KR20140097515A - 조류 병원체의 항원을 발현하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (ｍｄｖ 혈청형 2) 벡터 및 그의 용도 - Google Patents

조류 병원체의 항원을 발현하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (ｍｄｖ 혈청형 2) 벡터 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조류 병원체의 항원을 함유 및 발현하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 벡터, 돌연변이화 gC 유전자를 함유하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 벡터, 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 벡터를 포함하는 조성물, 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 벡터 및 하나 이상의 야생형 바이러스 또는 재조합 벡터를 포함하는 다가 백신을 제공한다. 본 발명은 각종 조류 병원체에 대항하는 백신접종 방법 및 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 벡터의 제조 방법을 추가로 제공한다.

Description

조류 병원체의 항원을 발현하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (ＭＤＶ 혈청형 2) 벡터 및 그의 용도 {RECOMBINANT GALLID HERPESVIRUS 3 (MDV SEROTYPE 2) VECTORS EXPRESSING ANTIGENS OF AVIAN PATHOGENS AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 명세서는 2011 년 11 월 30 일에 제출한 미국 가출원 제 61/564,877 호 및 2012 년 8 월 30 일에 제출한 미국 가출원 제 61/694,957 호에 대해 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 각종 병원체에 대항해 보호하는 안전한 면역 비히클로서 사용되기 위한 외래 유전자의 삽입 및 발현용 재조합 바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 각종 병원체에 대항해 보호되도록 하나 이상의 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 다가 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 재조합 바이러스 벡터를 제조 및 이용하는 방법에 관한 것이다.
가금류 백신접종은 뉴캐슬 질환 (ND), 전염성 점액낭병 (IBD), 마렉병 (MD), 전염성 기관지염 (IB), 전염성 후두기관염 (ILT) 및 조류 인플루엔자 (AI) 을 비롯한 파괴적인 질환에 대항해 가금류를 보호하는데 널리 사용된다. ND 는 파라믹소대 (Paramyxoviridae) 패밀리에 속하는 ND 바이러스 (NDV) 로 지칭되는 조류 파라믹소바이러스 1 (APMV-1) 에 의해 야기된다. MD 는 MD 바이러스 혈청형 1 (MDV1) 으로서 지칭되는 칠면조 헤르페스바이러스 2 (헤르페스비리대 (Herpesviridae) 패밀리) 에 의해 야기된다. IB 는 코로나비리대 (코로나viridae) 패밀리에 속하는 IB 바이러스 (IBV) 에 의해 야기되고, ILT 는 또한 ILT 바이러스 (ILTV) 로 지칭되는 칠면조 헤르페스바이러스 1 (헤르페스비리대 패밀리) 에 의해 야기되고, AI 는 오르토믹소비리대 (Orthomyxoviridae) 패밀리에 속하는 AI 바이러스 (AIV) 에 의해 야기된다.
다수의 재조합 조류 바이러스 벡터가 이들 조류 병원체에 대항해 새의 예방접종하는 견지에서 제시된 바 있다. 사용된 바이러스 벡터는 조류폭스 바이러스, 특히 계두 (EP-A-0,517,292), 마렉 바이러스, 예컨대 혈청형 2 및 3 (HVT) (WO-A-87/04463), 또는 대안적으로 ITLV, NDV 및 조류 아데노바이러스를 포함한다. 이들 재조합 조류 바이러스 벡터 중 일부를 백신접종에 사용한 경우, 이들은 가변적인 수준의 보호를 나타낸다.
IBDV, NDV, ILTV 및 AIV 를 포함하는 각종 병원체로부터의 항원을 발현하는 몇몇의 재조합 칠면조 헤르페스 (HVT, 또한 멜리아그리드 (Meleagrid) 헤르페스 1 또는 MDV 혈청형 3 으로 지칭) 벡터가 (US 특허 번호 5,980,906, 5,853,733, 6,183,753, 5,187,087) 개발되어 허가된 바 있다. 특히 관심 있는 것은 전통적인 IBD 백신보다 분명한 이점을 보이는 IBDV VP2 보호 유전자를 발현하는 HVT 벡터이다 (Bublot et al J.Comp. Path.2007, Vol.137, S81-S84). 여타 관심 있는 HVT 벡터는 NDV (Morgan et al 1992, Avian dis. 36, 858-70) 또는 ILTV (Johnson et al, 2010 Avian Dis 54, 1251-1259) 보호 유전자(들)를 발현하는 것이다. 여러 종의 HVT-기재 재조합 백신을 함께 이용하는데 있어서 실용적인 문제점 중 하나는 이들의 간섭 (interference) 이다. 상이한 항원을 발현하는 2 종의 HVT 재조합체들을 혼합하는 경우 그 질환 중 적어도 하나에 대항해 낮은 보호가 유도된다 (Rudolf Heine 2011; Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vaccines which May Cause an Effect on the Economic Benefits of those Vaccines; paper presented at the XVII World Veterinary Poultry Association (WVPA) Congress in Cancun, Mexico, August 14-18, 2011; Slacum G, Hein R. and Lynch P., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek's vaccines, 58th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, CA, USA, March 23rd-25th, p 84).
HVT 와 SB-1, 즉 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV 혈청형 2 또는 MDV-2) 의 조합 백신 균주가 MD 보호에 대해 시너지 효과를 보였다 (Witter and Lee, 1984, Avian Pathology 13, 75-92). 상기 간섭 문제를 다루기 위해, HVT 벡터와 혼화가능할 수 있는 보호 항원(들)을 발현시켜 MD 보호를 개선하고자 백신 벡터로서 SB-1 바이러스를 평가하는 것에 관심이 있다.
SB-1 게놈을 클로닝하고, 박테리아 인공 염색체 (BAC) 에서 특성화하였다 (Petherbridge, et al.,J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009; Singh et al., Research in Veterinary Science 89, 140-145, 2010). MDV2 SB-1 서열이 최근에 수득되어 분석되었다 (Spatz and Schat, Virus Gene 42, 331-338, 2011). SB-1 바이러스의 당단백질 E 결실이 Petherbridge et al. (J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009)] 에 의해 기재되어 있다. 그러나, SB-1 을 외래 보호 유전자를 발현하는 바이러스 벡터로서 이용하는 연구는 보고된 바 없다.
UL13 단백질 키나아제 및 당단백질 C (UL44) 유전자 양자 모두는 각각 닭에서 MDV 의 수평적인 전염에 필수적이라는 점이 밝혀진 바 있다 (Jarosinski, et al., J. of Virology 81, 10575-10587, 2007; Jarosinski, et al., J. of Virology 84, 7911-7916, 2010).
동물 병원체, 예컨대 NDV 및 IBDV 의, 수의과적 공중 위생 및 경제에 대한 잠재적인 작용을 고려할 때, 감염을 예방하고 동물을 보호하는 효율적인 방법이 필요하다. 2 종의 HVT-기재 벡터 백신 사이에서 관찰된 간섭이라는 문제점을 완화시킬 수 있는 백신을 제조하기 위한 적합한 방법 및 조합된 효과적인 벡터 백신 용액에 대한 요구가 존재한다.
본 발명의 개요
본 발명은 마렉병 바이러스를 넘어 가금류 병원체에 대항해 보호하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 바이러스 벡터를 처음으로 입증하였다.
본 발명은 각종 조류 병원체에 대항해 동물을 보호하기 위해 다가 백신을 이용했을 때 놀라운 결과를 보였다.
본 발명은 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩하고 발현하는 하나 이상의 이종 (heterologous) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 돌연변이화 당단백질 C (gC) 유전자를 포함하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩하고 발현하는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터를 포함하는 조성물 또는 백신을 제공한다. 본 발명은 추가로 돌연변이화 당단백질 C (gC) 유전자를 포함하는 하나 이상의 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 하기를 포함하는 다가 조성물 또는 백신을 제공한다: i) 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩 및 발현하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 돌연변이화 당단백질 C (gC) 유전자를 포함하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터; 및 ii) 하기 중 하나 이상: 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩 및 발현하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 HVT 벡터 (또는 MDV-3 또는 멜리아그리드 헤르페스바이러스-1); 또는 야생형 HVT (MDV-3); 또는 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩 및 발현하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 MDV 혈청형 1 벡터 (즉, MDV-1, 칠면조 헤르페스바이러스-2); 또는 임의의 야생형 MDV-1.
본 발명은 본 발명의 조성물 또는 벡터의 적어도 한 투여를 포함하는 동물의 백신접종 또는 동물에 면역원 또는 보호 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 SB-1 게놈의 비필수 영역에 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드의 도입을 위한 특이적 삽입 유전자좌를 추가로 제공한다.
하기 상세한 설명은 예로서 제공되나, 본 발명을 기술된 특정 구현예로 제한하려는 것이 아니며, 참조로서 본원에서 통합된 하기 첨부된 도면과 함께 이해될 수 있다:
도 1 은 각 DNA 및 단백질 서열에 부여된 SEQ ID NO 를 보여주는 표이다.
도 2 는 SB-1 게놈 조직의 개략도를 나타낸다.
도 3 은 NDV-F 단백질을 발현하는 재조합 vSB1-004 바이러스의 면역형광 염색을 나타낸다.
도 4 는 프라이머 결합 부위의 개략적 표시를 나타낸다.
도 5 는 vSB1-004 를 동정하는 PCR 결과를 나타낸다.
도 6 은 NDV-F 단백질을 발현하는 재조합 vSB1-006 바이러스의 면역형광 염색을 나타낸다.
도 7 은 vSB1-006 상 프라이머 결합 부위의 개략적 표시를 나타낸다.
도 8 은 vSB1-006 의 PCR 결과를 나타낸다.
도 9 는 NDV-F 단백질을 발현하는 재조합 SB1-007 바이러스의 면역형광 염색을 나타낸다.
도 10 은 pSB1 44 cds SVOptF 공여체 플라스미드 상 프라이머 위치의 개략도를 나타낸다.
도 11 은 vSB1-007 의 PCR 결과를 나타낸다.
도 12 는 NDV-F 단백질을 발현하는 재조합 SB1-008 바이러스의 면역형광 염색을 나타낸다.
도 13 은 프라이머 결합 부위의 개략적 표시를 나타낸다.
도 14 는 vSB1-008 의 PCR 결과를 나타낸다.
도 15 는 vSB1-009 감염 세포로부터의 면역침전된 샘플의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 16 은 vHVT114 의 면역침전 및 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 17 은 CA02 및 ZJ1 NDV 챌린지 (challenge) 에 대항하는 재조합체의 임상적 분석 (챌린지 바이러스를 셰딩 (shedding) 하는 새의 백분율) 을 나타낸다.
도 18 은 NDV 챌린지에 대항하는 재조합체의 임상적 분석 (구강인두 셰딩) 을 나타낸다.
도 19 는 서열 정렬 및 서열 동일성% 를 나타낸다.
도 20 은 DNA 및 단백질 서열을 나타낸다.
본 명세서에서, 특히 청구항에서, "포함하다", "포함되는", "포함하는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어, 이들은 "포함하다", "포함되는", "포함하는" 등을 의미할 수 있고; "~ 로 본질적으로 이루어지는" 및 "~ 로 본질적으로 이루어지다" 와 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 갖고, 예를 들어, 이들은 명백하게 언급되지 않은 요소를 포함하나, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특성에 영향을 미치는 요소는 배재한다는 점에 유의한다.
다르게 설명되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 과학적 용어는 통상적인 용도에 따라 사용된다. 분자 생물학에서의 통상 용어의 정의는 문헌 [Benjamin Lewin, Genes V. published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)] 에서 찾아볼 수 있다. 단수형 용어에는 문맥이 명백하게 다르게 표시하지 않는 한 복수의 지시대상이 포함된다. 유사하게는, "또는" 이라는 단어는 문맥이 명백하게 다르게 표시하지 않는 한 "및" 을 포함하는 것으로 의도된다. 단어 "또는" 은 특정 리스트의 임의의 한 구성원을 포함하고, 또한 그 리스트의 구성원의 임의의 조합을 포함한다.
용어 "동물" 은 포유류, 새, 물고기를 포함하는 것으로 본원에서 사용된다. 본원에서 사용되는 동물은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다: 말류 (예를 들어, 말), 개류 (예를 들어, 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼), 고양이류 (예를 들어, 사자, 호랑이, 집고양이, 들고양이, 기타 큰 고양이, 및 치타 및 스라소니를 비롯한 기타 고양이과), 소류 (예를 들어, 소), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 양류 (예를 들어, 양, 염소, 어린양, 들소), 조류 (예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치, 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조), 영장류 (예를 들어, 원원류, 안경원숭이, 원숭이, 긴팔원숭이, 유인원), 인간 및 물고기. "동물" 이라는 용어에는 또한 배아 및 태아 단계를 비롯한, 모든 발달 단계의 개개의 동물이 포함된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질" 은 본원에서 호환되게 사용되고, 연이은 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다.
