CN102947452A - 使用用于癌症的辅佐治疗的李斯特菌属的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文提供初免-加强方案以及本文所使用的材料。初免-加强方案增强对靶抗原的免疫应答。用于加强的疫苗由编码可表达的抗原的重组减毒的代谢活性李斯特菌属(Listeria)组成，该可表达的抗原与靶抗原交叉反应。在一些例子中，免疫应答是细胞免疫应答。

Description

使用用于癌症的辅佐治疗的李斯特菌属的方法和组合物

本发明要求2010年5月23日提交的美国临时专利申请61/347,447的优先权，包括所有表格、附图和权利要求的其全部内容特此并入。

关于联邦政府赞助研究的声明

美国政府具有本发明的全额支付许可证以及在限制的情况下具有在根据美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)授予号NHI 1K23CA104160-01所提供的合适的条款下要求专利权人许可其他人的权利。

发明背景

据认为，建立对特异性病原体的强细胞免疫是所需的。已经证明，使用相同疫苗的重复施用(同源性加强)对于加强体液应答是有效的。然而，因为之前对载体的免疫倾向于损坏强抗原呈递和合适炎症信号的生成，所以该方法对加强细胞免疫相对无效。规避该问题的一种方法为连续施用使用不同抗原依赖性系统(异源性加强)的疫苗。该方法称为“初免-加强(prime-boosting)”。

以下是异源性初免-加强方案的例子。涉及DNA初免的那些包括：DNA初免：针对病毒抗原的DNA初免/细菌加强(李斯特菌属)(Boyer等(2005)Virology 333:88-101)；DNA初免/细菌载体(芽孢杆菌属)加强，针对细菌抗原(Ferraz等(2004)Infection Immunity72:6945-6950)；DNA初免/病毒载体加强，针对肿瘤抗原(Goldberg等(2005)Clin.Cancer Res.11:8114-8121；Smith等(2005)Int.J.Cancer113:259-266)；针对病毒抗原的DNA初免/病毒加强(Toussaint等(2005)Vaccine 23:5073-5081；Cebere等(2006)Vaccine 24:417-425；Coupar等(2006)Vaccine 24:1378-1388)；针对病毒抗原的DNA初免/蛋白加强(Cristillo等(2006)Virology 346:151-168；Rasmussen等(2006)Vaccine 24:2324-2332)；DNA初免/病毒加强，针对寄生虫的抗原(Gilbert等(2006)Vaccine 24:4554-4561；Webster等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:4836-4841)；DNA初免/辅佐的蛋白加强，针对肿瘤抗原(Prud'homme(2005)J.Gene Med.7:3-17)；DNA初免/病毒加强以及蛋白加强，针对病毒抗原(Stambas等(2005)Vaccine23:2454-2464)；以及DNA初免(纳米颗粒)/蛋白加强，针对病毒抗原(Castaldello等(2006)Vaccine 24:5655-5669)。

以下异源性初免-加强方案利用不涉及DNA的初免组合物：树状细胞(DC)初免/细菌(李斯特菌属)加强、以及DC初免/病毒加强，针对细菌抗原(Badovinac等(2005)Nat.Med.11:748-756)；细菌载体初免(沙门氏菌属)/蛋白加强，针对细菌抗原(Vindurampulle等(2004)Vaccine 22:3744-3750；Lasaro等(2005)Vaccine 23:2430-2438)；辅佐的蛋白初免/DNA加强，针对病毒抗原(Sugauchi等(2006)J.Infect.Dis.193:563-572；Pal等(2006)Virology 348:341-353)；蛋白初免/细菌载体(沙门氏菌属)加强，针对病毒抗原(Liu等(2006)Vaccine24:5852-5861)；蛋白初免/病毒载体加强，针对病毒抗原(Peacock等(2004)J.Virol.78:13163-13172)；异源性病毒初免/病毒加强，使用不同病毒载体，针对病毒抗原或肿瘤抗原(Ranasinghe等(2006)Vaccine24:5881-5895；Kaufman等(2004)J.Clin.Oncol.22:2122-2132；Grosenbach等(2001)Cancer Res.61:4497-4505)。使用脂囊泡的异源性初免/加强，针对细菌抗原(Luijkx等(2006)Vaccine 24:1569-1577)。

用于调控免疫系统的试剂是李斯特菌属以及特别地为单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)。单核细胞增生性李斯特菌具有对肝脏和脾脏以及一定程度对诸如小肠的其他组织的天然向性(参见，例如，Dussurget等(2004)Ann.Rev.Microbiol.58:587-610；Gouin等(2005)Curr.Opin.Microbiol.8:35-45；Cossart(2002)Int.J.Med.Microbiol.291:401-409；Vazquez-Boland等(2001)Clin.Microbiol.Rev.14:584-640；Schluter等(1999)Immunobiol.201:188-195)。对于细菌位于肠道，则通过诸如ActA和internalin A的李斯特菌属蛋白来介导至血流的通道(参见，例如，Manohar等(2001)Infection Immunity69:3542-3549；Lecuit等(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:6152-6157；Lecuit和Cossart(2002)Trends Mol.Med.8:537-542)。一旦细菌进入宿主细胞，单核细胞增生性李斯特菌的生命周期包括从吞噬溶酶体脱逸至胞质溶胶。该生命周期对比于分枝杆菌属(Mycobacterium)，其仍旧在吞噬溶酶体内(参见，例如，Clemens等(2002)Infection Immunity 70:5800-5807；Schluter等(1998)Infect.Immunity 66:5930-5938；Gutierrez等(2004)Cell 119:753-766)。单核细胞增生性李斯特菌从吞噬溶酶体中的脱逸通过诸如猪单核细胞增生李斯特菌素(lysteriolysin)(LLO)、PI-PLC和PC-PLC的李斯特菌属蛋白介导(参见Portnoy等(2002)J.Cell Biol.158:409-414)。

对比以上所讨论的免疫治疗方法，其中免疫疗法用作主要治疗；辅助疗法是指在主要疗法之前(“新辅助疗法”)或者之后(“辅佐”)使用次要治疗，例如手术或辐射，其中主要疗法旨在去除或者破坏主要肿瘤。例如，在手术之后可提供辅助疗法，其中已经去除可检测的疾病，但是由于隐藏疾病还存在复发的统计学风险。对于包括结肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和一些妇科癌症的许多类型的癌症，手术之后提供辅助系统疗法和辐射疗法。

发明概要

本发明提供采用李斯特菌属细菌用于癌症的次级治疗的辅助疗法方案。在已经向受试者施用一次或者多次初级治疗之前或之后，施用表达癌症相关抗原的有效量的李斯特菌属疫苗。本发明包括包装在合适的容器中的含有基于李斯特菌属的疫苗的试剂盒，以及可包括说明书。

在第一方面，本发明涉及罹患癌症的哺乳动物的辅佐治疗的方法，该方法包括在向所述哺乳动物施用主要疗法之前或之后向所述哺乳动物施用有效量的组合物作为辅佐治疗以去除或者杀死表达癌症抗原的癌症细胞，所述组合物包含减毒的、代谢活性李斯特菌属，所述减毒的、代谢活性李斯特菌属编码所述癌症抗原的可表达的、免疫活性部分。

如上所述，可将本发明的组合物提供作为新辅助疗法；然而在优选的实施方案中，在主要疗法之后施用本发明的组合物。在各个实施方案中，所述主要疗法包括去除所述哺乳动物的所述癌症细胞的手术；杀死在所述哺乳动物中所述癌症细胞的辐射疗法；或者所述手术以及所述辐射疗法。

因为李斯特菌属可以为病原生物，以及特别是在免疫功能不全的情况下，优选所述施用步骤包括以多剂量施用所述减毒的、代谢活性李斯特菌属，所述减毒的、代谢活性李斯特菌属编码所述癌症抗原的可表达的、免疫活性部分。“减毒”是指藉此修饰细菌以减轻或者消除它的病原性但是仍保留用作目标疾病的预防或治疗的能力的方法。通过不同机制可获得细菌减毒。一种是引入突变至一种或者多种代谢途径内，其功能对于细菌体内生存和生长以致病是关键的。在李斯特菌属的情况下，在某些实施方案中，使细菌突变以减轻或者预防细胞内生长和扩散的能力。优选的李斯特菌属可包括使ActA失活的突变；使InlB失活的突变；或者两者。最优选地，在本发明中采用缺失它的天然ActA和inlB基因(ΔactAΔinlB)的减毒的、代谢活性李斯特菌属。在某些实施方案中，本方法采用被杀死但具代谢活性的李斯特菌属("KBMA")。

通过本发明的组合物提供编码各种癌症抗原的任意类型的一种或多种核酸的重组表达。在某些实施方案中，癌症抗原全部或者一部分是间皮素。其他合适抗原详细描述如下，以及可取决于待治疗的癌症类型以及通过癌症待表达的抗原。在各个实施方案中，待治疗的癌症选自胰腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和间皮瘤。该清单并非旨在限制。

除了优选为如所述的手术或辐射的主要疗法之外，可将本发明的组合物递送作为初免-加强方案的一部分。例如，在施用本发明的李斯特菌属组合物之间，已经预先向哺乳动物施用表达目标癌症抗原的来自人细胞系的细胞，其中所述细胞已经被重组修饰以生成和分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，以及其中已通过辐射修饰所述细胞以防细胞分裂(即，

疫苗，Cell Genesys,Inc.)。

应理解，本发明在其应用时并不限于构造细节以及在以下描述中阐述或者附图中所图示的组分的布置。本发明能够具有实施方案(除了描述的那些实施方案之外)以及能够以各种方法实施和进行。而且，应理解，本文所采用的措辞和术语以及摘要用于描述的目的以及不应当视为限制。

就其本身而言，本领域技术人员应理解，可容易地利用该公开基于的概念作为设计进行本发明的多种目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是，只要它们未偏离本发明的精神和范围，权利要求就应被视为包括在这些等同构造内。

附图简述

图1A是显示使用表达抗原的单核细胞增生性李斯特菌和牛痘病毒的初免-加强方案所致的对靶抗原(OVA)的OVA特异性细胞免疫应答的图。显示在ICS测定中使用OVA257-264肽(SIINFEKL(SEQ IDNO:1))接种的C57BL/6小鼠中的OVA特异性应答。

图1B是显示由使用表达靶抗原(人间皮素)的单核细胞增生性李斯特菌和腺病毒的初免-加强方案所致的人间皮素特异性细胞免疫应答的图。

图2是显示由使用单核细胞增生性李斯特菌、腺病毒和牛痘病毒的初免-加强方案所致的在Balb/c小鼠中人间皮素特异性细胞免疫应答的图。也图示初免-加强方案。

图3A是显示由使用增加水平的腺病毒初免和恒定水平的单核细胞增生性李斯特菌加强的初免-加强方案所致的在C57BL/6(HLA-A2转基因)小鼠中人间皮素特异性细胞免疫应答的图(使用间皮素肽池(peptide pool)来刺激脾细胞)。

图3B显示由使用增加水平的腺病毒初免和恒定水平的单核细胞增生性李斯特菌加强的初免-加强方案所致的在Balb/c小鼠中人间皮素特异性细胞免疫应答(使用间皮素肽池来刺激脾细胞)。也图示初免-加强方案。

图4A显示在图的左侧，其显示由具有预先存在的对腺病毒的免疫的小鼠中腺病毒初免所致的人间皮素特异性细胞免疫应答。也在图4A中显示如使用类型I Hex3表位(腺病毒特异性表位)测定的腺病毒特异性应答。也图示初免-加强方案。

图4B是显示在具有预先存在的对腺病毒的免疫的小鼠中由腺病毒初免和单核细胞增生性李斯特菌加强所致的人间皮素特异性细胞免疫应答和中和腺病毒特异性抗体的滴度的图。也图示初免-加强方案。

