CN104159605A - 表达禽类病原体的抗原的重组禽疱疹病毒3型(mdv血清型2型)载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含并表达禽类病原体的抗原的重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体、包含突变型gC基因的重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体、包含重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体的组合物、包含重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体和一种或多种野生型病毒或重组载体的多价疫苗。本发明还提供了接种抗多种禽类病原体的疫苗的方法和产生重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体的方法。

Description

表达禽类病原体的抗原的重组禽疱疹病毒3型(MDV血清型2型)载体及其用途

相关申请的交叉参考

本申请要求2011年11月30日提交的美国临时申请61/564,877和2012年8月30日提交的美国临时申请61/694,957的优先权

发明领域

本发明涉及用于插入和表达外来基因以用作保护免受多种病原体体感染的安全免疫媒介物的重组病毒载体。其还涉及包含一种或多种重组病毒载体以用于保护免受多种病原体感染的多价组合物或疫苗。本发明涉及制备和使用重组病毒载体的方法。

发明背景

家禽接种被广泛用于保护家禽群体免受破坏性疾病，包括新城疫疾病(ND)、传染性法氏囊病(IBD)、马立克氏病(MD)、传染性支气管炎(IB)、传染性喉气管炎(ILT)和禽流感(AI)。ND由属于副粘病毒科的禽副粘病毒1型(APMV-1)(也称为ND病毒(NDV))引发。MD由也称为MD病毒血清型1(MDV1)的鸡疱疹病毒2型(疱疹病毒科)引发。IB由属于冠状病毒科的IB病毒(IBV)引发，ILT由也称为ILT病毒(ILTV)的鸡疱疹病毒1(疱疹病毒科)引发，AI由属于正粘病毒科的AI病毒(AIV)引发。

许多重组禽病毒载体已被提出用于接种鸡以抗这些禽类病原体。使用的病毒载体包含禽痘病毒，特别地鸡痘病毒(EP-A-0,517,292)、马立克氏病毒例如血清型2和3(HVT)(WO-A-87/04463)或可选择地ITLV、NDV和禽腺病毒。当这些重组禽病毒载体中的一些用于接种时，它们显示可见水平的保护作用。

已开发和许可了表达来自不同病原体(美国专利No.5,980,906,5,853,733,6,183,753,5,187,087)(包括IBDV、NDV、ILTV和AIV)的抗原的几种火鸡重组疱疹病毒(HVT，也称为吐绶鸡疱疹病毒1或MDV血清型3)载体。特别吸引人的是表达IBDV VP2保护基因的HVT载体，其已显示明确的优于经典IBD疫苗(Bublot等人J.Comp.Path.2007,第137卷,S81-S84)的有利方面。其它目标HVT载体是表达NDV(Morgan等人1992,Avian dis.36,858-70)或ILTV(Johnson等人,2010Avian Dis54,1251-1259)保护性基因的载体。一起使用若干基于HVT的重组疫苗的实际问题之一是它们的干扰。当将两种表达不同抗原的HVT重组体混合时针对至少一种疾病诱导更低的保护作用(Rudolf Heine2011；Issues of the Poultry Recombinant Viral VectorVaccines which May Cause an Effect on the Economic Benefits ofthose Vaccines；2011年8月14日-18日在Cancún,Mexico的第XVII届世界家畜兽医协会(WVPA)会议提供的论文；Slacum G,Hein R.和Lynch P.,2009,The compatibility of HVT recombinants with otherMarek’s disease vaccines,第58届西方家禽疾病会议(WesternPoultry Disease Conference),Sacramento,CA,USA,3月23-25日,p84)。

HVT和SB-1、鸡疱疹病毒3(MDV血清型2或MDV-2)疫苗株的组合已显示对MD保护作用的协同效果(Witter和Lee,1984,AvianPathology13,75-92)。为了说明干扰问题，有益地将SB-1病毒评价为可与HVT载体相容并且改善MD保护作用的表达保护性抗原的疫苗载体。

克隆SB-1基因组，在细菌人工染色体(BAC)中进行表征(Petherbridge,等人,J.Virol.Methods158,11-17,2009；Singh等人,Research in Veterinary Science89,140-145,2010)。最近获得了MDV2SB-1序列，并分析所述序列(Spatz和Schat,Virus Gene42,331-338,2011)。SB-1病毒的糖蛋白E缺失由Petherbridge,等人(J.Virol.Methods158,11-17,2009)进行了描述。然而，未报导使用SB-1作为表达外来保护性基因的病毒载体的研究。

已显示U_L13蛋白激酶和糖蛋白C(U_L44)基因单个地是MDV在鸡中水平传播所必需的(Jarosinski,等人,J.of Virology81,10575-10587,2007；Jarosinski,等人,J.of Virology84,7911-7916,2010)。

鉴于动物病原体例如NDV和IBDV对兽医公共健康和经济的潜在影响，因此需要有预防感染和保护动物的高效方法。存在对用于制备可缓解在两种基于HVT的载体疫苗之间观察到的干扰问题的组合的有效载体疫苗和适当的方法的解决方案的需要。

发明概述

本发明第一次显示了除了马立克氏病病毒以外还抗禽类病原体的重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)病毒载体。

本发明显示当将多价疫苗用于保护动物免受多种禽类病原体侵害时产生的令人惊讶的结果。

本发明涉及包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的一个或多个异源多核苷酸的重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)载体。本发明还涉及包含突变的糖蛋白C(gC)基因的重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)载体。

本发明提供了包含一种或多种重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)载体的组合物或疫苗，所述载体包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的一个或多个异源多核苷酸。本发明还提供了包含一种或多种包含突变糖蛋白C(gC)基因的禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体的疫苗组合物。

本发明提供了多价组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包含：i)包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸，或包含突变糖蛋白C(gC)基因的重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)载体；和ii)下述中至少一种：包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸的重组HVT载体(或MDV-3或吐绶鸡疱疹病毒-1)、或野生型HVT(MDV-3)、或包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸的重组MDV血清型1型载体(即，MDV-1，禽疱疹病毒-2型)或任何野生型MDV-1。

本发明涉及接种动物或诱导动物中免疫原性或保护性反应的方法，其包括本发明的组合物或载体的至少一次施用。

本发明还提供了用于将一个或多个分离的多核苷酸引入SB-1基因组的非必需区域的特定插入基因座。

附图概述

通过实例给出的并且无意将本发明限定于描述的特定实施方案的下列详细描述，可结合附图(通过引用并入本文)来理解，其中：

图1是显示被赋予每一个DNA和蛋白质序列的SEQ ID NO的表。

图2描述SB-1基因组组织的示意图。

图3描述表达NDV-F蛋白的重组vSB1-004病毒的免疫荧光染色。

图4描述引物结合位点的图示。

图5显示鉴定vSB1-004的PCR结果。

图6显示表达NDV-F蛋白的重组vSB1-006病毒的免疫荧光染色。

图7描述vSB1-006上的引物结合位点的图示。

图8显示vSB1-006的PCR结果。

图9描述表达NDV-F蛋白的重组SB1-007病毒的免疫荧光染色。

图10描述pSB144cds SVOptF供体质粒上的引物位置的示意图。

图11显示vSB1-007的PCR结果。

图12描述表达NDV-F蛋白的重组SB1-008病毒的免疫荧光染色。

图13描述引物结合位点的图示。

图14显示vSB1-008的PCR结果。

图15描述来自vSB1-009感染细胞的免疫沉淀样品的Western印迹分析。

图16描述vHVT114的免疫沉淀和Western印迹。

图17描述抗CA02和ZJ1NDV攻击的重组体的临床分析(脱落攻击病毒的鸡的百分比)。

图18描述了抗NDV攻击的重组体的临床分析(口咽脱落)。

图19显示序列比对和序列同一性百分比。

图20显示DNA和蛋白质序列。

发明详述

应指出在本公开内容中，特别地在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”、“含有”等可具有美国专利法中的含义；例如，可意指“包括”、“包含的”、“含有”等；术语例如“基本上由……组成”和“基本上由……组成”具有它们在美国专利法中的含义，例如，它们允许包括未明确引述的元素，但不包括在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新型特征的元素。

除非另外指出，否则根据常规惯用法使用技术术语。分子生物学中的一般术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V.由OxfordUniversity Press出版,1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑.),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive DeskReference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN1-56081-569-8)。

除非上下文明确地另有所指，否则单数术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所指物(the)”包括复数形式。类似地，除非明确地另有所指，否则单词“或”意欲包括“和”。单词“或”意指特定列表的任一个成员，并且还包括该列表的成员的任意组合。

术语“动物”在本文中用于包括所有哺乳动物、鸟类和鱼。本文中使用的动物可选自马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗、狼、狐狸、草原狼、豺)、猫科动物(例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其它大型猫，和其它猫科动物包括猎豹和山猫)、牛族动物(例如，牛)、猪类(例如，猪)、羊类(例如，绵羊、山羊、羊驼、野牛)、禽类(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、驼鸟、鸸鹋和鹤鸵)、灵长类动物(例如，狐猴、跗猴、猴子、长臂猿、人猿)、人和鱼。术语“动物”还包括处于所有发育阶段包括胚胎期和胎儿期中的个体动物。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，表示连续氨基酸残基的多聚体。

术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且意指RNA、DNA、cDNA或cRNA及其衍生物，例如包含修饰主链的那些核酸。应当理解，本发明提供了包含与本文中描述的序列互补的序列的多核苷酸。本发明中涉及的“多核苷酸”包括正向链(5’至3’)和反向互补链(3’至5’)。根据本发明的多核苷酸可以以不同的方式(例如通过化学合成，通过基因克隆等)来制备，并且可采取不同的形式(例如，线性的或分支的、单链或双链的，或其杂合体、引物、探针等)。

术语“基因组DNA”或“基因组”可互换使用，意指宿主生物的可遗传的遗传信息。基因组DNA包括细胞核的DNA(也称为染色体DNA)还包括质体(例如，叶绿体)以及其它细胞器(例如，线粒体)的DNA。本发明中涉及的基因组DNA或基因组还指病毒的RNA。RNA可以是正链或负链RNA。本发明中涉及的术语“基因组DNA”包括包含与本文中描述的序列互补的序列的基因组DNA。术语“基因组DNA”还指信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)和互补RNA(cRNA)。

术语“基因”被广泛用于指与生物功能相关的多核苷酸的任意区段。因此，基因或多核苷酸包括内含子和外显子(如在基因组序列中)或仅编码序列(如在cDNA中)，例如开放阅读框架(ORF)，其始于起始密码子(甲硫氨酸密码子)并终于终止信号(终止密码子)。基因和多核苷酸还可包括调节它们的表达例如转录起始、翻译和转录终止的区域。因此，还包括的是启动子和核糖体结合区域(一般地，这些调控元件位于编码序列或基因的起始密码子上游约60至250个核苷酸处；Doree SM等人；Pandher K等人；Chung J Y等人)、转录终止子(一般地，终止子位于编码序列或基因的终止密码子下游约50个核苷酸内；Ward C K等人)。基因或多核苷酸还指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质的核酸片段，其包括调控序列。

如本文中所用，术语“异源DNA”是指来源于不同生物，例如不同细胞类型或与受体不同的物种的DNA。该术语还指宿主DNA的相同基因组上的DNA或其片段，其中异源DNA被插入基因组内与其原始位置不同的区域中。

如本文中所用，术语“抗原”或“免疫原”意指诱导宿主动物的特异性免疫反应的物质。抗原可包括完整生物体、杀死的、减毒的或活的；生物体的亚单位或部分；包含具有免疫原性性质的插入物的重组载体；能够在呈递至宿主动物后诱导免疫反应的DNA碎片或片段；多肽、表位、半抗原或其任意组合。或者，免疫原或抗原可包括毒素或抗毒素。

如本文中所用，术语“免疫原性蛋白或肽”包括在一旦给宿主施用后，其能够引发针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫反应的意义上具有免疫活性的多肽。优选，蛋白质片段是这样的片段，该片段具有与整个蛋白质大体上相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包括至少一个表位或抗原决定簇或基本上由其组成或由其组成。如本文中所用，"免疫原性"蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。"免疫原性片段"意指包括一个或多个表位，从而引发上述免疫反应的蛋白质片段。这样的片段可使用本领域内已知的许多表位作图技术来鉴定。参见，例如，Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris,Ed.,1996)。例如，线性表位可通过例如在固体载体上同时合成大量肽(所述肽对应于该蛋白质分子的部分)，并且使肽与抗体反应(同时肽仍然连接于载体上)来测定。这样的技术在本领域中是已知的并且描述于例如美国专利No.4,708,871中。类似地，构象表位可通过测定氨基酸的空间构象(例如通过例如X射线晶体学和二维核磁共振)来容易地鉴定。参见，例如，Epitope Mapping Protocols(同上)。

术语“免疫原性蛋白或肽”还涉及序列的缺失、添加和置换，只要多肽能够产生本文中定义的免疫反应即可。术语"保守改变"意指用另一个生物学上相似的残基进行氨基酸残基的替换或核酸序列中核苷酸的替换使得编码的氨基酸残基不改变或为另一个生物学上相似的残基。在这一点上，特别优选的置换通常是性质保守的，即在氨基酸的家族内发生的那些置换。例如，氨基酸通常被分成4个家族：(1)酸性—天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性—赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性—丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性—甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守改变的实例包括一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸对另一个疏水残基的置换或一个极性残基对另一个极性残基的置换，例如精氨酸对赖氨酸的置换、谷氨酸对天冬氨酸或谷氨酰胺对天冬酰胺的置换等；或对生物活性不会具有主要影响的结构上相关的氨基酸对氨基酸的相似保守替换。因此，具有与参照序列大体上相同的氨基酸序列但具有大体上不影响蛋白质的免疫原性的少数氨基酸置换的蛋白质在参考多肽的定义之内。所有由这些修饰产生的多肽包括在本文中。术语"保守改变"还包括使用取代的氨基酸替代未取代的亲代氨基酸，只要针对被取代的多肽产生的抗体也与未被取代的多肽发生免疫反应。

术语"表位"是指特定B细胞和/或T细胞对其反应的抗原或半抗原上的部位。该术语还可与"抗原决定簇"或"抗原决定部位"互换使用。识别相同表位的抗体可在显示一种抗体阻断另一种抗体对靶抗原的结合的能力的简单免疫测定中被鉴定。

对组合物或疫苗的"免疫反应"是宿主中针对目标组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫反应的发展。通常地，"免疫反应"包括但不限于下列效应中的一个或多个：特异性针对目标组合物或疫苗中包含的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫反应，从而对新感染的抗性得到增强和/或疾病的临床严重性减轻。这样的保护作用可通过通常由被感染宿主显示的症状的减轻或不存在、被感染宿主的更快恢复时间和/或更低病毒滴度来显示。

术语“重组的”和“遗传修饰的”可互换使用，意指多核苷酸或蛋白质在其天然形式或结构上的任何修饰、改变或工程化，或多核苷酸或蛋白质在其天然环境或周围事物上的任何修饰、改变或工程化。多核苷酸或蛋白质的修饰、改变或工程化可包括但不限于一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失、整个基因的缺失、基因的密码子最优化、氨基酸的保守置换、一个或多个异源多核苷酸的插入。

术语“多价疫苗或组合物”、“组合或复合(combo)疫苗或组合物”和“多价疫苗或组合物”可互换用于指包含超过一种组合物或疫苗的组合物或疫苗。多价疫苗或组合物可包含2、3、4或更多种组合物或疫苗。多价疫苗或组合物可包含重组病毒载体、活性或减毒或杀死的野生型病毒或重组病毒载体与以活性或减毒的或杀死的形式存在的野生型病毒的混合物。

本发明的一个实施方案提供了包含突变的糖蛋白C(gC或UL44)基因的重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体。术语“突变的gC基因”是指被改变或工程化(所述改变或工程化导致在表达后产生无功能的gC蛋白)的禽疱疹病毒3型(MDV-2)的gC基因。gC基因的改变或工程化包括为功能性gC蛋白的表达所必需的gC基因区段的突变或缺失。术语“突变的gC基因”还包括其中gC蛋白不被表达的禽疱疹病毒3型(MDV-2)完整gC基因的缺失。本发明的另一个实施方案提供了重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)，其中天然(野生型)禽疱疹病毒3型(MDV-2)基因组的编码gC蛋白的糖蛋白C(gC)被缺失。术语“糖蛋白C(gC)基因”包括编码禽疱疹病毒3型(MDV-2)的糖蛋白C(gC)及其同源物、片段或变体的任何基因或多核苷酸。gC基因可编码与SEQ ID NO:35具有至少75％、80％、85％、90％、95％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性的gC蛋白或其变体。与SEQ ID NO:34具有至少75％、80％、85％、90％、95％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性的gC基因也包括在本发明中。

本发明的另一个实施方案提供了重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)病毒载体，其包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原或多肽的一个或多个异源多核苷酸。用于重组病毒载体的禽疱疹病毒3型(MDV-2)株可以是任意SB-1株，包括但不限于商业马立克氏病疫苗(SB-1疫苗)(Merial Select Inc.,Gainesville,GA30503,USA)、具有如由GenBank登录号HQ840738.1定义的基因组序列的SB-1株。用于重组病毒载体的禽疱疹病毒3型(MDV-2)株可以是任何其它禽疱疹病毒3型分离株，包括具有如由GenBank登录号AB049735.1定义的基因组序列的HPRS24株，或具有如由GenBank登录号NC_002577.1定义的基因组序列的HPRS24株。HPRS24与SB-1的基因组共有98.4％的序列同一性(Spatz和Schat,2011；Virus Gene42,331-338)。用于该重组病毒载体的禽疱疹病毒3型(MDV-2)株可以是由Witter(1987Avian Dis31,752-765)或由Witter等人(1987Avian Dis31,829-840)描述的301B/1分离株。禽疱疹病毒3型(MDV-2)株可以是任何禽疱疹病毒3型(MDV-2)株，所述株包含与如GenBank登录号HQ840738.1(SEQ ID NO:14)、AB049735.1或NC_002577.1中定义的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的基因组序列。

