ES2719409T3 - Vectores recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (mdv serotipo 2) que expresan antígenos de patógenos aviares y usos de los mismos - Google Patents

Vectores recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (mdv serotipo 2) que expresan antígenos de patógenos aviares y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Una composición o vacuna para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmunógena o protectora en un animal contra uno o más patógenos aviares, comprendiendo dicha composición o vacuna un vector de la cepa SB-1 de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) recombinante, comprendiendo dicho vector uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar, en la que el polinucleótido heterólogo codifica la proteína del virus de la enfermedad de Newcastle NDV-F, en la que dicho procedimiento comprende al menos una administración de dicha composición o vacuna.

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (mdv serotipo 2) que expresan antígenos de patógenos aviares y usos de los mismos
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
[0001] Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos 61/564.877 presentada el 30 de noviembre de 2011 y la solicitud provisional de Estados Unidos 61/694.957 presentada el 30 de agosto de 2012.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0002] La invención se refiere a vectores virales recombinantes para la inserción y expresión de genes extraños para su uso como vehículos de inmunización seguros para la protección contra una diversidad de patógenos. También se refiere a una composición o vacuna multivalente que comprende uno o más vectores virales recombinantes para la protección contra una diversidad de patógenos. En el presente documento también se describen procedimientos para producir y utilizar vectores virales recombinantes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0003] La vacunación de aves de corral se usa ampliamente para proteger las manadas de aves de corral contra enfermedades devastadoras incluyendo la enfermedad de Newcastle (ND), la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBD), la enfermedad de Marek (MD), la bronquitis infecciosa (IB), la laringotraqueítis infecciosa (ILT) y la gripe aviar (AI). La ND es causada por el paramixovirus 1 aviar (APMV-1), también denominado virus ND (NDV) que pertenece a la familia Paramyxoviridae. La MD es causada por el herpesvirus gallináceo 2 (familia Herpesviridae), también denominado como virus de MD de serotipo 1 (MDV1). La IB es causada por el virus IB (IBV) que pertenece a la familia Coronaviridae, la ILT es causada por el herpesvirus gallináceo 1 (familia Herpesviridae), también denominado virus ILT (ILTV) y la IA es causada por el virus A i (AIV) que pertenece a la familia Orthomyxoviridae.
[0004] Se han propuesto varios vectores virales recombinantes aviares con el fin de vacunar a las aves contra estos patógenos aviares. Los vectores virales utilizados comprenden virus avipox, especialmente la viruela aviar (documento EP-A-0.517.292), virus de Marek, tal como los serotipos 2 y 3 (HVT) (documento WO-A-87/04463), o como alternativa, ITLV, NDV y adenovirus aviares. Cuando algunos de estos vectores virales recombinantes aviares se utilizaron para la vacunación, mostraron niveles variables de protección.
[0005] Se han desarrollado y autorizado varios vectores de herpesvirus recombinantes de pavos (HVT, también denominados Meleagrid herpesvirus 1 o MDV serotipo 3) que expresan antígenos de diversos patógenos (patentes de Estados Unidos N.° 5.980.906, 5.853.733, 6.183.753, 5.187.087) incluyendo IBDV, NDV, ILTV y AIV. De particular interés es un gen protector de VP2 de IBDV que expresa el vector HVT que ha mostrado claras ventajas sobre las vacunas contra la IBD clásicas (Bublot et al J.Comp. Path.2007, Vol.137, S81-S84). Otros vectores de HVT de interés son aquellos que expresan el gen o los genes protectores contra NDV (Morgan et al 1992, Avian dis. 36, 858-70) o ILTV (Johnson et al, 2010 Avian Dis 54, 1251-1259). Uno de los problemas prácticos de usar varias vacunas recombinantes basadas en HVT juntas es su interferencia. La protección más baja se induce al menos contra una de las enfermedades cuando se mezclan dos recombinantes HVT que expresan diferentes antígenos (Rudolf Heine 2011; Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vaccines which May Cause an Effect on the Economic Benefits of those Vaccines; artículo presentado en la XVII World Veterinary Poultry Association (WVPA) Congress en Cancún, México, 14-18 de agosto de 2011; Slacum G, Hein R. y Lynch P., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek's disease vaccines, 58th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, CA, EE.UU., 23-25 de marzo, pág. 84).
[0006] La combinación de HVT y SB-1, una cepa de vacuna contra el herpesvirus gallináceo 3 (MDV serotipo 2 o MDV-2), ha mostrado un efecto sinérgico en la protección contra la MD (Witter y Lee, 1984, Avian Pathology 13, 75-92). Para abordar el problema de la interferencia, es de interés evaluar el virus SB-1 como un vector de vacuna para expresar el antígeno o antígenos protectores que podrían ser compatibles con el vector HVT y mejorar la protección contra MD.
[0007] El genoma de SB-1 se clonó y se caracterizó en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) (Petherbridge, et al., J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009; Singh et al., Research in Veterinary Science 89, 140-145, 2010). La secuencia de SB-1 de MDV2 se obtuvo y analizó recientemente (Spatz y Schat, Virus Gene 42, 331-338, 2011). Se describió una deleción de la glucoproteína E del virus SB-1 por Petherbridge et al. (J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009). Sin embargo, no se ha indicado ninguna investigación que use SB-1 como un vector viral que exprese genes protectores extraños.
[0008] Se ha demostrado que tanto los genes de la proteína cinasa Ul13 como de la glucoproteína C (Ul44) son esenciales para la transmisión horizontal de MDV en pollos (Jarosinski, et al., J. of Virology 81, 10575-10587, 2007; Jarosinski, et al., J. of Virology 84, 7911-7916, 2010).
El documento EP1298139 describe vacunas recombinantes basadas en el virus del herpes aviar, que enseñan diversas posiciones para insertar antígenos heterólogos y procedimientos para determinar regiones no esenciales. También se describe un vector recombinante que contiene el gen heterólogo de VP2 de IBDV, que puede mezclarse con una vacuna que consiste principalmente en MDV-3. Sin embargo, el documento EP1298139 no enseña el uso de SB-1 para expresar un transgén NDV-F, ni el uso médico de un vector MDV-2.
[0009] Teniendo en cuenta el efecto potencial de los patógenos animales, tales como NDV e IBDV en la salud pública veterinaria y la economía, se necesitan procedimientos eficientes para prevenir la infección y proteger a los animales. Existe la necesidad de una solución de vacunas vectoriales eficaces combinadas y un procedimiento adecuado para fabricar la vacuna que pueda aliviar el problema de la interferencia observada entre 2 vacunas vectoriales basadas en HVT.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0010] En una primera realización, la invención es una composición o vacuna para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmunógena o protectora en un animal contra uno o más patógenos aviares, comprendiendo dicha composición o vacuna un vector de la cepa SB-1 de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) recombinante, comprendiendo dicho vector uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar, en la que el polinucleótido heterólogo codifica la proteína del virus de la enfermedad de Newcastle NDV-F, en la que dicho procedimiento comprende al menos una administración de dicha composición o vacuna.
[0011] En una segunda realización, la invención es un vector recombinante de la cepa SB-1 de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica una proteína del virus de la enfermedad de Newcastle NDV-F, un promotor, y una señal de poliadenilación; en el que
(a) el polinucleótido heterólogo es un polinucleótido NDV-F VIId de tipo silvestre, el promotor es un promotor IE del citomegalovirus de ratón (mCMV IE) y la señal de poliadenilación es una señal de poliadenilación del virus de simio 40 (SV40), adicionalmente, en el que el polinucleótido heterólogo codifica NDV-F se inserta en la región entre ORF SORF4 y ORF US10 del vector de la cepa SB-1 del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2); o
(b) el polinucleótido heterólogo es un polinucleótido NDV-F VIId optimizado por codones, el promotor es un promotor SV40 y la señal de poliadenilación es SEQ ID NO: 13, adicionalmente, en el que el polinucleótido heterólogo que codifica NDV-F se inserta en la región entre ORF UL55 y ORF LORF5 en la región única larga (UL) del vector de la cepa SB-1 del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2); o
(c) el polinucleótido heterólogo es un polinucleótido NDV-F VIId optimizado por codones, el promotor es un promotor SV40 y la señal de poliadenilación es endógena originada en el gen de la glucoproteína C (gC), adicionalmente, en el que el polinucleótido heterólogo que codifica NDV-F se inserta en la región que codifica la glucoproteína C (UL44) del vector de la cepa SB-1 del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2); o
(d) el polinucleótido heterólogo es un polinucleótido NDV-F V (cepa CA02) optimizado por codones, el promotor es un promotor SV40 y la señal de poliadenilación es SEQ ID NO: 13, adicionalmente, en el que el polinucleótido heterólogo que codifica NDV-F se inserta en la región entre ORF UL55 y ORF LORF5 en la región única larga (UL) del vector de la cepa SB-1 del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2); o
(e) el polinucleótido heterólogo es un polinucleótido NDV-F V (cepa CA02) optimizado por codones, el promotor es un promotor SV40 y la señal de poliadenilación es endógena originada en el gen de la glucoproteína C (gC), adicionalmente, en el que el polinucleótido heterólogo que codifica NDV-F se inserta en la región que codifica la glucoproteína C (UL44) del vector de la cepa SB-1 del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2).
[0012] La presente invención demostró por primera vez un vector viral recombinante de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) que protege contra un patógeno de aves de corral más allá del virus de la enfermedad de Marek.
[0013] La presente invención mostró un resultado sorprendente cuando se usaron vacunas multivalentes para proteger a los animales contra una diversidad de patógenos aviares.
[0014] La presente invención se refiere a un vector recombinante de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) que comprende uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar. En el presente documento se describe un vector recombinante de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) que comprende un gen mutado de la glucoproteína C (gC).
[0015] En el presente documento se describe una composición o vacuna que comprende uno o más vectores recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar. En el presente documento se describe adicionalmente una composición para vacuna que comprende uno o más vectores de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) que comprenden un gen mutado de la glucoproteína C (gC).
[0016] En el presente documento se describe una composición o vacuna polivalente que comprende: i) un vector recombinante de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) que comprende polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar, o que comprenden un gen mutado de la glucoproteína C (gC); y ii) al menos uno de: un vector HVT recombinante (o MDV-3 o Meleagrid herpesvirus 1) que comprende polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar; o HVT de tipo silvestre (MDV-3); o vector recombinante de MDV serotipo 1 (es decir, MDV-1, herpesvirus 2 gallináceo) que comprende polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar; o cualquier m DV-1 de tipo silvestre.
[0017] En el presente documento se describe un procedimiento para vacunar a un animal, o inducir una respuesta inmunógena o protectora en un animal, que comprende al menos una administración de la composición o vector de la presente invención.
[0018] La presente invención proporciona además loci de inserción específicos para la introducción de uno o más polinucleótidos aislados en regiones no esenciales del genoma de SB-1.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0019] La siguiente descripción detallada, dada a modo de ejemplo, y que no pretende limitar la invención a realizaciones específicas descritas, puede entenderse junto con las figuras adjuntas, en las que:
La Figura 1 es una tabla que muestra la SEQ ID NO asignada a cada secuencia de ADN y de proteínas.
La Figura 2 muestra un diagrama esquemático de la organización del genoma de SB-1.
La Figura 3 representa la tinción inmunofluorescente del virus recombinante vSB 1-004 que expresa la proteína NDV-F.
La Figura 4 representa la representación esquemática de los sitios de unión al cebador.
La Figura 5 muestra los resultados de la PCR de la identificación de vSB1-004.
La Figura 6 muestra la tinción inmunofluorescente del virus recombinante vSB 1-006 que expresa la proteína NDV-F. La Figura 7 representa la representación esquemática de los sitios de unión al cebador en vSB1-006.
La Figura 8 muestra los resultados de PCR de vSB 1-006.
La Figura 9 representa la tinción inmunofluorescente del virus recombinante SB1-007 que expresa la proteína NDV-F.
La Figura 10 representa el diagrama esquemático de la ubicación del cebador en el plásmido donante pSB1 44 cds SVOptF.
La Figura 11 muestra los resultados de la PCR de vSB1-007.
La Figura 12 representa la tinción inmunofluorescente del virus recombinante SB1-008 que expresa la proteína NDV-F.
La Figura 13 representa la representación esquemática de los sitios de unión al cebador.
La Figura 14 muestra los resultados de la PCR de vSB1-008.
La Figura 15 representa el análisis de Western blot de una muestra inmunoprecipitada de células infectadas con vSB 1-009.
La Figura 16 muestra la inmunoprecipitación y la Western blot de vHVT114.
La Figura 17 representa el análisis clínico (porcentaje de aves que propagan el virus de exposición) de los recombinantes frente a la exposición a NDV de CA02 y ZJ1.
La Figura 18 representa el análisis clínico (propagación orofaríngea) de los recombinantes frente a la exposición a NDV.
La Figura 19 muestra el alineamiento de secuencias y el porcentaje de identidad de secuencia.
La Figura 20 muestra las secuencias de ADN y de proteínas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0020] Se observa que en esta descripción, y particularmente en las reivindicaciones, términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares, pueden tener el significado que se le atribuye en la Ley de Patentes de EE.UU.; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "incluyendo" y similares; y que términos tales como "que consisten esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de EE.UU., por ejemplo, permiten elementos no mencionados explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.
[0021] A menos que se indique otra cosa, los términos técnicos se usan según el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes V. publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensiva Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La palabra "o" significa cualquier miembro de una lista en particular y también incluye cualquier combinación de miembros de esa lista.
[0022] El término "animal" se usa en el presente documento para incluir a todos los mamíferos, aves y peces. El animal, como se usa en el presente documento, puede seleccionarse del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballo), canino (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos, incluyendo guepardos y linces), bovinos (por ejemplo, ganado), porcinos (por ejemplo, cerdos), ovinos (por ejemplo, ovejas, cabras, llamas, bisontes), aves (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emú y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tarsero, mono, gibón, simio), seres humanos y peces. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluidas las etapas embrionarias y fetales.
[0023] Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos consecutivos.
[0024] El término "ácido nucleico", "nucleótido" y "polinucleótido" se usan de manera intercambiable y se refiere a ARN, ADN, ADNc o ARNc, y derivados de los mismos, tales como que contienen esqueletos modificados. Debe apreciarse que la invención proporciona polinucleótidos que comprenden secuencias complementarias a las descritas en el presente documento. El "polinucleótido" contemplado en la presente invención incluye tanto la cadena directa (5' a 3') como la cadena complementaria inversa (3' a 5'). Los polinucleótidos según la invención pueden prepararse de diferentes maneras (por ejemplo, por síntesis química, por clonación génica, etc.) y pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, lineal o ramificada, monocatenaria o bicatenaria, o un híbrido de las mismas, cebadores, sondas, etc.).
[0025] El término "ADN genómico", o "genoma" se usan indistintamente y se refieren a la información genética hereditaria de un organismo huésped. El ADN genómico comprende el ADN del núcleo (también denominado ADN cromosómico) pero también el ADN de los plástidos (por ejemplo, cloroplastos) y otros orgánulos celulares (por ejemplo, mitocondrias). El ADN genómico o genoma contemplado en la presente invención también se refiere al ARN de un virus. El ARN puede ser una cadena positiva o un ARN de cadena negativa. El término "ADN genómico" contemplado en la presente invención incluye las secuencias que contienen ADN genómico complementarias a las descritas en el presente documento. El término "ADN genómico" también se refiere a ARN mensajero (ARNm), ADN complementario (ADNc) y ARN complementario (ARNc).
[0026] El término "gen" se usa ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes o polinucleótidos incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o solo las secuencias de codificación como en los ADNc, tal como un marco de lectura abierto (ORF), partiendo del codón de inicio (codón de metionina) y terminando con una señal de terminación (codón de parada). Los genes y los polinucleótidos también pueden incluir regiones que regulan su expresión, tal como el inicio de la transcripción, la traducción y la terminación de la transcripción. Por lo tanto, también se incluyen los promotores y las regiones de unión al ribosoma (en general, estos elementos reguladores se encuentran aproximadamente entre 60 y 250 nucleótidos aguas arriba del codón de inicio de la secuencia de codificación o gen; Doree S M et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.), terminadores de la transcripción (en general, el terminador se encuentra en aproximadamente 50 nucleótidos aguas abajo del codón de parada de la secuencia de codificación o gen; Ward C K et al.). Gen o polinucleótido también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.
[0027] El término "ADN heterólogo", como se usa en el presente documento, se refiere al ADN derivado de un organismo diferente, tal como un tipo de célula diferente o una especie diferente del receptor. El término también se refiere a un ADN o fragmento del mismo en el mismo genoma del ADN huésped en el que el ADN heterólogo se inserta en una región del genoma que es diferente de su ubicación original.
[0028] Como se usa en el presente documento, el término "antígeno" o "inmunógeno" significa una sustancia que induce una respuesta inmune específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o porción de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunógenas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmunitaria tras la presentación en un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno, o cualquier combinación de los mismos. Como alternativa, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.
[0029] El término "proteína o péptido inmunógeno", como se usa en el presente documento, incluye polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que, una vez administrado al huésped, es capaz de provocar una respuesta inmunitaria de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por lo tanto, un fragmento de proteína según la invención comprende o consiste esencialmente en o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. Una proteína "inmunógena" o polipéptido, como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma, o fragmentos inmunógenos de la misma. Por "fragmento inmunógeno" se refiere a un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y, por lo tanto, provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Dichos fragmentos pueden identificarse utilizando cualquier número de técnicas de cartografía de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando simultáneamente grandes cantidades de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos todavía están unidos a los soportes. Dichas técnicas se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, las Pat. de Estados Unidos N.° 4.708.871. De manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente mediante la determinación de la conformación espacial de los aminoácidos, tal como, por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, anteriormente.
[0030] El término "proteína o péptido inmunogénico" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones a la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica como se define en el presente documento. El término "variación conservadora" representa el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o el reemplazo de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal forma que el residuo de aminoácido codificado no cambie o sea otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservadora, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos generalmente se dividen en cuatro familias: (1) ácidos: aspartato y glutamato; (2) básicos: lisina, arginina, histidina; (3) no polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga: glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina para la asparagina; o un reemplazo conservador similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente que no tendrá un efecto importante en la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término "variación conservadora" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido principal no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también reaccionen de forma inmunitaria con el polipéptido no sustituido.
[0031] El término "epítopo" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al que responden los linfocitos B y/o linfocitos T específicos. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo se pueden identificar en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.
[0032] Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Normalmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero sin limitación, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, linfomas B, linfomas T auxiliares y/o linfomas T citotóxicos, dirigida específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped mostrará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora de tal manera que la resistencia a una nueva infección aumentará y/o la gravedad clínica de la enfermedad se reducirá. Dicha protección se demostrará mediante una reducción o falta de síntomas que se muestra normalmente por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral reducido en el huésped infectado.
[0033] Los términos "recombinante" y "modificado genéticamente" se usan de manera intercambiable y se refieren a cualquier modificación, alteración o diseño de un polinucleótido o proteína en su forma o estructura nativa, o cualquier modificación, alteración o diseño de un polinucleótido o proteína en su entorno nativo o alrededores. La modificación, alteración o diseño de un polinucleótido o proteína puede incluir, pero sin limitación, la deleción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, la deleción de un gen completo, la optimización por codones de un gen, la sustitución conservadora de aminoácidos, la inserción de uno o más polinucleótidos heterólogos.
[0034] Los términos "vacuna o composición polivalente", "combinación o combinación de vacuna o composición" y "vacuna o composición multivalente" se usan indistintamente para referirse a una composición o vacuna que contiene más de una composición o vacunas. La vacuna o composición polivalente puede contener dos, tres, cuatro o más composiciones o vacunas. La vacuna o composición polivalente puede comprender vectores virales recombinantes, virus de tipo silvestre activos o atenuados o muertas, o una mezcla de vectores virales recombinantes y virus de tipo silvestre en formas activas o atenuadas o muertas.
[0035] En el presente documento se describe un vector recombinante de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) que comprende un gen de glucoproteína C mutado (gC o UL44). El término "gen gC mutado" se refiere al gen gC del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) que está alterado o diseñado para producir una proteína gC no funcional tras la expresión. La alteración o diseño del gen gC incluye la mutación o eliminación de un segmento del gen gC que es esencial para la expresión de una proteína gC funcional. El término "gen gC mutado" también incluye la deleción del gen gC completo del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) en el que no se expresa la proteína gC. En el presente documento se describe adicionalmente un herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) recombinante en el que se elimina el gen de la glucoproteína C (gC) en el genoma del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) nativo (de tipo silvestre) que codifica la proteína gC. El término "gen de la glucoproteína C (gC)" incluye cualquier gen o polinucleótido que codifica la glucoproteína C (gC) del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2), y homólogos, fragmentos o variantes de la misma. El gen gC puede codificar una proteína gC que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % o un 99,9 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 35, o una variante de la misma. El gen gC que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % o un 99,9 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:34 también se describe en el presente documento.
