CN112206317B - 一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，属于基因工程疫苗技术领域。本发明公开的一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，首先以GCRV‑I、II S10基因为靶基因，构建融合表达GCRV‑I、II衣壳蛋白的真核表达载体，并进行体外表达鉴定；第二阶段制备大肠杆菌DH5α菌蜕，将裂解质粒pHH43导入大肠杆菌DH5α，制备出具有完好外膜的大肠杆菌菌蜕；第三阶段进行大肠杆菌菌蜕装载重组质粒研制二价核酸菌蜕疫苗，并进行实验室免疫效果评价研究，初步确定了免疫方案并进行了免疫示范应用。

Description

一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程疫苗技术领域，更具体的说是涉及一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法。
背景技术
草鱼出血病一直是我国草鱼养殖中最难控制的疾病，目前对于病毒病还没有特效的治疗方法，一直采用疫苗免疫作为控制该病的主要方法，最早全国各地相继应用组织浆灭活疫苗进行免疫防治，取得了一定的成效，但组织浆灭活疫苗需大量鱼体扩增病毒，费时费力，并存在扩散病毒的危险。后又研制成功细胞灭活疫苗及细胞培养弱毒疫苗并取得了疫苗生产批准文号，在多个地区进行了推广应用，对草鱼出血病的控制起了很大的作用，但细胞灭活疫苗的制备需大量培养病毒并传代扩增，成本很高，也存在灭活不完全会散毒的危险。弱毒活疫苗常能有效的刺激机体的免疫系统产生体液免疫和细胞免疫，其主要缺点是接种机体后毒力可能出现返强，以及运输保存时要求的条件较高。鉴于这些常规疫苗难以解决的问题以及GCRV出现新的毒力较强的变异毒株即GCRV-II在全国范围内流行的情况，迫切需要研制一种安全、高效且多价的疫苗用于预防草鱼出血病的爆发。
核酸疫苗(nucleic acid vaccine)以其无致病性、研制简单等诸多优点成为现代疫苗的研究热点，该疫苗也称基因疫苗(genetic vaccine)或DNA疫苗(DNA vaccine)，是指将含有编码某种抗原蛋白的外源基因克隆到真核表达质粒载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。该疫苗具有安全、价廉、易于制备、改造等优点，故一经问世便迅速发展起来，本实验室也研制了GCRV-I VP7的核酸疫苗，取得了一定的草鱼免疫效果。但越来越多的研究也发现核酸疫苗存在着免疫方式有限、免疫原性不强，常需高剂量多次免疫等问题。因而，人们开始转向对核酸疫苗佐剂和载体的研究，希望能够通过各种佐剂、载体的使用来扬长补短，使其免疫效果得到进一步提高。
菌蜕的问世，为核酸的输送带来了新的希望，菌蜕是利用基因灭活的方法而产生的细菌空壳，即噬菌体PhiX174裂解蛋白E介导的G-菌的裂解而产生，由于G-菌具有完整的生物亲和性的外膜结构，如菌毛能够进行特异的细胞和组织定位，其表面的脂多糖成分可以作为一种天然佐剂，而且菌蜕的胞周间隙和细胞空腔可接收大量外源物质，因而菌蜕成为一种新型无病原性的生物载体和靶向工具，并且有望在增强核酸疫苗免疫原性、弥补其接种方式受限方面开辟一个新的途径，为更高效的DNA疫苗的开发提供一个具有广阔前景的技术平台。
因此，提供一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，具体步骤如下：
(1)构建GCRV-I-II-S10重组质粒；
(2)制备大肠杆菌DH5α菌蜕；
(3)制备GCRV二价核酸菌蜕疫苗：
将步骤(2)制备的大肠杆菌DH5α菌蜕重悬于含GCRV-I-II-S10重组质粒的PBS体系中，加入CaCl2溶液，摇床孵育，离心，收集沉淀，得到GCRV二价核酸菌蜕疫苗。
进一步，步骤(1)构建GCRV-I-II-S10重组质粒的具体步骤如下：
①分别根据GCRV-I及GCRV-II第10基因片段序列，直接合成可融合表达的基因序列，并引入Hind III/EcoR I双酶切位点，基因序列如SEQ ID NO.1所示；
②利用Hind III和EcoR I对pcDNA3.1(+)载体进行双酶切，再将酶切产物用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化；
③将步骤①获得的基因序列和步骤②酶切纯化后的pcDNA3.1(+)载体利用T4 DNA连接酶16℃过夜连接；
④将步骤③获得的连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有50μg·mL-1Amp+的LB平板上进行筛选，挑取白色菌落进行扩增，并小量提取质粒，进行双酶切鉴定，获得pcDNA-I-II-S10重组质粒。
进一步，步骤(2)制备大肠杆菌DH5α菌蜕的具体步骤如下：
①将裂解质粒pHH43转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有30mg/L氯霉素的固体LB平板进行筛选，挑取单个菌落小提质粒进行EcoR V和Kpn I双酶切鉴定；
②经鉴定，将含有裂解质粒pHH43的大肠杆菌于28℃ 200rpm摇床培养，当OD600＝0.4-0.6时，迅速升高温度至42℃以启动E裂解蛋白的表达，前期每隔20min、后期1h测定OD值，280min后挑选OD值最小的克隆菌进行菌蜕收集。
进一步，步骤(3)制备GCRV二价核酸菌蜕疫苗的具体步骤如下：
将0.5mL浓度为4.6×108CFU/mL菌蜕重悬于含762μg GCRV-I-II-S10重组质粒的4.5mL的PBS体系中，加入终浓度25mM CaCl2溶液，25℃、150rpm摇床孵育15min，8000rpm离心10min收集沉淀，再用PBS将沉淀悬浮稀释至使用浓度，得到GCRV二价核酸菌蜕疫苗。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，并进行了草鱼实验室免疫效果评价研究，高剂量(6μg/尾)腹腔及肌肉免疫组保护率分别为75％及71.4％，低剂量(0.6μg/尾)腹腔及肌肉免疫组保护率分别为71.4％和67.8％。根据实验室免疫效果评价及实际情况初步制订了草鱼二价核酸菌蜕疫苗免疫方案，即每年3月初放苗时进行免疫，二价核酸菌蜕疫苗菌蜕浓度为3.2×108CFU/mL，重组质粒装载量为0.6μg/100μL，体重为20g-50g的草鱼鱼种，每尾鱼腹腔注射100μL，51g-100g的草鱼鱼种，每尾鱼腹腔注射200μL。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明重组质粒pcDNA-I-II-S10酶切鉴定结果；