용어 "핵산", "뉴클레오티드", 및 "폴리뉴클레오티드" 는 호환되게 사용되고, RNA, DNA, cDNA, 또는 cRNA 및 개질된 백본을 포함하는 것과 같은 이들 유도체를 지칭한다. 본 발명은 본원에 기재된 것과 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다는 점이 인지되어야 한다. 본 발명에서 고려되는 "폴리뉴클레오티드"는 전향적 가닥 (5' → 3') 및 역향적 상보성 가닥 (3' → 5') 모두를 포함한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 상이한 방법 (예, 화학적 합성, 유전자 클로닝 등) 으로 제조될 수 있고, 각종 형태 (예, 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥, 또는 이의 하이브리드, 프라이머, 프로브 등) 을 취할 수 있다.
용어 "게놈 DNA" 또는 "게놈" 은 호환되어 사용되며, 숙주 생물체의 유전학적 유전자 정보를 지칭한다. 게놈 DNA 는 핵의 DNA (염색체 DNA 로도 지칭됨) 뿐 아니라 또한 원형자 (예, 엽록체) 의 DNA 및 기타 세포소기관 (예, 미토콘드리아) 의 DNA 를 포함한다. 본 발명에서 고려되는 게놈 DNA 및 게놈은 또한 바이러스의 RNA 를 지칭한다. RNA 는 + 가닥 또는 - 가닥 RNA 일 수 있다. 본 발명에서 고려되는 용어 "게놈 DNA" 는 본원에 기재된 것과 상보적인 서열을 포함하는 게놈 DNA 를 포함한다. 용어 "게놈 DNA" 는 또한 메신져 RNA (mRNA), 상보성 DNA (cDNA), 및 상보성 RNA (cRNA) 을 지칭한다.
용어 "유전자" 는 생물학적 기능과 연관되는 폴리뉴클레오티드의 임의의 분절을 언급하는데 폭넓게 사용된다. 따라서, 유전자 또는 폴리뉴클레오티드에는 게놈 서열에서와 같은 인트론 및 엑손, 또는 단지 cDNA 에서와 같은 코딩 서열, 예컨대 시작 코돈 (메티오닌 코돈) 으로부터 시작하고 종결 시그널 (중지 코돈) 으로 종결되는 열린 해독틀 (open reading frame (ORF)) 이 포함된다. 유전자 및 폴리뉴클레오티드는 또한 전사 시작, 번역 및 전사 종료와 같이 이의 발현을 조절하는 영역을 포함할 수도 있다. 따라서 또한 프로모터 및 리보솜 결합 영역 (일반적으로는 코딩 서열 또는 유전자의 시작 코돈의 상향스트림 (upstream) 에서 대략적으로 60 내지 250 뉴클레오티드에 놓인 이들 조절 요소; Doree S M et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.), 전사 터미네이터 (일반적으로, 터미네이터는 코딩 서열 또는 유전자의 중지 코돈의 하향스트림에서 (downstream) 대략적으로 50 뉴클레오티드 내에 위치됨; Ward C K et al.) 이 포함된다. 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 또한 mRNA 또는 기능성 RNA 를 발현하거나, 특정 단백질을 인코딩하고, 조절성 서열을 포함하는 핵산 단편을 또한 언급한다.
본원에서 사용되는 바 용어 "이종 DNA" 는 상이한 유기체, 예컨대 수용자와 상이한 세포 유형 또는 상이한 종으로부터 유래된 DNA 를 지칭한다. 이 용어는 또한 숙주 DNA 의 동일한 게놈 상에서의 이의 DNA 또는 단편을 지칭하는데, 이때 이종 DNA 는 이의 원래 위치와는 상이한 게놈의 영역에 삽입된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원" 또는 "면역원" 이라는 용어는 숙주 동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 사멸된, 약독화된 또는 살아 있는 전체 유기체; 유기체의 서브유닛 또는 일부; 면역원성 특성을 갖는 삽입체를 함유하는 재조합 벡터; 숙주 동물에 제시되었을 때 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA의 조각 또는 절편; 폴리펩티드, 에피토프, 합텐 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원성 단백질 또는 펩티드" 에는 일단 숙주에 투여되면 그 단백질에 대한 체액성 및/또는 세포성 유형의 면역 반응을 유발할 수 있다는 의미에서 면역적으로 활성인 폴리펩티드가 포함된다. 바람직하게는 단백질 단편은 총 단백질과 실질적으로 동일한 면역적 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 단편은 하나 이상의 에피토프 또는 항원성 결정인자를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다. 본원에서 사용되는 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드에는 단백질의 전장 서열, 그의 유사체, 또는 그의 면역원성 단편이 포함된다. "면역원성 단편" 은 하나 이상의 에피토프를 포함하고 따라서 상기 기술된 면역적 반응을 유발하는 단백질의 단편을 의미한다. 상기 단편은 당업계에 잘 알려진 임의의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 식별될 수 있다. 예를 들어, [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996)] 을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는, 예를 들어, 많은 수의 펩티드를 고체 지지체 상에서 동시에 합성하고 (이 경우, 펩티드는 단백질 분자의 일부에 해당함), 펩티드가 지지체에 아직 부착되어 있는 동안 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 측정될 수 있다. 상기 기술은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,708,871 에 기술되어 있다. 유사하게는, 입체형태적 에피토프는 예컨대, 예를 들어, x-선 결정술 및 2차원 핵 자기 공명에 의해 아미노산의 공간적 입체구조를 확인함으로써 용이하게 식별된다. 예를 들어, 상기 [Epitope Mapping Protocols] 을 참조한다.
용어 "면역원성 단백질 또는 폴리펩티드" 는 폴리펩티드가 본원에서 정의된 바와 같은 면역적 반응을 초래하는 기능을 하는 한, 서열에 대한 결실, 부가 및 치환을 추가로 고려한다. 용어 "보존성 변이" 는 아미노산 잔기의 또다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 대체, 또는 인코딩된 아미노산 잔기가 변화하지 않거나 또다른 생물학적으로 유사한 잔기가 되도록 하는 핵산 서열 내 뉴클레오티드의 대체를 의미한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 성질이 보존성일 것이며, 즉 그러한 치환이 아미노산의 하나의 패밀리 내에서 일어날 것이다. 예를 들어, 아미노산은 일반적으로 하기와 같은 4 개의 패밀리로 분류된다: (1) 산성--아스파르테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성--알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프로린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전된 극성--글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 타이로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 보존성 변이의 예에는 하나의 소수성 잔기 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또다른 소수성 잔기로의 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 또다른 극성 잔기로의 치환, 예컨대 아르기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환 등; 또는 생물학적 활성에 중대한 영향을 미치지 않을, 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산에 의한 유사한 보존성 대체가 포함된다. 참조 분자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 작은 아미노산 치환을 보유하는 단백질은 그러므로 참조 폴리펩티드의 정의 안에 있다. 이들 개질에 의해 생성되는 모든 폴리펩티드가 본원에 포함된다. 용어 "보존성 변이" 는 치환된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체가 비치환된 폴리펩티드와도 면역반응한다는 전제 하에 비치환된 부모 아미노산 대신 치환된 아미노산의 사용도 포함한다.
용어 "에피토프"는 특이적 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 또는 합텐 상 부위를 지칭한다. 상기 용어는 또한 "항원성 결정인자" 또는 "항원성 결정인자 부위"와 상호 교환적으로 사용된다. 동일 에피토프를 인지하는 항원들은 하나의 항체의 또 다른 항체의 표적 항원에 대한 결합을 차단하는 능력을 보여주는 간단한 면역검정에서 동정될 수 있다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 반응" 은 관심의 조성물 또는 백신에 대한 세포성 및/또는 항체-매개 면역 반응의 숙주에서의 전개이다. 통상, "면역학적 반응" 에는 관심의 조성물 또는 백신에 포함되는 항원 또는 항원들에게 특이적으로 대항하는, 항체, B 세포, 조력자 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생성이라는 효과 중 하나 이상이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 숙주는 새로운 감염에 대한 저항성이 향상될 것이고/거나 질환의 임상적 심각성이 감소되는 식의, 치료적 또는 보호적 면역학적 반응을 나타낼 것이다. 이러한 보호는 감염된 숙주에 의해 정상적으로 나타나는 증상의 감소 또는 결핍, 감염된 숙주에서 보다 빠른 회복 시간 및/또는 보다 낮은 바이러스 역가에 의해 증명될 것이다.
용어 "재조합" 및 "유전적 개질된" 은 상호교환적으로 사용되고, 그의 천연 형태 또는 구조에서 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 임의의 개질, 변경 또는 조작, 또는 그의 천연 환경 또는 주위에서 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 임의의 개질, 변경 또는 조작을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 개질, 변경 또는 조작은 이에 제한되는 것은 아니나, 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 결실, 전체 유전자의 결실, 유전자의 코돈-적합화, 아미노산의 보존적 치환, 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드의 삽입을 포함한다.
용어 "다가 백신 또는 조성물", "조합 또는 콤보 백신 또는 조성물" 및 "다중가 백신 또는 조성물"은 하나 초과의 조성물 또는 백신을 포함하는 조성물 또는 백신을 지칭하는데 상호교환적으로 사용된다. 다가 백신 또는 조성물은 2, 3, 4 또는 그 이상의 조성물 또는 백신을 포함할 수 있다. 다가 백신 또는 조성물은 재조합 바이러스 벡터, 활성 또는 약독화 또는 사멸된 야생형 바이러스, 또는 재조합 바이러스 백터와 야생형 바이러스 백터 (활성 또는 약독화 또는 사멸 형태) 의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구현예는 돌연변이화 당단백질 C (gC 또는 UL44) 유전자를 포함하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 벡터를 제공한다. 용어 "돌연변이화 gC 유전자"는 변경 또는 조작되어 발현시 비(非)작용적 gC 단백질을 도모하는 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 의 gC 유전자를 지칭한다. 상기 gC 유전자의 변경 또는 조작에는, 작용적 gC 단백질의 발현에 필수적인 gC 유전자의 분절의 돌연변이화 또는 결실을 포함한다. 용어 "돌연변이화 gC 유전자"는 또한 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 의 전체 gC 유전자의 결실을 포함하는데, 이때 gC 단백질은 발현되지 않는다. 본 발명의 또 다른 구현예는 gC 단백질을 인코딩하는 (encoding) 천연 (야생형) 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 게놈에서 당단백질 C (gC) 유전자가 결실되어 있는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 를 제공한다. 용어 "당단백질 C (gC) 유전자"는 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 의 당단백질 C (gC) 를 인코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드, 및 그의 상동체 (homolog), 단편 또는 변이체를 포함한다. gC 유전자는 SEQ ID NO: 35 와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 gC 단백질 또는 그의 변이체를 인코딩할 수 있다. SEQ ID NO:34 와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 gC 유전자도 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 또 다른 구현예는 조류 병원체의 하나 이상의 항원 또는 폴리펩티드를 코딩 및 발현하는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 바이러스 벡터를 제공한다. 재조합 바이러스 벡터에 사용된 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 균주는 이에 제한되는 것은 아니나 시판중인 마렉병 백신 (SB-1 백신) (Merial Select Inc., Gainesville, GA 30503, USA) 을 포함한 임의의 SB-1 균주일 수 있으며, 이때 SB-1 균주는 GenBank 기탁 번호 HQ840738.1 로써 정의된 바와 같은 게놈 서열을 가진다. 재조합 바이러스 벡터에 사용되는 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 균주는, GenBank 기탁 번호 AB049735.1 에 의해 정의된 바와 같은 게놈 서열을 가진 HPRS24 균주, 또는 GenBank 기탁 번호 NC_002577.1 에 의해 정의된 바와 같은 게놈 서열을 가진 HPRS24 균주를 비롯한 임의의 여타 칠면조 헤르페스바이러스 3 단리물일 수 있다. HPRS24 및 SB-1 의 게놈은 98.4% 서열 동일성을 공유한다 (Spatz and Schat, 2011; Virus Gene 42, 331-338). 재조합 바이러스 벡터에 사용된 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 균주는 Witter (1987 Avian Dis 31, 752-765) 또는 Witter et al. (1987 Avian Dis 31, 829-840) 가 기술한 301B/1 단리물일 수 있다. 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 균주는 GenBank 기탁 번호 HQ840738.1 (SEQ ID NO:14), AB049735.1, 또는 NC_002577.1 에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가진 게놈 서열을 포함하는 임의의 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 균주일 수 있다.
