KR100354972B1

KR100354972B1 - 닭전염성기관지염 바이러스 ｓ1 단백질을 발현하는유전자재조합 마렉바이러스 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100354972B1
Application number: KR20000019033A
Authority: KR
Inventors: 송창선; 이윤정; 성환우; 한명국; 김기석
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2000-04-11
Filing date: 2000-04-11
Publication date: 2002-10-05
Also published as: KR20010095727A

Abstract

본 발명은 닭전염성 기관지염바이러스(IBV)의 S1 유전자를 함유한 마렉 바이러스 type 2 (MDV2) 전이벡터와 이것으로 형질전환된 유전자재조합 마렉바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 닭전염성 기관지염바이러스의 S1 유전자를 함유한 신규한 MDV2 전이벡터와 1회 접종으로 IB와 마렉병을 동시에 막을 수 있는 신규한 닭전염성기관지염 바이러스 S1 단백질 발현 유전자재조합 마렉바이러스 및 그의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명에 의한 유전자재조합 마렉바이러스는 기존의 IB 생독백신의 단점을 보완한 국내 변이형 IB의 효과적 예방을 위한 유전자재조합 IB 생독벡터백신으로서, 국내형 닭전염성기관지염의 예방에 크게 기여할 것이다.

Description

닭전염성기관지염 바이러스 Ｓ1 단백질을 발현하는 유전자재조합 마렉바이러스 및 그의 제조방법{Recombinant Marek's disease virus type 2 expressing the S1 glycoprotein of infectious bronchitis virus and a method for constructing thereof}

본 발명은 가축질병 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 닭전염성 기관지염바이러스(IBV)의 S1 유전자를 함유한 마렉 바이러스 type 2 (MDV2) 전이벡터와 이 것으로 형질전환된 유전자재조합 마렉바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

닭전염성 기관지염은 코로나바이러스(Coronavirus)에 의해 호흡기질병, 산란저하, 신장염 등을 유발하는 질병으로서, 국내 양계산업에 많은 경제적 피해를 유발하고 있는 주요 생산성 저하 질병중의 하나이다.

코로나비리대속 코로나바이러스종에 속하는 전염성 기관지염바이러스 (infectious bronchitis virus ; 이하 IBV라 함)는 서로 다른 IBV 간의 재조합으로 인하여 변이형 바이러스가 생긴다는 사실이 실험적으로 확인되었고, 앞으로도 계속해서 새로운 혈청형의 IBV들이 출현할 가능성이 있으며, 이들 각 혈청형에서 변이된 변이형 바이러스까지 포함하면 그 종류는 수십종에 이를 것으로 추정되고 있다. 또한 이들 혈청형 간에는 상호 교차 반응이나 교차 면역이 되지 않기 때문에 변이형 IBV에 대한 신속한 진단 및 예방에는 많은 어려움이 따르게 된다.

또한 닭전염성 기관지염의 예방을 위하여 생독백신의 개발에 박차를 가하고는 있으나, 현재까지는 야외에서 분리된 IBV를 이용한 생독백신 제조에만 의존해 오고 있는 실정이다. 하지만 상기 방법은 병원성이 있는 IBV 야외분리주의 병원성을 약독화시키기 위해 IBV 분리주를 특정질병부재(SPF) 종란에서 100대 이상 맹목 계대한 후 바이러스의 병원성 및 면역원성 등을 확인하는 과정을 거쳐 생독백신을 제조하는 방법으로서( Avian Disease 1981, 25 : 655-666 ), 생독백신 개발에 2∼3 년이라는 장기간의 개발기간이 소요될 뿐만 아니라, 부작용이 심하고 생독백신의사용 자체가 새로운 변이형 바이러스의 출현을 야기시키는 문제점이 있기 때문에 기존의 생독백신을 대체할 수 있는 안전한 차세대 생독백신의 개발이 절실한 실정이다.