图5是显示由使用

(CELL GENESYS,INC.)或者编码AH1的单核细胞增生性李斯特菌的初免以及使用

(CELLGENESYS,INC.)或者编码AH1的单核细胞增生性李斯特菌的加强所致的AH1特异性细胞免疫应答的图。

图6A是显示由使用经间皮素肽131-139脉冲的树状细胞或者编码人间皮素的腺病毒的初免以及使用编码人间皮素的单核细胞增生性李斯特菌的加强所致的在CD8⁺T细胞中的间皮素_131-139特异性应答的百分率的图。初免发生在第0天；加强发生在第8天；以及在第13天收获脾细胞。

图6B是显示由使用经间皮素肽131-139脉冲的树状细胞或者编码人间皮素的腺病毒的初免以及使用编码人间皮素的单核细胞增生性李斯特菌的加强所致的每个脾脏中间皮素l31-139特异性CD8+T细胞的绝对数的图。初免发生在第0天；加强发生在第8天；以及在第13天收获脾细胞。

图6C是显示由使用经间皮素肽131-139脉冲的树状细胞的初免以及使用以下编码间皮素试剂的加强所致的在CD8+T细胞中间皮素131-139特异性应答的百分率的图：单核细胞增生性李斯特菌、腺病毒或牛痘病毒。

图7A是显示在脾细胞中小鼠间皮素特异性免疫应答的图，其中评估在小鼠间皮素肽文库中各肽的免疫应答。Balb/c小鼠接受使用编码小鼠间皮素的裸DNA载体的初免以及使用编码小鼠间皮素的单核细胞增生性李斯特菌的加强。

图7B是显示在脾细胞中小鼠间皮素特异性免疫应答的图，其中评估在小鼠间皮素肽文库中各肽的免疫应答。Balb/c小鼠接受使用编码小鼠间皮素的腺病毒的初免以及使用编码小鼠间皮素的单核细胞增生性李斯特菌的加强。也图示初免-加强方案。

图7C是显示酶联免疫斑点法(elispot)测定的结果的孔相片的半色调再现(hali-tone reproduction)，其中从小鼠(其研究结果显示在图7B中)获得的脾细胞暴露于间皮素肽编号278(SEQ ID NO:2)、279(SEQ ID NO:3)或者280(SEQ ID NO:4)。

图8是显示由使用编码OVA的KBMA单核细胞增生性李斯特菌作为初免以及KBMA单核细胞增生性李斯特菌、牛痘病毒或“活”单核细胞增生性李斯特菌作为加强的初免-加强方案所致的OVA特异性细胞免疫应答的图。所有“加强”载体编码OVA。

图9A显示在接种小鼠中AH-和AH 1/A5-特异性T细胞应答。

图9B显示在接种小鼠中间皮素特异性T细胞应答。

图9C显示在CT26肿瘤激发(tumor challenge)之后接种的小鼠的生存数据。

发明详述

本发明涉及用于引起对作为非李斯特菌属抗原的靶抗原的免疫应答的材料和方法。靶抗原优选为与疾病相关的靶抗原，使得对靶抗原的免疫应答提供治疗作用。本发明提供癌症的辅佐治疗的疫苗组，其中基于李斯特菌属的疫苗是代谢活性李斯特菌属，该代谢活性李斯特菌属编码其被施用的宿主中表达的靶抗原的免疫活性部分。

本发明部分基于施用疫苗的辅助使用可增强大量原发癌治疗的发现，该疫苗由编码癌症相关的抗原(例如间皮素)的活的减毒的单核细胞增生性李斯特菌组成。

除非另有说明，否则本发明的实施采用包括分子生物学(包括重组技术)、免疫学、细胞生物学、生物化学和药物规程的常规技术。这些技术完整解释在文献中，例如，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版,(Sambrook等)；Methods in Enzymology(AcademicPress,Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编辑)；Current Protocols in Immunology(John Wiley & Sons,Inc.,N.Y.)；Handbook of Pharmaceutical Excipients(Rowe等编辑)；Vaccine(Plotkinand Orenstein,2003)；以及Vaccine Protocols(Methods in MolecularMedicine)(Robinsin,Cranage和Hudson,2003)。

定义

用于表示在基因中突变或者在包含基因的细菌中突变的缩写如下。例如，缩写“李斯特菌属ΔactA”是指缺失部分或者所有actA基因。三角形符号(Δ)表示缺失。包括上标负号(李斯特菌属actA^-)的缩写是指该actA基因突变，例如缺失、点突变或者移码突变，但不限于这些类型的突变。可将指数缩写，例如"3e7"是指3x10⁷。

如包括所附权利要求的本文所使用，除文本另有明确说明外，诸如“一个”、“一种”、“所述”的词汇的单数形式包括复数指示物。本文所引用的参考资料通过引用整体并入，并入的程度如同明确且单独地指出各单独的公开、通过GenBank登录号所登记的序列、专利申请、专利、序列表、在序列表中的核苷酸或者寡肽或多肽序列、以及在所述公开和专利文献中的图片和照片通过引用并入。

当应用至人、哺乳动物、哺乳类受试者、动物、兽类受试者、安慰剂受试者、研究受试者、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体，“施用”是指(但不限于)使受试者、细胞、组织、器官或生物流体等接触外源性脂质、试剂、安慰剂、小分子、药物试剂、治疗剂、诊断剂或者组合物。“施用”可表示例如治疗、预防、药代动力学、研究、安慰剂和实验方法。对细胞的“施用”涵盖使试剂接触细胞；以及试剂接触流体，其中该流体接触细胞。“施用”也涵盖通过试剂、结合组合物或者通过另一细胞的细胞的体外和离体方法。如与使用安慰剂施用或者不施用的相比较，可通过例如增加的生存时间(例如，对危及生命的增殖性疾患)；减小肿瘤尺寸；减少肿瘤数目；降低特异性组织的代谢；降低特异性组织的代谢；降低传染物的滴度等来评估施用的结果。“治疗”涵盖有预期功效的施用。“治疗”包括预防性(预防疾病)以及治疗施用。

“抗原呈递细胞”是用于呈递抗原至T细胞的免疫系统的细胞。APC包括树状细胞、单核细胞、巨噬细胞、边缘区库弗氏细胞、小胶质细胞、朗氏细胞、T细胞、以及B细胞(参见，例如，Rodriguez-Pinto和Moreno(2005)Eur.J.Immunol.35:1097-1105)。树状细胞出现在至少两个谱系中。第一谱系包括pre-DCl、骨髓DC1和成熟DC1。第二谱系包括CD34⁺⁺CD45RA^-早期多功能T祖细胞、CD34⁺⁺CD45RA⁺细胞、CD34⁺⁺CD45RA⁺⁺CD4⁺IL-3Ralpha⁺⁺pro-DC2细胞、CD4+CD11c^-类浆细胞pre-DC2细胞、淋巴人DC2类浆细胞源性DC2、以及成熟DC2(参见，例如，Gilliet和Liu(2002)J.Exp.Med.195:695-704；Bauer等(2001)J.Immunol.166:5000-5007；Arpinati等(2000)Blood95:2484-2490；Kadowaki等(2001)J.Exp.Med.194:863-869；Liu(2002)Human Immunology 63:1067-1071；McKenna等(2005)J.Virol.79:17-27；O'Neill等(2004)Blood 104:2235-2246；Rossi和Young(2005)J.Immunol.175:1373-1381；Banchereau和Palucka(2005)Nat.Rev.Immunol.5:296-306)。

“减毒”和“减毒的”涵盖经修饰以降低对宿主的毒性的细菌、病毒、寄生虫、感染生物、肿瘤细胞、感染生物中的基因等。宿主可以为人或动物宿主或者器官、组织或细胞。给出非限制性例子，可使细菌减毒以降低与宿主细胞的结合；以降低从一种宿主细胞扩散至另一宿主细胞；以降低宿主细胞中的细胞外生长；或者以降低在宿主细胞的细胞内生长。通过测定诸如毒性指标、LD₅₀、从器官中清除速率或者竞争系数可评估减毒(参见，例如，Auerbuch等(2001)Infect.Immunity 69:5953-5957)。通常，减毒导致LD₅₀增加至少25%；更通常至少50%；最通常至少100%(2倍)；常规至少5倍；更常规至少10倍；最常规至少50倍；经常至少100倍；更经常至少500倍；以及最经常至少1000倍；一般至少5000倍；更一般至少10,000倍；以及最一般至少50,000倍；并且最通常至少100,000倍。

“减毒的基因”包括介导对宿主的毒性、病理或毒力；在宿主内生长；或者在宿主内存活的基因，其中基因以减轻、降低或者消除毒性、病理或毒力的方式来突变。“突变的基因”包括在基因的调控区、基因的编码区、基因的非编码区或其任何组合中的缺失、点突变、插入突变和移码突变。

“癌病症”和“癌疾患”包括但不限于癌症；肿瘤；肿瘤的转移、血管生成；以及诸如发育异常的癌症前疾患。具有癌症、肿瘤、癌症前病症、癌症前疾患或者癌疾患等的哺乳类受试者涵盖不仅包括癌症、癌症前疾患或肿瘤的哺乳类受试者，而且涵盖已经去除肿瘤、明显消除癌症(例如，通过化学疗法或者手术或者单独针对受试者免疫系统)的哺乳类受试者。

如在治疗中使用的“有效量”包括但不限于可改善、逆转、缓和或者预防医学病症或疾患的症状或迹象的量。除非另有明确或者以其他方式说明，“有效量”不限于足够改善病症的最小量；或者导致病症的最佳或者最大改善的量。在初免和/或加强的施用的文本内“有效量”是导致哺乳动物中免疫应答的量。

“细胞外流体”涵盖例如血清、血浆、血液、间质液、脑脊液、分泌的流体、淋巴液、胆汁、汗液、粪便物和尿液。“细胞外流体”可包括胶体或者混悬物，例如全血。

李斯特菌属细菌的“生长”是李斯特菌属领域的术语，其涵盖在诸如哺乳动物细胞的宿主细胞内生长的李斯特菌属细菌的细胞内生长。尽管可通过光学显微术、荧光显微术或菌落形成单位(CFU)测定法来测定李斯特菌属细菌的细胞内生长(“生长”)，但是生长不受测量的任何技术限制。诸如李斯特菌属抗原的量、李斯特菌属核酸序列或者李斯特菌属细菌脂质特异性的生化参数可用于评估生长。介导生长的基因是特异性介导细胞内生长的基因。特异性介导细胞内生长的基因包括但不限于其中基因失活降低细胞内生长速率但未可检测地降低细胞外生长速率(例如，肉汤中的生长)的基因；或者其中基因失活降低细胞内生长的速率的程度比对其降低细胞外生长的速率的程度更大的基因。为了提供非限制性例子，介导细胞内生长的基因是其中它的缺失降低细胞内生长至小于50%、小于40%、小于30%、小于20%或者小于10%的由野生型李斯特菌属表现出的细胞内生长的基因。为了提供进一步的非限制性例子，介导细胞内生长的基因涵盖其中它的缺失不仅降低细胞内生长至小于50%的野生型李斯特菌属的细胞内生长，而且降低细胞外生长至约95%、90%、85%或80%的使用野生型李斯特菌属所检测的细胞外生长的基因。在该文本中，术语“约”是指±5%。

“杀死但具代谢活性”(KBMA)涵盖任何含有修饰的基因组的细菌，例如其中基因组修饰足以预防菌落形成，但其中基因组修饰不足以基本上阻止或者破坏代谢。KBMA细菌不能形成如在琼脂上或者宿主细胞体内可检测的菌落。为了提供非限制性例子，可使用诸如补骨脂素的交联剂来修饰基因组。为了提供非限制性例子，在代谢中未被全部破坏的KBMA细菌是其中基因组仅在没有调控、编码、结构或者生物功能的基因间区中含有交联的一种。这对比于“活”细菌，其可形成菌落，尽管在一些实施方案中活细菌可以为减毒的。

