CN114317827B - 一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的多重pcr引物、方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的多重PCR引物、方法及应用。所述多重PCR引物组合物包括：引物对Meq‑9F、Meq‑11R，核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，扩增MDV‑1流行毒株的S‑meq基因和弱毒疫苗株的L‑meq基因；引物对SB‑1‑1F、SB‑1‑1R，核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，扩增MDV‑2疫苗株的gB基因；引物对SB‑1‑1F、HVT‑8R，核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示，扩增HVT疫苗株的gB基因。

Description

一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的多重PCR引 物、方法及应用

技术领域

本发明涉及一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的多重PCR引物、方法及应用，属于基因工程与生物技术领域。

背景技术

鸡马立克病(Marek’s disease，MD)是由鸡马立克病病毒(Marek’s diseasevirus，MDV)早期感染雏鸡引发的一种重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病。主要特征是外周神经、内脏器官、虹膜、肌肉及皮肤内发生淋巴样细胞浸润，并最终发展成为多发性淋巴瘤。MDV可经空气传播，传染能力强，被感染的宿主早期可导致免疫抑制及严重发育不良，晚期产生内脏肿瘤而引起大批死亡，导致全球每年约10～20亿美元的巨大经济损失，加上MDV感染宿主后产生的免疫抑制导致其他禽病疫苗免疫预防效果不佳或免疫失败造成的间接影响，长期以来一直严重影响我国养禽业的健康发展。

MDV在分类上属于甲亚科疱疹病毒，是少数几种疱疹病毒在其自然宿主中可诱导产生肿瘤的一种致瘤性疱疹病毒。MDV共有3种不同的血清型：血清I型(MDV-1)、血清II型(MDV-2)和血清III型(MDV-3，即火鸡疱疹病毒HVT)。其中，只有MDV-1流行毒株具有致病性和致瘤性。根据致病性的不同，MDV-1分离株又可以分为温和毒(Mild MDV，mMDV)、强毒(Virulent MDV，vMDV)、超强毒(Very virulent MDV，vvMDV)以及特超强毒(Very virulentplus MDV，vv+MDV)。MDV感染宿主诱发的肿瘤可以用病毒疫苗进行有效的免疫预防，这是世界上第一个可用病毒疫苗预防肿瘤和癌症发生的成功案例。当前，我国用于MD临床免疫预防的疫苗毒株主要有MDV-1的CVI988/Rispens、814株和HVT的FC-126株，更早一些时期也曾广泛使用过MDV-2的SB-1株，这些疫苗毒株在MD的有效防控中发挥了重要作用。虽然疫苗的应用可以较好地预防MD肿瘤的发生，但由于近年来MDV毒力的不断增强，部分毒株已经突破了现有MD疫苗的免疫保护，vv+MDV及部分变异株的出现，已经导致疫苗免疫鸡群中仍不断有MD的爆发和流行，给我国养禽业造成了严重的经济损失。

MDV和其它疱疹病毒一样是严格的细胞结合性疱疹病毒，临床生产中所有种鸡、蛋鸡及部分肉鸡(如生长周期较长的地方品系)均需要进行全群MD疫苗免疫。目前广泛使用的MD疫苗都是天然的或者人工致弱的MDV活病毒疫苗，如MDV-1的CVI988/Rispens和814疫苗株、HVT的FC-126疫苗株。活病毒疫苗接种宿主后可在鸡体内持续性终身带毒，因此在临床诊断中很难有效区分发病鸡群和病例鸡体内感染携带的MDV是疫苗株还是田间流行毒株。此外，在临床上发病鸡群经常会出现家禽肿瘤病的混合感染，比如除MDV感染之外往往还伴随着禽白血病病毒(ALV)和禽网状内皮增生症病毒(REV)等的共感染。它们均可导致宿主免疫抑制和内脏肿瘤，发病鸡和病死鸡的大体剖检病变肉眼观察结果极为相似，在临床诊断中非常容易导致误诊。在生产一线和兽医门诊，尽早的对相关疑似病例进行快速准确的鉴别诊断，可为企业和养殖户及时采取措施、减少和挽回部分经济损失提供的重要科学依据。因此，急需建立一种快速精准的技术方法，用于鸡群MD临床病例流行毒株感染与疫苗免疫的鉴别诊断，同时也可为MDV流行毒株的分离鉴定和疫苗免疫效果评价提供重要技术手段。

