CN101991863B - 一种双重靶向dna疫苗及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双重靶向DNA疫苗及其构建方法。该疫苗是以BG作为DNA运送载体，且所述DNA携带有MHC-II的分子伴侣恒定链Ii基因的DNA疫苗。该疫苗既可以防止DNA疫苗降解、增加疫苗DNA编码序列在抗原提呈细胞中的表达水平，又可以进一步将表达的抗原高效提呈给免疫效应细胞，从而大大提高DNA疫苗的免疫活性。本发明将在新型疫苗的研制(以提高现有DNA疫苗和未来DNA疫苗的免疫活性)及未来疾病的防治中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一种双重靶向DNA疫苗及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的疫苗及其构建方法，特别是涉及一种双重靶向DNA疫苗及其构建方法。

背景技术

疫苗是防治传染病的有效方法。迄今为止，世界上80％以上的儿童均使用白喉、麻疹、百日咳、小儿麻痹、破伤风以及肺结核等6种疫苗，极大地降低了这些疾病的死亡率。但是对于很多疾病，在疫苗的研制和使用过程中还存在很多困难。以结核病为例，接种卡介苗只对50％-80％的儿童有保护作用，对成人的保护力更低。霍乱曾经造成严重大流行，近年来，该病例有增加的趋势，而且常用的霍乱弧菌灭活疫苗的有效期仅4个月。此外，口蹄疫、乙型脑炎、轮状病毒、志贺氏杆菌、伤寒、疟疾、血吸虫病、登革热等疫苗研制过程中均存在很多困难，需进一步改进疫苗制备方法、以提高其免疫活性(WHO.State of the art of new vaccines：research &development-Initiative for Vaccine Research.World Health OrganizationJanuary

2005.http://www.who.int/vaccine_research/documents/stateoftheart /en/index.htmL)。DNA疫苗的研制为解决疫苗研究存在的困难提供了有力的手段。DNA疫苗是作为免疫原的一种或多种蛋白的编码基因克隆到真核表达载体上，将构建的重组质粒直接注入到体内并使外源基因得以表达，从而激活机体免疫系统，引发抗体反应。DNA疫苗具有传统疫苗不可比拟的优势：1.能表达天然蛋白抗原并进行准确的折叠和修饰、递呈给宿主免疫系统，诱导更有效的免疫应答。2.可在体内持久表达，全方位地调动机体的免疫系统，诱发广泛而持久的体液和细胞免疫。3.DNA疫苗可直接在宿主体内表达目的抗原，省略了传统疫苗复杂的制备、加工过程，生产简便、成本低廉、稳定性好且贮存方便。4、DNA疫苗是病原体抗原的基因片段，没有感染病原的危险，安全性很高。5、同一表达载体可同时表达多种抗原，诱导机体产生针对多种病原体的免疫应答，可用来制备多价或多联疫苗。

研究表明，作为DNA疫苗的重组质粒首先必须被转移到抗原提呈细胞(Antigenpresentation cell，APC)内并得到高效表达，接着表达的抗原表位通过MHC分子的协同作用被提呈到细胞表面，通过与效应细胞的相互作用，产生免疫应答。由于质粒DNA为生物大分子，不容易被细胞吸收，而且很容易被核酸酶类降解，难以被APC摄入、表达。此外，质粒DNA本身的免疫原性很低，其表达产物难以进行抗原提呈，因而“裸”DNA疫苗的免疫应答较低，大大限制了其应用范围。

提高疫苗的免疫活性是DNA疫苗研制的关键，也是目前DNA疫苗研究的热点。为此，各国的学者尝试采用各种免疫佐剂，如细胞因子(Encke J，et al.Geneticvaccination with Flt3-L and GM-CSF as adjuvants：Enhancement of cellular andhumoral immune responses that results in protective immunity in a murinemodel of hepatitis C virus infection.World J Gastroenterol.

2006；12(44)：7118-25).、CpG基序(Coban C，et al.Effect of plasmid backbonemodification by different human CpG motifs on the immunogenicity of DNAvaccine vectors.J Leukoc Biol.2005；78(3)：647-55.)等，以提高DNA疫苗的免疫活性保护能力，但增效作用有限。究其原因，主要是由于这些佐剂不能防止DNA疫苗的降解、促进DNA疫苗在APC中的表达，因而在DNA疫苗表达水平很低的条件下，即使佐剂能够刺激抗原提呈细胞、提高抗原提呈的效率，其作用也是有限的。近年的研究表明，树突状细胞(DC)在免疫应答中起中心作用。高效、特异地将DNA疫苗导入到DC中并使它得到高效表达是提高DNA疫苗免疫活性的根本途径。DNA运送载体是将DNA疫苗导入DC的基本工具。完美的DNA运送载体有以下特点：DC靶向性好，导入效率高，负载DNA的容量大，较快建立起持久的保护机制，可以多疫苗联合使用，操作简便。DNA运送载体分为病毒载体和非病毒载体，病毒是目前最高效的运送载体，但容易引起免疫毒性和遗传毒性，而且制备方法复杂，费用较昂贵(Schweichel D，et al.Evaluation of DNA vaccination with recombinant adenoviruses usingbioluminescence imaging of antigen expression：impact of application routesand delivery with dendritic cells.J Gene Med.2006；8(10)：1243-50)。以阳离子脂类(Hattori Y，et al.Enhancement of immune responses by DNA vaccinationthrough targeted gene delivery using mannosylated cationic liposomeformulations following intravenous administration in mice.Biochem BiophysRes Commun.2004；317(4)：992-9.)、聚合物(Dailey LA，et al.The role ofbranched polyesters and their modifications in the development of modern drugdelivery vehicles.J Control Rel。2005；101(1-3)：137-49)和纳米颗粒(BalengaNA，et al.Protective efficiency of dendrosomes as novel nano-sizedadjuvants for DNA vaccination against birch pollen allergy.J Biotechnol.2006；124(3)：602-14)等化合物为代表的非病毒载体生物安全性好，使用简单、费用低，但基因导入效率较低。以细菌或细胞作为DNA载体的研究正受到越来越多的关注。红细胞鬼影可高效地将质粒DNA导入巨噬细胞，有可能成为DNA疫苗运送载体。但红细胞血型匹配问题和血液传播疾病是其推广应用的两个障碍(Byun H M，et al.Erythrocyte ghost-mediated gene delivery for prolonged and blood-targetedexpression.Gene Therapy 2004，11：492-496)。减毒细菌作为DNA疫苗载体具有导入效率较高、费用低，制备方法简便等优点，是近年DNA疫苗研究的热点。减毒鼠伤寒沙门氏菌被用于多种人畜共患病的DNA疫苗载体，不仅可作为肺炎链球菌、结核杆菌、鼠疫耶尔森菌、牛布氏杆菌、炭疽芽孢杆菌等DNA疫苗的载体(李文桂，陈雅棠.细菌重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗研究进展.动物医学进展，2004，25(2)：49-53)，而且可作为猪肺炎支原体(Chen AY，et al.Evaluation of theimmunogenicity of the P97R1adhesin of Mycoplasma hyopneumoniae as a mucosalvaccine in mice.J Med Microbiol.2006；55(Pt 7)：923-9、伪狂犬病毒(Eo SK，et al.Systemic and mucosal immunity induced by oral somatic transgenevaccination against glycoprotein B of pseudorabies virus using liveattenuated  Salmonella typhimurium.FEMS Immunol Med Microbiol.2006；47(3)：451-6l、猪生殖呼吸综合症病毒(Jiang P，et al.Humoral immuneresponse induced by oral administration of S.typhimurium containing a DNAvaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome virus.VetImmunol Immunopathol.2004Dec 8；102(3)：321-8.)，疟疾(Wang L，et al.Orallydelivered malaria vaccines：not too hard to swallow.Expert Opin Biol Ther.2004；4(10)：1585-94.)等DNA疫苗的载体。此外，减毒产单核细胞李氏杆菌和乳酸菌也被用于运送HPV(Hussain SF，Paterson Y.What is needed for effectiveantitumor immunotherapy？Lessons learned using Listeria monocytogenes as alive vector for HPV-associated tumors.Cancer Immunol Immunother.2005；54(6)：577-86.)、HIV(Paterson Y，Johnson RS.Progress towards the use ofListeria monocytogenes as a live bacterial vaccine vector for the deliveryof HIV antigens.Expert Rev Vaccines.2004；3(4Suppl)：S119-34)及口蹄疫病毒的(Li YG，et al.Immune responses generated by Lactobacillus as a carrierin DNA immunization against foot-and-mouth disease virus.Vaccine.2007；25(5)：902-11).DNA疫苗。减毒的细菌能够以自然感染的方式进入人体，更主要的是疫苗能够口服，能够在较长时间内刺激免疫DC，但也存在毒力逆转的安全隐患(Vassaux G，et al.Bacterial gene therapy strategies.J Pathol.2006；208(2)：290-8.)。