현재 전세계적으로 유용 유전자를 이용한 바이러스 벡터백신의 개발은 실용화 단계에 접근해 있으며, 최근 뉴캣슬병 F 단백을 이용한 MDV type 3 (HVT) 바이러스 벡터 백신이 개발되어 상품화된 바 있다 ( Avian Disease 1996, 40 : 770-777 ).

본 발명자들은 현재 국내에서 유행중인 변이형 전염성 기관지염(IB)의 감염피해를 최소화 하고 기존의 IBV 생독백신의 단점을 극복하고 이를 대체할 수 있는 안전하고 효과가 우수한 차세대 IBV 유전자재조합 백신을 개발하기 위한 연구를 수행한 결과, IBV 구성 단백중 중화능과 관련이 있는 S1 단백질을 S1 유전자 단독으로 마렉바이러스 벡터를 이용하여 발현시키고 그 방어면역 효과를 숙주동물인 닭에서 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 닭전염성 기관지염바이러스(IBV)의 S1 유전자를 함유한 신규한 마렉 바이러스 type 2 (MDV2) 전이벡터 및 1회 접종으로 IBV와 마렉병을 동시에 막을 수 있는 신규한 닭전염성기관지염 바이러스 S1 단백질 발현 유전자재조합 마렉바이러스를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 닭전염성기관지염 바이러스 S1 단백질을 발현 하는 유전자재조합 마렉바이러스를 제조하는 새로운 방법을 제공함에 있다.

도 1은 MDV 유전자 구조 및 외래 유전자 삽입부위를 나타낸 도해,

도 2는 IBV S1 유전자 전달수용체인 pKGFKM의 제작과정,

도 3은 유전자재조합 MDV에 의해 IBV S1 단백질이 발현됨을 확인한 결과,

도 4는 MDV2 게놈내의 GFP-IBV S1 융합 단백질 발현 카세트의 접합위치를 확인하기 위한 PCR 분석결과,

도 5는 IBV KM91 주의 S1 당단백질에 특이적인 IBV 단크론항체(MAb)를 이용한 웨스턴블랏 실시결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 닭전염성 기관지염바이러스(IBV)의 S1 유전자를 함유한 마렉 바이러스 type 2 (MDV2) 전이벡터 pKGFKM 및 닭전염성 기관지염바이러스(IBV)의 S1 유전자를 함유한 마렉 바이러스 type 2 (MDV2) 전이벡터 pKGFKM로 형질전환된 닭전염성기관지염 바이러스 S1 단백질을 발현하는 유전자재조합 마렉바이러스임을 특징으로 한다.

본 발명에 사용된 유전자재조합 마렉바이러스(rMDV2)의 모주는 마렉 바이러스 type 2 (MDV2)의 HPRS24주가 사용되고, MDV2와 rMDV2는 계태아 섬유아세포(CEF)의 단일층에서 증식되는데, 증식배지로는 5% M199 배지(GibcoBRL), 5% HAM F10 배지(GibcoBRL) 또는 3% 송아지혈청과 항생물질이 첨가된 10% 트립토스 포스페이트 브로스(Difco)를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 IBV S1 단백 발현에 이용된 바이러스 벡터는 마렉 바이러스 type 2 (MDV2) HPRS24주의 US3(PK) 유전자를 외래 유전자 삽입부위로 선택한 것으로, 상기 PK 유전자에 바이러스 중화능이 있는 IBV S1 유전자를 삽입한 후 생산된 유전자재조합 마렉 바이러스(rMDV2)를 이용하여 재조합 IBV S1 단백 발현을 확인하고 마렉 바이러스 type 2 바이러스내 PK 유전자가 비 필수적 유전자임을 밝혀내었다.

