免疫应答意在消灭细胞，例如癌细胞，或支持已经逃避控制的肿瘤发展的细胞，所述细胞在药物活性剂靶向的多肽中含有突变，但是清除细胞并非是必须的。在一些实例中，细胞和/或体液免疫应答将阻断细胞增殖或复制。

因此，本文提供了这样的方法，用于引发对突变多肽，或包含编码突变多肽的核酸和/或表达突变多肽的细胞的免疫应答，所述突变多肽已知将或已经响应治疗和/或预防剂的施用而出现，并具有特定突变。在一些实例中，免疫应答是细胞免疫应答。在一些实例中，免疫应答是体液免疫应答。在其它实例中，免疫应答包括细胞和体液免疫应答。在一些实例中，突变多肽是由癌基因编码的和/或由癌细胞表达的。在一些实例中，突变多肽与癌细胞相关或由癌细胞表达。在一些实例中，所述活性剂靶向癌细胞。在一些实例中，所述活性剂是小分子或抗体。

靶向治疗剂包括但不限于，抑制表达(或过表达)与癌症的发生和发展相关的蛋白质的激酶活性的活性剂。此类激酶的实例包括Bcr-Abl、Src、Src/Akt、EGFR、PDGFR、Raf、Mek、Erk、PI3K、PDK、AKT和mTOR。在其它实例中，所述活性剂作为这些蛋白质及其通路中的其它蛋白质的常规抑制剂发挥作用。在一些实例中，所述活性剂通过与蛋白质的活性位点直接结合发挥作用，而在其它情况下，所述活性剂导致蛋白质的别构变化从而影响它的活性。本文中描述的组合物用于与这些靶向治疗剂组合使用，从而控制和/或消除由于使用这些靶向治疗剂而出现的逃逸突变体。

常规技术

除非另有指明，本发明的实践将使用本领域技术人员普遍已知的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。文献中已经详细解释了此类技术，例如，Methods of Enzymology，第194卷，Guthrie等人编著，Cold Spring HarborLaboratory Press(1990)；Biology and activities of yeasts，Skinner等人编著，Academic Press(1980)；Methods in yeast genetics：a laboratory coursemanual，Rose等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；TheYeast Saccharomyces：Cell Cycle and Cell Biology，Pringle等人编著，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1997)；The Yeast Saccharomyces：GeneExpression，Jones等人编著，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1993)；The Yeast Saccharomyces：Genome Dynamics，Protein Synthesis，andEnergetics，Broach等人编著，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1992)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，(Sambrook等人，1989)和Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版(Sambrook和Russell，2001)，(在本文中共同地称为“Sambrook”)；CurrentProtocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel等人编著，1987，包括2001的补充)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人编著，1994)；Harlow和Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Publications，New York；Harlow和Lane(1999)Using Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY(在本文中共同地称为“Harlow和Lane”)，Beaucage等人编著，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons，Inc.，New York，2000)和Vaccines，S.Plotkin和W.Orenstein编著，第3版(1999)。

定义

除非有明确指明，在本文中使用时，单数形式“一个/种”、“这个/种”(“a”、“an”和“the”)包括指复数形式。

在本文中使用时，“癌症”包括但不限于黑素瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈部癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、血管肉瘤(angiosarcoma)、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、肥大细胞瘤、原发性肝癌、肺癌、胰腺癌、胃肠癌、肾细胞癌、造血瘤形成(hematopoietic neoplasias)、白血病及其转移性癌。

在本文中使用时，靶向细胞的治疗性和/或预防性“活性剂(agent)”(治疗和/或预防剂)或“药物活性剂(drug agent)”表示，该物质/剂被导向下述分子，在癌症的情况下，所述分子相关于或作用于引起细胞转化或支持肿瘤发展。设计来靶向细胞(例如癌细胞)的治疗和/或预防剂的实例公开于本文，并且是本领域已知的。

在本文中使用时，“突变体多肽”包括基因组中编码的全长多肽及其片段，只要该片段包含突变，所述多肽已知将或已经响应于活性剂(例如预防和/或治疗剂)而出现，其具有特定突变。响应活性剂(例如靶向细胞，例如癌细胞的预防和/或治疗剂)而出现的具有特定突变的此类突变体多肽在本领域中通常被称为“逃逸突变体”。突变多肽也在本文中被称为“突变逃逸”以及“逃逸突变”。突变可被发现于全长多肽的任何区域，其可包括氨基酸取代、插入或缺失或其组合，或非顺序(sequential)序列的融合，例如在易位事件中发现的那样。在一些实例中，已知将或已经响应活性剂而出现的具有特定突变的突变体多肽其自身就是免疫原性的，即，无须与佐剂或其它载体或运载体(例如酵母运载体)相关联，但这并非必须。在其它一些实例中，已知将或已经响应活性剂而出现的突变体多肽在与促进其抗原性的佐剂相关联时是免疫原性的。

在本文中使用时，“佐剂”包括，例如，针对Toll样受体(TLR)的激动剂配体，所述Toll样受体能引发先天免疫的细胞因子应答，并被报道为与抗原呈递细胞(APC)的成熟和活化相关；CpG核苷酸序列；单链或双链RNA(TLR7抗原)；脂类部分，例如脂多糖(LPS)；甘露聚糖和葡聚糖，这是酵母的组分(其被报道通过与TLR 2、4和6的相互作用发挥功能)；以及酵母运载体，例如本文描述的那些。

将突变体多肽或编码突变体多肽的核酸(其可通过本文公开的或本领域已知的任何方法来制备)与活性剂“联合”施用并不意味着突变体多肽要和活性剂同时施用，虽然同时施用也包括在本文公开的方法内。突变体多肽可在活性剂施用之前、同时或之后施用，或者可以是上述的组合。突变体多肽或编码突变体多肽的核酸可在施用活性剂后数小时、数日或数月后施用。在一些实例中，突变体多肽或编码突变体多肽的核酸(其可通过本文公开的或本领域已知的任何方法来制备)的施用在活性剂施用前进行，并且可在施用活性剂后再额外施用，特别是已知活性剂会直接或间接干扰任何类型的细胞的增殖的情况下。

如本文中使用的，“模拟物”指能够模拟肽或多肽引发针对靶多肽或表达靶多肽的细胞的免疫应答(在一些实例中，是细胞和/或体液免疫应答)的能力的肽表位。如本文中使用的，“模拟物”包括但不限于，模拟突变多肽蛋白质的一个或多个表位的肽，所述突变多肽蛋白质已知将或已经响应治疗和/或预防剂的施用而出现，并具有特定突变。可以利用计算机生成的MHC-肽复合体结构，和与T细胞受体的假定结合位点来设计此类模拟物。还可以通过本文中描述的和本领域已知的方法和测定，产生分子(例如寡核苷酸、肽或其它有机分子)的随机样品，并筛选此类样品引发免疫应答(例如细胞免疫应答)的能力来获得模拟物。

在本文中使用时，“减轻疾病或感染的症状”包括缓和、稳定、逆转、减慢或延迟任何症状和/或疾病状态的发展，这可通过临床和/或亚临床标准来测量。

在一些实例中，突变体多肽(或其模拟物)或编码突变体多肽的核酸的“有效量”指当施用给哺乳动物时能引发免疫应答的量。在一些实例中，免疫应答是细胞免疫应答。在其它一些实例中，免疫应答是体液应答。在一些实例中，免疫应答是细胞和体液应答。

在本文中使用时，“哺乳动物”、“哺乳动物的”或“哺乳动物宿主”包括人和非人灵长类，例如黑猩猩或其它猿类和猴类物种；畜牧动物，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家养、野生和竞技鸟类，例如鸡、火鸡和其它家禽鸟，鸭、鹅等。该术语并不指代特定年龄。因此，成年、青年和新生个体和未出生哺乳动物都被包括在内。

“抗原”指含有一个或多个表位(线性、构象或两者均是)或免疫原性决定子的分子，其将刺激宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统，以产生抗原特异性体液和/或细胞抗原特异性应答。抗原可以自身是“免疫原”或与促进其抗原性的物质联合。术语“抗原”包括整个蛋白质、截短的蛋白质、蛋白质片段、肽和肽模拟物。抗原可以是天然存在的或经遗传改造的蛋白质变体。抗原可以是天然存在的或经遗传改造的蛋白质变体。术语“抗原”包括亚基抗原(即，从抗原在自然中相关联的整个生物体分离并分隔的抗原)。抗体(例如抗独特型抗体)或其片段以及合成的肽模拟物(是可模拟抗原或抗原决定簇的合成肽)也包括在本文使用的抗原的定义内。在一些实例中，抗原包括突变体多肽，或者抗原可从突变体多肽获得，所述突变体多肽已知将或已经响应治疗和/或预防剂而出现，其具有特定突变，并且，所述抗原可以是天然存在的或合成的。抗原可以小至单个表位，或者更大，并且可包括多个表位。因此，抗原的大小可小至大约5-12个氨基酸(例如，肽)，大至全长蛋白质(包括多聚体和融合蛋白质)、嵌合蛋白质、整个细胞、整个微生物或其部分(例如整个细胞的裂解物或微生物的提取物)。应当认识到，在一些实例中(即，当抗原由载体(例如酵母载体)或病毒从重组核酸分子表达时)，抗原包括但不限于蛋白质或其片段、融合蛋白质、嵌合蛋白质、多聚体，而非整个细胞或微生物。

在本文中使用时，“表位”在本文中被定义为给定抗原中足以引发免疫应答(可以是细胞和/或体液免疫应答)的单个抗原性位点。本领域技术人员将认识到，T细胞表位的大小与组成同B细胞表位不同，并且通过I类主要组织相容性复合体(MHC)途径呈递的表位也不同于通过II类MHC途径呈递的表位。通常，B细胞表位将包括至少大约5个氨基酸，但是也可小至3-4个氨基酸。T细胞表位，例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位将包括至少大约7-10个氨基酸，辅助T细胞表位包括至少大约12-20个氨基酸。在本文中，抗原可以是对活化和扩增能够识别表达突变多肽的细胞的T细胞更有效的模拟物。通常，T细胞的识别将引发靶细胞消除的表位包括约7-15个氨基酸，例如8、9、10、12或15个氨基酸。

在本文中使用时，对突变体多肽(或其模拟物)或编码所述多肽的核酸(或能与所述突变体多肽结合的核酸，例如siRNA或反义RNA)或包含多肽或核酸的组合物的“免疫性应答”或“免疫应答”包括识别该多肽的细胞免疫应答在哺乳动物中的发展。在一些实例中，免疫应答是体液免疫应答。在一些实例中，细胞免疫应答额外包括体液免疫应答。免疫应答可以对突变体多肽是特异性的，但这并非必须。施用突变体多肽或编码该多肽的核酸引发的免疫应答，与没有施用多肽或核酸时的免疫应答相比，可以在免疫应答的任何方面(例如细胞应答、体液应答、细胞因子的产生)有任何可检测到的增加。免疫应答可以是突变体多肽特异性应答，但这并非必须。本发明包括与突变体多肽(或其模拟物)或编码突变体多肽的核酸相关联的组合物，其引发免疫应答。