经典的MD诊断方法包括病毒的细胞分离培养、琼脂扩散试验(AGP)、酶联免疫吸附实验(ELISA)和病理组织学切片观察等。这些方法或检测周期较长，或灵敏度较低，或成本较高，其共性缺点都是难以有效区分和鉴别MDV野毒感染与疫苗免疫。近年来，随着分子生物学技术的发展和广泛应用，标志着动物疫病鉴别诊断技术的革新时代已经来临。与传统方法相比，新的分子生物学技术如PCR拥有更多优点，不仅可以实现高通量检测、有效提高病毒检测的灵敏度，而且可以显著节约时间成本，尤为重要的是病毒感染与免疫的鉴别诊断在某些技术层面已经完全成为可能。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的多重PCR引物、方法及应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括：

引物对Meq-9F、Meq-11R，核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；

引物对SB-1-1F、SB-1-1R，核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

引物对SB-1-1F、HVT-8R，核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示；

所述引物对Meq-9F、Meq-11R扩增MDV-1流行毒株的S-meq基因和弱毒疫苗株的L-meq基因；引物对SB-1-1F、SB-1-1R扩增MDV-2疫苗株的gB基因；引物对SB-1-1F、HVT-8R扩增HVT疫苗株的gB基因。

一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的试剂盒，所述试剂盒含有多重PCR引物组合物。

所述试剂盒还包括阳性标准质粒、PCR反应预混液和ddH₂O；所述阳性标准质粒包括pMD19-T-S-meq、pMD19-T-L-meq、pMD19-T-SB-1gB和pMD19-T-HVTgB；

所述阳性标准质粒的构建方法为：以pMD19-T为载体，分别构建MDV-1超强毒株Md5的S-meq基因、MDV-1疫苗株CVI988/Rispens或疫苗株814的L-meq基因、MDV-2疫苗株SB-1的gB基因、HVT疫苗株FC-126的gB基因的阳性质粒。

所述PCR反应预混液为2×Easy

PCR SuperMix(+dye)。

一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的多重PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待检样品的DNA模板；

(2)以阳性标准质粒为对照，根据权利要求1所述的多重PCR引物组合物进行PCR扩增；

(3)待检样品的结果鉴定。

所述PCR反应体系为20μL，包括PCR反应预混液10μL、10μM的Meq-9F引物0.5μL、10μM的Meq-11R引物0.5μL、10μM的SB-1-1F引物0.25μL、10μM的SB-1-1R引物0.25μL、10μM的HVT-8R引物0.25μL、待检样品DNA或阳性标准质粒1μL，余量为ddH₂O。

所述阳性标准质粒中pMD19-T-L-meq、pMD19-T-S-meq、pMD19-T-SB-1gB、pMD19-T-HVTgB的浓度均为10ng/μL，pMD19-T-L-meq﹕pMD19-T-S-meq﹕pMD19-T-SB-1gB﹕pMD19-T-HVTgB的体积比为10﹕10﹕1﹕1；所述待检样品DNA的浓度为10ng/μL。

所述PCR反应程序为94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃延伸5min。

所述结果鉴定的具体方法为：

(1)扩增阳性标准质粒时，扩增得到大小分别为1558bp、1381bp、789bp和483bp的4个特异性条带，分别指示MDV-1疫苗株CVI988/Rispens或疫苗株814的L-meq基因、MDV-1流行毒株的S-meq基因、HVT疫苗株FC-126的gB基因以及MDV-2疫苗株SB-1的gB基因，表示检测系统正常有效；

(2)扩增待检样品的凝胶电泳仅出现1381bp条带时，说明待检样品存在MDV-1流行毒株感染，发病鸡群可诊断为MD病例；

(3)扩增待检样品的凝胶电泳出现1558bp条带时，说明待检样品免疫了MDV-1的CVI988/Rispens疫苗或814疫苗；

(4)扩增待检样品的凝胶电泳出现789bp条带时，说明待检样品免疫了HVT疫苗；

(5)扩增待检样品的凝胶电泳出现483bp条带时，说明待检样品免疫了MDV-2的SB-1疫苗。

(6)扩增待检样品的凝胶电泳同时出现1381bp和(3)-(5)预期大小的条带时，综合判断三种不同血清型MDV疫苗的免疫类型及野毒感染情况；

(7)扩增待检样品的凝胶电泳结果未出现任何条带时，说明未检测到MDV，但不能排除感染的可能，应结合样品来源鸡群的临床症状、剖检病变以及其他检测结果综合判定。

所述的多重PCR引物组合物在鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫中的应用，包括但不仅限于临床马立克病例的鉴别诊断、病毒分离株分型鉴定以及MD疫苗免疫评价。本发明的有益效果：