细菌鬼影(bacterial ghost，BG，也译为菌蜕)为DNA疫苗的递送效率、促进外源性DNA疫苗在抗原提呈细胞中表达水平提供了全新的技术平台(Ebensen T，etal.Bacterial Ghosts Are an Efficient Delivery System for DNA Vaccines.TheJournal of Immunology，2004，172：6858-6865.and Palffy R，Gardlik R，HodosyJ，et al.Bacteria ingene therapy：bactofection versus alternative genetherapy.Gene Therapy 2006，13：101-105.)。BG是将细菌裂解细胞壁、去除菌体内容物之后形成的细菌空腔。研究表明，φX174噬菌体能够表达一种裂解革兰氏阴性菌细胞壁的蛋白-E蛋白。E蛋白由91个氨基酸残基组成的，N末端的1/3处有一个疏水序列，是细胞壁溶解作用发生的关键部位，C端的亲水结构对其在细胞内膜下形成高浓度的寡聚体非常重要。将E蛋白的基因构建到可诱导的表达载体中，转化革兰氏阴性细菌，在合适的条件下诱导E蛋白表达，可使宿主菌的内膜和外膜融合，形成裂解通道，在离心洗去细胞内容物后即可制备BG。这时，细菌的内膜和外膜连接在一起形成一个具有完整的细胞膜结构的空腔(图1，A、B分别为完整的细菌及其鬼影的电镜图(引自Panthel K，Jechlinger W，Matis A，et al.Generation ofHelicobacter pylori ghosts by PhiX protein E-mediated inactivation and theirevaluation as vaccine candidates.Infect Immun.2003；71：109-16.)，C为自绘的鬼影模式图。可见细胞的内膜和外膜相连形成一个完整的空腔(周质腔)。细菌内容物去除之后，内膜可以展开、周质腔形成大囊泡。)，这一空腔将是运载DNA或其它生物分子的载体。

研究表明，人畜共患病原体，如，幽门螺旋菌(Panthel K，et al.Generationof Helicobacter pylori ghosts by PhiX protein E-mediated inactivation andtheir evaluation as vaccine candidates.Infect Immun.2003；71：109-16).、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌(Weiss J.Transfer of eukaryotic expressionplasmids to mammalian host cells by salmonella spp.Int J Med Microbiol.2003，293：95-106).、弗氏志贺氏菌(Xu F，et al.Immunogenicity of an HIV-gag DNAvaccine carried by attenuated Shigella.Vaccine 2003，21：644-648).和肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC，Mayr UB，et al.Bacterial Ghosts as an Oral Vaccine：a Single Dose of Escherichia coli O157:H7Bacterial Ghosts Protects Mice against Lethal Challenge.Infect Immun.2005；73(8)：4810-4817)等均可以被蛋白E裂解，制备BG)。其中EHEC可引起严重腹泻，常常便血并伴有腹部绞痛，并有可能发展成溶血性尿毒症综合征，导致肾脏严重受损或甚至造成死亡。O157:H7就属于EHEC。2006年9月，美国发生了与菠菜有关的O157:H7大肠杆菌暴发，有205人患病，31起肾衰竭病例和3例死亡(WHO.Escherichia coli O157:H7 outbreak in spinach”.World HealthOrganization，International Food Safety Authorities Network(INFOSAN).INFOSAN Information Note No.1，12Feb，2007.)。在2004年欧洲联盟发病率为每10万人口1.3例。在阿根廷发病率最高，在6至48个月儿童中的估计值约为每10万儿童22例尿毒症。Mayr等(Mayr UB，et al.Bacterial Ghosts as an OralVaccine：a Single Dose of Escherichia coli O157:H7Bacterial Ghosts ProtectsMice against Lethal Challenge.Infect Immun.2005；73(8)：4810-4817)将EHEC的BG注射到受致死剂量EHEC感染的小鼠体内，仅注射一次，小鼠在28天和55天的存活率分别为93.3％和86％，而对照组的成活率仅为30％和26.7％，提示EHEC的BG具有很强的免疫原性，对EHEC起重要的防治作用。可见，EHEC鬼影本身也能够成为一种疫苗，在对抗人畜共患病的过程中发挥作用。此外，减毒和灭活弗氏志贺氏菌在运载DNA疫苗的同时还保留免疫原性，在动物实验中能够对机体产生保护作用(Xu F，Hong M，Ulmer JB：Immunogenicity of an HIV-gag DNA vaccinecarried by attenuated Shigella.Vaccine 2003，21：644-648.)，因此我们推测各种BG均可能作为疫苗对相应的病原感染产生保护作用。

BG又是良好的DNA运送载体，Ebensen等(Ebensen T，et al.Bacterial GhostsAre an Efficient Delivery System for DNA Vaccines.The Journal of Immunology，2004，172：6858-6865.)发现每个BG可以装载2000拷贝(5μg/mg细菌蛋白)，具有很大的装载容量。由于BG保留了完整细菌所有的抗原特性，宿主免疫识别细胞(主要是DC)将BG作为是“危险的入侵者”，从而主动识别并将它吞噬，因而BG能够靶向性进入DC。用装载pEGFP-N1质粒的BG转染巨噬细胞系RAW264.7和原代培养的DC，其转染效率分别为57.6％和52％，转染效率远高于脂质体或聚合物载体。将装载β-半乳糖苷酶基因的BG经皮下或肌肉注射到小鼠体内，免疫应答比裸DNA高1个数量级，产生的抗β-半乳糖苷酶抗体以IgG1亚型为主(均引自Ebensen T，et al.Bacterial Ghosts Are an Efficient Delivery System for DNAVaccines.The Journal of Immunology，2004，172：6858-6865.)。最近，Jechlinger等以BG为载体导入HBV核心抗原，取得良好的免疫效果(Jechlinger W，et al.Comparative immunogenicity of the hepatitis B virus core 149antigendisplayed on the inner and outer membrane of bacterial ghosts.Vaccine 2005，23(27)：3609-17.)，说明BG还可以作为多肽抗原的载体。BG不仅可以将DNA特异地导向APC，而且还是天然的佐剂，促进树突状细胞的成熟和激活(Ebensen T，etal.Bacterial Ghosts Are an Efficient Delivery System for DNA Vaccines.TheJournal of Immunology，2004，172：6858-6865.)。与活菌相比，无生命的BG显然是很安全的。虽然，BG作为DNA载体的研究是近5年才开始的，尚未受到应有的关注，但这一技术已经显示出很好的潜力，为提高DNA疫苗的免疫效率提供了一个崭新的技术平台。