在本文中使用时，“体液免疫应答”指抗体分子或免疫球蛋白介导的免疫应答。本发明的抗体分子包括IgG(以及IgG1、IgG2a和IgG2b亚型)、IgM、IgA、IgD和IgE类。抗体从功能上包括初次免疫应答的抗体以及记忆抗体应答的抗体或血清中和抗体。在感染性疾病的方面，本发明的抗体可用于(但并非必须)中和或降低编码突变体多肽的病毒的感染性和/或介导抗体补体，或抗体依赖性细胞针对突变体多肽的细胞毒性(ADCC)。

在本文中使用时，“细胞免疫应答”是T淋巴细胞和/或其它白细胞(包括但不限于天然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞)介导的。本发明的T淋巴细胞包括表达α/βT细胞受体亚基的T细胞或表达γ/δ受体的T细胞，并且可以是效应T细胞或阻抑性T细胞。

在本文中使用时，“T淋巴细胞”或“T细胞”是非抗体产生型淋巴细胞，其组成了免疫系统的细胞介导臂的一部分。T细胞产生自未成熟的淋巴细胞，其从骨髓移到胸腺，在那里它们在胸腺激素指导下经历成熟过程。成熟T细胞基于其识别和结合特定抗原的能力变为免疫活性的。当抗原与淋巴细胞表面受体结合时，就触发了对免疫活性T细胞的活化。已知，为了产生T细胞应答，必须在细胞中合成抗原或将抗原引入细胞，随后通过蛋白酶体复合体将其加工为小肽，再转移到内质网/高尔基复合体分泌途径中，以最终与主要组织相容性复合体(MHC)I类蛋白质结合。可选地，肽抗原可被从细胞外引入，以替换已结合进MHC-1或MHC-II受体的肽。功能上讲，细胞免疫性包括抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。

在本文中使用时，“抗原特异性杀伤T细胞”、“CTL”或“细胞毒性T细胞”在本文中使用时是指针对下述呈递的肽抗原具有特异性的细胞，所述肽抗原是与MHC的蛋白质或者(当在人中提到所述蛋白质时)人白细胞抗原(HLA)相关联。本发明的CTL包括活化的CTL(这是已通过MHC方面的特定抗原触发的)；记忆CTL(memory CTL)或回忆CTL(recalCTL)(指再次暴露给抗原后被重新活化的T细胞)以及交叉反应性或交叉分支(cross clade)CTL。本发明的CTL包括CD4+和CD8+T细胞。本发明的经活化的抗原特异性CTL能促进对被病原体(对其来说CTL是特异性的)感染的受试者细胞的裂解和/或破坏，促进对病原体通过分泌趋化因子和细胞因子(包括但不限于巨噬细胞炎性蛋白质1α(MIP-1α)、MIP-1β和RANTES)进入的阻断；以及促进遏制感染的可溶因子分泌。本发明的细胞免疫性还指T细胞的T辅助性细胞亚型产生的抗原特异性应答。辅助性T细胞作用于协助刺激该功能，并且将非特异性效应细胞的活性集中针对在其表面展示出与MHC分子相关的肽的细胞。细胞免疫应答还指细胞因子、趋化因子和经活化T细胞和/或其它白细胞产生的其它此类分子(包括从CD4和CD8T细胞和NK细胞获得的那些)的产生。引发细胞免疫应答的组合物可用于使哺乳动物敏感化，这是通过在细胞表面呈递与MHC分子相关的多肽实现的。细胞介导的免疫应答被指导至在或靠近其表面呈递出抗原的细胞。此外，可产生抗原特异性T淋巴细胞，以允许对经免疫的宿主的后续保护。

特定多肽或抗原刺激细胞介导的免疫性应答的能力可通过本领域已知的多种测定来确定，例如通过淋巴组织增生(淋巴细胞活化)测定、CTL杀伤测定或通过在经敏感化的受试者中对抗原特异的T淋巴细胞进行测定来进行。见，例如Erickson等人，J.Immunol.(1993)151：4189-4199；Doe等人，Eur.J.Immunol.(1994)24：2369-2376。测量细胞介导的免疫应答的其它方法包括对细胞内细胞因子或T细胞群导致的细胞因子分泌进行测量，或通过测量表位特异性T细胞来进行(例如，通过四聚体技术)(综述见McMichael，A.J.，和O′Callaghan，C.A.，J.Exp.Med.187(9)1367-1371，1998；Mcheyzer-Williams，M.G.，等人，Immunol.Rev.150：5-21，1996；Lalvani，A.，等人，J.Exp.Med.186：859-865，1997)。

在本文中使用时，“免疫性应答”或“免疫应答”包括下述这些：刺激CTL产生和/或辅助性T细胞的产生或活化和/或抗体介导的免疫应答。“T淋巴细胞”或“T细胞”是非抗体产生型淋巴细胞，其组成了免疫系统的细胞介导臂(arm of the immune system)的一部分。T细胞产生自未成熟的淋巴细胞，其从骨髓移到胸腺，在那里它们在胸腺激素指导下经历成熟过程。在此，成熟淋巴细胞迅速分裂增加至非常大的数量。成熟T细胞基于其识别和结合特异性抗原的能力变为免疫活性的。在MHC/HLA受体和共受体呈递的方面，当抗原与淋巴细胞表面受体结合，就触发了对免疫活性T细胞的活化。

在本文中使用时，“免疫原性组合物”是包含突变体多肽(或包括其突变的表位的模拟物)或编码突变体多肽的核酸的组合物，所述突变体多肽已知将或已经响应治疗性和/或预防剂而出现，其具有特定突变，所述“免疫原性组合物”可以或可以不包含促进突变体多肽的抗原性的佐剂，其中，向哺乳动物施用所述组合物导致细胞免疫应答、体液免疫应答或者细胞和体液免疫应答的发展。免疫原性组合物包括能引发保护性细胞免疫应答的组合物，但这并非必须。

在本文中使用时，“预防性组合物”指这样的组合物，其被施用给“未经历免疫(immunologically naive)”或以前没有暴露给病原体的抗原的哺乳动物受试者或宿主，或者没有产生对于病原体的有效免疫应答的哺乳动物受试者或宿主，以预防疾病，例如癌症和感染或再次感染(但是本发明不一定需要完全预防感染或再次感染)。本发明的预防性组合物不一定要在施用它们的受试者或宿主中产生杀菌免疫性。

在本文中使用时，“治疗性组合物”指这样的组合物，其被施用给正遭受癌症，以及在一些实例中，已发展为疾病状态的宿主或受试者。

在本文中使用时，术语“免疫(immunization)”“免疫(immunize)”“被免疫(immunized)”指向活的哺乳动物受试者或宿主施用免疫原性组合物的过程，施用的量是有效诱导对所述组合物的免疫应答的量。在一些实例中，免疫应答包括细胞免疫应答，例如细胞毒性T细胞应答。在一些实例中，免疫应答包括体液应答，例如抗体产生。在一些实例中，免疫应答既包括细胞应答又包括体液应答。

基于酵母的组合物和方法

本发明提供了酵母载体、酵母运载体和基于酵母的组合物，其包含已知将或已经响应活性剂而出现的具有特定突变的突变体多肽。在本文中使用时，术语“酵母载体”和“酵母运载体”可互换使用，其包括但不限于，整个酵母、酵母原生质球、酵母胞质体、酵母菌蜕或亚细胞酵母膜提取物或其部分。在另一些实例中，用酵母细胞或酵母原生质球来制备酵母运载体，在一些实例中，所述运载体包含编码突变体多肽的核酸分子，使得该多肽可被酵母细胞或酵母原生质球表达。在一些实例中，酵母运载体可从非病原性酵母获得。在其它一些实例中，酵母运载体可从选自酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)和毕赤酵母属(Pichia)的酵母获得。在一些实例中，酵母属是酿酒酵母(S.cerevisiae)。

通常，酵母运载体和突变体多肽可通过本文描述的任何技术相关联。在一些实例中，向酵母运载体细胞内装载突变体多肽。在其它一些实例中，突变体多肽通过共价或非共价方式附着到酵母运载体上。在还有其它一些实例中，酵母运载体和突变体多肽通过混合相关联。在其它一些实例中，突变体多肽由酵母运载体或酵母运载体所来源的酵母细胞或酵母原生质球重组表达。

因此，本发明提供了酵母运载体，其包括任何酵母细胞(例如整个的或完整的细胞)或其衍生物，其可与突变体多肽在组合物中联合使用，或者作为佐剂使用。酵母运载体因此可包括但不限于：活的完整酵母微生物(即，具有其所有组分，包括细胞壁在内的酵母细胞)、被杀死的(死的)完整酵母微生物或其衍生物，包括：酵母原生质球(即，缺少细胞壁的酵母细胞)、酵母胞质体(即，缺少细胞壁和核的酵母细胞)、酵母菌蜕(即，缺少细胞壁、核和胞质的酵母细胞)或者亚细胞酵母膜提取物或其部分(以前也被称为亚细胞酵母颗粒)。

通常，通过酶促消化酵母细胞壁来生产酵母原生质球。此类方法被描述于，例如，Franzusoff等人，Meth.Enzymol.194(1991)，662-674中。通常，通过酵母细胞去核来生产酵母胞质体。此类方法被描述于，例如，Coon，Natl.Cancer Inst.Monogr.48，45-55(1978)中。通常，通过重新填封(reseal)透化的或裂解的细胞来生产酵母菌蜕，但是酵母菌蜕可以但无需含有该细胞的至少一些细胞器。此类方法被描述于，例如Franzusoff等人，J Biol.Chem.258，3608-3614(1983)和Bussey等人，Biochim.Biophys.Acta553，185-196(1979)中。亚细胞酵母膜提取物或其部分指缺少天然核或胞质的酵母膜。颗粒可以是任何大小的，其大小范围包括从天然酵母膜到通过超声处理或本领域技术人员已知的其它膜破裂方法在重新填封后生产的微粒。用于生产亚细胞酵母膜提取物的方法被描述于，例如Franzusoff等人，Meth.Enzymol.194，662-674(1991)中。人们还可以使用含有酵母膜部分的酵母膜提取物部分，当在制备酵母膜提取物之前酵母重组表达抗原时，感兴趣的抗原是提取物的一部分。还可对酵母进行电穿孔，或者可向其装载靶标抗原，例如肽。