본 발명에 의한 MDV2 전이벡터 pKGFKM는 pCRⅡ/KMS1으로부터 분리한 IBVKM91 주의 S1 유전자를 pEGFP-C1에 클로닝하여 pEGFP/KMS1을 제작하고, pEGFP/KMS1으로부터 분리해 얻은 GFP-IBV S1 융합단백질 발현 카세트를 MDV2 US3 유전자를 함유하고 있는 pBluePK에 삽입시켜 제조한다. 상기 IBV KM91주의 S1 유전자는 국립수의과학검역원에서 1991년도 야외농장에서 분리한 국내분리주 KM91 바이러스의 S1유전자를 PCR을 이용하여 증폭한 것로서 상기 유전자는 본 발명자(Journal of General Virology 1998, 79: 719-723)가 이미 발표한 것과 동일하다.

또한 본 발명은 닭전염성 기관지염바이러스(IBV)의 S1 유전자를 함유한 마렉 바이러스 type 2 (MDV2) 전이벡터 pKGFKM로 형질전환된 닭전염성기관지염 바이러스 S1 단백질을 발현하는 유전자재조합 마렉바이러스 및 이의 제조방법을 포함한다.

상기 본 발명의 유전자재조합 마렉바이러스의 제조방법은 상기 소정량의 재조합 벡터 pKGFKM과 게노믹(genomic) MDV HPRS24 DNA를 유전자 전달장치를 이용하여 상온에서 적절한 크기로 조절된 전기장의 조건하에 일렉트로포레이션 (electroporation)방법에 의하여 CEF세포에 코트랜스펙션(cotransfection)하는 방법으로 행하는 것이 바람직하다. 하지만 상기 방법에 사용되는 DNA의 함량, 유전자 전달장치, 온도 및 전기장의 조건은 특별한 것으로 한정을 요하는 것은 아니며 당업자에 의하여 적절한 조건을 필요에 맞게 셋업하여 사용하는 것이 가능하다.

본 발명에 의한 닭전염성 기관지염 바이러스 S1 단백질을 발현하는 상기 유전자재조합 마렉바이러스(rMDV2-US3S1)는 2000.3.17일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁번호 KFCC-11154로 기탁되었다.

이하 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 이들실시예 및 시험예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것으로 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> MDV2 전이벡터(transfer vector) pKGFKM의 제작

전이벡터 플라즈미드는 도 2에 도시한 바와 같은 공정에 의하여 제작하였다. pEGFP/KMS1을 제작하기 위하여 PCR을 이용하여 증폭시킨 IBV KM91주의 S1 유전자를 pCRⅡ 벡터(Invitro사)에 클로닝하여 pCRⅡ/KMS1 벡터를 제작하였으며, 제작된 pCRII/KMS1을 제한효소 BamHI으로 처리한 후, IBV KM91 주의 S1 유전자를 pEGFP-C1(Clonetech 사)의 유일한 BamHⅠ 위치에 클로닝하였다.

상기 pEGFP/KMS1은 인간의 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 프로모우터의 통제하에 있는 GFP-IBV S1 융합단백질 발현 카세트를 함유하고 있다.

전이벡터 플라즈미드인 pKGFKM을 제작하기 위하여, 제한효소인 MluⅠ과 NsiⅠ을 이용하여 pEGFP/KMS1으로부터 분리해 얻은 GFP-IBV S1 융합단백질 발현 카세트를 MDV2 유전자중 US3 부위를 포함하고 있는 5.4kb의 유전자를 pBluescript 벡터(Stratagene사)에 클로닝하여 제작한 pBluePK의 EcoRⅤ위치에 삽입시켰다.

이에 의하여 MDV2 시퀀스의 US3부위내에 GFP-IBV S1 융합단백질 발현 카세트가 위치지워진 전이벡터 플라즈미드인 pKGFKM을 얻을 수 있었다.

<실시예 2> 트랜스펙션(Transfection)과 재조합 MDV2의 동정

실시예 1에서 얻은 pKGFKM 4㎍과 전체 길이의 게노믹 MDV HPRS24 DNA 40㎍을유전자 전달장치(Gene Pulser, Bio-Rad co., LTD)를 이용하여 상온에서 1KV/㎝의 전기장의 조건하에 일렉트로포레이션(electroporation)방법에 의하여 CEF세포에 코트랜스펙션(cotransfection)하였다.