“样品”是指来自人、动物、安慰剂或者研究样品的样品，例如，细胞、组织、器官、流体、气体、气溶胶、浆料、胶体或者凝结的材料。“样品”也指例如包含流体或者组织样品的细胞或者从流体或者组织样品中分离的细胞。“样品”也可表示从人或动物中新鲜取样的细胞、组织、器官或流体；或者经处理或储存的细胞、组织、器官或者流体。

细菌的“扩散”涵盖“细胞至细胞扩散”，其是部分被囊泡介导的来自第一宿主细胞的细菌传输至第二宿主细胞。与扩散相关的功能包括但不限于：例如，肌动蛋白尾的形成；伪足样延长的形成；以及双膜液泡的形成。

“初免剂量”或者“初免用量”的“有效量”是指如与在没有施用抗原的哺乳类受试者中免疫应答相比较在哺乳类受试者中引起可测定免疫应答的靶抗原的量。

如本文所使用的“疫苗”是指由异源性蛋白组成或者由编码异源性蛋白的核酸组成的组合物，使得当向哺乳动物施用疫苗时，异源性蛋白在哺乳动物中表达以用于引起免疫应答的目的。免疫应答可以为体液、细胞介导的或者两者。

如本文所使用的“初免疫苗(priming vaccine)”是指包含以引起对目标抗原的免疫应答的有效量向受试者或者宿主施用的试剂的疫苗。初免疫苗可编码抗原，以及也可编码诸如GM-CSF的各种免疫刺激细胞因子，其用于补充和激活抗原呈递细胞。

如本文所使用的“加强疫苗(boosting vaccine)”是指包含编码具有靶抗原的免疫活性部分的抗原的试剂的疫苗，以及该试剂可包含靶抗原、其片段和/或含有接合在靶抗原中通常不存在的区域的靶抗原的至少免疫活性部分的融合多肽。“加强剂量”或者“加强用量”的“有效量”是指一旦向之前已经施用初免剂量的靶抗原的哺乳动物施用则引起对靶抗原的免疫应答的抗原的量。

如本文所使用的“载体组”或“疫苗组”包含初免载体或初免疫苗以及加强载体或加强疫苗，其中各自编码共享免疫决定簇、交叉反应免疫决定簇、共享抗原、免疫蛋白或肽或其片段之一。

“抗原”是指含有刺激诸如哺乳动物免疫系统的宿主免疫系统以产生体液和/或细胞抗原特异性应答的一种或者多种表位(线性、构象或者两者)或者免疫决定簇的分子。该术语与术语“免疫原”可交换使用。抗原可以是全蛋白、截短蛋白或者蛋白或肽的片段。抗原可以为蛋白的天然存在的、遗传工程化的变体；或者可以为用于特别是在哺乳类受试者或者宿主中表达的最佳化密码子。通常，B细胞表位至少包括约5个氨基酸，但也可少至3-4个氨基酸。诸如CTL表位的T细胞表位包括至少约7-9个氨基酸，并且辅助T细胞表位包括至少约12-20个氨基酸。通常，表位包括约7和15个氨基酸，例如，9、10、12或15个氨基酸。术语“抗原”表示两个亚单位抗原(即，从完整生物体中分离和离散的抗原以及与天然抗原相关的抗原)。诸如抗独特型抗体或其片段、以及可模拟抗原或抗原决定簇的合成肽模拟表位的抗体也涵盖在如本文所使用的抗原的定义下。为了本发明，抗原可来自多种已知病原性病毒、细菌、寄生虫和真菌的任意一种。它们也可来自癌症。而且，为了本发明，“抗原”是指只要蛋白维持引起免疫应答的能力则包括对天然存在的序列的通常在自然界中保守的诸如缺失、添加和取代的修饰的如本文所定义的蛋白。这些修饰可以为有意的，例如通过定点诱变；或者可以为偶然的，例如通过产生抗原的宿主的突变。本发明的抗原也可以为通过本领域已知方法最佳化的密码子以改善在宿主中的它们的表达或者免疫原性。如本文所使用，“交叉反应”免疫决定簇是指能够引起对相关但并不相同抗原决定簇的免疫应答的决定簇、表位或者抗原，例如HIV的交叉反应决定簇是能够引起对分化枝中HIV抗原的所有成员中两个或者多个的免疫应答的抗原。

对抗原、载体或疫苗或者包含抗原的组合物的“免疫性应答”或“免疫应答”是在哺乳类受试者中对抗原或者存在于载体组中的抗原的体液和/或细胞免疫应答的发展。“细胞免疫应答”是通过T-淋巴母细胞和/或包括但不限于NK细胞和巨噬细胞的其他白血细胞介导的。本发明的T淋巴母细胞包括表达αβT细胞受体亚单位的T细胞或者表达γδ受体的T细胞以及效应子或者抑制子T细胞。“T淋巴母细胞”或者“T细胞”是非抗体生成淋巴母细胞，其构成免疫系统的细胞介导的臂的一部分。T细胞源于不成熟淋巴母细胞，该成熟淋巴母细胞由骨髓迁移至胸腺，其中它们经历在胸腺激素的定向下的成熟过程。基于它们识别和结合特异性抗原的能力，成熟T细胞变得具有免疫能力。当抗原结合淋巴母细胞的表面受体时，触发具有免疫能力的T细胞的激活。已知，为了产生T细胞应答，必须在细胞内合成抗原或者必须将抗原引入细胞内，随后通过蛋白酶体复合物将其处理为小肽，并且移位至内质网/Golgi复合物分泌途径以用于最后与主要组织相容性复合物(MHC)级别I蛋白缔合。功能细胞免疫包括抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)。当蛋白来自人类中时，如本文所使用的抗原特异性T细胞、CTL或者细胞毒性T细胞是指对与通过主要组织相容性复合物(MHC)或者人白细胞抗原(HLA)编码的蛋白缔合存在的肽抗原具有特异性的细胞。本发明的CTL包括激活的CTL，其在MHC的环境中被特异性抗原触发；以及称为由于再暴露于抗原以及可交叉反应CTL中而变得再激活的T细胞的记忆CTL或者恢复CTL。本发明的CTL包括CD4+和CD8+T细胞。本发明的激活的抗原特异性CTL通过以下各项促进CTL对其特异的病原体或癌症细胞感染的受试者的细胞的破坏和/或裂解：尤其是趋化因子和细胞因子(包括但不限于巨噬细胞炎症蛋白1a(MIP-1a)、MIP-1B和RANTES)的分泌；以及抑制疾病状态的可溶性因子的分泌。本发明的细胞免疫是指通过T细胞的T辅助亚单位产生的抗原特异性应答。辅助T细胞用于帮助刺激功能，以及集中针对显示在它们的表面上与MHC分子缔合的肽的T细胞的非特异性效应细胞的活性。细胞免疫应答也指细胞因子、趋化因子和通过激活的T细胞和/或包括由CD4和CD8 T细胞以及NK细胞衍生的那些的其他白血细胞生成的其他这些分子的生成。引起细胞免疫应答的初免剂量或加强剂量或者包含初免剂量或加强剂量的组合物或疫苗通过呈递在细胞表面处与MHC分子缔合的抗原可用于敏化哺乳类受试者。将细胞介导的免疫应答定向在或者靠近在它们的表面处呈递抗原的细胞。此外，抗原特异性T-淋巴母细胞使得可进一步保护免疫的宿主。通过诸如淋巴组织增生(淋巴母细胞激活)测定法、CTL细胞毒性细胞测定法或者通过测定在敏化的受试者中抗原的T-淋巴母细胞特异性的本领域已知的多种测定法可测定特定抗原刺激细胞介导的免疫性应答的能力。这些测定法是本领域公知的。参见，例如，Erickson等,J.Immunol.(1993)151:4189-4199；Doe等；Eur.J.Immunol.(1994)24:2369-2376。测定细胞介导的免疫应答的方法包括通过T-细胞群体来测定细胞内细胞因子或细胞因子分泌；或者通过测定表位特异性T细胞(例如，通过四聚体技术)(由McMichael,A.J.,和O'Callaghan,C.A.,J.Exp.Med.187(9)1367-1371,1998；Mcheyzer-Williams,M.G.等,Immunol.Rev.150:5-21,1996；Lalvani,A.等,J.Exp.Med.186:859-865,1997综述)。如本文所使用的免疫性应答或者免疫应答涵盖刺激CTL的生成和/或辅助T细胞和/或抗体介导的免疫应答的生成或者激活的免疫性应答或者免疫应答。

如本文所使用的“免疫性应答”或者“免疫应答”涵盖以下效应的至少一种或者多种：通过B细胞生成抗体；和/或抑制T细胞和/或特异性定向抗原或者存在于目标载体、组合物或者疫苗中的抗原的T细胞的激活。在一些实施方案中，“免疫性应答”或者“免疫应答”涵盖抑制T细胞的失活。如本文所使用，“增强的加强免疫应答”是指通过加强剂量的引起如与通过初免剂量的单次施用引起的应答相比较更大的可测定的免疫应答的疫苗的施用。

所谓“药学上可接受的”或者“药理上可接受的”是指不是生物学上期望或者另外期望的材料。

如本文所使用，术语“试剂盒”是指包装和/或标记的尽管并不必要同时但共同使用的组分。试剂盒可在单独的容器中包括初免疫苗和加强疫苗。试剂盒也可在单独的容器中包括初免疫苗和/或加强疫苗的组分。试剂盒可包括用于合并组分以配制适合于向哺乳动物使用的免疫原性组合物的组分。

“治疗作用”是减缓与待施用疫苗的疾病相关的一种或多种症状。“预防作用”是对与待施用疫苗相关的疾病的一种或多种症状的抑制。

如本文所使用“哺乳类受试者”或者“宿主”是指亚门脊索动物门的任意成员，包括但不限于人和包括诸如黑猩猩和其他猿类以及猴类的非人灵长类的其他灵长类；家畜，例如牛、羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；包括啮齿类动物的实验室动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠。术语不表示特定的年龄。因此，旨在包括成年和新生个体。

如本文所使用“辐射疗法”或“放射疗法”是指作为癌症治疗的一部分的电离辐射的医学用途以控制恶性细胞。放射疗法可用于治愈性、辅助性或缓和性治疗。放射疗法的合适类型包括常规外粒子束放射疗法；立体定位的辐射疗法(例如，Axesse、射波刀(Cyberknife)、伽玛刀、Novalis、Primatom、Synergy、X-Knife、TomoTherapy或者Trilogy),；强度调制的辐射疗法；粒子疗法(例如，质子疗法)；短程治疗(brachytherapy)；递送放射性同位素等。该清单并非旨在限制。

引起对靶抗原的免疫应答的方法

本发明涵盖用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法。靶抗原可以为与疾病状态相关的那些，例如，如在癌细胞或者病原体上存在被识别的那些。在原发癌治疗之后，施用包含编码和表达靶抗原的免疫活性部分的减毒的代谢活性李斯特菌属的疫苗。