任何酵母菌株可用于生产本发明的酵母运载体。酵母是属于以下三个纲之一的单细胞微生物：子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)和半知菌类(Fungi Imperfecti)。虽然可以使用病原性酵母菌株或其非病原性突变体，但在一些实例中，使用非病原性酵母菌株。用于本文公开的组合物和方法的酵母菌株的属包括酵母属、假丝酵母属(其可以是病原性的)、隐球酵母属(Cryptococcus)、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、红酵母属(Rhodotorula)、裂殖酵母属和耶氏酵母属(Yarrowia)。在一些实例中，酵母菌株包括酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和裂殖酵母属。在一些实例中，酵母菌株是酵母属。酵母菌株的物种包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、白假丝酵母(Candida albicans)、乳酒假丝酵母(Candidakefyr)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、罗伦隐球酵母(Cryptococcnslaurentii)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、乳酸马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus var.lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、深红酵母(Rhodotorula rubra)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。应当认识到，这些物种的很多都包括多种不同的亚种、型、亚型等，这些都被包括在前述物种中。在一些实例中，酵母物种包括酿酒酵母(S.cerevisiae)、白假丝酵母(C.albicans)、多形汉逊酵母(H.polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)和粟酒裂殖酵母(S.pombe)。在一些实例中，使用酿酒酵母，因为其相对容易被操作，并且对于用作为食品添加剂来说是“通常认为安全的”或“GRAS”(GRAS，FDA建议规章(FDA proposed Rule)62FR18938，1997年4月17日)。在一些实例中，使用能将质粒复制为特别高的拷贝数的酵母菌株，例如酿酒酵母cir°菌株。其它可用的菌株是本领域已知的。

在一些实例中，本发明的酵母运载体能与酵母运载体和突变体多肽被递送至的细胞类型(例如树突细胞或巨噬细胞)融合，由此实现特别高效地向该细胞类型递送酵母运载体以及(在一些实例中)抗原。在本文中使用时，酵母运载体与靶向细胞类型的融合指酵母细胞膜或其颗粒与靶向细胞类型(例如树突细胞或巨噬细胞)的膜融合，导致合胞体(syncytia)形成的能力。在本文中使用时，合胞体是细胞合并产生的多核原生质物质。但是应当注意，靶标或融合部分掺入酵母运载体并非必须，虽然在某些情况下这可能是人们想要的。已经显示，酵母运载体易于被树突细胞(以及其它细胞，例如巨噬细胞)吸收。

可在施用之前将酵母运载体直接配制进基于酵母的组合物(包括意欲直接施用给遭受癌症或感染或处于癌症或感染的风险的个体的组合物)，或首先离体装载进介载体(carrier)，例如树突细胞，这是用本领域技术人员已知的多种技术来进行的。

本发明提供了包含至少一种突变体多肽的酵母运载体以及包含它们的组合物，用于施用给哺乳动物。还提供了酵母运载体和包含它们的组合物，包括两种或三种用于向动物施用的突变多肽。这将包括含有突变多肽的基于酵母的疫苗，所述突变多肽具有对已知的或预期的靶向剂或预防剂的1、2、3种或更多种的逃逸突变。在一个方面，酵母运载体含有一种逃逸突变。在其他方面，酵母运载体含有两种逃逸突变。在其他方面，酵母运载体含有三种逃逸突变。

在一些实例中，组合物包含下述中的一种或多种：i)酵母运载体，其包含下述核酸，所述核酸编码至少一种突变体多肽、包含突变的其片段或模拟物；ii)酵母运载体，其包含至少一种突变体多肽、包含突变的其片段或模拟物；iii)酵母运载体，其与至少一种突变体多肽、包含突变的其片段或模拟物相关联；iv)细胞内装载进树突细胞的酵母运载体，其包含下述核酸，所述核酸编码至少一种突变体多肽、包含突变的其片段或模拟物；或v)细胞内装载进树突细胞的酵母运载体和至少一种突变体多肽、包含突变的其片段或模拟物，其中，所述突变体多肽已知将或已经响应靶向的治疗和/或预防剂的施用而出现，其具有至少一种特定突变。

此类组合物可包括一种、两种、几种、若干种或多种突变体多肽，所述突变体多肽包括描述的一种或多种突变体多肽的一个或多个免疫原性结构域。在本文中使用时，多肽包括“抗原”。在本文中使用时，抗原包括蛋白质(其中，该蛋白质是天然存在或合成获得的)的任何部分(肽、蛋白质片段、全长蛋白质)、细胞组合物(整个细胞、细胞裂解物或破裂的细胞)、生物(整个生物、裂解物或破裂的细胞)、糖类、脂类或其它分子或其部分，其中抗原引发抗原特异性免疫应答(体液和/或细胞免疫应答)。

酵母展示出免疫刺激复合物的多种特殊特征，并且具有额外的好处：它们天然具有类似佐剂的性质，可以很容易地被改造，以表达多种多肽(包括抗原)。Lu等人，Cancer Research 64，5084-5088(2004)表明，基于酵母的免疫疗法能引发细胞介导的、针对表达携有单个氨基酸突变的Ras癌蛋白质的肿瘤的免疫应答。结果证实了酵母运载体和基于酵母的系统将免疫疗法靶向于针对携带有单个氨基酸突变的多肽的能力。因此，本发明提供了包含突变体多肽的酵母运载体和基于酵母的组合物，所述突变体多肽已知将或其已经响应活性剂而出现，本发明还提供了使用它们来引发对于突变体多肽的免疫应答的方法。在一些实例中，免疫应答是细胞免疫应答。在一些实例中，免疫应答是体液应答。在其它一些实例中，免疫应答是细胞和体液的。在另一些实例中，酵母运载体经过改造，向想要的细胞类型选择性递送抗原。本发明还提供了包含下述酵母菌株的酵母运载体，所述酵母菌株能生产具有氨基二羧酸加工位点的异源前体蛋白质。此类酵母菌株能将前体蛋白质正确加工为至少一种切割产物蛋白质。

在一些实例中，突变体多肽由癌基因(例如Ras)编码。在一些实例中，突变体多肽是肿瘤相关抗原或癌细胞表达的蛋白质。

载体的制备

本发明提供了包含与突变体多肽相关联的载体(例如酵母运载体)的组合物。此类相关联包括：多肽由载体(例如，由重组酵母)表达、将突变体多肽引入载体、将突变体多肽对载体的物理附着、以及将载体与突变体多肽混合到一起，例如在缓冲液或用于配制的其它溶液中。此类方法是本领域技术人员常规使用的。

下面通过阐释的方式来描述酵母载体。在一些实例中，用编码突变体多肽的异源核酸分子转化用于制备酵母运载体的酵母细胞，使得该多肽由酵母细胞表达。此类酵母在本文中也被称为重组酵母或重组酵母运载体。然后可将酵母细胞装载进作为完整细胞的树突细胞，酵母细胞可被杀死，或者其可例如通过形成酵母原生质球、胞质体、菌蜕或亚细胞颗粒被衍生化，上述任何步骤之后是将所述衍生物装载进树突细胞。还可用重组核酸分子直接转染酵母原生质球(例如，从整个酵母生产的原生质球，然后进行转染)，以生产出表达抗原的重组原生质球。

根据本发明，经分离的核酸分子或核酸序列是已从其天然相连的至少一种成分移开的核酸分子或序列。因此，“经分离的”并不一定反映核酸分子被纯化的程度。可用于转染载体，例如酵母运载体的经分离的核酸分子包括DNA、RNA、或DNA或RNA的衍生物。经分离的核酸分子可以是双链或单链的。可用于本发明的经分离的核酸分子包括编码蛋白质或其片段的核酸分子，只要该片段含有可用于本发明的组合物中的至少一种表位即可。

可通过本领域已知的任何方法将核酸分子转化入载体，例如酵母运载体，所述方法包括但不限于，扩散、主动转运、脂质体融合、电穿孔、浴槽式超声处理和遗传工程。

转化入酵母运载体的核酸分子可包括编码一种或多种突变体多肽的核酸序列。此类核酸分子可包含部分或完全的编码区域、调控区域或其组合。酵母菌株的一个优点在于它们携带大量核酸分子的能力以及能够产生多种异源蛋白质的能力。在一些实例中，待由酵母运载体生产的抗原的数量是可由酵母运载体合理生产的抗原的任何数量，其一般在至少1至至少大约5或更多的范围。在一个实例中，酵母运载体生产约2种至约5种抗原。

酵母运载体内核酸分子编码的突变体多肽可以是全长蛋白质，或者可以是功能性等价蛋白质，在所述功能性等价蛋白质中氨基酸已被缺失(例如蛋白质的截短模式)、插入、倒位(invert)、取代和/或衍生化(例如，乙酰化、糖基化、磷酸化、拴系甘油磷脂酰肌醇(GPI)锚)，使得经修饰的蛋白质具有与天然蛋白质基本上相似的生物学功能(或者，根据需要，与天然蛋白质相比，具有增强的或受到抑制的功能)。修饰可通过本领域已知的技术来完成，所述技术包括但不限于，对蛋白质进行直接修饰或者对编码蛋白质的核酸序列进行修饰，这使用例如经典或重组DNA技术，以实现随机或靶向诱变。

载体中突变体多肽的表达用本领域技术人员已知的技术来完成。简言之，以使得核酸分子与转录控制序列有效连接的方式，将编码至少一种想要的突变体多肽的核酸分子插入表达载体，使得当转化进宿主酵母细胞时，能够实现核酸分子组成型地或受调控地表达。编码一种或多种突变体多肽的核酸分子在一个或多个表达载体上，其与一种或多种转录控制序列有效连接。

在本发明的重组分子中，核酸分子与含有调控序列(例如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点和与载体相容且能控制核酸分子表达的其它调控序列)的表达载体有效连接。具体而言，本发明的重组分子包括与一种或多种转录控制序列有效连接的核酸分子。短语“有效连接”指：以使得在转染(即，转化、转导或转染)进宿主细胞时该分子能够表达的方式，将核酸分子与转录控制序列相连。

能控制产生的蛋白质的量的转录控制序列包括控制转录起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的序列，例如启动子和上游活化序列。也被称为增强子的多种上游活化序列(UAS)是已知的，并且可用于载体中。

将核酸分子转染进载体可通过将核酸分子放入细胞的任何方法来完成，所述方法包括但不限于：扩散、主动转运、浴槽式超声波处理、电穿孔、显微注射、脂质体转染、吸附和原生质体融合。可使用本领域技术人员已知的技术将经转染的核酸分子整合进染色体，或者保持在染色体外的载体上。在酵母的情况下，酵母胞质体、酵母菌蜕和亚细胞酵母膜提取物或其部分还可通过下述方法重组生产：用想要的核酸分子转染完整的酵母微生物或酵母原生质球，在其中生产抗原，然后再使用本领域技术人员已知的技术对微生物或原生质球进行进一步操作，以生产含有想要的抗原的胞质体、菌蜕或亚细胞酵母膜提取物或其部分。

生产重组载体以及通过载体表达突变体多肽的有效条件包括在其中培养载体的有效培养基。通常，有效培养基是包含可同化的糖类、氮源和磷源以及合适的盐、矿物质、金属和其它营养物(例如维生素和生长因子)的含水培养基。培养基可包含复合营养物，或其可以是确定成分基本培养基。可在多种容器(包括生物反应器、锥形瓶、试管、微量滴定皿和培养平板(petri plate))中培养本发明的载体。培养在适合酵母菌株的温度、pH和氧含量下进行。此类培养条件是本领域普通技术人员专业上熟知的(见，例如Guthrie等人(编)，1991，Methods in Enzymology，194卷，AcademicPress，San Diego)。