항원 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는, 뉴캐슬 질환 바이러스 융합 단백질 (NDV-F), 뉴캐슬 질환 바이러스 적혈구응집소 뉴라미니다아제 (NDV-HN), 마렉병 바이러스 당단백질 C (gC), 마렉병 바이러스 당단백질 B (gB), 마렉병 바이러스 당단백질 E (gE), 마렉병 바이러스 당단백질 I (gI), 마렉병 바이러스 당단백질 H (gH) 또는 마렉병 바이러스 당단백질 L (gL), IBDV VP2, IBDV VPX, IBDV VP3, IBDV VP4, ILTV 당단백질 B, ILTV 당단백질 I, ILTV UL32, ILTV 당단백질 D, ILTV 당단백질 E, ILTV 당단백질 C, 인플루엔자 적혈구응집소 (HA), 인플루엔자 뉴라미니다아제 (NA) 를 코딩하는 것, 마이코플라스마 갈리셉티쿰 (Mycoplasma gallisepticum; MG), 또는 마이코플라스마 시노비애 (Mycoplasma synoviae; MS) 로부터 유래된 보호 유전자, 또는 그 조합물일 수 있다. 항원 또는 폴리펩티드는 조류 뇌척수염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 조류 메타뉴모바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 조류 아데노바이러스, 계두 바이러스, 조류 코로나바이러스, 조류 로타바이러스, 닭 빈혈 바이러스, 조류 아스트로바이러스, 조류 파르보바이러스, 콕시디아증 (에이머리아 종; Eimeria sp.), 캄필로박터 종 (Campylobacter sp.), 살모넬라 종 (Salmonella sp.), 파스테우렐라 종 (Pasteurella sp.), 아비박테리움 종 (Avibacterium sp.), 마이코플라스마 갈리셉티쿰, 마이코플라스마 시노비애, 클로스트리듐 종 (Clostridium sp.), 및 대장균 (E. coli) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가금류 병원체로부터의 임의의 항원일 수 있다.
더욱이, 상술된 항원 또는 폴리뉴클레오티드의 상동체는 본 발명의 범주 내에 존재하는 것으로 의도된다. 본원에서 이용되는 바, 용어 "상동체"에는 이종상동체 (ortholog), 유사체 (analog) 및 동족체 (paralog) 가 포함된다. 용어 "유사체" 는 동일 또는 유사한 기능을 가지나, 무관한 유기체에서 별도로 진화되어 온 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "이종상동체" 는 상이한 종으로부터이나, 공통의 조상 유전자로부터 종분화에 의해 진화되어온 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 보통, 이종상동체는 동일 또는 유사한 기능을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 용어 "동족체" 는 게놈 내 중복에 의해 관련되는 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 동족체는 보통 상이한 기능을 갖지만, 이들 기능은 관련될 수 있다. 야생형 폴리펩티드의 유사체, 이종상동체, 및 동족체는 번역후 개질에 의해, 아미노산 서열 차이에 의해, 또는 둘 다에 의해 야생형 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 특히, 본 발명의 상동체는 일반적으로 상술된 항원의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전부 또는 일부와 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 또는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 나타낼 것이고, 유사한 기능을 나타낼 것이다.
한 구현예에서, 본 발명은 NDV-F 항원 또는 폴리펩티드를 코딩하고 발현하는 1, 2 또는 그 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 바이러스 벡터를 제공한다. 한 측면의 구현예에서, NDV-F 항원 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, 9, 50, 52, 또는 54 로 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이들 폴리펩티드 중 하나의 8 개 이상 또는 10 개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 보존성 변이체, 대립 변이체, 상동체 또는 면역원성 단편, 또는 이들 폴리펩티드의 조합과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진다. 또 다른 측면의 구현예에서, NDV-F 항원 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2, 9, 50, 52, 또는 54 에 제시된 서열을 가진 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진다. 또한, 또다른 측면의 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1, 8, 49, 51, 또는 53 에 제시된 서열을 가진 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진다.
변이체는 대립 변이체를 포함한다. 용어 "대립 변이체" 는 단백질의 아미노산 서열에 변화를 초래하고 자연 집단 (예, 바이러스 종 또는 변종) 에 존재하는 다형성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 언급한다. 그러한 자연 대립 변이는 전형적으로는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 1-5% 변동을 초래할 수 있다. 대립 변이체는 다수의 상이한 종에서 관심의 핵산 서열을 서열분석함으로써 식별될 수 있고, 이는 하이브리드형성 프로브를 사용하여 이들 종에서 동일한 유전자 유전자좌를 식별함으로써 용이하게 수행될 수 있다. 자연 대립 변이의 결과이고 관심의 유전자의 기능적 활성을 변경하지 않는 임의의 모든 상기 핵산 변이 및 결과적인 아미노산 다형성 또는 변이가 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
서열과 관련하여 "동일성" 은 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 있는 위치의 수를 2 개의 서열 중 더 짧은 것의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수로 나눈 값을 언급할 수 있으며, 이 경우 2 개의 서열의 정렬은 Wilbur and Lipman algorithm (Wilbur and Lipman) 에 따라 측정될 수 있다. 두 아미노산 서열의 서열 동일성 또는 서열 유사성 또는 두 뉴클레오티드 서열간의 서열 동일성은 Vector NTI 소프트웨어 패키지 (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA) 를 이용하여 측정될 수 있다. RNA 서열이 DNA 서열과 유사하다거나, DNA 서열과 어느 정도의 서열 동일성 또는 상동성을 갖는다고 언급되는 경우, DNA 서열 내 티미딘 (T) 은 RNA 서열 내 우라실 (U) 과 동등하다고 여겨진다. 따라서, RNA 서열은 본 발명의 범주 안에 있고, DNA 서열 내 티미딘 (T) 을 RNA 서열 내 우라실 (U) 과 동등하다고 여김으로써 DNA 서열로부터 유도될 수 있다.
본 개시의 폴리뉴클레오티드에는 유전적 코드, 예를 들어, 특정 숙주에 대해 최적화된 코돈 사용의 결과로서 축퇴성인 서열이 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "최적화된" 은 특정 종에서 그의 발현을 증가시키도록 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. NDV-F 폴리펩티드를 코딩하는 최적화된 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위해, NDV-F 단백질 유전자의 DNA 서열은 1) 특정 종에서 고발현되는 유전자에 의해 선호되는 코돈을 포함하거나; 2) 뉴클레오티드 염기 조성 중 A+T 또는 G+C 함량을 상기 종에서 실질적으로 발견되는 정도까지 포함하거나; 3) 상기 종의 개시 서열을 형성하거나; 또는 4) RNA 의 불안정화, 부적절한 폴리아데닐화, 붕괴 및 종결을 야기하거나, 2 차 구조 헤어핀 또는 RNA 스플라이스 자리를 형성하는 서열을 제거하도록 개질될 수 있다. 상기 종에서 NDV F 단백질의 증가된 발현은 진핵생물 및 원핵생물에서의, 또는 특정 종에서의 코돈 사용의 분포 빈도를 이용함으로써 달성될 수 있다. 용어 "바람직한 코돈 사용의 빈도" 는 특정 아미노산을 지정하는 뉴클레오티드 코돈의 사용시 특정 숙주 세포에 의해 나타나는 선호도를 언급한다. 20 개의 자연 아미노산이 존재하고, 이들 중 대부분은 하나 이상의 코돈에 의해 지정된다. 그러므로, 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 NDV-F 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기능적으로 변화되지 않는 한 모든 축퇴성 뉴클레오티드 서열이 본 개시에 포함된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SB-1 게놈의 비필수 영역 내 1, 2 또는 그 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드의, SB-1 게놈으로의 도입을 포함하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 또는 SB-1 바이러스 벡터의 제조 방법을 제공한다. 또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 SB-1 게놈으로부터 gC 유전자를 변경, 조작 또는 결실하는 단계를 포함하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 또는 SB-1 바이러스 벡터의 제조 방법을 제공한다. 용어 "비필수 영역"은 조직 배양 또는 닭에서 바이러스의 복제 및 전파에 필수적이지 않은 바이러스 게놈의 영역을 지칭한다. 임의의 비필수 영역 또는 이의 부분이 SB-1 게놈으로부터 결실될 수 있거나, 또는 외래 서열이 상기에 삽입될 수 있고, 이 결실 또는 삽입으로 도모되는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 또는 SB-1 벡터의 생존력 및 안정성이, 결실된 영역 또는 이의 부분이 실제로 비필수적인지 여부를 알아내는데 사용될 수 있다. 한 측면의 구현예에서, 비필수 영역은 SB-1 게놈의 독특 장 (unique long; UL) 및 독특 단 (unique short; US) 영역에 위치된다 (Spatz et al., Virus Genes 42:331-338, 2011 참조). SB-1 의 UL 영역은 길이가 약 109,744 bp 내지 약 109,932 bp 이고, SEQ ID NO:14 (GenBank 기탁 No, HQ840738.1) 의 위치 12,209 에서 121,952 까지 뻗어 있거나, 또는 기타 SB-1 게놈의 등가 위치, 예를 들어 HPRS24 게놈의 11,826 bp 에서 121,757 bp 이다. SB-1 의 US 영역은 길이가 약 12,109 bp 내지 약 12,910 bp 이고, SEQ ID NO:14 (GenBank 기탁 No, HQ840738.1) 의 위치 143,514 에서 156,423 일 수 있거나, 또는 기타 SB1-게놈의 등가 위치, 예를 들어 HPRS24 게놈의 142,681bp 에서 154,789 bp 일 수 있다 (Spatz et al., 2011). 한 측면의 구현예에서, 비필수 영역은 SB-1 의 독특 장 (UL) 영역에서, UL55 의 ORF 와 LORF5 의 ORF 사이에 있다. 또 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드가 삽입되거나, SB-1 당단백질 C 유전자 (또는 UL44 로 지명) 를 대체한다. gC 유전자좌의 용도는 기능성 gC 단백질을 생산할 수 없고 수평적으로 전염을 일으킬 수 없는 재조합 바이러스의 제조를 가능하게 한다. 또한 또 다른 구현예에서, 비필수 영역은 UL7 와 UL8, UL 21 와 UL22, UL40 와 UL41, UL50 와 UL51, UL54 와 LORF4, US10 와 SORF4 사이의 유전자간 영역에서, 또는 UL43, US2, US10 또는 US6 (gD 코딩) 유전자 내에 존재할 수 있다 (GenBank 기탁 No, HQ840738.1 참조). 또한 또 다른 구현예에서, 비필수 영역은 SEQ ID NO:14 의 뉴클레오티드 위치 118057-118306 (유전자간 UL55-LORF5), 98595-100031 (gC 또는 UL44), 25983-26038 (유전자간 UL7-UL8), 49865-50033 (유전자간 UL21-UL22), 75880-75948 (유전자간 UL35-UL36), 93928-93990 (유전자간 UL40-UL41), 109777-109847 (유전자간 UL50-UL51), 116466-116571 (유전자간 UL54-LORF4), 146548-146697 (유전자간 US10-SORF4), 97141-98385 (UL43), 147857-148672 (US2), 145853..146548 (US10) 또는 150322-151479 (gD 또는 US6) 의 영역에 존재할 수 있다.
재조합 바이러스의 구축은 예를 들어 US 특허 번호 4,769,330, 4,722,848, 4,603,112, 5,174,993, 및 5,756,103, 6,719,979 에 기재된 바와 같이 당업계에 익히 공지되어 있다. 구체적으로, 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 바이러스 벡터는 두 단계로 구축될 수 있다. 먼저, 삽입 유전자좌 측면 (flank) 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 또는 SB-1 게놈 영역을 대장균 플라스미드 구축물로 클로닝하고; 공여체 발현 카세트 DNA 의 삽입을 허용하도록 독특 제한 부위(들) 를 두 측면 영역 사이에 놓는다 (삽입 플라스미드). 개별적으로, 삽입될 cDNA 또는 DNA 유전자 서열은 프로모터 영역 (유전자 시작 영역) 의 뒤를 잇고, 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 또는 SB-1 벡터 및/또는 진핵 세포에 특이적인 터미네이터 (또는 폴리-아데닐화, poly-A) 서열을 후속시킨다. 전체 발현 카세트 (프로모터-외래 유전자-poly-A) 를 이어서 삽입 플라스미드의 독특 제한 부위(들) 내로 클로닝화해, 삽입 유전자좌 측면의 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 또는 SB-1 "팔 (arm)" 에 의해 측면화된 발현 카세트를 함유하는 "공여체 플라스미드"가 구축된다. 이어서, 생성된 공여체 플라스미드 구축물을 대장균 박테리아 내에서 성장으로써 증폭시키고, 플라스미드 DNA 를 추출한다. 이후, 플라스미드 백본 (칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 또는 SB-1 팔 및 발현 카세트 외부쪽) 을 절단하는 제한 효소를 이용해 상기 플라스미드를 선형화한다 . 이후, 닭 배아 섬유모세포를 부모 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 또는 SB-1 DNA 및 선형화된 공여체 플라스미드 DNA 와 공동-트랜스펙션한다. 이어서, 생성 바이러스 집단을 다중 한계 희석 단계로써 클로닝하며, 이때 외래 유전자를 발현하는 바이러스를 비(非)발현 바이러스 집단에서 단리한다. 마찬가지로, 또 다른 외래 카세트를 또 다른 삽입 유전자좌에 삽입해 두 유전자를 발현하는 이중의 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 또는 SB-1 재조합체를 제조할 수 있다. 제 2 의 카세트도 또한 동일 유전자좌에 삽입될 수 있다. 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 또는 SB-1 재조합체는 부모 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 또는 SB-1 MD 백신과 유사하게 주된 닭 배야 섬유모세포에서 생성된다. 인큐베이션 후, 감염된 세포를 수확하고, 동결 배지와 혼합해, 감염된 세포를 생존 가능하게 하고 냉동 바이알 (cryovial) 또는 유리 앰플에서 통상 동결시키고 액체 질소 중 보관한다.