编码抗原或多肽的基因可以是编码如下蛋白的那些基因：新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)、新城疫病毒血细胞凝集素神经氨酸酶(NDV-HN)、马立克氏病病毒糖蛋白C(gC)、马立克氏病病毒糖蛋白B(gB)、马立克氏病病毒糖蛋白E(gE)、马立克氏病病毒糖蛋白I(gI)、马立克氏病病毒糖蛋白H(gH)或马立克氏病病毒糖蛋白L(gL)、IBDVVP2、IBDV VPX、IBDV VP3、IBDV VP4、ILTV糖蛋白B、ILTV糖蛋白I、ILTV UL32、ILTV糖蛋白D、ILTV糖蛋白E、ILTV糖蛋白C、流感血凝素(HA)、流感神经氨酸酶(NA)、来源于鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)(MG)或滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae)(MS)的保护性基因或其组合。抗原或多肽可以是来自家禽病原体的任何抗原，所述病原体选自禽脑脊髓炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽偏肺病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、鸡痘病毒、禽冠状病毒、禽轮状病毒、鸡贫血病毒、禽星状病毒、禽细小病毒、球虫病病毒(艾美球虫属的种(Eimeria sp.))、弯曲杆菌属的种(Campylobacter sp.)、沙门菌属的种(Salmonella sp.)、巴斯德菌属的种(Pasteurella sp.)、禽杆菌属的种(Avibacterium sp.)、鸡败血支原体、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、梭菌属的种(Clostridium sp)和大肠杆菌(E.coli)。

此外，上述抗原或多核苷酸的同源物意欲在本发明的范围内。如本文中所用，术语“同源物”包括直系同源物、类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或相似功能，但已在无关生物中分开进化的两个多核苷酸或多肽。术语“直系同源物”是指来自不同物种、但已通过物种形成从共同祖先基因进化而来的两个多核苷酸或多肽。通常地，直系同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物”是指通过基因组内的复制而相关的两个多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同功能，但这些功能可以相关。野生型多肽的类似物、直系同源物和旁系同源物可与野生型多肽在翻译后修饰、氨基酸序列或两者方面有差异。具体地，本发明的同源物通常显示与上述抗原的多核苷酸或多肽序列的全部或部分有至少80-85％、85-90％、90-95％或95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且可显示相似的功能。

在一个实施方案中，本发明提供了包含编码和表达NDV-F抗原或多肽的1个、2个或更多个异源多核苷酸的重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)病毒载体。在该实施方案的一个方面，NDV-F抗原或多肽与具有SEQ ID NO:2、9、50、52或54所示序列的多肽或这些多肽之一的保守变体、等位基因变体、同源物或包含所述多肽的至少8个或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段或这些多肽的组合具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在该实施方案的另一个方面，异源多核苷酸编码与具有SEQ ID NO:2、9、50、52或54所示序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的NDV-F抗原或多肽。在该实施方案的另一个方面，异源多核苷酸与具有SEQ ID NO:1、8、49、51或53所示序列的多核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

变体包括等位基因变体。术语"等位基因变体"是指包含导致蛋白质的氨基酸序列的变化并且存在于天然群体(例如，病毒的种或变种)内的多态性的多核苷酸或多肽。这样的天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽内1-5％的变异。等位基因变体可通过对许多不同物种的目标核酸序列进行测序来鉴定，这可通过使用杂交探针鉴定那些物种中相同基因的基因座来容易地进行。作为天然等位基因变异的结果并且不改变目标基因的功能活性的任何和所有这样的核酸变异和所得的氨基酸多态性或变异意欲包括在本发明的范围内。

关于序列的术语“同一性”可指例如具有相同核苷酸或氨基酸的位置数目除以两个序列中更短序列内的核苷酸或氨基酸数目，其中两个序列的比对可按照Wilbur和Lipman的算法(Wilbur和Lipman)来测定。两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性或者两个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包(Invitrogen,1600Faraday Ave.,Carlsbad,CA)来测定。当RNA序列被认为是与DNA序列相似的或与其具有一定程度的序列同一性或同源性时，该DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列包括在本发明的范围内并且可来源于DNA序列，其中DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。

本公开内容的多核苷酸包括作为遗传密码的结果(例如对于特定宿主的最优化密码子选择)是简并的序列。如本文中所用，“最优化的”是指经遗传工程改造以增加其在给定物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码NDV-F多肽的最优化的多核苷酸，NDV-F蛋白基因的DNA序列可被修饰来1)包含在特定物种中高度表达的基因所偏好的密码子；2)以与大体上在所述物种中发现的核苷酸碱基组成相似的核苷酸碱基组成包含A+T或G+C含量；3)形成所述物种的初始序列；或4)消除引起RNA的去稳定作用、不适当的多聚腺苷酸化、降解和终止或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。NDV F蛋白在所述物种中的增加表达可通过使用真核生物和原核生物中或特定物种中的密码子用法分布频率来实现。术语“偏好密码子用法的频率”是指由特定宿主细胞在核苷酸密码子的使用中显示的指定给定氨基酸的偏好性。存在20种天然氨基酸，其大部分由超过一个密码子指定。因此，所有简并核苷酸序列包括在本公开内容中，只要由所述核苷酸序列编码的NDV-F多肽的氨基酸序列在功能上不被改变即可。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于产生重组禽疱疹病毒-3型或SB-1病毒载体的方法，包括将1、2或更多个分离的多核苷酸在SB-1基因组的非必需区域中引入SB-1基因组。在另一个实施方案中，本发明提供了用于产生重组禽疱疹病毒-3型或SB-1病毒载体的方法包括改变、工程化gC基因或从SB-1基因组缺失gC基因。术语“非必需区域”是指不是病毒在组织培养物或在鸡中复制和繁殖所必需的病毒基因组区域。可将任何非必需区域或其部分从SB-1基因组缺失或可将任何外来序列插入其中，因缺失或插入而产生的重组禽疱疹病毒-3型或SB-1载体的活力和稳定性可用于确定被缺失区域或其部分是否确实是非必需的。在该实施方案的一个方面，非必需区域位于SB-1基因组的独特长(UL)和独特短(US)区域中(参见Spatz等人,VirusGenes42:331-338,2011)。SB-1的UL区域在长度上为约109,744bp至约109,932bp，并且可从SEQ ID NO:14(GenBank登录号HQ840738.1)的位置12,209延伸至121,952或其它SB1-基因组的等同位置，例如HPRS24基因组的11,826bp至121,757bp。SB-1的US区域在长度上为约12,109bp至约12,910bp，并且可从SEQ IDNO:14(GenBank登录号HQ840738.1)的位置143,514延伸至156,423或其它SB1-基因组的等同位置，例如从HPRS24基因组的142,681bp至154,789bp(Spatz等人,2011)。在该实施方案的一个方面，非必需区域位于SB-1的独特长(UL)区域中的UL55ORF与LORF5ORF之间。在另一个方面，将多核苷酸插入SB-1糖蛋白C基因(也称为UL44)内或替代其。gC基因座的使用可允许产生不能生产功能性gC蛋白和不能被水平传播的重组病毒。在另一个实施方案中，非必需区域可存在于UL7与UL8之间、UL21与UL22之间、UL40与UL41之间、UL50与UL51之间、UL54与LORF4之间、US10与SORF4之间的基因间区域中，或UL43、US2、US10或US6(编码gD)基因(参见GenBank登录号HQ840738.1)内。在另一个实施方案中，非必需区域可存在于SEQ ID NO:14的核苷酸位置118057-118306(基因间UL55-LORF5)、98595-100031(gC或UL44)、25983-26038(基因间UL7-UL8)、49865-50033(基因间UL21-UL22)、75880-75948(基因间UL35-UL36)、93928-93990(基因间UL40-UL41)、109777-109847(基因间UL50-UL51)、116466-116571(基因间UL54-LORF4)、146548-146697(基因间US10-SORF4)、97141-98385(UL43)、147857-148672(US2)、145853..146548(US10)或150322-151479(gD或US6)的区域中。

重组病毒的构建在本领域中是公知的，如例如美国专利No.4,769,330、4,722,848、4,603,112、5,174,993和5,756,103、6,719,979中描述的。具体地，可在两个步骤中构建重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)病毒载体。第一，将禽疱疹病毒-3型(MDV-2)或插入位点侧翼的SB-1基因组区域克隆入大肠杆菌(E.coli)质粒构建体；将独特的限制位点置于两个侧翼区域(插入质粒)之间以允许供体表达盒DNA的插入。单独地，待插入的cDNA或DNA基因序列位于对于禽疱疹病毒-3型(MDV-2)或SB-1载体和/或真核细胞特异性的启动子区域(基因起始区域)和终止子(或多聚腺苷酸化，poly-A)序列之后。随后将完整表达盒(启动子-外来基因-poly-A)插入所述插入质粒的独特限制位点，以构建“供体质粒”，所述供体质粒包含侧翼连接有插入基因座侧翼的禽疱疹病毒-3型(MDV-2)或SB-1“臂”的表达盒。随后通过在大肠杆菌细菌中生长来扩增所得的供体质粒构建体，提取质粒DNA。随后使用切割质粒骨架(在禽疱疹病毒-3型(MDV-2)或SB-1的臂和表达盒的外部)的限制性内切酶线性化该质粒。随后用亲代禽疱疹病毒-3型(MDV-2)或SB-1DNA和线性化供体质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞。随后通过多个有限稀释步骤克隆所得的病毒群体，在所述步骤中将表达外来基因的病毒与不表达的病毒群体分离。类似地，可将另一个外来盒插入另一个插入基因座以产生表达两个基因的双重禽疱疹病毒-3型(MDV-2)或SB-1重组体。可将第二盒插入相同基因座。与亲代禽疱疹病毒-3型(MDV-2)或SB-1MD疫苗类似地，在原代鸡胚成纤维细胞中产生禽疱疹病毒-3型(MDV-2)或SB-1重组体。在温育后，收获感染的细胞，将其与冷冻培养基混合，从而允许感染的细胞存活，通常将其冷冻于冷冻小瓶或玻璃安瓿中并于液氮中贮藏。

插入的cDNA基因序列被修饰的感染性病毒成功表达需要两个条件。首先，必须将插入引入病毒基因组的区域以使被修饰病毒保持活力。表达插入的cDNA的第二个条件是允许基因在病毒背景中表达的调控序列(例如：启动子、增强子、供体和受体剪接位点和内含子、Kozak翻译起始共有序列、多聚腺苷酸化信号、非翻译序列元件)的存在。

一般而言，有利地使用在真核细胞中具有功能的强启动子。启动子包括但不限于立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子、豚鼠CMV启动子、SV40启动子、假性狂犬病毒启动子例如糖蛋白X启动子、单纯疱疹病毒-1的启动子例如α4启动子、马立克氏病病毒(包括MDV-1、MDV-2和HVT)启动子例如驱动糖蛋白gC、gB、gE或gI表达的启动子、感染性喉气管炎病毒启动子例如糖蛋白gB、gE、gI、gD基因的启动子或其它疱疹病毒启动子。当插入基因座由SB-1基因(例如，gC、gD、US2或US10基因)组成时，可将外来基因插入不具有另外的启动子序列的载体，因为载体的被缺失基因的启动子将驱动被插入的外来基因转录。

在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物或疫苗，其包含本发明的一个或多个重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)病毒载体和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。用于重组禽疱疹病毒-3型病毒载体的禽疱疹病毒3型(MDV-2)株可以是任何SB-1株、HPSR24株或301B/1株。禽疱疹病毒-3(MDV-2)株还可包括Witter等人(Avian Diseases34,944-957；1990)、Witter(Avian Pathology21,601-614,1992)和Witter(Avian Pathology24,665-678,1995)中描述的那些株：280-5/1、281MI/1、287C/1、298B/1、301A/1、401/1、437A/1、437B/1、468A/1、468A/2、468B/1、471B/1或HN-1/1。

在另一个实施方案中，本发明提供了组合物或疫苗，其包含：i)包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸的重组禽疱疹病毒-3型载体(MDV-2)；和ii)下述中至少一种：包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸的重组HVT载体(或MDV-3或吐绶鸡疱疹病毒-1型)、或野生型MDV-3、或包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸的重组MDV-1载体(或禽疱疹病毒-2型)或野生型MDV-1。组合物或疫苗中还可包含药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。该组合物还可包含重组鸡痘病毒载体，其包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸；或野生型鸡痘病毒。

在该实施方案的一个方面，组合物或疫苗包含一种(或多种)重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)载体和一种或多种野生型HVT(MDV-3)。在另一个方面，组合物或疫苗包含一种(或多种)重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)载体和一种或多种重组HVT(MDV-3)。在另一个方面，组合物或疫苗包含一种或多种重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)载体和一种或多种野生型或遗传修饰型MDV-1。在另一个方面，组合物或疫苗包含一种或多种重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)载体和一种或多种重组MDV-1。在另一个方面，组合物或疫苗包含一种或多种重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)载体、一种或多种野生型HVT(MDV-3)以及一种或多种野生型MDV-1。在另一个方面，组合物或疫苗包含一种或多种重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)载体、一种或多种重组HVT(MDV-3)以及一种或多种野生型MDV-1。在另一个方面，组合物或疫苗包含一种或多种重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)载体、一种或多种野生型HVT(MDV-3)以及一种或多种重组MDV-1。在另一个方面，组合物或疫苗包含一种或多种重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2)载体、一种或多衙重组HVT(MDV-3)以及一种或多种重组MDV-1。野生型HVT(MDV-3)或野生型MDV-1可以是活的、减毒的或遗传修饰的。重组禽疱疹病毒-3型(MDV-2载体、重组HVT(MDV-3)载体和重组MDV-1载体中的异源多核苷酸可编码来自相同或不同禽类病原体的相同或不同抗原。

药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂对于本领域技术人员来说是公知的。例如，药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂可以是用于MD疫苗的马立克氏病疫苗稀释剂。可用于本发明的方法的其它药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂包括但不限于0.9％NaCl(例如，盐水)溶液或磷酸盐缓冲液、多聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是有利于载体(或从本发明的载体体外表达的蛋白质)的施用或有利于载体(或蛋白质)的转染或感染和/或改善其保存的任何化合物或化合物的组合。剂量和剂量体积在本文一般描述中进行了论述，其还可由本领域技术人员根据本公开内容结合本领域的知识来确定，而无需任何过度的实验。

任选地可添加其它化合物作为药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂，包括但不限于明矾；CpG寡核苷酸(ODN)，特别地ODN2006、2007、2059或2135(Pontarollo R.A.等人,Vet.Immunol.Immunopath,2002,84：43-59；Wernette C.M.等人,Vet.Immunol.Immunopath,2002,84：223-236；Mutwiri G.等人,Vet.Immunol.Immunopath,2003,91：89-103)；polyA-polyU，二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)(“Vaccine Design The Subunit and AdjuvantApproach”，由Michael F.Powell和Mark J.Newman编辑的,Pharmaceutical Biotechnology,6：p.03,p.157)；N,N-双-十八烷基-N’,N’-双(2-羟乙基)丙二胺(例如)(Ibid,p.148)；卡波姆、壳聚糖(参见例如美国专利系列No.5,980.912)。

根据本发明的药物组合物和疫苗可包含一种或多种佐剂或基本上由一种或多种佐剂组成。用于实施本发明的适当佐剂为(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、马来酸酐和烯基衍生物的聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)例如具有一个或多个非甲基化CpG单位的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等人,1996；WO98/16247)，(3)水包油乳剂，例如在由M.Powell,M.Newman,Plenum Press1995出版的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”的第147页上描述的SPT乳剂，和相同著作的第183页上描述的乳剂MF59；(4)包含季铵盐例如，DDA的阳离子脂质，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)在引用的和通过引用并入本申请中的任何文献中论述的其它佐剂或(9)其任意组合或混合物。

本发明的另一个方面涉及用于诱导动物中抗一种或多种抗原的免疫反应或者动物中抗一种或多种禽类病原体的保护性反应的方法，所述方法包括用本发明的疫苗或药物组合物接种动物至少一次。本发明的另一个方面涉及用于诱导动物中针对一种或多种抗原的免疫反应，或在初免-加强施用方案中诱导动物中抗一种或多种禽类病原体的保护性反应的方法，所述方法包括使用至少一种常用多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次初始施用和至少一次加强施用。初始施用中使用的免疫组合物或疫苗可以相同，可在性质上与用作加强剂的免疫组合物或疫苗不同。

禽类病原体可以是新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(即，IBDV或禽肾病病毒)、马立克氏病病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽脑脊髓炎病毒和其它微小核醣核酸病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽偏肺病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、鸡痘病毒、禽冠状病毒、禽轮状病毒、禽细小病毒、禽星状病毒和鸡贫血病毒球虫病(艾美球虫属的种)、弯曲杆菌属的种、沙门菌属的种、鸡败血支原体、滑液囊支原体、巴斯德菌属的种、禽杆菌属的种、大肠杆菌和梭菌属的种。

通常地，在1日龄时通过皮下或肌内途径进行疫苗的一次施用，或在17-19日龄胚胎中通过卵内途径进行疫苗的一次施用。第二次施用可在第一个10日龄内进行。动物优选在第一次施用时为至少17日胚胎或1日龄。