在本发明的一个实例中，作为在载体中表达突变多肽的备选，向载体，例如酵母运载体胞内装载突变多肽，或作为表位而发挥作用的肽或模拟物，其中所述表位用于激活抗具有突变多肽的细胞的T细胞介导的免疫应答。随后，可以将目前细胞内含有对突变多肽特异的表位的载体施用给患者，或装载到介载体中，例如树突细胞(如下述)。在酵母运载体的方面，可通过本领域技术人员已知的技术，例如扩散、主动转运、脂质体融合、电穿孔、吞噬作用、冷冻-解冻循环和浴槽式超声处理，将突变体多肽直接插入本发明的酵母运载体中。

可直接装载突变体多肽或靶向突变的表位的肽的酵母运载体包括完整酵母以及原生质球、菌蜕和胞质体，其可在产生之后，但在装载进树突细胞之前装载上抗原。可选地，可在完整酵母上装载抗原，然后从其来制备原生质球、菌蜕、胞质体或亚细胞颗粒。可向酵母运载体装载任何数量的抗原，从至少1、2、3、4或任何整数直到数百或数千抗原，所述抗原是例如通过装载微生物，通过装载哺乳动物肿瘤细胞，或其部分来提供的。

在另一实例中，将突变体抗原与载体(例如酵母运载体)物理附着。突变体多肽对载体的物理附着可通过本领域中合适的任何方法来完成，包括共价和非共价关联方法，其包括但不限于，将突变体多肽与载体外表面化学交联，或者将突变体多肽与载体外表面生物学连接，例如通过使用抗体或其它结合配偶体来进行。化学交联可例如通过下述方法来实现，所述方法包括戊二醛连接、光亲和标记、用碳二亚胺处理、用能连接二硫键的化学物质处理以及用本领域中标准的其它交联化学物质处理。备选地，在酵母的情况下，可将化学物质与酵母运载体接触，改变酵母膜脂双层的电荷或细胞壁的组成，使得酵母外表面更容易与具有特定电荷性质的抗原融合或结合。靶向剂，例如抗体、结合肽、可溶受体和其它配体也可作为融合蛋白质或者另外与抗原相连而被掺入进突变体抗原，以用于将抗原与载体结合。

在又一实例中，载体和突变体多肽通过更被动、非特异性或非共价的结合机制互相关联起来，所述机制例如是通过在缓冲液或其它合适配方中温和地将载体和抗原混合到一起。

在本发明的一些实例中，将载体和突变体抗原都细胞内装载进介载体(例如树突细胞或巨噬细胞)，以形成免疫原性组合物。树突细胞可以是本领域已知的任何树突细胞。树突细胞是单核细胞和淋巴细胞谱系的，已知其是最具潜能的抗原呈递细胞(APC)，能刺激抗原特异性T细胞应答。通常，成熟的树突细胞被鉴定为具有下述细胞表面标记表型：MAC3^-、CD80⁺、CD83⁺、CD86⁺、CD401°w、CD54⁺、MHC I类和MHC II类，并且所述细胞能摄取FITC-右旋葡聚糖(dextran)。用于本发明的组合物中的树突细胞在一些实例中是从待施用所述组合物的患者中分离的(即，自体细胞)。可从骨髓或外周血分离树突细胞。例如可通过在存在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，例如IL-4和TNF-α的情况下进行培养，从外周血单核细胞产生此类细胞。用于分离和产生树突细胞的其它方法是本领域已知的(见，例如Wilson等人，1999，Immunol 162：3070-8、Romani等人，1994，J.Exp Med 180：83-93、Cauxetal.，1996，J.Exp Med 184：695-706和Kiertscher等人，1996，J Leukoc.Biol 59：208-18)。

为使树突细胞能够有效将抗原呈递给天然T细胞，必需将未成熟的树突细胞活化至成熟，这是通过MHC和共激分子的上调来定义的。酵母通过Toll样受体(TLR)和吞噬受体(见，例如D.M.Underhill和B.Gantner，2004，Microbes and Infection第6卷：第1368-1373页；Takeda K.和Akira S.，2005，International Immunology，17卷：第1-14页)、甘露聚糖、葡聚糖和dectin受体，提供了对树突细胞的有力活化刺激，这导致共激免疫受体、MHC分子的上调和免疫调节细胞因子的分泌。此外，当在装载到树突细胞之前给酵母预装载抗原时，为树突细胞提供了处于不同的、浓缩的包装中的抗原，所述抗原被良好的内化从而有效增加了可用于加工的抗原的量。如本领域技术人员所能够认识到的，可用额外的载体装载树突细胞。

下文将更详细讨论其中可实现装载两种组分的多种形式。在本文中使用时，术语“装载”及其派生词指将组分(例如酵母运载体和/或抗原)插入、引入或使其进入细胞(例如树突细胞)。细胞内装载组分是指将组分插入或引入到细胞的细胞内区室中(例如，通过质膜，最少要进入胞质、吞噬体、溶酶体或细胞的一些细胞内空间)。为将组分装载进细胞，参考用来迫使组分进入细胞(例如通过电穿孔)或者将组分放置于使得该组分充分可能通过一定的过程(例如吞噬作用)进入细胞的环境(例如，与细胞接触或靠近细胞)中的任何技术。装载技术包括但不限于扩散、主动转运、脂质体融合、电穿孔、吞噬作用和浴槽式超声处理。在一些实例中，使用用于用酵母运载体和/或抗原装载树突细胞的被动机制，此类被动机制包括树突细胞对酵母运载体和/或抗原的吞噬作用。

在酵母的情况下，可将酵母运载体和突变体多肽几乎在同样时间或同时装载进树突细胞，虽然也可能将一种组分装载进细胞，随后在一定时间后装载另一样。在一些实例中，在装载进树突细胞之前将酵母运载体和突变体多肽彼此相关联。例如，可将表达突变体多肽的重组酵母运载体或酵母运载体和突变体多肽的任何其它复合体或混合物装载进树突细胞。树突细胞可额外用游离的突变体多肽装载，所述多肽即当引入(装载进)树突细胞时不直接与酵母运载体相关联的多肽。游离多肽与酵母运载体-抗原复合体的加入可额外增强针对多肽的免疫应答。装载进树突细胞的游离多肽无须与酵母运载体所表达的、装载进酵母运载体或与酵母运载体另外相关联的那些相同。以这种方式，可以增强针对靶标细胞的免疫应答。

在一些实例中，包含突变体多肽或编码其的核酸的组合物包含一种或多种佐剂(包括本文描述的那些)和/或介载体，虽然这并非必须。通常，佐剂是通常能增强动物对于特定抗原的免疫应答的物质。合适的佐剂包括但不限于：本文所述的TLR激动剂、CpG序列(见，例如Krieg等人WO96/02555)、单链RNA、双链RNA、弗氏佐剂、其它细菌细胞壁组分(包括LPS、鞭毛蛋白)、基于铝的盐、基于钙的盐、硅石、多核苷酸、类毒素、血清蛋白、病毒外壳蛋白、其它来源于细菌的制品、γ干扰素、嵌段共聚物佐剂(例如Hunter′s Titermax佐剂(诺克劳斯，Ga.CytRx.TM.有限公司(CytRx.TM.，Inc.Norcross，Ga.)))、Ribi佐剂(可从蒙特汉密尔顿Ribi免疫化学研究有限公司(Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Mont.)获得)和皂苷类及其衍生物，例如Quil A(可从丹麦苏波佛生物公司A/S(Superfos Biosector A/S，Denmark)获得)。

通常，介载体是增加被治疗动物中治疗性组合物半寿期的化合物。合适的介载体包括但不限于：聚合的受控释放制品(formulation)、生物可降解植入物、脂质体、油类、酯和二元醇。

本发明的免疫原性组合物还可包含一种或多种可药用赋形剂。在本文中使用时，“可药用赋形剂”指适合将可用于本发明方法的组合物递送至合适的体内或离体位点的任何物质。在一些实例中，可药用赋形剂能将载体(或包含载体的树突细胞)保持为一定形式，使载体或细胞到达体内的靶标细胞、组织或位点时，载体(与突变体多肽相关联)或树突细胞(装载有载体和突变体抗原)能在靶标位点(注意：靶标位点可以是合成的)引发免疫应答，包括细胞免疫应答、体液免疫应答或两者均有。本发明的合适赋形剂包括转运组合物或疫苗，但并不特异性将组合物或疫苗靶向至位点的赋形剂或配方集(formulary)(在本文中还被称为非靶向介载体)。可药用赋形剂的实例包括但不限于：水、盐水、磷酸缓冲盐溶液、林格溶液、右旋糖(dextrose)溶液、含血清溶液、Hank′s溶液、其它含水生理平衡溶液、油类、酯和二元醇(glycol)。含水介载体可含有接近受体生理条件所需的合适辅助物质，例如通过增强化学稳定性和等渗性来实现。合适的辅助物质包括，例如，乙酸钠、氯化纳、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和用于生产磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和碳酸氢盐缓冲液的其它物质。辅助性物质还可包含防腐剂，例如硫柳汞、间或邻甲酚、福尔马林和苯甲醇。

癌症

在本文中使用时，癌症包括任何类型的肿瘤或瘤形成(neoplasia)，其包括但不限于结肠直肠癌、黑素瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈部癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、血管肉瘤(angiosarcomas)、血管肉瘤(hemangiosarcomas)、肥大细胞瘤、原发性肝癌、肺癌、胰腺癌、胃肠癌、肾细胞癌、造血瘤形成及其转移性癌。本发明认为白血病属于其“癌症”的定义范围内。慢性髓性白血病是一种类型的癌症，考虑在其治疗和预防中使用本发明。

特异性癌抗原的实例包括但不限于：MAGE(包括但不限于MAGE3、MAGEA6、MAGEA10)、NY-ESO-1、gp100、酪氨酸酶、EGFR、PSA、PSMA、VEG-F、PDGFR、KIT、PMSA、CEA、HER2/neu、Muc-1、hTERT、MART1、TRP-1、TRP-2、Bcr-Abl和p53(TP53)的突变体致癌形式、p73、Ras、Raf、PTENSrc、p38、BRAF、APC(腺瘤性结肠息肉病)、myc、VHL(von Hippel Lindau蛋白质)、Rb-1(成视网膜细胞瘤)、Rb-2、BRCA1、BRCA2、AR(雄激素受体)、Smad4、MDR1和FLT3。

在一些实例中，癌抗原是适合治疗和/或预防剂靶向的分子(例如，蛋白质、肽、糖蛋白或糖类)，或可从此类分子获得。针对治疗性和/或预防性癌症活性剂的分子靶标是本领域已知的，其包括但不限于：细胞表面受体(例如，受体酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶和受体酪氨酸激酶)、细胞内信号传导分子(例如细胞内酪氨酸激酶和其它二级信号分子)和转录因子、细胞周期调节子、蛋白酶体成分、血管发生中涉及的蛋白质、凋亡控制中涉及的蛋白质以及伴侣蛋白质。