外源性抗原在抗原提呈细胞中表达之后能够能否高效地提呈给效应细胞也是决定其免疫活性的关键因素。研究表明，树突状细胞(dendritic cell，DC)是抗原提呈能力最强、也是唯一能激活初始型T细胞的专职抗原提呈细胞(antigen presentcell，APC)，可将抗原加工成小肽段并与胞质内MHC-II类分子形成复合体，将抗原部位呈递给初始型T细胞并使之活化(Bancherea J，Briere F，Caux C.et a1.Immunobiology of dendritic cells.Annu Rev Immunol，2000，18：767.)。MHC-II的分子伴侣恒定链(invariant chain，Ii)在抗原提呈通路中发挥重要作用。MHC-II在与多肽结合之前，抗原结合槽一直被Ii链的CLIP占据。如果用抗原表位替代CLIP，就能够让外源的抗原表位靶向性地进入MHC II的抗原结合槽，进入抗原提呈通路，这种方法被称作内源性靶向(Nagata T，et al.Immunization with plasmid DNAencoding MHC class II binding peptide/CLIP-replace invariant chain(Ii)induces specific helper T cells in vivo：the assessment of Ii p31 and p41isoforms as vehicles for immunization.Vaccine，2002；20：105-114.)。据此，高明等曾利用Ii作为HCV-NS3区的1248-1261表位基因疫苗的载体，构建了基于Ii分子的内源性靶向基因疫苗载体pEGFP-Ii/HCV-NS3-Th1。在细胞实验中，该疫苗mRNA和蛋白都得以高效表达，含NS3表位的Ii突变体在结合MHCII分子后能够和野生型Ii分子一样到达细胞表面。采用肌肉注射的方法将此疫苗导入HCV-NS3荷瘤小鼠，发现这一内源性靶向基因疫苗在抑制肿瘤生成，延长成瘤小鼠的生存时间等方面优于非靶向基因疫苗(Gao M et al.HCV-NS3 Th1 minigene vaccine based on invariantchain CLIP genetic substitution enhances CD4+Th1 cell responses in vivo.Vaccine，2006，24：5491-5497.及Gao M et al.Target HCV NS3CD4+Th1 epitopeto major histocompatibility complex class II pathway.Biotechnol Lett.2006；28(1)：3-8.)。在此基础上，将pEGFP-Ii/HCV-NS3-Th1的mRNA导入体外培养的小鼠DC，发现靶向性疫苗可更有效地刺激DC成熟，增加其表面协同刺激分子CD80、CD86、I-A^d的表达，诱导DC分泌IL-12、IFN-γ，有效的刺激CD4⁺T细胞增殖，并诱导其向Th1方向分化(高明等，基于Ii分子的HCV-NS3内源性靶向基因疫苗的构建及免疫应答研究。中华微生物学和免疫学杂志；2007，27(3)：242-246)。以上结果初步证明，内源性靶向DNA疫苗在激活DC及诱发免疫反应过程中的免疫活性明显优于非靶性疫苗，有可能是对抗HCV相关疾病的良好疫苗。

由于DNA疫苗必须在抗原提呈细胞中得到高效表达并将表达的抗原提呈给免疫效应细胞(如分泌抗体的B淋巴细胞，杀伤病原体的细胞毒性的T细胞及T辅助细胞等)，因此我们认为将BG及MHC-II的分子伴侣恒定链Ii结合起来构建的新型疫苗的免疫反应水平将优于仅采用单项技术构建的疫苗，这时因为采用BG技术(外源性靶向技术)虽可大大提高DNA疫苗在抗原提呈细胞中的表达水平，从而增加抗原提呈的机会，但如果抗原提呈的整体水平不高，则其提高免疫应答水平的作用还是有限的；反之，将DNA疫苗构建到Ii的CLIP区虽可提高抗原提呈水平，但若DNA疫苗无法进入抗原提呈细胞，则内源性靶向机制根本上无法发挥作用；可见只有将两种技术结合起来，就可以利用BG的外源性靶向作用将构建到Ii分子CLIP区域的DNA疫苗高效导入抗原提呈细胞，同时高效表达的抗原又可以直接与MHC-II分子结合、将抗原直接提呈到细胞表面，才DNA疫苗发挥更大的功效。

本发明的核心就是将上述两种技术结合起来，提出一种新的双重靶向的DNA疫苗制备技术。这一设想是在充分研究DNA疫苗的抗原提呈机理及现有的疫苗设计策略的基础上提出的。此前，仅有文献或专利分别进行内源性靶向和外源性靶向研究，并没有将两种策略联系起来。究其原因，可能是相关学者只注重自己的研究领域、研究策略，而没有很好地借鉴不同领域的研究策略。本发明是根据DNA疫苗的作用机理的不同环节，将内源性靶向技术和外源性靶向技术是结合起来，而非仅将两种策略简单叠加在一起，因而是一种全新的疫苗设计思路，有可能为提高疫苗的免疫活性提供全新的思路和有效地技术手段。

发明内容

本发明的目的之一是提供了一种免疫应答水平较高的双重靶向DNA疫苗。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种双重靶向DNA疫苗，是以BG作为疫苗DNA运送载体，且所述疫苗DNA携带有MHC-II的分子伴侣恒定链(invariant chain，Ii)基因的DNA疫苗。

所述Ii基因位于真核表达载体中，包括所有能够在真核细胞中表达的载体，如pDSRed-N1、pcDNA3.1、pEGFP-N1、pSV2或pLXSN等。本发明中仅列举以pDSRed-N1为出发载体构建的携带Ii基因的重组表达载体pDSRed-mIi，具有序列表中序列1的核苷酸序列，而在实际应用中，可将Ii基因构建在任何可作为DNA疫苗载体的真核表达载体中。

本发明双重靶向DNA疫苗的应用范围是广泛的，可制成口蹄疫、乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、肿瘤及其它任何疾病的双重靶向DNA疫苗。

在本发明实施例中，以针对FMDV的疫苗提供了一种具体的双重靶向口蹄疫DNA疫苗，是将质粒pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)和/或pDSRed-mIi-FMDV(141-160+200-213)装载于BG中得到。