其中，M：Marker；1：重组质粒双酶切产物；
图2附图为本发明荧光显微镜观察融合基因在CHO和CIK中的表达(×200)；其中，A：CHO细胞；B：CIK细胞；
图3附图为本发明阳性克隆双酶切鉴定；其中，M：2000bp Marker；1、3、4、5、6、7、8：单克隆EcoR V/Kpn I双酶切；
图4附图为本发明3号单克隆菌热诱导前后平板计数；
其中，A：热诱导后，10-3稀释平板，32个单克隆；B：热诱导前，10-6稀释平板，122个单克隆；
图5附图为本发明1、3、4号克隆菌以及对照组细菌DH5α生长与动态裂解曲线；
其中，1号克隆菌：1DH5α(pHH43)；3号克隆菌：3DH5α(pHH43)；4号克隆菌：4DH5α(pHH43)；对照组细菌DH5α；
图6附图为本发明大肠杆菌DH5α和DH5α菌蜕扫描电镜观察；
其中，A:正常大肠杆菌DH5α；B:大肠杆菌DH5α菌蜕，箭头所示为裂解孔道；
图7附图为本发明注射不同剂量疫苗对草鱼MHC I mRNA表达量的影响；
图8附图为本发明注射不同剂量疫苗对草鱼IFN I mRNA表达量的影响；
图9附图为本发明注射不同剂量疫苗对草鱼Intelectin mRNA表达量的影响；
图10附图为本发明草鱼IgM基因的PCR扩增电泳图谱；
其中，M：DL2000标准分子量；1：PCR扩增产物；2：阴性对照；
图11附图为本发明SDS-PAGE鉴定表达；
其中，M：蛋白质分子量标准；1：未诱导的菌体；2：诱导的菌体；
图12附图为本发明SDS-PAGE鉴定目的蛋白可溶性；
其中，M：蛋白质分子量标准；2：上清液；3：沉淀；
图13附图为本发明SDS-PAGE鉴定目的蛋白纯化过程；
其中，M：蛋白质分子量标准；1：Buffer B溶解后的上清；2：流穿液；3：Buffer C后的滤液；4：Buffer D后的滤液；5：Buffer E、F后的合并滤液；6：Buffer G后的滤液；
图14附图为本发明Western blot分析草鱼IgM蛋白单抗特性；
其中，M：蛋白质分子量标准；1：纯化的重组IgM蛋白；
图15附图为本发明重组质粒pET28a-GCRV-I双酶切鉴定结果；
图16附图为本发明重组质粒pET28a-GCRV-II双酶切鉴定结果；
图15-16中，M：marker；1：双酶切结果；
图17附图为本发明GCRV-I融合蛋白SDS-PAGE分析图；
图18附图为本发明GCRV-II融合蛋白SDS-PAGE分析图；
图17-18中，M：Protein Marker；1：诱导前总蛋白；2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀；
图19附图为本发明GCRV-I融合蛋白镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析图；
其中，M：Protein marker；1：上样；2：流出；3：20mM Imidazole；4：50mMImidazole；5：500mM Imidazole；
图20附图为本发明GCRV-I纯化蛋白SDS-PAGE分析结果；
图21附图为本发明GCRV-I纯化蛋白Western Blot分析结果；
图22附图为本发明GCRV-II融合蛋白镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析图；
其中，M：Protein marker；1：上样；2：流出；3-4：20mM Imidazole；5-7：50mMImidazole；8：500mM Imidazole；
图23附图为本发明GCRV-II纯化蛋白SDS-PAGE分析结果；
图24附图为本发明GCRV-II纯化蛋白WesternBlot分析结果；
图25附图为本发明不同草鱼免疫组不同时间采集的血清基因I型GCRV抗体水平；
图26附图为本发明不同草鱼免疫组不同时间采集的血清基因II型GCRV抗体水平；
图25-26中，1-1W为首免一周；1-2W为首免两周；1-3W为首免三周；1-4W为首免四周；2-2W为二免两周；2-3W为二免三周。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1GCRV-I-II-S10基因真核重组质粒的构建
分别根据GCRV-I及GCRV-II第10基因片段序列(序列号AF403396.1，GU350747.1)(I型S10 909bp，II型1124bp)，直接合成可融合表达的基因序列，并引入Hind III/EcoR I双酶切位点，全长序列为1892bp(见SEQ ID NO.1)，氨基酸序列621aa(见SEQ ID NO.2)。
利用Hind III和EcoR I对pcDNA3.1(+)载体进行双酶切，再将酶切产物用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化。然后按照3：1的比例(全长序列：pcDNA3.1(+))将两者混合，加T4 DNA连接酶，于16℃反应过夜。以连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有50μg·mL-1Amp+的LB平板上进行筛选，挑取白色菌落进行扩增，并小量提取质粒，进行双酶切鉴定，结果见图1。双酶切鉴定目的片段为1892bp，且测序正确，表明重组质粒pcDNA-I-II-S10构建成功。
实施例2重组质粒pcDNA-I-II-S10的体内外表达鉴定
直接合成GCRV-I-II-S10目的基因与GFP融合表达的基因，GFP片段在下游，并引入Hind III/EcoR I双酶切位点，全长序列为2609bp，具体基因序列见SEQ ID NO.3。
将上述基因序列克隆入pcDNA3.1(+)载体，进行重组质粒pcDNA-I-II-S10-GFP鉴定后转染细胞，进行融合基因体外表达鉴定。利用阳离子脂质体介导法，将含GFP基因的重组质粒pcDNA-I-II-S10-GFP转染到培养成单层的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)及草鱼肾细胞(CIK)中进行瞬时表达，通过荧光倒置显微镜观察GFP的表达，结果见图2，表明所构建的表达载体在两种细胞中均得到了很好的表达。另外，将制备的融合表达重组质粒免疫Balb/c小鼠，3次免疫后测定免疫小鼠血清抗基因I型和II型GCRV的ELISA效价分别为1：320和1：640，结果表明所构建的融合表达重组质粒能在体内表达并产生免疫应答反应。
实施例3大肠杆菌DH5α菌蜕的制备