트랜스펙션이 있은 후 7일간의 배양 후에 형광 마이크로스코피를 이용하여 세포들을 스크린하여 GFP를 발현하는 플라그를 동정하고 다시 새로운 CEF 세포에 이들을 도말하였다. 이로 인하여 얻어진 플라그들을 형광 마이크로스코피를 이용하여 다시 선발하였으며, 이러한 과정을 대부분의 플라그들이 GFP발현체로 될 때까지 수회 반복실시하였다. 이런 과정을 거쳐 얻어진 감염세포는 초음파처리를 통하여 세포가 제거된 재조합체(rMDV2-US3S1)를 얻었다.

<실시예 3> 면역 염색법에 의한 재조합 MDV(rMDV2) 플라그의 동정

GFP-IBV S1 융합 단백질을 발현하는 재조합 MDV 플라그는 IBV KM91 종의 S1 당단백질에 특이적인 IBV 단크론항체인 MAb를 이용하여 아비딘-바이오틴 복합체(ABC) 염색에 의하여 동정하였다.

도 3은 상기 실험결과를 보여주는 것으로 이에 의하면 rMDV2가 GFP-IBV 융합단백질을 발현하고 있는 것을 확인할 수 있다.

<실시예 4> PCR 분석

MDV2 게놈내의 GFP-IBV S1 융합 단백질 발현 카세트의 접합위치를 확인하기 위하여 PCR 분석을 실시하였다.

PCR은 퍼킨-엘머 9600(Perkin-elmer 9600)을 이용하여 93도에서 2분 pre-denature후 93도 10초, 50도 30초, 68도 5분의 조건으로 30 싸이클 반응시켰는데, 이때 탁 폴리머라제(Taq polymerase)는 BM Expand long PCR 키트를 사용하였다.

프라이머 PK F (서열번호 1)와 PK R (서열번호 2)을 이용할 경우 야생 HPRS24주는 약 300bp 정도의 유전자가 증폭되었으며, 재조합 바이러스의 경우 약 3.5kb 정도의 유전자가 증폭된 것을 확인할 수 있었다.

PCR 분석결과는 도 4에 나타난 바와 같으며, 이에 의하면 GFP-IBV S1 융합 단백질 발현 카세트가 MDV2의 US3부위에 안정하게 삽입되어져 있는 것을 확인 할 수 있다. 상기 도 4에서 M은 1kb DNA 래더, 1은 야생 MDV(HPRS24)주, 2는 rMDV이고 3은 pKGFKM의 PCR 분석결과를 나타낸 것이다.

<실시예 5> 웨스턴 블랏 분석

rMDV2로 감염된 CEF세포내에서의 GFP-IBV S1 융합 단백질의 발현을 실시예 3에서와 같은 IBV KM91 주의 S1 당단백질에 특이적인 IBV 단크론항체( MAb)를 이용하여 웨스턴블랏을 실시하여 확인하였다.

IB 바이러스와 rMDV2가 감염된 CEF 세포, 감염되지 않는 CEF 세포를 12% SDS-PAGE에서 오버나잇으로 분리하였다(Hoeffer SE600). 분리된 단백질을 니트로셀룰로우즈 막에 전이시킨 후, IBV에 대한 특이 단크론성항체를 이용하여 염색하였다.

도 5에서 보는 바와 같이, GFP-IBV S1 융합 단백질이 IBV의 S1 당단백질에 특이적인 MAb와 반응하고 있으며 원래의 IBV S1 당단백질의 분자량보다는 다소 높게 나타나고 있음을 보여주고 있다. 도 5에서 레인 1은 M_r마커, 레인 2는 KM91에 감염된 요낭액(allantoic fluid), 레인 3은 rMDV2에 감염된 세포, 레인 4는 야생주의 MDV(HPRS24)에 감염된 세포의 웨스턴 블랏 분석결과를 나타낸 것이다.