[0036] Otra realización de la invención proporciona un vector viral de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) recombinante que comprende uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno o polipéptido de un patógeno aviar. Las cepas del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) utilizadas para el vector viral recombinante pueden ser cualquier cepa SB-1, incluidas, pero sin limitación, la vacuna comercial contra la enfermedad de Marek (vacuna de SB-1) (Merial Select Inc., Gainesville, GA 30503, EE.UU.), la cepa SB-1 que tiene la secuencia genómica como se define por el Número de Acceso de GenBank HQ840738.1. Las cepas de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) utilizadas para el vector viral recombinante descrito en el presente documento pueden ser cualquier otro aislado de herpesvirus gallináceo 3 que incluya la cepa HPRS24 que tiene la secuencia genómica definida por el GenBank con el Número de Acceso AB049735.1, o la cepa HPRS24 que tiene la secuencia genómica como se define por el Número de Acceso de GenBank NC_002577.1. Los genomas de HPRS24 y SB-1 comparten un 98,4 % de identidad de secuencia (Spatz y Schat, 2011; Virus Gene 42, 331-338). Las cepas de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) usadas para el vector viral recombinante descritas en el presente documento pueden ser el aislado 301B/1 descrito por Witter (1987 Avian Dis 31, 752-765) o por Witter et al. (1987 Avian Dis 31, 829-840). Las cepas de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) descritas en el presente documento pueden ser las cepas de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) que comprenden la secuencia genómica que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia como se define en el Número de Acceso de GenBank HQ840738.1 (SEQ ID NO:14), AB049735.1, o NC_002577.1.
[0037] Los genes que codifican el antígeno o polipéptido descrito en el presente documento pueden ser los que codifican la proteína de fusión del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F), la neuraminidasa de hemaglutinina del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-HN), la glucoproteína C del virus de la enfermedad de Marek (gC), la glucoproteína B del virus de la enfermedad de Marek (gB), la glucoproteína E del virus de la enfermedad de Marek (gE), la glucoproteína I del virus de la enfermedad de Marek (gI), la glucoproteína H del virus de la enfermedad de Marek (gH) o la glucoproteína del virus de la enfermedad de Marek (gL), VP2 de IBDV, VPX de IBDV, VP3 de IBDV, VP4 de IBDV, la glucoproteína B de ILTV, la glucoproteína I de ILTV, ILTV UL32, la glucoproteína D de ILTV, la glucoproteína E de ILTV, la glucoproteína C de ILTv , hemaglutinina de influenza (HA), neuraminidasa de influenza (NA), genes protectores derivados de Mycoplasma gallisepticum (MG), o Mycoplasma synoviae (MS), o combinaciones de los mismos. El antígeno o polipéptido puede ser cualquier antígeno del patógeno de las aves de corral seleccionado del grupo que consiste en virus de la encefalomielitis aviar, reovirus aviar, paramixovirus aviar, metaneumovirus aviar, virus de la influenza aviar, adenovirus aviar, virus de la viruela aviar, coronavirus aviar, rotavirus aviar, virus de la anemia del pollo, astrovirus aviar, parvovirus aviar, coccidiosis (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Pasteurella sp., Avibacterium sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Clostridium sp., y E. coli.
[0038] Además, se pretende que los homólogos de antígeno o polinucleótidos mencionados anteriormente estén dentro del alcance de la presente descripción. Como se usa en el presente documento, el término "homólogos" incluye ortólogos, análogos y parálogos. El término "análogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen la misma función o similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. El término "ortólogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos de diferentes especies, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos que tienen las mismas funciones o funciones similares. El término "parálogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos usualmente tienen diferentes funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas. Los análogos, ortólogos y parálogos de un polipéptido de tipo silvestre pueden diferir del polipéptido de tipo silvestre por modificaciones postraduccionales, por diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambas. En particular, los homólogos descritos en el presente documento generalmente presentarán al menos un 80-85 %, 85-90 %, 90-95 %, o un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia, con toda o parte de las secuencias de polinucleótidos o polipéptidos de antígenos descritos anteriormente, y presentarán una función similar.
[0039] En una realización, la presente invención proporciona un vector viral de herpesvirus gallináceo 3 recombinante (MDV-2) que comprende uno, dos o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan el antígeno o polipéptido NDV-F. En un aspecto de la realización, el antígeno o polipéptido NDV-F tiene al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:2, 9, 50, 52, o 54, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos. En otro aspecto de la realización, el polinucleótido heterólogo que codifica un antígeno o polipéptido n DV-F tiene al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:2, 9, 50, 52, o 54. En aún otro aspecto de la realización, el polinucleótido heterólogo tiene al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:1, 8, 49, 51, o 53.
[0040] Las variantes incluyen variantes alélicas. El término "variante alélica" se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o diversidad de virus). Dichas variaciones alélicas naturales pueden dar como resultado típicamente una variación del 1 al 5 % en un polinucleótido o un polipéptido. Las variantes alélicas se pueden identificar mediante la secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en varias especies diferentes, que se pueden realizar fácilmente mediante el uso de sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético del gen en estas especies. Se pretende que todas y cada una de dichas variaciones de ácidos nucleicos y los polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes de la variación alélica natural y que no alteren la actividad funcional del gen de interés, estén dentro del alcance de la invención.
[0041] El término "identidad" con respecto a las secuencias puede referirse, por ejemplo, al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en la que el alineamiento de las dos secuencias se puede determinar según el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman). La identidad de secuencia o la similitud de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos se pueden determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Cuando se dice que las secuencias de ARN son similares, o tienen un grado de identidad de secuencia u homología con las secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la invención y pueden derivarse de secuencias de ADN, considerándose la timidina (T) en la secuencia de ADN igual al uracilo (U) en las secuencias de ARN.
[0042] Los polinucleótidos de la descripción incluyen secuencias que se degeneran como resultado del código genético, por ejemplo, el uso de codones optimizado para un huésped específico. Como se usa en el presente documento, "optimizado" se refiere a un polinucleótido que está diseñado genéticamente para aumentar su expresión en una especie dada. Para proporcionar polinucleótidos optimizados que codifican polipéptidos NDV-F, la secuencia de ADN del gen de la proteína NDV-F se puede modificar para 1) comprender los codones preferidos por los genes altamente expresados en una especie particular; 2) comprender un contenido de A+T o G+C en la composición de bases de nucleótidos con respecto al que se encuentra sustancialmente en dicha especie; 3) formar una secuencia de inicio de dicha especie; o 4) eliminar las secuencias que causan desestabilización, poliadenilación inadecuada, degradación y terminación del ARN, o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de corte y empalme de ARN. El aumento de la expresión de la proteína NDV F en dichas especies puede lograrse utilizando la frecuencia de distribución del uso de codones en eucariotas y procariotas, o en una especie particular. El término "frecuencia de uso de codones preferido" se refiere a la preferencia mostrada por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales se especifican por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas se incluyen en la descripción, siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido NDV-F codificada por la secuencia de nucleótidos no se modifique funcionalmente.
[0043] En el presente documento se describe adicionalmente un procedimiento para producir un vector viral de herpesvirus gallináceo 3 o SB-1 que comprende la introducción en el genoma de SB-1 de uno, dos o más polinucleótidos aislados en una región no esencial del genoma de SB-1. En el presente documento se describe adicionalmente un procedimiento para producir un vector viral de herpesvirus gallináceo 3 o SB-1 recombinante que comprende las etapas de alterar, diseñar o eliminar el gen gC del genoma de SB-1. El término "región no esencial" se refiere a una región de un genoma de virus que no es esencial para la replicación y propagación del virus en cultivo tisular o en pollos. Cualquier región no esencial, o una porción de la misma, puede eliminarse del genoma de SB-1 o se le puede insertar una secuencia extraña, y la viabilidad y estabilidad del vector recombinante de herpesvirus gallináceo 3 o SB-1 resultante de la deleción o inserción puede utilizarse para determinar si una región eliminada o una porción de la misma es, de hecho, no esencial. En un aspecto de la realización, las regiones no esenciales se ubican en las regiones únicas largas (UL) y únicas cortas (US) del genoma de SB-1 (véase Spatz et al., Virus Genes 42:331-338, 2011). La región UL de SB-1 tiene una longitud de aproximadamente 109.744 pb a aproximadamente 109.932 pb y puede extenderse desde las posiciones 12.209 a 121.952 de la SEQ ID NO:14 (Número de Acceso de GenBank HQ840738.1) o posiciones equivalentes de otros genomas de SB1, por ejemplo, de 11.826 pb a 121.757 pb del genoma de Hp Rs 24. La región US de SB-1 tiene aproximadamente de 12.109 pb a 12.910 pb de longitud y puede extenderse desde las posiciones 143.514 a 156.423 de la SEQ ID NO: 14 (Número de Acceso de GenBank HQ840738.1) o posiciones equivalentes de otros genomas de SB1, por ejemplo, de 142.681 pb a 154.789 pb del genoma de HPRS24 (Spatz et al., 2011). Descrita en el presente documento, la región no esencial está entre ORF de UL55 y ORF de LORF5 en la región única larga (UL) de SB-1. Descrito en el presente documento, el polinucleótido se inserta en o para reemplazar el gen de la glucoproteína C SB-1 (también denominado UL44). El uso del locus gC puede permitir que la generación de virus recombinante incapaz de producir una proteína gC funcional y e incapaz de transmitirse horizontalmente. Descrita en el presente documento, la región no esencial puede estar en las regiones intergénicas entre UL7 y UL8, entre UL 21 y UL22, entre UL40 y UL41, entre UL50 y UL51, entre UL54 y LORF4, entre US10 y SORF4, o en el gen UL43, US2, US 10 o US6 (que codifica gD) (véase Número de Acceso de GenBank HQ840738.1). Descritas en el presente documento, las regiones no esenciales pueden estar en la región de las posiciones de nucleótidos 118057-118306 (UL55-LORF5 intergénico), 98595-100031 (gC o UL44), 25983-26038 (UL7-UL8 intergénico), 49865-50033 (UL21-UL22 intergénico), 75880­ 75948 (UL35-UL36 intergénico), 93928-93990 (UL40-UL41 intergénico), 109777-109847 (UL50-UL51 intergénico), 116466-116571 (UL54-LORF4 intergénico), 146548-146697 (US10-SORF4 intergénico), 97141-98385 (UL43), 147857-148672 (US2), 145853.146548 (US10) o 150322-151479 (gD o US6) de la SEQ ID NO:14.
[0044] La construcción de virus recombinantes se conoce bien en la técnica como se describe en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 4.769.330, 4.722.848, 4.603.112, 5.174.993, y 5.756.103, 6.719.979. Específicamente, un vector viral recombinante del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) se puede construir en dos etapas. Primero, se clonan las regiones genómicas del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) o SB-1 que flanquean el locus de inserción en una construcción plasmídica de E. coli; el sitio o sitios de restricción únicos se colocan entre las dos regiones flanqueantes (plásmido de inserción) para permitir la inserción del ADN del casete de expresión del donante. Por separado, la secuencia del gen de ADNc o ADN a insertar está precedida por una región promotora (región de inicio del gen) y una secuencia de terminador (o poli-adenilación, poli-A) que es específica para el vector del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) o SB-1 y/o las células eucariotas. El casete de expresión completo (promotorgen extraño-poli-A) se clona entonces en el sitio o sitios de restricción únicos del plásmido de inserción para construir el "plásmido donante" que contiene el casete de expresión flanqueado por los "brazos" de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) o SB-1 que flanquean el locus de inserción. La construcción de plásmido donante resultante se amplifica entonces por crecimiento dentro de las bacterias de E. coli y se extrae el ADN plasmídico. Este plásmido se linealiza entonces utilizando una enzima de restricción que corta el esqueleto del plásmido (fuera de los brazos del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) o SB-1 y el casete de expresión). Los fibroblastos embrionarios de pollo luego se cotransfectan después con el ADN parental de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) o SB-1 y el ADN plasmídico de donante linealizado. La población de virus resultante se clona entonces mediante múltiples etapas de dilución limitante en las que los virus que expresan el gen extraño se aíslan de la población viral que no expresa. De manera similar, se puede insertar otro casete extraño en otro locus de inserción para crear un recombinante doble de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) o SB-1 que expresa dos genes. El segundo casete también se puede insertar en el mismo locus. El herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) o SB-1 recombinante se produce en fibroblastos embrionarios de pollo primarios de manera similar a la vacuna parental contra MD de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) o SB-1. Después de la incubación, las células infectadas se recogen, se mezclan con un medio de congelación que permite la supervivencia de las células infectadas y, normalmente, se congelan en ampollas de vidrio o crioviales y se almacenan en nitrógeno líquido.
[0045] La expresión exitosa de la secuencia genética de ADNc insertada por el virus infeccioso modificado requiere dos condiciones. Primero, la inserción debe introducirse en una región del genoma del virus para que el virus modificado sigua siendo viable. La segunda condición para la expresión de ADNc insertado es la presencia de secuencias reguladoras que permiten la expresión del gen en el fondo viral (por ejemplo: promotor, potenciador, sitios de corte y empalme donante y aceptor e intrón, secuencia consenso de inicio de la traducción de Kozak, señales de poliadenilación, elementos de secuencia no traducidos).
[0046] En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte funcional en células eucariotas. Los promotores incluyen, pero sin limitación, un promotor inmediato temprano del citomegalovirus (CMV), un promotor CMV de cobaya, un promotor SV40, promotores del virus de la pseudorrabia, tal como el del promotor de la glucoproteína X, el virus del herpes simple 1, tal como el promotor alfa 4, promotores de los virus de la enfermedad de Marek (incluidos MDV-1, MDV-2 y HVT), tales como los que impulsan las glucoproteínas gC, gB, gE o gl, promotores del virus de la laringotraqueítis infecciosa, tales como los de los genes de la glucoproteína gB, gE, gI, gD, u otros promotores del herpesvirus. Cuando el locus de inserción consiste en un gen SB-1 (por ejemplo, gC, gD, US2 o US10), el gen extraño puede insertarse en el vector sin una secuencia promotora adicional ya que el promotor del gen eliminado del vector impulsará la transcripción del gen extraño insertado.
[0047] En el presente documento se describe una composición farmacéutica o vacuna que comprende uno o más vectores virales recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) de la presente invención y un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable. Las cepas del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) utilizadas para el vector viral recombinante de del herpesvirus gallináceo 3 puede ser cualquier cepa SB-1, las cepas HPSR24 o las cepas 301B/1. Las cepas del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) también pueden incluir las descritas en Witter et al (Avian Diseases 34, 944-957; 1990), Witter (Avian Pathology 21, 601-614, 1992) y Witter (Avian Pathology 24, 665-678, 1995): 280-5/1, 281MI/1, 287C/1, 298B/1, 301A/1, 401/1, 437A/1, 437B/1, 468A/1, 468A/2, 468B/1, 471B/1, o HN-1/1.
[0048] En otra realización, la presente invención proporciona una composición o vacuna que comprende: i) un vector de herpesvirus gallináceo 3 recombinante (MDV-2) que comprende polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar; y ii) al menos uno de: un vector HVT recombinante (o MDV-3 o Meleagrid Herpesvirus 1) que comprende polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar; o MDV-3 de tipo silvestre; o vector MDV-1 recombinante (o herpesvirus gallináceo 2) que comprende polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar; o MDV-1 de tipo silvestre. La composición o vacuna puede comprender además un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable. Esta composición puede contener además un vector de viruela aviar recombinante que comprende polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar; o la viruela de tipo silvestre.
[0049] En un aspecto de la realización, la composición o vacuna comprende uno (o más) vectores recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) y uno o más HVT de tipo silvestre (MDV-3). En otro aspecto, la composición o vacuna comprende uno (o más) vectores recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) y uno o más HVT recombinantes (MDV-3). En otro aspecto, la composición o vacuna comprende uno o más vectores recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) y uno o más MDV-1 de tipo silvestre o genéticamente modificados. En otro aspecto, la composición o vacuna comprende uno o más vectores recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) y uno o más MDV-1 recombinantes. En otro aspecto, la composición o vacuna comprende uno o más vectores recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2), uno o más HVT de tipo silvestre (MDV-3) y uno o más MDV-1 de tipo silvestre. En otro aspecto, la composición o vacuna comprende uno o más vectores recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2), uno o más HVT recombinantes (MDV-3) y uno o más MDV-1 de tipo silvestre. En otro aspecto, la composición o vacuna comprende uno o más vectores recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2), uno o más HVT de tipo silvestre (MDV-3) y uno o más MDV-1 recombinantes. En aún otro aspecto, la composición o vacuna comprende uno o más vectores recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2), uno o más HVT recombinantes (MDV-3) y uno o más MDV-1 recombinantes. El HVT de tipo silvestre (MDV-3) o el MDV-1 de tipo silvestre pueden estar vivos, atenuados o modificados genéticamente. Los polinucleótidos heterólogos en vectores recombinantes de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2), vectores HVT recombinantes (MDV-3) y vectores MDV-1 recombinantes pueden codificar antígenos iguales o diferentes de los mismos o diferentes patógenos aviares.
[0050] Los portadores o adyuvantes o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables se conocen bien por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un portador o adyuvante o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser el diluyente de la vacuna contra la enfermedad de Marek utilizado para las vacunas contra MD. Otro portador o adyuvante o vehículo o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que se pueden usar para los procedimientos de esta invención incluyen, pero sin limitación, una solución al 0,9 % de NaCl (por ejemplo, una solución salina) o un tampón fosfato, poli(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que faciliten la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vector de la invención in vitro), o que faciliten la transfección o infección y/o mejoren la conservación del vector (o proteína). Las dosis y los volúmenes de dosis se analizan en el presente documento en la descripción general y también pueden determinarse por el experto en la técnica a partir de esta descripción, junto con el conocimiento de la técnica, sin una experimentación excesiva.
[0051] Opcionalmente, pueden añadirse otros compuestos como portadores o adyuvantes o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables, incluyendo, pero sin limitación, alumbre; oligonucleótidos CpG (ODN), en particular ODN 2006, 2007, 2059, o 2135 (Pontarollo R.A. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43-59; Wernette C.M. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89-103); poliA-poliU, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) ("Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", editado por Michael F. Powell y Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: p.03, pág. 157); N,N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroxietil)propanodiamina (tal como AVRIDINE®) (Ibid, pág. 148); carbómero, quitosano (véase, la Patente de Estados Unidos N.° de Serie 5.980.912, por ejemplo).
[0052] Las composiciones farmacéuticas y vacunas según la invención pueden comprender o consistir esencialmente en uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados para su uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades CpG no metiladas (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en la pág. 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicado por M.
Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la pág. 183 del mismo trabajo, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA, (5) citocinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina u (8) otros adyuvantes analizados en cualquier documento citado en la presente solicitud, o (9) cualquier combinación o mezcla de los mismos.
[0053] En el presente documento se describe un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un animal contra uno o más antígenos o una respuesta protectora en un animal contra uno o más patógenos aviares, cuyo procedimiento que comprende inocular al animal al menos una vez con la vacuna o la composición farmacéutica de la presente invención. En el presente documento se describe adicionalmente un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un animal a uno o más antígenos o una respuesta protectora en un animal contra uno o más patógenos aviares en un régimen de administración de sensibilización y refuerzo, que comprende al menos una administración primaria y al menos una administración de refuerzo usando al menos una administración de refuerzo que utiliza al menos un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. La composición inmunológica o la vacuna utilizada en la administración primaria pueden ser iguales, pueden ser de naturaleza diferente de las utilizadas como refuerzo.
[0054] Los patógenos aviares pueden ser el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), el virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa (es decir, IBDV o el virus de la enfermedad de Gumboro), el virus de la enfermedad de Marek (MDV), el virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV), el virus de la encefalomielitis aviar y otros picornavirus, reovirus aviar, paramixovirus aviar, metaneumovirus aviar, virus de la influenza aviar, adenovirus aviar, virus de la viruela aviar, coronavirus aviar, rotavirus aviar, parvovirus aviar, astrovirus aviar y virus de la anemia del pollo, coccidiosis (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Pasteurella sp., Avibacterium sp., E. coli o Clostridium sp.
[0055] Usualmente, una administración de la vacuna se realiza a un día de edad por vía subcutánea o intramuscular o in ovo en embriones de 17-19 días. Se puede hacer una segunda administración en los primeros 10 días de edad. Los animales tienen preferiblemente al menos 17 días de embrión o un día de edad en el momento de la primera administración.
[0056] Se puede usar una diversidad de vías de administración en pollos de un día, tales como por vía subcutánea o intramuscular, intradérmica, transdérmica. La vacunación in ovo se puede realizar en el saco amniótico y/o en el embrión. Se pueden utilizar dispositivos de administración in ovo y SC comercialmente disponibles para la vacunación.