将裂解质粒pHH43(含噬菌体PhiX174的裂解基因E及热敏感元件λpR-cI857)转化至制备好的感受态细胞DH5α，涂布于含有Cm(氯霉素，30mg/L)的固体LB平板进行筛选，挑取单个菌落小提质粒进行EcoR V和Kpn I双酶切鉴定，结果见图3。将阳性即含有裂解质粒pHH43的大肠杆菌于28℃200rpm摇床培养，当OD600＝0.4-0.6时，迅速升高温度至42℃以启动E裂解蛋白的表达，前期每隔20min、后期1h测定OD值，280min后挑选OD值最小的克隆菌(图4的泳道3，记为3号克隆菌：3DH5α(pHH43))进行菌蜕收集，并进行菌落计数(CFU)，结果见图4-5，计算其裂解效率为99.973％。扫描电镜观察菌蜕形态，菌蜕细胞保持了细菌的基本细胞形态，但细胞表面因为细胞内容物流失而发生明显的皱缩，并能看到菌蜕细胞上的溶菌孔道，溶菌孔道位于细胞两极，结果见图6。
实施例4GCRV二价核酸菌蜕疫苗的制备
大量制备上述GCRV-I-II-S10真核重组质粒及大肠杆菌菌蜕，分别测定并计算好浓度后，将0.5mL浓度为4.6×108CFU/mL菌蜕重悬于含762μgGCRV-I-II-S10真核重组质粒的4.5mL的PBS体系中，加入终浓度25mM CaCl2溶液，25℃、150rpm摇床孵育15min，8000rpm离心10min收集沉淀和上清，Nanodrop2000测定上清OD260值42.4ng/μL，计算出上清中DNA的量212μg；从而计算出菌蜕核酸疫苗中DNA的含量为550μg，结果表明菌蜕装载效率为72％，再用PBS将沉淀悬浮稀释至使用浓度即可。
实施例5GCRV二价核酸菌蜕疫苗免疫效果评价研究
草鱼免疫分组
于试验前两周，选取同一批健康的草鱼，体重30±5g。在过滤的池塘水中充氧饲育，水温20-22℃。试验共分14个组，各组免疫50尾鱼，每2组同样的免疫剂量和途径。(1)高剂量腹腔免疫组：腹腔注射装载重组质粒菌蜕(6μg/尾)；其中6μg/尾为按装载的重组质粒量进行免疫；(2)高剂量肌肉免疫组：肌肉注射装载重组质粒菌蜕(6μg/尾)；(3)低剂量腹腔免疫组：腹腔注射装载重组质粒菌蜕(0.6μg/尾)；(4)低剂量肌肉免疫组：肌肉注射装载重组质粒菌蜕(0.6μg/尾)；(5)高剂量空载体腹腔组：腹腔注射装载空载体菌蜕(6μg/尾)；(6)高剂量空载体肌肉组：肌肉注射装载空载体菌蜕(6μg/尾)；(7)对照组：腹腔注射PBS对照；以上各处理组注射体积均为100μL。接种后1d、3d、5d和7d分别取组织，提取RNA，测定免疫基因的表达量。分别于接种后1W、2W、3W、4W尾静脉取血；首免2W后二免，二免后2W、3W尾静脉取血；将静脉血放置灭菌离心管中，4℃冰箱过夜，1500r/min离心10min，分离血清，-20℃保存，用于抗体的检测。
(一)细胞免疫效果评价研究
(1)引物设计及合成
根据GenBank中登录的草鱼免疫基因Intelectin、MHCI、IFNI以及内参基因18SrRNA基因序列设计特异性扩增引物(表1)，引物序列由南京金斯瑞生物公司合成。
表1荧光定量PCR的引物序列
(2)MHC I mRNA在不同草鱼免疫组中的表达
利用上述MHCI引物，对接种后1d、3d、5d和7d的组织RNA进行qRT-PCR分析；采用方法处理数据，结果见图7。图11结果显示，各免疫组MHC I mRNA表达呈现先上升后下降再上升的趋势，其中在7d时表达量最高，最高表达量组是对照组的6.8倍。经SPSS多重比较显示，各组之间除了高剂量空载体腹腔组和高剂量空载体肌肉组之间无显著差异外，其他各组之间表达量呈显著差异(P<0.05)；多重分析显示，不同时间之间表达量差异均显著(P<0.05)。
(3)IFN I mRNA在不同草鱼免疫组中的表达
利用上述IFN I引物，对接种后1d、3d、5d和7d的组织RNA进行qRT-PCR分析；采用方法处理数据，结果见图8。图12结果显示，与对照组相比，各免疫组IFN I mRNA表达均呈现先上升后下降的趋势，其中在3d时表达量最高，最高表达量组是对照组的18倍。经SPSS多因素方差分析组别间多重比较显示，各免疫组之间除了PBS对照组和高剂量空载体肌肉组之间、高剂量腹腔免疫组和低剂量腹腔免疫组之间无显著差异外，其他各组之间表达量呈显著差异(P<0.05)；多重分析显示，不同时间之间表达量差异均显著(P<0.05)。
(4)intelectin mRNA在不同草鱼免疫组中的表达
利用上述intelectin引物，对接种后1d、3d、5d和7d的组织RNA进行qRT-PCR分析；采用方法处理数据，结果见图9。图13结果显示，与对照组相比，各免疫组intelectinmRNA表达均呈现上升的趋势，其中在7d时表达量最高，最高表达量组是对照组的14倍。经SPSS多因素方差分析组别间多重比较显示，各免疫组之间均呈显著差异(P<0.05)；多重分析显示，除免疫5d时表达量与对照组间差异不显著，其余时间差异均显著(P<0.05)。
(二)体液免疫效果评价研究
1)草鱼免疫球蛋白IgM原核表达及纯化
为了有效评价GCRV二价核酸菌蜕疫苗免疫的抗体效价，对草鱼免疫球蛋白IgM重链区进行了原核表达纯化。
针对GenBank中登录的草鱼IgM的基因组序列(DQ417927.1)设计了1对特异性引物，具体引物序列如下：
上游引物：5’-CTACCTCCAACTCCACCACC-3’；SEQ ID NO.12；
下游引物：5’-ACCGCTCTTCCACTCAGAAT-3’；SEQ ID NO.13；
引物序列由南京金斯瑞生物公司合成。
PCR反应体系如下：
HS(Premix)25μL，模板3.5μL，上下游引物各1μL，ddH2O19.5μL，总体系50μL。PCR反应条件：95℃ 5min；94℃ 50sec，55℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸12min，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图10，可观察到891bp大小的目的DNA条带，大小与预期的一致。
将扩增获得的IgM与载体连接，转化，筛选，获得重组质粒菌株；进行SDS-PAGE分析。
将单克隆白色菌落，接种于3ml LB液体培养基中(含有100μg/mL氨苄)，37℃，250rpm过夜培养，第二天挑取新鲜菌液继续扩大培养，37℃ 250rpm恒温摇至OD600＝0.8时，加入终浓度为(1mM)的IPTG诱导，同时设置未诱导组，诱导6h后置于4℃冰箱备用。
经SDS-PAGE分析表达的重组蛋白显示，重组质粒菌株在43kD处出现一条目的条带，见图11；/>载体的His-标签蛋白与目的蛋白一起融合表达。经超声波裂解，分别取破碎液离心后的上清液和沉淀，经SDS-PAGE分析表明，融合标签蛋白的目的蛋白主要存在于沉淀中，即目的蛋白主要存在于包涵体中，见图12。
2)目的蛋白IgM的纯化