本发明对国内外已发表的具有广泛代表性的三种不同血清型MDV(MDV-1、MDV-2和HVT)参考毒株的meq基因和gB基因进行了系统的序列比对和分析，然后分别根据MDV-1强弱毒株的meq基因、MDV-2疫苗株SB-1和HVT疫苗株FC-126的gB基因序列与其它不同血清型毒株之间显著差异的区域设计了3对特异性引物(SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.5)，并将上述引物进行有效组合及应用，建立了一种可鉴别检测不同血清型MDV的多重PCR方法。具有下述优点：

1、操作简便、快速。本发明的方法，可按照常规的PCR方法进行操作，反应仅需1.5h左右，加上临床组织样品或细胞感染样品处理和DNA提取，共需时约2～3h即可完成全程检测并获得准确结果。

2、投资少、成本低。本发明的方法，仅需配置普通PCR仪，且只需一次PCR反应就可以做出多项判定，如：发病鸡群是否感染了MDV，是否因感染MDV-1流行毒株而发病，并且能够评估鸡群前期是否进行了有效的疫苗免疫、免疫了哪种血清型的MD疫苗。无需配备大型仪器、设备和附加的昂贵试剂等费用，一般实验或技术人员简单培训即可上岗操作。

3、样品类型多样化、高通量检测。使用本发明的方法，不仅可以实现检测样品种类的多样性，如对不同类型的临床样品(如内脏组织、血液样品、羽毛囊样品)以及病毒分离细胞培养物等的检测，还能实现高通量检测，一次PCR反应可检测多达96个样品，为MD临床病例诊断及疫苗免疫效果评价提供了便捷高效的技术方法。

4、本发明的多重PCR方法，不仅可以用于鸡MD疑似病例的感染与免疫的鉴别诊断，通过对临床病例的组织样本或病毒分离细胞培养物进行鉴别检测、有效判断发病鸡群的MDV感染状况，还可以用于评估健康或发病鸡群的MD疫苗免疫状况及免疫效果。

5、本发明为生产一线和临床兽医部门的技术人员对鸡MD疑似病例的早期鉴别诊断提供了重要技术手段，对MD有效防控和保障我国家禽养殖业健康发展具有重要的现实意义。

附图说明

图1.MDV-1参考毒株meq基因序列保守性分析及PCR引物设计位点示意图；

其中：A，表示上下游引物Meq-9F和Meq-11R识别不同致病型MDV-1参考毒株meq基因的特异性靶点序列；B，表示上下游引物识别meq基因的相对位置；正反向箭头，表示上下游引物；数字，表示核苷酸相对位点；S-meq，表示MDV-1流行毒株相对较短的meq基因；L-meq，表示MDV-1疫苗株相对较长的meq基因。

图2.MDV-2疫苗株SB-1的gB基因PCR引物设计示意图；

其中：A，表示不同血清型MDV参考毒株gB基因的序列保守性分析，方框，表示上下游引物SB-1-1F和SB-1-1R识别SB-1gB基因的特异性靶点序列；B，表示上下游引物识别靶基因的相对位置；正反向箭头，表示上下游引物；数字，表示核苷酸相对位点。

图3.HVT疫苗株的gB基因PCR引物设计示意图；

其中，A，表示不同血清型MDV参考毒株gB基因的序列保守性分析，方框，表示上下游引物SB-1-1F和HVT-8R识别HVT gB基因的特异性靶点序列；B，表示上下游引物识别gB基因的相对位置；正反向箭头，表示上下游引物；数字，表示核苷酸相对位点。

图4.本发明实施例2多重PCR检测阳性标准质粒的电泳结果示意图；

其中：M，表示DNA marker；vMDV，表示MDV-1流行毒株；CVI988，表示MDV-1疫苗株；SB-1，表示MDV-2疫苗株；HVT，表示MDV-3疫苗株；PC，表示阳性标准质粒。