[0057] La invención se describirá ahora más detalladamente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
[0058] La construcción de insertos de ADN, plásmidos y vectores virales recombinantes se realizó utilizando las técnicas estándar de biología molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).
Ejemplo 1 Construcción de vSB1-004 recombinante que expresa NDV-F
[0059] El objetivo del trabajo es construir un virus SB-1 recombinante en el que un casete de expresión que contiene el promotor de citomegalovirus de ratón (mCMV), la proteína de fusión del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F), y la cola de poli A del virus de simio 40 (SV40) se inserta en el sitio intergénico entre el sitio US10 y SORF4 del virus SB-1 (Tabla 1 y Figura 2).
Tabla 1 Características de vSB1-004
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[0060] Se sintetizó químicamente (GenScript, Piscataway, NJ, EE.UU.) una proteína de fusión del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F) correspondiente a la secuencia del genotipo VIId (SEQ ID NO:2 codificada por SEQ ID NO:3). El sitio de escisión de la proteína F de este gen sintético se alteró para coincidir con una secuencia de sitio de escisión de F lentogénica y la secuencia del gen NDV-F resultante tiene un 99 % identidad de secuencia de nucleótidos, así como un 99 % identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de NDV-F depositada en GenBank con el número de acceso AY337464 (para ADN) y AAP97877.1 (para proteína), respectivamente.
Construcción del plásmido donante SB-1 US10mFwt Sbfl
[0061] Un fragmento que contenía el gen NDV-F sintético se extrajo del plásmido pUC57 NDV-F VIId wt (sintetizado por GeneScript) usando NotI y se insertó en el mismo sitio del plásmido pCD046 que contenía el promotor mCMV y la cola de poli A de SV40. El plásmido resultante, pCD046+NDV-F wt se digirió con EcoRI y SalI y se hicieron los extremos romos con Klenow. Un fragmento de 3,3 kb se extrajo en gel y se ligó a un vector digerido con SmaI y desfosforilado (CIPed) (SB1 US10-SORF4 SbfI pUC57) que contenía brazos flanqueantes. El material ligado se transformó utilizando el kit Top10 Oneshot (Invitrogen, CA, EE.UU.). Las colonias bacterianas se hicieron crecer en caldo LBamp, el plásmido se extrajo usando el kit Qiagens MiniSpin Prep, y se cribaron para determinar la orientación del inserto utilizando la digestión con PstI. El plásmido donante correcto se designó SB-1 10mFwt SbfI. Los cultivos a gran escala se hicieron crecer y la extracción del plásmido se realizó con el kit Qiagens Maxi Prep. La expresión transitoria de las preparaciones máximas se verificó utilizando reactivo de transfección de Fugene en células de fibroblastos embrionarios de pollo (CEF) y sueros policlonales de pollo contra NDV.
Generación de recombinantes
[0062] Un procedimiento de recombinación homóloga estándar se siguió de la coelectroporación de células CEF secundarias utilizando el plásmido donante SB-1 US10mFwt SbfI SB-1 y el ADN viral aislado de la cepa de vacuna del virus SB-1. La coelectroporación se realizó utilizando 1 x 107 de CEF 2° en 300 pl de Opti-MEM y se aplicó una descarga eléctrica de 150 voltios con capacitancia de 950 en una cubeta de electroporación de 2 mm. Las células transfectadas se sembraron en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 5-7 días. Las células que crecieron en la placa de 96 pocillos se trataron entonces con tripsina y se transfirieron a dos placas "hermanas" de 96 pocillos y se incubaron durante 5 días más. Se usó un conjunto de placas de 96 pocillos para el IFA utilizando sueros policlonales de pollo contra NDV-F para identificar los pocillos positivos que contenían recombinantes y se usó otro conjunto de placas de 96 pocillos para recuperar las células infectadas de los pocillos positivos.
[0063] Los procedimientos de purificación viral recombinante se realizaron primero mediante duplicación de placas de 96 pocillos y selección de iFa para los pocillos que contenían la mayor parte de las placas positivas para IFA con la menor cantidad de placas negativas para IFA. Los pocillos que coincidían con esos criterios se luego cosecharon entonces y se ajustaron a 1 ml en d Me M FBS al 2 %. De la solución madre de 1 ml, se eliminaron 5­ 20 pl (dependiendo del número de placas visibles), se mezclaron con 1 x 107 de CEF en 10 ml de DMEM FBS al 2 % y se dividieron en alícuotas en una nueva placa de 96 pocillos para tener placas individuales de SB-1 por pocillo. Las placas de 96 pocillos se duplicaron después de 5 días de incubación y los pocillos que contenían placas se ensayaron para determinar la presencia de SB-1 recombinante y la ausencia de virus parental por IFA y PCR. De nuevo, los pocillos que parecían tener más virus recombinantes, al comparar los resultados de la banda de PCR, se recolectaron y ajustaron a 1 ml y se dividieron en alícuotas en nuevas placas de 96 pocillos. Después de tres a cinco rondas de purificación de las células infectadas con virus, se aisló el SB-1 recombinante que expresaba la proteína NDV-F y se analizó la pureza del virus recombinante mediante IFA y PCR para confirmar la ausencia del virus parental. El virus recombinante seleccionado se pasó entonces por un pocillo de una placa de 96 pocillos (P0) a matraces 2xT-25 (P1), después a matraces 2xT-75 (P2), a matraces 2xT-175 (P3), y finalmente a botellas rotatorias de 2 x 850 cm2 (reserva pre-MSV o P4). Los viales con alícuotas de 2 ml se almacenaron en nitrógeno líquido. Las titulaciones se realizaron por triplicado en CEF y se obtuvo un título de 1 x 105 ufp/ml para SB1-004.
Análisis de expresión
[0064] Para las pruebas de inmunofluorescencia, el material P3 se diluyó 1:100 en medio. Se añadieron aproximadamente 50 pl del virus diluido a 10 ml de DMEM FBS al 2 % con 1 x 107 de CEF y después se dividió en alícuotas en una placa de 96 pocillos (100 pl/pocillo). Las placas se incubaron durante 5 días a 37 °C CO2 al 5 % hasta que las placas virales fueron visibles. Las placas se fijaron con acetona enfriada con hielo al 95 % durante tres minutos y se lavaron tres veces con PBS. Se añadieron antisueros de pollo contra el virus de la enfermedad de Newcastle (lote N.° C0139, Charles Rivers Laboratory) a 1:1000 y las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de una hora de incubación, las placas se lavaron tres veces con PBS y se añadió anti-pollo FITC (cat. N.° F8888, Sigma) a 1:500. De nuevo, las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de una hora de incubación, las células se aclararon tres veces con PBS y se visualizaron con un microscopio fluorescente usando un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC). Se encontró que todas las placas examinadas de vSB1-004 expresaban la proteína NDV-F (Figura 3).
Análisis de recombinantes por PCR
[0065] Se extrajo ADN de un virus de reserva mediante extracción con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol, y se resuspendió en HEPES 20 mM. Los cebadores de PCR se diseñaron para identificar específicamente el gen NDV-F VlId, el promotor, la poli A de SV40 y los brazos que flanquean SB-1 (véase la Figura 4). También se incluyeron cebadores, específicos para HVT (cepa FC126), MDV serotipo 3 (MB080 MB081) en el análisis para verificar la pureza del virus recombinante del virus parental SB-1. El análisis por PCR se realizó utilizando 200 pg de plantilla de ADN junto con los pares de cebadores especificados.
[0066] Las reacciones de PCR con todos los pares de cebadores dieron como resultado los productos de PCR esperados y los patrones de banda. Los resultados de la PCR demuestran que el virus recombinante vSB 1­ 004 transporta el casete de expresión deseado y que la reserva de virus está libre de cantidades detectables del virus SB-1 parental (Figura 5).
[0067] La secuencia de nucleótidos del plásmido donante SB-1 US10mFwt SbfI (SEQ ID NO: 41) se muestra en la Figura 20.
[0068] En base a las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, vSB 1-004 es un SB-1 recombinante que expresa un gen NDV-F bajo el control del promotor mCMV. El vector recombinante vSB 1-004 está libre de cualquier virus SB-1 parental detectable o potencial contaminante de HVT.
Ejemplo 2 Construcción de vSB1-006 recombinante que expresa NDV-F
[0069] El objetivo del trabajo es construir un virus SB-1 recombinante en el que un casete de expresión que contiene el promotor SV40, la proteína de fusión del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F), y la cola de poli A sintética se inserta entre el sitio UL55 y LORF5 del virus SB-1 (Tabla 2).
Tabla 2 Características de vSB1-006
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[0070] Se sintetizó químicamente (GeneArt) una proteína de fusión del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F) correspondiente a una secuencia consenso del genotipo VIId optimizado por codones (SEQ ID NO:2 codificada por SEQ ID NO:1).
Construcción del plásmido donante SB-1 UL55 SV Fopt cola syn SbfI
[0071] Un plásmido sintético SB-1 UL55-LOrf5 Sbfl que cubre una secuencia de aproximadamente 1 kb en cada lado del sitio de inserción (GenScript) se digirió con SbfI y se desfosforiló. Un plásmido sintético de SV OptF cola syn pUC57 (Genscript) se digirió con SbfI y se extrajo en gel un fragmento de 2239 pares de bases y se ligó al vector digerido con SbfI para crear el nuevo plásmido donante Sbfl SB1 UL55 SVFopt cola syn.
Generación de recombinantes, análisis de expresión y pruebas por PCR
[0072] Un procedimiento de recombinación homóloga estándar se siguió de la coelectroporación de células CEF secundarias usando el plásmido donante SB1 UL55 SV Fopt cola syn Sbfl y el ADN viral aislado de la cepa de vacuna del virus SB-1. Esencialmente. el procedimiento descrito en el ejemplo 1 para vSB 1-004 se siguió para generar, purificar en placa y caracterizar los recombinantes mediante inmunofluorescencia y PCR.
[0073] La secuencia de nucleótidos del plásmido donante SB1 UL55 SVFopt cola syn SbfI (SEQ ID NO:42) se muestra en la Figura 20.
Generación de recombinantes y análisis de expresión
[0074] El ADN genómico del virus SB-1 se sometió a coelectroporación con el plásmido donante SB-1 UL55 SV Fopt cola syn Sbfl para generar SB-1 recombinante usando una técnica de recombinación homóloga. El virus recombinante se separó del virus SB-1 parental mediante la selección de pocillos positivos por inmunofluorescencia y el cribado por PCR en múltiples rondas de purificación de placa. Un virus SB-1 recombinante purificado en placa que expresaba la proteína nDV-F, designado vSB 1-006, se amplió de los matraces de cultivo tisular a 2 botellas rotatorias de 850 cm2. Después de aproximadamente 72 h después de la infección en botellas rotatorias, se recogieron los CEF infectados. Las alícuotas se congelaron en nitrógeno líquido que contenía FBS al 10 % y DMSO al 10 %. Las titulaciones se realizaron por triplicado en CEF y se obtuvo un título de 8 x 105 ufp/ml para SB1-006.
[0075] La inmunofluorescencia se realizó utilizando anti-sueros de pollo (lote N.° C0139, Charles Rivers Laboratories) seguido de una IgG anti-pollo marcada con FITC (cat. N.° 02-24-06, KPL). Se encontró que todas las placas examinadas de vSB 1-006 expresaban la proteína NDV-F (Figura 6).
Análisis por PCR de vSB1-006
[0076] La pureza del virus recombinante se verificó por PCR usando pares de cebadores que son específicos para los brazos que flanquean SB-1, NDV-F VIId optimizado por codones, el promotor SV40, así como los pares de cebadores específicos para HVT (véase la Figura 7). Las reacciones de pCr con todos los pares de cebadores dieron como resultado los productos de PCR esperados y los patrones de banda. Además, no hubo evidencia del virus SB-1 parental en vSB 1-006 (Figura 8).
[0077] En base a las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, se confirma que vSB1-006 es un SB-1 recombinante que expresa el gen NDV-F optimizado por codones bajo el control del promotor SV40. El vector recombinante vSB 1-006 está desprovisto de cualquier cantidad detectable de virus SB-1 parental y potencial contaminante de HVT.
Ejemplo 3 Construcción de vSB1-007 recombinante que expresa NDV-F
[0078] El objetivo del trabajo es construir un virus SB-1 recombinante en el que un casete de expresión que contiene el promotor SV40, el gen NDV-F correspondiente a la secuencia F del genotipo VIId de NDV se usa para reemplazar la secuencia codificante de la glucoproteína C (gC o UL44) del virus SB-1 (Tabla 3).
Tabla 3 Características de vSB1-007
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[0079] Se sintetizó químicamente (GeneArt) una proteína de fusión del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F) correspondiente a una secuencia consenso del genotipo VIId optimizado por codones (SEQ ID NO:2 codificada por SEQ ID NO:1).
Construcción del plásmido donante pSB144 cds SVOptF
[0080] Se generó un plásmido pSB1 44 cds sintético que contenía brazos flanqueantes mediante síntesis génica (GenScript). El pSB1 44 cds se digirió con SbfI y se desfosforiló. Otro plásmido llamado SV-OptF-cola syn no poliA-pUC57 se digirió con Sbfl y se extrajo en gel un fragmento de 2,1 kb que contenía el promotor SV40 y el gen NDV-F, se ligó en el vector digerido con SbfI y se transformó usando el kit Top10 Oneshot (Invitrogen). Las colonias bacterianas se hicieron crecer en medio LB-ampicilina (100 pg/ml), y los plásmidos se extrajeron utilizando el kit Qiagen Mini Spin Prep, y se cribaron para determinar las inserciones mediante digestión con EcoRI y NcoI. El plásmido donante resultante se designó pSB144 cds SVOptF.
[0081] El plásmido sintético pSB1 44 cds (SEQ ID NO: 36 en la Figura 20) también se puede usar como un plásmido donante sin modificación adicional (sin insertar el casete de expresión NDV-F) para generar un SB-1 recombinante que carece del gen de glucoproteína (gC).
Generación de recombinantes y análisis de expresión
[0082] Un procedimiento de recombinación homóloga estándar se siguió de la coelectroporación de células CEF secundarias usando el plásmido donante pSB1 44 cds SVOptF y el ADN viral aislado de la cepa de vacuna del virus SB-1. Esencialmente, el procedimiento descrito en el ejemplo 1 para vSB 1-004 se siguió para generar, purificar en placa y caracterizar los recombinantes mediante inmunofluorescencia. Un virus SB-1 recombinante purificado en placa que expresaba la proteína NDV-F, designado vSB 1-007, se amplió de matraces de cultivo tisular T-25 a matraces 10xT-150 cm2. Las células CEF infectadas se recogieron y se congelaron alícuotas en nitrógeno líquido que contenía FBS al 10 % y DMSO al 10 %. Las titulaciones se realizaron por triplicado en CEF y se obtuvo un título de 7,2 x 104 ufp/ml para SB1-007.
[0083] La inmunofluorescencia se realizó utilizando anti-sueros de pollo (lote N.° C0139, Charles Rivers Laboratories) seguido de una IgG anti-pollo marcada con FITC (cat. N.° 02-24-06, KPL). Se encontró que todas las placas examinadas de vSB 1-007 expresaban la proteína NDV-F (Figura 9).
Análisis por PCR de vSB1-007
[0084] Se extrajo ADN viral de SB1-007 de P.1 a P.6 mediante el kit QIA DNeasy Blood & Tissue (Qiagen). Los cebadores de pCr se diseñaron específicamente para identificar la presencia de NDV F (optimizado por codones), el promotor SV40 y los brazos flanqueantes de UL44 (véase la Figura 10). Las amplificaciones de PCR se realizaron usando 200 ng de plantilla de ADN junto con los pares de cebadores especificados.
[0085] De forma similar, un procedimiento de recombinación homóloga estándar usando el plásmido sintético pSB1 44 cds y el ADN viral aislado de la cepa de vacuna del virus SB-1 generará un SB-1 recombinante en el que la región codificante del gen gC se elimina. Dos cebadores de PCR (SB1 43.F y SB145.R, Tabla 4) producirán un producto de PCR de 103 nucleótidos para un SB-1 recombinante con eliminación de gC frente a 1540 nucleótidos para el virus SB-1 parental.
[0086] La pureza del virus recombinante se verificó por PCR usando pares de cebadores que son específicos para los brazos que flanquean SB-1, NDV-F VIId optimizado por codones, el promotor SV40, así como los pares de cebadores (MB080 MB081) específicos para HVT. Las reacciones de PCR con todos los pares de cebadores dieron como resultado los productos de PCR esperados y los patrones de banda. Además, no hay evidencia del virus SB-1 parental en vSB 1-007 (Tablas 4-5 y Figura 11).
Tabla 4 Cebadores de PCR
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Tabla 5 Tamaño de am licón es erado
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[0087] En base a las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, se confirma que vSB 1-007 es un SB-1 recombinante que expresa un gen NDV-F optimizado por codones bajo el control del promotor SV40. El casete de expresión de NDV-F se utilizó con éxito para reemplazar el gen gC de SB1, lo que demuestra que gC es prescindible para la propagación in vitro del virus SB-1. El vector recombinante vSB 1-007 está desprovisto de cualquier cantidad detectable de virus SB-1 parental o HVT.
[0088] La secuencia de nucleótidos del plásmido donante pSB1 44 cds SVOptF (SEQ ID NO:43) se muestra en la Figura 20.
Ejemplo 4 Construcción de vSB1-008 recombinante que expresa NDV-F
[0089] El objetivo del trabajo es construir un virus SB-1 recombinante en el que un casete de expresión que contiene el promotor SV40, el gen NDV-F correspondiente a la secuencia F de la cepa CA02 de NDV, y la cola de poli A sintética se inserta entre el sitio UL55 y LORF5 del virus SB-1 (Tabla 6).
Tabla 6 Características de vSB1-008
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[0090] Se sintetizó químicamente (GeneArt) NDV-F correspondiente a una secuencia de genotipo V optimizado por codones (cepa CA02) (SEQ ID NO:9 codificada por la SEQ ID NO:8). El sitio de escisión de la proteína F de este gen sintético se alteró para coincidir con una secuencia del sitio de escisión de F lentogénica y la secuencia del gen NDV-F resultante tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 99 % con la secuencia de NDV-F depositada en GenBank (ABS84266).
Construcción del plásmido donante SB1 UL55 SV CaFopt cola syn SbfI
[0091] Un plásmido sintético SB-1 UL55-LOrf5 SbfI (Genscript) que contenía una secuencia de aproximadamente 1 kb de cada lado del sitio de inserción se digirió con SbfI y se desfosforiló. Un plásmido sintético SV OptF cola syn pUC57 (Genscript) se digirió con SbfI y se extrajo en gel un fragmento de 2239 pares de bases que contenía la cola syn y se ligó al vector digerido con SbfI para crear el nuevo plásmido donante SB1 UL55 SVFopt cola syn SbfI. Este plásmido donante se digirió entonces con NotI, CIPed y se extrajo en gel un fragmento de 5196 pares de bases. Un plásmido donante sintético NDV-F CAO2 CSmut 0813005 pVR101 (GeneArt) se digirió con NotI y se extrajo en gel un fragmento de 1677 pares de bases y se ligó al vector UL55 digerido con NotI y CIPed dando como resultado el plásmido donante SB1 UL55 SV CaFopt cola syn SbfI.
Generación de recombinantes y análisis de expresión
[0092] Un procedimiento de recombinación homóloga estándar se siguió de la coelectroporación de células CEF secundarias usando el plásmido donante SB-1 UL55 SV CaFopt cola syn SbfI y el ADN viral aislado de la cepa de vacuna del virus SB-1. Esencialmente, el procedimiento descrito en el ejemplo 1 se siguió para generar y caracterizar recombinantes por inmunofluorescencia y PCR.
[0093] El virus recombinante se separó del virus SB-1 parental mediante la selección de pocillos positivos por inmunofluorescencia y el cribado por PCR en múltiples rondas de purificación de placa. Un virus SB-1 recombinante purificado en placa que expresaba la proteína NDV-F, designado vSB1-008, se amplió de matraces de cultivo tisular a 2 botellas rotatorias de 850 cm2 Después de aproximadamente 72 h después de la infección en botellas rotatorias, se recogieron los CEF infectados. Las alícuotas se congelaron en nitrógeno líquido que contenía FBS al 10 % y DMSO al 10 %.
[0094] La inmunofluorescencia se realizó utilizando anti-sueros de pollo (Charles Rivers Laboratories) seguido de una IgG anti-pollo marcada con FITC (KPL) (Figura 12).