已观察到，将治疗和/或预防剂靶向癌症导致逃逸突变体(即，突变体多肽)的存在。例如，在Bcr-Abl中发现了这样的突变，它们被报道为使以前应答于Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(格列卫)治疗的个体对这种治疗产生了抗性。Gorre等人，Science，293：876-880(2001)、Shah等人，Cancer Cell，2：117-125(2002)、Branford等人，Blood，99(9)：3742-3745(2002)、Deininger等人，Blood，105(7)：2640-263(2005)。类似地，已在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中发现了EGFR的突变，其使得患者对吉非替尼(易瑞沙)或埃罗替尼(特罗凯)的治疗产生抗性。Kobayashi等人，N.Engl.J.Med.，352(8)：786-792(2005)。因此，这些抗癌剂的有效性受到突变多肽出现的显著限制。

因此，本发明提供了免疫原性组合物，其包含癌基因编码的和/或癌细胞表达的突变体多肽或编码所述突变体多肽的核酸，所述突变体多肽已知将或已经响应治疗和/或预防剂的施用而出现且具有特定突变，本发明还提供了引发对于突变体多肽或表达突变体多肽的细胞的免疫应答的方法。在一些实例中，免疫应答是细胞免疫应答。在一些实例中，免疫应答是体液免疫应答。在其它一些实例中，免疫应答既包括细胞又包括体液应答。

癌抗原的多肽突变体可预先存在于哺乳动物中，即，在诊断时存在，并且作为治疗和/或预防剂施用的结果而选择性出现。备选地，多肽突变体可作为由所述活性剂所引起的压力的结果而出现。突变可以位于癌抗原的任何氨基酸位置。虽然多肽的突变被描述于关于单个突变的上下文中，但应当理解，突变体多肽可包含多于一个(例如两个、三个、四个、五个或更多)氨基酸突变。

在一些实例中，多肽突变体包含除Bcr-Abl连接区以外的突变。Bcr-Abl是由于染色体9和22之间的DNA易位，从而在Philadelphia染色体中融合了Bcr和Abl基因，导致的组成性激活的酪氨酸激酶。据报道，Bcr-Abl是慢性髓性白血病(CML)发病的因素，它的组成型激酶活性对其体内转化造血细胞的能力是关键的。酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(格列卫，2-苯基氨基嘧啶)，是CML的治疗剂。已经在体内和体外鉴定了Bcr-Abl中的多种导致蛋白质耐受药物治疗(例如，格列卫治疗)的逃逸突变。Deininger等人，Blood，105(7)：2640-2653(2005)；Azam等人，Cell，112：831-43(2003)。这些突变位于Bcr-Abl的多个结构域中，包括但不限于激酶结构域(例如P-环、A-环、T315、C-螺旋、SH3接触区域，或SH2接触区域)、帽结构域(cap domain)、SH3结构域、SH2结构域和其它连接区。在一个实施方案中，突变多肽包含E255K、T315I和M351T。在其它实施方案中，突变多肽包含T315I。在其它实施方案中，突变多肽包含E255K。在其它实施方案中，突变多肽包含M351T。还在其它实施方案中，突变多肽包含下列突变中两个的组合：E255K、T315I和M351T(例如，E255K/T315I或T315I/M351T或E255K/M351T)。在另一个实施方案中，逃逸突变是V299L。在另一个实施方案中，逃逸突变是T315A。在另一个实施方案中，逃逸突变是F317V。在另一个实施方案中，逃逸突变是F311I。关于对伊马替尼(格列卫)靶向逃逸突变的综述，参见例如WaIz等人，Critical Reviews in Oncology/Hematology 57：145-164(2006)和Burgess等人，TheScientificWorldJOURNAL，6：918-930(2006)。

癌抗原可以在不同的氨基酸位置含有一种或多种突变。对于Bcr-Abl及其对伊马替尼(格列卫)治疗的响应，本领域已经描述的多种逃逸突变。在一个方面，突变是T315I逃逸突变。在另一个方面，突变是E255K突变。在另一个方面，突变是M351T突变。在其它方面，突变是所有三种E255K、T315I和M351T的组合。在其它方面，突变是上文公开的三种突变中两种的组合(例如，E255K/T315I或T315I/M351T或E255K/M351T)。癌抗原还可以包含其它突变，例如与转化事件相关的突变。

在一些实例中，多肽突变体可以是包含多个免疫原性结构域的融合多肽，所述结构域来自癌抗原的一个或多个突变多肽。例如，已知Bcr-Abl蛋白中存在一些不同的突变，作为甚至是施用格列卫的逃逸突变而出现(例如，E255K、T315I、M351T、V299L、T315A、F317V或F311I)。突变多肽可以包含一个或多个Bcr-Abl突变，位于相同的位置和/或不同的位置和/或在一个以上的位置的突变的组合。

因此，在一个方面，发明提供了在需要其的个体中，靶向消除突变逃逸的方法，这是通过向个体施用有效量的靶向治疗剂和组合物，其中，组合物包括一种或多种下列物质：i)包含核酸的酵母运载体，所述核酸编码至少一种与癌症相关的突变多肽，其包含突变的片段，或模拟物；ii)包含至少一种与癌症相关的突变多肽，其包含突变的片段，或模拟物的酵母运载体；iii)与至少一种与癌症相关的突变多肽，其包含突变的片段，或模拟物相关联的酵母运载体；iv)细胞内装载入树突细胞的酵母运载体，其包含下述核酸，所述核酸编码至少一种与癌症相关的突变多肽，其包含突变的片段，或模拟物；或者v)细胞内装载入树突细胞的酵母运载体，和至少一种与癌症相关的突变多肽，其包含突变的片段，或模拟物，其中，所述突变多肽已知将或已经响应癌症的靶向治疗和/或预防剂的施用而出现，并具有至少一种特定的突变。

使用靶向治疗剂预防或治疗的癌症可以是任何类型的癌症。所述活性剂的非限制性实例是：酪氨酸激酶抑制剂、Src激酶抑制剂、双重的Src/Abl抑制剂、作用于Ras/Raf/Mek通路的活性剂、作用于PI3K通路的活性剂；对癌信号转导通路中涉及的伴侣蛋白质起作用的活性剂。治疗剂和靶向消除方法学的组合有效地消除了含有逃逸突变的细胞。许多现有的治疗剂在可以消除野生型表型的同时，不能消除具有逃逸突变的细胞。因此，当活性剂或靶向消除方法学单独使用时，不如它们彼此组合使用时使用它们来的有效。

作为酪氨酸激酶抑制剂发挥作用的靶向治疗剂的非限制性实例是：伊马替尼、尼罗替尼、PD1866326、PD180970、AP23464、BMS-354825、ON012380、VX-680和BIRB-796。

作为Src激酶抑制剂发挥作用的靶向治疗剂的非限制性实例是：PD166326、PD180970、AP23464、BMS-354825、AZM475271、PP1、PP2、AP-23236、CGP76030和PD173955。

影响癌症涉及的蛋白质(例如，Bcr-Abl)的稳定性的靶向治疗剂的非限制性实例包括与癌症涉及的蛋白质相关的热休克蛋白或其它伴侣蛋白质。在一些方面，活性剂是格尔德霉素/17-AAG或NVP-LAQ824。

靶向治疗剂还可以在Bcr-Abl的下游信号通路中发挥作用。认为在发明的范围内的信号通路的实例包括但不限于，Ras、Raf、Mek、Erk、Src、PI3K、PDK、ASK、mTOR。靶向上述信号通路的活性剂的非限制性实例包括：SCH66336、BAY-439006、CI-1040、LY294002、渥曼青霉素(wortmannin)、OSU-03012、CCI-779、R115777、BMS-214662、U0126、PD184352、雷帕霉素(rapamycin)、RAD001、CCI-779和AP23573。此外，靶向与这些通路激活相关的蛋白质的活性剂也认为在发明的范围内。例如，法尼基转移酶抑制剂如SCH66336、R115777和BMS-214662，可以与本文中描述的靶向消除方法学组合使用。

除了靶向蛋白质例如Bcr-Abl外，下文也将详细讨论针对其它靶(例如FLT3、PDGFR、VEGR、PKC和c-Kit)的其它癌症治疗剂。在一些实施方案中，D816V和V560G是可以被本文描述的方法学靶向的c-Kit中的逃逸突变。利用靶向消除突变逃逸可以和针对上述靶标和任何其它癌症抗原和/或与癌症相关的蛋白质的活性剂组合使用。例如，可以使用PKC412和sunitinib(SU11248)靶向FLT3、PDGFR、VEGR、PKC和c-Kit。突变逃逸的靶向消除还可以和治疗其它癌症的活性剂组合使用，所述癌症例如伊马替尼-抗性hypoeosiniphilic symdrome(HES)或胃肠间质瘤(GIST)。

在一些实例中，突变体多肽包含EGFR中的突变。EGFR是受体酪氨酸激酶，其在对正常细胞和癌细胞的细胞分裂的启始中发挥关键作用。据报道，在多种癌症(包括非小细胞肺癌(NSCLC)和成胶质细胞瘤(脑癌))中，EGFR过量表达或突变，并且相信这些改变与肿瘤形成和生长相关。两种口服苯胺喹唑啉类EGFR酪氨酸激酶抑制剂——吉非替尼(易瑞沙)和埃罗替尼(特罗凯)已在美国被批准用于治疗NSCLC。在EGFR中发现了逃逸突变——T790M，其被报道为使得哺乳动物受试者对易瑞沙或特罗凯的治疗产生抗性。因此，针对突变逃逸的靶向消除的使用也可以与易瑞沙或可选的，与特罗凯，组合使用，用于治疗已发展出对这些活性剂逃逸突变的个体。

因此，本发明提供了包含EGFR的突变体多肽(或其模拟物)或编码EGFR的核酸的组合物，以及使用它们引发免疫应答的方法。在一些实例中，免疫应答是细胞免疫应答。在一些实例中，免疫应答是体液免疫应答。在其它一些实例中，免疫应答既包括细胞又包括体液免疫应答。在一些实例中，突变体多肽包含EGFR激酶结构域中的突变。

在一些实例中，突变体多肽包含来自血小板的生长因子受体(PDGFR)中的突变。PDGFR是受体酪氨酸激酶。据报道，PDGFR的活化对于多种类型的癌症(例如成胶质细胞瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤和CML)的进展来说起关键作用。因此，本发明提供了包含PDGFR的突变体多肽(或其模拟物)或编码PDGFR的核酸的组合物，以及使用它们引发免疫应答的方法。在一些实例中，免疫应答是细胞免疫应答。在一些实例中，免疫应答是体液免疫应答。在其它一些实例中，免疫应答既包括细胞又包括体液免疫应答。在一些实例中，突变体多肽包含PDGFR激酶结构域中的突变。