1.靶抗原

可在本发明的治疗方案中使用的靶抗原的例子列于下表中。靶抗原也可以为包含在表中列出的抗原的免疫活性部分的片段或者融合多肽。

表1.抗原

2.在初免-加强途径中使用的试剂

在初免-加强途径中，辅助疗法可包括向哺乳动物施用有效剂量的初免疫苗。初始疫苗优选不含有编码靶抗原的代谢活性李斯特菌属。这些疫苗可含有其自身靶抗原，例如，具有或者没有佐剂的蛋白、肿瘤细胞裂解物、经辐射的肿瘤细胞、使用靶细胞(例如树状细胞)脉冲的抗原呈递细胞；或者它可含有提供靶抗原的试剂。提供靶抗原的合适的试剂包括重组载体，例如，细菌、病毒和裸DNA。使用本领域已知标准技术来制备重组载体，并且该重组载体含有可操作连接至编码靶抗原的核苷酸序列的合适控制元件。参见，例如，Plotkin等(编辑)(2003)Vaccines,第4版,W.B.Saunders,Co.,Phila.,PA.；Sikora等(编辑)(1996)Tumor Immunology Cambridge University Press,Cambridge,UK；Hackett和Harn(编辑)Vaccine Adjuvants,HumanaPress,Totowa,NJ；Isaacson(编辑)(1992)Recombinant DNA Vaccines,Marcel Dekker,NY，NY；Morse等(编辑)(2004)Handbook of CancerVaccines,Humana Press,Totowa,NJ)；Liao等(2005)Cancer Res.65:9089-9098；Dean(2005)Expert Opin.Drug Deliv.2:227-236；Arlen等(2003)Expert Rev.Vaccines 2:483-493；Dela Cruz等(2003)Vaccine21:1317-1326；Johansen等(2000)Eur.J.Pharm.Biopharm.50:413-417；Excler(1998)Vaccine 16:1439-1443；Disis等(1996)J.Immunol.156:3151-3158)。肽疫苗描述在(参见，例如，McCabe等(1995)CancerRes.55:1741-1747；Minev等(1994)Cancer Res.54:4155-4161；Snyder等(2004)J.Virology 78:7052-7060中。

病毒源性载体包括病毒、经修饰的病毒和病毒粒子(参见，例如，表2)。可将病毒源性载体直接向哺乳类受试者施用；或者可将其离体引入抗原呈递细胞(APC)内，其中然后向受试者施用APC。

病毒载体可以基于例如，披膜病毒类，包括甲病毒属和虫媒病毒；甲病毒属，例如辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、辛德毕斯菌株SAAR86、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)(SFV)、委内瑞拉马脑炎(VEE)、东方马脑炎(EEE)、西方马脑炎、罗斯河病毒、鹭山病毒(Sagiyami virus)、奥尼永尼永病毒(O'Nyong-nyong virus)、高地J病毒；虫媒病毒，例如黄热病病毒、黄热病菌株17D、日本脑炎、圣路易士脑炎、蜱传脑炎、登革病毒、西尼罗河病毒、Kunjin病毒(西尼罗河病毒的亚型)；动脉炎病毒属例如马动脉炎病毒；以及风疹病毒属例如风疹病毒、疱疹病毒、修饰的安卡拉痘苗(MVA)；禽痘病毒载体；禽痘载体；牛痘病毒载体；流感病毒载体；腺病毒载体；人乳头瘤病毒载体；牛乳头瘤病毒载体等。病毒载体可以基于正痘病毒属，例如天花病毒(天花)、牛痘病毒(天花的疫苗)、Ankara(MVA)或者哥本哈根菌株、鸵花、猴痘或牛痘。病毒载体可以基于麻雀痘病毒，例如禽痘病毒或者金丝雀痘病毒。

可获得腺病毒载体和腺相关的病毒载体(AAV)，其中腺病毒载体包括腺病毒血清型5(adeno5；Ad5)、adeno6、adeno11和adeno35。可获得至少51种人腺病毒血清型，将其归类成六个亚组(亚组A、B、C、D、E和F)。例如可用于评估对“空白”腺病毒载体的免疫应答腺病毒蛋白包括六邻体蛋白，例如六邻体3蛋白、纤维蛋白和五邻体基质蛋白，以及已经描述对腺病毒蛋白的人免疫应答(参见，例如，Wu等(2002)J.Virol.76:12775-12782；Mascola(2006)Nature 441:161-162；Roberts等(2006)Nature 441:239-243)。

表2.病毒源性疫苗载体

诸如树状细胞(DC)载体的抗原呈递细胞(APC)载体包括经抗原承载的细胞；经肿瘤裂解物承载的细胞；或者经包含核酸的组合物转染的细胞，其中核酸可以为例如质粒、mRNA或病毒。也可使用DC/肿瘤融合疫苗。参见，例如，Di Nicola等(2004)Clin.Cancer Res.10:5381-5390；Cerundolo等(2004)Nature Immunol.5:7-10；Parmiani等(2002)J.Natl.Cancer Inst.94:805-818；Kao等(2005)Immunol.Lett.101:154-159；Geiger等(2005)J.Transl.Med.3:29；Osada等(2005)Cancer Immunol.Immunother.11月5日,1-10[印刷前电子出版物]；Malowany等(2005)Mol.Ther.13:766-775；Morse和Lyerly(2002)World J.Surg.26:819-825；Gabrilovich(2002)Curr.Opin.Mol.Ther.4:454-458；Morse等(2003)Clin.Breat Cancer 3副刊4:S164-S172；Morse等(2002)Cancer Chemother.Biol.Response Modif.20:385-390；Arlen等(2003)Expert Rev.Vaccines 2:483-493；Morse和Lyerly(1998)Expert Opin.Investig.Drugs 7:1617-1627；Hirschowitz等(2004)J.Clin.Oncol.22:2808-2815；Vasir等(2005)Br.J.Haematol.129:687-700；Koido等(2005)Gynecol.Oncol.99:462-471。

可获得作为疫苗的诸如自体和同种异体肿瘤细胞的肿瘤细胞(Arlen等(2005)Semin.Oncol.32:549-555)。疫苗也可包含修饰的肿瘤细胞，例如肿瘤细胞裂解物或者经辐射的肿瘤细胞。通过并入编码诸如细胞因子(GM-CSF、IL-12、IL-15等)；NKG2D脂质；CD40L；CD80；CD86等的分子的核酸也可修饰肿瘤细胞(参见，例如，Dranoff(2002)Immunol.Rev.188:147-154；Jain等(2003)Ann.Surg.Oncol.10:810-820；Borrello和Pardoll(2002)Cytokine Growth Factor Rev.13:185-193；Chen等(2005)Cancer Immunol.Immunother.27:1-11；Kjaergaard等(2005)J.Neurosurg.103:156-164；Tai等(2004)J.Biomed.Sci.11:228-238；Schwaab等(2004)J.Urol.171:1036-1042；Friese等(2003)Cancer Res.63:8996-9006；Briones等(2002)Cancer Res.62:3195-3199；Vieweg和Dannull(2003)Urol.Clin.North Am.30:633-643；Mincheff等(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39:125-132)。

疫苗可包括裸DNA载体和裸RNA载体。可通过基因枪、电穿孔、细菌膜影、微球体、微粒、脂质体、聚阳离子纳米颗粒等来施用含有核酸的这些疫苗(参见，例如，Donnelly等(1997)Ann.Rev.Immunol.15:617-648；Mincheff等(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39:125-132；Song等(2005)J.Virol.79:9854-9861；Estcourt等(2004)Immunol.Rev.199:144-155)。

可获得通过基因枪、真皮内、肌肉内和电穿孔方法来使用裸核酸的试剂和方法。核酸疫苗可包含锁核酸(LNA)，其中LNA使得可使功能部分附接至质粒DNA，以及其中功能部分可以为佐剂(参见，例如，Fensterle等(1999)J.Immunol.163:4510-4518；Strugnell等(1997)Immunol.Cell Biol.75:364-369；Hertoughs等(2003)Nucleic Acids Res.31:5817-5830；Trimble等(2003)Vaccine 21:4036-4042；Nishitani等(2000)Mol.Urol.4:47-50；Tuting(1999)Curr.Opin.Mol.Ther.1:216-225)。核酸疫苗可联合促进不成熟树状细胞朝向疫苗迁移的试剂；以及促进成熟DC迁移至初免可出现处的引流淋巴结的试剂使用，其中这些试剂包括MIP-1α和Flt3L(参见，例如，Kutzler和Weiner(2004)J.Clin.Invest.114:1241-1244；Sumida等(2004)J.Clin.Invest.114:1334-1342)。

细菌载体包括，例如，沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、乳酸杆菌属、链球菌属、卡介苗、炭疽杆菌属和大肠杆菌。可将细菌工程化以含有编码重组抗原；异源性抗原；或者由肿瘤、癌症细胞或传染物衍生的抗原的核酸。而且，可以修饰细菌以减毒。在另一方面中，非李斯特菌属细菌疫苗可缺乏任意编码重组抗原的核酸(参见，例如，Xu等(2003)Vaccine 21:644-648；Pasetti等(2003)J.Virol.77:5209-5219；Loessner和Weiss(2004)Expert Opin.Biol.Ther.4:157-168；Grangette等(2002)Vaccine 20:3304-3309；Byrd等(2002)Vaccine 20:2197-2205；Edelman等(1999)Vaccine 17:904-914；Domenech等(2005)Microbes and Infection 7:860-866)。

可由活细菌制备杀死但具代谢活性(″KBMA")细菌以及特别是KBMA李斯特菌属通过使用DNA交联剂(例如，补骨脂素)来处理和/或通过使诸如重组修复基因(例如，recA)或者紫外光损伤修复基因(例如，uvrA、uvrB、uvrAB、uvrC、uvrD、phrA、phrB)的介导DNA修复的至少一种基因失活(参见，例如，Dubensky等的美国专利公开号2004/0228877和2004/0197343，其各自以引用方式整体并入本文)。

KBMA李斯特菌属中的一类是表达异源性抗原的经工程化的李斯特菌属uvrAB，其中使用核酸交联剂、补骨脂素化合物、氮芥化合物、4'-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4,5',8-三甲基补骨脂素或者β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯来处理工程化的细菌。也参见，例如，Dubensky等的美国公开专利申请号US 2004/0197343,MODIFIED FREE-LIVING MICROBES,VACCINE COMPOSITIONSAND METHODS OF USE THEREOF；Brockstedt等(2005)Nature Med.11:853-860)。

在一些实施方案中，初免疫苗包含选自痘病毒(VV)载体、树状细胞(DC)载体、腺病毒载体、裸DNA载体和

(CELL GENESYS,INC.)的试剂。

3.在辅助疗法中使用的李斯特菌属

在某些实施方案中，本发明包括使用李斯特菌属细菌，其中李斯特菌属经减毒。减毒可由突变编码病毒性因子的一种或多种基因所致，例如actA、内化蛋白B(inlB)、p60(自溶素)、猪单核细胞增生李斯特菌素O(LLO；hly基因)、磷脂酰胆碱磷脂酶C(PC-PLC)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC；plcA基因)、硫辛酸蛋白连接酶、以及公开在转让给Cerus Corporation的ENGINEERED LISTERIA ANDMETHODS OF USE THEREOF，美国系列号11/395,197(2006年3月30日提交)中的基因。本发明的方法包括但不限于使用一种或者多种李斯特菌属种类以及本文所识别的菌株。例如，本发明涵盖使用是或者由单核细胞增生性李斯特菌衍生的李斯特菌属细菌。也可使用诸如经工程化以表达一种或者多种猪单核细胞增生李斯特菌素O(hly基因；LLO)的无害李斯特氏菌的李斯特菌属的其他种类；plcA；plcB；或者诸如病毒性基因或者介导进入宿主细胞内的基因的其他基因(参见，例如，Johnson等(2004)Appl.Environ.Microbiol.70:4256-4266；Slaghuis等(2004)J.Infect.Dis.189:393-401；Milohanic等(2003)Mol.Microbiol.47:1613-1625)。可如PCT/US2004/003429和PCT/US2004/044080所述来制备适合于在本发明的加强疫苗中使用的李斯特菌属的减毒的菌株。所有上述申请均以引用方式整体并入本文。

减毒的李斯特菌属的非限制性例子描述在以下专利公开(其各自以引用方式整体并入本文)中：美国专利公开号2004/0228877；美国专利公开号2004/0197343；和美国专利公开号2005/0249748。还在诸如2006年3月30日提交的美国专利申请号11/395,197中提供非限制性例子，其以引用方式整体并入本文。