图5.本发明实施例3多重PCR检测阳性参考毒株的电泳结果示意图；

其中：M，表示DNA Marker；SB-1，表示MDV-2疫苗株；HVT，表示MDV-3疫苗株；GX0101，表示MDV-1超强毒株；CVI988，表示MDV-1疫苗株；CEF，表示阴性对照；PC，表示阳性标准质粒。

图6.本发明应用例1多重PCR检测肉鸡MD疑似病例组织样本的电泳结果示意图；

其中：M，表示DNA Marker；PC，表示阳性标准质粒；A01～A11，表示临床发病鸡脾脏样品编号。

图7.本发明应用例2多重PCR检测蛋鸡MD疑似病例组织样本的电泳结果示意图；

其中：M，表示DNA Marker；PC，表示阳性标准质粒；B01～B07，表示临床发病鸡脾脏或肝脏样品编号。

图8.本发明应用例3多重PCR检测MDV分离株的电泳结果示意图；

其中：M，表示DNAMarker；PC，表示阳性标准质粒；C01～C22，表示临床发病鸡病毒分离CEF培养物编号；CEF，表示阴性细胞对照。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1多重PCR引物的设计

在NCBI GenBank数据库中查询MDV-1代表株Md5(GenBank Acc.No.:AF243438.1)、疫苗株CVI988/Rispens(GenBank Acc.No.:ABF72323.1)、疫苗株814(GenBank Acc.No.:JF742597)等国内外参考毒株的S-meq和L-meq基因序列，用MegALign软件进行序列比对。

结果显示：Md5等MDV流行毒株(包括强毒、超强毒和特超强毒等不同致病型毒株)的S-meq基因序列全长为1020bp，CVI988/Rispens和814疫苗株的L-meq基因序列全长均为1197bp，三者相比CVI988/Rispens和814疫苗株的L-meq基因在Md5的S-meq基因575位点处插入了一段长177bp的基因片段，其余位点基因序列高度保守。

因此，选择meq基因外侧两端保守区域，用Primer Premier 5.0软件分别设计特异性针对疫苗株L-meq和流行毒株S-meq基因的引物对SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(图1)，预期PCR扩增产物长度分别为1558bp和1381bp。

同上，查询国内外代表性的MDV-1参考毒株(如Md5、CVI988/Rispens、814等)、MDV-2疫苗株SB-1(GenBank Acc.No.:MH825644.1)和HVT疫苗株FC-126(GenBank Acc.No.:AF291866)的gB基因序列，用MegALign软件进行序列比对。

结果显示：MDV-1国际代表株Md5和疫苗株CVI988/Rispens的gB基因序列完全相同，但MDV-2疫苗株SB-1和HVT疫苗株FC-126的gB基因序列之间以及与MDV-1参考毒株之间均存在有多处差异，针对这些差异区域用Primer Premier 5.0软件分别设计了3个引物，即SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5(图2和图3)。

其中SEQ ID NO.3是扩增MDV-2疫苗株SB-1和HVT疫苗株FC-126的gB基因的上游通用引物，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5则分别是扩增MDV-2疫苗株SB-1和HVT疫苗株FC-126gB基因的特异性下游引物，预期扩增产物的长度分别为483bp和789bp。

上述引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。合成的引物分别用灭菌超纯水稀释至10μM的工作浓度，小量分装，-20℃保存备用。

表1多重PCR的引物及序列

引物名称	序列(5’-3’)	SEQ ID NO.
			Meq-9F	TGCTGGAATGTTAAGAATAAATTCCGCAC	1
Meq-11R	TTATCTCATACTTCGGAACTCCTGG	2
			SB-1-1F	TGCCCCATACCGTTGAACAATTCCGCC	3
SB-1-1R	GCAGAATTCCATGAGGGTCGC	4
			HVT-8R	CGCCTCGTCCGGCAAGGCCATCTTGA	5

实施例2阳性标准质粒的多重PCR检测

1、阳性标准质粒的制备

(1)meq和gB基因的质粒构建

分别用引物对SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2扩增MDV-1疫苗株CVI988/Rispens的L-meq基因全长和国际代表株Md5的meq基因全长(如图1所示)；用引物对SEQ ID NO.3/SEQ IDNO.4扩增MDV-2疫苗株SB-1的gB基因中间片段(如图2所示)；用引物对SEQ ID NO.3/SEQ IDNO.5扩增疫苗株HVT的gB基因中间片段(如图3所示)。