在一些实例中，突变多肽包含在KIT中的突变。KIT是干细胞因子(SCF)的酪氨酸激酶受体。据报道，通过激酶结构域中的突变激活KIT与胃肠间质瘤(GIST)和其它类型的肿瘤相关。在用格列卫治疗的患者中，已经描述了c-kit中的频繁的逃逸突变，例如D816V或V560G。参见例如，Walz等人，Critical Reviews in Oncology/Hematology，57：145-164(2006)。因此，本发明提供了包含KIT的突变体多肽(或其模拟物)或编码KIT的核酸的组合物，以及使用它们引发免疫应答的方法。在一些实例中，免疫应答是细胞免疫应答。在一些实例中，免疫应答是体液免疫应答。在其它一些实例中，免疫应答既包括细胞又包括体液免疫应答。在一些实例中，突变体多肽包含KIT激酶结构域中的突变。在一些实例中，突变体多肽包含相对野生型KIT多肽而言的T670I突变。

因此，本文提供了包含此类突变体多肽(或其模拟物)，或编码突变体多肽的核酸的组合物，以及使用它们引发免疫应答的方法。在一些实例中，免疫应答是细胞免疫应答。在一些实例中，免疫应答是体液免疫应答。在其它实例中，免疫应答包括细胞和体液免疫应答。在一些实例中，突变体多肽是已知将或已经响应活性剂而出现的，且具有特定突变，其自身是免疫原性的，即不需要与佐剂相关联，但这不是必需的。在其它实例中，已知将或已经响应活性剂而出现的突变体多肽，在与促进其抗原性的佐剂相关联时是免疫原性的，所述佐剂例如Toll-样受体配体或激动剂，或CpG核苷酸序列，或其它载体或运载体，例如酵母运载体。

因此，本文中描述的组合物用于在哺乳动物中，引发针对突变体多肽的免疫应答，包括向哺乳动物组合施用有效量的组合物和靶向治疗和/或预防剂。在一些实例中，组合物包括一种或多种以下物质：i)包含核酸的酵母运载体，所述核酸编码至少一种突变多肽，其包含突变的片段，或模拟物；ii)包含至少一种突变多肽，其包含突变的片段，或模拟物的酵母运载体；iii)与至少一种突变多肽，其包含突变的片段，或模拟物相关联的酵母运载体；iv)细胞内装载入树突细胞的酵母运载体，其包含下述核酸，所述核酸编码至少一种突变多肽，其包含突变的片段，或模拟物；或者v)细胞内装载入树突细胞的酵母运载体，和至少一种突变多肽，其包含突变的片段，或模拟物，其中，所述突变多肽已知将或已经响应靶向治疗和/或预防剂的施用而出现，并具有至少一种特定的突变。

此外，组合物可用于制备或生产这样的药物，所述药物用于与靶向治疗和/或预防剂联合在哺乳动物中引发针对突变体多肽的免疫应答。在一些实例中，突变多肽是癌基因、肿瘤相关抗原或癌细胞表达的多肽。在一些实例中，癌细胞选自结肠直肠癌、黑素瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈部癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、血管肉瘤(angiosarcomas)、血管肉瘤(hemangiosarcomas)、肥大细胞瘤、原发性肝癌、肺癌、胰腺癌、胃肠癌、肾细胞癌、造血瘤形成及其转移性癌。

在一些实例中，免疫应答是细胞免疫应答。在其它一些实例中，免疫应答是体液免疫应答。在其它实例中，免疫应答包括细胞和体液免疫应答。

此外，本文描述的组合物可用于在哺乳动物中治疗疾病，包括向哺乳动物施用有效量的组合物，其中，所述疾病与突变体多肽相关，所述突变体多肽已知将或已经响应靶向治疗和/或预防剂的施用而出现，并具有至少一种特定的突变。在一些实例中，组合物和靶向治疗和/或预防剂组合使用。此外，组合物可用于制备或生产这样的药物，所述药物用于与靶向治疗和/或预防剂联合在哺乳动物中治疗疾病。在一些实例中，突变多肽是癌基因、肿瘤相关抗原或癌细胞表达的多肽。在一些实例中，癌细胞选自结肠直肠癌、黑素瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈部癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、血管肉瘤(angiosarcomas)、血管肉瘤(hemangiosarcomas)、肥大细胞瘤、原发性肝癌、肺癌、胰腺癌、胃肠癌、肾细胞癌、造血瘤形成及其转移性癌。在一些实例中，疾病是癌症。

鉴定癌抗原中作为活性剂施用的结果而出现的新的突变体多肽的方法是本领域已知的。通过体外方法鉴定的逃逸突变显示出与体内发展出的那些高程度的相关性。参见，例如，Azam等人，Cell，112：831-843(2003)、Cools等人，Cancer Research，64：6385-6389(2004)、Blencke等人，Chem.Biol，11：691-701(2004)。例如，Azam等人提供了一种筛选方法，用于鉴定针对靶标导向的抗癌剂的抗性突变体多肽，该方法通常可应用于任何活性剂-突变体多肽对。(Azam等人，Biol.Proced.Online，5(l)：204-210(2003))。简言之，在克隆载体中克隆编码靶标突变体多肽的cDNA，对其进行随机诱变，产生靶标癌多肽的突变文库。然后将该文库引入对活性剂的治疗敏感的细胞。然后选出在存在治疗性活性剂时对用活性剂进行的治疗有抗性的菌落，将其分离，并测序，以揭示推定的突变。为确认每个候选突变的抗性表型，还可通过位点定向诱变在天然cDNA中从头产生突变。将突变体cDNA引入药物敏感性细胞，以验证它们的药物抗性表型。可以通过细胞增殖测定来进一步验证药物抗性。还可通过在蛋白质晶体结构模型中图谱定位，分析突变的结构后果。

组合物和药物制剂及其施用

本文提供了包含与突变体多肽相关联的载体的组合物，包括将直接施用给患者的组合物，或者使用本领域技术人员已知的多种技术先装载到介载体(例如树突细胞)上的组合物。例如，可通过暴露给液氮或干冰进行冷冻干燥或冷冻来干燥载体。还可通过将酵母包装到饼(cake)或片剂中来制备包含酵母运载体的组合物，这和对用于烘焙或酿造操作的酵母所进行的一样。此外，在装载进树突细胞或其它类型的施用之前，可将载体与可药用赋形剂(例如宿主细胞耐受的等渗缓冲液)混合。此类赋形剂的实例包括水、盐水、林格溶液、右旋糖溶液、Hank′s溶液和其它含水生理平衡盐溶液。还可使用非水性运载体，例如，不挥发油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其它有用的配方包括含有增粘剂(例如，聚乙二醇(PEG)羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、甘油或右旋葡聚糖)的混悬剂。赋形剂还可含有少量添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质。缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，而防腐剂的实例包括硫柳汞、间或邻甲酚、福尔马林和苯甲醇。标准制剂可以是可注射的液体或者可放进合适液体作为用于注射的混悬剂或溶液剂的固体。因此，在非液体制剂中，赋形剂可包含，例如，右旋糖(dextrose)、人血清清蛋白和/或防腐剂，可在施用之前向其中加入灭菌水或盐水。

本发明提供了下述方法，所述方法包括，向处于癌症或感染风险或正遭受癌症或感染的哺乳动物施用包含与突变体多肽相关联的载体的组合物(例如免疫原性组合物)。所述方法通常可用于在哺乳动物中引发免疫应答，在一些实例中是细胞免疫应答。相信此类方法可用于引发对突变体多肽的细胞免疫应答，所述突变体多肽已经响应活性剂而出现或者被相信将响应活性剂而出现；由此最小化或逆转对该活性剂的抗性，和/或延长活性剂的效力和/或最小化、降低或逆转疾病或感染的某些症状。

因此，本发明提供了在哺乳动物中最小化对预防性和/或治疗性活性剂的抗性的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的下述组合物，所述组合物包含与突变体多肽相关联的载体，例如酵母运载体，所述突变体多肽已经响应所述活性剂而出现。此外，本发明提供了降低对施用给处于疾病或感染风险或正遭受疾病或感染的哺乳动物的活性剂的抗性的方法，无论所述活性剂是预防性和/或治疗性施用的，所述方法包括将下述组合物与所述活性剂联合施用给哺乳动物，其中，所述组合物包含：a.细胞、载体或病毒，其包含编码所述突变体多肽的核酸；b.细胞、载体或病毒，其与所述突变体多肽相关联；c.所述突变体多肽、或引发针对所述突变体多肽的免疫应答的肽(模拟物)；或d.编码所述突变体多肽的核酸或能与所述核酸结合的核酸，例如，siRNA或反义RNA；其中，将有效量的组合物与所述活性剂联合施用。

在一些实例中，组合物包含下述一种或多种：i)酵母运载体，其包含下述核酸，所述核酸编码至少一种突变体多肽、包含突变的其片段或模拟物；ii)酵母运载体，其包含至少一种突变体多肽、包含突变的其片段或模拟物；iii)酵母运载体，其与至少一种突变体多肽、包含突变的其片段或模拟物相关联；iv)细胞内装载进树突细胞的酵母运载体，其包含下述核酸，所述核酸编码至少一种突变体多肽、包含突变的其片段或模拟物；或v)细胞内装载进树突细胞的酵母运载体和至少一种突变体多肽、包含突变的其片段或模拟物，其中，所述突变体多肽已知将或已经响应靶向的治疗和/或预防剂的施用而出现，其具有至少一种特定突变。

在一些实例中，组合物能引发细胞免疫应答。在其它一些实例中，免疫应答是体液免疫应答。在其它一些实例中，免疫应答既包括细胞又包括体液免疫应答。

在所述方法的一些实例中，组合物包含佐剂。在其它还有一些实例中，组合物还包含Toll样受体或吞噬受体或二者的激动剂或配体。在其它一些实例中，组合物包含酵母运载体。在其它还有一些实例中，组合物包含CpG序列。在其它一些实例中，细胞是树突细胞。在一些实例中，哺乳动物是人。

本发明还提供了载体(其包括例如，酵母运载体)、病毒和组合物(例如，包含酵母运载体的基于酵母的组合物，包括免疫原性组合物)，它们用于在哺乳动物中引发突变体多肽特异性免疫应答的方法，所述哺乳动物已、将或正被施用活性剂。在一些实例中，哺乳动物处于疾病风险，在施用活性剂之前、同时或之后，向其预防性施用与突变体多肽、包含突变的其片段或模拟物相关联的载体，和/或包含此类载体的组合物。在其它一些实例中，哺乳动物正遭受疾病，在施用活性剂之前、同时或之后，向其治疗性施用与突变体多肽相关联的载体，和/或包含此类载体的组合物。可使用与突变体多肽相关联的此类酵母运载体的施用，例如，以增加哺乳动物对治疗和/或预防剂的易感性；和/或增加此类活性剂的治疗效力；和/或延长此类活性剂的有效期。在一些实例中，在施用本文所述的载体或组合物之前对突变体多肽进行鉴定；在其它一些实例中，突变体多肽被预期将响应活性剂而发生。