本发明的第二个目的是提供一种本发明双重靶向DNA疫苗的制备方法。

本发明双重靶向DNA疫苗的制备方法，可包括以下步骤：

1)构建携带优势抗原表位和Ii基因的真核表达载体：将Ii基因的CLIP区基因片段用优势抗原表位基因替代，再将该基因片段连接入真核表达载体中；

2)将步骤1)构建的携带优势抗原表位和Ii基因的真核表达载体导入BG中，得到双重靶向DNA疫苗。

以针对口蹄疫病毒的所述双重靶向DNA疫苗制备为例，是将步骤1)中的Ii基因的CLIP区基因片段的80-130aa片段切除，用Ii80-89aa-FMDV-VP1-Ii99-130aa替代。

所述优势抗原表位FMDV-VP1片段优选为21-40+141-160片段或141-160+200-213片段。

为使两个抗原之间具有柔性，利于形成正确的抗原表位，在构建双表位序列时，将21-40和141-160之间及141-160和200-213之间分别加入了甘氨酸(Glycine)作为连接物。

其中，以pDSRed-mIi为出发载体，构建的携带有21-40+141-160片段和Ii基因的真核表达载体为pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)，携带有141-160+200-213片段和Ii基因的真核表达载体为pDSRed-mIi-FMDV(141-160+200-213)。

所述步骤2)将携带优势抗原表位和Ii基因的真核表达载体导入BG的具体过程为：将10mg/mL携带优势抗原表位和Ii基因的真核表达载体和6.2mg/mL BG混匀在包被缓冲液中，28℃水浴90min；再加入膜囊(2mg/mL)和25mM CaCl₂封闭BG，37℃孵育过夜。

本发明以上技术方案提供了一种双重靶向DNA疫苗及其构建方法。本发明首次提出了以细菌鬼影(BG)为载体制备双重靶向DNA疫苗的技术构思与实施方案。发明人综合研究总结出：首先，BG是高效的DNA导入载体，能够将DNA疫苗靶向性的抗原提呈细胞、并获得高效表达(外源性靶向作用)。BG具有理想的DNA载体所要求的其它所有特性：如以DC为特异性靶，能够使DNA在DC中高效表达并将抗原递送给MHC-II分子，负载DNA的容量大；能够较快建立起保护机制并具有长期有效的保护作用，能够多疫苗联合使用，使用简单、可操作性强、价格低廉，安全性好等。同时BG本身也能对本身的病原体产生保护作用。这是因为BG保留了细菌较为完整的细胞壁结构，因而基本保留了细菌完整的免疫特性，因而既能够靶向地将携带的DNA疫苗导入APC细胞，而且可以刺激抗原递呈细胞、刺激机体的免疫应答水平。与活菌相比，作为细菌空壳的BG是不会出现毒性逆转现象的，因而其安全性高于减毒细菌。其次，将作为疫苗的DNA片段构建在Ii载体中，可内源靶向性地递交给MHC-II分子，进一步发挥其高效的抗原提呈优势(内源性靶向作用)。通过利用本发明的技术策略，既可以防止DNA疫苗降解、增加疫苗DNA编码序列在抗原提呈细胞中的表达水平，又可以进一步将表达的抗原高效提呈给免疫效应细胞，从而大大提高DNA疫苗的免疫活性。本发明将在新型疫苗的研制(以提高现有DNA疫苗和未来DNA疫苗的免疫活性)及未来疾病的防治中发挥重要作用，应用前景广阔。

附图说明

图1为细菌及其形成的鬼影结构

图2为DH5α-pHH43细菌在不同条件下的OD₆₀₀值

图3为荧光共聚焦显微镜观察细菌鬼影(1000×)

图4为细菌及其BG样品的DNA琼脂糖凝胶电泳图

图5为PCR扩增的mIi编码基因的琼脂糖凝胶电泳图

图6为pDSRed-N1真核表达载体的物理图谱

图7为内源性靶向FMDV-VP1载体的构建示意图

图8为PCR扩增检测内源性靶向FMDV-VP1载体的琼脂糖凝胶电泳图

图9为BG装载核酸片段装载效率的激光共聚焦显微镜检测结果

图10为BG装载核酸片段装载效率的流式细胞术检测结果

图11为BG浓度和质粒载体的装载效率关系图

图12为使用BG装载的pDsred-N1质粒转染RAW264.7细胞24小时后使用荧光显微镜观察细胞内的荧光水平

图13为流式细胞仪检测BG装载的pDsred-N1质粒转染24小时后RAW264.7细胞的荧光强度

图14为基因转染24h后RAW264.7细胞中FMDV mRNA RT-PCR扩增产物的电泳图谱

图15为采用BG装载的FMDV疫苗免疫小鼠后小鼠血清中的FMDV抗体表达水平的测定结果

图16为FMDV抗原刺激后小鼠脾脏淋巴细胞中IL-2和IFN-γ水平的ELISA法检测结果

图17为小鼠脾脏淋巴细胞中的T淋巴细胞增殖实验结果

图18为BG或BG装载质粒注射小鼠的血清与BG反应的水平

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、大肠杆菌细菌鬼影(BG)的制备与鉴定

1、构建热诱导表达噬菌体E蛋白表达质粒

将PhiX174噬菌体的E蛋白基因连接入pHH43(

H K.et al.Therecombinant Azotobacter vinelandii mannuronan C-5-epimerase AlgE4epimerizes alginate by a nonrandom attack mechanism.J Biol Chem 1999；274：12316-12322)，具体方法如下：

将裂解基因盒(E-box)(包括温度敏感性转录调控区(cI857)、λ启动子区、E基因区)串联后分别在上游和下游添加kpn I和EcoRV酶切位点，然后和表达型载体pHH43酶切后连接，鉴定和测序正确。具体方法：以kpn I和EcoR V分别对E-box片段和原核表达载体pHH43进行双酶切，酶切片段进行1％琼脂糖胶电泳(100V，30min)，在紫外灯下切下所需的DNA片段，采用DNA胶回收试剂盒回收酶切后载体及E-box片段。将回收的载体和片段按1：3的摩尔比混合，加入T4DNA连接酶室温反应30min。取2μl重组质粒加入到100μl DH5α感受态菌液中，冰浴30min，42℃水浴热休克90s，冰浴2min。加入100μl不含抗生素的LB培养液，28℃、90r/min培养1h。4℃，5000×g离心5min，弃去上清。菌体重悬于500μl LB培养基中，取50μl菌液涂布于含氯霉素(CatGC⁺，50mg/L)的LB平板上，28℃过夜培养。待长出菌落之后，挑取平板上分隔良好的单菌落接种于5mL CatGC⁺LB培养液中，28℃、200r/min过夜培养。采用质粒小量提取试剂盒提取质粒，使用kpn I和EcoRV进行酶切，酶切产物进行1％琼脂糖胶电泳(100V，30min)，获得约1.4kbp的片段，提示E-box构建到了pHH43载体中，命名为pHH43-E，经测序证实获得了插入位置及序列均正确的重组质粒。