1％琼脂糖凝胶电泳分析后切胶回收符合预期大小的PCR产物，以pMD19-T为载体，分别构建三种不同血清型MDV(MDV-1、MDV-2和HVT)特定靶基因meq和gB的阳性质粒：pMD19-T-S-meq、pMD19-T-L-meq、pMD19-T-SB-1gB和pMD19-T-HVTgB。将上述质粒分别转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，阳性克隆进行摇菌培养，送样至生工生物工程(上海)有限公司测序。

引物背景信息见表2，PCR反应体系见表3。PCR反应程序为：预变性94℃4min；变性94℃30s、退火60℃30s、延伸72℃1.5min；72℃延伸5min。随后的质粒构建和鉴定，如菌液PCR、质粒酶切鉴定及序列测定分析等，均按常规方法进行。最后摇菌培养、提取质粒，紫外分光光度计测定浓度，-20℃冻存备用。

表2MDV S-meq、L-meq和gB基因的PCR扩增引物

表3MDV meq和gB基因的PCR扩增体系

(2)阳性标准质粒的配制

紫外分光光度计测定MDV-1L-meq和S-meq基因阳性质粒、MDV-2及HVT gB基因阳性质粒的浓度，均稀释为10ng/μL，制备混合阳性标准质粒模板(L-meq+S-meq+SB-1gB+HVTgB)，阳性参照质粒混合最佳配比为pMD19-T-L-meq﹕pMD19-T-S-meq﹕pMD19-T-SB-1gB﹕pMD19-T-HVTgB＝10μL﹕10μL﹕1μL﹕1μL。按照上述配比，混合制备好阳性标准质粒之后，小量分装(20μL/支)，-20℃冻存。

表4 MDV-1/MDV-2/HVT多重PCR反应体系

2、阳性标准质粒的鉴定

以1μL阳性标准质粒为模板，用表4所述的引物及反应体系进行多重PCR鉴定，反应程序为：预变性94℃4min；变性94℃30s、退火60℃30s、延伸72℃1.5min；72℃延伸5min。

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果应分别扩增出1558bp、1381bp、789bp和483bp大小的4个特异性条带(图4)，分别指示MDV-1疫苗株CVI988/Rispens的meq基因(L-meq)、MDV-1流行毒株的meq基因(S-meq)、HVT疫苗株FC-126的gB基因以及MDV-2疫苗株SB-1的gB基因。

其中，因为814疫苗株与CVI988/Rispens疫苗株的L-meq基因长度完全相同，基因序列高度保守，因此1558bp特异性条带还可以指示为814疫苗株的L-meq基因。

实施例3阳性参考毒株的多重PCR检测

同实施例2所述方法，分别提取MDV阳性参考毒株(MDV-1超强毒株GX0101、疫苗株CVI988/Rispens、MDV-2疫苗株SB-1以及HVT疫苗株FC-126)的细胞毒DNA，统一稀释至工作浓度为10ng/μL，以阳性标准质粒为对照，各取1μL DNA为模板，用表4所述的引物及反应体系，进行PCR扩增，最后用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果如图5所示。

检测结果显示：阳性标准质粒(PC)扩增出1558bp、1381bp、789bp和483bp大小的4个与预期相符的特异性条带，表明检测系统有效；同时SB-1、HVT、GX0101或CVI988单一血清型参考毒株DNA样品中均只扩增出与预期大小完全相符的单一条带，而两两组合的双重血清型混合参考毒株也均扩增出了与预期大小完全相符的两个特异性条带。对照多重PCR检测结果判定标准，可以得出检测结论：该多重PCR可以用于鉴别检测不同血清型MDV的流行毒株和疫苗株。

应用例1肉鸡群MD临床病例的多重PCR检测

1、病例样品的采集与处理

该病例来自某家禽养殖场地方品种肉鸡群，80日龄左右开始发病，发病率约35％，临床剖检11只发病鸡均出现不同程度的肝脾肿大，且个别鸡只的肝脏和脾脏呈现典型的疑似肿瘤灶。将11只发病鸡随机编号为A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10和A11，每只鸡各取脾脏样品约10mg置入1.5mL灭菌EP管，分别加入200μL PBS溶液，用冷冻组织研磨仪研磨3min，10000rpm离心1min，弃上清。按细胞/组织/血液基因组DNA提取试剂盒(TIAGEN)说明书操作，分别提取病鸡脾脏样品DNA，测定浓度并均稀释至10ng/μL，-20℃冻存待检。