在0日龄鸡中可以例如皮下或肌内、皮内、经皮肤地使用多种施用途径。可在羊膜囊和/或胚胎中进行卵内接种。商购可得的卵内和SC施用装置可用于接种。

本发明现通过下列非限定性实施例来进一步描述。

实施例

使用由J.Sambrook等人(Molecular Cloning：A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,New York,1989)描述的标准分子生物学技术进行DNA插入物、质粒和重组病毒载体的构建。

实施例1 表达NDV-F的重组vSB1-004的构建

本工作的目的是构建重组SB-1病毒，其中将包含小鼠巨细胞病毒(mCMV)启动子、新城疫病病毒融合蛋白(NDV-F)和猿猴病毒40(SV40)poly A尾的表达盒插入SB-1病毒的US10与SORF4位点之间的基因间位点内(表1和图2)。

表1 vSB1-004的特征

SB-1*:Merial的商业化马立克氏病疫苗SB-1(Merial Select Inc.,Gainesville,GA30503,USA)。疫苗批号JV505。

化学合成(GenScript,Piscataway,NJ,USA)对应于基因型VIId序列(由SEQ ID NO:3编码的SEQ ID NO:2)的新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)。改变该合成基因的F蛋白切割位点以匹配迟发型(lentogenic)F切割位点序列，并且所得NDV-F基因序列与分别在登录号AY337464(对于DNA)和AAP97877.1(对于蛋白质)下录入在GenBank中的NDV-F序列具有99％的核苷酸序列同一性以及99％的氨基酸序列同一性。

供体质粒SB-1US10mFwt SbfI的构建

使用NotI从pUC57NDV-F VIId wt质粒(由GeneScript合成的)切取包含合成NDV-F基因的片段，并将其插入含有mCMV启动子和SV40polyA尾的pCD046质粒的相同位点。用EcoRI和SalI消化所得的质粒pCD046+NDV-F wt，利用Klenow将其平端化。凝胶提取3.3kb片段，将其连接于SmaI消化并且去磷酸化的(CIPed)包含侧翼臂的载体(SB1US10-SORF4SbfI pUC57)。使用Top10Oneshot试剂盒(Invitrogen,CA,USA)转化连接的材料。将细菌菌落生长在LBamp液体培养基中，使用Qiagens MiniSpin Prep试剂盒提取质粒，随后使用PstI消化筛选插入物的定向。正确的供体质粒被命名为SB-110mFwt SbfI。生长大规模培养物，使用Qiagens Maxi Prep试剂盒进行质粒提取。在鸡胚成纤维细胞(CEF’s)中使用Fugene转染剂和抗NDV鸡多克隆血清验证大制备物的瞬时表达。

重组体的产生

在进行标准同源重组法后，使用SB-1US10mFwt SbfI供体质粒和从SB-1病毒的疫苗株分离的病毒DNA进行二级CEF细胞的共电穿孔。使用1x10⁷个2°CEF(于300μl Opti-MEM中)进行共电穿孔，在2mm电穿孔杯中以950的电容于150伏下进行电击。将转染的细胞接种入96孔板，温育5-7天。随后用胰蛋白酶处理96孔板中生长的细胞，将其转移至2个“姊妹”96孔板，再温育5天。将一套96孔板用于使用抗NDV-F的鸡多克隆血清的IFA，以鉴定包含重组体亲代的阳性孔，将另一套96孔板用于从阳性孔回收感染的细胞。

首先通过96孔板复制和通过IFA选择包含最多IFA阳性噬斑和最少量IFA阴性噬斑的孔来进行重组病毒纯化法。随后收集符合这些标准的孔，将其在DMEM+2％FBS中调整至1ml。从1ml原液取出5-20μl(取决于可见噬斑的数目)，将其与1x10⁷个CEF在10mlDMEM+2％FBS中混合，等分至新的96孔板上以便每孔具有单个SB-1噬斑。在5天的温育后复制96孔板，通过IFA和PCR就重组SB-1的存在和亲代病毒的不存在测试包含噬斑的孔。再次地收获显示具有更多重组病毒的孔(通过与PCR条带结果相比较)，将其调整至1ml，等分至新的96孔板中。在纯化病毒感染的细胞3至5轮后，分离表达NDV-F蛋白的重组SB-1，通过IFA和PCR测试重组病毒的纯度以确认亲代病毒的不存在。随后将选择的重组病毒从96孔板(P0)的一个孔传代至2xT-25培养瓶(P1)，随后传代至2xT-75培养瓶(P2)、2xT-175培养瓶(P3)和最终2x850cm²转瓶(pre-MSV原液或P4)。将具有2ml等分的小瓶保藏在液氮中。以一式三份对CEF进行滴定，对于SB1-004获得1x10⁵pfu/ml的滴度。

表达分析

为了进行免疫荧光测定，将P3材料以1:100稀释于培养基中。将约50μl的被稀释病毒添加至10ml具有1x10⁷个CEF的DMEM+2％FBS中，随后将其等分至96孔板(100μl/孔)上。将板在37℃+5％CO₂下温育5天直至病毒斑可见。用95％冰冷丙酮固定板，进行3分钟，用PBS洗涤3次。将抗新城疫病毒的鸡抗血清(lot#C0139,CharlesRivers Laboratory)以1:1000添加，将板在37℃温育1小时。在1小时的温育后，用PBS洗涤板3次，以1:500添加FITC抗鸡(cat#F8888,Sigma)。再次地，将板在37℃温育1小时。在1小时温育后，用PBS漂洗细胞3次，使用异硫氰酸荧光素(FITC)滤光片，通过荧光显微镜进行显现。发现vSB1-004的所有检查的斑表达NDV-F蛋白(图3)。

通过PCR进行的重组体分析

通过苯酚/氯仿提取从病毒原液提取DNA，将DNA乙醇沉淀，重悬浮于20mM HEPES中。PCR引物被设计来特异性鉴定NDV-F VIId基因、启动子、SV40poly A和SB-1侧翼臂(参见图4)。特异于HVT(株FC126)、MDV血清型3型(MB080+MB081)的引物也包括在分析中以检查来自SB-1亲代病毒的重组病毒的纯度。使用200μg DNA模板以及指定的引物对来进行PCR。

采用所有引物对的PCR反应产生预期PCR产物和带型。PCR结果显示重组病毒vSB1-004具有期望的表达盒并且病毒原液不含可检测量的亲代SB-1病毒(图5)。

供体质粒SB-1US10mFwt SbfI(SEQ ID NO:41)的核苷酸序列显示于图20中。

基于PCR测试和免疫荧光分析，vSB1-004是在mCMV启动子的控制下表达NDV-F基因的重组SB-1。重组载体vSB1-004不含任何可检测的亲代SB-1病毒或潜在HVT重组体。

实施例2 表达NDV-F的重组vSB1-006的构建

本工作的目的是构建重组SB-1病毒，其中将包含SV40启动子、新城疫病病毒融合蛋白(NDV-F)和合成poly A尾的表达盒插入在SB-1病毒的UL55与LORF5位点之间(表2)。

表2 vSB1-006的特征

化学合成(GeneArt)对应于共有密码子最优化的基因型VIId序列(由SEQ ID NO:1编码的SEQ ID NO:2)的新城疫病病毒融合蛋白(NDV-F)。

供体质粒SB-1UL55SV Fopt syn tail SbfI的构建

用SbfI消化覆盖插入位点每一侧上的约1kb序列的合成SB-1UL55-LOrf5SbfI质粒(GenScript)，并将其去磷酸化。用SbfI消化合成的SV OptF syn tail pUC57质粒(Genscript)，凝胶提取2239个碱基对的片段，将其连接于SbfI消化的载体以产生新的SB1UL55SVFoptsyn tail SbfI供体质粒。

重组体产生、表达分析和PCR测试

在进行标准同源重组法后，使用供体质粒SB1UL55SV Fopt syntail SbfI和从SB-1病毒的疫苗株分离的病毒DNA进行二级CEF细胞的共电穿孔。进行基本上如实施例1中针对vSB1-004描述的操作，以产生重组体，进行噬斑纯化，通过免疫荧光和PCR表征重组体。

供体质粒SB1UL55SVFopt syn tail SbfI的核苷酸序列(SEQ IDNO:42)示于图20。

重组体的产生和表达分析

将SB-1病毒的基因组DNA与SB-1UL55SV Fopt syn tail SbfI供体质粒共穿孔来使用同源重组技术产生重组SB-1。通过在多轮噬斑纯化中进行免疫荧光阳性孔选择和PCR筛选来将重组病毒与亲代SB-1病毒分离。将命名为vSB1-006的表达NDV-F蛋白的噬斑纯化重组SB-1病毒从组织培养瓶放大至2x850cm²转瓶。在转瓶中在感染后约72小时后，收获感染的CEF。将等分试样于包含10％FBS和10％DMSO的液氮中冷冻。以一式三份对CEF进行滴定，对于SB1-006获得8x10⁵pfu/ml的滴度。

使用鸡抗-血清(批号C0139,Charles Rivers Laboratories)，随后使用FITC标记的抗-鸡IgG(cat#02-24-06,KPL)进行免疫荧光。发现所有检查的vSB1-006噬斑表达NDV-F蛋白(图6)。

vSB1-006的PCR分析

使用特异于SB-1侧翼臂、密码子最优化的NDV-F VIId、SV40启动子的引物对以及特异于HVT的引物对通过PCR确认重组病毒的纯度(参见图7)。对于所有引物对，PCR反应产生预期的PCR产物和带型。此外，在vSB1-006中没有亲代SB-1病毒的迹象(图8)。

基于PCR测试和免疫荧光分析，确认了vSB1-006为在SV40启动子控制下表达密码子最优化的NDV-F基因的重组SB-1。重组载体vSB1-006不含任何可检测量的亲代SB-1病毒和潜在HVT污染物。

实施例3 表达NDV-F的重组体vSB1-007的构建

本工作的目的是构建重组SB-1病毒，其中将包含SV40启动子、对应于NDV的基因型VIId的F序列的NDV-F基因的表达盒用于替代SB-1病毒糖蛋白C(gC或UL44)的编码序列(表3)。

表3 vSB1-007的特征

化学合成(GeneArt)对应于共有密码子最优化的基因型VIId序列(由SEQ ID NO:1编码的SEQ ID NO:2)的新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)。

供体质粒pSB144cds SVOptF的构建

通过基因合成(GenScript)产生包含侧翼臂的合成pSB144cds质粒。用SbfI消化pSB144cds，将其去磷酸化。用SbfI消化称为SV-OptF-syn no polyA tail-pUC57的另一个质粒，凝胶提取包含SV40启动子和NDV-F基因的2.1kb片段，将其连接入经SbfI消化的载体，并使用Top10Oneshot试剂盒(Invitrogen)转化。将细菌菌落生长在LB-氨苄青霉素培养基(100ug/ml)中，使用Qiagen Mini Spin Prep试剂盒提取质粒，通过EcoRI和NcoI消化筛选其插入。所得供体质粒称为pSB144cds SVOptF。

合成质粒pSB144cds(SEQ ID NO:36，图20中)还可在无需进一步修饰(不插入NDV-F表达盒)下用作供体质粒，以产生不存在糖蛋白(gC)基因的重组SB-1。

重组体的产生和表达分析

在进行标准同源重组法后，使用供体质粒pSB144cds SVOptF和从SB-1病毒的疫苗株分离的病毒DNA进行二级CEF细胞的共电穿孔。进行基本上如实施例1中针对vSB1-004所描述的方法，以产生重组体、噬斑纯化重组体和通过免疫荧光表征。将称为vSB1-007的表达NDV-F蛋白的噬斑纯化的重组SB-1病毒从T-25组织培养瓶放大至10xT-150cm²培养瓶。收获感染的CEF细胞，将等分试样于包含10％FBS和10％DMSO的液氮中冷冻。以一式三份对CEF进行滴定，对于SB1-007获得7.2x10⁴pfu/ml的滴度。

使用鸡抗-血清(批号C0139,Charles Rivers Laboratories)，随后使用FITC标记的抗-鸡IgG(cat#02-24-06,KPL)进行免疫荧光。发现所有检查的vSB1-007噬斑表达NDV-F蛋白(图9)。

vSB1-007的PCR分析

利用QIA DNeasy Blood&Tissue试剂盒(Qiagen)从SB1-007提取从P.1至P.6的病毒RNA。设计PCR引物来特异性鉴定NDV F(密码子最优化的)、SV40启动子和UL44的侧翼臂的存在(参见图10)。使用200ng的DNA模板和指定的引物对进行PCR扩增。

类似地，使用合成质粒pSB144cds和从SB-1病毒的疫苗株分离的病毒DNA进行的标准同源重组法将产生其中gC基因的编码区被缺失的重组SB-1。两个PCR引物(SB143.F和SB145.R，表4)对于缺失gC的重组SB-1将产生103个核苷酸的PCR产物，对于亲代SB-1病毒将产生1540个核苷酸。

使用特异于通过SB-1侧翼臂、密码子最优化的NDV-F VIId、SV40启动子的引物对以及特异于HVT的引物对(MB080+MB081)通过PCR确认重组病毒的纯度。对于所有引物对，PCR反应产生预期的PCR产物和带型。此外，在vSB1-007中没有亲代SB-1病毒的迹象(表4-5和图11)。

表4 PCR引物

引物	SEQ ID NO:	序列(5’至3’)
			SB143.F	27	GCTCTCGGAGACGCGGCTCGC
SB145.R	28	GCTCTTGTAACATCGCGGACG
			SV40promoter.F	29	AGCTTGGCTGTGGAATGT
Opt F	24	ACTGACAACACCCTACATGGC
			HVTUS10.FP	30	CCGGCAACATACATAATGTG
HVTUS10.RP	31	GGCACTATCCACAGTACG

表5 预期的扩增子尺寸

基于PCR测试和免疫荧光分析，确认了vSB1-007为在SV40启动子控制下表达密码子最优化的NDV-F基因的重组SB-1。NDV-F表达盒成功地用于替代SB1的gC基因，显示了gC对于SB-1病毒的体外增殖不是必需的。重组载体vSB1-007不含任何可检测量的亲代SB-1病毒或HVT。

供体质粒pSB144cds SVOptF的核苷酸序列(SEQ ID NO:43)示于图20。

实施例4 表达NDV-F的重组vSB1-008的构建

本工作的目的是构建重组SB-1病毒，其中将包含SV40启动子、对应于NDV的CA02株的F序列的NDV-F基因和合成polyA尾的表达盒插入在SB-1病毒的UL55与LORF5位点之间(表6)。

表6 vSB1-008的特征

化学合成(GeneArt)对应于密码子最优化的基因型V(CA02株)序列(由SEQ ID NO:8编码的SEQ ID NO:9)的NDV-F。改变该合成基因的F蛋白切割位点以匹配迟发型F切割位点序列，所得NDV-F基因序列与保藏在GenBank(ABS84266)中的NDV-F序列具有99％的氨基酸序列同一性。

供体质粒SB1UL55SV CaFopt syn tail SbfI的构建

用SbfI消化包含插入位点每一侧的约1kb序列的合成SB-1UL55-LOrf5SbfI质粒(GenScript)，并将其去磷酸化。用SbfI消化合成的SV OptF syn tail pUC57质粒(Genscript)，凝胶提取包含合成尾的2239个碱基对的片段，将其连接于SbfI消化的载体以产生新的SB1UL55SVFopt syn tail SbfI供体质粒。随后用NotI消化该供体质粒，CIP化并凝胶提取5196个碱基对的片段。用NotI消化合成的NDV-FCAO2CSmut0813005pVR101供体质粒(GeneArt)，凝胶提取1677个碱基对片段，将其连接于NotI消化并CIP化的UL55载体内，从而产生供体质粒SB1UL55SV CaFopt syn tail SbfI。

重组体的产生和表达分析

在进行标准同源重组法后，使用供体质粒SB-1UL55SV CaFoptsyn tail SbfI和从SB-1病毒的疫苗株分离的病毒DNA进行二级CEF细胞的共电穿孔。进行基本上如实施例1中所描述的方法，以产生重组体，并且通过免疫荧光和PCR表征。

通过在多轮噬斑纯化中进行免疫荧光阳性孔选择和PCR筛选来将重组病毒与亲代SB-1病毒分离。将称为vSB1-008的表达NDV-F蛋白的噬斑纯化重组SB-1病毒从组织培养瓶放大至2x850cm²转瓶。在转瓶中在感染后约72小时后，收获感染的CEF。将等分试样于包含10％FBS和10％DMSO的液氮中冷冻。

使用鸡抗-血清(Charles Rivers Laboratories))，随后使用FITC标记的抗-鸡IgG(KPL)进行免疫荧光(图12)。

vSB1-008的PCR分析

使用特异于SB-1侧翼臂、密码子最优化的NDV-F VIId、SV40启动子的引物对(参见图13)以及特异于HVT、MDV血清型3型的引物对(MB080+MB081)通过PCR确认重组病毒的纯度。所有引物对的PCR反应产生预期的PCR产物和带型。此外，在vSB1-008中没有亲代SB-病毒的迹象(图14)。

供体质粒SB-1UL55CaFopt syn tail SbfI的核苷酸序列(SEQ IDNO:44)示于图20中。

基于PCR测试和免疫荧光分析，确认了vSB1-008为在SV40启动子控制下表达密码子最优化的NDV-F基因的重组SB-1。重组载体vSB1-008不含任何可检测量的亲代SB-1病毒或HVT。

实施例5 表达NDV-F的重组vSB1-009和vSB1-010的构建

本研究的目的是构建重组SB-1病毒载体vSB1-009，其中包含SV40启动子和新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)基因的表达盒插入来替代编码SB-1的UL44编码(gC)序列，和构建其中另外的包含豚鼠CMV启动子和NDV-F基因的表达盒被插入SB1-009载体骨架的SORF-US2基因座中的重组SB-1病毒载体vSB1-010。