개질된 전염성 바이러스에 의한 삽입된 cDNA 유전자 서열의 성공적인 발현은 두 조건을 요구한다. 먼저, 삽입물이 개질된 바이러스가 생존되도록 바이러스의 게놈 영역에 도입되어야 한다. 삽입된 cDNA 의 발현을 위한 두 번째 조건은 바이러스 배경 (예, 프로모터, 인핸서, 공여체 및 수용체 슬라이싱 부위 및 인트론, Kozak 번역 개시 공통 서열, 폴리아데닐화 시그널, 미번역 서열 요소) 에서 유전자의 발현을 허용하는 조절 서열의 존재이다.
일반적으로, 진핵 세포에서 기능하는 강한 프로모터를 이용하는 것이 유리하다. 프로모터에는 이에 제한되는 것은 아니나 전초기 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터, 기니아 피그 CMV 프로모터, SV40 프로모터, 거짓광견병 바이러스 프로모터, 예컨대 당단백질 X 프로모터, 단순 헤르페스 바이러스-1, 예컨대 알파 4 프로모터, 마렉병 바이러스 (MDV-1, MDV-2 및 HVT 포함) 프로모터, 예컨대 당단백질 gC, gB, gE, 또는 gI 발현을 구동하는 것, 전염성 후두기관염 바이러스 프로모터, 예컨대 당단백질 gB, gE, gI, gD 유전자의 것, 또는 기타 헤르페스바이러스 프로모터가 포함된다. 삽입 유전자좌가 SB-1 유전자 (예, gC, gD, US2 또는 US10 유전자) 로 이루어진 경우, 외래 유전자가 추가의 프로모터 서열 없이 벡터에 삽입될 수 있는데, 그 이유는 벡터의 결실된 유전자의 프로모터가 삽입된 외래 유전자의 전사를 구동하기 때문이다.
한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 바이러스 벡터 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클 또는 아쥬번트를 포함하는 약학적 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 바이러스 벡터에 사용되는 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 균주는 임의의 SB-1 균주, HPSR24 균주, 또는 301B/1 균주일 수 있다. 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 균주는 또한 [Witter et al (Avian Diseases 34, 944-957; 1990), Witter (Avian Pathology 21, 601-614, 1992) 및 Witter (Avian Pathology 24, 665-678, 1995)] 에 기재된 것: 280-5/1, 281MI/1, 287C/1, 298B/1, 301A/1, 401/1, 437A/1, 437B/1, 468A/1, 468A/2, 468B/1, 471B/1, 또는 HN-1/1 을 포함할 수도 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 조성물 또는 백신을 제공한다: i) 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩 및 발현하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 벡터 (MDV-2) ; 및 ii) 하기 중 적어도 하나: 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩 및 발현하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 HVT 벡터 (또는 MDV-3 또는 멜리아그리드 헤르페스바이러스-1); 또는 야생형 MDV-3; 또는 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩 및 발현하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 MDV-1 벡터 (또는 칠면조 헤르페스바이러스-2); 또는 야생형 MDV-1. 조성물 또는 백신은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클 또는 아쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩 및 발현하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 계두 벡터; 또는 야생형 계두를 추가로 포함할 수 있다.
한 측면의 구현예에서, 조성물 또는 백신은 하나 (또는 그 이상의) 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터 및 하나 이상의 야생형 HVT (MDV-3) 를 포함한다. 또 다른 측면에서, 조성물 또는 백신은 하나 (또는 그 이상의) 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터 및 하나 이상의 재조합 HVT (MDV-3) 를 포함한다. 또 다른 측면에서, 조성물 또는 백신은 하나 이상의 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터 및 하나 이상의 야생형 또는 유전적 개질된 MDV-1 를 포함한다. 또 다른 측면에서, 조성물 또는 백신은 하나 이상의 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터 및 하나 이상의 재조합 MDV-1 를 포함한다. 또 다른 측면에서, 조성물 또는 백신은 하나 이상의 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터, 하나 이상의 야생형 HVT (MDV-3) 및 하나 이상의 야생형 MDV-1 을 포함한다. 또 다른 측면에서, 조성물 또는 백신은 하나 이상의 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터, 하나 이상의 재조합 HVT (MDV-3) 및 하나 이상의 야생형 MDV-1 을 포함한다. 또 다른 측면에서, 조성물 또는 백신은 하나 이상의 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터, 하나 이상의 야생형 HVT (MDV-3) 및 하나 이상의 재조합 MDV-1 을 포함한다. 또한 또 다른 측면에서, 조성물 또는 백신은 하나 이상의 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터, 하나 이상의 재조합 HVT (MDV-3) 및 하나 이상의 재조합 MDV-1 을 포함한다. 야생형 HVT (MDV-3) 또는 야생형 MDV-1 은 살아있거나, 약독화되거나 또는 유전적 개질될 수 있다. 재조합 칠면조 헤르페스바이러스-3 (MDV-2) 벡터, 재조합 HVT (MDV-3) 벡터, 및 재조합 MDV-1 벡터에서 이종 폴리뉴클레오티드는 동일 또는 상이한 조류 병원체로부터의 동일 또는 상이한 항원을 인코딩할 수 있다.
약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 아쥬반트 또는 비히클 또는 부형제가 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 아쥬반트 또는 비히클 또는 부형제는 MD 백신에 사용된 마렉병 백신 희석제일 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 기타 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 아쥬반트 또는 비히클 또는 부형제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 0.9% NaCl (예, 식염) 용액 또는 포스페이트 완충액, 폴리-(L-글루타메이트) 또는 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 벡터 (또는 본 발명의 벡터로부터 시험관내 발현되는 단백질) 의 투여를 촉진하는 임의의 화합물 또는 화합물의 조합일 수 있고, 트랜스펙션 또는 감염을 촉진할 수 있고/거나 벡터 (또는 단백질) 의 보존을 향상시킬 수 있다. 투여량 및 투여 부피는 본원의 일반적 기술에서 논의되어 있고, 당업자가 당업계의 지식과 함께 본 개시를 읽음으로써 임의의 과도한 실험 없이 결정할 수 있다.
이에 제한되는 것은 아니나 하기를 포함하는 임의로는 기타 화합물이 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 아쥬반트 또는 비히클 또는 부형제로서 첨가될 수 있다: 알룸 (alum); CpG 올리고뉴클레오티드 (ODN), 특히 ODN 2006, 2007, 2059, 또는 2135 (Pontarollo R.A. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43-59; Wernette C.M. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89-103); polyA-polyU, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDA) ("Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: p.03, p.157); N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-히드록시에틸) 프로판디아민 (예컨대, AVRIDINE® (Ibid, p. 148); 카르보머, 키토산 (예를 들어, US 특허 일련 번호 5,980,912 참조).
본 발명에 따른 약학적 조성물 및 백신은 하나 이상의 아쥬반트를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 실시에서의 사용에 적합한 아쥬반트는 하기이다: (1) 알케닐 유도체 중합체, 말레산 무수물, 및 아크릴 또는 메타크릴산의 중합체, (2) 면역자극 서열 (ISS), 예컨대 하나 이상의 비-메틸화 CpG 유닛을 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열 (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) 수중유 에멀젼, 예컨대 M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995 에 의해 출판된 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" 의 페이지 147 에 기술되어 있는 SPT 에멀젼, 및 동일한 문헌의 페이지 183 에 기술되어 있는 에멀젼 MF59, (4) 4차 암모늄 염, 예를 들어, DDA 를 함유하는 양이온 지질 (5) 사이토카인, (6) 알루미늄 히드록시드 또는 알루미늄 포스페이트, (7) 사포닌 또는 (8) 본 출원에 참조로 포함되고 임의의 언급된 문헌에서 논의된 다른 아쥬반트, 또는 (9) 그의 임의의 조합 또는 혼합물.
본 발명의 또 다른 측면은 하나 이상의 항원에 대항해 동물에서 면역학적 반응을 유도하거나, 또는 하나 이상의 조류 병원체에 대항해 동물에서 보호적 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로서, 이때 상기 방법은 본 발명의 약학적 조성물 또는 백신으로 적어도 1 회 동물에 접종하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 또 다른 측면은 프라임-부스트 (prime-boost) 투여 요법으로 하나 이상의 조류 병원체에 대한 동물에서의 보호 반응을 유도하거나, 또는 하나 이상의 항원에 대한 동물에서의 면역학적 반응을 유도 방법에 관한 것으로, 이는 하나 이상의 공통의 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 사용하는 하나 이상의 1 차 투여 및 하나 이상의 부스터 투여로 이루어진다. 1 차 투여에 사용되는 면역학적 조성물 또는 백신은 부스터로서 사용되는 것과 성질이 상이할 수 있다.
조류 병원체는 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV), 전염성 점액낭병 바이러스 (즉, IBDV 또는 검보로 질환 바이러스), 마렉병 바이러스 (MDV), 전염성 후두기관염 바이러스 (ILTV), 조류 뇌척수염 바이러스 및 기타 피코르나바이러스, 조류 레오바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 조류 메타뉴모바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 조류 아데노바이러스, 계두 바이러스, 조류 코로나바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 아스트로바이러스 및 닭 빈혈 바이러스, 콕시디아증 (에이머리아 종), 캄필로박터 종, 살모넬라 종, 마이코플라스마 갈리셉티쿰, 마이코플라스마 시노비애, 파스테우렐라 종, 아비박테리움 종, 대장균 또는 클로스트리듐 종일 수 있다.
통상적으로, 백신의 1 차 투여는 1일령, 피하 또는 근육내 경로로써, 또는 17 내지 19 일령 배아에서 난 내 (in ovo) 수행된다. 2차 투여는 첫 10 일령 이내에 수행될 수 있다. 동물은 바람직하게 제 1 투여의 시기에 적어도 17일 배아 또는 1일령이다.
피하 또는 근육내, 피내, 경피와 같이 다양한 투여 경로가 1일령 닭에서 이용될 수 있다. 난 내 백신접종은 양막 낭 및/또는 배아에서 수행될 수 있다. 시판중인 난 내 및 SC 투여 장치가 백신접종에 사용될 수 있다.
본 발명을 이제 하기 비제한적인 실시예를 통해 추가로 기술할 것이다.
실시예
DNA 삽입물, 플라스미드 및 재조합 바이러스 벡터의 구축을 J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) 에 의해 기술된 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수행했다.
실시예 1. NDV-F 를 발현하는 재조합 vSB1-004 의 구축
이 작업의 목표는 마우스 거대세포바이러스 (mCMV) 프로모터, 뉴캐슬 질환 바이러스 융합 단백질 (NDV-F), 및 원숭이 바이러스 40 (SV40) 폴리 A 꼬리를 포함하는 발현 카세트가 SB-1 바이러스의 US10 와 SORF4 부위 사이의 유전자간 부위에 삽입된 재조합 SB-1 바이러스를 구축하는 것이다 (표 1 및 도 2).
vSB1-004 의 특징
명칭 부모 바이러스 프로모터 유전자 Poly-A 유전자좌
vSB1-004 SB-1* mCMV IE VIId 의 Wt-NDV-F SV40 SORF4/US10
SB-1*: Merial 의 시판중인 마렉병 백신 SB-1(Merial Select Inc., Gainesville, GA 30503, USA). Vaccine Lot# JV505.
유전형 VIId 서열에 해당하는 뉴캐슬 질환 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) (SEQ ID NO:3 에 의해 인코딩된 SEQ ID NO:2) 을 화학적으로 합성했다 (GenScript, Piscataway, NJ, USA). 상기 합성 유전자의 F 단백질 절단 부위를 변경해 약독형 (렌토제닉; lentogenic) F 절단 부위 서열과 매칭시키고, 생성 NDV-F 유전자 서열은 GenBank 에 각각 기탁 번호 AY337464 (DNA) 및 AAP97877.1 (단백질) 로 수탁된 NDV-F 서열과 99% 뉴클레오티드 및 99% 아미노산 서열 동일성을 지닌다.
공여체 플라스미드 SB-1 US10mFwt SbfI 구축
합성 NDV-F 유전자를 포함하는 단편을, NotI 을 이용해 pUC57 NDV-F VIId wt 플라스미드 (GeneScript 에 의해 합성됨) 로부터 잘라내어, mCMV 프로모터 및 SV40 polyA 꼬리를 포함하는 pCD046 플라스미드의 동일 부위에 삽입했다. 생성 플라스미드인 pCD046+NDV-F wt 를, EcoRI 및 SalI 로 소화 (digest) 시키고, Klenow 로 둔단 (blunt end) 시켰다. 3.3kb 단편을 겔 추출해, 측면 팔을 포함하는 SmaI 소화되고 탈인산화된 (CIPed) 벡터 (SB1 US10-SORF4 SbfI pUC57) 에 리게이션했다. 리게이션된 물질을 Top10 Oneshot kit (Invitrogen, CA, USA) 을 이용해 형질전환했다. 박테리아 콜로니를 LBamp 브로쓰 (broth) 에서 성장시키고, Qiagens MiniSpin Prep 키트를 이용함으로써 플라스미드를 추출하고, PstI 소화를 이용해 삽입 방향에 대해 스크리닝했다. 올바른 공여체 플라스미드를 SB-1 10mFwt SbfI 로 지정했다. 대규모 배양물을 성장시키고, 플라스미드 추출을 Qiagens Maxi Prep 키트를 이용해 수행했다. 맥시 프렙 (maxi preps) 의 일시적 발현은 NDV 에 대항하는 닭 폴리클로날 혈청 및 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 에서 Fugene 트랜스펙션 시약을 이용해 검증했다.