Análisis por PCR de vSB1-008
[0095] La pureza del virus recombinante se verificó por PCR usando pares de cebadores que son específicos para los brazos que flanquean SB-1, NDV-F VIId optimizado por codones, el promotor SV40 (véase la Figura 13), así como pares de cebadores (MB080 MB081) específicos para HVT, MDV serotipo 3. Las reacciones de PCR con todos los pares de cebadores dieron como resultado los productos de PCR esperados y los patrones de banda. Además, no hay evidencia del virus SB-1 parental en vSB 1-008 (Figura 14).
[0096] La secuencia de nucleótidos del plásmido donante SB-1 UL55 CaFopt cola syn SbfI (SEQ ID NO:44) se muestra en la Figura 20.
[0097] En base a las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, se confirma que vSB 1-008 es un SB-1 recombinante que expresa un gen NDV-F optimizado por codones bajo el control del promotor SV40. El vector recombinante vSB 1-008 está desprovisto de cualquier virus SB-1 parental o HVT detectable.
Ejemplo 5 Construcción de vSB1-009 y vSB1-010 recombinantes que expresan NDV-F
[0098] El objetivo de este estudio es construir un vector viral recombinante de SB-1 vSB 1-009 en el que un casete de expresión que contiene el promotor SV40 y el gen de fusión del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F) se inserta para reemplazar la secuencia codificante de UL44 (gC) de SB-1 y para construir un vector viral recombinante de SB-1 vSB1-010 en el que un casete de expresión adicional que contiene el promotor CMV de cobaya y el gen NDV-F se inserta en el locus SORF-US2 del esqueleto vectorial de SB1-009.
Ejemplo 5.1 Construcción de vSB1-009
[0099] Se construyó un plásmido donante pSB1 44 cds SV FCAopt que contenía los brazos flanqueantes de UL44 del virus SB1, el promotor SV40 y la secuencia génica optimizada por codones de NDV F (SEQ ID NO:8, que codifica la SEQ ID NO:9) (Tabla 7).
Tabla 7 Características de vSB1-009
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Generación de virus recombinante
[0100] Un procedimiento de recombinación homóloga estándar se siguió de la coelectroporación de células CEF secundarias usando el plásmido donante pSB1 44 cds SV FCAopt y el ADN viral aislado de CEF infectados con el virus SB-1. Esencialmente, el procedimiento descrito en el ejemplo 1 se siguió para generar, purificar en placa y caracterizar los recombinantes mediante inmunofluorescencia.
[0101] Después de dos rondas de purificación en placa, se aisló el virus recombinante puro (vSB1-009) y la pureza de vSB 1-009 se probó mediante IFA y PCR para validar la inserción apropiada, así como el virus parental no remanente.
Análisis por PCR
[0102] Se extrajo ADN viral de la reserva de virus de siembra pre-maestra (pre-MSV) vSB 1-009 mediante el kit QlA DNeasy Blood & Tissue (Qiagen). Los cebadores de PCR se diseñaron específicamente para identificar la presencia del NDV F, la NDV F de tipo silvestre, el promotor SV40, el promotor mCMV, los brazos flanqueantes de UL44 del SB-1 virus y el virus HVT. Las amplificaciones por PCR se realizaron utilizando aproximadamente 200 ng de plantilla de ADN junto con los pares de cebadores.
[0103] La amplificación por PCR con diversos cebadores confirmó que el vSB1-009 tiene los patrones de amplificación y amplicones esperados.
Análisis de expresión
[0104] El ensayo inmunofluorescente indirecto (IFA) se realizó en la reserva pre-MSV vSB 1-009 para examinar la expresión del gen NDV F y el antígeno del virus SB-1. Los CEF que se inocularon con vSB1-009 se fijaron con acetona al 95 % enfriada con hielo durante tres minutos a temperatura ambiente y se secaron al aire durante 10 minutos. Las placas se lavaron con PBS, después se añadieron dos anticuerpos primarios, sueros contra el virus de la enfermedad de Newcastle de pollo (Charles Rivers Laboratories cat. N.° 10100641, lote N.° C0117A) a una dilución de 1:500 y anticuerpo monoclonal Y5.9 contra el virus SB-1 (Merial Select, Gainesville, GA) a una dilución de 1:3000 y las placas se incubaron durante 45 minutos a 37 °C. Después de tres lavados con PBS, se añadieron dos anticuerpos secundarios, IgG-fluoresceína anti-pollo de cabra (KPL) a una dilución de 1:500 e IgG-Alexa Fluor 568 anti-ratón de burro (Molecular Probe) a una dilución de 1:250. Las placas se incubaron a 37 °C durante 45 min y seguidas de tres lavados con PBS. Los pocillos se cribaron para determinar placas positivas para IFA con un microscopio fluorescente usando filtros de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y de isotiocianato de tetrametilrrodamina (TRITC) del microscopio invertido Nikon Eclipse Ti. De manera similar, la reactividad de vSB1-009 con NDV F Mab se examinó mediante IFA dual utilizando suero anti-MDV (Charles River Laboratories (dilución 1/300) y anticuerpo monoclonal anti-NDV F (dilución 1/300) como anticuerpo primario. Se utilizaron IgG-fluoresceína anti-pollo de cabra (KPL) (dilución 1:500) e IgG-Alexa Fluor 568 anti-ratón de burro (Molecular Probe) (dilución 1:250) se utilizaron como anticuerpos secundarios. Se observaron los pocillos para identificar las placas positivas para IFA con un microscopio de fluorescencia utilizando filtros FITC y TRITC del microscopio invertido Nikon Eclipse Ti.
[0105] Los resultados del IFA indican que vSB1-009 expresa la proteína NDV F en CEF infectado con virus. Se contaron más de 500 placas de vSB1-009 para la expresión de la proteína NDV F, así como la expresión de la proteína específica del virus SB-1 con IFA dual. La expresión de la proteína NDV F coincidió completamente con la expresión del antígeno del virus SB-1 en cada placa de virus (Tabla 8).
Tabla 8 IFA dual de vSB1-009
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[0106] La reactividad de NDV F Mab se confirmó mediante IFA dual. Se examinaron más de 200 placas de vSB 1-009 para determinar la reactividad del NDV F Mab, así como la reactividad del suero anti-MDV. La reactividad con NDV F Mab coincidió completamente con la reactividad del suero anti-MDV en cada placa de virus (Tabla 9).
Tabla 9 Reactividad de vSB1-009 con anti-NDV F Mab
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Análisis de Southern Blot
[0107] Se extrajo ADN genómico total de CEF infectados con reserva pre-MSV de vSB1-009. El ADN genómico de vSB 1-009, el virus SB-1 (control negativo), el plásmido donante pSB1 44 cds SV FCA opt se digirieron a 37 °C con las endonucleasas de restricción EcoRI, NcoI y KpnI por separado. Los fragmentos de restricción se separaron mediante una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % y se transfirieron a una membrana de Nylon cargada positivamente. Después de la transferencia, la membrana se trató con NaOH 0,4 M y después se neutralizó con tampón 2XSSC-HCl. Después, la membrana se secó al aire y se reticuló con UV.
[0108] Siguiendo las instrucciones de los fabricantes del kit de hibridación quimioluminiscente y detección North2South (Thermo Scientific cat. N.° 89880), la membrana se hibridó previamente durante 1 h y después se hibridó con la sonda a 55 °C durante una noche. Para la hibridación, se utilizaron dos sondas; 1) el fragmento SbfI de pSB1 44 cds SV FCA opt como sonda del casete de NDV F, 2) el fragmento SmaI-EcoRI del brazo pUC57 SB1 44 (GenScript) como sonda del brazo de recombinación. Después de la hibridación durante una noche, se realizaron varios lavados rigurosos hasta que la membrana se colocó en un tampón de bloqueo con la adición de estreptavidina-HRP. Después de aclarar la membrana de cualquier estreptavidina-HRP no unida, se añadieron la solución de sustrato de Luminal y peróxido. Después, la membrana se expuso a una película de rayos X y la película se desarrolló.
[0109] Los resultados de la Southern blot fueron los esperados según el análisis de cartografía Vector NTI. El casete de NDV F (promotor SV40, gen NDV-F CA02 optimizado por codones) reemplazó las secuencias codificantes de UL44 del virus Sb -1.
Análisis genómico
[0110] El ADN genómico de la reserva pre-MSV de vSB1-009 se realizó mediante la determinación de la secuencia de nucleótidos de la región del brazo de recombinación, así como el casete génico insertado. Los cebadores se diseñaron y se utilizaron para amplificar todo el casete del gen NDV-F, incluidos los brazos de recombinación.
[0111] Se confirmó que la secuencia vSB1-009 (plásmido donante pSB1 44 cds SV FCAopt) que contenía los brazos recombinantes, el promotor SV40 y el gen NDV F optimizado por codones era correcta, como se muestra en la SEQ ID NO: 37 (Figura 20).
Análisis de Western blot
[0112] La monocapa de CEF se infectó con pre-MSV de vSB1-009 a MOI ~0,1. Después de una incubación de 5 días, los CEF se sedimentaron y se lavaron con PBS, seguido de lisis con tampón de lisis IP/lavado del kit Pierce Classic IP (Thermo Scientific cat. N.° 26146) según los protocolos de los fabricantes. El lisado se aclaró previamente y se incubó con 100 ul de anticuerpo monoclonal anti-NDV F para formar el complejo inmune. El complejo inmune se capturó por la proteína A/G más agarosa y después de eliminar el complejo inmune no unido por etapas de lavado, se utilizaron 50 ul de tampón de muestra para eluir en condiciones no reductoras. Los CEF no infectados se incluyeron como control. Los 20 ul de muestras eluidas se separaron en geles de Bis-Tris al 10 % mediante electroforesis. Después de la electroforesis, las proteínas separadas en un gel se transfirieron a la membrana de PVDF. El kit Western Blot de detección de proteínas Tm B (KPL cat. N.° 54-11-50) se utilizó para detectar los antígenos de NDV en la membrana de PVDF con suero de pollo anti-NDV (Charles River Laboratories cat. N.° 10100641, lote N.° C0117A) y el conjugado de IgG-peroxidasa anti-pollo de cabra (KPL cat. N.° 14-24-06) siguiendo los protocolos de los fabricantes.
[0113] La expresión de la proteína NDV F de vSB1-009 se confirmó mediante inmunodetección de dos etapas. Primero, las proteínas n Dv F expresadas del lisado de CEF infectados con vSB1-009 se capturaron mediante la inmunoprecipitación utilizando el anticuerpo monoclonal anti-NDV F 001C3. Posteriormente, se aplicó un análisis de Western blot utilizando suero policlonal anti-NDV (Charles River Laboratories, cat. N.° 10100641, lote N.° C0117A) para detectar la proteína NDV F en las muestras capturadas (complejo de proteína NDV F-anticuerpo monoclonal) (Figura 15). Se detectó una proteína de aproximadamente 55 kDa en los lisados pre-MSV de vSB 1-007 mediante suero anti-NDV que correspondía al tamaño esperado de la proteína de fusión NDV F1 (Figura 15).
Ejemplo 5.2 Construcción de vSB1-010
Construcción del plásmido donante SB1US2 gpVIIdwtsyn
[0114] Utilizando el plásmido HVT SOrf3-US2 gpVar-Ewt Syn, el gpCMV, Variante E, la cola Syn se eliminó mediante digestión con SbfI. Este fragmento se ligó en el plásmido donante SB1 US2. El gen variante E se cortó por NotI y se reemplazó por NDV-F VIId wt. El gen sintético de tipo silvestre NDV-F VIId (SEQ ID NO:3 que codifica la SEQ ID NO: 2) se escindió del plásmido pUC57 NDV-F VIId wt (sintetizado por GeneScript) usando digestión con NotI. El material ligado se transformó utilizando el kit Top10 Oneshot (cat. N.° C404002, Invitrogen). Las colonias bacterianas se hicieron crecer en caldo LBamp, el plásmido se extrajo usando el kit Qiagens MiniSpin Prep, y se cribaron para determinar la orientación del inserto utilizando la digestión con NcoI+SalI. El plásmido donante correcto se designó pSB1 US2 gpVIIdwt Syn. La Tabla 10.1 muestra las características únicas de la construcción alrededor de los casetes de expresión, incluidas las secuencias respectivas. Los cultivos a gran escala se hicieron crecer y la extracción del plásmido se realizó con el kit Qiagens Maxi Prep. La expresión transitoria de las preparaciones máximas se verificó utilizando reactivo de transfección de Fugene en células de fibroblastos embrionarios de pollo (CEF) y sueros policlonales de pollo contra NDV-F.
Generación de recombinantes
[0115] Un procedimiento de recombinación homóloga estándar se siguió de la coelectroporación de células CEF secundarias usando el plásmido donante pSB1 US2 gpVIIdWt Syn y el ADN viral aislado de vSB1-009 (vSB1-009 ya es un virus recombinante que expresa el gen CA02 F de NDV). Esencialmente, el procedimiento descrito en el ejemplo 1 se siguió para generar, purificar en placa y caracterizar los recombinantes mediante inmunofluorescencia.
[0116] Después de cinco rondas de purificación en placa, se aisló el virus recombinante puro (vSB1-010) y la pureza de vSB1-010 se probó mediante IFA y PCR para validar la inserción apropiada, así como el virus parental no remanente.
Tabla 10.1 Características de vSB1-010
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[0117] La secuenciación de la región del inserto confirmó que vSB1-010 contiene las secuencias correctas de promotor CMV de cobaya y el gen NDV-F VI I d wt como se muestra en la secuencia del plásmido donante SB1US2 gpVIIdwtsyn (SEQ ID NO: 57).
Análisis de recombinantes por PCR
[0118] Se extrajo ADN de un virus de reserva mediante extracción con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol, y se resuspendió en HEPES 20 mM. Los cebadores de PCR se diseñaron para identificar específicamente el gen NDV-F VI I d wt, el promotor, la poli A, así como la pureza del virus recombinante del virus parental SB1. El análisis por PCR se realizó utilizando 200 |jg de plantilla de ADN junto con los pares de cebadores especificados indicados en la Tabla 1. Las condiciones de ciclado de la PCR son las siguientes (a menos que se indique de otro modo): 94 °C - 2 min; 30 ciclos de 94 °C - 30 s, 55 °C - 30 s, 68 °C - 3 min; 68 °C - 5 min.
[0119] La pureza del virus recombinante se verificó por PCR usado pares de cebadores que son específicos para los brazos que flanquean SB1, el promotor gpCMV, el gen NDV-F VI I d wt y la cola syn. Los cebadores, específicos para HVT, MDV serotipo 3 (MB080 MB081) también se incluyeron en el análisis. Los resultados de la PCR demuestran que el virus recombinante vSB1-010 transporta el casete de expresión deseado y que la reserva de virus está libre de cantidades detectables del virus SB1-009 parental.
Tinción inmunofluorescente del virus vSB1-010 recombinante que expresa dos proteínas NDV-F
[0120] Para las pruebas de inmunofluorescencia, el material P3 se diluyó 1:100 en medio. Se añadieron aproximadamente 50 j l del virus diluido a 10 ml de DMEM FBS al 2 % con 1 x 107 de CEF y después se dividió en alícuotas en una placa de 96 pocillos (100 jl/pocillo). Las placas se incubaron durante 5 días a 37 °C CO2 al 5 % hasta que las placas virales fueron visibles. Las placas se fijaron con acetona enfriada con hielo al 95 % durante tres minutos y se lavaron tres veces con PBS. Se añadieron antisueros de pollo contra el virus de la enfermedad de Newcastle (lote N.° C0139, Charles Rivers Laboratory) a 1:1000 y las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de una hora de incubación, las placas se lavaron tres veces con PBS y se añadió anti-pollo FITC (cat. N.° F8888, Sigma) a 1:500. De nuevo, las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de una hora de incubación, las células se aclararon tres veces con PBS y se visualizaron con un microscopio fluorescente usando un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC).
[0121] Los resultados de la tinción inmunofluorescente indican que vSB1-010 mostró una expresión muy fuerte de la proteína NDV-F cuando se usaron los sueros policlonales contra ambas proteínas CA02 y VIId F de NDV.
Conclusión
[0122] En base a las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, vSB1-010 es un SB-1 recombinante en que el gen VIId-F de NDV bajo el control del promotor gpCMV se insertó con éxito en un vSB 1­ 009, que ya expresa el gen CA02-F de NDV. En consecuencia, vSB1-010 transporta ambos genes VIId y CA02 F de los genotipos de NDV y está desprovisto de cualquier vSB 1-009 parental detectable.
Ejemplo 6 Construcción de los vectores vHVT recombinantes que expresan NDV-F
Preparación del plásmido donante pHM103+Fopt para vHVT114
[0123] El plásmido pHM103 (Merial Limited) que contenía los brazos intergénicos I de HVT FC126, el promotor SV40 y la poli A de SV40 se digirió con NotI, se desfosforiló, y el fragmento de 5,6 kb se extrajo en gel. Un fragmento de 1,7 kb flanqueado por NotI de un gen NDV-F del genotipo VIId optimizado por codones sintetizado químicamente (SEQ ID NO:1, que codifica la SEQ ID NO:2) también se digirió con NotI y el fragmento de 1,7 kb se extrajo en gel. Los fragmentos de 5,6 y 1,7 kb se ligaron para crear un pHM103 Fopt (Tabla 10.2).
Tabla 10.2 Características de vHVT 114
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Generación de vector viral recombinante de HVT
[0124] Un procedimiento de recombinación homologa estándar se siguió de la coelectroporación de células CEF secundarias usando el plásmido donante pHM103+Fopt y el ADN viral aislado de la cepa de HVT FC126 (Igarashi T. et al., J. Gen. Virol. 70, 1789-1804, 1989). Esencialmente, el procedimiento descrito en el ejemplo 1 se siguió para generar, purificar en placa y caracterizar los recombinantes mediante inmunofluorescencia.
[0125] Después de cinco rondas de purificación en placa, se aisló un virus recombinante designado como vHVT114 y se analizó la pureza mediante IFA y PCR para confirmar la expresión de NDV-F y la ausencia de virus parental.
Análisis por PCR de vHVT114 recombinante
[0126] Se extrajo ADN de vHVT114 mediante extracción con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol, y se resuspendió en HEPES 20 mM. Los cebadores de PCR se diseñaron específicamente para identificar la presencia de la NDV-F optimizado por codones, el promotor SV40, así como la pureza del virus recombinante del virus parental FC126 CL2.
[0127] Los resultados de la PCR mostraron que los tamaños de los productos de la PCR después de la electroforesis en gel se corresponden bien con los tamaños esperados y los patrones de banda.
Análisis de secuencia de la región insertada en vHVT114 recombinante
[0128] El análisis de la región del ADN genómico de vHVT114 se realizó mediante amplificación por PCR. Se utilizaron un total de 10 cebadores para amplificar todo el casete, así como, más allá de los brazos de BamHI-I flanqueantes utilizados en el plásmido donante. El producto de PCR de 4,727 kb se purificó en gel y el fragmento completo se secuenció usando los cebadores de secuenciación. El resultado de la secuencia confirmó que el vHVT114 contiene el promotor SV40 correcto, el NDV-F optimizado por codones y las secuencias de poliA de SV40 que coinciden exactamente con la secuencia descrita para el plásmido donante pHM103 Fopt en la SEQ ID NO: 38 (véase la Figura 20).
Análisis Western blot de vHVT114 recombinante
[0129] Se infectaron aproximadamente 2 x 106 células de fibroblastos de pollo a MOI ~0,1 con Pre-MSV de vHVT114. Después de dos días de incubación a 37 °C, las células infectadas, así como las no infectadas se recogieron utilizando un raspador de células después de eliminar el medio y aclarar con PBS. Las células se recogieron con 1 ml de PBS y se centrifugaron. Los sedimentos celulares se lisaron siguiendo el kit Pierce Classic IP (Thermo Scientific). Se usaron 100 pl del anticuerpo monoclonal anti-NDV-F 001C3 (Merial Limited) para formar el complejo inmune. La muestra de anticuerpo/lisado se añadió a la proteína A/G más agarosa para capturar el complejo inmune. El complejo inmune se lavó tres veces para eliminar el material no unido y después se eluyó en un volumen de 50 pl utilizando una elución de tampón de muestra en condiciones no reductoras. Después de la ebullición durante 5 minutos, se cargaron 10 pl de las muestras en un gel de acrilamida al 10 % (Invitrogen). El gel PAGE se ejecutó en tampón MOPS (Invitrogen) a 200 voltios durante 1 hora. Después, el gel se transfirió a una membrana de PVDF.