实施例5.1 vSB1-009的构建

构建包含SB1病毒的UL44侧翼连接臂、SV40启动子和NDV F密码子最优化基因序列(SEQ ID NO:8，编码SEQ ID NO:9)的供体质粒pSB144cds SV FCAopt(表7)。

表7 vSB1-009的特征

重组病毒的产生

在进行标准同源重组法后，使用供体质粒pSB144cds SV FCAopt和从SB-1病毒感染的CEF分离的病毒DNA进行二级CEF细胞的共电穿孔。进行基本上如实施例1中所描述的方法以产生重组体，进行噬斑纯化，通过免疫荧光表征重组体。

在2轮噬斑纯化后，分离纯的重组病毒(vSB1-009)，通过IFA和PCR测试vSB1-009的纯度以确认适当的插入以及无残留亲代病毒。

PCR分析

利用QIA DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)从vSB1-009原种前种子病毒(pre-MSV)原液提取病毒DNA。PCR引物被设计来鉴定最优化的NDV F、NDV F野生型、SV40启动子、mCMV启动子、SB-1病毒的UL44侧翼连接臂和HVT病毒的存在。使用约200ng DNA模板和引物对进行PCR扩增。

利用不同引物的PCR扩增确认vSB1-009具有预期的扩增模式和扩增子。

表达分析

对vSB1-009pre-MSV原液进行间接免疫荧光测定(IFA)以检查NDV F基因和SB-1病毒抗原的表达。在室温用冰冷的95％丙酮固定利用vSB1-009接种的CEF，进行3分钟，风干10分钟。在利用PBS洗涤板后，添加两种一抗，即以1:500稀释的鸡抗-新城疫病毒血清(Charles Rivers Laboratories cat#10100641,lot#C0117A)和以1:3000稀释的抗SB-1病毒的Y5.9单克隆抗体(Merial Select,Gainesville,GA)，在37℃温育板45分钟。在利用PBS洗涤3次后，添加两种二抗，即以1:500稀释的山羊抗-鸡IgG-荧光素(KPL)和以1:250稀释的驴抗-小鼠IgG-Alexa Fluor568(Molecular Probe)。将板在37℃温育45分钟，随后利用PBS洗涤3次。使用Nikon Eclipse Ti倒置显微镜的异硫氰酸荧光素(FITC)和四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)-滤光片，利用荧光显微镜筛选孔的IFA阳性噬斑。类似地，使用抗-MDV血清(Charles River Laboratories)(1/300的稀释度)和抗-NDV F单克隆抗体(1/300的稀释度)作为一抗通过双重IFA来检查vSB1-009与NDVF Mab的反应性。将山羊抗-鸡IgG-荧光素(KPL)(1:500的稀释度)和驴抗-小鼠IgG-Alexa Fluor568(Molecular Probe)(1:300的稀释度)用作二抗。使用Nikon Eclipse Ti倒置显微镜的FITC-和TRITC-滤光片利用荧光显微镜观察孔以鉴定IFA阳性噬斑。

IFA结果表明vSB1-009在病毒感染的CEF中表达NDV F蛋白。利用双重IFA计数超过500个vSB1-009噬斑的NDV F蛋白表达以及SB-1病毒特异性蛋白表达。NDV F蛋白的表达完全匹配每一个病毒噬斑中的SB-1病毒抗原表达(表8)。

表8 vSB1-009的双重IFA

通过双重IFA确认NDV F Mab反应性。检查超过200个vSB1-009噬斑的NDV F Mab反应性以及抗-MDV血清反应性。与NDV F Mab的反应性完全匹配每一个病毒噬斑中的抗-MDV血清反应性(表9)。

表9 vSB1-009与抗-NDV F Mab的反应性

Southern印迹分析

从vSB1-009pre-MSV原液感染的CEF提取总的基因组DNA。分别用EcoRI、NcoI和KpnI限制性核酸内切酶在37℃消化vSB1-009、SB-1病毒(阴性对照)、pSB144cds SV FCA opt供体质粒的基因组DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离限制性片段，将其转移至带正电荷的Nylon膜上。转移后，用0.4M NaOH处理膜，随后用2XSSC-HCl缓冲液中和。随后风干膜，进行UV交联。

按照North2South Chemiluminescent Hybridization andDetection试剂盒(Thermo Scientific cat#89880)制造商的说明书，将膜预杂交1hr，随后在55℃与探针杂交过夜。为了进行杂交，使用两个探针；1)作为NDV F盒探针的pSB144cds SV FCA opt的SbfI片段，2)作为重组臂探针的pUC57SB144臂的SmaI-EcoRI片段(GenScript)。在过夜杂交后，进行数次严格性洗涤，直至膜被置于添加有链霉抗生物素蛋白-HRP的封闭缓冲液中。在漂洗掉膜的任何未结合的链霉抗生物素蛋白-HRP后，添加鲁米诺和过氧化物的底物溶液。随后将膜暴露于X射线胶片，使胶片显影。

Southern印迹结果是如基于Vector NTI图谱分析所预期的。NDVF盒(SV40启动子、NDV-F CA02密码子最优化的基因)替代SB-1病毒的UL44编码序列。

基因组分析

通过重组臂的区域以及插入的基因盒的核苷酸序列测定来进行vSB1-009pre-MSV原液的基因组DNA分析。引物被设计来用于扩增包括重组臂的完整NDV-F基因盒。

包含重组臂、SV40启动子和NDV F密码子最优化的基因的vSB1-009序列(供体质粒pSB144cds SV FCAopt)经确认是正确的，如SEQ ID NO:37(图20)中显示的。

Western印迹分析

利用vSB1-009pre-MSV以MOI～0.1感染CEF单层。在5天的温育后，沉淀CEF，利用PBS洗涤CEF，随后按照制造商的方案，利用Pierce Classic IP试剂(Thermo Scientific cat#26146)的IP裂解/洗涤缓冲液进行裂解。预先澄清裂解物，用100ul抗-NDV F单克隆抗体温育裂解物以制备免疫复合物。通过蛋白A/G Plus琼脂糖捕获免疫复合物，在通过洗涤步骤除去未结合的免疫复合物之后，将50ul的样品缓冲液用于在非还原条件下洗脱。包括未感染的CEF作为对照。将20ul的洗脱样品在10％Bis-Tris凝胶中通过电泳进行分离。在电泳后，将凝胶中分离的蛋白质转移至PVDF膜。按照制造商的方案，利用鸡抗-NDV血清(Charles River Laboratories Laboratoriescat#10100641,lot#C0117A)和山羊抗-鸡IgG-过氧化物酶缀合物(KPLcat#14-24-06)，将Protein Detection TMB Western Blot试剂盒(KPLcat#54-11-50)用于检测PVDF膜上的NDV抗原。

通过两步免疫检测来确认vSB1-009的NDV F蛋白表达。首先，使用抗-NDV F单克隆抗体001C3通过免疫沉淀捕获来自vSB1-009感染的CEF裂解物的表达NDVF蛋白。随后，将使用抗-NDV多克隆血清的Western印迹分析(Charles River Laboratories cat#10100641,lot#C0117A)用于检测捕获的样品中的NDV F蛋白(NDV F蛋白-单克隆抗体复合物)(图15)。利用抗-NDV血清检测vSB1-007pre-MSV裂解物中的55kDa蛋白，其对应于NDV F1融合蛋白的预期尺寸(图15)。

实施例5.2 双重构建体vSB1-010的构建

供体质粒SB1US2gpVIIdwtsyn的构建

使用质粒HVT SOrf3-US2gpVar-Ewt Syn，通过SbfI消化除去gpCMV、Varient E、Syn尾。将该片段连接入SB1US2供体质粒。通过NotI切出Varient E基因，并利用NDV-F VIId wt替代。使用NotI消化从pUC57NDV-F VIId wt质粒(由GeneScript合成的)切出合成NDV-F VIId野生型基因(SEQ ID NO:3，编码SEQ ID NO:2)。使用Top10Oneshot试剂盒(cat#C404002,Invitrogen)转化连接的材料。将细菌菌落生长在LBamp液体培养基中，使用Qiagens MiniSpinPrep试剂盒提取质粒，使用NcoI+SalI消化筛选插入物的定向。正确的供体质粒称为pSB1US2gpVIIdwt Syn。表10.1显示表达盒周围对于构建体独特的特征，包括各自的序列。生长大规模培养物，使用Qiagens Maxi Prep试剂盒进行质粒提取。使用Fugene转染剂和抗NDV-F鸡多克隆血清在鸡胚成纤维细胞(CEF’s)中验证大制备物的瞬时表达。

重组体的产生

在进行标准同源重组法后，使用pSB1US2gpVIIdWt Syn供体质粒和从vSB1-009(vSB1-009是表达NDV的CA02F基因的重组病毒)分离的病毒DNA进行次级CEF细胞的共电穿孔。基本上按照实施例1中所描述的方法产生重组体，进行噬斑纯化，通过免疫荧光表征重组体。

在5轮噬斑纯化后，分离纯的重组病毒(vSB1-010)，通过IFA和PCR测试vSB1-010的纯度以验证适当的插入以及无残留亲代病毒。

表10.1 vSB1-010的特征

名称	亲代病毒	启动子	Poly-A	基因座
					vSB1-010	vSB1-009	豚鼠CMV	合成的	SORF4-US2

插入区的测序确认了vSB1-010包含豚鼠CMV启动子和NDV-FVIId wt基因的正确序列，如供体质粒SB1US2gpVIIdwtsyn的序列(SEQ ID NO:57)中显示的。

通过PCR进行的重组体的分析

通过苯酚/氯仿提取从病毒原液提取DNA，将DNA乙醇沉淀，重悬浮于20mM HEPES中。PCR引物被设计来特异性鉴定NDV-F VIIdwt基因、启动子、polyA以及来自SB1亲代病毒的重组病毒的纯度。使用200μg DNA模板以及表1中显示的指定引物对来进行PCR。PCR循环条件如下(除非另有所指)：94℃–2分钟；30个循环(94℃–30秒，55℃–30秒，68℃–3分钟)；68℃–5分钟。

使用对于SB1侧翼连接臂、gpCMV启动子、NDV-F VIId wt基因和syn尾特异性的引物对通过PCR来确认重组病毒的纯度。特异于HVT、MDV血清型3(MB080+MB081)的引物也包括在分析中。PCR结果显示重组病毒vSB1-010具有期望的表达盒并且病毒原液不含可检测量的亲代SB1-009病毒。

表达两个NDV-F蛋白的重组vSB1-010病毒的免疫荧光染色

为了进行免疫荧光测试，将P3材料以1:100稀释于介质中。将约50μl的稀释病毒添加至10ml的含有1x10⁷个CEF的DMEM+2％FBS中，随后等分至96孔板(100μl/孔)中。将板在37℃+5％CO₂温育5天，直至病毒噬斑可见。用95％冰冷丙酮固定板，进行3分钟，用PBS洗涤3次。以1:1000添加抗新城疫病毒的鸡抗-血清(lot#C0139,Charles Rivers Laboratory)，将板在37℃温育1小时。在1小时的温育后，用PBS洗涤板3次，以1:500添加FITC抗-鸡(cat#F8888,Sigma)。再次地将板在37℃温育1小时。在1小时的温育后，用PBS漂洗细胞3次，使用异硫氰酸荧光素(FITC)滤光片，利用荧光显微镜进行显现。

当使用抗NDV的CA02和VIId F蛋白的多克隆血清时，免疫荧光染色结果表明vSB1-010显示了极强的NDV-F蛋白表达。

结论

基于PCR测试和免疫荧光分析，vSB1-010是其中在gpCMV启动子控制下的NDV的VIId-F基因被成功地插入vSB1-009(其已表达NDV的CA02-F基因)的重组SB-1。因此，vSB1-010具有NDV基因型的VIId和CA02F基因，并且其不含任何可检测的亲代vSB1-009。

实施例6 表达NDV-F的重组vHVT载体的构建

用于vHVT114的供体质粒pHM103+Fopt的制备

用NotI消化包含HVT FC126的基因间I臂、SV40启动子和SV40poly A的质粒pHM103(Merial Limited)，将其去磷酸化，凝胶提取5.6kb片段。也对化学合成的密码子最优化基因型VIId NDV-F基因(SEQ ID NO:1，编码SEQ ID NO:2)的侧翼连接有NotI的1.7kb片段进行NotI消化，凝胶提取1.7kb片段。将5.6和1.7kb片段连接以产生pHM103+Fopt(表10.2)。

表10.2 vHVT114的特征

重组HVT病毒载体的产生

在进行标准同源重组法后，使用供体质粒pHM103+Fopt和从HVT株FC126分离的病毒DNA进行二级CEF细胞的共电穿孔(Igarashi T.等人,J.Gen.Virol.70,1789-1804,1989)。进行基本上如实施例1中所描述的方法，以产生重组体、噬斑纯化重组体和通过免疫荧光表征重组体。

在5轮噬斑纯化后，分离称为vHVT114的重组病毒，通过IFA和PCR测试纯度以确认NDV-F表达和亲代病毒的不存在。

重组vHVT114的PCR分析

通过苯酚/氯仿提取从vHVT114提取DNA，将DNA乙醇沉淀，并重悬浮于20mM HEPES中。PCR引物被设计来特异性鉴定密码子最优化的NDV-F、SV40启动子的存在，以及来自FC126CL2亲代病毒的重组病毒的纯度。

PCR结果显示凝胶电泳后PCR产物的尺寸很好地对应于预期的尺寸和带型。

重组vHVT114中的插入区域的序列分析

vHVT114基因组DNA区域的分析通过PCR扩增来进行。将总共10个引物用于扩增整个盒，以及超出用于供体质粒的侧翼BamHI-I臂。凝胶纯化4.727kb PCR产生，使用测序引物对完整片段进行测序。序列结果确认了vHVT114包含正确的SV40启动子、密码子最优化的NDV-F和与SEQ ID NO:38中的针对供体质粒pHM103+Fopt描述的序列完全匹配的SV40polyA序列(参见图20)。

重组vHVT114的Western印迹分析

利用vHVT114Pre-MSV以～0.1MOI感染2x10⁶个鸡成纤维细胞。在于37℃温育2天后，在除去培养基和利用PBS漂洗后使用细胞刮棒收集感染的以及未感染的细胞。利用1ml PBS收集细胞，随后离心。按照Pierce Classic IP试剂盒(Thermo Scientific)裂解细胞沉淀。将100μl的抗-NDV-F单克隆抗体001C3(Merial Limited)用于形成免疫复合物。将抗体/裂解物样品添加至蛋白A/G Plus琼脂糖以捕获免疫复合物。将免疫复合物洗涤3次以除去未结合的材料，随后在非还原条件下使用样品缓冲液洗脱将其洗脱在50ul体积中。在煮沸5分钟后，将10μl的样品加载至10％丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)中。将PAGE凝胶在MOPS缓冲液(Invitrogen)中在200伏下电泳1小时。随后将凝胶转移至PVDF膜。

通过使用试剂和遵照制造商的指导将蛋白质检测器Western印迹试剂盒TMB系统(KPL,cat#54-11-50)用于印迹PVDF膜。在于室温封闭膜1小时后，随后在1X洗涤缓冲液中漂洗膜3次，每次5分钟，随后将其浸渍于含有针对NDV病毒产生的鸡血清(Lot#C0139,Charles River Laboratories)的1:1000稀释物的封闭缓冲液中。在于洗涤缓冲液中洗涤3次后，在室温以1:2000的稀释度用过氧化物酶标记的山羊抗-鸡IgG(KPL,cat#14-24-06)温育膜1小时。随后在1X洗涤缓冲液中洗涤膜3次，每次5分钟。将5ml的TMB膜过氧化物酶底物添加至膜，轻轻摇动约1分钟。通过将膜置于水中来终止显影反应。

免疫沉淀和Western印迹技术在vHVT114样品中检测到对应于NDV-F蛋白F1组分预期尺寸的约55kD的蛋白(图16)。

其它HVT重组体的产生和表征

其它HVT重组体例如vHVT039、vHVT110、vHVT111、vHVT112、vHVT113和vHVT116的产生和表征基本上以与上文中针对vHVT114所描述的方式相同的方式来进行。重组HVT病毒载体的产生和表征也描述于在_______提交的美国专利申请系列No.US_________(Merial limited)(将其通过引用整体并入本文)中。表11显示表达盒周围对于每一个构建体是独特的特征，包括各自的序列。

表11 单一HVT重组体的表达盒的特征

实施例7 表达NDV-F和IBDV VP2的双重HVT载体以及表达IBDV VP2变体的双重HVT载体的构建

用于vHVT306的供体质粒pHVT US2SV-Fopt-synPA的制备

构建供体质粒pHVT US2SV-Fopt-synPA，其包含SV40启动子、合成NDV F密码子最优化的VII基因、侧翼连接有HVT FC126的SORF3和US2臂序列的合成polyA尾。

重组病毒的产生

在进行标准同源重组法之后，使用供体质粒粒pHVT US2SV-Fopt-synPA和从vHVT13(表达IBDV VP2基因的HVT载体，Merial Limited)分离的病毒DNA进行次级CEF细胞的共电穿孔。进行基本上如实施例1中描述的方法以产生重组体，噬斑纯化重组体，通过免疫荧光表征重组体。