재조합체 제조
표준 상동 재조합 절차 후에, SB-1 바이러스의 백신 균주로부터 단리된 바이러스 DNA 및 SB-1 US10mFwt SbfI 공여체 플라스미드를 이용해 2차 CEF 세포의 공동-전기천공을 이었다. 공동-전기천공은, 300 ㎕ Opti-MEM 중 1x107 2o CEF 를 이용해 수행하고, 150 볼트에서 950 정전용량으로 2 mm 전기천공 큐벳에서 충격을 가했다. 트랜스펙션된 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 5 내지 7 일 동안 인큐베이션했다. 96-웰 플레이트에 성장시킨 세포를 이후 트립신으로 처리하고 두 "자매" 96-웰 플레이트에 옮기고 5 일간 더 인큐베이션하였다. 96-웰 플레이트의 한 세트를 NDV-F 에 대항하는 닭 폴리클로날 혈청을 이용하는 IFA 에서 이용해 재조합체를 함유하는 양성의 웰을 동정하였고, 또 다른 세트의 96-웰 플레이트를 양성 웰로부터 감염된 세포를 회수하는데 사용했다.
우선, 재조합 바이러스 정제 방법을, 96-웰 플레이트 복제, 및 대부분 IFA 양성 플라크 (plaque) 를 함유하고 가장 적은 양의 IFA 음성 플라크를 가진 웰의 IFA 선택으로써 수행했다. 이후, 이런 기준에 매칭하는 웰을 수확하고, DMEM+2% FBS 중 1 ml 로 조절했다. 1 ml 스톡으로부터, 5-20㎕ (가시적인 플라크의 수에 좌우됨) 를 제거하고, 10ml DMEM+2% FBS 중 1x107 CEF 와 혼합하고, 웰 당 단일의 SB-1 플라크를 갖도록 새로운 96-웰 플레이트로 분취했다. 96-웰 플레이트를 5 일의 인큐베이션 후 복제하고, 플라크를 함유하는 웰을 재조합 SB-1 의 존재 및 부모 바이러스의 부재에 대해 IFA 및 PCR 로써 시험했다. 다시, PCR 밴딩 결과를 비교함으로써, 더 많은 재조합 바이러스를 가진 것으로 보이는 웰을 수확하고 1 ml 로 조절하고 새로운 96-웰 플레이트 상으로 분취했다. 3 내지 5 라운드의 바이러스 감염된 세포의 정제 후, NDV-F 단백질을 발현하는 재조합 SB-1 를 단리하고, 재조합 바이러스의 순도를 IFA 및 PCR 로써 시험해 부모 바이러스의 부재를 확인했다. 이어서, 선택된 재조합 바이러스를 96-웰 플레이트의 한 웰 (P0) 에서 2xT-25 플라스크 (P1), 이후 2xT-75 플라스크 (P2), 2xT-175 플라스크 (P3), 및 마지막으로 2x850 cm2 롤러 보틀 (pre-MSV 스톡 또는 P4) 로 통과시켰다. 2 ml 분취량을 가진 바이알을 액체 질소에서 보관했다. 적정을 3 세트로 CEF 상에서 수행하고, 1x105 pfu/ml 의 역가를 SB1-004 에 대해서 수득했다.
발현 분석
면역형광 시험을 위해, P3 물질을 배지 중 1:100 희석했다. 약 50 ㎕ 의 희석된 바이러스를, 1x107 CEF 를 가진 DMEM+2% FBS 10 ml 에 첨가한 다음 96 웰 플레이트 상으로 분취했다 (100 ㎕/웰). 플레이트를 5 일 동안 37℃ + 5%CO2 에서, 바이러스 플라크가 눈에 보일 때까지 인큐베이션했다. 플레이트를 95% 빙냉 아세톤으로 3 분간 고정시키고, 3 회 PBS 로 세정했다. 뉴캐슬 질환 바이러스에 대항하는 닭 항혈청을 (lot#C0139, Charles Rivers Laboratory) 1:1000 로 첨가하고, 플레이트를 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 1 시간 인큐베이션 후, 플레이트를 3 회 PBS 로 세정하고, FITC 항-닭 (cat# F8888, Sigma) 을 1:500 으로 첨가했다. 다시, 플레이트를 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 1 시간 인큐베이션 후, 세포를 3 회 PBS 로 린스하고, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 필터를 이용하는 형광 현미경으로 가시화하였다. vSB1-004 의 조사된 모든 플라크는 NDV-F 단백질을 발현하는 것으로 발견되었다 (도 3).
PCR 에 의한 재조합체의 분석
DNA 를, 페놀/클로로포름 추출로써 스톡 바이러스로부터 추출하고, 에탄올 침전시키고, 20 mM HEPES 에서 재현탁했다. PCR 프라이머를 고안해 NDV-F VIId 유전자, 프로모터, SV40 poly A 및 SB-1 측면 팔을 구체적으로 동정하였다 (도 4 참조). HVT (균주 FC126), MDV 혈청형 3 에 특이적인 프라이머 (MB080 +MB081) 를 또한 분석에 포함시켜 SB-1 부모 바이러스로부터의 재조합 바이러스의 순도를 체크했다. PCR 을 지정된 프라이머 쌍과 함께 20 ㎍ 의 DNA 주형을 이용해 수행했다.
모든 프라이머 쌍을 이용한 PCR 반응 결과, 예상된 PCR 생성물 및 밴딩 패턴을 얻었다. PCR 결과는, 재조합 바이러스 vSB1-004 가 의도된 발현 카세트를 보유하고, 바이러스 스톡이 검출가능한 양의 부모 SB-1 바이러스가 부재하다는 점을 입증했다 (도 5).
공여체 플라스미드 SB-1 US10mFwt SbfI (SEQ ID NO:41) 의 뉴클레오티드 서열은 도 20 에 나타낸다.
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vSB1-004 이 mCMV 프로모터의 제어 하에 NDV-F 유전자를 발현하는 재조합 SB-1 이다. 재조합 벡터 vSB1-004 는 어떠한 검출가능한 부모 SB-1 바이러스 또는 잠재적인 HVT 오염물도 없다.
실시예 2 NDV-F 를 발현하는 재조합 vSB1-006 의 구축
본 작업의 목표는 SV40 프로모터, 뉴캐슬 질환 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) 및 합성 polyA 꼬리를 포함하는 발현 카세트가 SB-1 바이러스의 UL55 와 LORF5 부위 사이에 삽입되어 있는 재조합 SB-1 바이러스를 구축하는 것이다 (표 2).
vSB1-006 의 특성
명칭 부모 바이러스 프로모터 유전자 Poly-A 유전자좌
vSB1-006 SB-1 SV40 VIId 의 Opt-NDV-F Syn (합성) UL55/LORF5
공통 코돈-최적화 유전형 VIId 서열에 해당하는 뉴캐슬 질환 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) (SEQ ID NO:1 에 의해 인코딩된 SEQ ID NO:2) 을 화학적으로 합성했다 (GeneArt).
공여체 플라스미드 SB-1 UL55 SV Fopt syn tail SbfI 구축
삽입 부위의 각 측면 상에 약 1 kb 서열을 커버하는 합성 SB-1 UL55-LOrf5 SbfI 플라스미드 (GenScript) 를, SbfI 로 소화시키고 탈인산화하였다. 합성 SV OptF syn tail pUC57 플라스미드 (Genscript) 를, SbfI 로 소화시키고, 2239 염기쌍 단편을 겔 추출하고, SbfI 소화된 벡터에 리게이션해 새로운 SB1 UL55 SVFopt syn tail SbfI 공여체 플라스미드를 제조했다.
재조합체 제조, 발현 분석 및 PCR 시험
표준 상동 재조합 절차 후, SB-1 바이러스의 백신 균주로부터 단리된 바이러스 DNA 및 공여체 플라스미드 SB1 UL55 SV Fopt syn tail SbfI 를 이용해 2차 CEF 세포를 공동-전기천공하였다. 본질적으로, vSB1-004 에 대한 실시예 1 에 기술된 절차 후에, 면역형광 및 PCR 로써 재조합체를 제조, 플라크 정제 및 특성화하였다.
공여체 플라스미드 SB1 UL55 SVFopt syn tail SbfI (SEQ ID NO:42) 의 뉴클레오티드 서열을 도 20 에 나타낸다.
재조합체 제조 및 발현 분석
SB-1 바이러스의 게놈 DNA 를, SB-1 UL55 SV Fopt syn tail SbfI 공여체 플라스미드와 공동-전기천공하여, 상동성 재조합 기술을 이용해 재조합 SB-1 을 제조했다. 재조합 바이러스를, 다수 라운드의 플라크 정제에서 PCR 스크리닝 및 면역형광 양성 웰 선택으로써 부모 SB-1 바이러스로부터 분리시켰다. NDV-F 단백질을 발현하는 플라크 정제된 재조합 SB-1 바이러스 (vSB1-006 로 지명) 를, 조직 배양 플라스크로부터 2 x 850 cm2 롤러 보틀로 스케일 업했다. 롤러 보틀에서 약 72 시간 감염후, 감염된 CEF 를 수확했다. 분취물을 10% FBS 및 10% DMSO 함유 액체 질소에서 동결했다. 3세트로 CEF 상 적정을 수행해, 8x105 pfu/ml 의 역가를 SB1-006 에 대해서 수득했다.
면역형광을 닭 항-혈청 (lot# C0139, Charles Rivers Laboratories) 후 FITC 표지된 항-닭 IgG (cat# 02-24-06, KPL) 을 이용해 수행했다. vSB1-006 의 조사된 모든 플라크는 NDV-F 단백질을 발현하는 것으로 발견되었다 (도 6).
vSB1-006 의 PCR 분석
재조합 바이러스의 순도를, SB-1 측면 팔에 특이적인 프라이머 쌍, 코돈-최적화 NDV-F VIId, SV40 프로모터뿐 아니라 HVT 에 특이적인 프라이머 쌍을 이용해 PCR 로써 검증했다 (도 7). 모든 프라이머 쌍을 이용한 PCR 반응 결과, 예상된 PCR 생성물 및 밴딩 패턴을 얻었다. 게다가, vSB1-006 에서 부모 SB-1 바이러스의 흔적을 찾아볼 수 없었다 (도 8).
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vSB1-006 이 SV40 프로모터의 제어 하 코돈-최적화 NDV-F 유전자를 발현하는 재조합 SB-1 이라는 점이 확인되었다. 재조합 벡터 vSB1-006 는 어떠한 검출가능한 양의 부모 SB-1 바이러스 및 잠재적인 HVT 오염물도 없다.
실시예 3 NDV-F 를 발현하는 재조합 vSB1-007 의 구축
본 작업의 목표는 SV40 프로모터, NDV 의 유전형 VIId 의 F 서열에 상응하는 NDV-F 유전자를 포함하는 발현 카세트가 SB-1 바이러스의 당단백질 C (gC 또는 UL44) 의 코딩 서열을 대체하는데 사용된 재조합 SB-1 바이러스를 구축하는 것이다 (표 3).
vSB1-007 의 특성
명칭 부모 바이러스 프로모터 유전자 Poly-A 유전자좌
vSB1-007 SB-1 SV40 VIId 의 Opt-NDV-F (gC 유전자로부터 내인성) gC
공통 코돈-최적화 유전형 VIId 서열에 해당하는 뉴캐슬 질환 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) (SEQ ID NO:1 에 의해 인코딩된 SEQ ID NO:2) 을 화학적으로 합성했다 (GeneArt).
공여체 플라스미드 pSB1 44 cds SVOptF 구축
측면 팔을 포함하는 합성 pSB1 44 cds 플라스미드를 유전자 합성에 의해 제조했다 (GenScript). pSB1 44 cds 를, SbfI 로 소화시키고, 탈인산화했다. SV-OptF-syn no polyA tail-pUC57 로 명명되는 또 다른 플라스미드를 SbfI 로 소화시키고, SV40 프로모터 및 NDV-F 유전자 함유 2.1 kb 단편을 겔 추출하고, SbfI 소화된 벡터에 리게이션하고, Top10 Oneshot 키트 (Invitrogen) 을 이용해 형질전환시켰다. 박테리아 콜로니를 LB-암피실린 배지 (100ug/ml) 에서 성장시키고, 플라스미드를 Qiagen Mini Spin Prep 키트를 이용함으로써 추출하고, EcoRI 및 NcoI 소화로써 삽입에 대해 스크리닝했다. 생성 공여체 플라스미드는 pSB1 44 cds SVOptF 로 지명했다.