表5 MDV-1/MDV-2/HVT多重PCR反应体系

2、多重PCR检测及结果分析

按照表5所述的多重PCR反应体系，以阳性标准质粒为对照，进行PCR扩增，反应程序为94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1.5min，进行30个循环；72℃延伸5min。

各取PCR产物5μL，分别点样于1％琼脂糖凝胶孔中，以2000bp DNA Marker作为标准分子量参照，以150V、300mA，1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，凝胶成像系统拍照分析结果(图6)。

分析方法：

(1)扩增阳性标准质粒时，扩增得到大小分别为1558bp、1381bp、789bp和483bp的4个特异性条带，分别指示MDV-1疫苗株CVI988/Rispens或814的L-meq基因、MDV-1流行毒株的S-meq基因、HVT疫苗株FC-126的gB基因以及MDV-2疫苗株SB-1的gB基因，表示检测系统正常有效；

(2)扩增待检样品的凝胶电泳仅出现1381bp条带时，说明待检样品存在MDV-1流行毒株感染，发病鸡群可诊断为MD病例；

(3)扩增待检样品的凝胶电泳出现1558bp条带时，说明待检样品免疫了MDV-1的CVI988/Rispens疫苗或814疫苗；

(4)扩增待检样品的凝胶电泳出现789bp条带时，说明待检样品免疫了HVT疫苗；

(5)扩增待检样品的凝胶电泳出现483bp条带时，说明待检样品免疫了MDV-2的SB-1疫苗。

(6)扩增待检样品的凝胶电泳同时出现1381bp和(3)-(5)预期大小的条带时，综合判断三种不同血清型MDV疫苗的免疫类型及野毒感染情况；

(7)扩增待检样品的凝胶电泳结果未出现任何条带时，说明未检测到MDV，但不能排除感染的可能，应结合样品来源鸡群的临床症状、剖检病变以及其他检测结果综合研判。

检测结果显示：阳性标准质粒(PC)扩增出1558bp、1381bp、789bp和483bp大小的4个与预期相符的特异性条带，表明检测系统有效；同时编号为A01～A11的待检病鸡脾脏DNA样品均扩增出1381bp大小的1个特异性条带。对照多重PCR检测结果判定标准，可以得出检测结论：该养殖场的鸡群因感染MDV-1流行毒株而发病。

应用例2蛋鸡群MD临床病例的多重PCR检测

1、病例样品的采集与处理

该病例来自某家禽养殖场蛋鸡群，120日龄左右送检，发病率约20％，临床剖检7只发病鸡均出现不同程度的肝脾肿大。将7只鸡随机编号为B01、B02、B03、B04、B05、B06和B07，每只鸡各取脾脏和肝样品约10mg置入1.5mL灭菌EP管，加入200μL PBS溶液，用冷冻组织研磨仪研磨3min，10000rpm离心1min，弃上清。按细胞/组织/血液基因组DNA提取试剂盒(TIAGEN)说明书操作，分别提取各脾脏和肝脏组织研磨液沉淀样品的DNA，测定浓度并均稀释至10ng/μL，-20℃冻存待检。

2、多重PCR检测及结果分析

按照表5所述的多重PCR反应体系，以阳性标准质粒为对照，进行PCR扩增，反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1.5min，进行30个循环；72℃延伸5min。各取PCR产物5μL，用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析(图7)。

检测结果显示：阳性标准质粒(PC)扩增出1558bp、1381bp、789bp和483bp大小的4个与预期相符的特异性条带，表明检测系统有效；同时编号为B01、B02、B03、B04、B05、B06和B07的7份脾脏或肝脏DNA样品中均扩增出483bp大小的特异性条带，其中编号为B01、B02、B04、B05、B06和B07的脾脏样品还扩增出1381bp的特异性条带，相应的肝脏样品除B-04未扩增出明显的1381bp特异性条带之外，其他样品的扩增条带均与脾脏样品一致。对照多重PCR检测结果判定标准，可以得出检测结论：该鸡群虽然免疫了MDV-2疫苗(SB-1株)，但仍因感染MDV-1流行毒株发病，提示该疫苗免疫失败(即SB-1疫苗株未能为MDV流行毒株提供足够的免疫保护)。