在2轮噬斑纯化后，分离纯的重组病毒(vHVT306)，测试vHVT306的纯度，通过IFA和PCR确认纯度。

PCR分析

利用QIA DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen cat#69506)从vHVT306原种前种子病毒(pre-MSV)原液提取病毒DNA。PCR引物被设计来鉴定最优化的NDV F、NDV F野生型、SV40启动子、mCMV启动子、US2HVT病毒和SB-1病毒的侧翼连接臂的存在。

利用不同引物的PCR扩增确认了vHVT306具有预期的扩增模式和扩增子。

基因组分析

对vHVT306pre-MSV原液的基因组DNA进行测序以验证重组臂区域的序列以及插入的基因盒。

引物被设计来扩增包括用于供体质粒的重组臂的整个插入基因盒。通过PCR扩增，随后通过核苷酸序列测定来进行vHVT306基因组DNA的分析。

包含重组臂、SV40启动子和NDV F密码子最优化的基因的vHVT306(供体质粒pHVT US2SV-Fopt-synPA)被确认为正确的，如SEQ ID NO:45中显示的(图20)。

Western印迹分析

通过两步免疫检测来确认vHVT306的NDV F蛋白表达。首先，使用抗-NDV F单克隆抗体001C3(Merial Limited)通过免疫沉淀捕获来自vHVT306感染的CEF的表达NDV F蛋白。随后，将使用抗-NDV多克隆血清(Charles River Laboratories)的Western印迹分析用于检测捕获样品(NDV F蛋白-单克隆抗体复合物)中的NDV F蛋白。利用抗-NDV血清检测vHVT306pre-MSV裂解物中的55kDa蛋白，其对应于NDV F1融合蛋白的预期尺寸。

其它双重HVT重组体的产生和表征

其它双重HVT重组体例如vHVT301、vHVT302、vHVT303、vHVT304、vHVT202和vHVT307的产生和表征基本上以与上文中针对vHVT306所描述的方式相同的方式来进行。重组HVT病毒载体的产生和表征也描述于在_______提交的美国专利申请系列No.US_________(Merial limited)(将其通过引用整体并入本文)中。表12显示表达盒周围对于每一个构建体独特的特征，包括各自的序列。

表12 双重HVT重组体的表达盒的特征

实施例8 不存在gC-缺失的SB-1突变体的水平传播

本研究的目的是将由亲代SB-1诱导的病毒血症和水平传播的水平与其中gC基因被缺失的重组SB-1病毒诱导的病毒血症和水平传播的水平相比较(参见实施例3)。

随机构建两组(A和B)(每组30只)1日龄无特异病原体(Specificpathogen free,SPF)白色来亨鸡。利用2000PFU的亲代SB-1通过皮下途径(颈背；0.2ml/鸡)接种(D0)组A的20只鸡，利用2000PFU的SB-1gC-缺失型突变体接种组B的20只鸡。在与被接种的鸡相同的隔离室中将10只鸡保持未接种(组Ac和Bc)。在2周龄(D14)时，在无痛致死后取出组A和B的20只接种鸡的脾以及2片羽毛。在4周龄(D28)时，也取出组Ac和Bc的10只接触鸡的脾以进行病毒分离。从已添加至淋巴细胞分离培养基并离心的碾磨脾的血沉棕黄层收集白细胞。对于每一只鸡，将10⁶个白细胞添加至包含在前一天制备的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)的汇合单层的60mm组织培养皿。感染后5天，计数每一个皿上的MDV噬斑，计算阳性鸡的数目和噬斑的平均数。对于羽毛滤泡样品，将羽毛髓添加至SPGA培养基，超声处理10秒，随后置于已从其除去培养基的原代CEF的汇合单层上。在添加具有1％小牛血清的新鲜培养基之前，使所述髓悬浮物被吸收45分钟。

来自D14的接种鸡的脾和羽毛滤泡的病毒分离结果报告于表13中。来自两个组的所有鸡对于来自脾的病毒分离阳性的，对于组A和B分别具有142.5和176.0的相似噬斑平均数目。可从组A中的所有鸡和组B中90％的鸡的羽毛滤泡分离到病毒。

来自D28的未接种的接触鸡的脾的病毒分离结果报告于表14中。组Ac的10只鸡中有7只对于来自脾的病毒分离是阳性的，表明亲代SB-1水平传播至接触鸡。不能从组Bc的鸡分离出病毒，表明gC-缺失型突变体不传播至接触鸡。

表13 D14来自组A和B的接种鸡的脾血沉棕黄层(BC)和羽毛滤泡(FF)的病毒分离结果

*来自脾血沉棕黄层(BC)的平均噬斑计数

**来自羽毛滤泡的阳性样品

***TNTC太多以至不能计数

表14 D28来自组Ac和Bc的未接种的接触鸡的脾血沉棕黄层(BC)的病毒分离结果

*平均噬斑计数

本研究显示在接种后D14测量的gC-缺失型SB-1突变体的病毒血症水平与亲代SB-1B病毒的相似，这表明gC缺失型不削弱SB-1病毒在接种的鸡中复制的能力。对于gC-缺失型突变体，羽毛滤泡中的病毒的水平略微更低，因为20只鸡中有2只不具有可检测量的病毒。可在与利用亲代SB-1接种的鸡接触的10只鸡内的7只鸡中检测到水平传播。相反地，从与利用gC-缺失型突变体接种的鸡接触的鸡中未检测到病毒，表明gC缺失严重削弱水平传播。

实施例9 由单独的或与HVT-IBD载体疫苗组合的SB-1重组体在1日龄SPF鸡中诱导的ND功效

本研究的目的是评价表达NDV F基因的vSB1-004重组体抗在4周龄于利用单独的或与HVT-IBD载体疫苗组合的vSB1-004接种的SPF鸡中进行的ND攻击的功效。

随机构成3组(1、2和3)(每组15只)1日龄无特异病原体(SPF)白色来亨鸡。使用两种载体化疫苗：实施例1中描述的vSB1-004，和vHVT13，即表达传染性法氏囊病病毒Faragher52/70株(Merial批准的HVT+IBD疫苗的活性成份，US5,980,906和EP0 719864)的VP2基因的火鸡疱疹病毒(HVT)载体。组1、2和3的鸡分别只接受vHVT13(对照组)、只接受vSB1-004和vHVT13与vSB1-004的混合物(参见表6)。利用2000PFU的vSB1-004和/或vHVT13(D0)通过皮下途径(颈背)接种所有鸡。接种后27天(D27)，利用基因型V型墨西哥基玛华坎(Mex V)速发型(velogenic)NDV株攻击每一组的鸡。使用稀释于0.2ml生理无菌水中的10⁵卵感染剂量50(EID50)通过肌内(IM)途径进行攻击。在攻击后14天的过程中每天观察鸡的临床体征和死亡率。在攻击后5、7和9天从每组10只鸡中也获取口咽拭子样品。在RNA提取后，通过使用由Wise等人(2004；Development of aReal-Time Reverse-Transcription PCR for Detection of NewcastleDisease Virus RNA in Clinical Samples；J.Clin.Microbiol.42,328-338)描述的，基于M基因的定量逆转录酶实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)，评价这些拭子中的病毒RNA载量。脱落水平表达为log10卵感染剂量50％(EID50)/mL。也在攻击时(D27)获取血液样品。利用抗-IBD ELISA(Synbiotics ELISA ProFlok PLUS IBD)测试血清以评价vSBA-004对vHVT13-诱导的IBDV抗体的影响。

保护作用和血清学的结果概述于表15中。所有对照鸡在ND攻击后5天内死亡。vSB1-004重组病毒单独地或当与vHVT13组合时，诱导完全临床保护作用。脱落可检测量的攻击ND病毒的鸡的数目在两个接种的组中非常低。组1和3中的平均IBD ELISA滴度几乎完全相同，表明不存在vSB1-004对vHVT13-诱导的IBDV抗体的干扰。

表15 表达NDV F基因的SB-1重组体在于D27攻击的SPF0日龄(15/组)中诱导的ND保护作用的结果

*标准差

**脱落的鸡的数目/总数(平均log10EID50当量/mL)

***攻击后天数

****组1的所有鸡在D5之前死亡，从而在该组中未评价脱落

利用基因V基玛华坎速发型NDV的ND攻击模型非常严重。在这些严重的攻击条件中，vSB1-004诱导完全临床保护作用和针对攻击病毒的通过口咽途径脱落的保护作用。值得注意地，插入在vSB1-004中的F基因来自基因型VIId NDV株，此处使用的攻击株为基因型V。从而显示了插入SB-1载体的基因型VIId F基因交叉保护鸡免受基因型V攻击。vHVT13的添加不削弱由vSB1-004诱导的ND保护作用，并且vSB1-004不干扰vHVT13-诱导的IBD抗体滴度，从而证实了SB-1载体与HVT载体的相容性。

实施例10 由SB-1重组体在1日龄SPF鸡中诱导的ND早期功效

本研究的目的是评价表达NDV F基因的vSB1-004重组体抗利用两种不同NDV攻击株在SPF鸡中进行的早期(D14)ND攻击的功效。

随机构建两组(1和2)(每组20只)1日龄无特异病原体(SPF)白色来亨鸡。利用2000PFU的vSB1-004通过皮下途径(颈背)接种组2的鸡。不接种组1的鸡，将其保持作为对照鸡。在2周龄时，用基因型V墨西哥基玛华坎(Mex V)速发型NDV株攻击每一个组的一半鸡，另一半鸡用基因型VIId Malaysia04-1(Mal VIId)速发型NDV株攻击。使用于0.2ml生理无菌水中稀释的10⁵卵感染剂量50(EID50)通过肌内(IM)途径进行攻击。在攻击后14天的过程中每天观察鸡的临床体征和死亡率。

保护作用的结果概述于表16中。所有对照鸡在ND攻击后5天内死亡。vSB1-004重组病毒在这些严重的早期攻击条件下诱导部分抗死亡(在利用Mal VIId和Mex V攻击后，分别地70％和40％的保护作用)和抗发病(在利用Mal VIId和Mex V攻击后，分别地50％和30％的保护作用)的保护作用。

表16 由表达NDV F基因的SB-1重组体在SPF0日龄鸡中诱导的早期ND保护作用的结果

选择用于评价vSB1-004重组体的功效的早期ND攻击模型，因为表达NDV F基因的马立克氏病病毒载体在该模型中通常不提供完全保护作用。事实上，它们的免疫力的发生相较于活NDV疫苗被延迟(Morgan等人(1993)Avian Dis37,1032-40；Heckert等人(1996)AvianDis40,770-777)。因而其是评价和比较疫苗候选者的良好模型。在这些严重的早期攻击条件下，vSB1-004重组体诱导部分保护作用，所述保护作用对Malaysian基因型VIId攻击的抵抗仅比对墨西哥基玛华坎基因型V攻击的抵抗略强，显示了针对2种分别在美洲和欧亚大陆/非洲循环的最流行基因型的广泛保护作用。

实施例11 单独的或与HVT-IBD载体疫苗组合的SB-1重组体在1日龄具有母体抗体的肉鸡中诱导的ND功效

本研究的目的是评价表达NDV F基因的vSB1-004重组体抗在4周龄于利用vSB1-004(单独的或与HVT-IBD载体疫苗组合的)接种的肉鸡中进行的两种ND攻击的功效。

随机构成6组(1a、1b、2a、2b、3a、3b)(每组12只)1日龄肉鸡(Hubbard JA957品系)。使用两个载体化疫苗：实施例1中描述的vSB1-004和vHVT13(表达传染性法氏囊病病毒Faragher52/70株的VP2基因的火鸡疱疹病毒(HVT)载体)(Merial批准的HVT+IBD疫苗的活性成份)。仅用vHVT13(对照组)接种组1的鸡(1a&1b)；仅用vSB1-004接种组2的那些鸡，以及用vHVT13与vSB1-004的混合物接种组3的那些鸡(参见表17)。利用2000PFU的vSB1-004和/或vHVT13(D0)通过皮下途径(颈背部)接种所有鸡。在接种后28天(D28)，利用基因型VIId Malaysia04-1(Mal VIId)速发型NDV株接种每一个亚组“a”的所有鸡，以及利用基因型V墨西哥基玛华坎(Mex V)速发型NDV株接种每一个亚组“b”的所有鸡。使用稀释于0.2ml生理无菌水中的10⁵卵感染剂量50(EID50)通过肌内(IM)途径进行攻击。在攻击后的14天过程中每天观察鸡的临床体征和死亡率。也在攻击时(D28)从每一个组的5只鸡获取血液样品。利用抗-IBDELISA(Synbiotics ELISA ProFlok PLUS IBD)测试血清以评价vSB1-004在肉鸡中对vHVT13-诱导的IBDV抗体的影响。

保护作用和血清学的结果概述于表17中。所有对照鸡在ND攻击后5天内死亡。vSB1-004重组病毒当与或不与vHVT13组合时，诱导显著的临床保护水平。脱落可检测量的病毒的鸡数目在两个接种组中极低。组2的平均IBD抗体滴度在D27仍然很高(3log10)，这表明高水平的母体来源IBD抗体；然而，vHVT13诱导明确的IBD抗体反应，该抗体反应在与vSB1-004混合时不受影响。

表17 由表达NDV F基因的SB-1重组体在于D28攻击的0日龄肉鸡(除组1b为11只外，每组12只)中诱导的ND保护作用结果

*标准差

本研究的结果显示在利用NDV MDA攻击的肉鸡中由vSB1-004显著水平诱导的保护作用。vHVT13的添加对vSB1-004-诱导的ND保护作用无负影响，表明不存在vHVT13干扰。此外，vSB1-004不干扰vHVT13-诱导的IBD抗体，从而确认了在肉鸡中这两种载体之间的相容性。

实施例12 vSB1-004不存在对由HVT-IBD载体疫苗在1日龄SPF鸡中诱导的IBD早期功效的干扰

本研究的目的是评价vSB1-004重组体在SPF鸡早期(D14)IBD攻击模型中对由HVT-IBD载体疫苗(vHVT13)诱导的IBD功效的潜在干扰。

随机构成3组(1至3)(每组10只)1日龄无特异病原体(SPF)白色来亨鸡。利用2000PFU的vSB1-004(对照组)通过皮下途径(颈背部)接种组1的鸡。利用2000PFU的vHVT13接种组2的鸡，以及利用2000PFU的vHVT13和2000PFU的vSB1-004接种组3的鸡。在2周龄时，利用50μL(包含2.5log10EID50的IBDV经典株Faragher52/70)通过眼部途径攻击每一个组的所有鸡。在攻击后10天的过程中每天观察鸡的临床体征和死亡率。攻击后10天将所有鸡无痛致死，记录体重和法氏腔上囊重量以评价粘液囊重量/体重比。还检查它们的粘液囊的IBD典型组织学损伤。基于如表18中显示的损伤严重度给每一个粘液囊赋予分数。计算每一个组中受累鸡(无保护的)的数目。如果鸡死亡和/或显示显著的疾病体征和/或中等或严重的法氏腔上囊损伤(即，组织学分数≥3)，则其被认为是受累的。

表18 法氏腔上囊的组织学损伤的评分等级

保护作用的结果概述于表19中。攻击后，所有对照鸡开始发病并且1只死亡，而所有接种的鸡保持健康。组2和3的粘液囊体重比相似，并且显著高于组1的粘液囊体重比。来自组1的所有8只在攻击后存活的鸡具有4或5的粘液囊损伤分数。

表19 由单独的或与表达NDV F基因的vSB1-004重组体组合的vHVT13在SPF0日龄鸡中诱导的早期(D14)IBD保护作用的结果

*这些组中的1只鸡在攻击前死亡。

选择用于评价vSB1-004重组体对vHVT13-诱导的IBD保护作用不存在干扰的早期IBD攻击模型，因为其非常灵敏地检测对vHVT13保护作用的干扰。利用vSB1-004+vHVT13获得的结果显示优良水平的IBD保护作用(89％)，这表明即使在早期IBD攻击中测量时vSB1-004与vHVT13之间亦存在相容性。

实施例13 vHVT114、vHVT116、vSB1-007、vSB1-008(单独地或与vHVT13一起地)和vHVT304在21日龄于SPF鸡中抗利用NDVZJ1(基因型VIId)和California/02(基因型V)的攻击的效力

本研究的目的是估量2个表达NDV F基因的单一HVT重组构建体(vHVT114和vHVT116)、2个表达NDV F基因的SB1重组构建体(vSB1-007和vSB1-008)以及双重HVT重组体(vHVT304)抵御在21日龄于SPF鸡中进行的利用NDV ZJ1(基因型VIId)和California/02(基因型V)的新城疫疾病攻击的效力。

这5个疫苗候选者的特征描述于下面表20中。

表20 用于攻击研究的载体的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT114	HVT	SV40	Opt-VIId	SV40	IG1
vHVT116	HVT	SV40	Opt-V	SV40	IG1
						vSB1-007	SB-1	SV40	Opt-VIId	gC	UL44(gC)
vSB1-008	SB-1	SV40	Opt-V	SV40	IG1
						vHVT304	vHVT13*	SV40	Opt-VIId	Synth	IG2

*vHVT13是基于表达IBDV VP2基因的HVT载体的被批准Vaxxitek HVT-IBD疫苗的活性成分(参见US5,980,906和EP0 719864)。

在D0天，158只1日龄SPF鸡随机分配至6个组(每组24只已接种的鸡)和1个组(12只鸡，未接种的对照)中。如下表21中所描述的，在D0，利用0.2mL包含1000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。随后将鸡分成两个亚组，在D21天通过肌内途径利用5log10EID50的NDV ZJ1(基因型VIId)或California/02(基因型V)速发型株攻击每一个亚组。