[0130] Se usó el sistema TMB del kit Western Blot del detector de proteínas (KPL, cat. N.° 54-11-50) para transferir la membrana de PVDF utilizando los reactivos y siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de bloquear la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente, la membrana se aclaró entonces tres veces en un tampón de lavado IX, cinco minutos cada vez y después se empapó en un tampón de bloqueo que contenía una dilución 1:1000 de suero de pollo producido contra el virus n Dv (Lote N.° C0139, Charles River Laboratories). Después de lavar tres veces en un tampón de lavado, la membrana se incubó con una IgG anti-pollo de cabra marcada con peroxidasa (KPL, cat. N.° 14-24-06) a una dilución de 1:2000 durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, la membrana se aclaró tres veces en tampón de lavado 1x, cinco minutos cada vez. Se añadieron 5 ml de sustrato de peroxidasa de membrana TMB a la membrana y se meció suavemente durante aproximadamente 1 minuto. La reacción de desarrollo se detuvo colocando la membrana en agua.
[0131] La técnica de inmunoprecipitación y transferencia de Western detectó una proteína de aproximadamente 55 kD en la muestra de vHVT114 que corresponde al tamaño esperado del componente F1 de la proteína NDV-F (Figura 16).
Generación y caracterización de otros recombinantes de HVT
[0132] La generación y caracterización de otros recombinantes de HVT, tales como vHVT039, vHVT110, vHVT111, vHVT112, vHVT113, y vHVT116, se realizaron esencialmente de la misma manera que para el vHVT114 descrito anteriormente. La Tabla 11 muestra las características únicas de cada construcción alrededor de los casetes de expresión, incluidas las secuencias respectivas.
Tabla 11 Características de los casetes de ex resión de los recombinantes individuales de HVT
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Ejemplo 7 Construcción de vectores dobles de HVT que expresan NDV-F y VP2 de IBDV, y vectores dobles de HVT que expresan variantes de VP2 de IBDV
Preparación del plásmido donante pHVT US2 SV- Fopt-synPA para vHVT306
[0133] Se construyó el plásmido donante pHVT US2 SV-Fopt-synPA que contenía el promotor SV40, el gen sintético NDV F del genotipo VII optimizado por codones, la cola de poliA sintética flanqueada por las secuencias de los brazos SORF3 y US2 del HVT FC126.
Generación de virus recombinante
[0134] Un procedimiento de recombinación homóloga estándar se siguió de la coelectroporación de células CEF secundarias usando el plásmido donante pHVT US2 SV-Fopt-synPA y el ADN viral aislado de vHVT13 (un vector HVT que expresa el gen VP2 de IBDV, Merial Limited). Esencialmente, el procedimiento descrito en el ejemplo 1 se siguió para generar, purificar en placa y caracterizar los recombinantes mediante inmunofluorescencia.
[0135] Después de dos rondas de purificación en placa, se aisló el virus recombinante puro (vHVT306) y la pureza de vHVT306 se ensayó y se confirmó mediante IFA y PCR.
Análisis por PCR
[0136] Se extrajo ADN viral de la reserva de virus de siembra pre-maestro (pre-MSV) de vHVT306 mediante el kit QIA DNeasy Blood & Tissue (Qiagen). Los cebadores de PCR se diseñaron específicamente para identificar la presencia del n Dv F optimizado, la NDV F de tipo silvestre, el promotor SV40, el promotor mCMV, los brazos flanqueantes del virus US2 HVT y el virus SB-1.
[0137] La amplificación por PCR con diversos cebadores confirmó que el vHVT306 tenía los patrones de amplificación y amplicones esperados.
Análisis genómico
[0138] El ADN genómico de la reserva pre-MSV de vHVT306 se secuenció para verificar la secuencia de la región del brazo de recombinación, así como el casete génico insertado.
[0139] Los cebadores se diseñaron para amplificar todo el casete génico insertado, incluido el brazo de recombinación utilizado en el plásmido donante. El análisis del ADN genómico de vHVT306 se realizó mediante amplificación por PCR y se siguió mediante la determinación de la secuencia de nucleótidos.
[0140] Se confirmó que el vHVT306 (plásmido donante pHVT US2 SV-Fopt-synPA) que contenía los brazos recombinantes, el promotor SV40 y el gen NDV F optimizado por codones es correcto como se muestra en la SEQ ID NO: 45 (Figura 20).
Análisis de Western blot
[0141] La expresión de la proteína NDV F de vHVT306 se confirmó mediante inmunodetección de dos etapas. Primero, las proteínas NDV F expresadas de CEF infectados con vHVT306 se capturaron mediante la inmunoprecipitación utilizando el anticuerpo monoclonal anti-NDV F 001C3 (Merial Limited). Posteriormente, se aplicó un análisis de Western blot utilizando suero policlonal anti-NDV (Charles River Laboratories) para detectar la proteína NDV F en las muestras capturadas (complejo de proteína NDV F-anticuerpo monoclonal). Se detectó una proteína de 55 kDa en lisados pre-MSV de vHVT306 mediante suero anti-NDV que corresponde al tamaño esperado de la proteína de fusión NDV F1.
Generación y caracterización de otros recombinantes dobles de HVT
[0142] La generación y caracterización de recombinantes dobles de HVT, tales como vHVT301, vHVT302, vHVT303, vHVT304, vHVT202, y vHVT307 se hicieron esencialmente de la misma manera que para el vHVT306 descrito anteriormente. La Tabla 12 muestra las características únicas de cada construcción alrededor de los casetes de expresión, incluidas las secuencias respectivas.
Tabla 12 Características de los casetes de ex resión de recombinantes dobles de HVT
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Ejemplo 8 Falta de transmisión horizontal del mutante de SB-1 con eliminación de gC
[0143] El objetivo del estudio fue comparar el nivel de viremia y la transmisión horizontal inducida por el SB-1 parental con los de un virus SB-1 recombinante en el que se eliminó el gen gC (véase el ejemplo 3).
[0144] Se constituyeron aleatoriamente dos grupos (A y B) de treinta pollos Leghorn blancos libres de patógenos específicos (SPF) de un día de edad. Veinte aves de los grupos A se vacunaron (D0) por vía subcutánea (nuca; 0,2 ml/ave) con 2000 UFP de SB-1 parental y veinte de los grupos B con 2000 UFP del mutante con eliminación de gC de SB-1. Diez aves se mantuvieron sin vacunar en el mismo aislador que las aves vacunadas (grupos Ac y Bc). A las 2 semanas de edad (D14), se extrajeron el bazo, así como 2 plumas de veinte aves vacunadas de los grupos A y B después de la eutanasia. A las 4 semanas de edad (D28), también se extrajo el bazo de las 10 aves de contacto de los grupos Ac y Bc para el aislamiento viral. Se recogieron glóbulos blancos de la capa leucocitaria de bazos molidos que se habían añadido al medio de separación de linfocitos y se centrifugaron. Para cada ave, se añadieron 106 leucocitos a una placa de cultivo tisular de 60 mm que contenía monocapas confluentes de fibroblastos embrionarios de pollo primarios (CEF) preparados el día anterior. Cinco días después de la infección, se contaron las placas de MDV en cada placa y se calculó el número de aves positivas y el número medio de placas. Para las muestras de folículos de plumas, la pulpa de plumas se añadió al medio SPGA y se sometió a sonicación durante 10 segundos antes de la colocación en monocapas confluentes de CEF primarios de los que se había eliminado el medio. La suspensión de pulpa se dejó absorber durante 45 minutos antes de añadir medio fresco con suero de ternera al 1 %.
[0145] Los resultados del aislamiento del virus del bazo y de los folículos de plumas de las aves vacunadas en D14 se indican en la Tabla 13. Todas las aves de ambos grupos fueron positivas para el aislamiento del virus del bazo con un número promedio similar de placas de 142,5 y 176,0 para los grupos A y B, respectivamente. El virus podría aislarse de los folículos de plumas de todas las aves en el grupo A y del 90 % de las aves en el grupo B.
[0146] Los resultados del aislamiento del virus del bazo de aves de contacto no vacunadas en D28 se indican en la Tabla 14. Siete de cada diez aves del grupo Ac fueron positivas para el aislamiento del virus del bazo, lo que indica que el SB-1 parental se extendió horizontalmente al contacto con las aves. El virus no se pudo aislar de las aves del grupo Bc, lo que sugiere que el mutante con eliminación de gC no se propagó al contacto con las aves. Tabla 13 Resultados del aislamiento viral de la capa leucocitaria del bazo (BC) y de los folículos de plumas (FF) de aves vacunadas de los ru os A B en D14
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Tabla 14 Resultados del aislamiento viral de la capa leucocítica del bazo (BC) de aves de contacto no vacunadas de l r A B n D2
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[0147] Este estudio indica que el nivel de viremia del mutante de SB-1 con eliminación de gC medido en D14 después de la vacunación fue similar al del virus SB-1 parental, lo que sugiere que la deleción de gC no afectó a la capacidad del virus SB-1 para replicarse en aves vacunadas. El nivel de virus en el folículo de la pluma fue ligeramente más bajo con el mutante con eliminación de gC, ya que 2/20 aves no tenían una cantidad detectable de virus. La transmisión horizontal se pudo detectar en 7/10 aves en contacto con aves vacunadas con el SB-1 parental. Por el contrario, no se pudo detectar ningún virus de las aves en contacto con las aves vacunadas con el mutante con eliminación de gC, lo que indica que la deleción de gC afectó gravemente a la transmisión horizontal.
Ejemplo 9 Eficacia contra ND inducida por SB-1 recombinante en solitario o en combinación con una vacuna vectorial HVT-IBD en pollos SPF de un día de edad
[0148] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia del vSB1-004 recombinante que expresa el gen NDV F contra una exposición a ND realizada a las 4 semanas de edad en pollos SPF vacunados con vSB1-004 en solitario o en combinación con una vacuna vectorial HVT-IBD.
[0149] Se constituyeron aleatoriamente tres grupos (1, 2 y 3) de quince pollos Leghorn blancos libres de patógenos específicos (SPF) de un día de edad. Se utilizaron dos vacunas vectorizadas: el vSB1-004 descrito en el ejemplo 1 y el vHVT13, un vector de herpesvirus de pavo (HVT) que expresa el gen VP2 de la cepa Faragher 52/70 del virus de la enfermedad de bursitis infecciosa (principio activo de la vacuna HVT+IBD VAXXITEK® autorizada a Merial, documentos US 5.980.906 y EP 0719864). Las aves de los grupos 1, 2 y 3 recibieron solamente vHVT13 (grupo de control), vSB1-004 solamente y una mezcla de vHVT13 y vSB1-004, respectivamente (véase la Tabla 6). Todas las aves fueron vacunadas por vía subcutánea (nuca) con 2000 UFP de vSB1-004 y/o vHVT13 (D0). Veintisiete días después de la vacunación (D27), las aves de cada grupo se expusieron a la cepa NDV velogénica Mexican Chimalhuacan de genotipo V (Mex V). La exposición se realizó por vía intramuscular (IM) utilizando 105 dosis infecciosas de embrión al 50 % (EID50) diluidas en 0,2 ml de agua fisiológica estéril. Las aves se observaron diariamente durante 14 días después de la exposición para determinar signos clínicos y la mortalidad. También se tomaron muestras de frotis orofaríngeos de 10 aves por grupo 5, 7 y 9 días después de la exposición. La carga de ARN viral se evaluó en estos frotis después de la extracción de ARN mediante el uso de una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real de transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR) basada en el gen M y descrita por Wise et al. (2004; Development of a Real-Time Reverse-Transcription pCr for Detection of Newcastle Disease Virus RNA in Clinical Samples; J. Clin. Microbiol. 42, 328-338). Los niveles de eliminación se expresaron como log10 en dosis infecciosas al 50 % (EID50) por ml. También se tomaron muestras de sangre en el momento de la exposición (D27). Los sueros se probaron con el ELISA anti-IBD (Synbiotics ELISA ProFlok PLUS IBD) para evaluar el impacto de vSBA-004 en los anticuerpos contra el IBDV con inducción de vHVT13.
[0150] Los resultados de protección y serología se resumen en la Tabla 15. Todas las aves de control murieron en los 5 días posteriores a la exposición a ND. El virus recombinante vSB 1-004 indujo una protección clínica completa en solitario o cuando se combinó con vHVT13. El número de aves que propagaron una cantidad detectable de virus ND de exposición fue muy bajo en ambos grupos vacunados. Los títulos medios de ELISA de IBD en los grupos 1 y 3 fueron casi idénticos, lo que indica la falta de interferencia de vSB 1-004 en los anticuerpos contra el IBDV con inducción de vHVT13.
Tabla 15 Resultados de la protección contra la ND inducida por los recombinantes de SB-1 que expresan el gen NDV F en pollos SPF de un día (15/grupo) expuestos en D27
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g p y, p , p p g g p [0151] El modelo de exposición a ND con el NDV velogénico Chimalhuacan de genotipo V es muy grave. En estas condiciones de exposición graves, vSB 1-004 indujo una protección clínica completa y una excelente protección contra la propagación del virus de exposición por la vía orofaríngea. Vale la pena señalar que el gen F insertado en vSB 1-004 proviene de una cepa de NDV de genotipo VIId y la cepa de exposición utilizada aquí es un genotipo V. Muestra, por lo tanto, que el gen F del genotipo VIId insertado en el vector SB-1 protege de forma cruzada a las aves frente a una exposición al genotipo V. La adición de vHVT13 no afectó a la protección contra ND inducida por vSB 1-004 y vSB1-004 no interfirió en los títulos de anticuerpos contra IBD inducidos por vHVT13, lo que demuestra la compatibilidad del vector SB-1 con el vector HVT.
Ejemplo 10 Eficacia temprana contra ND inducida por SB-1 recombinante en pollos SPF de un día de edad [0152] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia del vSB1-004 recombinante que expresa el gen NDV F frente a una exposición temprana a ND (D14) en pollos SPF realizada con dos cepas de exposición a NDV diferentes.
[0153] Se constituyeron aleatoriamente dos grupos (1 y 2) de veinte pollos Leghorn blancos libres de patógenos específicos (SPF) de un día de edad. Las aves del grupo 2 fueron vacunadas por vía subcutánea (nuca) con 2000 UFP de vSB 1-004. Los pollos del grupo 1 no fueron vacunados y se mantuvieron como aves de control. A las 2 semanas de edad, la mitad de las aves de cada grupo fueron expuestas a la cepa de NDV velogénica Mexican Chimalhuacan del genotipo V (Mex V) y la otra mitad a la cepa de n Dv velogénica Malaysia 04-1 del genotipo VIId (Mal VIId). La exposición se realizó por vía intramuscular (IM) utilizando 105 dosis infecciosas de embrión al 50 % (EID50) diluidas en 0,2 ml de agua fisiológica estéril. Las aves se observaron diariamente durante 14 días después de la exposición para determinar signos clínicos y la mortalidad.
[0154] Los resultados de la protección se resumen en la Tabla 16. Todas las aves de control murieron en los 5 días posteriores a la exposición a ND. El virus recombinante vSB1-004 indujo una protección parcial contra la mortalidad (70 % y 40 % de protección después de la exposición a Mal VIId y Mex V, respectivamente) y contra la morbilidad (50 % y 30 % de protección después de la exposición a Mal VIId y Mex V, respectivamente) en estas condiciones graves de exposición temprana.
Tabla 16 Resultados de la protección contra la ND temprana inducida por los recombinantes de SB-1 que expresan
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[0155] El modelo de exposición a ND temprana que se usó para evaluar la eficacia del vSB1-004 recombinante se eligió porque los vectores del virus de la enfermedad de Marek que expresan el gen NDV F generalmente no proporcionan una protección completa en este modelo. De hecho, su inicio de inmunidad se retrasa en comparación con las vacunas vivas contra NDV (Morgan et al. (1993) Avian Dis 37, 1032-40; Heckert et al. (1996) Avian Dis 40, 770-777). Por lo tanto, es un buen modelo para evaluar y comparar las vacunas candidatas. En estas condiciones de exposición temprana grave, vSB1-004 recombinante indujo una protección parcial que fue solo ligeramente mayor contra la exposición a Malaysian de genotipo VI I d que contra el genotipo V de Mexican Chimalhuacan, lo que indica una amplia protección contra los 2 genotipos más prevalentes que circulan en América y Eurasia/África, respectivamente.
Ejemplo 11 Eficacia contra ND inducida por SB-1 recombinante en solitario o en combinación con una vacuna vectorial HVT-IBD en pollos de engorde de 1 día de edad con anticuerpos maternos
[0156] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia del vSB1-004 recombinante que expresa gel gen NDV F contra dos exposiciones a ND realizadas a las 4 semanas de edad en pollos de engorde vacunados con vSB 1-004 en solitario o en combinación con una vacuna vectorial HVT-IBD.
[0157] Se constituyeron aleatoriamente seis grupos (1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b) de doce pollos de un día de edad (línea Hubbard JA957). Se utilizaron dos vacunas vectorizadas: el vSB1-004 descrito en el ejemplo 1 y el vHVT13, un vector de herpesvirus de pavo (HVT) que expresa el gen VP2 de la cepa Faragher 52/70 del virus de la enfermedad de bursitis infecciosa (principio activo de la vacuna HVT+IBD VAXXITEK® autorizada a Merial). Las aves de los grupos 1 (1a y 1b) se vacunaron solo con vHVT13 (grupo de control); las de los grupos 2 con vSB1-004 solo y las de los grupos 3 con una mezcla de vHVT13 y vSB 1-004 (véase la Tabla 17). Todas las aves fueron vacunadas por vía subcutánea (nuca) con 2000 UFP de vSB1-004 y/o vHVT13 (D0). Veintiocho días después de la vacunación (D28), todas las aves de cada subgrupo "a" fueron expuestas a la cepa velogénica de NDV del genotipo VI I d Malasia 04-1 (Mal VIId) y todas las aves de cada subgrupo "b" a la cepa velogénica de NDV del genotipo V Mexican Chimalhuacan (Mex V). La exposición se realizó por vía intramuscular (IM) utilizando 105 dosis infecciosas de embrión al 50 % (EID50) diluidas en 0,2 ml de agua fisiológica estéril. Las aves se observaron diariamente durante 14 días después de la exposición para determinar signos clínicos y la mortalidad. También se tomaron muestras de sangre de 5 aves en cada grupo en el momento de la exposición (D28). Los sueros se probaron con el ELISA anti-IBD (Synbiotics ELISA ProFlok PLUS IBD) para evaluar el impacto de vSB1-004 en los anticuerpos contra el IBDV inducidos por vHVT13 en pollos de engorde.
[0158] Los resultados de protección y serología se resumen en la Tabla 17. Todas las aves de control murieron en los 5 días posteriores a la exposición a ND. El virus recombinante vSB 1-004 indujo un nivel significativo de protección clínica cuando se combinó o no con vHVT13. El número de aves que propagaron una cantidad detectable de virus fue muy bajo en ambos grupos vacunados. Los títulos medios de anticuerpos contra IBD en los grupos 2 todavía eran altos (3 log10) en D27, lo que indica un alto nivel de anticuerpos contra IBD maternos; sin embargo, vHVT13 indujo una clara respuesta de anticuerpos contra IBD que no se vio afectada al mezclarse con vSB 1-004.
Tabla 17 Resultados de la protección contra la ND inducida por los recombinantes de SB-1 que expresan el gen
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[0159] Los resultados de este estudio indicaron niveles significativos de protección inducida por vSB1-004 en pollos de engorde con NDV MDA. La adición de vHVT13 no tuvo un impacto negativo en la protección contra ND inducida por vSB1-004, lo que indica la falta de interferencia de vHVT13. Además, vSB1-004 no interfirió en los anticuerpos contra IBD inducidos por vHVT13, lo que confirma en los pollos de engorde la compatibilidad entre estos dos vectores.
Ejemplo 12 Falta de interferencia de vSB1-004 en la eficacia temprana contra IBD inducida por una vacuna vectorial HVT-IBD en pollos SPF de 1 día de edad
[0160] El objetivo del estudio fue evaluar el potencial de interferencia del vSB1-004 recombinante en la eficacia contra IBD inducida por una vacuna vectorial HVT-IBD (vHVT13) en un modelo de exposición temprana (D14) a IBD en pollos SPF.
[0161] Se constituyeron aleatoriamente tres grupos (1 a 3) de diez pollos Leghorn blancos libres de patógenos específicos (SPF) de un día de edad. Las aves del grupo 1 fueron vacunadas por vía subcutánea (nuca) con 2000 UFP de vSB 1-004 (grupo de control). Los pollos del grupo 2 se vacunaron con 2000 UFP de vHVT13 y las aves del grupo 3 se vacunaron con 2000 UFP de vHVT13 y 2000 UFP de vSB 1-004. A las 2 semanas de edad, todas las aves de cada grupo fueron expuestas por vía ocular a 50 pl que contenían 2,5 log10 EID50 de la cepa clásica de IBDV Faragher 52/70. Las aves se observaron diariamente durante 10 días después de la exposición para determinar signos clínicos y la mortalidad. Todas las aves se sacrificaron 10 días después de la exposición y se registraron el peso del cuerpo y la bolsa de Fabricius para evaluar la relación en peso de la bolsa/cuerpo. También se revisó la bolsa en busca de lesiones histológicas típicas de la IBD. Se asignó una puntuación a cada bolsa en función de la gravedad de las lesiones como se muestra en la Tabla 18. Se calculó el número de aves afectadas (no protegidas) en cada grupo. Un ave fue considerada como afectada si murió y/o mostró signos notables de enfermedad y/o lesiones intermedias o graves de la bolsa de Fabricio (es decir, puntuación histológica <3).