Lysis Buffer配方：Tris-HCL 0.7882g，NaCL 1.7532g，Imidazole 0.06808g，加蒸馏水至终体积100mL。
Buffer B配方：磷酸二氢钠7.02045g，Tris 0.54513g，Urea 216.216g，Imidazole0.6129g，调整pH至8.0，加蒸馏水至终体积450mL。
Buffer C配方：取配制好的Buffer B溶液30mL，加入Imidazole 0.08172g溶解。
Buffer D配方：取配制好的Buffer B溶液30mL，加入Imidazole 0.14301g溶解。
Buffer E配方：取配制好的Buffer B溶液30mL，加入Imidazole 0.2043g溶解。
Buffer F配方：取配制好的Buffer B溶液30mL，加入Imidazole 0.26559g溶解。
Buffer G配方：取配制好的Buffer B溶液30mL，加入Imidazole 0.36774g溶解。
含6mol/L尿素的PBS的配方：取配制好的PBS溶液600mL，加入Urea 216.216g溶解。
目的蛋白的大量表达和纯化
①将菌液按照上述摸索好的表达条件诱导表达6小时。
②诱导表达的菌液4℃，8000rpm，15min收集菌体，弃去上清；收集菌体，用80mLPBS重悬离心洗涤2次后，再加入8mL Lysis Buffer重悬，加溶菌酶至终浓度1mg/ml置于冰上4℃冰箱内过夜放置。
③冰上超声波破碎。
④将破碎液离心收集细菌沉淀(该蛋白可溶性检验为包涵体蛋白)，然后参照Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)说明书纯化目的蛋白。
操作步骤如下：
A、组装层析：将填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出；
B、用5-10倍柱体积的Buffer B平衡层析柱；
C、细菌沉淀用Buffer B 8ml溶解，悬浮后室温放置5h；
D、12000rpm，20min，4℃离心，上清及沉淀分别跑SDS-PAGE胶，大部分反应在上清中；
E、将上清加到Ni柱中，冰浴1小时，放掉上清，收集流穿液鉴定目的蛋白的结合情况；
F、用5-10倍柱体积的BufferB洗涤层析柱，收集流出液；
G、用4mL Buffer C洗涤层析柱，收集滤液；
H、用4mL Buffer D洗涤层析柱，收集滤液；
I、用4mL Buffer E洗涤层析柱，收集滤液；
G、用4mL Buffer F洗涤层析柱，收集滤液；
K、用4mL Buffer G洗涤层析柱，收集滤液。
纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE电泳分析，结果见图13，纯化过程中，杂带被去除，IgM蛋白最终呈现单一条带。目的蛋白经透析浓缩后用NanoDrop2000超微量分光光度计测定浓度为1.224mg/mL。
3)草鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体的制备
利用纯化的目的蛋白免疫BALB/c小鼠，制备了5株单克隆抗体，分别为3A8D1、3F4E2、4A6E3、4H8B6和10G2D9，ELISA效价达1：3200-1：6400，选择10G2D9制备了小鼠腹水进行抗体纯化，效价为1：5.12×105，这为疫苗的免疫效果评价提供了必要的试剂。Westernblot分析草鱼IgM蛋白单抗特性结果见图14。
4)TAS-ELISA方法的建立
首先利用方阵实验确定TAS-ELISA体系各抗原、抗体的工作浓度。然后进行待测样品的检测。
(1)两种基因型GCRV S10基因原核表达载体的构建及蛋白表达纯化
①分别根据GCRV-I及GCRV-II第10基因片段序列(序列号AF403396，GU350747.1)(I型S10 909bp，II型1124bp)，设计特异性引物，并引入酶切位点Nde I和Xho I，进行PCR扩增。
其中，GCRV-I引物序列如下：
上游引物：5’-CGCATATGATGCCACTTCACATGATTCCGCA-3’；SEQ ID NO.14；
下游引物：5’-CTACCTCGAGTGGCTCCACATGCAAGTCGAGTC-3’；SEQ ID NO.15。PCR反应体系如下(50μL)：HS(Premix)25μL，上游引物(10μmol/L)
1μL，下游引物(10μmol/L)1μL，cDNA模板3μL，ddH2O20μL。PCR反应条件：95℃5min后从94℃50sec，56℃1min，到72℃1min共进行36个循环；72℃延伸10min，PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。获得目的蛋白的基因序列为840bp，大小与预期一致，测序正确。
GCRV-II引物序列如下：
上游引物：5’-CGCATATGATGGCGGGTGTGTCTCTCAA-3’；SEQ ID NO.16；
下游引物：5’-CTACCTCGAGCATCTGCGCAAATATACGTCT-3’；SEQ ID NO.17。
GCRV-II扩增的PCR反应体系同GCRV-I。PCR反应条件：95℃ 5min后从94℃ 50sec，57℃ 1min，到72℃ 1min共进行36个循环；72℃延伸10min，PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。获得目的蛋白的基因序列为1050bp，大小与预期一致，测序正确。
②重组质粒pET28a-S10的鉴定
分别将上述目的条带克隆于原核表达载体pET28a中，构建了表达目的蛋白的原核表达载体pET28a-GCRV-I、pET28a-GCRV-II，小量提取重组质粒，进行双酶切鉴定，结果见图15-16，结果表明：S10基因片段已成功克隆入pET28a中。
③诱导表达融合蛋白
分别将上述重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达，分别于20℃诱导过夜；37℃诱导4h，收集菌体，超声破碎，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μL包涵体溶解液溶解，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析融合蛋白的表达情况结果见图17-18，结果表明，两种融合蛋白均能在大肠杆菌中以包涵体形式表达，分子量大小为分别为32kDa和41kDa。
④表达蛋白纯化鉴定及浓度测定
大量诱导表达融合蛋白，超声破碎菌体，镍琼脂糖亲和层析纯化，进行SDS-PAGE及Western blot检测，见图19-24，表明两个蛋白均获得了较好的纯化，并测定两个纯化蛋白浓度，分别为0.70mg/mL及0.72mg/mL，纯度均大于80％。两个蛋白的表达纯化为进一步ELISA评价疫苗免疫效果提供了有用的试剂。