4.疫苗组合物

除了上述试剂之外，本发明的疫苗组合物可进一步包含各种赋形剂、佐剂、载体、辅助材料、调制剂等。任选存在的载体是自身不会诱导对吸纳组合物的个体的有害作用的分子。合适的载体通常为大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体(例如油滴或者脂质体)、以及非活性病毒粒子。特定载体的例子包括由聚甲基丙烯酸甲酯聚合物衍生的那些、以及由聚(丙交酯)以及称为PLG的聚(丙交酯-共-乙交酯)衍生的微粒，参见，例如，Jeffery等,Pharm.Res.(1993)10:362-368；McGee J P等,J Microencapsul.14(2):197-210,1997；O'Hagan D T等,Vaccine 11(2):149-54,1993。这些载体是本领域普通技术人员公知的那些。此外，这些载体可用作免疫刺激剂(“佐剂”)。而且，可使抗原与来自白喉、破伤风、霍乱等的细菌类毒素以及由大肠杆菌衍生的类毒素的细菌类毒素共轭。这些佐剂包括但不限于：(1)铝盐(明矾)，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油乳液配制物(具有或者不具有其他特异性免疫刺激剂，例如胞壁酰二肽(见下)或者细菌细胞壁组分)，例如(a)使用诸如Model 110Y微射流机(Microfluidics,Newton,Mass.)的微射流机配制成亚微细粒的含有5%角鲨烯、0.5%吐温80和0.5%司盘85(尽管不需要，但任选含有各种量的MTP-PE(见下))的MF59(国际公开号WO 90/14837)；(b)微流化成超微乳液或者涡旋以生成更大粒子尺寸乳液的含有10%角鲨烷、0.4%吐温80、5%普朗尼克嵌段共聚物L121和MDP的SAF；以及(c)含有2%角鲨烯、0.2%吐温80、以及一种或者多种选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、以及细胞壁骨架，优选为MPL+CWS(Detoxu)的细菌细胞壁组分的Ribi.TM.辅佐体系(RAS),(Ribi Immunochem,Hamilton,MT)；(3)可使用诸如Stimulon.TM.(Cambridge Bioscience,Worcester,Mass.)的皂草苷佐剂或者由此生成诸如ISCOM(免疫刺激复合物)的粒子；(4)费氏完全佐剂(Complete Freunds Adjuvant)(CFA)和费氏不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，例如白细胞介素类(IL-1、IL-2等)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、β趋化因子(MIP、1-α、1-β趋化因子等)；(6)诸如霍乱毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大肠杆菌不耐热毒素(LT)的细菌ADP-糖基化毒素的经解毒突变体，特别是LT-K63(其中在位置63处赖氨酸被野生型氨基酸取代)；LT-R72(其中在位置72处精氨酸被野生型氨基酸取代)；CT-S109(其中在位置109处丝氨酸被野生型氨基酸取代)；以及PT-K9/G129(其中在位置9处赖氨酸被野生型氨基酸取代以及在位置129处甘氨酸被取代)(参见，例如，国际公开号WO93/13202和WO92/19265)；以及(7)用作免疫刺激剂的其他物质以增强组合物的效果。

5.疫苗组合物的制备

通过本领域技术人员已知的方法来制备疫苗。通常，通过混合所需量的试剂与药学上可接受的赋形剂来制备一种或者多种上述试剂(用于初免或加强疫苗)。药学上可接受的赋形剂包括但不限于无菌蒸馏水、盐水、磷酸缓冲液、基于氨基酸的缓冲液或者碳酸氢盐缓冲液。

6.疫苗施用

本领域技术人员可测定在一个或多个剂量的疫苗中待提供的有效量的初免载体或加强载体。这些量落入可通过常规试验测定的范围内。

通过以下路径中任意一种或组合可测定初免疫苗和加强疫苗。在一方面中，通过相同路径来施用初免疫苗和加强疫苗。在另一方面中，通过不同路径来施用初免疫苗和加强疫苗。术语“不同路径”包括但不限于在身体上不同位置，例如口服、非口服、肠内、胃肠外、直肠、节点内(淋巴结)、静脉内、动脉、皮下、肌内、肿瘤内、肿瘤周围、肿瘤内、输注、粘膜、鼻子、在脑脊髓空间或者脑脊液等中；以及通过不同模式，例如口服、静脉内、以及肌肉内。

可以一个剂量给予有效量的初免或者加强疫苗，但不限于一个剂量。因此，该施用可以为两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或者更多次的疫苗的施用。当疫苗施用一次以上时，可以一分钟、两分钟、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多分钟的时间间隔；以一小时、两小时、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时等的间隔来分隔施用。在小时的情况中，术语“约”是指在30分钟内的任意时间间隔左右。也可通过1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、及其组合的时间间隔来分隔施用。本发明并不限于给药间隔在时间上均匀隔开，也涵盖不相同间隔的给药，例如由以1天、4天、7天和25天施用组成的初免时间表，仅用于提供非限制性例子。

在确定初免疫苗和加强疫苗的相对定时时应当考虑以下。据发现，抗原或者编码抗原的核酸的施用可刺激抗原特异性免疫细胞的扩张，导致出现峰值，随后为抗原特异性免疫细胞数目的缩减(参见，例如，Badovinac等(2002)Nature Immunol.3:619-626)。在到达峰值之前、与峰值同时或者在峰值之后可施用加强接种的启动。

当抗原特异性免疫细胞的种群扩张(数目上增加)至最终获得的抗原特异性免疫细胞的最大数目的至少20%；至至少30%；至至少40%；至至少50%；至至少60%；至至少70%；至至少80%；至至少90%；至至少95%；至至少99%的最终获得的抗原特异性免疫细胞的最大数目时，可启动加强接种的施用。可获得初免-加强疫苗的另外的时间表，例如，当抗原特异性细胞的种群缩减至90%的抗原特异性细胞的最大数目之下；80%之下；70%之下；60%之下；50%之下；40%之下；30%之下；20%之下；10%之下；5%之下；1.0%之下；0.5%之下；0.1%之下；0.05%之下；或者0.01%的抗原特异性免疫细胞的最大数目之下时可启动加强接种。抗原特异性细胞可被识别为对载体特异性抗原(对空白载体的特异性)具有特异性；或者对通过包含在载体中的核酸表达的异源性抗原具有特异性。

在其他方面中，在启动初免接种之后约5天；在启动初免接种之后约10天；在启动初免接种的施用之后约15天；约20天；约25天；约30天；约35天；约40天；约45天；约50天；约55天；约60天；约65天；约70天；约75天；约80天；约6个月；以及约1年时可启动加强接种的施用。

在初免接种之后5-10天；在初免接种之后10-15天；在初免接种之后15-20天；在初免接种之后20-25天；在初免接种之后25-30天；在初免接种之后30-40天；在初免接种之后40-50天；在初免接种之后50-60天；在初免接种之后60-70天等可施用加强接种。

本领域技术人员可测定在启动初免接种和启动加强接种之间的时间段。例如，它可基于对发生初免免疫之后测定的生理参数敏感的算法。

通过模态的效能、采用的疫苗递送、主题需求、以及取决于操作者的判断来至少部分地确定剂量和方案。

例如，可以剂量或者用药量来施用在本发明中使用的疫苗中的李斯特菌属，其中各剂量包含10⁷-10⁸个李斯特菌属/70kg体重；2x10⁷-2x10⁸个李斯特菌属/70kg体重；5x10⁷-5x10⁸个李斯特菌属/70kg体重；10⁸-10⁹个李斯特菌属/70kg体重；2.0x10⁸-2.0x10⁹个李斯特菌属/70kg体重；5.0x10⁸-5.0x10⁹个李斯特菌属/70kg体重；10⁹-10¹⁰个李斯特菌属/70kg；2x10⁹-2x10¹⁰个李斯特菌属/70kg；5x10⁹-5x10¹⁰个李斯特菌属/70kg；10¹¹-10¹²个李斯特菌属/70kg；2x10¹¹-2x10¹²个李斯特菌属/70kg；5x10¹¹-5x10¹²个李斯特菌属/70kg；10¹²-10¹³个李斯特菌属/70kg；2x10¹²-2x10¹³个李斯特菌属/70kg；5x10¹²-5x10¹³个李斯特菌属/70kg等湿重。基于每1.7平方米表面积计，或基于1.5kg肝重计，也提供以上各剂量。注意，在施用本发明的李斯特菌属时，小鼠肝脏重约1.5克。人肝脏重量约1.5千克。

在本发明的一些实施方案中，加强剂量的李斯特菌属增强至少2倍；约3至5倍或者5倍至10倍；或者10倍至100倍或者更大倍数的初免剂量免疫应答。在本发明的一些实施方案中，初免剂量和加强剂量具有对免疫应答的协合效应。在本发明的一些实施方案中，增强的免疫应答包括T-细胞应答；以及在一些实施方案中，T-细胞应答是CD8⁺ T-细胞应答。在本发明的一些实施方案中，初免剂量和加强剂量破坏哺乳动物对于靶抗原的耐受状态。以下提供所有这些实施方案的例子。

7.测定免疫应答的方法

各种用于测量免疫应答(包括测量体液和细胞免疫应答)的体外和体内测定法在本领域是已知的，其包括但不限于标准免疫测定法，例如RIA、ELISA测定法；细胞内染色；包括例如淋巴组织增殖(淋巴母细胞激活)测定法的T细胞测定法；CTL细胞毒性细胞测定法；或者通过测定对在敏化受试者中的抗原具有特异性的T-淋巴母细胞。这些测定法是本领域技术人员公知的。参见，例如，Erickson等,J.Immunol.(1993)151:4189-4199；Doe等,Eur.J.Immunol.(1994)24:2369-2376。测量细胞介导的免疫应答的当前方法包括细胞内细胞因子或者通过T细胞种群分泌的细胞因子的测量；或者通过表位特异性T细胞的测量(例如，通过四聚体技术)(由McMichael,A.J.和O'Callaghan,C.A.,J.Exp.Med.187(9)1367-1371,1998；Mcheyzer-Williams,M.G.等,Immunol.Rev.150:5-21,1996；Lalvani,A.等,J.Exp.Med.186:859-865,1997综述)。在本文公开的示意性实施方案中，酶联免疫斑点(ELISPOT)测定法用于检测和分析分泌干扰素