합성 플라스미드 pSB1 44 cds (도 20 에서 SEQ ID NO:36) 를, 또한 추가의 개질 없이 (NDV-F 발현 카세트 삽입 없이) 공여체 플라스미드로서 이용해, 당단백질 (gC) 유전자가 결핍된 재조합 SB-1 을 제조할 수 있다.
재조합체 제조 및 발현 분석
표준 상동 재조합 절차 후, SB-1 바이러스의 백신 균주로부터 단리된 바이러스 DNA 및 공여체 플라스미드 pSB1 44 cds SVOptF 를 이용해 2차 CEF 세포의 공동-전기천공을 수행했다. 필수적으로 vSB1-004 에 대한 실시예 1 에서 기재된 절차 수행 후, 재조합체를 제조, 플라크 정제 및 특성화를 면역형광으로써 실시하였다. NDV-F 단백질을 발현하는 플라크 정제된 재조합 SB-1 바이러스 (vSB1-007 로 지명) 를 T-25 조직 배양 플라스크에서 10xT-150 cm2 플라스크로 스케일 업했다. 감염된 CEF 세포를 수확하고 분취물을 10% FBS 및 10% DMSO 함유 액체 질소에서 동결했다. 3세트로 CEF 상 적정을 수행해, 7.2x104 pfu/ml 의 역가를 SB1-007 에 대해서 수득했다.
면역형광을 닭 항-혈청 (lot# C0139, Charles Rivers Laboratories) 후 FITC 표지된 항-닭 IgG (cat# 02-24-06, KPL) 을 이용해 수행했다. vSB1-007 의 조사된 모든 플라크는 NDV-F 단백질을 발현하는 것으로 발견되었다 (도 9).
vSB1-007 의 PCR 분석
바이러스 DNA 를 QIA DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) 를 이용해 P.1 내지 P.6 까지 SB1-007 로부터 추출했다. PCR 프라이머를 NDV F (코돈-최적화됨), SV40 프로모터 및 UL44 의 측면 팔의 존재를 구체적으로 동정하도록 고안했다 (도 10). PCR 증폭을 지정된 프라이머 쌍과 함께 200 ng 의 DNA 주형을 이용해 수행했다.
마찬가지로, SB-1 바이러스의 백신 균주에서 단리된 바이러스 DNA 및 합성 플라스미드 pSB1 44 cds 를 이용하는 표준 상동 재조합 절차로, gC 유전자의 코딩 영역이 결실되어 있는 재조합 SB-1 을 제조할 것이다. 2 개의 프라이머 (SB1 43.F 및 SB1 45.R, 표 4) 는, 모체 SB-1 바이러스에 대한 1540 뉴클레오티드 대 gC-결실된 재조합 SB-1 에 대한 103 뉴클레오티드의 PCR 생성물을 생산할 것이다.
재조합 바이러스의 순도를, SB-1 측면 팔에 특이적인 프라이머 쌍, 코돈-최적화 NDV-F VIId, SV40 프로모터뿐 아니라 HVT 에 특이적인 프라이머 쌍 (MB080 +MB081) 을 이용해 PCR 로써 검증했다. 모든 프라이머 쌍을 이용한 PCR 반응 결과, 예상된 PCR 생성물 및 밴딩 패턴을 얻었다. 게다가, vSB1-007 에서 부모 SB-1 바이러스의 흔적을 찾아볼 수 없었다 (표 4-5 및 도 11).
PCR 프라이머
프라이머 SEQ ID NO: 서열 (5'→ 3')
SB1 43.F 27 GCTCTCGGAGACGCGGCTCGC
SB1 45.R 28 GCTCTTGTAACATCGCGGACG
SV40 프로모터.F 29 AGCTTGGCTGTGGAATGT
Opt F 24 ACTGACAACACCCTACATGGC
HVTUS10.FP 30 CCGGCAACATACATAATGTG
HVTUS10.RP 31 GGCACTATCCACAGTACG
앰플리콘 예상 크기
프라이머 쌍 앰플리콘 예상 크기(bp)
SB-1 vSB1-007/pSB1 44 cds SVOptF
SB1 43.F+SB1 45.R 1540 2188
SV40프로모터F + SB1 45.R - 2113
Opt F + SB1 45.R - 611
HVTUS10.FP + HVTUS10.RP - -
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vSB1-007 이 SV40 프로모터의 제어 하 코돈-최적화 NDV-F 유전자를 발현하는 재조합 SB-1 이라는 점이 확인되었다. NDV-F 발현 카세트를 성공적으로 이용해 SB1 의 gC 유전자를 대체했는데, 이는 gC 가 SB-1 바이러스의 실험관 내 전파에 불필요하다는 점을 입증한다. 재조합 벡터 vSB1-007 는 어떠한 검출가능한 양의 부모 SB-1 바이러스 또는 HVT 도 없다.
공여체 플라스미드 pSB1 44 cds SVOptF (SEQ ID NO:43) 의 뉴클레오티드 서열을 도 20 에 나타낸다.
실시예 4 NDV-F 를 발현하는 재조합 vSB1-008 의 구축
본 작업의 목표는 SV40 프로모터, NDV 의 CA02 균주의 F 서열에 해당하는 NDV-F 유전자, 및 합성 polyA 꼬리가 SB-1 바이러스의 UL55 와 LORF5 부위 사이에 삽입되어 있는 재조합 SB-1 바이러스를 구축하는 것이다 (표 6).
vSB1-008 의 특징
명칭 부모
바이러스		 프로모터 유전자 Poly-A 유전자좌
vSB1-008 SB-1 SV40 CA02 의 Opt-NDV-F Syn UL55/LORF5
코돈-최적화 유전형 V (CA02 균주) 서열에 해당하는 NDV-F (SEQ ID NO:8 에 의해 인코딩된 SEQ ID NO:9) 을 화학적으로 합성했다 (GeneArt). 상기 합성 유전자의 F 단백질 절단 부위를 변경해 렌토제닉 F 절단 부위 서열과 매칭시키고, 생성된 NDV-F 유전자 서열은 GenBank (ABS84266) 에 기탁된 NDV-F 서열과 99% 아미노산 서열 동일성을 가진다.
공여체 플라스미드 SB1 UL55 SV CaFopt syn tail SbfI 구축
삽입 부위의 각 측면 상의 약 1 kb 서열을 함유하는 합성 SB-1 UL55-LOrf5 SbfI 플라스미드 (GenScript) 를, SbfI 로 소화시키고 탈인산화하였다. 합성 SV OptF syn tail pUC57 플라스미드 (Genscript) 를, SbfI 로 소화시키고, 합성 꼬리 (syn tail) 를 포함하는 2239 염기쌍 단편을 겔 추출하고, SbfI 소화된 벡터에 리게이션해 새로운 SB1 UL55 SVFopt syn tail SbfI 공여체 플라스미드를 제조했다. 상기 공여체 플라스미드를 이후 NotI 로 소화시키고, CIPed 하고, 5196 염기쌍 단편을 겔 추출했다. 합성 NDV-F CAO2 CSmut 0813005 pVR101 공여체 플라스미드 (GeneArt) 를, NotI 로 소화시키고, 1677 염기쌍 단편을 겔 추출하고, NotI 소화 및 CIPed UL55 벡터에 리게이션해, 공여체 플라스미드 SB1 UL55 SV CaFopt syn tail SbfI 를 수득했다.
재조합체 제조 및 발현 분석
표준 상동 재조합 절차 후, SB-1 바이러스의 백신 균주로부터 단리된 바이러스 DNA 및 공여체 플라스미드 SB-1 UL55 SV CaFopt syn tail SbfI 를 이용해 2차 CEF 세포를 공동-전기천공하였다. 본질적으로, 실시예 1 에 기술된 절차 후에, 재조합체를 면역형광 및 PCR 로써 제조 및 특성화하였다.
재조합 바이러스를 다수 라운드의 플라크 정제에서 PCR 스크리닝 및 면역형광 양성 웰 선택으로써 부모 SB-1 바이러스로부터 분리시켰다. NDV-F 단백질을 발현하는 플라크 정제된 재조합 SB-1 바이러스 (vSB1-008 로 지명) 를, 조직 배양 플라스크로부터 2 x 850 cm2 롤러 보틀로 스케일 업했다. 롤러 보틀에서 약 72 시간 감염후, 감염된 CEF 를 수확했다. 분취물을 10% FBS 및 10% DMSO 함유 액체 질소에서 동결했다.
면역형광을 닭 항-혈청 (Charles Rivers Laboratories) 후 FITC 표지된 항-닭 IgG (KPL) 을 이용해 수행했다 (도 12).
vSB1-008 의 PCR 분석
재조합 바이러스의 순도를, SB-1 측면 팔에 특이적인 프라이머 쌍, 코돈-최적화 NDV-F VIId, SV40 프로모터 (도 13 참조) 뿐 아니라 HVT, MDV 혈청형 3 에 특이적인 프라이머 쌍 (MB080 +MB081) 을 이용해 PCR 로써 검증했다. 모든 프라이머쌍을 이용한 PCR 반응 결과, 예상된 PCR 생성물 및 밴딩 패턴을 얻었다. 게다가, vSB1-008 에서 부모 SB-1 바이러스의 흔적을 찾아볼 수 없었다 (도 14).
공여체 플라스미드 SB-1 UL55 CaFopt syn tail SbfI (SEQ ID NO:44) 의 뉴클레오티드 서열은 도 20 에 나타낸다.
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vSB1-008 이 SV40 프로모터의 제어 하 코돈-최적화 NDV-F 유전자를 발현하는 재조합 SB-1 이라는 점이 확인되었다. 재조합 벡터 vSB1-008 는 어떠한 검출가능한 부모 SB-1 바이러스 또는 HVT 도 없다.
실시예 5 NDV-F 를 발현하는 재조합 vSB1-009 및 vSB1-010 의 구축
본 연구의 목표는 SV40 프로모터 및 뉴캐슬 질환 바이러스 융합 (NDV-F) 유전자를 함유하는 발현 카세트가 삽입되어 SB-1 의 UL44 코딩 (gC) 서열을 대체시킨 재조합 SB-1 바이러스 벡터 vSB1-009 를 구축하고, 기니아 피그 CMV 프로모터 및 NDV-F 유전자를 함유하는 추가의 발현 카세트가 SB1-009 벡터 백본의 SORF-US2 유전자좌에 삽입되어 있는 재조합 SB-1 바이러스 벡터 vSB1-010 를 구축하는 것이다.
실시예 5.1 vSB1-009 의 구축
SB1 바이러스의 UL44 측면 팔, SV40 프로모터 및 NDV F 코돈 최적화 유전자 서열 (SEQ ID NO:9 를 코딩하는 SEQ ID NO:8) 을 함유하는 공여체 플라스미드 pSB1 44 cds SV FCAopt 를 구축했다 (표 7).
vSB1-009 의 특징
명칭 부모 바이러스 프로모터 F 유전자 Poly-A 유전자좌
vSB1-009 SB1 SV40 CA02 의 Opt-NDV-F (gC 유전자로부터 내인성) UL44 (gC)
재조합 바이러스의 제조
표준 상동 재조합 절차 후, SB-1 바이러스 감염된 CEF 로부터 단리된 바이러스 DNA 및 공여체 플라스미드 pSB1 44 cds SV FCAopt 를 이용해 2차 CEF 세포를 공동-전기천공하였다. 본질적으로, 실시예 1 에 기술된 절차 후에, 재조합체를 제조, 플라크 정제 및 면역형광에 의해 특성화하였다.
2 라운드의 플라크 정제 후, 순수 재조합 바이러스 (vSB1-009) 를 단리하고, vSB1-009 의 순도를 IFA 및 PCR 로써 시험해 적절한 삽입 및 잔여 부모 바이러스 부재를 입증하였다.
PCR 분석
바이러스 DNA 를, QIA DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) 에 의해, vSB1-009 프리-마스터 시드 바이러스 (pre-MSV) 스톡으로부터 추출했다. PCR 프라이머를 고안해, 최적화된 NDV F, NDV F 야생형, SV40 프로모터, mCMV 프로모터, SB-1 바이러스 및 HVT 바이러스의 UL44 측면 팔의 존재를 동정하였다. PCR 증폭을 프라이머쌍과 더불어 약 200 ng 의 DNA 주형을 이용해 수행했다.
각종 프라이머를 이용한 PCR 증폭으로, vSB1-009 이 예상된 증폭 패턴 및 앰플리콘을 갖는다는 점을 확인했다.