(2)TAS-ELISA方法
A、包被两种基因型GCRV纯化的融合表达蛋白，分别用包被液CBS(pH9.6碳酸盐缓冲液)稀释到50μg/mL，包被96孔酶标板，100μL/孔，4℃冰箱过夜。
B、封闭取出过夜的ELISA板，用PBST充分洗涤3～4次，每次3～5min。用含10％小牛血清的PBS封闭，200μL/孔，37℃封闭3h，同上洗涤。
C、一抗孵育每孔加入100μL草鱼血清(1：80稀释)，37℃孵育1.5h，同上洗涤。
D、单抗孵育每孔加入100μL所制备的草鱼IgM单抗腹水(1：1000稀释)，37℃孵育1.5h，同上洗涤。
E、酶标抗体孵育每孔加入50μL工作浓度(1：2000)的羊抗鼠IgG酶标抗体，37℃孵育1.5h，同上洗涤。
F、TMB显色，每孔50μL，37℃避光显色10～l5min。终止并读数，每孔加50μL 2mol/L硫酸终止反应。应用酶联免疫阅读仪读出OD450值。P/N≥2.1者判为阳性，P/N<2.1者判为阴性。(P代表TAS-ELISA所测受免草鱼血清中抗体的OD值，N代表所测健康草鱼的相应血清中抗体的OD值)
(3)不同草鱼免疫组I型抗体水平评价
利用上述建立的TAS-ELISA方法，对不同草鱼免疫组不同时间采集血清进行了抗体水平测定，抗基因I型GCRV抗体的变化如图25，两种不同免疫剂量的二价核酸菌蜕疫苗经不同免疫途径接种草鱼1周后，都能测到针对基因I型GCRV的抗体，且显著高于对照组(P<0.05)；并且随着时间的延长抗体水平增加，但一免4周内各周抗体水平差异不显著，但都显著高于对照组(P<0.05)；二免后2周及3周血清抗体水平明显提高，且显著高于对照组和一免的血清抗体水平(P<0.05)。经方差分析结果表明，高剂量和低剂量二价核酸菌蜕疫苗分别经腹腔及肌肉两种免疫途径免疫草鱼产生的针对基因I型GCRV抗体水平没有显著差异(P＞0.05)。
(4)不同草鱼免疫组II型抗体水平评价
利用上述建立的TAS-ELISA方法，对不同草鱼免疫组不同时间采集的血清进行了抗体水平测定，抗基因II型GCRV抗体的变化如图26，两种不同免疫剂量的二价核酸菌蜕疫苗经不同免疫途径接种草鱼1周后，都能测到针对基因II型GCRV的抗体，且显著高于对照组(P<0.05)；并且随着时间的延长抗体水平增加，但免疫3周、4周的抗体水平显著高于1周和2周，且都显著高于对照组(P<0.05)；二免后2周及3周血清抗体水平明显提高，除和一免后4周的草鱼抗体水平差异不显著外，显著高于对照组和其他三组血清抗体水平(P<0.05)。经方差分析结果表明，高剂量和低剂量二价核酸菌蜕疫苗分别经腹腔及肌肉两种免疫途径免疫草鱼产生的针对基因II型GCRV抗体水平没有显著差异(P＞0.05)，但同时间同剂量的草鱼抗体水平都高于基因I型GCRV抗体。
(三)免疫保护率测定
各组草鱼免疫后第21d，进行GCRV-HZ13强毒株(本实验室保存)攻毒，腹腔注射剂量为0.2mL。28℃水温饲养，观察15d。每日检查，记录发病情况，最后统计死亡率及免疫保护率，见表2。计算各试验组和对照组死亡率后，按下列公式进行计算：免疫保护率＝[(对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率]×100％。
表2疫苗免疫后草鱼的免疫保护率
(四)免疫方案的确定
综合上述免疫评价结果，并根据核酸菌蜕疫苗的免疫特点，初步制订了草鱼核酸菌蜕疫苗免疫方案。即每年3月初放苗时进行免疫，二价核酸菌蜕疫苗菌蜕浓度为3.2×108CFU/mL，重组质粒装载量为0.6μg/100μL，体重为20g-50g的草鱼鱼种，每尾鱼腹腔注射100μL，51g-100g的草鱼鱼种，每尾鱼腹腔注射200μL。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 浙江省淡水水产研究所
<120> 一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1892
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aagcttccgc cgccaccatg ccactccaca tgattccaca ggtcgcacac gctatggtca 60
gggctgctgc tgccggacgc ctcactctct atacaagaac tcgcaccgag acaacaaact 120
tcgaccacgc tgagtacgtg acctgcggcc ggtacacaat ctgcgccttt tgtctgacca 180
cactggctcc ccacgccaac gtgaagacaa tccaggactc tcacgcttgt agcaggcagc 240
ctaacgaggc catcagaagc ctggtggagg tgtccgataa ggctcagacc gccctggtgg 300
gctcccgcac agtggactac cacgagctgg atgtgaaggc tggattcgtg gctccaaccg 360
ccgacgagac aatcgccccc tctaaggata tcgtggagct gccttttcgg acctgcgacc 420
tggacgatag ctccgccaca gcttgcgtgc gcaaccactg tcaggctgga cacgacggag 480
tgatccacct gccaatcctg agcggcgatt tcaagctgcc caacgagcac cccaccaagc 540
ctctggacga tacacaccct cacgacaagg tgctgacccg gtgcccaaag acaggactgc 600
tgctggtgca cgatacccac gctcacgcta cagctgtggt ggctaccgct gctacaaggg 660
ctatcctgat gcacgacctg ctgacctctg ctaacgccga cgatggccac caggctagaa 720
gcgcctgtta cggaccagcc ttcaacaacc tgacctttgc ttgccactcc acatgtgcct 780
ctgatatggc tcattttgac tgcggacaga ttgtgggact ggacctgcat gtggaaccaa 840
gcgatatggc aggggtcagc ctcaacatca atcgcaacat ttcaaactcc gcaagcacca 900