的单独的细胞。酶联免疫斑点法测定法和试剂可由BDBiosciences 2350 Qume Drive San Jose,CA,95131获得。ELISPOT测定法能够从激活的首次接触试验的和记忆的T细胞种群中检测生成细胞因子的细胞以及通过采用高亲和捕获以及检测抗体和酶扩增来得到其特异性和敏感性。关于使用ELISPOT测定法的另外的信息提供在J.Immunol.Methods.2001,254(1-2):59中。诸如非人灵长类的动物模型是本领域已知的。例如，小鼠是对于人免疫应答的可接受的模型。小鼠NK细胞对肿瘤的应答是人NK细胞对肿瘤的应答的可接受的模型。此外，小鼠T细胞是人T细胞的模型；小鼠树状细胞(DC)是人DC的模型；小鼠NKT细胞是人NKT细胞的模型；小鼠先天应答是人先天应答的可接受的模型等。模型研究公开用于例如CD8⁺T细胞；中枢记忆T细胞；以及效应记忆T细胞(参见，例如，Walzer等(2002)J.Immunol.168:2704-2711)；NK细胞的两种亚型(参见，例如，Chakir等(2000)J.Immunol.165:4985-4993；Smith等(2000)J.Exp.Med.191:1341-1354；Ehrlich等(2005)J.Immunol.174:1922-1931；Peritt等(1998)J.Immunol.161:5821-5824)；NKT细胞(参见，例如，Couedel等(1998)Eur.J.Immunol.28:4391-4397；Sakamoto等(1999)J.Allergy Clin.Immunol.103:S445-S451；Saikh等(2003)J.Infect.Dis.188:1562-1570；Emoto等(1997)Infection Immunity 65:5003-5009；Taniguchi等(2003)Annu.Rev.Immunol.21:483-513；Sidobre等(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.101:12254-12259)；单核细胞/巨噬细胞(Sunderkotter等(2004)J.Immunol.172:4410-4417)；DC的两个谱系(Boonstra等(2003)J.Exp.Med.197:101-109；Donnenberg等(2001)Transplantation 72:1946-1951；Becker(2003)Virus Genes 26:119-130；Carine等(2003)J.Immunol.171:6466-6477；Penna等(2002)J.Immunol.69:6673-6676；Alferink等(2003)J.Exp.Med.197:585-599)。包括Toll样受体(TLR)的小鼠先天应答是人先天免疫应答的模型，如公开在(参见，例如，Janssens和Beyaert(2003)Clinical Microb.Revs.16:637-646)中。小鼠中性白细胞是人中性白细胞的可接受的模型(参见，例如，Kobayashi等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:10948-10953；Torres等(2004)72:2131-2139；Sibelius等(1999)Infection Immunity 67:1125-1130；Tvinnereim等(2004)J.Immunol.173:1994-2002)。鼠对李斯特菌属的免疫应答是人对李斯特菌属的应答的可接受模型(参见，例如，Kolb-Maurer等(2000)Infection Immunity 68:3680-3688；Brzoza等(2004)J.Immunol.173:2641-2651)。

8.初免-加强方案的使用

通过施用调控免疫系统的试剂可治疗和/或抑制癌症和感染。涵盖在本发明内的初免-加强方法引起上调的免疫应答，以及包括破坏对自身抗原的耐受。因此，预期这些初免-加强方法可用于抑制癌症的生长和/或改善与癌症相关的一种或者多种症状。也预期，初免-加强方法可用于预防和/或治疗由病原体所导致的疾病。

除了以上之外，这些方案可用于确定哺乳动物是否对治疗有应答。例如，当使用对特异性抗原的初免-加强方法时，在加强之后获得显著性免疫应答失败表明，哺乳动物未对靶抗原应答以及应当继续治疗的可选择的方式。当癌症或者病原体的遗传背景使得靶抗原缺乏或者以不与靶抗原交叉反应的方式修饰时，可以为该例子。

实施例

应理解，本发明并不限于本文公开的特定例子，因此可改变。也应理解，因为本发明的范围通过所附权利要求来示出，所以这些例子并非旨在限制性。

在实施例中使用的方法的一般信息

通过收获脾细胞来评估对疫苗的免疫应答，该脾细胞是提供包括T细胞和树状细胞(DC)的免疫系统的细胞。通过使用一种或者多种肽来孵育脾细胞并测量免疫细胞活性来测量抗原特异性免疫应答，其中通过细胞内染色(ICS)和酶联免疫斑点测定法来测定活性。在一些测定法，仅添加单个肽，其中肽仅含有肿瘤抗原的一个表位。在其他测定法中，添加包括抗原的全部长度的肽的整个文库。

ICS测定法包括透化脾细胞，以及使用结合聚集在免疫细胞内的细胞因子的抗体来处理，其中抗体允许荧光标记。布雷菲德菌素阻断蛋白转运，以及引起在免疫细胞内细胞因子的聚集。

Elispot(酶联免疫斑点)测定法对于分泌的蛋白敏感，其中在将免疫细胞置于孔中一段时间开始分泌蛋白。将捕捉抗体结合至孔，其固定化分泌的细胞因子。在分泌周期之后，将细胞移除，并且使用检测抗体以检测固定的细胞因子。捕捉抗体和检测抗体结合细胞因子的不同区。公开了ICS和酶联免疫斑点测定法的方法细节(参见，例如，Dubensky等的2005年11月10日公开的美国专利申请公开号2005/0249748)。

当施用的载体含有编码卵清蛋白的核酸时，通过ICS测定法或者酶联免疫斑点测定法的方式的任意诱导的免疫应答的分析用于来自卵清蛋白,OVA_257-264(SIINFEKL(SEQ ID NO:l))的标准肽，其中将肽加入以及使用脾细胞制备物来孵育。

在下列构建物中使用的人间皮素的核酸序列在转让给CerusCorporation的于2006年3月30日提交的ENGINEERED LISTERIAAND METHODS OF USE THEREOF，美国专利系列号11/395,197中。跨越人间皮素的全部长度的间皮素肽文库由153种肽组成，各15-mer，各15-mer与下一个15-mer重叠11个氨基酸。

表1中鉴定了Lm-hMeso38(一种在以下例子中使用的单核细胞增生性李斯特菌的构建体)。也参见，于2006年3月30日提交的ENGINEERED LISTERIA AND METHODS OF USE THEREOF，美国专利系列号11/395,197。Lm-mMeso是与Lm-hMeso38相同的构建体，除了全长人间皮素序列被全长小鼠间皮素序列取代外。全长小鼠序列可由GenBank登录号NM_018857得到。

表3.单核细胞增生性李斯特菌-hMeso38(Lm-hMeso38)

编码OVA(″Lm-OVA")的单核细胞增生性李斯特菌的制备如在美国专利公开号2004/0197343(美国专利系列号10/773,618)中论述。

如(Overwijk等(1998)J.Exp.Med.188:277-286)所述由N.P.Restifo制备和提供包含编码全长卵清蛋白的核酸的牛痘病毒源性载体(VV-OVA)。

基于腺病毒的载体含有编码全长人间皮素或全长小鼠间皮素(Ad-hMeso或Ad-mMeso)的核酸。也使用另外称为“空白Ad载体”的未编码异源性抗原的对照Ad载体。所有对照和编码抗原的Ad载体均基于具有E1和E3区缺失的腺病毒血清型5，并且均利用由Stratagem(San Diego,CA)获得的"AdEasy"体系来得到以及根据供应商所述的方法来得到。将抗原克隆在E1基因座处。将编码异源性抗原的核酸整合至与CMV启动子操作连接的AdEasy的穿梭载体内。

是指含有编码小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸的失活的肿瘤细胞，其中肿瘤细胞系是CT-26细胞，表达gp70的细胞系。AH1是gp70的表位，一种CT26细胞的免疫显性抗原。如公开(参见，例如，Yoshimura等(2006)Cancer Res.66:1096-1104；Jain等(2003)Annals Surgical Oncol.10:810-820；Zhou等(2005)Cancer Res.65:1079-1088；Chang等(2000)Int.J.Cancer86:725-730；Borrello和Pardoll(2002)Cytokine Growth Factor Rev.13:185-193；Thomas等(1998)Human Gene Ther.9:835-843)制备和施用

(CELL GENESYS,INC.)。

通过处理缺失uvrAB基因的活Lm来制备杀死但具代谢活性Lm("KBMA-Lm")，使用补骨脂素和紫外线，连同uvrC基因产物的这些表达形成核苷酸切除修复所需的核酸外切酶，这导致少量的基因组的交联(参见，例如，美国专利系列号10/773,618。Dubensky等的美国专利公开号2004/0197343.MODIFIED FREE-LIVING MICROBES,VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF；Brockstedt等(2005)Nature Med.11:853-860)。

实施例1

使用1x10⁶pfu的编码OVA的牛痘病毒("VV")或者使用5x10⁶cfu的缺失actA和inlB病毒性决定簇且编码OVA的重组单核细胞增生性李斯特菌("Lm")在第0天时免疫C57BL/6只小鼠(每组3只)。在第21天使小鼠接纳加强剂量的VV或者Lmat剂量，在各例子中，其与初免免疫剂量是等同的。处死小鼠以及在第27天收获脾细胞。为了评估在单次免疫之后疫苗诱导的OVA特异性CD8+T细胞的大小，对照小鼠在第20天仅接纳VV或Lm的单次免疫，然后将其处死，并且在第27天收获脾细胞。在ISC测定中使用OVA_257-264肽来测定OVA特异性CD8+T细胞应答。

由初免-加强方案所致的OVA特异性CD8+T细胞免疫应答显示在图1A中。如图中所示，当比较LM初免/VV加强时，利用VV初免/Lm加强的初免-加强方案导致OVA特异性CD8⁺细胞的百分率几乎加倍。此外，在VV初免/Lm加强中OVA特异性CD8⁺细胞的百分率比同源性Lm初免/Lm加强高约3倍；以及比同源性VV初免/VV加强高约9倍。该数据提供在异源性初免-加强方案中定向性的迹象，在使用Lm加强的体系获得更好的结果。

实施例2

使用编码人间皮素的3x10⁷pfu腺病毒("AV"或者"腺-hMeso")或者使用编码人间皮素(″Lm-hMeso38")的5x10⁶cfu LmΔactA/inlB在第0天注射每组3只的Balb/c小鼠。在第21天，小鼠，以在各例子中与初免免疫剂量等同的剂量接纳加强剂量的AV或者Lm-hMeso38。处死小鼠以及在第27天收获脾细胞。为了评估在单次免疫之后疫苗诱导的OVA特异性CD8+T细胞的大小，对照小鼠在第20天仅接纳AV和Lm-hMeso38，然后将其处死，并且在第27天收获脾细胞。

由初免-加强方案所致的疫苗诱导的人间皮素特异性CD4+和CD8+细胞免疫应答显示在图1B中。当与给予Lm初免/AV加强方案的一组小鼠比较时，AV初免/Lm-hMeso38加强比对人间皮素(″hMeso")特异的脾CD8+细胞的百分率的量级高约10倍，这表明在异源性加强方案中定向影响对编码的抗原特异的疫苗诱导的细胞免疫的量级以及从使用Lm加强的体系中获得更好的结果。

实施例3

Balb/c小鼠(每组3只)接纳初免剂量和加强剂量以引起对人间皮素的免疫应答。使用全部编码人间皮素的所示载体的初免和加强方案示出在图2中。如从ICS测定法的结果可见，AV初免/Lm加强的方案产生比Lm初免/AV加强的人间皮素(″hMeso")特异性CD8⁺细胞的百分率高3至4倍。此外，在图2中结果也显示：AV初免/Lm加强显著高于测试的任意其他异源性初免-加强方案。

实施例4

测试了不同AV初免剂量对于在疫苗诱导的脾hMeso特异性CD4+和CD8+T细胞的量级上在异源性AV初免/Lm加强中的恒定Lm加强的作用。所有载体编码人间皮素。HBSS用作对照。利用的初免和加强方案示出在图3A中，各实验组由三只C57BL/6小鼠组成。在这些研究中，在ICS之前将从免疫的小鼠中获得的的脾细胞用由4个氨基酸长度偏移的肽15氨基酸("15x11文库")组成的间皮素肽池文库刺激5小时，该间皮素肽池文库对应于全长间皮素蛋白。在初免-加强方案中由AV的滴定所致的人间皮素特异性细胞免疫应答示出在图3A中。如图所示，在更大量的AV下获得特异性T细胞应答的显著增加，以及CD8⁺T细胞应答大于CD4⁺T细胞应答。

实施例5

除了在初免和加强之间的时间是38天，以及使用Lm hMeso 38来免疫化对照小鼠但未使用AV来初免之外，在Balb/c小鼠中使用类似于在实施例4中使用的免疫方案(参见图3B)。如图3B中所示，在更广范围的AV量上特异性T细胞应答显著增强；以及再次，CD8⁺T细胞应答大于CD4⁺的T细胞应答。在Balb/c小鼠中，在使用5x10⁶cfu的Lm hMeso 38加强之后，诱导在AV初免剂量下低至1x10⁴pfu基本水平的hMeso特异性CD8+T细胞。