발현 분석
간접 면역형광 검정 (IFA) 를, vSB1-009 pre-MSV 스톡 상에서 수행해, NDV F 유전자 및 SB-1 바이러스 항원의 발현을 검사했다. vSB1-009 로 접종한 CEF 를 실온에서 3 분 동안 빙냉 95% 아세톤으로 고정하고, 10 분간 공기-건조시켰다. 플레이트를 PBS 로 세정한 다음, 두 1차 항체, 닭 항-뉴캐슬 질환 바이러스 혈청 (Charles Rivers Laboratories cat#10100641, lot#C0117A) (1:500 희석) 및 SB-1 바이러스에 대한 Y5.9 모노클로날 항체 (Merial Select, Gainesville, GA) (1:3000 희석) 을 첨가하고, 플레이트를 45 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. PBS 로의 3 회 세정 후, 두 2차 항체, 염소 항-닭 IgG-플루오레세인 (KPL) (1:500 희석) 및 당나귀 항-마우스 IgG-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe) (1:250 희석) 을 첨가했다. 플레이트를 45 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션하고, PBS 로 3 회 세정했다. 웰을 Nikon Eclipse Ti 도립 현미경의 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 및 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC)-필터를 이용하는 형광 현미경으로 IFA 양성 플라크에 대해 스크리닝하였다. 유사하게도, vSB1-009 의 NDV F Mab 와의 반응성을 항-MDV 혈청 (Charles River Laboratories (1/300 희석) 및 항-NDV F 모노클로날 항체 (1/300 희석) 을 1차 항체로서 이용해 이중 IFA 로써 검사하였다. 염소 항-닭 IgG-플루오레세인 (KPL) (1:500 희석) 및 당나귀 항-마우스 IgG-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe) (1:250 희석) 을, 2차 항체로서 이용했다. 상기 웰을 관찰해, Nikon Eclipse Ti 도립 현미경의 FITC- 및 TRITC-필터를 이용하는 형광 현미경으로 IFA 양성 플라크를 동정했다.
IFA 결과는, 바이러스-감염된 CEF 에서 vSB1-009 가 NDV F 단백질을 발현한다는 점을 나타낸다. 500 개 초과의 vSB1-009 플라크를 NDV F 단백질 발현뿐 아니라 SB-1 바이러스 특이적 단백질 발현에 대해 이중 IFA 로 카운팅했다. NDV F 단백질의 발현은 각 바이러스 플라크에서 SB-1 바이러스 항원 발현과 완전히 매칭했다 (표 8).
[표 8]
vSB1-009 의 이중 IFA
Figure pct00001
NDV F Mab 반응성을 이중 IFA 로써 확인했다. 200 종 초과의 vSB1-009 플라크를 NDV F Mab 반응성뿐 아니라 항-MDV 혈청 반응성에 대해 조사했다. NDV F Mab 과의 반응성은, 각 바이러스 플라크에서, 항-MDV 혈청 반응성과 완전히 매칭하였다 (표 9).
항-NDV F Mab 와의 vSB1-009 의 반응성
바이러스 이중 IFA (총 254 플라크)
항-MDV 혈청 양성 플라크 항-NDV F Mab 양성 플라크
vSB1-009 254 254
써던 블롯 분석
총 게놈 DNA 를 vSB1-009 pre-MSV 스톡 감염된 CEF 로부터 추출했다. vSB1-009 의 게놈 DNA, SB-1 바이러스 (음성 대조군), pSB1 44 cds SV FCA opt 공여체 플라스미드를 EcoRI, NcoI, 및 KpnI 제한 엔도뉴클레아제로 개별적으로 37℃ 에서 소화시켰다. 제한 단편을 0.8% 아가로오스 겔 전기영동으로써 분리하고 양전하 Nylon 멤브레인에 옮겼다. 이동 후, 멤브레인을 0.4 M NaOH 로 처리한 다음 2XSSC-HCl 버퍼로 중화했다. 이후, 멤브레인을 공기 건조하고 UV 가교했다.
North2South 화학발광 하이브리드화 및 검출 키트(Thermo Scientific cat#89880) 제작자 지침에 따라, 멤브레인을 1 시간 동안 사전-하이브리드화한 후, 하룻밤 동안 55℃ 에서 프로브와 하이브리드화하였다. 하이브리드화를 위해서는, 2 종의 프로브를 이용했다; 1) NDV F 카세트 프로브로서 pSB1 44 cds SV FCA opt 의 SbfI 단편, 2) 재조합 팔 프로브로서 pUC57 SB1 44 팔 (GenScript) 의 SmaI-EcoRI 단편. 하룻밤 하이브리드화 후, 멤브레인을 스트렙타비딘-HRP 의 첨가와 함께 블록킹 버퍼 중에 놓을 때까지, 수회의 엄격 세정을 수행했다. 임의의 비결합된 스트렙타비딘-HRP 의 멤브레인을 린스 후, 퍼옥시드 및 Luminal 의 기질 용액을 첨가했다. 이후, 멤브레인을 X-선 필름에 노출시켜 필름을 현상했다.
써던 블롯 결과는 Vector NTI 지도 분석을 바탕으로 하는 예상된 대로였다. NDV F 카세트 (SV40 프로모터, NDV-F CA02 코돈 최적화 유전자) 는 SB-1 바이러스의 UL44 코딩 서열을 대체하였다.
게놈 분석
vSB1-009 pre-MSV 스톡의 게놈 DNA 에 대해, 삽입된 유전자 카세트 및 재조합 팔 영역의 뉴클레오티드 서열 결정을 수행했다. 프라이머를 고안하고 이용해 재조합 팔을 포함하는 전체 NDV-F 유전자 카세트를 증폭시켰다.
재조합 팔, SV40 프로모터 및 NDV F 코돈-최적화 유전자를 포함하는 vSB1-009 서열 (공여체 플라스미드 pSB1 44 cds SV FCAopt) 이, SEQ ID NO:37 (FIG. 20) 에 나타낸 바 맞는 것으로 확인되었다.
웨스턴 블롯 분석
CEF 단층을 MOI ~ 0.1 에서 vSB1-009 pre-MSV 로 감염시켰다. 5-일 인큐베이션 후, CEF 를 펠릿화하고, PBS 로 세정한 다음, 제작자 프로토콜에 따라 Pierce Classic IP Kit (Thermo Scientific cat#26146) 의 IP 분해/세정 버퍼로 분해시켰다. 분해물을 사전 제거하고 (pre-clear), 100 ul 의 항-NDV F 모노클로날 항체로 인큐베이션하여 면역 복합체를 조제했다. 면역 복합체를 단백질 A/G 플러스 아가로오스로써 포획하고, 비결합된 면역 복합체를 세정 단계로써 제거한 후, 50 ul 의 샘플 버퍼를 이용해 비(非)환원 조건 하에서 용리했다. 감염되지 않은 CEF 를 대조군으로서 포함하였다. 20 ul 의 용리된 샘플을 전기영동으로써 10% Bis-Tris 겔에서 분리시켰다. 전기영동 후, 겔 중 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인 상으로 옮겼다. 단백질 검출 TMB 웨스턴 블롯 키트 (KPL cat#54-11-50) 를 이용해, 닭 항- NDV 혈청 (Charles River Laboratories Laboratories cat#10100641, lot#C0117A) 및 염소 항-닭 IgG-퍼옥시다아제 컨쥬게이트 (KPL cat#14-24-06) 를 갖는 PVDF 멤브레인 상으로 제작자 프로토콜에 따라 NDV 항원을 검출했다.
vSB1-009 의 NDV F 단백질 발현은, 2-단계 면역검출로써 확인했다. 첫째로, vSB1-009 감염된 CEF 분해물로부터의 발현된 NDV F 단백질을, 항-NDV F 모노클로날 항체 001C3 을 이용한 면역침전으로써 포획했다. 후속해서, 항-NDV 폴리클로날 혈청 (Charles River Laboratories cat#10100641, lot#C0117A) 을 이용하는 웨스턴 블롯 분석을 적용해 포획된 샘플 (NDV-F 단백질-모노클로날 항체 복합체) 중 NDV F 단백질을 검출하였다 (도 15). vSB1-007 pre-MSV 분해물 중 약 55 kDa 단백질을, 예상되는 크기의 NDV F1 융합 단백질에 해당하는 항-NDV 혈청에 의해 검출했다 (도 15).
실시예 5.2 vSB1-010 의 구축
공여체 플라스미드 SB1US2 gpVIIdwtsyn 구축
플라스미드 HVT SOrf3-US2 gpVar-Ewt Syn 를 이용해, gpCMV, 변이체 E, 합성 꼬리를 SbFI 소화로써 제거했다. 상기 단편을 SB1 US2 공여체 플라스미드에 리게이션하였다. 변이체 E 유전자를 NotI 로써 컷팅해내고, NDV-F VIId wt 로써 대체했다. 합성 NDV-F VIId 야생형 유전자 (SEQ ID NO:2 를 인코딩하는 SEQ ID NO:3) 를 NotI 소화를 이용해, pUC57 NDV-F VIId wt 플라스미드 (GeneScript 합성) 로부터 잘라내었다. 리게이션된 물질을 Top10 Oneshot kit (cat#C404002, Invitrogen) 을 이용해 형질전환하였다. 박테리아 콜로니를 LBamp 브로쓰에서 성장시키고, Qiagens MiniSpin Prep 키트를 이용함으로써 플라스미드를 추출하고, NcoI+SalI 소화를 이용해 삽입 방향에 대해 스크리닝했다. 올바른 공여체 플라스미드를 pSB1 US2 gpVIIdwt Syn 로 지정했다. 표 10.1 은 각 서열을 포함한 발현 카세트 주위 구축물에 대해 독특한 특징을 보여준다. 대규모 배양물을 성장시키고, 플라스미드 추출을 Qiagens Maxi Prep 키트를 이용해 수행했다. 맥시 프렙의 일시적 발현은 NDV 에 대항하는 닭 폴리클로날 혈청 및 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 에서 Fugene 트랜스펙션 시약을 이용해 검증했다.
재조합체 제조
표준 상동 재조합 절차 후, vSB1-009 로부터 단리된 바이러스 DNA 및 pSB1 US2 gpVIIdWt Syn 공여체 플라스미드를 이용해 2차 CEF 세포를 공동-전기천공하였다 (vSB1-009 는 이미 NDV 의 CA02 F 를 발현하는 재조합 바이러스임). 본질적으로, 실시예 1 에 기술된 절차 후에, 면역형광으로써 재조합체를 제조, 플라크 정제 및 특성화하였다.
5 라운드의 플라크 정제 후, 순수 재조합 바이러스 (vSB1-010) 를 단리하고, vSB1-010 의 순도를 IFA 및 PCR 로써 시험해, 적절한 삽입 및 잔여 부모 바이러스 부재를 입증하였다.
[표 10.1]
vSB1-010 의 특징
Figure pct00002

삽입 영역의 시퀀싱으로, vSB1-010 이 공여체 플라스미드 SB1US2 gpVIIdwtsyn 의 서열에서 (SEQ ID NO:57) 나타낸 바와 같이 기니아 피그 CMV 프로모터 및 NDV-F VIId wt 유전자의 올바른 서열을 포함한다는 점이 확인되었다.
재조합체의 PCR 로써의 분석
DNA 를, 페놀/클로로포름 추출로써 스톡 바이러스로부터 추출하고, 에탄올 침전시키고, 20 mM HEPES 에서 재현탁했다. PCR 프라이머를 고안해 NDV-F VIId wt 유전자, 프로모터, poly A 뿐 아니라, SB-1 부모 바이러스로부터의 재조합 바이러스의 순도를 구체적으로 동정하였다 (도 4 참조). PCR 을 표 1 에 지정된 프라이머 쌍과 함께 200 ㎍ 의 DNA 주형을 이용해 수행했다. PCR 사이클링 조건은 (달리 명기되지 않는 한) 하기와 같다: 94℃ - 2 분; 94℃ - 30 초, 55℃ - 30 초, 68℃ - 3 분의 30 주기; 68℃ - 5 분.
재조합 바이러스의 순도를, SB1 측면 팔에 특이적인 프라이머 쌍, gpCMV 프로모터, NDV-F VIId wt 유전자 및 합성 꼬리를 이용해 PCR 로써 검증했다. HVT, MDV 혈청형 3 에 특이적인 프라이머 (MB080 +MB081) 를 분석에 포함시켰다. PCR 결과는, 재조합 바이러스 vSB1-010 가 의도된 발현 카세트를 보유하고, 바이러스 스톡에서 검출가능한 양의 부모 SB1-009 바이러스가 부재하다는 점을 입증했다.
2 종의 NDV-F 단백질을 발현하는 재조합 vSB1-010 바이러스의 면역형광 염색
면역형광 시험을 위해, P3 물질을 배지 중 1:100 희석했다. 약 50 ㎕ 의 희석된 바이러스를, 1x107 CEF 를 가진 DMEM+2% FBS 10 ml 에 첨가한 다음 96 웰 플레이트 상으로 분취했다 (100 ㎕/웰). 플레이트를 5 일 동안 37℃ + 5%CO2 에서, 바이러스 플라크가 눈에 보일 때까지 인큐베이션했다. 플레이트를 95% 빙냉 아세톤으로 3 분간 고정시키고, 3 회 PBS 로 세정했다. 뉴캐슬 질환 바이러스에 대항하는 닭 항혈청을 (lot#C0139, Charles Rivers Laboratory) 1:1000 로 첨가하고, 플레이트를 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 1 시간 인큐베이션 후, 플레이트를 3 회 PBS 로 세정하고, FITC 항-닭 (cat# F8888, Sigma) 을 1:500 으로 첨가했다. 다시, 플레이트를 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 1 시간 인큐베이션 후, 세포를 3 회 PBS 로 린스하고, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 필터를 이용하는 형광 현미경으로 가시화하였다.