tttttctgga agacatccct ctcctctcat gctctgtgcg ctgcgagcct ggcaagggaa 960
gggagctgcc aaagttcaac atgagctgcc ccgccatcaa cgctatgggc cggtgtctga 1020
accccatgaa gtttatcgcc gagcactggg tgcccaacag cccttccaga aagcctagcc 1080
ggcagcactg gcgcaacgtg ctgaacggcc tggagttctc caacggccgg ggattcgatg 1140
tgctgtcttt tagccctgcc ggaatggctg tgctgcgcga catcctgaca gaggatagcg 1200
tgaactactg cttcgatgag tccaacacct gttctctgtt tacactgctg tacaccctgt 1260
gctgtgacgc tgctggagtg gagccaatgg acctggattc cagacagaca gatgccagcg 1320
ccaggatggt gtcctaccag gacagggcca tcgtgctgac ctctaacgag gctggcgaca 1380
ggatcgagcc ttggaacgtg gagctggata aggagtttgg aaacccagac ctgctgtcta 1440
ggctgaacat cagctacggc gtgcagagat acggagactc caaggcctct accgatacac 1500
tgaccctggc cgacgctcca gagagatcca agcccgccct gatcacagtg cagccactgc 1560
tggtggctat gtgcatcaag cagtccctgg atggcctgct ggccctgtct gatctgaggc 1620
tgagattcga ccagtacccc ggatacgcca acgctctgat gaacgccatg gctatgtacg 1680
cttgtctgga cagggatctg atgagatttc tgctgcggct ggagatgaca cacgccagca 1740
ccgtgtccga ggtggctgag tgctggcgga actctcgcaa cagcagggac gccaccggct 1800
gtcacatcgt gcccaggcag ggactcctca ttattgtctc aggggatgtg gaagtcaggc 1860
ggatttttgc tcagatgctg taatgagaat tc 1892
<210> 2
<211> 621
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Pro Leu His Met Ile Pro Gln Val Ala His Ala Met Val Arg Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Arg Leu Thr Leu Tyr Thr Arg Thr Arg Thr Glu Thr
20 25 30
Thr Asn Phe Asp His Ala Glu Tyr Val Thr Cys Gly Arg Tyr Thr Ile
35 40 45
Cys Ala Phe Cys Leu Thr Thr Leu Ala Pro His Ala Asn Val Lys Thr
50 55 60
Ile Gln Asp Ser His Ala Cys Ser Arg Gln Pro Asn Glu Ala Ile Arg
65 70 75 80
Ser Leu Val Glu Val Ser Asp Lys Ala Gln Thr Ala Leu Val Gly Ser
85 90 95
Arg Thr Val Asp Tyr His Glu Leu Asp Val Lys Ala Gly Phe Val Ala
100 105 110
Pro Thr Ala Asp Glu Thr Ile Ala Pro Ser Lys Asp Ile Val Glu Leu
115 120 125
Pro Phe Arg Thr Cys Asp Leu Asp Asp Ser Ser Ala Thr Ala Cys Val
130 135 140
Arg Asn His Cys Gln Ala Gly His Asp Gly Val Ile His Leu Pro Ile
145 150 155 160
Leu Ser Gly Asp Phe Lys Leu Pro Asn Glu His Pro Thr Lys Pro Leu
165 170 175
Asp Asp Thr His Pro His Asp Lys Val Leu Thr Arg Cys Pro Lys Thr
180 185 190
Gly Leu Leu Leu Val His Asp Thr His Ala His Ala Thr Ala Val Val
195 200 205
Ala Thr Ala Ala Thr Arg Ala Ile Leu Met His Asp Leu Leu Thr Ser
210 215 220
Ala Asn Ala Asp Asp Gly His Gln Ala Arg Ser Ala Cys Tyr Gly Pro
225 230 235 240
Ala Phe Asn Asn Leu Thr Phe Ala Cys His Ser Thr Cys Ala Ser Asp
245 250 255
Met Ala His Phe Asp Cys Gly Gln Ile Val Gly Leu Asp Leu His Val
260 265 270
Glu Pro Ser Asp Met Ala Gly Val Ser Leu Asn Ile Asn Arg Asn Ile
275 280 285
Ser Asn Ser Ala Ser Thr Ile Phe Leu Glu Asp Ile Pro Leu Leu Ser
290 295 300
Cys Ser Val Arg Cys Glu Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Pro Lys Phe
305 310 315 320
Asn Met Ser Cys Pro Ala Ile Asn Ala Met Gly Arg Cys Leu Asn Pro
325 330 335
Met Lys Phe Ile Ala Glu His Trp Val Pro Asn Ser Pro Ser Arg Lys