实施例6

在对AV的预先存在的免疫的存在下，测试AV初免/Lm加强的有效性。在第一次研究中，使用图4A中所示的方案来测试在预先存在的腺病毒特异性免疫的存在下对AV免疫的应答。在使用编码人间皮素的AV免疫28天之前，通过使用各种水平的如图所示的“空白Ad载体”免疫化小鼠来引起预先存在的腺病毒特异性免疫。该研究使用5只Balb/C小鼠/组。在第0天向小鼠注射空白Ad粒子以及随后在第28天，注射编码人间皮素的AV(″Ad-hMeso")。在第35天收获脾细胞以及用在ICS测定中。Ad-空白和Ad-hMeso载体均为血清型5。通过使用人间皮素肽池刺激脾细胞来测量间皮素特异性免疫应答；使用类型I Hex3表位来测量AV特异性应答。显示在图4A中结果表明：在预先存在的Ad5特异性细胞免疫的存在下，当使用相同的编码人间皮素的Ad5载体对小鼠免疫时，仅可诱导低hMeso特异性应答。

第二次研究测试在预先存在AV免疫的小鼠中AV初免/Lm加强方案之后hMeso特异性细胞免疫应答(在图4B的X轴上显示施用的AV pfu的量)。除了在使用AV初免之后20天，使用Lm-hMeso38来给予小鼠加强，以及替代测量AV特异性T细胞免疫应答，通过空斑减数实验来测定AV特异性中和抗体之外，使用的方案(显示在图4B中)类似于测试初免的方案。当比较图4A时，在图4B中结果显示：尽管对AV血清型5的预先存在的中和免疫的存在，但是在AV初免之后联合Lm hMeso38的加强导致引入hMeso特异性细胞免疫的显著增加。

实施例7

如下进行使用肿瘤细胞初免/Lm加强的异源性初免-加强。方案使用

(CELL GENESYS,INC.)初免/Lm-AH1-A5加强。"GVAX"是指含有编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸的失活的肿瘤细胞。施用的单核细胞增生性李斯特菌是Lm-ΔactA-OVA-AH1-A5。Lm-ΔactA-OVA-AH1-A5是重组单核细胞增生性李斯特菌，其通过actA基因缺失来减毒；以及含有在李斯特菌属基因组中单个拷贝的抗原表达盒；其在tRNA^Arg基因座处被整合，其中表达盒含有在卵清蛋白内框架内插入AH1-A5(Brockstedt等(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:13832-13837)。AH1-A5是通过CT26腺癌细胞系表达的gp70内源性注射抗原的AH1 L^d免疫显性表位的改变的T细胞脂质，并且通常用于对肿瘤抗原，gp70的免疫应答中(Slansky等(2000)Immunity 13:529-538；Jain等(2003)AnnalsSurgical Oncol.10:810-820)。

对于异源性初免/加强，每组3只小鼠接纳

(CELLGENESYS,INC.)(1x10⁶个细胞)(s.c.)作为初免和Lm-OVA-AH1-A5(5x10⁶cfu)(i.v.)作为加强。对于具有GVAX的同源初免/加强疫苗，小鼠接纳

(CELL GENESYS,INC.)初免(1x10⁶个细胞)(s.c)以用于初免和加强。对于仅具有Lm的同源初免/加强疫苗，给予小鼠Lm-OVA-AH1-A5(5x10⁶cfu)(i.v.)以用于初免和加强。进行单独的同源初免/加强试验，其中仅s.c、i.m.或i.v.施用Lm。在所有情况下，在t=0天时进行初免；在t=21天时进行加强；在t=29天时收获脾细胞。如图所示，使用单独施用单疫苗(仅

(CELLGENESYS,INC.)；仅Lm-OVA-AH1-A5)来处理小鼠。

结果证实，

(CELL GENESYS,INC.)初免之后的Lm-ΔactA-OVA-AH1-A5加强引起的AH1特异性免疫应答比通过任意途径的施用的任意同源初免/加强免疫方案的更大。

实施例8

如下进行AV初免/Lm加强与树状细胞(″DC")初免/Lm加强的比较。使用每组5只Balb/c小鼠。以2x10⁶个树状细胞(i.v.)的量来施用树状细胞。将含有编码人间皮素的核酸的腺病毒源性载体以1x10⁸cfu的剂量来施用(i.m.)。将Lm-hMeso38以5x10⁶cfu的量来施用(i.v.)。将肽脉冲的DC以2x10⁶ DC的剂量来施用(i.v.)。DC和Lm初免和加强免疫化相隔8天，以及AV和Lm初免和加强免疫化相隔14天。在所有小鼠中，在使用Lm hMeso 38的加强免疫化之后数天来测量脾间皮素131-139特异性CD8+T细胞。对照示出在图6A和图6B中。

如下制备肽脉冲的DC。使用hMeso_{131_139}(SGPQACTRF)来脉冲DC。使用高GM-CSF浓度(20ng/mL鼠GM-CSF)(R&D Systems,Minneapolis,MN)从Balb/c小鼠的整个骨髓中制备DC。在进行初始接种以及GM-CSF富集之后第8天，收获非粘着T细胞以及经显型验证其为骨髓树状细胞(CD11c^hi)。使用脂多糖(LPS)来处理DC(24h)以及使用1.0微摩尔肽(hMeso_{131_139})(0.001mM)脉冲1小时。在将1x106DC注射至受体Balb/c小鼠之前，将肽承载的DC洗涤两次。

在图6A中示出的ICS测定的结果证实：具有DC-hMeso 131-139初免/Lm-hMeso38加强的异源性初免/加强以及异源性腺-hMeso初免/Lm-hMeso38加强各自诱导间皮素特异性细胞免疫应答，其中对两种初免/加强方案的免疫应答的水平基本相同。

显示在图6B中酶联免疫斑点测定法的结果证实：具有DC-hMeso131-139初免/Lm-hMeso38加强的异源性初免/加强以及异源性腺-hMeso初免/Lm-hMeso38加强各自诱导间皮素特异性细胞免疫应答，其中对于两种初免/加强方案的免疫应答水平基本相同。

实施例9

在进行如下DC初免之后比较作为加强的Lm、AV和VV。在第0天，将Balb/c小鼠(每组五只)静脉内接种1x10⁶个骨髓源性树状细胞(初免)。如实施例8所述制备DC。在第21天，给小鼠提供加强，其中加强是以下之一：Lm-hMeso38(5x10⁶cfu,i.v.)；Ad-hMeso(1x10⁷pfu,i.m.)或者牛痘病毒-hMeso("VV-hMeso")(1x10⁶pfu,i.p.)。单独的小鼠组接纳HBSS，而不是加强疫苗。在加强接种之后5天通过细胞内细胞因子染色(ICS)来测定Meso_131-139特异性CD8⁺T细胞应答。

显示在图6C中结果表明：尽管AV-hMeso缺失给出对hMeso细胞特异性应答更显著加强，使用Lm作为加强剂来获得约5倍更高的结果。

实施例10

比较在使用Lm作为加强的异源性初免-加强方案中作为初免的AV和裸DNA。此外，将小鼠间皮素替代人间皮素以测定是否可以使用异源性初免-加强方案来破坏耐受性。在研究中，使用Balb/c小鼠。施用异源性DNA初免/Lm加强和异源性Ad初免/Lm加强疫苗，使用整个间皮素肽文库来评估间皮素特异性免疫应答。DNA初免/Lm加强是DNA-mMeso(0.1mg)(i.m.)初免/Lm-mMeso38(5x10⁶cfu)(i.v.)加强(图7A)。Ad初免/Lm加强是Ad-mMeso(1x10⁸pfu)(i.m.)初免/Lm-mMeso38(5x10⁶cfu)(i.v.)加强(图7B)。如下制备裸DNA载体，DNA-mMeso。将编码全长小鼠间皮素的核酸插入pCDNA3(一种真核表达载体)(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)内。

在第0天施用初免；在第13天施用加强；在第18天收获脾细胞。使用来自小鼠间皮素(″mMesothelin")肽文库的肽来处理收获的脾细胞，其中将独特的肽加入各含有脾细胞的孔中，以及其中使用酶联免疫斑点测定法来评估免疫应答。利用来自免疫化小鼠的脾细胞的充足数量的孔，使得可使用包括小鼠间皮素蛋白的全长的独特肽(15氨基酸长，偏移4个氨基酸)，使得T细胞反应性小鼠间皮素肽可被识别。

在图7A中结果表明：当对在mMesothelin肽文库中的各肽单独评估免疫应答时，DNA-mMeso初免/Lm-mMeso38加强引起相对较少的免疫应答。反之，在图7B中的结果表明：Ad-mMeso初免/Lm-mMeso38加强诱导对来自小鼠间皮素肽文库的小鼠间皮素肽编号278、279和280的相对较高免疫应答。发现相对较低的免疫应答，其中使用来自小鼠间皮素肽文库的其他肽。图7C是孔的照片，其中将脾细胞暴露于间皮素肽编号278、279或280，以及其中照片示出来自酶联免疫斑点测定法的斑点。因此，显示在图7B和图7C中结果证实：AV初免/Lm加强方案导致对mMesothelin的特异性细胞免疫应答。而且，结果也示出在给予由编码小鼠间皮素的两载体AV和Lm载体组成的初免和加强免疫方案的小鼠中对小鼠间皮素内源性抗原的耐受性的破坏。

实施例11

评估作为初免剂和/或加强剂的KB MA Lm的效果。在第0天使用作为初免的KBMA-Lm来施用C57BL/6小鼠(每组3只)。在第14天给予以下之一的加强：“活”Lm；KBMA-Lm；或VV。在第14天也施用KBMA-Lm和活Lm的对照。在第19天处死小鼠，然后收获脾细胞。

李斯特菌属构建物具有可操作连接至BaPA分泌序列的hly启动子和卵清蛋白，其在tRNAArg基因座处具有基因组整合。

注射的KBMA单核细胞增生性李斯特菌ΔactAΔuvrAB-OVA(KBMA Lm)的数目是3x10⁸个细菌粒子。KBMA Lm已经经补骨脂素和UV光处理。施用的“活”单核细胞增生性李斯特菌(Lm-ΔactAΔuvrAB-OVA)的量为1x10⁶cfu。施用的牛痘病毒源性载体(VV-OVA)的量为1x10⁶pfu。

通过使用由卵清蛋白(OVA_257-264)衍生的标准八肽的肽-脉冲以及通过IFN-γ的细胞内染色(ICS)测定法的方式测量卵清蛋白特异性免疫应答来测定免疫应答。

如从显示在图8中的结果所示，KBMA-Lm是活性初免剂。KBMA-Lm初免/活Lm加强引起更高水平的免疫应答，其中使用异源性KBMA-Lm初免/VV加强疫苗出现更低水平的免疫应答。

实施例12

将每组15只Balb/c小鼠肌肉内接种1e8pfu的空白腺病毒(即，未表达AH1、AH1/A5或mMesothelin的腺病毒)或者表达AH1/A5或鼠间皮素(mMesothelin)的腺病毒，在21天之后，使用不编码异源性抗原的5e6cfu的Lm或者表达AH1/A5或mMesothelin的Lm来静脉内加强小鼠。描述了AH1/A5(参见，例如，Brockstedt等(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:13832-13837)。在5天之后获取每组5只小鼠的脾脏以评估AH1/A5(图9A)和mMesothelin(图9B)免疫应答。在加强接种之后一周，使用4e5 CT26细胞静脉内激发其余小鼠。监控小鼠的存活率(图9C)。在图9A-9C中，"Ad"表示空白腺病毒；"Lm"表示未编码异源性抗原的单核细胞增生性李斯特菌；"Ad-AH1/A5"表示表达AH1/A5的腺病毒；"Ad-mMeso"表示表达鼠间皮素的腺病毒；"Lm-AH1/A5"表示编码AH1/A5的单核细胞增生性李斯特菌；以及"Lm-mMeso"表示编码鼠间皮素的单核细胞增生性李斯特菌。