2、诱导E蛋白表达，裂解宿主菌

将步骤1构建的重组表达载体pHH43-E导入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，接种于氯霉素抗性(150μg/mL)的LB平板上，三线法划平板，28℃恒温培养过夜；挑单克隆接种于3mL氯霉素抗性(150μg/mL)的LB液体培养基中，28℃、200r/min过夜培养；次日，转接于100mL氯霉素抗性(150μg/mL)的LB液体中，28℃、200r/min培养至OD₆₀₀值为0.5时，留取1mL菌液用于裂解率的计算，摇床温度升至42℃，诱导细菌的裂解；每30min测定OD₆₀₀值，并留取1mL菌液，培养4～5h，直至OD₆₀₀值基本保持平稳。同时设置非诱导组作为对照。研究结果如图2所示(将重组菌命名为DH5α-pHH43-E)，随着菌体的裂解，培养基变得较为澄清，OD₆₀₀值显著下降，在2h左右降到最低值0.4左右，并在培养4.5h之后维持在1.1以下，而对照组则随着培养时间的延长，菌体密度不断上升，菌体密度不断上升，OD₆₀₀值超过3.8。研究结果显示，在42℃诱导后大肠杆菌开始裂解。

3、细菌鬼影(BG)的制备与鉴定

将DH5α-pHH43-E菌种接种于LB培养基中并于28℃扩大培养；待OD₆₀₀值为0.5时，42℃诱导细菌裂解；OD₆₀₀值降至0.3时，将菌液转至无菌离心管中，离心收集菌体(4℃，6000×g，10min)，用PBS反复洗涤3次，清洗BG的内容物，得到DH5α大肠杆菌BG(可冻干保存)。采用线粒体染料Mito Tracker对BG的外壁进行染色(绿色)，37℃，染色15min，使用荧光共聚焦显微镜观察BG的形态。结果如图3所示，菌体形成空壳(即BG)

取制备好的BG 20μl进行琼脂糖电泳，同样取1mL对照菌液裂解去除蛋白后的上清液20μl作为对照，进行1％琼脂糖胶电泳(100V，30min)，BIO-RAD GelDoc2000凝胶成像系统观察电泳结果。检测结果如图4所示(1为裂解后的大肠杆菌；2为Marker DL2000plus；3为BG)，发现对照组有明显的、大小不一的DNA条带，提示这是细菌本身基因组DNA，相反，BG组则检测不到DNA信号，提示BG内DNA已随着细胞质内容物被洗去。

4、裂解率的计算

将上述经42℃诱导4.5h的菌液及稀释了10⁵倍的非诱导对照组菌液分别涂布在LB平板中，37℃培养过夜，观察细菌的集落形成数目，计算集落形成单位(CFU)。以下列公式计算诱导组的裂解率＝(1-裂解后CFU/裂解前CFU)×100％。经三次试验，取平均值，得出细菌裂解率为97.8％。

通过上述实验，将PhiX174噬菌体的裂解基因(E蛋白基因)构建到温控诱导载体并转化大肠杆菌DH5α，在42℃成功地诱导菌体裂解，裂解率可达97.8％。采用离心法收集BG，激光共聚焦显微镜证实其确为中空大肠杆菌ghost的形态，通过DNA电泳实验证实菌体内不含DNA，提示我们成功制备了大肠杆菌的BG，为下一步实验奠定基础。

BG比灭活的细菌或减毒活菌更为安全。例如，采用甲醛化学物质制备的灭活菌作为载体，其制备过程非常简单，但是残留的甲醛等化学物质可能对人体造成潜在的危害。因此，BG的制备方法与减毒或灭活细菌一样简单，DNA装载能力和装载效率及免疫活性也非常相似，但BG的安全性却明显高于减毒或灭活细菌。当然，有人会质疑说，在制备BG的过程中，菌体的裂解并未达到100％，因而残存的活菌会对疫苗施用对象造成危害。在现实中，有几种方法可以克服这一问题：1.采用减毒菌制备BG，这样即使有少数活菌也不会对施用对象造成危害。2.将核酸酶基因与E基因共同转化细菌(Ebensen T，Paukner S，et al.Bacterial Ghosts Are an EfficientDelivery System for DNA Vaccines.The Journal of Immunology，2004，172：6858-6865.)，这样的细菌裂解的同时，菌体内的DNA也被降解，确保未裂解的细菌因其DNA被降解而成为灭活细菌。3.未裂解的细菌可以通过加入抗生素等方式使细菌得到完全的灭活。

实施例2、构建小鼠恒定链(mIi)的真核表达载体

以质粒pQE31-mIi(Bischof F，et al.Melms A.Specific treatment ofautoimmunity with recombinant invariant chains in which CLIP is replaced byself-epitopes.Proc Natl Acad Sci U S A.2001；98(21)：12168-73)为模板，采用PCR方法获得mIi编码基因(设计PCR引物序列时分别在上游和下游引物的5’端引入Xho I和EcoR I酶切位点，具体序列为

P1：5’-GCGCTCGAGATGACGGATCCGCATGCGAGCT-3’和

P2：5’-CGCGAATTCGCAGGGTGACTTGACCCAG-3’)。

方法为：在50μl的反应体系中，将引物(正向、及反向引物各1μl)、模板(1μl)、高保真DNA聚合酶(0.25μl)，dNTP(2.5mM，4μl)，10×扩增缓冲液(5μl)和去离子水(36.75μl)振荡混匀，离心处理后，94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸100s，35个循环，反应完毕后取5μl反应物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示(泳道1为DNA Marker，泳道2为PCR扩增产物)，表明获得417bp的目的片段，与预期结果相符。

将mIi基因插入pDSRed-N1真核表达载体中(物理图谱见图6)多克隆位点的Xho I和EcoR I酶切位点之间。具体方法为：以Xho I和EcoR I分别对mIi片段和编码红色荧光蛋白的pDSRed-N1进行双酶切，酶切片段进行1％琼脂糖胶电泳(100V，30min)，在紫外灯下切下所需的DNA片段，采用DNA胶回收试剂盒回收酶切后载体及mIi片段。将回收的载体和片段按1∶3的摩尔比混合，加入T4DNA连接酶室温反应30min。取2μl重组质粒加入到100μl DH5α感受态菌液中，冰浴30min，42℃水浴热休克90s，冰浴2min。加入100μl不含抗生素的LB培养液，37℃、90r/min培养1h。4℃、5000×g离心5min，弃去上清。菌体重悬于500μl LB培养基中，取50μl菌液涂布于含卡那霉素(Kan⁺，50mg/L)的LB平板上，37℃过夜培养。待长出菌落之后，挑取平板上分隔良好的单菌落接种于5mL Kan⁺LB培养液中，37℃、200r/min过夜培养。采用质粒小量提取试剂盒提取质粒，使用Xho I和EcoR I进行酶切，酶切产物进行1％琼脂糖胶电泳(100V，30min)，获得约500bp的片段，提示mIi构建到了含RED标签的真核表达载体上，命名为pDSRed-mIi，经测序证实获得了插入位置及序列均正确的重组质粒，如序列表中序列1的核苷酸序列。

实施例3、构建内源性靶向的FMDV-VP1载体

1、选择、合成口蹄疫病毒(FMDV)的优势抗原表位

FMDV是一种单股正链RNA病毒，其结构蛋白VP1上有多个B细胞和T细胞抗原表位，能够诱导强烈的免疫反应；其中以VP1蛋白21-40、141-160、200-213的抗原表位的抗原性最强，而且各种血清性的FMDV均具有此表位，因而是非常重要的DNA疫苗候选序列。拟采用21-40+141-160和141-160+200-213序列为靶标，构建相应的表达载体。