340 345 350
Pro Ser Arg Gln His Trp Arg Asn Val Leu Asn Gly Leu Glu Phe Ser
355 360 365
Asn Gly Arg Gly Phe Asp Val Leu Ser Phe Ser Pro Ala Gly Met Ala
370 375 380
Val Leu Arg Asp Ile Leu Thr Glu Asp Ser Val Asn Tyr Cys Phe Asp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Thr Cys Ser Leu Phe Thr Leu Leu Tyr Thr Leu Cys Cys
405 410 415
Asp Ala Ala Gly Val Glu Pro Met Asp Leu Asp Ser Arg Gln Thr Asp
420 425 430
Ala Ser Ala Arg Met Val Ser Tyr Gln Asp Arg Ala Ile Val Leu Thr
435 440 445
Ser Asn Glu Ala Gly Asp Arg Ile Glu Pro Trp Asn Val Glu Leu Asp
450 455 460
Lys Glu Phe Gly Asn Pro Asp Leu Leu Ser Arg Leu Asn Ile Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Val Gln Arg Tyr Gly Asp Ser Lys Ala Ser Thr Asp Thr Leu Thr
485 490 495
Leu Ala Asp Ala Pro Glu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Ile Thr Val Gln
500 505 510
Pro Leu Leu Val Ala Met Cys Ile Lys Gln Ser Leu Asp Gly Leu Leu
515 520 525
Ala Leu Ser Asp Leu Arg Leu Arg Phe Asp Gln Tyr Pro Gly Tyr Ala
530 535 540
Asn Ala Leu Met Asn Ala Met Ala Met Tyr Ala Cys Leu Asp Arg Asp
545 550 555 560
Leu Met Arg Phe Leu Leu Arg Leu Glu Met Thr His Ala Ser Thr Val
565 570 575
Ser Glu Val Ala Glu Cys Trp Arg Asn Ser Arg Asn Ser Arg Asp Ala
580 585 590
Thr Gly Cys His Ile Val Pro Arg Gln Gly Leu Leu Ile Ile Val Ser
595 600 605
Gly Asp Val Glu Val Arg Arg Ile Phe Ala Gln Met Leu
610 615 620
<210> 3
<211> 2609
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aagcttccgc cgccaccatg ccactccaca tgattccaca ggtcgcacac gctatggtca 60
gggctgctgc tgccggacgc ctcactctct atacaagaac tcgcaccgag acaacaaact 120
tcgaccacgc tgagtacgtg acctgcggcc ggtacacaat ctgcgccttt tgtctgacca 180
cactggctcc ccacgccaac gtgaagacaa tccaggactc tcacgcttgt agcaggcagc 240
ctaacgaggc catcagaagc ctggtggagg tgtccgataa ggctcagacc gccctggtgg 300
gctcccgcac agtggactac cacgagctgg atgtgaaggc tggattcgtg gctccaaccg 360
ccgacgagac aatcgccccc tctaaggata tcgtggagct gccttttcgg acctgcgacc 420
tggacgatag ctccgccaca gcttgcgtgc gcaaccactg tcaggctgga cacgacggag 480
tgatccacct gccaatcctg agcggcgatt tcaagctgcc caacgagcac cccaccaagc 540
ctctggacga tacacaccct cacgacaagg tgctgacccg gtgcccaaag acaggactgc 600
tgctggtgca cgatacccac gctcacgcta cagctgtggt ggctaccgct gctacaaggg 660
ctatcctgat gcacgacctg ctgacctctg ctaacgccga cgatggccac caggctagaa 720
gcgcctgtta cggaccagcc ttcaacaacc tgacctttgc ttgccactcc acatgtgcct 780
ctgatatggc tcattttgac tgcggacaga ttgtgggact ggacctgcat gtggaaccaa 840
gcgatatggc aggggtcagc ctcaacatca atcgcaacat ttcaaactcc gcaagcacca 900
tttttctgga agacatccct ctcctctcat gctctgtgcg ctgcgagcct ggcaagggaa 960
gggagctgcc aaagttcaac atgagctgcc ccgccatcaa cgctatgggc cggtgtctga 1020
accccatgaa gtttatcgcc gagcactggg tgcccaacag cccttccaga aagcctagcc 1080
ggcagcactg gcgcaacgtg ctgaacggcc tggagttctc caacggccgg ggattcgatg 1140
tgctgtcttt tagccctgcc ggaatggctg tgctgcgcga catcctgaca gaggatagcg 1200
tgaactactg cttcgatgag tccaacacct gttctctgtt tacactgctg tacaccctgt 1260