__________ Tabla 18 Escala de puntuación de las lesiones histológicas de la bolsa de Fabricio_____________
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_________ _________
[0162] Los resultados de la protección se resumen en la Tabla 19. Todas las aves de control enfermaron y una murió después de la exposición, mientras que todas las aves vacunadas se mantuvieron sanas. Las relaciones en peso del cuerpo-bolsa de los grupos 2 y 3 fueron similares y significativamente más altas que las del grupo 1. Las 8 aves que sobrevivieron a la exposición del grupo 1 tuvieron puntuaciones de lesión de la bolsa de 4 o 5.
Tabla 19 Resultados de la protección temprana (D14) contra IBD inducida por vHVT13 en solitario o en combinación ______________con vSB 1-004 recombinante que expresa el gen NDV F en pollos SPF de un día.______________ Grupo Vacuna Mortalidad Morbilidad Relación en peso Bolsa con bolsa/cuerpo* 100 puntuación <3 Protección 1 vSB 1-004
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1/9* 9/9 0,14 ± 0,02 8/8 0 % 2 vHVT13 0/10 0/10 0,47 ± 0,10 0/10 100 % 3 vHVT1
vSB1-0 3
0 +
4 0/9* 0/9 0,46 ± 0,20 1/9 89 % * Un ave en estos grupos murió antes de la exposición.
[0163] Se eligió el modelo de exposición a IBD temprana que se usó para evaluar la falta de interferencia de vSB 1-004 recombinante en la protección contra IBD inducida por vHVT 13 porque es muy sensible para detectar interferencia en la protección de vHVT13. Los resultados obtenidos con vSB1-004 vHVT13 indicaron un nivel excelente de protección contra IBD (89 %) que indica la compatibilidad entre vSB 1-004 y vHVT13 incluso cuando se mide en una exposición temprana a IBD.
Ejemplo 13 Eficacia de vHVT114, vHVT116, vSB1-007, vSB1-008 (en solitario o con vHVT13) y vHVT 304 frente a exposiciones a NDV ZJ1 (genotipo VIId) y California/02 (genotipo V) a los 21 días de edad en pollos SPF
[0164] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de 2 construcciones recombinantes de HVT únicos (vHVT1 14 y vHVT1 16), 2 construcciones recombinantes de SB1 (vSB1-007 y vSB1-008) que expresan el gen NDV F y un recombinante de HVT doble (vHVT304) contra la exposición a la enfermedad de Newcastle con NDV ZJ1 (genotipo VIId) y California/02 (genotipo V) realizada a los 21 días de edad en pollos SPF.
[0165] Las características de estas 5 vacunas candidatas se describen en la Tabla 20 a continuación.
Tabla 20 Características de los vectores usados en el estudio de ex osición
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[0166] En D0, 158 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 6 grupos de 24 aves (vacunadas) y 1 grupo de 12 aves (controles no vacunados). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 1000 ufp como se describe en la Tabla 21 a continuación. Las aves se separaron después en dos subgrupos, estando cada uno de los subgrupos expuesto por vía intramuscular en D21 con 5 log10 EID50 de la cepa velogénica de NDV ZJ1 (genotipo VIId) o California/02 (genotipo V).
Tabla 21 Resultados de eficacia
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30 9 % 5 %
[0167] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los problemas técnicos observados con los aisladores redujeron el número de aves en el grupo 2 (vHVT1 14: de 24 a 14) y en el grupo 3 (vHVT1 16: de 24 a 20). Los signos clínicos del NDV se registraron después de la exposición. El suero se recolectó de muestras de sangre tomadas de aves de los grupos 2 y 7 antes de la exposición (D21) para la serología de NDV mediante la prueba HI usando cada cepa de exposición como antígeno.
[0168] Los porcentajes de protección contra la mortalidad y la morbilidad se indican en la tabla anterior. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1, validando de este modo la alta gravedad de ambas exposiciones. Todas las vacunas indujeron altos niveles (<75 %) de protección contra ambas exposiciones. La protección clínica completa contra ambas exposiciones se indujo por vHVT114 y vSB 1-008.
[0169] La propagación se evaluó después de la exposición mediante RT-PCR en tiempo real en frotis orales y cloacales tomados 2 y 4 días después de la exposición. El porcentaje de aves positivas (Ct <40) se muestra para ambas exposiciones en las Figuras 17A y 17B. Cabe apreciar que las 6 aves murieron a los 4 después de la exposición en el grupo de control expuesto al aislado CA/02 y solo un ave (de 6) seguía con vida a los 4 después de la exposición en el grupo de control expuesto a ZJ1. Se detectó propagación en todas las aves control. Se observó una reducción del porcentaje de aves positivas para la propagación en todos los grupos vacunados.
[0170] En conclusión, los resultados de este estudio mostraron una muy buena protección contra la ND a las 3 semanas de edad inducida por las vacunas vectoriales de la enfermedad de Marek probadas.
Ejemplo 14 Eficacia de las vacunas vHVT114, vSB1-007, vSB1-009, vHVT306 y vHVT307 contra las exposiciones a la cepa NDV Texas GB a los 28 días de edad en pollos SPF
[0171] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de combinaciones de diferentes vacunas vectoriales de la enfermedad de Marek que expresan el NDV F y/o el gen VP2 de IBDV contra la exposición a la enfermedad de Newcastle (cepa Texas GB, genotipo II) realizada a los 28 días de edad en pollos SPF.
[0172] Las características de las 5 vacunas recombinantes candidatas probadas en este estudio se describen en la Tabla 22 a continuación.
Tabla 22 Características de los vectores usados en el estudio de ex osición
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[0173] Las vacunas contra el virus de la enfermedad de Marek serotipo 1 (cepa CVI988 (o Rispens); herpesvirus gallináceo 2) y serotipo 2 (cepa SB-1; herpesvirus gallináceo 3) también se usaron en combinación con virus recombinantes en algunos de los grupos.
[0174] En D0, 135 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 9 grupos de 15 aves. A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp para vacunas recombinantes (vSB1-007, vSB 1-009, vHVT13, vHVT306, vHVT307, vHVT114), y 1000 ufp para cepas parentales de vacuna contra la enfermedad de Marek (SB-1 y CVI988). El diseño del estudio se muestra en la Tabla 23 a continuación. Las aves se expusieron por vía intramuscular en D28 con la cepa velogénica 4,0 log10 EID50 ND Texas GB (genotipo II).
Tabla 23 Resultados de eficacia
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[0175] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Se registraron los signos clínicos del NDV después de la exposición.
[0176] Los porcentajes de protección contra la mortalidad y la morbilidad se indican en la tabla 23 anterior. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Se observaron excelentes niveles de protección en todos los grupos vacunados. Las aves de G3, G6, G7 y G9 estaban completamente protegidas. Este estudio muestra que los candidatos vSB1-ND pueden administrarse conjuntamente con vHVT13 y CVI988 y aun así proporcionar una muy buena protección contra ND. De manera similar, HVT-IBD ND doble es compatible con SB-1, y vHVT-ND (vHVT1 14) es compatible con vHVT13 y SB-1.
[0177] En conclusión, los resultados de este estudio mostraron la falta de interferencia en la protección contra la ND inducida por las vacunas parentales y vectoriales de la enfermedad de Marek probadas.
Ejemplo 15 Eficacia de vHVT114, vHVT307, vSB1-007 y vSB1-009 en combinación con vHVT13 contra exposiciones a la cepa de NDV Chimalhuacan (genotipo V) en D28 en pollos SPF
[0178] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de una construcción recombinante de HVT (vHVT114) y dos construcciones recombinantes de SB1 (vSB1-007 y vSB 1-009) que expresan el gen NDV F en combinación con vHVT-IBD (vHVT13), así como un doble hVt vHVT307 que expresaba tanto NDV F como VP2 de IBDV frente a la exposición a la enfermedad de Newcastle (Chimalhuacan, genotipo V) realizada a los 28 días de edad en pollos SPF.
[0179] Las características de estas 4 vacunas candidatas se describen en la Tabla 24 a continuación.
Tabla 24 Características de los vectores usados en el estudio de ex osición
Figure imgf000028_0002
[0180] En D0, 45 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 4 grupos de 10 aves y 1 grupo de 5 aves (grupos de control sin vacunar). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp como se describe en la Tabla 25 a continuación. Las aves se expusieron por vía intramuscular en D28 con la cepa velogénica 5,0 log10 EID50 Chimalhuacan (genotipo V).
Tabla 25 Diseño de estudio y resultados de la eficacia contra ND
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[0181] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos del NDV se registraron después de la exposición. Se tomaron frotis orofaríngeos en los grupos vacunados a los 5 y 7 días después de la exposición para evaluar la carga viral mediante RT-PCR en tiempo real.
[0182] Los porcentajes de protección contra la mortalidad y la morbilidad se indican en la tabla anterior. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Se observó una muy buena protección en los 4 grupos vacunados, induciéndose una protección clínica completa por vHVT114+vHVT13. Se muestra el porcentaje de aves positivas y el título medio de propagación (expresado como log 10 EID50 equivalente por ml) en las Figuras 18A y 18B. Sorprendentemente, no se detectó propagación en G2, lo que indica una protección contra ND completa (contra tanto los signos clínicos como la propagación) inducida por vHVT114, incluso si se administra conjuntamente con vHVT13, en las condiciones probadas. Los niveles de propagación detectados en los otros grupos vacunados fueron bajos, con un nivel ligeramente superior detectado en G3 (vHVT307) solo 5 días después de la infección (pi).
[0183] En conclusión, este ejemplo ilustra adicionalmente la excelente protección contra ND inducida por el recombinante HVT-IBD ND doble o una combinación de los virus recombinantes SB1-ND o HVT-ND y HVT-IBD (vHVT13). Contrariamente a la creencia general en el campo de que una segunda vacuna HVT (vacunas contra HVT regulares o vacunas contra HVT recombinantes) interfiere con la inmunidad a los genes extraños insertados en la primera vacuna contra HVT recombinante, la presente invención mostró un resultado sorprendente de que vHVT114 en combinación con vHVT13 ofreció una excelente protección contra el NDV y no se observó efecto de interferencia.
Ejemplo 16 Eficacia de vHVT306, vSB1-008 en combinación con vHVT13 administrado por SC o in ovo contra la exposición a la cepa Chimalhuacan de NDV (genotipo V) en D28 en pollos SPF
[0184] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia del HVT doble VHVT306 que expresa los ambos genes NDV F y VP2 de IBDV, y el vSB1-008 SB1 recombinante que expresa el gen NDV F en combinación con vHVT-IBD (vHVT13), administrado in ovo o por vía subcutánea contra la exposición a la enfermedad de Newcastle (Chimalhuacan, genotipo V) realizada a los 28 días de edad en pollos SPF.
[0185] El diseño de los grupos se muestra en la Tabla 26. Se usaron sesenta huevos embrionarios SPF (después de aproximadamente 18 días y 18 horas de incubación; D-3) para la administración in ovo (20 por grupo para G1, G2 y G3). Se administraron cincuenta microlitros de vacuna que contenía 2000 UFP por vía in ovo utilizando el dispositivo IntelliLab System de AviTech LLC (Salisbury, MD, EE.UU.). La incubabilidad y la supervivencia se registraron después de la administración in ovo. En D0, 20 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 2 grupos de 10 aves (G4 y G5). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea (SC) en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp como se describe en la Tabla 26 a continuación. Diez aves por grupo se expusieron por vía intramuscular en D28 con la cepa velogénica 5,0 log10 EID50 Chimalhuacan (genotipo V).
Tabla 26 Diseño de estudio y resultados de la eficacia contra ND
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[0186] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos del NDV se registraron después de la exposición. Se tomaron frotis orofaríngeos en los grupos vacunados a los 5 y 7 días después de la exposición para evaluar la carga viral mediante RT-PCR en tiempo real.
[0187] Se registró la incubabilidad completa y viabilidad hasta D28 (día de exposición) para las aves de los grupos G1 y G2. La incubabilidad en G3 fue del 85 % y un ave adicional murió después de la eclosión en este grupo. La menor incubabilidad de ese grupo puede deberse a problemas con la incubadora de huevos. Los pesos corporales de machos y hembras en G1, G2 y G3 fueron similares en D1 y en D28.
[0188] Los porcentajes de protección contra la mortalidad y la morbilidad se indican en la tabla 26. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Se observó una muy buena protección en los 4 grupos vacunados, induciéndose una protección clínica completa por vHVT306 administrado por ambas rutas.
[0189] Se muestra el porcentaje de aves positivas y el título medio de propagación (expresado como log 10 EID50 equivalente por ml) en la Tabla 27. Se observó la ausencia de propagación detectable o muy baja en G2 y G4 vacunados con vHVT306. Los niveles de propagación detectados en los grupos vacunados con vSB1-008 vHVT13 fueron mayores, especialmente a los 5 días posteriores a la infección (pi).
Tabla 27 Resultados de la protección contra la propagación (porcentaje de aves con propagación detectable y carga ______________ viral media en log10) evaluados en D5 y D7 después de la exposición a NDV______________
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[0190] En conclusión, este ejemplo muestra una excelente protección contra la ND inducida por recombinante de HVT doble VHVT306 administrado in ovo o por SC. El rendimiento de vSB1-008 vHVT13 fue ligeramente inferior, especialmente después de la administración in ovo, pero puede deberse, al menos parcialmente, a problemas con la incubadora de huevos. De hecho, la prueba de seguridad in ovo de otro SB1-ND recombinante (vSB1-009) a 1000 o 4000 UFP asociado con 6000 UFP de vHVT13 no mostró ninguna diferencia en la incubabilidad y la supervivencia temprana con un grupo que recibió 6000 UFP de vHVT13 solamente.
Ejemplo 17 Eficacia de vHVT304, vHVT306, vSB1-007 y vSB1-008 en combinación con vHVT13 frente a la exposición a la cepa de NDV Chimalhuacan (genotipo V) en D42 en pollos de engorde comerciales [0191] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de dos HVT dobles (vHVT304 y vHVT306) que expresan ambos genes NDV F y VP2 de IBDV, y dos recombinantes de SB1 (vSB1-007 y vSB 1-008) que expresan el gen NDV F en combinación con vHVT-IBD (vHVT13) frente a la exposición a la enfermedad de Newcastle (Chimalhuacan, genotipo V) realizada a los 42 días de edad en pollos de engorde comerciales.
[0192] El diseño de los grupos se muestra en la Tabla 28. En D0, 55 pollos de engorde comerciales de un día de edad se asignaron al azar a 5 grupos de 11 aves. A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea (SC) en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp como se describe en la Tabla 28 a continuación. Diez aves por grupo se expusieron por vía intramuscular en D42 con la cepa velogénica 5,0 log10 EID50 Chimalhuacan (genotipo V).
________________ Tabla 28 Diseño de estudio y resultados de la eficacia contra ND________________
Figure imgf000030_0002
[0193] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos del NDV se registraron durante 14 días después de la exposición. Se tomaron frotis orofaríngeos en los grupos vacunados a los 5 y 7 días después de la exposición para evaluar la carga viral mediante RT-PCR en tiempo real.
[0194] Los porcentajes de protección contra la mortalidad y la morbilidad se indican en la tabla 28. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Se observó una muy buena protección en los 4 grupos vacunados, induciéndose una protección clínica completa inducida por vHVT306 y por vSB1-007+vHVT13.
[0195] Se muestra el porcentaje de aves positivas y el título medio de propagación (expresado como log10 EID50 equivalente por ml) en la Tabla 29. La mejor reducción de propagación se indujo por vHVT306 y vSB1-007 vHVT13, que también fueron los mejores candidatos para la protección clínica.
Tabla 29 Resultados de la protección contra la propagación (porcentaje de aves con propagación detectable y carga viral media en log10) evaluados en D5 y D7 después de la exposición a NDV (pi)
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[0196] El vSB1-007+vHVT13 actuó mejor que vSB1-008+vHVT13. La estructura genómica vSB1-007 difiere de la de vSB1-008 en diferentes aspectos: locus de inserción, promotor, señal de poliadenilación y origen del gen F. La combinación de estas secuencias extrañas y el lugar de inserción en vSB 1-007 probablemente fueron responsables de su mejor rendimiento de protección contra ND.
[0197] En resumen, este ejemplo ilustra la importancia del lugar de inserción y otras secuencias reguladoras del casete de expresión de NDV en la protección contra ND inducida por los vectores HVT y MDV serotipo 2.
Ejemplo 18 Eficacia de HVT-ND+IBD doble (vHVT304 y vHVT306) o SB1-ND (vSB1-008) en combinación con vacunas recombinantes vHVT13, frente a la exposición a un aislado de IBDV clásico en D14 en pollos SPF [0198] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia temprana de IBD de los recombinantes dobles de HVT vHVT304 y vHVT306, así como la de vHVT13 administrado conjuntamente con una construcción recombinante de SB1-ND (vSB1-008) frente a una exposición a virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa virulenta (vIBDV) (cepa Faragher 52/70) realizada a los 14 días de edad en pollos SPF.
[0199] En D0, 95 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 9 grupos de 10 aves y 1 grupo de 5 aves (grupo de control no expuesto sin vacunar). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 300 o 1000 ufp como se describe en la Tabla 30 a continuación. En D14, se extrajo una muestra de sangre de 5 aves por grupo para las pruebas serológicas con el Kit ProFLOK® plus IBD (Synbiotics Corp). Las aves (10 aves por grupo, excepto para el grupo 7 en el que 1 ave murió antes de la exposición) se expusieron por gota ocular (0,05 ml por ave) a 2,5 log10 EID50.
Tabla 30 Diseño de estudio resultados de la eficacia contra IBD
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[0200] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos de IBDV se registraron durante 11 días después de la exposición (de D15 a D25). Al final del periodo de observación posterior a la exposición (D25), todas las aves supervivientes se sacrificaron y se les realizó la autopsia. Se registró el peso corporal y de la bolsa. Cada bolsa de Fabricio (BF) se pesó y después se almacenó en recipientes individuales que contenían formaldehído al 4 % para histología. Las lesiones histológicas de la bolsa se puntuaron según la escala presentada en la Tabla 31.
Tabla 31 Escala de puntuación de las lesiones histológicas de la bolsa de Fabricio* Puntuación Observación histológica/lesiones
0 Sin lesión, bolsa normal
1 Del 1 % al 25 % de los folículos muestran agotamiento linfoide (es decir, menos del 50
% de agotamiento en 1 folículo afectado), afluencia de heterófilos en las lesiones Del 26 % al 50 % de los folículos muestran un agotamiento linfoide casi completo (es 2 decir, más del 75 % de agotamiento en 1 folículo afectado), los folículos afectados _________________ muestran necrosis y se puede detectar una afluencia grave de heterófilos______
3 Del 51 % al 75 % de los folículos muestran agotamiento linfoide; los folículos afectados muestran lesiones de necrosis y se detecta una afluencia grave de heterófilos
Del 76 % al 100 % de los folículos muestran un agotamiento linfoide casi completo; se 4 detectan hiperplasia y estructuras quísticas; los folículos afectados muestran necrosis y _____________________________se detecta una afluencia grave de heterófilos_________________
El 100 % de los folículos muestran un agotamiento linfoide casi completo; pérdida
5 completa de la estructura folicular; epitelio engrosado y plegado; fibrosis del tejido de la _____________________________________________bolsa_________________________________ * Fuente: Monografía N.° 01/2008: 0587 de la Farmacopea de la UE "Avian Infectious Bursal Disease ___________________________________ vaccine (live)____________________________________
[0201] Se consideró que un ave estaba afectada si moría y/o mostraba signos notables de enfermedad y/o lesiones graves de la bolsa de Fabricio (es decir, puntuación histológica <3).
[0202] El título de anticuerpos contra IBD+ por ELISA medio expresado en log10 antes de la exposición se muestra en la Tabla 30. Se detectaron títulos significativos en todos los grupos vacunados que fueron significativamente más altos que los del grupo de control G1. El título de serología no fue dependiente de la dosis.
[0203] Se observaron signos clínicos graves después de la exposición en todas las aves del grupo de control G1. Siete de 10 aves de ese grupo murieron dentro del periodo de observación de 11 días, lo que indica la gran gravedad de la exposición. Ninguna de las aves vacunadas mostró signos clínicos graves después de la exposición, excepto un ave de G4 que murió. Los porcentajes de protección contra lesiones graves de la bolsa se muestran en la tabla 30 anterior. Se observó una protección significativa contra la IBD en todos los grupos, observándose la mejor protección en G2 y G3 (vHVT13 en solitario). La administración conjunta de vSB1-008 vHVT13 y las construcciones dobles de vHVT304 y vHVT306 indujeron niveles similares de protección contra IBD. La protección no fue dependiente de la dosis en las dosis probadas. Las relaciones medias en peso de la bolsa/cuerpo también se muestran en la Tabla 30. Las relaciones en todos los grupos vacunados fueron más altas que las del grupo de control expuesto.