2、构建载体

如图7所示，以pDSRed-mIi为真核表达载体(实施例2构建的)，使用21-40+141-160、141-160+200-213序列去替换mIi的CLIP区，构建表达VP1的真核表达载体。理论上VP1基因片段在DC细胞中表达之后应靶向性地与MHC分子结合，提高提呈效率。在构建双表位序列21-40+141-160和141-160+200-213时；两片段之间加入甘氨酸(Glycine)为连接物，使两个抗原之间具有柔性，利于形成正确的抗原表位。在构建载体时，将mIi的CLIP区的80-130aa片段切除，用mIi80-89aa-FMDV-VP1-mIi99-130aa替代。在两个质粒(分别命名为pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)(序列表中序列2)和pDSRed-mIi-FMDV(141-160+200-213)(序列表中序列3))构建完成后，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，进行PCR扩增(扩增pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)的引物序列为P1：5’-gcgctcgagatggaaacacagatccagagg-3’和P2：5’-cgcgaattcaggcagcgtccgtgccac-3’，扩增pDSRed-mIi-FMDV(141-160+200-213)的引物序列为P1：5’-gcgctcgagatggtgcccaacttgagaggt-3’和P2：5’-cgcgaattccaaagtctgtttcaccgg-3’)，结果如图8所示(泳道1为DNA Marker，泳道2-12为挑起的单克隆菌落后进行的PCR鉴定)，分别获得240bp(FMDV(21-40+141-160)片段)和220bp(FMDV(141-160+200-213)片段)2个片段，与预期结果相符，提示上述抗原表位已经构建到带红色荧光标记的内源性靶向载体上。

实验1：以核酸片段和质粒DNA检测BG的装载效率

为检测BG装载效率，将核酸片段(该核酸片段为带有CY5荧光标记的核酸片段，由随机合成的36个碱基组成，TaKaRa公司合成)和质粒DNA pDSRed-N1(购自BDClontech公司)分别用CY5及PI(均为红色荧光)标记，而BG则采用绿色荧光染料MitoTracker标记。将终浓度为66～264μg/mL的核酸片段与终浓度为2mg/mL的BG，28℃水浴90min；用DH5α膜囊(2mg/mL))和CaCl₂(25mM)封闭BG，37℃孵育过夜。由于质粒浓度较高，保持质粒的浓度不变，将BG设置为不同浓度0～100mg/mL，28℃水浴90min；同样加入膜囊和CaCl₂封闭BG，37℃孵育过夜；次日，MitoTracker染料37℃染色15min，室温，20000×g，离心20min收集BG。首先用激光共聚焦显微镜检测BG装载核酸片段的效率，结果如图9所示(左图，CY5标记的核酸片段在激发光下显示红色荧光；中图，MitoTracker染色的BG在激发光下的形态；右图，拟合后可见包被了核酸片段的BG呈现黄色。)，发现在很多绿色荧光标记的BG中均可检测到红色荧光信号，表明该BG中已经装载了CY5红色荧光标记的核酸片断。

采用流式细胞仪同时检测BG内的红色荧光和绿色荧光信号，结果如图10所示(横、纵坐标分别代表红色和绿色荧光的强度)，发现大多BG同时可以检测到红色和绿色荧光信号，表明这些BG已成功装载了核酸片段。研究结果显示，核酸片段的装载效率与其浓度密切相关，当核酸片段的浓度为66μg/mL时，红色荧光和绿色荧光双阳性的BG的比例为70％，提示这时70％的BG内装有核酸片段，而当核酸片段浓度增加到264μg/mL时，双阳BG的比例逐渐增加至94.89％。可见，在保持BG浓度不变(2mg/mL)的情况下，装载的效率和核酸片段的浓度成正比，继续增加核酸片段的浓度，装载的效率逐步增加，直到95％的水平。

DNA疫苗一般是以质粒DNA的形式存在的，因此研究BG装载质粒DNA的方法更为重要。由于质粒DNA的分子量比核酸片段要大很多，因而装载的难度更大。在试验中发现，要达到和装载核酸片段同样的效率，质粒DNA的浓度要远远高于核酸片段的浓度，因此在实验中，将质粒pDSred-N1设置较高的浓度(10mg/mL以上)并保持该浓度不变，将BG的浓度设成不同的梯度，在保持质粒pDSred-N1浓度不变的情况下，装载效率和BG浓度的关系图如图11所示，发现在质粒浓度一定的情况下，装载的效率与BG的浓度成反比，装载效率最高达到91.98％，并且不再随着BG浓度的降低而增加，推测已经到达极限；说明不同的质粒应该会有不同的最佳装载效率以及不同的装载浓度比例，这应该和质粒的分子量有关，分子量越大应该越难用于装载，寡核苷酸片段的装载效率高于质粒DNA也许就是这个原因。

实施例4、双重靶向DNA疫苗的制备

以口蹄疫疫苗为例，用本发明的方法制备双重靶向DNA疫苗，具体方法为：

1)取实例3中构建的内源性靶向的FMDV疫苗质粒

pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)；

对照质粒的制备：设计引物P1：5’-gcgctcgagatggaaacacagatccagagg-3’和P2：5’-cgcgaattcaggcagcgtccgtgccac-3’进行PCR扩增FMDV片段，经酶切后连接到真核表达载体pDSred-N1中，构建非内源性靶向的FMDV疫苗质粒pDSRed-FMDV(21-40+141-160)(对照)。

2)取实例1中制备得到的BG，按照实例3中摸索的最佳装载方法：将10mg/mL携带优势抗原表位和Ii基因的真核表达载体和6.2mg/mL BG混匀在包被缓冲液(HBS缓冲液：氯化钠100mmol/L，乙酸钠10mmol/L，HEPES 10 mmol/L，pH7.0)中，28℃水浴90min；再加入膜囊(将与BG同种的大肠杆菌超声裂解后，经超高速离心收集的细菌菌膜结构)(2mg/mL)和25mM CaCl₂封闭BG，37℃孵育过夜，分别将质粒pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)和pDSRed-FMDV(21-40+141-160)装载入BG，得到FMDV疫苗BG+Ii-FMDV和对照FMDV疫苗BG+FMDV。

实验2、BG装载质粒的转染及转染效率检测

靶向性的DNA疫苗载体能够将疫苗靶向性的导入抗原递呈细胞，是提高核酸疫苗免疫原性的有效方法。RAW264.7细胞是巨噬细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合而成的，具有与普通巨噬细胞相似的特性，也具有抗原递呈的功能，因此将BG装载的质粒pDSred-N1(实施例2)转染到RAW264.7细胞，初步验证BG是否具备将DNA靶向性地导入抗原提呈细胞的能力。

BG装载：将pDSred-N1质粒装载于BG中，将质粒溶解于包被缓冲液中(质粒终浓度10mg/mL)，和BG(6.2mg/mL)，28℃孵育1.5小时。加入终浓度为2mg/mL的膜囊，终浓度为25mM的氯化钙，37℃孵育过夜。20000g离心20分钟，用PBS重悬装载质粒DNA的BG。

转染：在转染前一天，收集RAW264.7细胞，将细胞浓度调整为1.0×10⁶细胞/mL，将0.5mL的细胞种植于24孔板中，于CO₂培养箱37℃孵育过夜。在转染时，将细胞培养基换成无血清和抗生素的培养基，然后加入BG装载的质粒DNA(BG终浓度为0.5mg/mL)于细胞中，充分混匀，2h后吸去培养基，加入含10％血清的培养基，于CO₂培养箱37℃培养过夜。