gctgtgacgc tgctggagtg gagccaatgg acctggattc cagacagaca gatgccagcg 1320
ccaggatggt gtcctaccag gacagggcca tcgtgctgac ctctaacgag gctggcgaca 1380
ggatcgagcc ttggaacgtg gagctggata aggagtttgg aaacccagac ctgctgtcta 1440
ggctgaacat cagctacggc gtgcagagat acggagactc caaggcctct accgatacac 1500
tgaccctggc cgacgctcca gagagatcca agcccgccct gatcacagtg cagccactgc 1560
tggtggctat gtgcatcaag cagtccctgg atggcctgct ggccctgtct gatctgaggc 1620
tgagattcga ccagtacccc ggatacgcca acgctctgat gaacgccatg gctatgtacg 1680
cttgtctgga cagggatctg atgagatttc tgctgcggct ggagatgaca cacgccagca 1740
ccgtgtccga ggtggctgag tgctggcgga actctcgcaa cagcagggac gccaccggct 1800
gtcacatcgt gcccaggcag ggactcctca ttattgtctc aggggatgtg gaagtcaggc 1860
ggatttttgc tcagatgctg atggccagca agggcgagga gctgttcacc ggcgtggtgc 1920
ccatcctggt ggagctggac ggcgatgtga atggccacaa gttcagcgtg agcggcgagg 1980
gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc 2040
tgcctgtgcc ctggcccacc ctggtgacca ccctgagcta cggcgtgcag tgcttctcac 2100
gctaccccga tcacatgaag cagcacgact tcttcaagag cgccatgcct gagggctaca 2160
tccaggagcg caccatcttc ttcgaggatg acggcaacta caagtcgcgc gccgaggtga 2220
agttcgaggg cgataccctg gtgaatcgca tcgagctgac cggcaccgat ttcaaggagg 2280
atggcaacat cctgggcaat aagatggagt acaactacaa cgcccacaat gtgtacatca 2340
tgaccgacaa ggccaagaat ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg 2400
atggcagcgt gcagctggcc gaccactacc agcagaatac ccccatcggc gatggccctg 2460
tgctgctgcc cgataaccac tacctgtcca cccagagcgc cctgtccaag gaccccaacg 2520
agaagcgcga tcacatgatc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccggcatc acccacggca 2580
tggacgagct gtacaagtaa tgagaattc 2609
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gatccctcct ctccagtgac g 21
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Claims (1)

1.一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建GCRV-I-II-S10重组质粒；
(2)制备大肠杆菌DH5α菌蜕；
(3)制备GCRV二价核酸菌蜕疫苗：
将步骤(2)制备的大肠杆菌DH5α菌蜕重悬于含GCRV-I-II-S10重组质粒的PBS体系中，加入CaCl2溶液，摇床孵育，离心，收集沉淀，得到GCRV二价核酸菌蜕疫苗；
步骤(1)构建GCRV-I-II-S10重组质粒的具体步骤如下：
①分别根据GCRV-I及GCRV-II第10基因片段序列，直接合成可融合表达的基因序列，并引入HindIII/EcoRI双酶切位点后的全长基因序列如SEQ ID NO.1所示；
②利用HindIII和EcoRI对pcDNA3.1(+)载体进行双酶切，再将酶切产物用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化；
③将步骤①获得的基因序列和步骤②酶切纯化后的pcDNA3.1(+)载体利用T4DNA连接酶16℃过夜连接；
④将步骤③获得的连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有50μg·mL-1Amp+的LB平板上进行筛选，挑取白色菌落进行扩增，并小量提取质粒，进行双酶切鉴定，获得pcDNA-I-II-S10重组质粒；
步骤(2)制备大肠杆菌DH5α菌蜕的具体步骤如下：
①将裂解质粒pHH43转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有30mg/L氯霉素的固体LB平板进行筛选，挑取单个菌落小提质粒进行EcoRV和KpnI双酶切鉴定；
②经鉴定，将含有裂解质粒pHH43的大肠杆菌于28℃200rpm摇床培养，当OD600＝0.4-0.6时，迅速升高温度至42℃以启动E裂解蛋白的表达，前期每隔20min、后期1h测定OD值，280min后挑选OD值最小的克隆菌进行菌蜕收集；
步骤(3)制备GCRV二价核酸菌蜕疫苗的具体步骤如下：
将0.5mL浓度为4.6×108CFU/mL菌蜕重悬于含762μgGCRV-I-II-S10重组质粒的4.5mL的PBS体系中，加入终浓度25mMCaCl2溶液，25℃、150rpm摇床孵育15min，8000rpm离心10min收集沉淀，再用PBS将沉淀悬浮稀释至使用浓度，得到GCRV二价核酸菌蜕疫苗。
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