表21 效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。对于分离株观察到的技术问题使组2(vHVT114：从24降至14)和组3(vHVT116：从24降至20)中的鸡的数目减少。攻击后记录NDV临床体征。在攻击(D21)前从采自组2和7的鸡的血液样品收集血清以用于使用每一个攻击株作为抗原，通过HI测试进行的NDV血清学测试。

抗死亡和发病的保护作用的百分比报告于上表中。在未接种的被攻击对照组G1中观察到完全易感性，从而确认了两种攻击的高度严重性。所有疫苗诱导了高水平(≥75％)的抗两种攻击的保护作用。vHVT114和vSB1-008诱导了抗两种攻击的完全临床保护作用。

攻击后通过实时RT-PCR评价攻击后2和4天采集的口腔和泄殖腔拭子中的脱落。针对两个攻击的阳性(Ct<40)鸡的百分比示于图17A和17B中。注意，利用CA/02分离株攻击的对照组中的所有6只鸡在4dpch死亡，在利用ZJ1攻击的对照组中仅1只鸡(6只中的1只)在4dpch仍然存活。在所有对照鸡中检测到脱落。在所有接种的组中观察到对于脱落是阳性的鸡的百分比的减少。

总之，本研究的结果显示在3周龄时由测试的马立克氏病载体疫苗诱导的极好的ND保护作用。

实施例14 vHVT114、vSB1-007、vSB1-009、vHVT306和vHVT307疫苗在28日龄于SPF鸡中抗利用NDV Texas GB株的攻击的效力

本研究的目的是估量表达NDV F和/或IBDV VP2基因的不同马立克氏病载体疫苗的组合抵御在28日龄于SPF鸡中进行的新城疫疾病攻击(Texas GB株，基因型II)的效力。

本研究中测试的5个重组疫苗候选者的特征描述于下面表22中。

表22 用于攻击研究的载体的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT114	HVT	SV40	Opt-VIId	SV40	IG1
vSB1-007	SB-1	SV40	Opt-VIId	gC	gC
						vSB1-009	SB-1	SV40	Opt-V(CA02)	gC	gC
vHVT306	vHVT13	SV40	Opt-VIId	Synth	SORF3-US2
						vHVT307	vHVT13	SV40	Opt-V(CA02)	Synth	SORF3-US2

在一些组中，还将马立克氏病病毒血清型1型(CVI988(或Rispens)株；禽疱疹病毒2)和血清型2型(SB-1株；禽疱疹病毒3型)疫苗与重组病毒组合使用。

在D0天，将135只1日龄SPF鸡随机分配至9个组(每组15只鸡)中。在D0，利用包含2000pfu靶剂量的0.2mL重组疫苗(vSB1-007、vSB1-009、vHVT13、vHVT306、vHVT307、vHVT114)和1000pfu靶剂量的亲代马立克氏病疫苗株(SB-1和CVI988)通过皮下注射在颈部注射鸡。研究的设计示于下面表23中。在D28通过肌内途径利用4.0log10EID50速发型ND Texas GB(基因型II)株攻击鸡。

表23 效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。记录攻击后NDV临床体征。

抗死亡和发病的保护作用的百分比报告于上表中。在未接种的被攻击对照组G1中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。在所有接种的组中观察到极佳水平的保护作用。来自G3、G6、G7和G9的鸡获得完全保护。本研究显示vSB1-ND候选者可与vHVT13和CVI988共施用，并且仍然提供极好的ND保护作用。类似地，双重HVT-IBD+ND与SB-1相容，并且vHVT-ND(vHVT114)与vHVT13和SB-1相容。

总之，本研究的结果显示不存在对由测试的马立克氏病亲代和载体疫苗诱导的ND保护作用的干扰。

实施例15 与vHVT13组合的vHVT114、vHVT307、vSB1-007和vSB1-009在D28SPF鸡中抗NDV基玛华坎株(基因型V)的攻击的效力

本研究的目的是估量表达NDV F基因的1个HVT重组构建体(vHVT114)和2个SB1重组构建体(vSB1-007和vSB1-009)与vHVT-IBD(vHVT13)的组合，以及表达NDV F和IBDV VP2的双重HVT vHVT307抵御在28日龄SPF鸡中进行的新城疫疾病攻击(基玛华坎,基因型V)的效力。

这4个疫苗候选者的特征描述于下面表24中。

表24 攻击研究中使用的载体的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT114	HVT	SV40	Opt-VIId	SV40	IG1
vSB1-007	SB-1	SV40	Opt-VIId	gC	gC
						vSB1-009	SB-1	SV40	Opt-V(CA02)	gC	gC
vHVT307	vHVT13	SV40	Opt-V(CA02)	Synth	SORF3-US2

在D0，将45只1日龄SPF鸡随机分配至4个组(每组10只鸡)和1个组(5只鸡，未接种的对照组)中。如下表25中所描述的，在D0天利用0.2mL包含2000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。在D28通过肌内途径利用5.0log10EID50速发型基玛华坎(基因型V)株攻击鸡。

表25 研究设计和ND效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。记录攻击后NDV临床体征。在攻击后5和7天在接种的组中获取口咽拭子来通过实时RT-PCR评估病毒载量。

抗死亡和发病的保护作用的百分比报告于上表中。在未接种的被攻击对照组G1中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。在所有4个接种的组中观察到极好的保护作用，vHVT114+vHVT13诱导了完全临床保护作用。

阳性鸡的百分比和平均脱落滴度(表达为log10EID50当量/mL)示于图18A和18B中。令人惊讶地，在G2中未检测到脱落，表明在测试的条件下，即使与vHVT13共施用，vHVT114仍然诱导完全(针对临床体征和脱落而言)ND保护作用。在另一个接种的组中检测到的脱落水平低，仅在感染后(pi)5天在G3中检测到略微更高的水平。

总之，本实施例进一步举例说明了由双重HVT-IBD+ND重组体或SB1-ND或HVT-ND与HVT-IBD(vHVT13)重组病毒的组合诱导的极佳ND保护作用。与第二HVT疫苗(常规HVT疫苗或重组HVT疫苗)干扰对插入第一重组HVT疫苗的外源基因的免疫力的本领域一般观念相反，本发明显示令人惊讶的结果：与vHVT13组合的vHVT114提供极佳的抗NDV保护作用并且未观察到干扰作用。

实施例16 通过SC或卵内途径施用的与vHVT13组合的vHVT306、vSB1-008在D28于SPF鸡中抗NDV基玛华坎株(基因型V)的攻击的效力

本研究的目的是估量通过卵内或通过皮下途径施用的与vHVT-IBD(vHVT13)组合的表达NDV F和IBDV VP2基因的vHVT306双重HVT和表达NDV F基因的vSB1-008SB1重组体抵御在28日龄于SPF鸡中进行的新城疫疾病攻击(基玛华坎,基因型V)的效力。

组的设计示于表26中。将60个SPF鸡胚蛋(在约18天又18小时的温育后；D-3)用于卵内施用(对于G1、G2和G3，每组20个)。使用来自AviTech LLC的IntelliLab系统装置(Salisbury,MD,USA)通过卵内途径施用50微升包含2000PFU的疫苗。在卵内施用后记录孵化率和存活率。在D0天，将20只1日龄SPF鸡随机分配入2组(G4和G5)(每组10只鸡)。如下表26中所描述的，在D0，利用0.2mL包含2000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下(SC)注射在颈部注射鸡。在D28利用5.0log10EID50速发型基玛华坎(基因型V)株通过肌内途径攻击每组10只鸡。

表26 研究设计和ND效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。记录攻击后NDV临床体征。在攻击后5和7天在接种的组中采集口咽拭子以通过实时RT-PCR来评估病毒载量。

记录组G1和G2的鸡的完全孵化率和活力直至D28(攻击日)。G3中的孵化率为85％，并且在该组中另有一只鸡在孵化后死亡。该组的更低的孵化率可能归因于鸡胚孵育箱问题。G1、G2和G3中的雄性和雌性的体重在D1和D28相似。

抗死亡和发病的保护作用的百分比报告于表26中。在未接种的被攻击对照组G1中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。在所有4个接种的组中观察到很好的保护作用，通过两个途径施用的vHVT306均诱导了完全临床保护作用。

阳性鸡的百分比和平均脱落滴度(表达为log10EID50当量/mL)示于表27中。在利用vHVT306接种的G2和G4中未观察到可检测的脱落或仅有极低脱落。在利用vSB1-008+vHVT13接种的组中检测到的脱落水平尤其地在感染后(pi)5天更高。

表27 在NDV攻击后D5和D7评估的抗脱落的保护作用的结果(具有可检测的脱落的鸡的百分比和以log10表示的平均病毒载量)

*以log10EID50当量表达的平均定量实时PCR值；阈值被设置在2.7log10。

总之，本实施例显示由通过卵内或通过SC途径施用的vHVT306双重HVT重组诱导的极佳ND保护作用。vSB1-008+vHVT13的性能尤其在卵内施用后略微更低，但其可能至少部分归因于鸡胚孵育箱问题。事实上，与6000PFU的vHVT13结合的1000或4000PFU另一SB1-ND重组体(vSB1-009)的卵内安全性测试在孵化率上和早期存活率方面未显示与仅接受6000PFU的vHVT13的组有任何差异。

实施例17 与vHVT13组合的vHVT304、vHVT306、vSB1-007和vSB1-008在D42在商业肉鸡中抗NDV基玛华坎株(基因型V)攻击的效力

本研究的目的是估量表达NDV F和IBDV VP2基因的两个双重HVT(vHVT304和vHVT306)和与vHVT-IBD(vHVT13)组合的两个表达NDV F基因的SB1重组体(vSB1-007和vSB1-008)抗在42日龄商业肉鸡中进行的新城疫疾病攻击(基玛华坎，基因型V)的效力。

组的设计示于表28中。在D0，将55只1日龄商业肉鸡随机分配入5个组(每组11只鸡)。如下表28中所述，在D0，利用0.2mL包含2000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下(SC)注射在颈部注射鸡。在D42，利用5.0log10EID50速发型基玛华坎(基因型V)株通过肌内途径攻击每组10只鸡。

表28 研究设计和ND效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。记录攻击后14天期间NDV临床体征。在攻击后5和7天在接种的组中采集口咽拭子以通过实时RT-PCR来评估病毒载量。

抗死亡和发病的保护作用的百分比报告于表28中。在未接种的被攻击对照组G1中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。在所有4个接种的组中观察到很好的保护作用，vHVT306和vSB1-007+vHVT13诱导了完全临床保护作用。

阳性鸡的百分比和平均脱落滴度(表达为log10EID50当量/mL)示于表29中。vHVT306和vSB1-007+vHVT13诱导了脱落的最佳减少，就临床保护作用而言它们也是最佳候选者。

表29 在NDV攻击(pi)后D5和D7评估的抗脱落的保护作用结果(具有可检测的脱落的鸡百分比和以log10表示的平均病毒载量)

*以log10EID50当量表达的平均定量实时PCR值；阈值被设置在2.7log10。

vSB1-007+vHVT13表现好于vSB1-008+vHVT13。vSB1-007基因组结构在不同方面与vSB1-008的基因组结构不同：插入的基因座、启动子、多聚腺苷酸化信号和F基因来源。这些外来序列与vSB1-007中插入的基因座的组合可能负责其更好的ND保护性能。

概括而言，本实施例举例说明了插入的基因座和NDV表达盒中的其它调控序列在通过HVT和MDV血清型2载体诱导的ND保护中的重要性。

实施例18 双重HVT-ND+IBD(vHVT304和vHVT306)或与vHVT13重组疫苗组合的SB1-ND(vSB1-008)在D14于SPF鸡中的抗经典IBDV分离株的攻击的效力

本研究的目的是估量双重HVT重组体vHVT304和vHVT306以及与SB1-ND(vSB1-008)重组构建体共施用的vHVT13抗在14日龄SPF鸡中进行的强毒性传染性法氏囊病病毒(vIBDV)攻击(Faragher52/70株)的早期IBD效力。

在D0，将95只1日龄SPF鸡随机分配入9个组(每组10只鸡)和1个组(5只鸡，未接种的未被攻击对照组)。如下表30中所描述的，在D0，利用包含300或1000pfu靶剂量的0.2mL的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。在D14，利用试剂盒plusIBD(Synbiotics Corp)从每组5只鸡收集血液样品来进行血清学测试。利用2.5log10EID50通过滴眼剂(0.05mL/鸡)攻击鸡(除其中1只鸡在攻击前死亡的组7外，每组10只鸡)。

表30 研究设计和IBD效力的结果

¹以log10表示的在攻击前于D14取样的每组5只鸡的血清的平均IBD+ELISA滴度；

²患病超过2天或在D25仍然生病的鸡被认为是患病的；

³针对临床体征和严重粘液囊损伤(粘液囊评分<3)的保护作用；

⁴未接种/未被攻击的组的粘液囊重量/体重比为0.0047。

在攻击之前和之后监控每一个组。在攻击后记录IBDV临床体征，进行11天(从D15至D25)。在攻击后观察期结束时(D25)，无痛致死所有存活的鸡，并进行尸检。记录体重和粘液囊重。将每一个法氏腔上囊(BF)称重，随后贮存在单个装有4％甲醛的容器中以进行组织学测试。按照表31中提供的等级对粘液囊的组织学损伤进行评分。

表25 法氏腔上囊的组织学损伤的评分等级*

*来源于欧洲药典的专著No.01/2008:0587“禽类传染性法氏囊病疫苗(活的)”

如果鸡死亡和/或显示疾病的显著体征和/或法氏腔上囊的严重损伤(即，组织学评分≥3)，则其被认为是受累的。

攻击前以log10表达的平均ELISA IBD+抗体滴度示于表30中。在所有接种的组中检测到显著高于对照组G1的显著滴度。血清学滴度不是剂量依赖性的。

攻击后在对照组G1的所有鸡中观察到严重临床体征。该组的10只鸡中有7只在11天的观察期内死亡，这表明攻击的高度严重性。攻击后，除G4的1只死亡的鸡外，被接种的鸡都未显示严重的临床体征。抗严重粘液囊损伤的保护作用的百分比示于上表30中。在所有组中观察到显著的IBD保护作用，在G2和G3(单独的vHVT13)中观察到最佳保护作用。vSB1-008+vHVT13与双重vHVT304和vHVT306构建体的共施用诱导了相似的IBD保护水平。保护作用在测试的剂量上不是剂量依赖性的。平均粘液囊重量/体重比率也示于表30中。所有接种的组中的比率高于被攻击的对照组的所述比率。

总之，这些数据表明SB1-ND载体与单一HVT-IBD或表达NDV-F和IBDV-VP2二者的双重HVT的组合在严重IBDV攻击模型中诱导IBD抗体和早期IBD保护作用。

实施例19 与vHVT13重组疫苗组合的单一HVT-ND(vHVT114)或SB1-ND(vSB1-007和vSB1-009)在D23于商业肉鸡中抗超强毒IBDV分离株的攻击的效力

本发明的目的是估量与HVT-ND(vHVT114)或SB1-ND(vSB1-007和vSB1-009)重组构建体共施用的vHVT13抗在23日龄商业肉鸡中进行的超强毒传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)攻击(91-168/980702分离株)的IBD效力。

在D0，将90只一日龄肉鸡随机分配入7组(每组12只鸡)和1组(每组6只鸡，未接种的未被攻击对照组)。如表32中所描述的，在D0，利用0.2mL包含3000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。在D14，从每组5只鸡收集血液样品以利用试剂盒plus IBD(Synbiotics Corp)进行血清学测试。在D0，利用相同试剂盒测试10只额外一日龄肉鸡的血清，以评估IBDV母体抗体的水平。在D23，利用4.3log10EID50的vvIBDV91-168分离株通过滴眼剂(0.05mL/鸡)攻击鸡(10只鸡/组)。

在攻击之前和之后监控每一个组。攻击后记录IBDV临床体征，进行11天(从D23至D33)。在攻击后观察期结束时(D33)，无痛致死所有存活的鸡，并进行尸检。记录体重和粘液囊重。对每一个法氏腔上囊(BF)称重，随后贮存在单个装有4％甲醛的容器中以进行组织学测试。按照表31中提供的等级对粘液囊的组织学损伤进行评分。

如果鸡死亡和/或显示疾病的显著体征和/或法氏腔上囊的严重损伤(即，组织学评分≥3)，则其被认为是受累的。

表32 研究设计和血清学结果

¹在攻击前在D23取样的每组5只鸡的血清中以log10表达的平均IBD+ELISA滴度；

²未接种/未被攻击的组的粘液囊重量/体重比率为0.0047

在D0的平均ELISA IBD+血清学滴度为4.36±0.01log10，表明孵化时极高水平的IBD母体抗体。在D23，平均ELISA IBD+滴度在对照组G1中仍然很高(3.9)。接种的组中的ELISA平均滴度与对照组的ELISA平均滴度没有显著差异。

攻击后在任何组中未观察到死亡或发病。针对严重粘液囊损伤的保护作用的百分比示于上表32中。结果显示vHVT114、vSB1-007或vSB1-009的共施用不干扰vHVT13-诱导的IBD保护作用，表明干扰不存在。类似地，接种的组的平均粘液囊重量/体重比相似并且明确地高于对照组的平均粘液囊重量/体重比，表明了IBD保护作用以及接种方案之间无差异。

总之，数据表明vHVT114、vSB1-007或vSB1-009与vHVT13之间在IBD保护作用上的相容性。

实施例20 与SB-1结合或不与其结合的双重HVT-ND+IBD(vHVT304和vHVT306)以及与vHVT13重组疫苗组合的SB1-ND(vSB1-007和vSB1-008)在D28于SPF鸡中抗变体E IBDV分离株的攻击的效力