如在图9A中所示，根据ICS测定法，使用Ad-AH1/A5初免和Lm-AH1/A5加强的初免/加强导致大量抗原特异性CD8+T细胞免疫应答。如所示，AH1肽和AH1/A5肽由gp70(一种CT26肿瘤细胞的内源性蛋白)衍生。如所示，使用AH1肽或者AH1/A5肽来补充脾细胞孵育。Gp70是CT26的内源性蛋白。当将脾细胞与添加的AH1/A5肽一起孵育时，具有更大的CD8+T细胞免疫应答；并且与添加的AH1肽一起孵育时则具有更小的CD8+T细胞免疫应答。

如下证实免疫应答的特异性。使用空白腺病毒和未编码异源性Ag的Lm的初免/加强不会导致可检测的CD8+T细胞免疫应答。而且，使用表达鼠间皮的载体的初免/加强不会导致可检测的AH-或AH1/A5特异性CD8+T细胞免疫应答，这再次证实免疫应答的特异性(图9A)。

显示在图9B中的数据证实对另一异源性抗原，即间皮素的免疫应答的初免/加强刺激；以及免疫应答对该抗原具特异性。示出特异性，即空白Ad初免/Lm(未编码异源性Ag)加强失败；或者Ad AH1/A5初免/Lm AH1/A5加强刺激mMesothelin特异性CD8+T细胞免疫应答。

在图9C中所示的数据证实：Ad-AH1/A5初免/Lm-AH1/A5加强增加用CT26肿瘤细胞激发的存活率。附图也证实：Ad-mMeso初免/Lm-mMeso增加CT26肿瘤细胞激发的存活率。如与使用HBSS处理比较(图9C)，使用空白载体(空白Ad；未表达异源性Ag的Lm)处理初免加强并未改变存活率。

实施例13

研究试剂，CRS-207由编码肿瘤抗原间皮素(LmΔactA/ΔinlB/hMeso)的细胞内细菌单核细胞增生性李斯特菌(LM)的活-减毒的菌株组成。施用CRS-207的目的是通过细胞介导的免疫(CMI)的诱导来诱导抗肿瘤应答，该细胞介导的免疫(CMI)针对表达在诸如恶性间皮瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、以及胰腺癌以及卵巢癌的细胞表面上的间皮素。通过缺失来自野生型Lm的基因组的两种病毒性-决定簇基因的全部编码序列来获得CRS-207。两种病毒性-决定簇基因，inlB和actA的产物分别有利于非吞噬细胞的Lm入侵以及细胞至细胞扩散。如通过小鼠中的病毒性评估，这些两种编码序列的合并缺失导致减毒超过1,000倍。然而，通过在肝脏和脾脏中的巨噬细胞和其他吞噬细胞对CRS-207的摄取被保留并且导致局部炎症应答和激活以及募集至肝脏的免疫效应细胞，例如自然杀伤(NK)细胞和T细胞。在通过吞噬细胞(包括DC和巨噬细胞)对CRS-207的摄取之后，将间皮素表达和释放至细胞溶质间隔内，以及随后将其处理通过内源性MHC I类呈递途径，这导致抗间皮素细胞介导的免疫(CMI)的激活。激活间皮素特异性CMI的其他机制可包括在被CRS-207感染和细胞凋亡之后通过来自巨噬细胞和/或其他细胞类型的APC摄取和交叉呈递抗原。

将CRS-207配制为两种浓度：高剂量和低剂量。选择两种浓度以便于制备在临床研究中期望的剂量范围。参见表1a和1b以用于配制CRS-207研究试剂。

表1a CRS-207高剂量配制物

表1b CRS-207低剂量配制物

将CRS-207在-75℃或者更低温度下冷冻储存。它由混悬在1.5mL的杜尔贝科磷酸缓冲盐水(DPBS)和9%v/v甘油中的减毒的Lm组成。各高剂量小瓶具有5x10¹⁰cfu/mL的浓度以及各低剂量小瓶具有1x108cfu/mL的浓度。

将CRS-207递送至具有卵巢或胰腺、非小细胞肺癌或者恶性间皮瘤的晚期癌症的人受试者(≥18周岁)中，这些受试者使用标准治疗法失败或者其不是标准治疗法的候选对象。纳入本研究的受试者符合所有以下选择标准：

经标准治疗失败或者不是标准治疗的候选对象的组织学上或者细胞学上记录的恶性间皮瘤；胰腺的腺癌；或者表达间皮素的非小细胞肺癌(NSCLC)或者卵巢癌。

ECOG性能得分0-1或者人体机能状态量表(KarnofskyPerformance Status)(KPS)80%至100%。

预期估计寿命长于研究的持续时间。

在所有受试者的研究期以及在施用CRS 207之后28天的期间内，可能怀孕的女性受试者和所有男性受试者必须同意使用高度有效避孕的医学上可接受的方法(口服激素避孕、避孕套以及杀精子剂或者激素移植物)。无论其他方法如何，必须包括避孕的屏障方法。

受试者提供知情同意书以及愿意和能够遵守所有研究工序。

充足的器官功能限定如下：

血液学

血小板≥100x10⁹/L

血红蛋白≥9.0g/dL

总WBC计数≥3.5x10⁹/L

ANC≥1.5x109/L

总淋巴母细胞计数≥0.8x10⁹/L

PT/INR和PTT≤1.3x临床实验室ULN

肝脏

胆红素≤1.5x临床实验室ULN

AST和ALT≤2.5x临床实验室ULN(对于具有胰腺癌的患者，≤3.5x临床实验室ULN是可接受的)

GGT≤5x临床实验室ULN

碱性磷酸酶≤2.5x临床实验室ULN

肾脏

血清肌酸酐≤1.5x临床实验室ULN

此外，受试者不能具有以下排除标准：

已知转移至中央神经系统。

李斯特氏病史或者使用基于李斯特菌属的疫苗的接种病史。

已知对青霉素过敏。

临床显著心脏病(例如在3个月内未受控制的心绞痛、心肌梗塞、纽约心脏协会III或IV的充血性心力衰竭)。

具有瓣膜性心病的个体，其需要抗生素预防治疗以用于预防与AHA指南一致的心内膜炎(Dajani等Circulation,1999)。

如通过脉搏血氧计测量，在室温空气中O2饱和度<92%。

基于病史和身体检查肺功能受损或者疑似受损的研究受试者不具有入选研究条件，除非记录VC、DLCO和FEV1的预期值>60%。

需要全身治疗的活跃的、临床显著性自身免疫性疾病或者自身免疫疾病的病史。

对应于3级或4级CTCAE临床代谢/实验室异常的临床试验结果。

肝硬化或者临床相关腹水或者具有阻塞性黄疸的大量风险的个体(例如，通过肝门的肿瘤质量缩减)。

人工(假体)关节或者不能容易移除的其他人工移植物或者装置。如果没有移植物感染历史和没有与移植物相关的临床显著副作用出现，可允许牙齿移植物和乳房移植物。

已知凝结紊乱或者服用抗凝剂药物。

需要比每月两次更频繁常规灌输的患者。

在入选研究的14天内输血，除非因白细胞减少以及辐射。

任何免疫缺陷疾病或者免疫受损状况(例如，使用免疫抑制剂；在施用CRS 207之前的28天内或者在施用CRS 207后28天计划的化疗剂或者辐射疗法)。

在施用CRS 207之前的28天内或者在施用CRS 207之后的研究期间内计划的，使用系统活性类固醇多于2天。在施用CRS 207的14天内使用任意系统类固醇

怀孕或者泌乳的女性受试者。可能怀孕的女性受试者必须具有阴性β-hCG测试(血清或者尿液)。

酒精依赖史或者使用可能干扰研究规程或者要求的违法药物(例如，阿片类、可卡因、安非他命、致幻剂等)。

在2小时内静脉内施用CRS 207来治疗受试者。如下表中所示，增加各连续剂量组的剂量。

在研究的剂量增加部分时，以剂量间的21天间隔施用CRS-207。

将受试者分成在使用CRS 207的第一次用量之后存活率≥15个月的那些受试者，以及在使用CRS 207的第一次剂量之后具有存活率<15个月的那些受试者。下表显示在这些两组中的人口统计资料。

在CRS 207为辅助疗法的受试者中存活率得到改善。

在那些在II期试验中之前接纳

(CELL GENESYS,INC.)的受试者中，通过随后递送CRS 207来改善存活率：

本领域技术人员容易理解，本发明易于适应完成主题以及获得所提到的目的和优势，以及本文所固有的那些。本文所提供的例子是代表性优选实施方案，其为示例性，并且不旨在限制本发明的范围。

尽管已经针对本领域技术人员充分详细地描述和例举如何进行和使用它，但是在未违背本发明的精神和范围下，各种替代形式、变更和改进应当是明显的。本文所提供的例子是代表性优选实施方案，其为示例性，并且不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员可想到其中的修改形式和其他用途。这些变更涵盖在本发明的精神内，并且由权利要求的范围限定。

对于本领域技术人员显而易见，在未违背本发明的精神和范围下可对本文公开的本发明进行不同的取代和变更。

在说明书中所提到的所有专利和出版物指示本发明所属技术领域普通技术人员的水平。所有专利和出版物均以引用方式并入本文，其引用程度如同明确且单独地指出各单独出版物以引用方式并入。

本文示意性描述的本发明可在缺乏任何一种或多种元件、本文非具体公开的一种或多种限制下进行。因此，例如在本文的各个例子下，术语“包含”、“基本由......组成”以及“由......组成”中的任一种可彼此或者术语之间两两替换。已经采用的术语和表达用作描述的术语，且是非限制性的，并且使用这些术语和表达并非旨在排除所示和所述特征或其部分的任何等同形式，但是意识到，在本发明所要求保护的范围内的各种变更均是可能的。因此，应当理解，尽管通过优选实施方案和任选特征具体公开本发明，但本领域技术人员可得到本文所公开的概念的变更和变化形式，并且认为这些变更和变化均在由所附权利要求限定的本发明范围之内。

其他实施方案示出在所附权利要求内。

Claims (11)

1.一种用于罹患癌症的哺乳动物的辅佐治疗的方法，所述方法包括：

在向所述哺乳动物施用主要疗法之前或之后向所述哺乳动物施用有效量的组合物作为辅佐治疗以去除或者杀死表达癌症抗原的癌症细胞，所述组合物包含减毒的、代谢活性李斯特菌属，所述减毒的、代谢活性李斯特菌属编码所述癌症抗原的可表达的、免疫活性部分。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述主要疗法之后施用所述组合物。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述主要疗法包括从所述哺乳动物中去除所述癌症细胞的手术；杀死所述哺乳动物中的所述癌症细胞的辐射疗法；或者所述手术以及所述辐射疗法二者。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括以多剂量施用所述减毒的、代谢活性李斯特菌属，所述减毒的、代谢活性李斯特菌属编码所述癌症抗原的可表达的、免疫活性部分。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述减毒的、代谢活性李斯特菌属具有使ActA失活的突变。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述减毒的、代谢活性李斯特菌属具有使InlB失活的突变。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述减毒的、代谢活性李斯特菌属是ΔactAΔinlB。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述李斯特菌属被杀死但具代谢活性(″KBMA")。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述癌症抗原是全部或者一部分间皮素。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在所述施用步骤之前，已经预先向所述哺乳动物施用表达全部或者一部分所述癌症抗原的来自人细胞系的细胞，其中所述细胞已经被重组修饰以生成和分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，以及其中所述细胞已经被修饰以防细胞分裂。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：胰腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和间皮瘤。

Images