[0204] En conclusión, estos datos indican que tanto la combinación de un vector SB1-ND con HVT-IBD simple como HVT doble que expresa tanto NDV-F como IBDV-VP2 inducen anticuerpos contra IBD y una protección temprana contra IBD en un modelo de exposición a IBDV grave.
Ejemplo 19 Eficacia de HVT-ND simple (vHVT114) o SB1-ND (vSB1-007 y vSB1-009) en combinación con vacunas recombinantes vHVT13, frente a la exposición a un aislado de IBDv muy virulento en D23 en pollos de engorde comerciales
[0205] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia contra IBD de vHVT13 administrado conjuntamente con una construcción recombinante HVT-ND (vHVT1 14) o SB1-ND (vSB1-007 y vSB 1-009) frente a una exposición al virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa muy virulento (wIBDV) (aislado 91-168/980702) realizada a los 23 días de edad en pollos de engorde comerciales.
[0206] En D0, 90 pollos de engorde de un día de edad se asignaron al azar a 7 grupos de 12 aves y 1 grupo de 6 aves (grupo de control no expuesto sin vacunar). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 3000 ufp como se describe en la Tabla 32. En D14, se extrajo una muestra de sangre de 5 aves por grupo para las pruebas serológicas con el Kit ProFLOK® plus IBD (Synbiotics Corp). El suero de 10 pollos de engorde de un día adicionales se ensayó en D0 con el mismo kit para evaluar el nivel de anticuerpos maternos contra IBDV. Las aves (10 aves por grupo) se expusieron por gota ocular (0,05 ml por ave) en D23 a 4,3 log10 EID50 del aislado vvIBDV 91-168.
[0207] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos de IBDV se registraron durante 11 días después de la exposición (de D23 a D33). Al final del periodo de observación posterior a la exposición (D33), todas las aves supervivientes se sacrificaron y se les realizó la autopsia. Se registró el peso corporal y de la bolsa. Cada bolsa de Fabricio (BF) se pesó y después se almacenó en recipientes individuales que contenían formaldehído al 4 % para histología. Las lesiones histológicas de la bolsa se puntuaron según la escala presentada en la Tabla 31.
[0208] Se consideró que un ave estaba afectada si moría y/o mostraba signos notables de enfermedad y/o lesiones graves de la bolsa de Fabricio (es decir, puntuación histológica <3).
Tabla 32 Diseño del estudio y resultados serológicos
Grupo Vacuna a un día de edad (D0) Título de IBD+ ELISA en D23, Relación en peso media de la bolsa/cuerpo2
G1 - 3,9 0,0007
G2 vHVT13 4,0 0,0015
G3 vHVT114+vHVT13 4,1 0,0015
G4 vSBI-007+vHVT13 3,8 0,0018
G5 vSBI-009+vHVT13 4,0 0,0019
1 Títulos de IBD+ ELISA medios expresados en log10 en el suero de 5 aves por grupo muestreadas en D23 antes de la exposición;
2 La relación en peso de la bolsa/cuerpo del grupo no vacunado/no expuesto fue de 0,0047
[0209] El título serológico medio de IBD+ por ELISA en D0 fue de 4,36 ± 0,01 log10, lo que indica un nivel muy alto de anticuerpos maternos contra IBD en la eclosión. En D23, el título medio de IBD+ por ELISA todavía era alto (3,9) en el control G1. Los títulos medios por ELISA en los grupos vacunados no fueron significativamente diferentes de los del grupo control.
[0210] No se observó morbilidad ni mortalidad en ninguno de los grupos después de la exposición. Los porcentajes de protección contra lesiones graves de la bolsa se muestran en la Tabla 32 anterior. El resultado mostró que la administración conjunta de vHVT114, vSB 1-007 o vSB1-009 no interfirió con la protección contra IBD inducida por vHVT13, lo que indica una falta de interferencia. De manera similar, las relaciones medias en peso de la bolsa/cuerpo de los grupos vacunados fueron similares y claramente más altas que las del grupo de control, lo que indica protección contra IBD y ninguna diferencia entre los regímenes de vacunación.
[0211] En conclusión, los datos indican la compatibilidad entre vHVT114, vSB1-007 o vSB 1-009 y vHVT13 para la protección contra IBD.
Ejemplo 20 Eficacia de HVT-ND+IBD doble (vHVT304 y vHVT306) asociado o no con SB-1 y de SB1-ND (vSB1-007 y vSB1-008) en combinación con vacunas recombinantes vHVT13, frente a la exposición a un aislado de IBDV de variante E en D28 en pollos SPF
[0212] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de dos HVT dobles (HVT-ND+IBD: vHVT304 y vHVT306) o dos vSB-1-NDV en combinación con las vacunas vectorizadas vHVT13 (vSB1-007+vHVT13, vSB1-008+vHVT13) administradas por vía subcutánea (SC) a pollos SPF de un día de edad y expuestos a la variante de IBDV (VAR-E) 28 días después de la vacunación.
[0213] En D0, 105 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 7 grupos de 15 aves, incluido un grupo de controles expuestos (G6) y controles no expuestos (G7). A las aves de los grupos G1 a G5 se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D0 0,2 ml de vacunas recombinantes y/o SB-1 cada conteniendo una dosis objetivo de 2000 ufp. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 33 a continuación. En D28, todas las aves de los grupos G1 a G6 se expusieron por gota ocular (0,03 ml que contenía 3 log10 EID50 por ave) del aislado de variante E del IBDV de la Universidad de Delaware (EE.UU.). Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Once días después de la exposición, las aves se pesaron y se les realizó la autopsia. Las bolsas se recogieron y se pesaron. Se calculó la relación en peso de la bolsa/cuerpo (relación en peso de la bolsa/cuerpo x 100).
___________ Tabla 33 Diseño de estudio y resultados de la eficacia contra IBD___________ Grupo Vacuna a un día de edad Relación media en peso de la bolsa/cuerpo (*100) G1 vHVT304 0,33
G2 vHVT304+SB-1 0,33
G3 vHVT306 0,29
G4 vHVT 13+vSB1-007 0,49
G5 vHVT13+vSB1-008 0,47
G6 - (con exposición) 0,13
G7 - (sin exposición) 0,46
[0214] Las relaciones medias en peso de la bolsa/cuerpo se muestran en la Tabla 33. Las aves de control expuestas tuvieron una atrofia de la bolsa grave en comparación con las no expuestas. Las vacunas vSB1-007 y vSB 1-008 no interfirieron en la protección inducida por vHVT13 (G4 y G5). Las relaciones en peso de la bolsa/cuerpo de las aves vacunadas con HVT doble (HVT-ND IBD) fueron ligeramente más bajas que el grupo de control no expuesto, pero fueron claramente más altas que los grupos de control expuestos. Además, la vacuna contra la enfermedad de Marek SB-1 serotipo 2 no interfirió con la protección contra IBD inducida por vHVT304.
[0215] En conclusión, estos datos indican que tanto la combinación de un vector SB1-ND con HVT-IBD simple como HVT doble que expresa tanto NDV-F como IBDV-VP2 inducen protección contra IBD en un modelo de exposición a IBDV de variante E.
Ejemplo 21 Falta de interferencia de vHVT114, vSB1-009 y/o SB-1 en la protección contra IBD de variante E inducida por vHVT13 en pollos SPF
[0216] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia contra IBD de vHVT13 cuando se administró por SC o in ovo de forma concomitante con vHVT114, vSB 1-009 y/o SB-1 en pollos SPF en una variante de IBDV (vAr-E) en el modelo de exposición de D28.
[0217] 75 pollos SPF de un día de edad y 75 embriones de pollo SPF de 18 a 19 días de edad se asignaron al azar a 5 grupos (G1 a G5 y G6 a G10, respectivamente) incluyendo un grupo de controles expuestos (G4 y G9, respectivamente) y controles no expuestos (G5 y G10, respectivamente). A las aves de los grupos G1 a G3 se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas cada una conteniendo una dosis objetivo de 3000 ufp excepto para SB-1 que tenía una dosis objetivo de 1000 UFP. Las aves de G6 a G8 recibieron las mismas dosis de vacuna pero en un volumen de 0,05 ml por la ruta in ovo 2-3 días antes de la eclosión. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 34 a continuación. A los 28 días de edad, todas las aves de los grupos G1 a G4 y G6 a G9 se expusieron por gota ocular (0,03 ml que contenía 3 log10 EID50 por ave) del aislado de variante E del IBDV de la Universidad de Delaware (EE.UU.). Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Once días después de la exposición, las aves se pesaron y se les realizó la autopsia. Las bolsas se recogieron y se pesaron. Se calculó la relación en peso de la bolsa/cuerpo (relación en peso de la bolsa/cuerpo x 100).
Tabla 34 Diseño de estudio y resultados de la eficacia contra IBD
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( p )
[0218] Las relaciones medias en peso de la bolsa/cuerpo se muestran en la Tabla 34. Las aves de control expuestas (G4 y G9) tuvieron una atrofia de la bolsa grave en comparación con las no expuestas. Las relaciones en peso de la bolsa/cuerpo de los grupos vacunados (G1 a G3 y G6 a G8) fueron similares a las de los grupos de control no expuestos (G5 y G10) y muy por encima de las de los grupos de control expuestos (G4 y G9). La falta de interferencia de vHVT114 en la protección contra IBD inducida por vHVT 13 después de ambas vías SC o in ovo fue sorprendente y confirmó los datos obtenidos en los ejemplos 15 y 19.
[0219] En conclusión, estos datos indican claramente la compatibilidad de vHVT114 vSB1-009 o SB-1 y vSB 1-009 con vHVT13 cuando se administran por SC o in ovo en un modelo de exposición a IBDV de variante E.
Ejemplo 22 Eficacia de vHVT114 y vHVT13 y los vectores SB1 o vSB1-009 frente a una exposición a la enfermedad de Marek mucho más virulenta
[0220] El objetivo de este estudio fue evaluar la eficacia de la enfermedad de Marek inducida por diferentes combinaciones de vacunas, incluidas vHVT114, vHVT13, SB-1 y/o vSB1-009 administradas por vía SC a pollos SPF de un día de edad y expuestos 4 días después al aislado de T-King del virus de la enfermedad de Marek mucho más virulento (vv MDV).
[0221] En D0, 100 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 5 grupos de 20 aves. A las aves de los grupos 1 a 3 se les inyectaron mediante inyección subcutánea en el cuello en DO 0,2 ml de vacunas que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp para cada vacuna, excepto para SB-1 para el cual la dosis objetivo era de 1000 ufp. Las aves de los grupos 4 y 5 no fueron vacunadas y se usaron como controles simulados expuestos (grupo 4) o no expuestos (grupo 5). El diseño del estudio se muestra en la Tabla 35. En D4, todas las aves de los grupos 1 a 4 se expusieron a 0,2 ml del aislado de Vv MDV T-King utilizando la vía de administración intraperitoneal.
Tabla 35 Diseño del estudio y resultados de la protección contra MD
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[0222] Cada grupo se controló diariamente para detectar cualquier reacción desfavorable antes y después de la exposición. El día 49, todas las aves vivas se sacrificaron y se sometieron a una autopsia para examinar lesiones macroscópicas asociadas con la enfermedad de Marek. Los pollos se clasificaron como positivos para la infección con la enfermedad de Marek si se observaron signos nerviosos, tales como parálisis, signos del sistema locomotor atribuibles a la enfermedad, y emaciación grave o depresión, si se produce una mortalidad directamente atribuible a la enfermedad de Marek, o si se observan lesiones macroscópicas en la autopsia. Las lesiones pueden incluir, pero sin limitación, las siguientes: lesiones en el hígado, corazón, bazo, gónadas, riñones y lesiones musculares
[0223] Los resultados de protección se muestran en la Tabla 35 anterior. Todos los grupos vacunados (G1 a G3) actuaron por igual, lo que indujo una protección parcial (65 %) contra MD como se esperaba en este modelo de exposición muy grave y temprana. Estos resultados indicaron que las vacunas vectoriales candidatas conservan su capacidad de protección contra la enfermedad de Marek.
Ejemplo 23 Evaluación de la eficacia de la enfermedad de Marek del vector SB1-ND combinada con el vector HVT-IBD
[0224] La sinergia entre HVT parental y el SB-1 en la inducción de una protección contra la enfermedad de Marek es bien conocida. El vector SB-1 que expresa un gen extraño puede, por lo tanto, mezclarse con HVT parental o HVT vectorizado que expresa otro gen extraño para obtener una solución de vacuna bivalente o trivalente, respectivamente. Un ejemplo de la evaluación de la eficacia contra la enfermedad de Marek inducida por una combinación de vSB1-009 con vHVT114 y vHVT13 se muestra anteriormente (ejemplo 22). La eficacia contra la enfermedad de Marek (MD) también se demuestra para los recombinantes vectorizados de la enfermedad de Marek, ya sea en solitario o en combinación en otros modelos de exposición a MD, incluyendo la exposición a la enfermedad de Marek virulenta (vMD), tal como GA22, la exposición a la enfermedad de Marek muy virulenta (vvMD), tal como RB1B y/o la exposición a la enfermedad de Marek mucho más virulenta (vv MD), tal como el virus T. King. Los pollos de un día se inoculan por vía subcutánea o los huevos embrionarios de 18-19 días se inoculan con una dosis de 0,2 ml o una dosis de 0,05 ml, respectivamente, de los virus de ensayo. A los cinco días de edad, los pollos vacunados y los controles sin tratar se exponen al virus de exposición a Marek relevante (v, vv o vv MDV). Las aves expuestas se observan hasta las siete semanas de edad. Todas las aves se sacrifican y se realizan necropsias para observar las lesiones visibles macroscópicas asociadas con la enfermedad de Marek, como se describe en el Ejemplo 22.
Ejemplo 24 Eficacia de vSB1-004, vSB1-006, vSB1-007, vSB1-008, la vacuna contra ND vectorizada con SB1 en solitario o en asociación con la vacuna contra IBD vectorizada con HVT vHVT13, y las vacunas vHVT302 y vHVT304 frente a exposición a la cepa de NDV Texas GB a los 14 y/o 28 días de edad en pollos SPF
[0225] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de combinaciones de diferentes vacunas vectoriales de la enfermedad de Marek que expresan el NDV F y/o el gen VP2 de IBDV contra la exposición a la enfermedad de Newcastle (cepa Texas Gb , genotipo II) realizada a los 14 y/o 28 días de edad en pollos SPF.
[0226] Las características de las 6 vacunas recombinantes candidatas contra NDV probadas en este estudio se describen en la Tabla 36 a continuación.
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[0227] En D0, 225 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 9 grupos de 15 aves (G1a a G9a expuestos en D14) y 6 grupos de 15 aves (G1b, G3b, G4b, G5b, G8b, G9b expuestos en D28). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp para vacunas recombinantes. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 37 a continuación. Las aves se expusieron por vía intramuscular en D14 o D28 a 4,3 y 4,2 log10 EID50 (0,1 ml) de la cepa velogénica ND Texas GB (genotipo II), respectivamente.
Tabla 37 Resultados de eficacia contra ND
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[0228] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Se registraron los signos clínicos del NDV después de la exposición. Un ave murió en G6 y G7 antes de la exposición, lo que redujo el número de aves de 15 a 14 en estos grupos.
[0229] Los porcentajes de protección clínica (incluida la protección contra la mortalidad y la morbilidad) se indican en la Tabla 37 anterior. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1a y G1b, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Se observaron protecciones parciales que variaban del 13,3 al 46,6 % después de la exposición en D14, induciéndose los niveles más altos de protección por vSB1-008, vSB1-007 y vHVT304. Los niveles de protección después de la exposición a ND en D28 fueron mucho más altos para todos los grupos vacunados y fueron de nuevo ligeramente más altos en los grupos vacunados con vSB1-008, vSB1-007 o vHVT304. Estos resultados indicaron que los niveles de protección contra ND dependían de la fecha de la exposición y de la construcción. Las construcciones vSB 1-008 y vSB1-007 actuaron ligeramente mejor que vSB 1-004 y vSB 1-006, y vHVT304 actuó ligeramente mejor que vHVT302, lo que indica que las diferentes características de las construcciones desempeñan un papel en la actuación de las vacunas vectoriales basadas en MDV.
[0230] En conclusión, los resultados de este estudio mostraron que los niveles de protección contra ND inducidos por los vectores de la enfermedad de Marek que expresan el gen NDV F pueden depender de diferentes parámetros incluyendo el vector, el locus de inserción, el gen F, el promotor, el sitio de poliadenilación y las condiciones de exposición.
Ejemplo 25 Eficacia de las vacunas HVT-ND+IBD doble vHVT304 y vHVT306 frente a exposición a la cepa de NDV Texas GB a los 14 y/o 28 días de edad en pollos SPF
[0231] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de la vacuna vectorizada con HVT que expresa ambos genes NDV F y VP2 de IBDV frente a la exposición a la enfermedad de Newcastle (cepa Texas GB, genotipo II) realizada a los 14 y/o 28 días de edad en pollos SPF.
[0232] Las características de las 2 vacunas recombinantes candidatas probadas en este estudio se describen en la Tabla 38 a continuación.
Tabla 38 Características de las vacunas recombinantes candidatas utilizadas en este estudio
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[0233] En D0, 90 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 3 grupos de 15 aves (G1a a G3a expuestos en D14) y 3 grupos de 15 aves (G1b a G3b expuestos en D28). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp para vacunas recombinantes. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 39 a continuación. Las aves se expusieron por vía intramuscular en D14 o D28 a una dosis objetivo de 4,0 log10 EID50 (0,1 ml) de la cepa velogénica ND Texas GB (genotipo II).
Tabla 39 Resultados de eficacia contra ND
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[0234] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Se registraron los signos clínicos del NDV después de la exposición. Un ave murió en G2b antes de la exposición, lo que redujo el número de aves de 15 a 14 en este grupo.
[0235] Los porcentajes de protección clínica (incluida la protección contra la mortalidad y la morbilidad) se indican en la Tabla 39 anterior. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1a y G1b, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Los niveles de protección después de la exposición en D14 fueron mucho más bajos que los obtenidos después de la exposición en D28. Estas vacunas candidatas tenían el mismo casete de expresión de NDV F insertado en 2 loci diferentes del genoma de vHVT13. Actuaron de igual manera en términos de protección contra ND en las condiciones ensayadas, lo que indica que ambos loci de inserción (IG2 y SORF3-US2) son igualmente adecuados para la inserción del casete de NDV F.
[0236] En conclusión, los resultados de este estudio mostraron que los niveles de protección contra ND inducidos por los vectores de la enfermedad de Marek que expresan el gen NDV F dependen de diferentes parámetros incluyendo el vector, el locus de inserción, el gen F, el promotor, el sitio de poliadenilación y las condiciones de exposición.
Ejemplo 26 Eficacia temprana contra ND inducida por HVT-ND+IBD doble (vHVT302, vHVT303, y vHVT304) o vectores SB1 (vSB1-006 y vSB1-007) en pollos SPF de un día de edad frente a una exposición a NDV velogénico del genotipo V
[0237] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres vectores HVT-ND+IBD dobles (vHVT302, vHVT303, y vHVT304) y dos vectores SB1-ND (vSB1-006 y vSB1-007) en pollos SPF de un día de edad frente a una exposición velogénica a NDV del genotipo V (Chimalhuacan) realizada en D14.
[0238] Las características de las 5 vacunas recombinantes candidatas probadas en este estudio se describen en la Tabla 40 a continuación.
Tabla 40 Características de las vacunas recombinantes candidatas utilizadas en este estudio
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_____ _____
[0239] Se constituyeron aleatoriamente seis grupos (1 y 2) de diez pollos Leghorn blancos libres de patógenos específicos (SPF) de un día de edad. Las aves de los grupos 2 a 6 se vacunaron por vía subcutánea (nuca) con una dosis objetivo de 2000 UFP como se muestra en la Tabla 41 a continuación. Los pollos del grupo 1 no fueron vacunados y se mantuvieron como aves de control. A las 2 semanas de edad, todas las aves se expusieron a la cepa velogénica de NDV Mexican Chimalhuacan del genotipo V (Mex V). La exposición se realizó por vía intramuscular (IM) utilizando 105 dosis infecciosas de embrión al 50 % (EID50) diluidas en 0,2 ml de agua fisiológica estéril. Todas las aves se controlaron hasta 14 días después de la exposición. Después de la exposición, el estado de salud de cada ave se calificó diariamente de la siguiente manera: sana/con síntomas específicos (plumas erizadas, postración, tortícolis, temblor)/muerta. Para el cálculo de la morbilidad se tuvo en cuenta cualquier ave que presentara síntomas específicos durante más de 2 días o que se notara enferma en D28.