本文描述的、包含与突变体多肽、包含突变的其片段或模拟物相关联的载体(例如酵母运载体)的组合物和治疗性或预防性活性剂可同时或顺序施用，不管在施用活性剂之前或之后施用。同时施用包括在一种组合物中一起施用，或者作为分开的组合物施用。在一些实例中，活性剂和突变体多肽、或编码其的核酸处于不同制剂中，并且同时和分别施用。应当认识到，在其中对活性剂和突变体多肽、或编码其的核酸顺序施用的一些实例中，施用可基于每天、每周或每月来进行，按照实施者认为对哺乳动物来说适当的。术语“同时施用”在本文中使用时表示在同一天施用包含酵母运载体的组合物和治疗性活性剂。包含突变体多肽的组合物或治疗性活性剂谁都可以先施用。当同时施用时，包含酵母运载体的组合物和治疗性活性剂可包含在同一剂量(即，既包含含有酵母运载体的组合物又包含治疗性活性剂的单位剂量)或分离的剂量(例如，包含酵母运载体的组合物包含在一种剂量形式中，而治疗性活性剂则包含在另一剂量形式)中。

在一些实例中，包含突变体多肽的组合物作为“随访治疗”施用，即在已经开始了活性剂的治疗之后，或在观察到疾病症状增加之后。但是，包含载体(例如酵母运载体)的组合物也可在治疗或预防剂的治疗起始之前施用。

本文所述的方法还可包括向哺乳动物施用载体和突变体多肽，其中，所述载体和多肽彼此不复合，即，多肽并不由载体重组表达、装载进载体或与载体物理附着。可在施用给受试者之前将载体和突变体多肽混合于制剂中，或者也可分别施用。施用过程可离体进行，例如通过引入装载有酵母运载体的树突细胞来实现，或者可以体内进行。离体施用指在哺乳动物之外进行部分调控步骤，例如，在使得载体和突变体多肽装载进细胞的条件下，将本发明的组合物施用给从哺乳动物移出的细胞(树突细胞)群，再将细胞返回给所述哺乳动物。然后可将包含载体的组合物返回给哺乳动物，或施用给哺乳动物，这通过任何合适的施用模式来进行。

组合物(包括包含装载有载体和突变体多肽的树突细胞的组合物)的施用可例如是全身的或粘膜的。施用途径对于本领域技术人员来说将是显而易见的，这取决于疾病的类型、所用的突变体多肽和/或靶标细胞群或组织。施用的方法包括但不限于，静脉内施用，腹膜内施用，肌内施用，结内(intranodal)施用，冠状动脉内施用，动脉内施用(例如施用进颈动脉)，皮下施用，经皮递送，气管内施用，皮下施用，关节内施用，心室内施用，吸入(例如，气雾剂)，颅内、脊柱内、眼内、耳、鼻内、口服、经肺施用(pulmonary administration)，导管注入(impregnation of catheter)以及直接注射进组织。施用途径包括：静脉内、腹膜内、皮下、皮内、结内、肌内、经皮、吸入、鼻内、口服、眼内、关节内、颅内和脊柱内。非肠道递送可以包括皮内、肌内、腹膜内、胸膜内、肺内、静脉内、皮下、心房导管(atrialcatheter)和静脉导管(venal catheter)途径。耳递送可以包括滴耳剂，鼻内递送可包括滴鼻剂或鼻内注射，眼内递送可包括滴眼剂。气雾剂(吸入剂)递送也可使用本领域的标准方法来进行(见，例如，Stribling等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 189：11277-11281，1992)。例如，在一个实例中，可将包含酵母运载体的组合物配制进适用于使用合适的吸入设备或喷雾器来喷雾递送的组合物。口服递送可包括通过嘴摄取的固体和液体，并且可用于发展粘膜免疫性，包含酵母运载体的组合物易于被制备为用于口服递送，例如，作为片剂或胶囊剂，以及被配制进食物和饮料产品。调节粘膜免疫性的其它施用途径可用于治疗癌症或感染性疾病。此类途径包括支气管、皮内、肌内、鼻内、其它吸入、直肠、皮下、局部、经皮、阴道和尿道途径。递送途径是将包含酵母运载体的组合物递送给呼吸系统的任何途径，其包括但不限于，吸入、鼻内、气管内等。

本文所述的细胞、载体(例如酵母运载体)或病毒，或包含细胞、载体、病毒或酵母运载体的组合物对处于疾病风险或正遭受疾病的哺乳动物的有效施用，不需要保护哺乳动物免遭该疾病。可使用本领域的标准方法，来确定有效剂量参数，该参数是适用于最小化或降低疾病症状，或者最小化疾病发展的。此类方法包括，例如，测定存活率、副作用(即，毒性)以及疾病的发展或消退。

关于使用酵母运载体而言，合适的单次剂量大小是：当在合适的时间段内一次或多次施用时，能在哺乳动物中引发免疫应答(一些实例中，细胞免疫应答)的剂量，所述免疫应答可以是抗原特异性免疫应答。本领域技术人员将理解，引发免疫应答所需的组合物的剂量取决于多种因素。本领域技术人员可以基于哺乳动物的大小和施用途径来容易地确定施用的合适单次剂量大小。

包含与突变体多肽相关联的载体的组合物的合适的单次剂量是：当在合适的时间段内一次或多次施用时，能向患者机体的给定细胞类型、组织或区域以有效引发免疫应答的量有效提供载体和/或突变体多肽的剂量。在酵母的情况下，本发明的酵母运载体的单次剂量为每剂量(即每个生物)大约0.004YU(4×10³个细胞)至大约100YU(1×10⁹个细胞)，例如0.1YU(1×10⁶个细胞)至大约100YU(1×10⁹个细胞)，这包括以0.1×10⁶个细胞递增的任何中间剂量(即，1.1×10⁶、1.2×10⁶、1.3×10⁶等)。在一个实施方案中，使用2YU(2×10⁷个酵母)。剂量的这一范围可有效用于任何大小的任何生物，包括小鼠、猴子、人等。当通过将酵母运载体和突变体抗原装载进树突细胞来施用组合物时，本文所述的组合物的单次剂量为：每次施用每哺乳动物，大约0.5×10⁶至大约40×10⁶个树突细胞。在其它一些实例中，单次剂量为：从每个体大约1×10⁶至大约20×10⁶个树突细胞，在其它还有一些实例中为从每哺乳动物大约1×10⁶至大约10×10⁶个树突细胞。当针对突变体抗原的免疫应答较弱，或者需要针对特定突变体多肽提供免疫应答或诱导记忆应答时，可施用本文所述的包含酵母运载体的组合物的“强化”剂量。强化剂量可在初次施用后大约1周至若干年后施用。在一个实例中，施用日程表是这样的：从3个月内每周施用相当于大约1×10⁵个至大约1×10⁹个酵母细胞的组合物，到1个月内每周施用(5次剂量)，接着是每月施用。

在一些实例中，本文所述的包含酵母运载体的树突细胞组合物含有每患者每单次剂量大约0.5×10⁶至大约40×10⁶个树突细胞，在另一实例中，为每患者每单次剂量大约1×10⁶至大约10×10⁶个树突细胞。这些剂量是针对典型的人或其它灵长类动物给出的。本领域技术人员可确定适用于其它动物的剂量。例如，对小鼠来说，合适的剂量为每小鼠每单次剂量大约1×10⁶至大约3×10⁶个。本领域技术人员可确定其它剂量，这是本领域技术人员能够进行的。能有效施用给哺乳动物的组合物含有每个体哺乳动物每单次剂量大约0.5×10⁶至大约40×10⁶个的树突细胞。

对哺乳动物的施用剂量数取决于酵母运载体的性质以及哺乳动物对施用的应答，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，合适的剂量数目包括想要的目的所需的任何数目，这在本发明的范围内。例如，重复剂量可增加攻击靶标细胞的T细胞的数量。在施用过程中，可对施用的剂量和频率加以调整，这是技术人员显而易见的。

本领域技术人员还可以利用动物模型监控给药效应，例如白血病的小鼠模型。此类小鼠模型是本领域技术人员普遍已知的。一种监控给药效应的方法是在刺激(challenge)或强化后，监控小鼠的存活率(接种的或未接种的)。另一种监控给药效应的方法是测量白血病细胞随时间的百分比。存在一些小鼠模型，其中白血病细胞用标志物标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)。GFP-阳性细胞表示白血病细胞，并可以在机体的不同部位进行监控，例如骨髓。

试剂盒

本文提供了用于实施本文描述的任何方法的试剂盒。发明的试剂盒可以包括至少一种酵母运载体和至少一种突变体多肽，所述突变体多肽与癌症相关，已知将或已经响应靶向治疗和/或预防性药物活性剂的施用而出现，并具有特定突变。试剂盒还可以包括治疗和/或预防性药物活性剂。在一些实例中，药物活性剂靶向癌细胞。示例性活性剂包括但不限于：伊马替尼、尼罗替尼、PD166326、PD180970、AP23464、BMS-354825、ON012380、VX-680、BIRB-796、AZM475271、PP1、PP2、AP-23236、CGP76030、PD173955、格尔德霉素/17-AAG、NVP-LAQ824、SCH66336、BAY-439006、CI-1040、LY294002、渥曼青霉素(wortmannin)、OSU-03012、CCI-779、R115777、BMS-214662、U0126、PD184352、雷帕霉素(rapamycin)、RAD001、CCI-779、AP23573、PKC412或SU11248。试剂盒还可以包括用于实施本文描述的方法的说明书。

包含单个组分的试剂盒通常将具有封装在容器(例如，小瓶、安瓿或其它合适的存储容器)内的组分。类似地，包括超过一种组分的试剂盒也可在容器内具有试剂(单独或处于混合物中)。

与使用试剂盒来实施本发明相关的说明书通常将描述如何使用试剂盒的内容物来实施本发明的方法。本发明的试剂盒内提供的说明书通常是标签或包装插页(例如试剂盒中包括的纸页)上的书面说明书，但是机读说明书(例如磁性或光存储盘上携带的说明书)也可接受。

虽然为了清楚理解的目的，通过阐述和举例的方式对前述发明进行了一定的详细描述，但是本领域技术人员显而易见，可以实施某些改变和改良。因此，说明书和实例不应被理解为限制本发明的范围。

实施例

实施例1包含逃逸突变的酵母运载体的构建

本实施例的目的是描述含有已知随格列卫的施用而发生的逃逸突变的酵母运载体。

产生基于酵母的载体，所述载体表达来自p210Bcr-Abl的约400个氨基酸的Abl部分。这类载体处于组成型TEF2启动子(转录延伸因子2)的控制之下。将含有下列构建体的酵母进行培养、收获、PBS洗涤、56摄氏度加热1小时杀死、用PBS再次洗涤，然后重悬在PBS中，用于向小鼠施用。

使用下列序列产生多个酵母构建体：构建体#1VK13-BA5M-VAX E1.E2.E3MADEAPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNG 50QGWVPSNYITPVNSLEKHSWYHGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVRESESS 100PGQRSISLRYEGRVYHYRINTASDGKLYVSSESRFNTLAELVHHHSTVAD 150GLITTLHYPAPKRNKPTIYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYG

VY 200EGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTR 250EPPFYII

EFMTYGNLLDYLRECNRQEVSAVVLLYMATQISSA

EYLEKK 300NFIHRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRLMTGDHHHHHH^*(SEQ ID NO：1)