本研究的目的是估量通过给0日龄SPF鸡皮下(SC)施用的两个双重HVT(HVT-ND+IBD：vHVT304和vHVT306)或两个vSB-1-NDV与vHVT13(vSB1-007+vHVT13、vSB1-008+vHVT13)载体化疫苗组合抗接种后28天IBDV-变体(VAR-E)攻击的效力。

在D0，将105只1日龄SPF鸡随机分配入7组(每组15只鸡)，包括一组被攻击的对照(G6)和未被攻击的对照(G7)。在D0，利用0.2mL的各自包含2000pfu靶剂量的组合疫苗和/或SB-1疫苗通过皮下注射在颈部注射组G1至G5的鸡。研究设计示表下表33中。在D28，通过来自University of Delaware(USA)的IBDV变体E分离株的滴眼剂(每只鸡0.03mL(包含3log10EID50))攻击组G1至G6的所有鸡。在攻击之前和之后监控每一个组。攻击后11天，将鸡称重并进行尸检。收集粘液囊，并称重。计算粘液囊重量/体重比(粘液囊重量/体重比X100)。

表33 研究设计和IBD效力的结果

平均粘液囊重量/体重比示于表33中。被攻击的对照鸡相较于未被攻击的鸡具有严重的粘液囊萎缩。vSB1-007和vSB1-008疫苗不干扰vHVT13-诱导的保护作用(G4和G5)。利用双重HVT(HVT-ND+IBD)接种的鸡的粘液囊重量/体重比略低于未被攻击的对照组，但明确地高于被攻击的对照组。此外，SB-1血清型2马立克氏病疫苗不干扰vHVT304-诱导的IBD保护作用。

总之，这些数据表明SB1-ND载体与单一HVT-IBD或表达NDV-F和IBDV-VP2二者的双重HVT的组合在变体E IBDV攻击模型中诱导IBD保护作用。

实施例21 vHVT114、vSB1-009和/或SB-1不存在对vHVT13在SPF鸡中诱导的变体E IBD保护作用的干扰

本研究的目的是估量当通过SC或卵内途径与vHVT114、vSB1-009和/或SB-1共施用时vHVT13在D28于SPF鸡中在IBDV-变体(VAR-E)攻击模型中的IBD保护效力。

将75只1日龄SPF鸡和75只SPF18至19日龄鸡胚随机分配入5组(分别地G1至G5和G6至G10)，包括一组被攻击的对照(分别地G4和G9)和未被攻击的对照(分别地G5和G10)。在D0，利用0.2mL的各自包含3000pfu靶剂量(除具有1000PFU靶剂量的SB-1外)的疫苗通过皮下注射在颈部注射组G1至G3的鸡。G6至G8的鸡在孵化前2-3天通过卵内途径接受相同疫苗剂量(但在0.05ml的体积中)。研究设计示于下表34中。在28日龄，通过来自University ofDelaware(USA)的IBDV变体E分离株的滴眼剂(每只鸡0.03mL(包含3log10EID50))攻击组G1至G4和G6至G9的所有鸡。在攻击之前和之后监控每一个组。攻击后11天，将鸡称重并进行尸检。收集粘液囊，并称重。计算粘液囊重量/体重比(粘液囊重量/体重比X100)。

表34 研究设计和IBD效力的结果

平均粘液囊重量/体重比示于表34中。被攻击的对照鸡(G4和G9)相较于未被攻击的鸡具有严重的粘液囊萎缩。接种的组(G1至G3和G6至G8)的粘液囊重量/体重比与未被攻击的对照组(G5和G10)的粘液囊重量/体重比相似，并明显高于被攻击的对照组(G4和G9)的粘液囊重量/体重比。在SC或卵内途径后vHVT114对vHVT13-诱导的IBD保护作用没有干扰是令人惊讶的，证实了实施例15和19中获得的数据。

总之，这些数据明确地表明当通过SC或卵内途径施用时HVT114+vSB1-009或+SB-1和vSB1-009与vHVT13在变体E IBDV攻击模型中的相容性。

实施例22 vHVT114和vHVT13以及SB1或vSB1-009载体抗超强毒+马立克氏病攻击的效力

本研究的目的是评估通过SC途径给一日龄SPF鸡施用包括vHVT114、vHVT13、SB-1和/或vSB1-009的疫苗的不同组合、并在4天后利用超强毒+马立克氏病病毒(vv+MDV)T-King分离株攻击诱导的马立克氏病效力。

在D0，将100只1日龄SPF鸡随机分配入5个组(每组20只鸡)。在D0，对于每一种疫苗利用0.2mL包含2000pfu(除其靶剂量为1000pfu的SB-1外)的疫苗通过皮下注射在颈部注射组1至3的鸡。组4和5的鸡是未接种的，并且用作被攻击的(组4)或未被攻击的(组5)假对照。研究设计示于表35中。在D4中，使用腹膜内施用途径利用0.2mL的vv+MDV T-King分离株攻击组1至4的所有鸡。

表35 研究设计和MD保护结果

在攻击之前和之后每日对每一个组监控任何不利反应。在第49天，杀死所有活鸡，并进行尸检以检查与马立克氏病相关的肉眼可见损伤。如果观察到神经体征，例如瘫痪、因疾病引起的运动体征(locomotive sign)和严重的消瘦或抑郁症，如果在尸检时观察到直接由马立克氏病发生引起的死亡或如果观察到肉眼可见损伤，将鸡分类为对于马立克氏病的感染是阳性的。损伤可能包括但不限于：肝、心脏、脾、性腺、肾和肌肉损伤。

保护作用的结果示于上表35中。将所有接种的组(G1至G3)同等地进行，在这种非常严重的早期攻击模型中如预期地诱导了部分(65％)MD保护作用。这些结果表明载体疫苗候选者保持它们抵御马立克氏病的能力。

实施例23 评估与HVT-IBD载体组合的SB1-ND载体对马立克氏疾病的功效

亲代HVT与SB-1之间在诱导抗马立克氏病的保护作用的协同作用是公知的。从而可将表达外来基因的SB-1载体与亲代HVT或表达另一个外来基因的载体化HVT混合，以分别获得双价或三价疫苗溶液。评价通过vSB1-009与vHVT114和vHVT13的组合诱导的马立克氏病功效的实例示于上文中(实施例22)。还显示了单独的或与其它MD攻击模型(包括强毒马立克氏病(vMD)攻击例如GA22、超强毒马立克氏病(vvMD)攻击例如RB1B和/或超强毒+马立克氏病(vv+MD)攻击例如T.King病毒)组合的马立克氏病载体化重组体的马立克氏病(MD)功效。分别用0.2ml剂量或0.05ml剂量的测试病毒皮下接种一日龄鸡或接种18-19日龄鸡胚蛋。在5日龄时，利用相关马立克氏攻击病毒(v、vv或vv+MDV)攻击接种的鸡和从未接种的对照。观察被攻击的鸡直至7周龄。杀死所有鸡并进行尸检以观察与马立克氏病相关的肉眼可见损伤，如实施例22中描述的。

实施例24 vSB1-004、vSB1-006、vSB1-007、vSB1-008、SB1-载体化ND疫苗单独地或与vHVT13HVT-载体化IBD疫苗组合时以及vHVT302和vHVT304疫苗在14和/或28日龄于SPF鸡中抗NDVTexas GB株攻击的效力

本研究的目的是估量表达NDV F和/或IBDV VP2基因的不同马立克氏病载体疫苗的组合抗在14和/或28日龄于SPF鸡中进行的新城疫疾病攻击(Texas GB株，基因型II)的效力。

本研究中测试的6个NDV重组疫苗候选者的特征描述于下表36中。

表36 本研究中测试的6个NDV重组疫苗候选者的特征

在D0，将225只1日龄SPF鸡随机分配入9个组(每组15只鸡)(在D14被攻击的G1a至G9a)和6个组(每组15只鸡)(在D28被攻击的G1b、G3b、G4b、G5b、G8b、G9b)。在D0，利用0.2mL的包含2000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。本研究的设计示于下表37中。在D14或D28，分别利用4.3和4.2log10EID50(0.1mL)速发型ND Texas GB(基因型II)株通过肌内途径攻击鸡。

表37 ND效力的结果

*ND＝未进行

在攻击之前和之后监控每一个组。记录攻击后的NDV临床体征。在攻击前G6和G7中有一只鸡死亡，使得这些组中的鸡的数目从15减少至14。

临床保护作用(包括抗死亡和发病的保护作用)的百分比报告于上表37中。在未接种的被攻击对照组G1a和G1b中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。在D14攻击后观察到13.3至46.6％的部分保护作用，vSB1-008、vSB1-007和vHVT304诱导最高水平的保护作用。在D28进行ND攻击后的保护水平对于所有接种的组均高得多，在利用vSB1-008、vSB1-007或vHVT304接种的组中同样略微更高。这些结果表明ND保护水平取决于攻击的日期和构建体。vSB1-008和vSB1-007构建体表现比vSB1-004和vSB1-006略微更好，vHVT304表现比vHVT302略微更好，这表明构建体的不同特征在基于MDV的载体疫苗的性能上起着重要作用。

总之，本研究的结果显示由表达NDV F基因的马立克氏病载体诱导的ND保护水平可取决于不同参数，包括载体、插入的基因座、F基因、启动子、多聚腺苷酸化位点和攻击条件。

实施例25 双重HVT-ND+IBD vHVT304和vHVT306疫苗在14和/或28日龄SPF鸡中抗NDV Texas GB株攻击的效力

本研究的目的是估量表达NDV F和IBDV VP2基因二者的HVT-载体化疫苗抗在14和/或28日龄SPF鸡中进行的新城疫疾病攻击(Texas GB strain,基因型II)的效力。

本研究中测试的2个重组疫苗候选者的特征描述于下表38中。

表38 研究中使用的重组疫苗候选者的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT304	vHVT13	SV40	Opt-VIId	合成的	IG2
vHVT306	vHVT13	SV40	Opt-VIId	合成的	SORF3-US2

在D0，将90只1日龄SPF鸡随机分配入3个组(每组15只鸡)(在D14被攻击的G1a至G3a)和3个组(每组15只鸡)(在D28被攻击的G1b至G3b)。在D0，利用0.2mL的包含2000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。研究设计示于下表39中。在D14或D28，利用4.0log10EID50(0.1mL)靶剂量的速发型ND Texas GB(基因型II)株通过肌内途径攻击鸡。

表39 ND效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。记录攻击后的NDV临床体征。G2b中的一只鸡在攻击之前死亡，从而使该组的鸡数从15减少至14。

临床保护作用(包括抗死亡和发病的保护作用)的百分比报告于上表39中。在未接种的被攻击对照组G1a和G1b中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。在D14攻击后的保护水平比在D28攻击后获得的保护水平低得多。这些疫苗候选者具有相同的插入vHVT13基因组的2个不同基因座的NDV F表达盒。在测试条件下，它们在ND保护方面表现相同，这表明两个插入基因座(IG2和SORF3-US2)同等地适合用于NDV F盒插入。

总之，本研究的结果显示由表达NDV F基因的马立克氏病载体诱导的ND保护水平取决于不同参数，包括载体、插入的基因座、F基因、启动子、多聚腺苷酸化位点和攻击条件。

实施例26 由双重HVT-ND+IBD(vHVT302、vHVT303和vHVT304)或SB1-载体(vSB1-006和vSB1-007)在1日龄SPF鸡中诱导的抗速发型基因型V NDV攻击的ND早期效力

本研究的目的是估量3个双重HVT-ND+IBD(vHVT302、vHVT303和vHVT304)和2个SB1-ND载体(vSB1-006和vSB1-007)在1日龄SPF鸡中抗在D14进行的速发型基因型V(基玛华坎)NDV攻击的效力。

在研究中测试的5个重组疫苗候选者的特征描述于下表40中。

表40 本研究中使用的重组疫苗候选者的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT302	vHVT13	US10	Opt-VIId	US10	US10
vHVT303	vHVT13	US10	Opt-V(CA02)	US10	US10
						vHVT304	vHVT13	SV40	Opt-VIId	合成的	IG2
vSB1-006	SB-1	SV40	Opt-VIId	合成的	UL55/LORF5
						vSB1-007	SB-1	SV40	Opt-VIId	(来自gC基因的内源序列)	gC

随机构成6组(1和2)10只1日龄无特异病原体(SPF)白色来亨鸡。以2000PFU靶剂量通过皮下途径(颈背)接种组2至6的鸡，如下表41中显示的。组1的鸡不接种，并被保持作为对照鸡。在2周龄时，利用基因型V Mexican基玛华坎(Mex V)速发型NDV株攻击所有鸡。使用于0.2ml生理无菌水中稀释的10⁵卵感染剂量50(EID50)通过肌内(IM)途径进行攻击。监控所有鸡直至攻击后14天。攻击后，如下每日对每一只鸡的健康状态进行评分：健康/具有特定症状(竖起的羽毛、虚脱、斜颈、颤抖)/死亡。显示特定症状超过2天或在D28被记录生病的任何鸡被考虑用于发病率的计算。

表41 由不同的表达NDV F基因的MDV载体化候选者在SPF0日龄鸡中诱导的早期ND保护结果

保护的结果概述于表41中。所有对照组在ND攻击后死亡。不同的测试疫苗在抗死亡和发病的保护作用方面分别诱导10％至80％和0％至60％的变化的ND保护水平。vHVT304候选者诱导比vHVT303和vHVT302候选者更好的保护作用；这可归因于置于NDV F基因之前的外源SV40启动子。vSB1-007表现比vSB1-006略好。此外，利用vHVT304获得的性能与利用vSB1-007获得的性能相当，表明不同马立克氏病载体可达到相同水平的ND保护作用。

总之，本研究显示双重HVT-ND+IBD和SB1-ND载体化疫苗均可在每一个严重的早期NDV攻击模型中达到显著的ND保护水平。

实施例27 通过卵内或SC途径给1日龄SPF鸡施用的双重HVT-ND+IBD vHVT306诱导的抗在D28进行的速发型基因型V NDV攻击的效力

本研究的目的是评价通过卵内或SC途径给SPF鸡施用的一种双重HVT-ND+IBD(vHVT306)抗在28日龄进行的速发型基因型V(基玛华坎)NDV攻击的效力。

本研究中测试的vHVT306重组疫苗候选者的特征描述于下表42中。单一HVT-IBD载体疫苗vHVT13用作对照。

表42 本研究中使用的重组疫苗候选者的特征

在第-3天，将40个约18日又18小时龄的已孵育SPF鸡胚蛋随机分配入2个组(每组20个蛋)。在D0，添加一组12日龄SPF鸡。组的定义示于下表43中。在D-3(卵内途径)或在D0(SC途径，在颈背中)进行接种，vHVT306和vHVT13的靶剂量为2000PFU/鸡。对于卵内途径，监控鸡的孵化率、活力(直至D28)和生长(在孵化与D28之间)。

在D28，利用强毒ND基玛华坎株攻击每组10只鸡。使用于0.2ml生理无菌水中稀释的10⁵卵感染剂量50(EID50)通过肌内(IM)途径进行攻击。监控鸡直至攻击后14天。记录特定的临床体征和死亡率。显示特定症状超过2天或在D42被记录为发病的任何鸡被考虑用于计算发病率。攻击后5和7天(即在D33和D35)，从每一只存活的鸡获取口咽拭子。通过特异性NDV qRT-PCR分析所有拭纸。

表43 通过SC或卵内途径施用至SPF鸡内的表达NDV F和IBDVVP2基因二者的vHVT306MDV载体化候选者诱导的ND保护结果

*实时RT PCR的阈值滴度被设置在2.7log10等同的EID50

在卵内接种后记录组1和2的完全孵化率，所有孵化的鸡存活至D28。在D0和D28未检测到两个组间的体重差异，证实了vHVT306在卵内施用时的完美安全性。保护的结果概述于表43中。所有vHVT13-接种的对照鸡到ND攻击后4天均死亡。通过两条途径施用的vHVT306均诱导完全临床ND保护作用。此外，在卵内施用后未检测到脱落，而在SC施用后仅少数鸡脱落可检测量的攻击病毒。

总之，本研究显示双重HVT-ND+IBD vHVT306通过SC或卵内施用途径在非常严重的异源NDV攻击模型中诱导极佳水平的ND保护作用。

实施例28 双重HVT-ND+IBD(vHVT302、vHVT303和vHVT304)重组疫苗抗在D15于SPF鸡中进行的经典IBDV分离株攻击的效力

本研究的目的是估量双重HVT重组体vHVT302、vHVT303和vHVT304重组构建体抗在15日龄于SPF鸡中进行的强毒传染性法氏囊病病毒(vIBDV)攻击(Faragher52/70株)的早期IBD效力。

本研究中测试的3个双重HVT-ND+IBD重组疫苗候选者的特征描述于下表44中。

表44 双重HVT重组体的表达盒的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT302	vHVT13	US10	Opt-VIId	US10	US10
vHVT303	vHVT13	US10	Opt-V(CA02)	US10	US10
						vHVT304	vHVT13	SV40	Opt-VIId	合成的	IG2

在D0，将40只1日龄SPF鸡随机分配入4个组(每组10只鸡)，包括一个利用vSB1-004(表达NDV F基因的SB-1载体)接种的对照组(G1)。5只其它SPF鸡保持不接种和不被攻击以进行粘液囊重量/体重评估。如下表45中所描述的，在D0，利用0.2mL包含2000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。在D15，从每组所有鸡(除其中1只鸡在血液采样前死亡的组1和3外，每组10只鸡)采集血液样品以利用试剂盒plus IBD(Synbiotics Corp)进行血清学测试。在D15，以2.5log10EID50通过滴眼剂(0.05mL/鸡)攻击所有4个组的鸡。