Tabla 41 Resultados de la protección temprana contra la ND inducida por diferentes candidatos vectorizados con MDV ue ex resan el en NDV F en ollos SPF de un día de edad
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[0240] Los resultados de la protección se resumen en la Tabla 41. Todas las aves de control murieron después de la exposición a ND. Los niveles variables de protección contra ND se indujeron por las diferentes vacunas ensayadas que variaron del 10 % al 80 % y del 0 % al 60 % en términos de protección contra la mortalidad y la morbilidad, respectivamente. El candidato vHVT304 indujo una mejor protección que los candidatos vHVT303 y vHVT302; esto puede deberse a que el promotor SV40 exógeno se coloca frente al gen NDV F. El vSB1-007 actuó ligeramente mejor que el vSB 1-006. Además, los rendimientos obtenidos con vHVT304 fueron comparables a los obtenidos con vSB1-007, lo que indica que diferentes vectores de la enfermedad de Marek pueden alcanzar el mismo nivel de protección contra ND.
[0241] En conclusión, este estudio demuestra que ambas vacunas vectorizadas HVT-ND IBD doble y SB1-ND pueden alcanzar niveles significativos de protección contra ND en un modelo muy grave y temprano de exposición a NDV.
Ejemplo 27 Eficacia contra ND inducida por HVT-ND IBD doble vHVT306 administrado in ovo o SC a pollos SPF de un día de edad frente a una exposición velogénica a NDV del genotipo V realizada en D28
[0242] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de un HVT-ND+IBD doble (vHVT306) administrado in ovo o SC a pollos SPF frente a una exposición velogénica a NDV del genotipo V (Chimalhuacan) realizada a los 28 días de edad.
[0243] Las características de la vacuna recombinante vHVT306 candidata ensayada en este estudio se describen en la Tabla 42 a continuación. La vacuna del vector HVT-IBD simple vHVT13 se usó como control.
Tabla 42 Características de la vacuna recombinante candidata utilizada en este estudio
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[0244] El día -3, se asignaron al azar 40 huevos embrionarios SPF de aproximadamente 18 días y 18 horas de incubación a 2 grupos de 20 huevos cada uno. En D0, se añadió un grupo de pollos SPF de 12 días de edad. La definición de grupos se da en la Tabla 43 a continuación. La vacunación se realizó en D-3 (in ovo) o en D0 (vía SC, en la nuca) y la dosis objetivo de vHVT306 y vHVT13 fue de 2000 UFP/ave. Para la vía in ovo, se controlaron la incubabilidad, la viabilidad (hasta D28) y el crecimiento de las aves (entre la incubación y D28).
[0245] En D28, 10 aves por grupo se expusieron a la cepa virulenta de ND Chimalhuacan. La exposición se realizó por vía intramuscular (IM) utilizando 105 dosis infecciosas de embrión al 50 % (EID50) diluidas en 0,2 ml de agua fisiológica estéril. Las aves se controlaron hasta 14 días después de la exposición. Se registraron signos clínicos específicos y la mortalidad. Para el cálculo de la morbilidad se tuvo en cuenta cualquier ave que presentara síntomas específicos durante más de 2 días o que se notara enferma en D42. Cinco y siete días después de la exposición (es decir, en D33 y D35), se tomó un frotis orofaríngeo de cada ave superviviente. Todos los frotis se analizaron mediante qVR-PCR de NDV específica.
Tabla 43 Resultados de la protección contra ND inducida por el candidato vectorizado vHVT306 MDV que expresa l n NDV F VP2 IBDV mini r r l ví in v n ll PF
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[0246] Se registró la incubabilidad total después de la vacunación in ovo en los grupos 1 y 2 y todas las aves incubadas sobrevivieron hasta D28. No se detectaron diferencias en el peso corporal entre los dos grupos, tanto en D0 como en D28, lo que confirma la seguridad perfecta de vHVT306 cuando se administra in ovo. Los resultados de la protección se resumen en la Tabla 43. Todas las aves de control vacunadas con vHVT13 murieron 4 días después de la exposición a ND. La protección clínica completa contra ND se indujo por vHVT306 administrado por ambas vías. Además, no se detectó propagación después de la administración in ovo, mientras que solo algunas aves propagaron una cantidad detectable de virus de exposición después de la administración de SC.
[0247] En conclusión, este estudio demuestra que el HVT-ND IBD doble vHVT306 induce un excelente nivel de protección contra ND por las vías de administración SC o in ovo en un modelo de exposición a NDV heterólogo muy grave.
Ejemplo 28 Eficacia de vacunas recombinantes de HVT-ND+IBD doble (vHVT302, vHVT303 y vHVT304), frente a la exposición a un aislado de IBDV clásico en D15 en pollos SPF
[0248] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia temprana contra IBD de construcciones de recombinantes dobles de HVT vHVT302, vHVT303 y vHVT304 frente a una exposición al virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa virulenta (vIBDV) (cepa Faragher 52/70) realizada a los 15 días de edad en pollos SPF.
[0249] Las características de las 3 vacunas recombinantes candidatas de HVT-ND+IBD doble ensayadas en este estudio se describen en la Tabla 44 a continuación.
Tabl HVT
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[0250] En D0, 40 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar en 4 grupos de 10 aves, incluido un grupo de control (G1) que se vacunó con vSB 1-004, un vector SB-1 que expresa el gen NDV F. Otras cinco aves SPF se mantuvieron sin vacunar y no se expusieron para determinar la evaluación del peso de la bolsa/cuerpo. A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp como se describe en la Tabla 45 a continuación. En D15, se extrajo una muestra de sangre de todas las aves por grupo (10 aves por grupo, excepto para los grupos 1 y 3 en los que 1 ave murió antes de la muestra de sangre) para las pruebas serológicas con el Kit ProFLOK® plus IBD (Synbiotics Corp). En D15, las aves de los 4 grupos se expusieron por gota ocular (0,05 ml por ave) con 2,5 log10 EID50.
Tabla 45 Diseño de estudio y resultados de la eficacia contra IBD
Figure imgf000039_0002
p p g p p
[0251] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos de IBDV se registraron durante 11 días después de la exposición (de D15 a D25). Al final del periodo de observación posterior a la exposición (D25), todas las aves supervivientes se sacrificaron y se les realizó la autopsia. Se registró el peso corporal y de la bolsa. Cada bolsa de Fabricio (BF) se pesó y después se almacenó en recipientes individuales que contenían formaldehído al 4 % para histología. Las lesiones histológicas de la bolsa se puntuaron según la escala presentada en la Tabla 46.
Tabla 46 Escala de puntuación de las lesiones histológicas de la bolsa de Fabricio*__________
Figure imgf000039_0003
Figure imgf000040_0002
( )________________________________________ |____________________________________________
[0252] Se consideró que un ave estaba afectada si moría y/o mostraba signos notables de enfermedad y/o lesiones graves de la bolsa de Fabricio (es decir, puntuación histológica <3).
[0253] El título de anticuerpos contra IBD+ por ELISA medio expresado en log10 antes de la exposición se muestra en la Tabla 45. Se detectaron títulos significativos en todos los grupos vacunados que fueron significativamente más altos que los del grupo de control G1. El título de serología fue ligeramente mayor en G3 (vHVT303).
[0254] Se observaron signos clínicos graves después de la exposición en las 9 aves del grupo de control G1, que llevaron a la muerte de 1 ave. Solo un ave vacunada en G2 (vHVT302) mostró signos clínicos después de la exposición. Los porcentajes de protección contra lesiones graves de la bolsa se muestran en la Tabla 45 anterior. Se observó una protección significativa contra IBD en todos los grupos vacunados, y se observó una protección completa en G3 (vHVT303). Las relaciones medias en peso de la bolsa/cuerpo también se muestran en la Tabla 45. Las relaciones en todos los grupos vacunados fueron más altas que las del grupo de control expuesto G1 y no fueron significativamente diferentes del grupo de control no vacunado y sin exposición.
[0255] En conclusión, estos datos indican que los tres HVT-IBD ND dobles ensayados en este estudio indujeron anticuerpos contra IBD y una protección temprana contra IBD en un modelo de exposición a IBDV grave.
Ejemplo 29 Eficacia de cinco vacunas candidatas HVT-ND diferentes frente a exposición a un aislado velogénico de NDV ZJ1 (genotipo VIId) a los 14 días de edad en pollos SPF
[0256] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de 5 construcciones recombinantes de HVT simple (vHVT39, vHVT110, vHVT111, vHVT112 y vHVT113) que expresan el gen NDV F frente a la exposición a la enfermedad de Newcastle con el aislado velogénico de NDV ZJ1 (genotipo VIId) realizada a los 14 días de edad en pollos SPF.
[0257] Las características de estas 5 vacunas candidatas se describen en la Tabla 47 a continuación.
Tabla 47 Características de los virus recombinantes HVT-ND utilizados en el estudio de ex osición
Figure imgf000040_0001
[0258] En D0, 72 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 5 grupos de 12 aves (vacunadas) y 1 grupo de 12 aves (controles no vacunados). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 6000 ufp como se describe en la Tabla 48 a continuación. Las aves se expusieron por vía intramuscular en D14 con 5 log 10 EID50 de la cepa velogénica de NDV ZJ1/2000 (genotipo VIId).
Tabla 48 Resultados de eficacia contra ND
Figure imgf000040_0003
[0259] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos del NDV y la mortalidad se registraron después de la exposición. Se tomaron frotis orofaríngeos 2 y 4 días después de la infección (dpi) para evaluar la carga viral mediante RT-PCR en tiempo real utilizando el procedimiento descrito por Wise et al. (2004; Development of a Real-Time Reverse-Transcription PCR for Detection of Newcastle Disease Virus RNA in Clinical Samples. J Clin Microbiol 42, 329-338).
[0260] Los porcentajes de protección contra la mortalidad y la morbilidad se indican en la Tabla 48 anterior. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Las vacunas indujeron niveles variables de protección contra la mortalidad (25-100 %) o contra la morbilidad (8 %-83 %). El mejor nivel de protección se indujo por vHVT110 mientras que el más bajo se indujo por vHVT039, mientras que los otros candidatos dieron resultados intermedios. Los resultados de la propagación orofaríngea en 2 y 4 dpi también se muestran en la Tabla 48 anterior y están en línea con los de la protección clínica. Estas vacunas candidatas difieren en su promotor y en la secuencia del gen F. Estos resultados muestran que ambos parámetros son importantes para el diseño de la vacuna candidata óptima contra HVT-ND.
[0261] En conclusión, los resultados de este estudio mostraron la importancia del promotor y la secuencia del gen F en la eficacia contra ND inducida por la vacuna candidata contra ND vectorizada con HVT.
Ejemplo 30 Evaluación de la eficacia contra la enfermedad de Newcastle inducida por construcciones de SB1 dobles que expresan VP2 de IBDV y NDV F
[0262] El objetivo del estudio es evaluar la eficacia de construcciones dobles de SB1 que expresan VP2 de IBDV y NDV F frente a la exposición a la enfermedad de Newcastle.
[0263] En D0, los pollos SPF de un día de edad se asignan al azar en varios grupos de 10-20 aves, incluidos los grupos vacunados y no vacunados. A las aves de los grupos vacunados se les inyectan por inyección subcutánea en el cuello en D0 0,2 ml que contienen una dosis objetivo de 1000 a 5000 ufp de vacunas recombinantes. Como alternativa, la misma dosis en 0,05 ml puede administrarse in ovo 2 o 3 días antes de la eclosión. Las aves (al menos un grupo vacunado y un grupo no vacunado) se exponen por vía intramuscular en un momento diferente después de la vacunación: por ejemplo, D14, D28 o D42 a aproximadamente 4,0 log10 EID50 (0,1 ml) de una cepa de NDV velogénica tales como las cepas Texas GB (genotipo II), ZJ1 (genotipo VIId), Chimalhuacan (genotipo V).
[0264] Cada grupo se controla clínicamente antes y después de la exposición. Los signos clínicos del NDV (morbilidad) y la mortalidad se registran después de la exposición. Se calculan los porcentajes de protección clínica en todos los grupos. Al menos el 90 % de las aves SPF expuestas no vacunadas deberían morir o estar gravemente enfermas después de la exposición para validar la gravedad de la exposición. Los frotis orofaríngeos y cloacales pueden ser muestras en diferentes momentos después de la exposición, tal como 3, 5, 7 y 9 días después de la exposición y la carga viral se puede estimar mediante RT-PCR en tiempo real. Los mejores candidatos serán aquellos que induzcan el nivel más alto de protección clínica y el nivel más bajo de carga viral en los frotis. Se puede realizar un estudio similar en pollos de engorde que contienen anticuerpos maternos contra NDV; sin embargo, estos anticuerpos maternos pueden proteger potencialmente a las aves no vacunadas si la exposición se realiza temprano. La construcción doble de SB1 también se puede ensayar en combinación con otra vacuna contra la enfermedad de Marek o vacunas vectoriales.
Ejemplo 31 Evaluación de la eficacia contra la enfermedad de la bursitis infecciosa por construcciones de SB1 dobles que expresan VP2 de IBDV y NDV F
[0265] El objetivo del estudio es evaluar la eficacia contra IBD de SB1 doble que expresa tanto el VP2 del IBDV como el NDV F.
[0266] Los pollos SPF de un día de edad se asignan al azar en varios grupos de 10 a 20 aves, incluidos los controles vacunados y no vacunados. Los controles no vacunados se separarán en 2 subgrupos, incluidas las aves expuestas y no expuestas. A las aves de los grupos vacunados se les inyectan por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas, cada una conteniendo una dosis objetivo de 1000 a 5000 ufp. Como alternativa, la misma dosis en 0,05 ml puede administrarse in ovo 2 o 3 días antes de la eclosión. En diferentes momentos después de la vacunación, tal como 14, 21, 28 o 42 días después de la vacunación, todas las aves de los grupos vacunados y los controles expuestos se exponen por gota ocular (0,03 ml que contienen de 2 a 4 log 10 EID50 por ave) de un IBDV virulento (tal como la cepa Faragher o la cepa estándar de EE.UU.), un IBDV muy virulento tal como el aislado 91-168 o un aislado de IBDV variante tal como el aislado de la variante E US Delaware. Cada grupo se controló clínicamente antes y después de la exposición. Se realizó la autopsia a las aves 4 o 5 días después del desafío para la evaluación de las lesiones macroscópicas de las bolsas. También se pueden realizar las autopsias de 10 a 11 días después de la exposición. Se pueden evaluar lesiones macroscópicas y/o histológicas. Además, las aves y la bolsa se pesan, y las relaciones en peso de la bolsa/cuerpo (relación en peso de la bolsa/cuerpo x 100) se calculan en comparación con las del grupo no vacunado sin exposición. Las aves de control SPF expuestas deben mostrar signos clínicos y/o tener lesiones macroscópicas y/o histológicas significativas, y/o deben tener una relación en peso de la bolsa/cuerpo significativamente menor que las aves de control no vacunadas y no expuestas para

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición o vacuna para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmunógena o protectora en un animal contra uno o más patógenos aviares, comprendiendo dicha composición o vacuna un vector de la cepa SB-1 de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) recombinante, comprendiendo dicho vector uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar, en la que el polinucleótido heterólogo codifica la proteína del virus de la enfermedad de Newcastle NDV-F, en la que dicho procedimiento comprende al menos una administración de dicha composición o vacuna.
2. La composición o vacuna para su uso según la reivindicación 1, que comprende además una o más composiciones o vacunas seleccionadas del grupo que consiste en un vector de HVT recombinante (o MDV-3 o Meleagrid herpesvirus-1) que comprende polinucleótidos heterólogos que codifican y que expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar, HVT de tipo silvestre (MDV-3), vector MDV-1 recombinante (o herpesvirus-2 gallináceo) que comprende polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar, MDV-1 de tipo silvestre, y una combinación de los mismos.
3. La composición o vacuna para su uso según la reivindicación 2, en la que el vector HVT recombinante es vHVT13.
4. La composición o vacuna para su uso según las reivindicaciones 1-2, en la que la secuencia de la proteína NDV-F tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en las SEQ ID NOs: 2, 9, 50, 52 o 54.
5. La composición o vacuna para su uso según las reivindicaciones 1-2, en la que el polinucleótido que codifica NDV-F tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs: 1, 8, 49, 51 o 53.
6. La composición o vacuna para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el polinucleótido heterólogo en el herpesvirus gallináceo 3 se inserta en la región que codifica la glucoproteína c (UL44), la región entre ORF UL55 y ORF LORF5 en la región única larga (UL), la región entre ORF SORF4 y ORF US10, o en la región US2 del vector de herpesvirus gallináceo 3.
7. La composición o vacuna para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el vector recombinante de herpesvirus gallináceo 3 comprende un promotor.
8. La composición o vacuna para su uso según la reivindicación 7, en la que el promotor se selecciona del grupo que consiste en un promotor CMV temprano inmediato, un promotor CMV de cobaya, un promotor SV40, un promotor de la glucoproteína X del virus de la pseudorrabia, un promotor alfa 4 del virus del herpes simple 1, un promotor de la glucoproteína A (o gC) del virus de la enfermedad de Marek, un promotor de la glucoproteína B del virus de la enfermedad de Marek, promotor de la glucoproteína E del virus de la enfermedad de Marek, glucoproteína B del virus de la laringotraqueítis infecciosa, glucoproteína E del virus de la laringotraqueítis infecciosa, glucoproteína D del virus de la laringotraqueítis infecciosa o un promotor de glucoproteína I del virus de la laringotraqueítis infecciosa, y un promotor VP8 del herpesvirus 1.1 bovino.
9. La composición o vacuna para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende además un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable.
10. Un vector recombinante de la cepa SB-1 de herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2) que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica una proteína del virus de la enfermedad de Newcastle NDV-F, un promotor, y una señal de poliadenilación; en el que
(a) el polinucleótido heterólogo es un polinucleótido NDV-F VI I d de tipo silvestre, el promotor es un promotor IE del citomegalovirus de ratón (mCMV IE) y la señal de poliadenilación es una señal de poliadenilación del virus de simio 40 (SV40), adicionalmente, en el que el polinucleótido heterólogo que codifica NDV-F se inserta en la región entre ORF SORF4 y ORF US10 del vector de la cepa SB-1 del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2); o
(b) el polinucleótido heterólogo es un polinucleótido NDV-F VIId optimizado por codones, el promotor es un promotor SV40 y la señal de poliadenilación es SEQ ID NO: 13, adicionalmente, en el que el polinucleótido heterólogo que codifica NDV-F se inserta en la región entre ORF UL55 y ORF LORF5 en la región única larga (UL) del vector de la cepa SB-1 del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2); o
(c) el polinucleótido heterólogo es un polinucleótido NDV-F VIId optimizado por codones, el promotor es un promotor SV40 y la señal de poliadenilación es endógena originada en el gen de la glucoproteína C (gC), adicionalmente, en el que el polinucleótido heterólogo que codifica NDV-F se inserta en la región que codifica la glucoproteína C (UL44) del vector de la cepa SB-1 del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2); o
(d) el polinucleótido heterólogo es un polinucleótido NDV-F V (cepa CA02) optimizado por codones, el promotor es un promotor SV40 y la señal de poliadenilación es SEQ ID NO: 13, adicionalmente, en el que el polinucleótido heterólogo que codifica NDV-F se inserta en la región entre ORF UL55 y ORF LORF5 en la región única larga (UL) del vector de la cepa SB-1 del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2); o
(e) el polinucleótido heterólogo es un polinucleótido NDV-F V (cepa CA02) optimizado por codones, el promotor es un promotor SV40 y la señal de poliadenilación es endógena originada en el gen de la glucoproteína C (gC), adicionalmente, en el que el polinucleótido heterólogo que codifica NDV-F se inserta en la región que codifica la glucoproteína C (UL44) del vector de la cepa SB-1 del herpesvirus gallináceo 3 (MDV-2).
11. El vector según la reivindicación 10 para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmunógena o protectora en un animal contra uno o más patógenos aviares, en el que dicho procedimiento comprende al menos una administración de dicha composición o vacuna.
12. La composición o vacuna para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o el vector para su uso según la reivindicación 11, adicionalmente, en la que dicha composición, vacuna o vector es para su uso en un procedimiento de vacunación de un animal, comprendiendo el procedimiento al menos una administración de la composición, vacuna o vector.
13. La composición, vacuna o vector para su uso según la reivindicación 12, en la que el procedimiento comprende un régimen de administración de sensibilización y refuerzo.
14. La composición, vacuna o vector para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 u 11­ 13, en la que el animal es un ave.
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