应用例3MDV分离株的多重PCR检测

1、病毒分离细胞培养物样品处理

健康或发病鸡抗凝血样品的处理：翅下静脉采集健康或发病鸡的抗凝血2～3mL(肝素钠抗凝)，编号后按鸡全血淋巴细胞分离液试剂盒说明书操作，分别提取鸡外周血淋巴白细胞，接种至提前准备好的CEF单层细胞，孵育3h后弃去淋巴白细胞，更换含2％FBS的M199培养基，38.5℃、5％CO₂培养箱培养5～7d，若第一代细胞未出现病毒噬斑可盲传至第二代和第三代，直至显微镜下观察出现典型的病毒噬斑，即可收集细胞。

对采集自不同养禽场发病鸡群的22份外周血淋巴白细胞样品孵育接种并盲传2代的CEF细胞培养物，随机编号为C01、C02、C03、C04、C05、C06、C07、C08、C09、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21和C22，按照细胞/组织/血液基因组DNA提取试剂盒(TIAGEN)说明书操作，分别提取细胞样品总DNA，测定浓度并均稀释至10ng/μL，-20℃冻存待检。

2、多重PCR检测及结果分析

按照表5所述的多重PCR反应体系，以阳性标准质粒为对照，以未接种鸡外周血淋巴白细胞的CEF为阴性对照，进行PCR扩增，反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1.5min，进行30个循环；72℃延伸5min。各取PCR产物5μL，用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析(图8)。

检测结果显示：阳性标准质粒(PC)分别扩增出1558bp、1381bp、789bp和483bp大小的4个符合预期的特异性条带，表明检测系统有效；同时编号为C02、C03、C16、C17和C19号样本均扩增出1558bp(即CVI988或814疫苗株的L-meq基因)的特异性条带，说明这些样品来源为CVI988或814疫苗免疫/感染鸡；C01、C02、C03、C07、C08、C10、C12、C16和C17号样本均扩增出483bp(即SB-1gB基因)的特异性条带，说明这些样品来源为SB-1疫苗免疫/感染鸡；C13、C14、C18和C20号样本仅扩增出一个大小为789bp的特异性条带(HVT gB基因)，说明这些样品来源为HVT疫苗免疫鸡；而C01、C04、C05、C06、C07、C08、C09、C10、C11、C12、C15、C16、C21和C22号细胞样本除了扩增出1558bp或483bp特异性条带之外，还均扩增出1381bp的特异性条带(即MDV-1流行毒株的S-meq基因)，说明这些发病鸡虽然经过MD疫苗免疫，但仍被MDV-1流行毒株感染而发病。

综上，本发明针对MDV-1流行毒株和疫苗株的meq基因、MDV-2疫苗株SB-1和HVT疫苗株FC-126的gB基因，设计了一组特异性的多重PCR扩增引物；同时分别构建了不同血清型MDV的meq和gB基因克隆质粒，通过优化后的最佳配比制备了阳性标准质粒；经过对PCR引物组合及反应条件进行优化，建立了一种可鉴别三种不同血清型MDV(MDV-1、MDV-2和HVT)感染与免疫的多重PCR方法，并将其很好的应用于多种临床样本(如健康或发病鸡的肝脏、脾脏、外周血淋巴细胞或病毒分离细胞培养物等)的检测，为MDV感染与免疫的鉴别诊断、分离株的分型鉴定及MD疫苗免疫效果评价提供了重要技术和方法。

从多个应用实例的检测及分析结果表明，本发明涉及的鉴别不同血清型马立克病病毒(MDV-1、MDV-2和HVT)感染与免疫的多重PCR方法操作简单、快速，临床组织或细胞样品的检测过程仅需2～3h即可完成，结果准确可靠。该方法适应性广，可用于多种不同类型的待检样品检测，而且一次性可以检测多份样品，具备高通量性，减少了人力资源的浪费。利用该多重PCR方法，不仅可以完成临床样品的快速检测和疑似病例的早期诊断，而且可以对实验室MDV细胞培养分离株的血清型进行快速分型鉴定，使得临床快筛检测结果更为准确，同时也可为鸡群MD疫苗的免疫效果评价提供重要依据。