表45 研究设计和IBD效力的结果

¹发病超过2天或在D25仍然发病的鸡被认为是发病的。括号内的数字是被攻击的组中的鸡的数目。

²抗临床体征和严重粘液囊损伤的保护作用(粘液囊评分<3)

⁴未接种/未被攻击的组的粘液囊重量/体重比为0.0043。

在攻击之前和之后监控每一个组。攻击后记录IBDV临床体征(从D15至D25)。在攻击后观察期结束时(D25)，无痛致死所有存活的鸡，并进行尸检。记录体重和粘液囊重。将每一个法氏腔上囊(BF)称重，随后贮存于单个装有4％甲醛的容器中以进行组织学测试。按照表46中提供的等级给粘液囊的组织学损伤评分。

表46 法氏腔上囊的组织学损伤的评分标准*

*来源于欧洲药典的专著No.01/2008:0587“鸡传染性法氏囊病疫苗(活的)”

如果鸡死亡和/或显示疾病的显著体征和/或法氏腔上囊的严重损伤(即，组织学评分≥3)，则其被认为是受累的。

攻击前以log10表达的平均ELISA IBD+抗体滴度示于表45中。在所有接种的组中检测到显著高于对照组G1的滴度的显著滴度。血清学滴度在G3(vHVT303)中略微更高。

攻击后在对照组G1的全部9只鸡中观察到几个临床体征，其导致1只鸡的死亡。攻击后G2(vHVT302)中仅一只接种的鸡显示临床体征。抗几个粘液囊损伤的保护作用的百分比示于上表45中。在所有接种的组中观察到显著的IBD保护作用，在G3(vHVT303)中观察到完全保护作用。平均粘液囊重量/体重比也示于表45中。所有接种的组中的比率高于被攻击的对照组G1的所述比率，并且与未接种并且未被攻击的对照组无显著差异。

总之，这些数据表明本研究中测试的3个双重HVT-IBD+ND在严重IBDV攻击模型中诱导IBD抗体和早期IBD保护作用。

实施例29 5个不同HVT-ND疫苗候选者在14日龄SPF鸡中抗速发型NDV ZJ1(基因型VIId)分离株攻击的效力

本研究的目的是估量5个表达NDV F基因的单一HVT重组构建体(vHVT39、vHVT110、vHVT111、vHVT112和vHVT113)抗在14日龄于SPF鸡中进行的速发型NDV ZJ1(基因型VIId)分离株新城疫攻击的效力。

这5个疫苗候选者的特征描述于下表47中。

表47 攻击研究中使用的HVT-ND重组病毒的特征

*Wt意指使用野生型速发型F基因序列，但切割位点被修饰成迟发型病毒的切割位点。Wtnm指野生型序列的切割位点未被修饰。Texas速发型株属于基因型IV，YZCQ属于基因型VIId。

在D0，将72只1日龄SPF鸡随机分配入5个组(每组12只鸡)(接种)和1组12只鸡(未接种的对照)。如下表48中所描述的，在D0，利用0.2mL包含6000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。在D14，利用5log10EID50的NDV ZJ1/2000(基因型VIId)速发型株通过肌内途径攻击鸡。

表48 ND效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。攻击后记录NDV临床体征和死亡率。在感染后2和4天(dpi)采集口咽拭子以使用由Wise等人描述的方法(2004；Development of a Real-Time Reverse-TranscriptionPCR for Detection of Newcastle disease virus RNA in Clinical Samples.J Clin Microbiol42,329-338)通过实时RT-PCR评估病毒载量。

抗死亡和发病的保护作用的百分比报告于上表48中。在未接种的被攻击对照组G1中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。疫苗诱导不同水平的抗死亡(25-100％)或抗发病(8％-83％)的保护作用。最佳保护水平由vHVT110诱导，然而最低保护水平由vHVT039诱导，其它候选者给予中间结果。在2和4dpi的口咽脱落的结果也显示于上表48中，并且与临床保护作用的结果一致。这些疫苗候选者在它们的启动子和F基因序列方面不同。这些结果显示这些参数对于最佳HVT-ND疫苗候选者的设计是非常重要的。

总之，本研究的结果显示启动子和F基因序列在由HVT-载体化ND疫苗候选者诱导的ND效力中的重要性。

实施例30 由表达IBDV VP2和NDV F的双重SB1构建体诱导的新城疫疾病效力的评估.

本研究的目的是估量表达IBDV VP2和NDV F的双重SB1构建体抗新城疫疾病攻击的效力。

在D0，将1日龄SPF鸡随机分配入几个组(每组10-20只鸡)，包括接种的和未接种的组。在D0，利用0.2mL包含1000至5000pfu的靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射接种组的鸡。或者，在卵化前2或3天卵内施用0.05mL中的相同剂量。在接种后在不同的时间：例如D14、D28或D42，利用约4.0log10EID50(0.1mL)的速发型NDV株例如Texas GB(基因型II)、ZJ1(基因型VIId)、基玛华坎(基因型V)株通过肌内途径攻击鸡(至少一个接种组和一个未接种组)。

在攻击之前和之后在临床上监控每一个组。攻击后记录NDV临床体征(发病率)和死亡率。计算所有组中临床保护作用的百分比。攻击后至少90％未接种的被攻击SPF鸡应当死亡或严重患病，以验证攻击的严重性。可在攻击后不同时间例如攻击后3、5、7和9天获取口咽和泄殖腔拭子的样品，可通过实时RT-PCR估计病毒载量。最佳候选者是诱导最高水平的临床保护和最低水平的拭子病毒载量的那些候选者。可在包含NDV母体抗体的肉鸡中进行相似研究；然而，如果早期进行攻击的话，这些母体抗体可潜在地保护未接种的鸡。还可组合其它马立克氏病疫苗或载体疫苗来测试双重SB1构建体。

实施例31 由表达IBDV VP2和NDV F的双重SB1构建体诱导的传染性法氏囊病效力的评估

本研究的目的是估量表达IBDV VP2和NDV F二者的双重SB1的IBD效力。

将1日龄SPF鸡随机分配入几个组(每组10-20只鸡)，包括接种的和未接种的组。将未接种的对照分入2个亚组，包括被攻击的和未被攻击的鸡。在D0，利用0.2mL各自包含1000至5000pfu靶剂量的疫苗通过皮下注射在颈部注射接种组的鸡。或者，在孵化前2或3天卵内施用0.05mL中的相同剂量。在接种后的不同时间：例如接种后14、21、28或42天，利用强毒IBDV(例如Faragher或the US标准株)、超强毒IBDV例如91-168分离株或变体IBDV分离株例如USDelaware变体E分离株的滴眼剂(0.03mL，包含2至4log10EID50/鸡)攻击来自接种组和被攻击对照的所有鸡。在攻击之前和之后在临床上监控每一个组。在攻击后4或5天可对鸡进行尸检以进行粘液囊肉眼可见损伤评估。还可在攻击后10至11天对它们进行尸检。可评估肉眼可见和/或组织学损伤。此外，称取鸡和粘液囊的重量，相较于未接种未被攻击组的粘液囊重量/体重比计算粘液囊重量/体重比(粘液囊重量/体重比X100)。对照SPF攻击的鸡必须显示临床体征和/或具有显著的肉眼可见和/或组织学损伤，和/或应当具有显著低于未接种的未被攻击的对照鸡的粘液囊重量/体重比，以证实攻击的严重性。疫苗的效力通过将这些参数与未接种/被攻击的和未接种的/未被攻击的组相比较来进行评估。这样的研究可在包含IBDV母体抗体的肉鸡中进行；然而，如果早期进行攻击的话，这些母体抗体可潜在地保护未接种的鸡。还可将双重SB1构建体与其它马立克氏病疫苗或载体疫苗组合来测试。

实施例32 由表达IBDV VP2和NDV F的双重SB1构建体诱导的马立克氏病效力的评估

本研究的目的是评估由表达IBDV VP2和NDVF二者的SB1载体诱导的马立克氏病效力。

将1日龄SPF鸡随机分配入几个组(每组20至50只鸡)，包括接种的和未接种的对照。可将未接种的对照分成2个亚组，包括被攻击的和未被攻击的鸡。在D0，利用0.2mL各自包含1000至5000pfu靶剂量的疫苗通过皮下注射在颈部注射接种组的鸡。或者，可在孵化前2或3天卵内施用0.05mL中的相同剂量。在接种后不同的时间例如接种后3至10天，利用0.2mL的马立克氏病病毒(MDV)株通过腹膜内途径攻击来自接种组和被攻击对照的所有鸡。MDV株可以是几个致病型，例如强毒MDV(vMDV)，包括JM或GA22分离株，超强毒MDV(vvMDV)例如RB-1B或Md5分离株，超强毒+(vv+MDV)例如T-King或648A分离株。通过感染鸡，收获它们的血细胞并在冷冻保护剂例如DMSO存在的情况下冷冻在液氮中来制备MDV攻击株接种物。在进行接种/攻击研究之前，确定每一个攻击批次的鸡感染剂量50(CID50)。在攻击之前和之后在临床上监控每一个组。在接种后至少7周对鸡进行尸检，检测每一只鸡的马立克氏病肉眼可见损伤的存在。损伤可能包括但不限于下列：肝、心脏、脾、性腺、肾、神经和肌肉损伤。这样的研究可在包含MDV母体抗体的肉鸡中进行。还可将双重SB1构建体与其它马立克氏病疫苗(例如HVT和或CVI988Rispens株)或MD载体疫苗组合来进行测试。还可通过接种的鸡与MDV感染的非接种SPF鸡之间的接触来进行MD攻击。

                             ***

上文详细地描述本发明的优选实施方案，应理解通过上述实施例定义的本发明不限于上述说明中所示的特定内容，因为其许多表观变化是可能的，而不背离本发明的精神或范围。

本文中引用或参考的所有文献(“本文中引用的文献”)，和本文中引用的文献中引用或参考的所有文献与本文中或通过引用并入本文中的任何文献中提及的任何产品的许多制造商的说明书、说明、产品说明书和产品介绍一起，通过引用并入本文，并且可用于本发明的实施。

Claims (43)

1.一种组合物或疫苗，其中所述组合物或疫苗包含一种或多种重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体，所述载体包含一个或多个编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸，或所述组合物或疫苗包含一种或多种包含突变的糖蛋白C(gC)基因的重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体。

2.权利要求1的组合物，其还包括选自下述的一种或多种组合物或疫苗：包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸的重组HVT载体(或MDV-3或Meleagrid疱疹病毒-1)、野生型HVT(MDV-3)、包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸的重组MDV-1载体(或禽疱疹病毒-2)、野生型MDV-1及其组合。

3.权利要求2的组合物或疫苗，其包含野生型HVT(MDV-3)。

4.权利要求2的组合物或疫苗，其包含重组HVT(MDV-3)。

5.权利要求2的组合物或疫苗，其包含野生型MDV-1。

6.权利要求2的组合物或疫苗，其包含重组MDV-1。

7.权利要求2的组合物或疫苗，其包含野生型HVT(MDV-3)和野生型MDV-1。

8.权利要求2的组合物或疫苗，其包含重组HVT(MDV-3)和野生型MDV-1。

9.权利要求2的组合物或疫苗，其包含野生型HVT(MDV-3)和重组MDV-1。

10.权利要求2的组合物或疫苗，其包含重组HVT(MDV-3)和重组MDV-1。

11.权利要求1-10中任一项的组合物或疫苗，其中禽疱疹病毒3型中的异源多核苷酸被插入所述禽疱疹病毒3型载体的独特长(UL)区域中的ORF UL55与ORF LORF5之间的区域内。

12.权利要求1-10中任一项的组合物或疫苗，其中禽疱疹病毒3型中的异源多核苷酸被插入禽疱疹病毒3型糖蛋白C内或替代该基因。

13.权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对应于禽类病原体新城疫病病毒F(NDV-F)的基因。

14.权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对应于禽类病原体新城疫病病毒血细胞凝集素神经氨酸酶(NDV-HN)的基因。

15.权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对应于来自禽类病原体马立克氏病病毒的一个或多个基因。

16.权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对应于选自如下的基因：马立克氏病病毒糖蛋白C(gC)、马立克氏病病毒糖蛋白B(gB)、马立克氏病病毒糖蛋白E(gE)、马立克氏病病毒糖蛋白I(gI)、马立克氏病病毒糖蛋白H(gH)或马立克氏病病毒糖蛋白L(gL)，及其组合。

17.权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对应于禽类病原体传染性法氏囊病病毒(即，IBDV或禽肾病病毒)的基因。

18.权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中所述异源多核苷酸对应于禽类病原体的基因IBDV VP2、IBDV VPX、IBDV VP3和/或IBDV VP4。

19.权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对应于禽类病原体感染性喉气管炎病毒(ILTV)的基因。

20.权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对应于禽类病原体的基因ILTV糖蛋白B、ILTV糖蛋白I、ILTV糖蛋白D、ILTV糖蛋白E、ILTV糖蛋白C或其组合。

21.权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对应于禽类病原体的基因，所述病原体选自禽脑脊髓炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、鸡痘病毒、禽冠状病毒、禽轮状病毒、禽细小病毒、禽星状病毒和鸡贫血病毒以及球虫病(艾美球虫属的种)、弯曲杆菌属的种、沙门菌属的种、鸡败血支原体和滑液囊支原体、大肠杆菌、巴斯德菌属的种、禽杆菌属的种、梭菌属的种。

22.权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对应于禽类病原体的基因，所述基因选自流感血凝素(HA)、流感神经氨酸酶(NA)、来自鸡败血支原体(MG)和/或滑液囊支原体(MS)的保护基因。

23.权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的编码并表达重组禽疱疹病毒3、重组HVT(MDV-3)和重组MDV-1中的禽类病原体的一个或多个抗原的异源多核苷酸编码不同抗原。

24.权利要求1-23中任一项的组合物或疫苗，其中所述重组禽疱疹病毒3型载体包含启动子。

25.权利要求1-23中任一项的组合物或疫苗，其还包含药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。

26.一种重组禽疱疹病毒3型载体，其包含一种或多种异源多核苷酸，所述多核苷酸编码并表达禽类病原体或包含突变的gC基因的重组禽疱疹病毒3型载体中。

27.权利要求26的重组禽疱疹病毒3型载体，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对应于禽类病原体新城疫病病毒F的基因(NDV-F)。

28.权利要求26的重组禽疱疹病毒3型载体，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对应于禽类病原体马立克氏病病毒的基因。

29.权利要求26的重组禽疱疹病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于选自如下的基因：马立克氏病病毒糖蛋白C(gC)、马立克氏病病毒糖蛋白B(gB)、马立克氏病病毒糖蛋白E(gE)、马立克氏病病毒糖蛋白I(gI)、马立克氏病病毒糖蛋白H(gH)或马立克氏病病毒糖蛋白L(gL)及其组合。

30.权利要求26的重组禽疱疹病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于禽类病原体传染性法氏囊病病毒(即，IBDV或禽肾病病毒)的基因。

31.权利要求26的重组禽疱疹病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于禽类病原体的基因IBDV VP2、IBDV VPX、IBDV VP3和/或IBDV VP4。

32.权利要求26的重组禽疱疹病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于禽类病原体传染性喉气管炎病毒(ILTV)的基因。

33.权利要求26的重组禽疱疹病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于禽类病原体ILTV糖蛋白B、ILTV糖蛋白I、ILTV糖蛋白D、ILTV糖蛋白E、ILTV糖蛋白C或其组合的基因。

34.权利要求26的重组禽疱疹病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于选自下述的禽类病原体的基因：禽脑脊髓炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、鸡痘病毒、禽冠状病毒、禽轮状病毒、禽细小病毒、禽星状病毒和鸡贫血病毒和球虫病(艾美球虫属的种)、弯曲杆菌属的种(Campylobacter sp.)、沙门菌属的种(Salmonella sp.)、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、巴斯德菌属的种(Pasteurella sp.)、禽杆菌属的种(Avibacterium sp.)和梭菌属的种(Clostridium sp.)。

35.权利要求26的重组禽疱疹病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于禽类病原体的基因，所述基因选自流感病毒血凝素(HA)、流感病毒神经氨酸酶(NA)或两者。

36.权利要求26-35中任一项的重组禽疱疹病毒3型载体，其中所述重组禽疱疹病毒3型载体包含启动子。

37.权利要求36的重组禽疱疹病毒3型载体，其中所述启动子选自下组中：立即早期CMV启动子、豚鼠CMV启动子、SV40启动子、假性狂犬病病毒糖蛋白X启动子、单纯疱疹病毒-1α4启动子、马立克氏病病毒糖蛋白A(或gC)启动子、马立克氏病病毒糖蛋白B启动子、马立克氏病病毒糖蛋白E启动子、传染性喉气管炎病毒糖蛋白B、传染性喉气管炎病毒糖蛋白E、传染性喉气管炎病毒糖蛋白D或传染性喉气管炎病毒糖蛋白I启动子和牛疱疹病毒1.1VP8启动子。

38.一种接种动物的方法，包括至少施用一次权利要求1-37中任一项的组合物或载体。

39.权利要求38的方法，其中所述方法包括初免-加强施用方案。

40.一种用于诱导动物中抗一种或多种禽类病原体的免疫原性或保护性反应的方法，包括至少施用一次权利要求1-37中任一项的组合物或载体。

41.权利要求38-41中任一项的方法，其中所述动物是禽类。

42.一种产生重组SB-1病毒载体的方法，包括将一个或多个分离的异源多核苷酸在SB-1基因组的非必需区域内引入所述SB-1基因组。

43.权利要求42的方法，其中所述异源多核苷酸被插入独特的长(UL)区域或独特的短(US)区域或替代SB-1糖蛋白C基因。