该构建体含有三个逃逸突变：E255K、T315I和M351T。该序列在V227I和N336S处改变，对应于从人残基向与小鼠残基相应的残基的改变。为了酵母表达的稳定性，向Bcr-Abl序列的起始处添加MADEAP序列。加粗的、下划线的文本表示与逃逸突变(E255K、T315I和M351T)相应的突变。最后6个残基是六组氨酸标签。在MADEAP序列和六组氨酸标签之间的328个氨基酸序列来自人Abl激酶结构域。最后的氨基酸是终止密码子(^＊)。构建体#2VK14-VAX E2ONLYMADEAPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNG 50QGWVPSNYITPVNSLEKHSWYHGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVRESESS 100PGQRSISLRYEGRVYHYRINTASDGKLYVSSESRFNTLAELVHHHSTVAD 150GLITTLHYPAPKRNKPTIYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYGEVY 200EGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTR 250EPPFYYII

EFMTYGNLLDYLRECNRQEVSAVVLLYMATQISSAMEYLEKK 300NFIHRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRLMTGDHHHHHH^*(SEQ ID NO：2)

该构建体只含有1个逃逸突变：T315I。该序列在V227I和N336S处改变，对应于从人残基向与小鼠残基相应的残基的改变。为了酵母表达的稳定性，向Bcr-Abl序列的起始处添加MADEAP序列。加粗的、下划线的文本表示与逃逸突变(T315I)相应的突变。最后6个残基是六组氨酸标签。在MADEAP序列和六组氨酸标签之间的序列来自人Abl激酶结构域。最后的氨基酸是终止密码子(^＊)。构建体#3VK15-JCN-BAM-VAX b3a2MADEAPCFRSFSLTSVE

QMLTNSCVKLQTVHIPLTINKEDDESPGLYG 50FLHVIVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEPQGLSEAARWNSKENLLAGPSE 100NDPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNGQGW 150VPSNYITPVNSLEKHSWYHGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVRESESSPGQ 200RSISLRYEGRVYHYRINTASDGKLYVSSESRFNTLAELVHHHSTVADGLI 250TTLHYPAPKRNKPT

YGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYGEVYEGV 300WKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTREPP 350FYIITEFMTYGNLLDYLRECNRQEV

AVVLLYMATQISSAMEYLEKKNFI 400HRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRLMTGDHHHHHH^*(SEQ ID NO：3)

该构建体是野生型Bcr-Abl，在Bcr和Abl的连接处具有小鼠残基。该序列在V227I和N336S处改变，并且在人Bcr-Abl的连接处上游的残基发生两处改变(用相应的小鼠氨基酸替换)，对应于从人残基向与小鼠残基相应的残基的改变(这些改变在上文用粗体和双下划线表示)。为了酵母表达的稳定性，向Bcr-Abl序列的起始处添加MADEAP序列。最后6个残基是六组氨酸标签。在MADEAP序列和六组氨酸标签之间的序列来自人Bcr-Abl激酶，其含有Bcr-Abl的连接处上游的97个残基。最后的氨基酸是终止密码子(^＊)。构建体#4完整人E2ONLYMADEAPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNG 50QGWVPSNYITPVNSLEKHSWYHGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVRESESS 100PGQRSISLRYEGRVYHYRINTASDGKLYVSSESRFNTLAELVHHHSTVAD 150GLVTTLHYPAPKRNKPTIYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYGEVY 200EGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTR 250EPPFYII

EFMTYGNLLDYLRECNRQEVNAVVLLYMATQISSAMEYLEKK 300NFIHRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRLMTGDHHHHHH^*(SEQ ID NO：4)

该构建体含有具有1个逃逸突变T315I的完整人Bcr-Abl残基。为了酵母表达的稳定性，向Bcr-Abl序列的起始处添加MADEAP序列。加粗的、下划线的文本是与逃逸突变(T315I)相应的突变。最后6个残基是六组氨酸标签。在MADEAP序列和六组氨酸标签之间的328个氨基酸序列来自人Abl激酶结构域。最后的氨基酸是终止密码子(^＊)。构建体#5含有连接的完整的人Bcr-Abl WT序列MADEAPCFRSFSLTSVELQMLTNSCVKLQTVHSIPLTINKEDDESPGLYG 50FLHVIVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEPQGLSEAARWNSKENLLAGPSE 100NDPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNGQGW 150VPSNYITPVNSLEKHSWYHGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVRESESSPGQ 200RSISLRYEGRVYHYRINTASDGKLYVSSESRFNTLAELVHHHSTVADGLI 250TTLHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYGEVYEGV 300WKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTREPP 350FYIITEFMTYGNLLDYLRECNRQEVNAVVLLYMATQISSAMEYLEKKNFI 400HRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRLMTGDHHHHHH^*(SEQ ID NO：5)

该构建体是含有Bcr和Abl连接的野生型人Bcr-Abl序列。为了酵母表达的稳定性，向Bcr-Abl序列的起始处添加MADEAP序列。最后6个残基是六组氨酸标签。在MADEAP序列和六组氨酸标签之间的序列来自含有Bcr-Abl连接的上游97个残基的人Bcr-Abl序列。最后的氨基酸是终止密码子(^＊)。构建体#6完整的人E1.E2.E3MADEAPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNG 50QGWVPSNYITPVNSLEKHSWYHGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVRESESS 100PGQRSISLRYEGRVYHYRINTASDGKLYVSSESRFNTLAELVHHHSTVAD 150GLITTLHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYG

VY 200EGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTR 250EPPFYII

EFMTYGNLLDYLRECNRQEVNAVVLLYMATQISSA

EYLEKK 300NFIHRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRLMTGDHHHHHH^*(SEQ ID NO：6)

该构建体含有三个逃逸突变：E255K、T315I和M351T。为了酵母表达的稳定性，向Bcr-Abl序列的起始处添加MADEAP序列。加粗的、下划线的文本表示与逃逸突变(E255K、T315I和M351T)相应的突变。最后6个残基是六组氨酸标签。在MADEAP序列和六组氨酸标签之间的328个氨基酸是来自人Abl激酶结构域。最后的氨基酸是终止密码子(^＊)。

实施例2白血病的小鼠模型

使用白血病的小鼠模型，其中用含有不同Bcr-Abl形式的逆转录病毒注射小鼠。这些白血病细胞经过改造，表达绿色荧光蛋白(GFP)，这是用于监控的标志物。

以2周的间隔，用2YU酵母(2千万酵母)免疫小鼠3次。在最后一次免疫后的第7天，用500,000白血病细胞进行刺激。小鼠研究分为2部分：

在实验#1中有2组小鼠：

(1)第1组不进行免疫，但用GFP标记的野生型CML(无逃逸突变的Bcr-Abl)刺激(5只动物)。(2)用基于酵母的疫苗免疫第2组小鼠，所述疫苗含有具有格列卫治疗发现的3个逃逸突变的Abl蛋白质(具有3TAME表位的Bcr-Abl——E255K、T315I和M351T，aka GI-10,001)，然后用GFP标记的野生型CML(无TAME突变的Bcr-Abl)刺激(5只动物)。

结果如下：

图1显示了Kaplan-Meier曲线，这些组的结果相同——所有小鼠都在第10天的同一24小时期内死亡。接种的小鼠在其脾脏内具有升高数量的T细胞和B细胞，证实了基于酵母的疫苗的施用，并表示对所施用疫苗的一般先天性免疫激活。

小鼠研究的第2部分中有3组小鼠：

(1)第1组不进行免疫，但用GFP标记的T315I CML(具有1TAME突变的Bcr-Abl——T315I)刺激(5只动物)。

(2)用基于酵母的疫苗免疫第2组小鼠，所述疫苗含有具有3个逃逸突变的Abl蛋白质(具有3TAME表位的Bcr-Abl——E255K、T315I、M351T)，然后用GFP标记的T315I CML(具有1TAME突变的Bcr-Abl——T315I)刺激(3只动物)。

(3)用基于酵母的疫苗免疫第3组小鼠，所述疫苗含有具有1个逃逸突变的Abl蛋白质(具有1TAME表位的Bcr-Abl——T315I)，然后用GFP标记的T315I CML(具有1TAME突变的Bcr-Abl——T315I)刺激(4只动物)。

结果如下：

图2描述了Kaplan-Meier曲线，显示了经接种小鼠的明确的存活优势。在对照组(组#1)中，所有小鼠都在第10-11天的24小时内死亡(5/5死亡)。相反，接种组的小鼠都在第11天存活。接种组中的所有7只小鼠在第13天都未死亡，2只小鼠存活了至少超过35天。

图3描述了相同组的小鼠的Kaplan-Meier曲线，其中经接种小鼠进一步绘出了接受具有3个逃逸突变(GI-10,001)的疫苗的那些，和接受具有T315I突变的疫苗的那些。

根据图1-2，明显可见靶向消除方法靶向了具有逃逸突变的细胞，而非野生型Bcr-Abl。因此，其提供了免疫识别已经逃避了现有癌症治疗剂的白血病细胞的非常有效的工具。图2和3显示，两种类型的疫苗的每一种都可以有效地靶向表达逃逸突变的细胞的破坏。两种疫苗中的每一种的使用都可以用于延长已经用白血病细胞刺激的小鼠的存活。多突变盒或单突变盒的使用可用于靶向表达逃逸突变的细胞。

当在第二部分的实验中测量白血病细胞的百分比时，与未接种的小鼠相比，在第10天，经接种小鼠在其血液中的白血病细胞百分比统计学显著的下降。图4中显示了这些结果。靠近0标记的2个空心点表示具有极少的至不可检测的白血病细胞负荷的小鼠。

图5显示了通过不同疫苗分布的白血病负荷。GI-10,001(三突变)和GI-10,002(T315I突变)都有效的靶向表达逃逸突变的免疫细胞。

Claims (1)

1.用于在需要其的个体中靶向消除突变逃逸的方法，其包括向个体施用有效量的靶向治疗剂和组合物，其中，所述治疗剂选自酪氨酸激酶抑制剂、Src激酶抑制剂、影响Bcr-Abl稳定性的活性剂，和在Bcr-Abl的下游信号通路中发挥作用的活性剂，所述组合物包含下述一种或多种：

(i)包含核酸的酵母运载体，所述核酸编码至少一种与癌症相关的突变多肽、其包含突变的片段、或模拟物；

(ii)包含至少一种与癌症相关的突变多肽、其包含突变的片段、或模拟物的酵母运载体；

(iii)与至少一种与癌症相关的突变多肽、其包含突变的片段、或模拟物相关联的酵母运载体；

(iv)细胞内装载入树突细胞的酵母运载体，其包含下述核酸，所述核酸编码至少一种与癌症相关的突变多肽、其包含突变的片段、或模拟物；或者

(v)细胞内装载入树突细胞的酵母运载体和至少一种与癌症相关的突变多肽，其包含突变的片段、或模拟物，

其中，所述突变多肽已知将或已经响应癌症的靶向治疗和/或预防剂的施用而出现，并具有至少一种特定的突变。

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