序列表

<110> 河南省农业科学院

<120> 一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的多重PCR引物、方法及应用

<130> PCR反应

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tgctggaatg ttaagaataa attccgcac 29

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ttatctcata cttcggaact cctgg 25

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tgccccatac cgttgaacaa ttccgcc 27

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gcagaattcc atgagggtcg c 21

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cgcctcgtcc ggcaaggcca tcttga 26

Claims (7)

1.一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的多重PCR引物组合物，其特征在于，所述多重PCR引物组合物为：

引物对Meq-9F、Meq-11R，核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；

引物对SB-1-1F、SB-1-1R，核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

引物对SB-1-1F、HVT-8R，核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示；

所述引物对Meq-9F、Meq-11R扩增MDV-1超强毒株Md5的S-meq基因和MDV-1疫苗株CVI988/Rispens或疫苗株814的L-meq基因；引物对SB-1-1F、SB-1-1R扩增MDV-2疫苗株SB-1的gB基因；引物对SB-1-1F、HVT-8R扩增HVT疫苗株FC-126的gB基因。

2.一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1所述的多重PCR引物组合物。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性标准质粒、PCR反应预混液和ddH₂O；所述阳性标准质粒为pMD19-T-S-meq、pMD19-T-L-meq、pMD19-T-SB-1gB和pMD19-T-HVTgB；

所述阳性标准质粒的构建方法为：以pMD19-T为载体，分别构建MDV-1超强毒株Md5的S-meq基因、MDV-1疫苗株CVI988/Rispens或疫苗株814的L-meq基因、MDV-2疫苗株SB-1的gB基因、HVT疫苗株FC-126的gB基因的阳性质粒。

4.一种以非疾病诊断目的鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待检样品的DNA模板；

（2）以阳性标准质粒为对照，根据权利要求1所述的多重PCR引物组合物进行PCR扩增；所述阳性标准质粒为pMD19-T-S-meq、pMD19-T-L-meq、pMD19-T-SB-1gB和pMD19-T-HVTgB；

PCR反应体系为20 µL，包括PCR反应预混液10 µL、10 μM 的Meq-9F引物0.5 µL、10 μM的Meq-11R引物0.5 µL、10 μM 的SB-1-1F引物0.25 µL、10 μM 的SB-1-1R引物0.25 µL、10μM 的HVT-8R引物0.25 µL、待检样品DNA或阳性标准质粒1 µL，余量为ddH₂O；

（3）待检样品的结果鉴定：

1）扩增阳性标准质粒时，扩增得到大小分别为1558 bp、1381 bp、789 bp和483 bp的4个特异性条带，分别指示MDV-1疫苗株CVI988/Rispens或疫苗株814的L-meq基因、MDV-1超强毒株Md5的S-meq基因、HVT疫苗株FC-126的gB基因以及MDV-2疫苗株SB-1的gB基因，表示检测系统正常有效；

2）扩增待检样品的凝胶电泳仅出现1381 bp条带时，说明待检样品存在MDV-1流行毒株感染；

3）扩增待检样品的凝胶电泳出现1558 bp条带时，说明待检样品免疫了MDV-1的CVI988/Rispens疫苗或814疫苗；

4）扩增待检样品的凝胶电泳出现789 bp条带时，说明待检样品免疫了HVT疫苗；

5）扩增待检样品的凝胶电泳出现483 bp 条带时，说明待检样品免疫了MDV-2的SB-1疫苗。

5.如权利要求4所述的多重PCR检测方法，其特征在于，所述阳性标准质粒中pMD19-T-L-meq、pMD19-T-S-meq、pMD19-T-SB-1gB、pMD19-T-HVTgB的浓度均为10 ng/μL，pMD19-T-L-meq﹕pMD19-T-S-meq﹕pMD19-T-SB-1gB﹕pMD19-T-HVTgB的体积比为10﹕10﹕1﹕1；所述待检样品DNA的浓度为10 ng/μL。

6.如权利要求4所述的多重PCR检测方法，其特征在于，PCR反应程序为94℃预变性4min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共30个循环；72℃延伸5 min。

7.如权利要求1所述的多重PCR引物组合物在以非疾病诊断目的鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫中的应用。

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