定性检测：转染24h后，用荧光显微镜观察RAW264.7细胞中绿色荧光(MitoTracker标记的BG)及红色荧光蛋白(Dsred表达产物)，结果如图12所示(A.绿色荧光视野，B.红色荧光视野，C.图片A和图片B重叠)，发现在大部分细胞中同时可观察到绿色荧光和红色荧光两种信号，提示Mito Tracker标记的BG成功地将装载的pDSRed-N1质粒导入到RAW264.7细胞中，并成功的表达了外源的红色荧光蛋白。

定量检测：为检测BG介导的pDSRed-N1质粒在RAW264.7细胞中表达水平，在转染24h后，收集细胞并调整细胞数为1.0×10⁶细胞/mL，流式细胞仪检测绿色荧光和红色荧光。结果如图13所示(上面两图(control)分别为未转染细胞的红色荧光和绿色荧光水平，下面两图分别为BG装载的pDSRed-N1质粒转染细胞的红色荧光和绿色荧光水平)，发现未转染细胞中绿色荧光和红色荧光蛋信号很弱，均为低于1％，而转染细胞的绿色荧光和红色荧光的检出率分别为54.70％和67.94％，提示大约MitoTracker标记的BG进入大约67.94％的RAW264.7细胞中，而表达外源红色荧光蛋白基因的细胞大约为54.70％。检测的基因表达水平高于体外转染试剂。

实验3、转染细胞中FMDV片段的表达水平检测

将RAW264.7细胞浓度调整为1.0×10⁶细胞/mL，吸取0.5mL的细胞种植于24孔板中，于CO₂培养箱中37℃培养过夜。在转染前，将实验分为：BG组，Ii质粒组，FMDV质粒组，Ii-FMDV组，BG+FMDV组和BG+Ii-FMDV组(实例4制备得到)六组。其中BG组在装载过程中不加DNA；Ii质粒组、FMDV质粒组和Ii-FMDV组分别加入pDSRed-mI i质粒，pDSRed-FMDV(21-40+141-160)(实例4制备得到)和pDSRed-Ii/FMDV质粒(pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160))但不加入BG，而BG+FMDV组和BG+Ii-FMDV组，则使用BG装载pDSRed-FMDV和DSRed-Ii/FMDV质粒，质粒DNA和/或BG的浓度同前。在装载后，取10μl装载产物加入到24孔板中，CO₂培养箱中37℃培养过夜。24h后，收集细胞，用Trizol试剂盒提取总RNA，逆转录合成cDNA，并使用FMDV引物(引物序列为P1：5’-gcgctcgagatggaaacacagatccagagg-3’和P2：5’-cgcgaattcaggcagcgtccgtgccac-3’)及β-act in引物(引物序列为ctc catcct ggc ctc gct gt和gct gtc acc ttc acc gtt cc)进行PCR扩增。扩增结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并利用紫外凝胶成像系统照相。结果如图14所示(1.Ii；2.BG；3.FMDV；4.Ii-FMDV；5.BG+FMDV；6.BG+Ii-FMDV)，未装载质粒的BG对照组及未使用BG装载的Ii，FMDV和Ii-FMDV组均未扩增出FMDV基因片段，说明裸质粒很难进入RAW264.7细胞，因而不可能在其中表达，从而无法扩增相应的基因片段。而BG+FMDV和BG+Ii-FMDV组均扩增出FMDV条带，提示BG成功地将DSRed-FMDV和DSRed-Ii/FMDV质粒导入RAW264.7细胞中，使外源的FMDV抗原的mRNA得以表达。实验提示BG是良好DNA疫苗载体，能够使外源FMDV基因片段在巨噬细胞系RAW264.7细胞(抗原提呈细胞)中高效表达。同时，DSRed-FMDV和DSRed-Ii/FMDV两种质粒导入后，FMDV的表达水平没有显著的差异，提示内源性靶向载体本身并不能增加外源基因在抗原提呈细胞中的表达水平。

实验4、动物实验

一、采用BG装载的FMDV疫苗免疫小鼠后小鼠血清中的FMDV抗体表达水平的测定

取70只5-6周龄、雌性Balb/c小鼠，分为7组，各组中每只小鼠分别注射以下液体：1.阴性组，100μl生理盐水；2.BG组，含35μg BG的PBS 100μl；3～5组分别为Ii组，FMDV和Ii-FMDV组，分别将50μg的pDSRed-mIi质粒，pDSRed-FMDV(21-40+141-160)质粒和pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)质粒溶解于100μl的PBS中。6和7组为BG+FMDV组和BG+Ii-FMDV组(实施例4制备得到)，分别使用35μg BG装载50μg的pDSRed-FMDV(21-40+141-160)质粒和pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)质粒，最后溶于100μl PBS中。采用肌肉注射法免疫，每两周免疫一次，共免疫6次。从第二次免疫开始尾静脉采血，离心后取上清，以化学合成的FMDV141-160为抗原，采用间接ELISA的方法检测小鼠血清中的抗体水平。

结果如图15所示，在6次免疫之后，阴性组，BG组及不含FMDV基因的Ii组这3个对照组中血清中FMDV抗体滴度均很低，而FMDV、Ii-FMDV、BG+FMDV和BG+Ii-FMDV四组均检出高滴度的抗FMDV抗体，其中，BG+Ii-FMDV组的FDMV抗体滴度超过10240。采用吸引析因设计方差分析对各组数据进行分析，发现四个实验组与3个对照组有显著差异(p＜0.01)，而四个实验组之间也有差异(p＜0.05)，抗体效价由低到高排列顺序为：FMDV组＜Ii-FMDV组＜BG+FMDV组＜BG+Ii-FMDV组，提示BG装载确实能够增加FMDV DNA疫苗的免疫原性，表现为BG+Ii-FMDV组的抗体滴度高于Ii-FMDV组，BG+FMDV组的抗体滴度高于FMDV组；同时Ii分子能够显著增强抗原提呈能力，进一步增强DNA疫苗的免疫原，表现为Ii-FMDV组的抗体滴度高于FMDV组，BG+I i-FMDV的抗体滴度高于BG+FMDV组。实验结果提示，双重靶向的DNA疫苗的免疫原性优于单靶向疫苗，而单靶向疫苗的效果优于非靶向疫苗。由于内源性靶向载体本身并不能增加外源基因在抗原提呈细胞中的表达水平，因此可以推测内源性表达载体主要是通过提高抗原提呈效率来提高DNA疫苗的免疫反应水平。

二、淋巴细胞增殖及细胞因子检测

处死小鼠，摘取小鼠脾脏，研磨后洗涤，取上清，用淋巴细胞分离液分离脾脏细胞中的淋巴细胞，以4-6×10⁶/mL的浓度种于96孔板中，在5％CO₂中，37℃培养24小时，加入ConA(5μg/mL，阳性对照)，FMDV合成抗原(3μg/mL)以及单纯的1640培养基(阴性对照)。刺激48小时候后，取细胞上清100μl，使用IL-2，IFN-γ检测试剂盒检测上清的细胞因子水平。细胞采用PROMEGA公司单溶液细胞增殖检测试剂盒检测T细胞的增殖能力。在加入检测试剂并于37℃孵育4h后，检测450nm的吸光度。