<시험예 1> 유전자재조합 MDV의 SPF 닭에 대한 MDV의 면역원성

실시예 2에서 얻은 rMDV2의 마렉병에 대한 면역원성을 알아보기 위하여 숙주동물인 SPF 닭에서의 방어면역 효과를 1일령 병아리에 피하로 백신한 후 1주일 후에 야외 강독 MDV 바이러스로 공격접종하여 측정한 결과를 표 1에 나타내었다.

<표 1> 유전자재조합 MDV의 SPF 닭에 대한 MDV의 면역원성

바이러스	도시지(PFU)	방어면역율(%)
rMDV2-US3S1	200	8/10 (80)
rMDV2-US3S1	2,000	10/10 (100)
HPRS24	2,000	10/10 (100)
HVT	2,000	10/10 (100)
대조구	-	0/10 (0)

* HPRS24 ( MDV type 2 virus )

HVT ( Herpes virus of Turkey ; MDV type 3 virus )

<시험예 2> 유전자재조합 MDV의 SPF 닭에 대한 IBV의 면역원성

실시예 2에서 얻은 rMDV2의 전염성 기관지염(IB)에 대한 면역원성을 알아보기 위하여 숙주동물인 SPF 닭에서의 방어면역 효과를 1일령 병아리에 피하로 백신한 후 3주일 후에 야외 강독 IBV 바이러스로 공격접종하여 측정한 방법으로 검정한 결과를 표 2에 나타내었다.

<표 2> 유전자재조합 MDV의 SPF 닭에 대한 IBV의 면역원성

바이러스	투여방법	도시지(PFU)	방어면역율(%)
바이러스	투여방법	도시지(PFU)	신 장	기 관 지
rMDV2-US3S1	S.C.	10,000	8/10 (80)	7/10 (70)
IBV KM91p130	O.C.	10^4.5	10/10 (100)	10/10 (100)
IBV H120	O.C.	10^4.5	3/10 (30)	3/10 (30)
대조구	-	-	0/10 (0)	0/10(0)

* IBV H120 : 생독 IB백신

IBV KM91p130 : ( IBV KM91주를 계란에 130대 계대배양한 바이러스 )

S.C. : ( Subcutaneous ; 피하접종 )

O.C. : ( Intra-Ocular route : 점안접종 )

본 발명에 의한 닭전염성기관지염 바이러스 S1 단백 발현 유전자재조합 마렉바이러스는 기존의 IB 생독백신의 단점을 보완한 국내 변이형 IB의 효과적 예방을 위한 유전자재조합 IB 생독벡터백신으로서, 국내형 닭전염성기관지염의 예방에 크게 기여할 것이다.

Claims

닭 전염성 기관지염 바이러스(IBV)의 S1 유전자를 함유한 마렉 바이러스 type 2(MDV2) 전이벡터 pKGFKM으로서 도 2에 기재된 개열지도를 갖는 벡터
닭전염성 기관지염바이러스(IBV)의 S1 유전자를 함유한 마렉 바이러스 type 2 (MDV2) 전이벡터 pKGFKM로 형질전환된 닭전염성기관지염 바이러스 S1 단백질을 발현하는 유전자재조합 마렉바이러스 rMDV2-US3S1 (KFCC 11154)
닭전염성 기관지염바이러스(IBV)의 S1 유전자를 함유한 마렉 바이러스 type 2 (MDV2) 전이벡터 pKGFKM와 게노믹 MDV HPRS24 DNA를 일렉트로포레이션법에 의하여 CEF세포에 코트랜스펙션하는 것을 특징으로 하는 닭전염성기관지염 바이러스 S1 단백질을 발현하는 유전자재조합 마렉바이러스 rMDV2-US3S1 (KFCC 11154)의 제조방법