在细胞因子检测实验中，IL-2、IFN-γ均采用ELISA法检测。结果如图16所示，FMDV刺激后，可见各组中均有IL-2，IFN-γ分泌，除Ii组外，其它各组相对于阴性对照的差异具统计学意义(P＜0.05)。而在四个实验组中，BG装载组分离的脾脏淋巴中的细胞因子水平高于其对应的非装载组，而在同等条件下内源靶向组的细胞因子水平明显高于非内源性靶向组，而双重靶向组优于单靶向组。值得指出的是，BG组的细胞因子水平也很高，这可能是由于BG本身也能够刺激非特异性的免疫反应，导致细胞因子整体水平升高。

T细胞增殖的检测结果如图17所示(ConA为非特异刺激的阳性对照组，1640为阴性对照组，FMDV为特异性刺激实验组。)，四个实验组均可见到FMDV特异性刺激引起的T细胞增殖，相对于阴性对照及阳性对照组(Con A)均有显著性差异(P＜0.05)。其中，BG+Ii-FMDV组的T细胞增殖能力高于Ii-FMDV组，BG+FMDV组的T细胞增殖能力高于FMDV组，提示BG装载确实能够提高FMDV疫苗的免疫原性，刺激特异性的T细胞增殖反应；同时Ii分子能够显著增强FMDV疫苗的抗原提呈能力，进一步增强疫苗的免疫原，表现为Ii-FMDV组的T细胞增殖活力高于FMDV组，BG+Ii-FMDV组的T细胞增殖活力高于BG+FMDV组。上述实验结果说明本发明的双重靶向疫苗的免疫原性明显高于单靶向，单靶向组又高于非靶向组。

三、针对BG的的抗体滴度的检测

取各组小鼠血清，用大肠杆菌BG检测血清中抗BG抗体的滴度，以观察以BG为载体的疫苗是否会产生针对BG的抗体。具体方法为：将血清样品分别稀释1、10、20、40、80倍后取5μl与适量等体积BG混匀，37℃孵育1h。6000×g离心，PBS洗涤2次。加入HRP标记的羊抗鼠抗体3μl，37℃孵育30min。PBS洗涤2次，定溶至500μl，流式细胞仪检测。

检测结果显示(图18，与血清反应的BG阳性率越高，说明血清中抗体滴度越高)，阴性对照，裸质粒注射组的血清均可在一定程度上与BG发生反应，但只能抗体与17.3％以下的BG发生反应，而且当血清稀释80倍以上时，仅1.5％在BG表面检测到抗体的信号，提示小鼠体内存在抗大肠杆菌的抗体，但是抗体的滴度很低。相反，在BG组或装载质粒的BG组中，血清抗体与BG反应的程度很高，当血清稀释80倍时，仍可以使80％左右的BG显示阳性信号，说明在以BG或BG+质粒免疫动物之后，可在体内产生高滴度的抗BG抗体，这些动物有可能对大肠杆菌产生较强的抗性。实验提示，BG在作为载体的同时，其本身还有可能作为疫苗，对相应的疾病产生免疫保护作用。

以上实施例以获得双重靶向FMDV疫苗为例，说明了以BG作为疫苗DNA运送载体，并携带有MHC-II的分子伴侣恒定链Ii基因制备得到的双重靶向DNA疫苗。可以确知的是，病毒不限于FMDV，可用本发明方法制备针对任何疾病的疫苗，包括但不限于口蹄疫、乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、肿瘤等疾病的疫苗；另一方面，实施例2中所用出发载体也不限于pDSRed-N1，还可以同类的pcDNA3.1、pEGFP-N1、pSV2、pLXSN以及其它任何可在真核细胞内表达载体作为出发载体，这些变化对于本领域技术人员而言均是常规技术，因此，这些常规变换所得到的双重靶向DNA疫苗也理应归属本发明。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所

<120>一种双重靶向DNA疫苗及其构建方法

<130>CGCNB105059W

<160>3

<210>1

<211>504

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atggatgacc aacgcgacct catctctaac catgaacagt tgcccatact gggcaaccgc    60

cctagagagc cagaaaggtg cagccgtgga gctctgtaca ccggtgtctc tgtcctggtg    120

gctctgctct tggctgggca ggccaccact gcttacttcc tgtaccagca acagggccgc    180

ctagacaagc tgaccatcac ctcccagaac ctgcaactgg agagccttcg catgaagctt    240

ccgaaatctg ccaaacctgt gagccagatg cggatggcta ctcccttgct gatgcgtcca    300

atgtccatgg ataacatgct ccttgggcct gtgaagaacg ttaccaagta cggcaacatg    360

acccaggacc atgtgatgca tctgctcacg aggtctggac ccctggagta cccgcagctg    420

aaggggacct tcccagagaa tctgaagcat cttaagaact ccatggatgg cgtgaactgg    480

aagatcttcg agagctggat gaag                                           504

<210>2

<211>240

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ctcgagatga cggatccgca tgcgagctcg gtaccccagc ttccgaaatc tgccaaaccg    60

gtgagccagg aaacacagat ccagaggcgc caacacacgg acgtctcgtt catcatggac    120

agatttgtgg gcgtgcccaa cttgagaggt gaccttcagg tgttggctca aaaggtggca    180

cggacgctgc ctcggccgat gtccatggat aacatgctcc ttgggcctgt gaagaacgtt    240

<210>3

<211>222

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ctcgagatga cggatccgca tgcgagctcg gtaccccagc ttccgaaatc tgccaaaccg    60

gtgagccagg tgcccaactt gagaggtgac cttcaggtgt tggctcaaaa ggtggcacgg    120

acgctgcctg gcagacacaa acagaaaatt gtggcaccgg tgaaacagac tttgcggccg    180

atgtccatgg ataacatgct ccttgggcct gtgaagaacg tt                       222

 

Claims (2)

1.一种双重靶向DNA疫苗，其特征在于：为针对FMDV的疫苗，是将质粒pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)装载于BG中得到，所述BG为细菌鬼影，所述质粒pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)按下述方式构建得到：将序列表中序列1所示小鼠Ii基因插入载体pDSRed-N1中形成真核表达载体pDSRed-mIi，另外用编码FMDV-VP1蛋白优势抗原表位的基因替代所述真核表达载体pDSRed-mIi中Ii基因的CLIP区基因的80-130aa片段，得到质粒pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)，所述优势抗原表位为FMDV-VP1蛋白的21-40和141-160片段间加入连接物甘氨酸形成。

2.一种权利要求1所述双重靶向DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)将所述真核表达载体pDSRed-mIi中编码Ii基因的CLIP区80-130aa基因片段切除，用优势抗原表位基因替代，再将该基因片段连接入所述真核表达载体pDSRed-mIi中，构建得到携带优势抗原表位和Ii基因的质粒pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)；

2)将步骤1)构建的携带优势抗原表位和Ii基因的质粒导入BG中，得到双重靶向DNA疫苗；具体过程为：将10mg/mL质粒pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)和6.2mg/mL BG混匀在包被缓冲液中，28℃水浴90min；再加入2mg/mL的膜囊和25mMCaCl₂封闭BG，37℃孵育过夜。

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