면역형광 염색 결과는, NDV 의 CA02 및 VIId F 단백질 모두에 대항하는 폴리클로날 혈청을 이용하는 경우, vSB1-010 가 NDV-F 단백질의 매우 강한 발현을 보인다는 점을 나타냈다.
결론
PCR 시험 및 면역형광 분석을 바탕으로 할 때, vSB1-010 는, gpCMV 프로모터의 제어 하 NDV 의 VIId-F 유전자가 이미 NDV 의 VA02-F 유전자를 발현하는 vSB1-009 에 성공적으로 삽입된 재조합 SB-1 이다. 결과적으로, vSB1-010 는 NDV 유전자의 VIId 및 CA02 F 유전형 모두를 가지며, 임의의 탐지가능한 부모 vSB1-009 는 없다.
실시예 6 NDV-F 를 발현하는 재조합 vHVT 벡터의 구축
vHVT114 에 대한 공여체 플라스미드 pHM103+Fopt 의 제조
HVT FC126 의 유전자간 I 팔, SV40 프로모터, 및 SV40 poly A 을 포함하는 플라스미드 pHM103 (Merial Limited) 를 NotI 로 소화시키고, 탈인산화하고, 5.6kb 단편을 겔 추출했다. 화학적으로 합성된 코돈-최적화된 유전형 VIId NDV-F 유전자의 NotI 측면 1.7 kb 단편 (SEQ ID NO:2 를 코딩하는 SEQ ID NO:1) 를, 또한 Not I 로 소화시키고, 1.7kb 단편을 겔 추출했다. 5.6 및 1.7kb 단편을 리게이션하여, pHM103+Fopt 를 제조했다 (표 10.2)
[표 10.2]
Figure pct00003

재조합 HVT 바이러스 벡터의 제조
표준 상동 재조합 절차 후, HVT 균주 FC126 로부터 단리된 바이러스 DNA 및 공여체 플라스미드 pHM103+Fopt 를 이용해 2차 CEF 세포를 공동-전기천공하였다 (Igarashi T. et al., J. Gen. Virol. 70, 1789-1804, 1989). 본질적으로, 실시예 1 에 기술된 절차 후에, 면역형광으로써 재조합체를 제조, 플라크 정제 및 특성화하였다.
5 라운드의 플라크 정제 후, vHVT114 로서 지명된 재조합 바이러스를 단리하고, 그 순도를 IFA 및 PCR 로써 시험해, NDV-F 발현 및 부모 바이러스의 부재를 확인했다.
재조합 vHVT114 의 PCR 분석
DNA 를, 페놀/클로로포름 추출로써 vHVT114 로부터 추출하고, 에탄올 침전시키고, 20 mM HEPES 에서 재현탁했다. PCR 프라이머를 고안해 코돈 최적화 NDV-F, SV40 프로모터의 존재뿐 아니라 FC126 CL2 부모 바이러스로부터의 재조합 바이러스의 순도를 구체적으로 동정하였다
PCR 결과는 겔 전기영동 후 PCR 생성물의 크기가 예상된 크기 및 밴딩 패턴과 매우 일치함을 보여줬다.
재조합 vHVT114 에서 삽입된 영역의 서열 분석
vHVT114 게놈 DNA 영역 분석을 PCR 증폭에 의해 수행했다. 총 10 종의 프라이머를 이용해, 공여체 플라스미드에 사용된 측면 BamHI-I 팔을 넘어서뿐 아니라 전체 카세트를 증폭시켰다. 4.727 kb PCR 생성물을 겔 정제하고, 전체 단편을 시퀀싱 프라이머를 이용해 시퀀싱했다. 서열 결과는, vHVT114 가 올바른 SV40 프로모터, 코돈-최적화된 NDV-F 및 SV40 polyA 서열 (SEQ ID NO:38 에서 공여체 플라스미드 pHM103+Fopt 에 대해 기술된 서열과 정확히 매칭함) 을 포함한다는 점을 확인시켰다 (도 20 참조).
재조합 vHVT114 의 웨스턴 블롯 분석
약 2x106 종의 닭 섬유모세포를, ~0.1 MOI 에서 vHVT114 Pre-MSV 로 감염시켰다. 2 일간의 37℃ 에서의 인큐베이션 후, 감염 및 비감염된 세포를, 배지 제거와 PBS 로의 린스 후 세포 스크레이퍼를 이용해 수확했다. 세포를 1ml 의 PBS 로 수확하고, 원심분리했다. 세포 펠릿을 Pierce Classic IP Kit (Thermo Scientific) 에 따라 분해했다. 100 ㎕ 의 항-NDV-F 모노클로날 항체 001C3 (Merial Limited) 를, 면역 복합체 형성에 이용했다. 항체/분해물 샘플을 단백질 A/G 플러스 아가로오스에 첨가해, 면역 복합체를 포획했다. 면역 복합체를 3 회 세정해, 비결합된 물질을 제거한 다음, 비환원 조건 하, 샘플 버퍼 용리액을 이용해 50ul 부피에서 용리하였다. 5 분 동안 비등시킨 후, 10 ㎕ 의 샘플을 10% 아크릴아미드 겔 (Invitrogen) 로 로딩했다. PAGE 겔을 1 시간 동안 200 볼트에서 MOPS 버퍼 (Invitrogen) 에서 작동시켰다. 이어서, 겔을 PVDF 멤브레인 상으로 옮겼다.
단백질 검출 웨스턴 블롯 키트 TMB 시스템 (KPL cat#54-11-50) 을, 시약을 이용하고 제작자 지시에 따라 PVDF 멤브레인을 블롯팅하는데 사용했다. 멤브레인을 1 시간 동안 실온에서 차단시킨 후, 이어서 멤브레인을 3 회 1X Wash Buffer 중에서 각 회 5 분으로 린스하고, NDV 바이러스에 대항하는 1:1000 희석의 닭 혈청 (Lot # C0139, Charles River Laboratories) 을 포함하는 블로킹 버퍼에 담그었다. 세정 버퍼에서 3 회 세정 후, 멤브레인을 퍼옥시다아제 표지된 염소 항-닭 IgG (KPL, cat# 14-24-06) (1:2000 희석) 으로 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 이어서, 멤브레인을 3 회 (각각 5 분) 1 X Wash Buffer 중에서 린스했다. 5 ml 의 TMB 멤브레인 퍼옥시다아제 기질을 멤브레인에 첨가하고, 온화하게 약 1 분간 흔들었다. 발생 반응을 멤브레인을 물 안으로 배치시킴으로써 멈추었다.
면역침전 및 웨스턴 블롯 기술은 예상된 크기의 NDV-F 단백질의 F1 성분에 해당하는 vHVT114 중 약 55 kD 단백질을 검출했다 (도 16).
기타 HVT 재조합체의 제조 및 특성화
기타 HVT 재조합체, 예컨대 vHVT039, vHVT110, vHVT111, vHVT112, vHVT113, 및 vHVT116 의 제조 및 특성화를, 필수적으로, 상술된 vHVT114 에 대해서와 동일한 방식으로 실시했다. 재조합 HVT 바이러스 벡터의 제조 및 특성화는, _____ 에 제출된 US 특허 출원 일련번호 US ____________ (Merial limited) 에 기재되어 있는데, 이는 본 발명에서 참조로써 통합되어 있다. 표 11 은 각 서열을 포함한, 발현 카세트 주위 각 구축물에 대한 독특한 특성을 나타낸다.
단일 HVT 재조합체의 발현 카세트의 특징
명칭 부모 바이러스 프로모터 F 유전자 Poly-A 유전자좌
vHVT039 HVT MDV gB Wtnm-Texas SV40 IG1
vHVT110 HVT mCMV IE Wt-VIId SV40 IG1
vHVT111 HVT SV40 Wt-VIId SV40 IG1
vHVT112 HVT MCMV IE Wt-YZCQ SV40 IG1
vHVT113 HVT MCMV IE Wt-Texas SV40 IG1
vHVT114 HVT SV40 Opt-VIId SV40 IG1
vHVT116 HVT SV40 CA02의 Opt-NDV-F SV40 IG1
실시예 7 NDV-F 및 IBDV VP2 를 발현하는 이중 HVT 벡터, 및 IBDV VP2 변이체를 발현하는 이중 HVT 벡터의 구축
vHVT306 에 대한 공여체 플라스미드 pHVT US2 SV- Fopt-synPA 의 제조
HVT FC126 의 SORF3 및 US2 팔 서열 측면에 있는 SV40 프로모터, 합성 NDV F 코돈 최적화 VII 유전자, 합성 polyA 꼬리를 포함하는 공여체 플라스미드 pHVT US2 SV- Fopt-synPA 를 구축하였다.
재조합 바이러스의 제조
표준 상동 재조합 절차 후, vHVT13 (IBDV VP2 를 발현하는 HVT 벡터, Merial Limited) 로부터 단리된 바이러스 DNA 및 공여체 플라스미드 pHVT US2 SV-Fopt-synPA 를 이용해 2차 CEF 세포를 공동-전기천공하였다. 본질적으로, 실시예 1 에 기술된 절차 후에, 면역형광으로써 재조합체를 제조, 플라크 정제 및 특성화하였다.
2 라운드의 플라크 정제 후, 순수 재조합 바이러스 (vHVT306) 를 단리하고, vHVT306 의 순도를 IFA 및 PCR 로써 시험하고, 확인했다.
PCR 분석
바이러스 DNA 를, QIA DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) 에 의해, vHVT306 프리-마스터 시드 바이러스 (pre-MSV) 스톡으로부터 추출했다. PCR 프라이머를 고안해, 최적화된 NDV F, NDV F 야생형, SV40 프로모터, mCMV 프로모터, US2 HVT 바이러스 및 SB-1 바이러스의 측면 팔의 존재를 동정하였다.
각종 프라이머를 이용한 PCR 증폭으로, vHVT306 이 예상된 증폭 패턴 및 앰플리콘을 갖는다는 점을 확인했다.
게놈 분석
vHVT306 pre-MSV 스톡의 게놈 DNA 를 시퀀싱해 재조합 팔 영역뿐만 아니라 삽입된 유전자 카세트의 서열을 확인했다.
공여체 플라스미드에 사용된 재조합 팔을 포함하는 전체 삽입된 유전자 카세트를 증폭하도록 프라이머를 설계했다. vHVT306 게놈 DNA 의 분석을, PCR 증폭으로써 수행한 후, 뉴클레오티드 서열 결정하였다.
재조합 팔, SV40 프로모터 및 NDV F 코돈-최적화 유전자를 포함하는 vHVT306 (공여체 플라스미드 pHVT US2 SV- Fopt-synPA) 가 SEQ ID NO:45 에 나타낸 바와 같이 맞는 것으로 확인되었다 (도 20).
웨스턴 블롯 분석
vHVT306 의 NDV F 단백질 발현은, 2-단계 면역검출로써 확인했다. 첫째로, vHVT306 감염된 CEF 로부터의 발현된 NDV F 단백질을, 항-NDV F 모노클로날 항체 001C3 (Merial Limited) 을 이용한 면역침전으로써 포획했다. 후속해서, 항-NDV 폴리클로날 혈청 (Charles River Laboratories) 을 이용하는 웨스턴 블롯 분석을 적용해 포획된 샘플 (NDV-F 단백질 모노클로날 항체 복합체) 중 NDV F 단백질을 검출하였다. vHVT306 pre-MSV 분해물 중 55 kDa 단백질을, 예상되는 크기의 NDV F1 융합 단백질에 해당하는 항-NDV 혈청에 의해 검출했다.
기타 이중 HVT 재조합체의 제조 및 특성화
이중 HVT 재조합체, 예컨대 vvHVT301, vHVT302, vHVT303, vHVT304, vHVT202, 및 vHVT307 의 제조 및 특성화를, 필수적으로, 상술된 vHVT306 에 대해서와 동일한 방식으로 실시했다. 재조합 HVT 바이러스 벡터의 제조 및 특성화는, _____ 에 제출된 US 특허 출원 일련번호 US ____________ (Merial limited) 에 기재되어 있는데, 이는 본 발명에서 그 전문이 참조로써 통합되어 있다. 표 12 는 각 서열을 포함해, 발현 카세트 주위 각 구축물에 대해 독특한 특징을 나타낸다.
이중 HVT 재조합체의 발현 카세트의 특징
명칭 부모 바이러스 프로모터 NDV-F 유전자 또는 IBDV VP2 유전자 Poly-A 유전자좌
vHVT301 vHVT13 SV40 Wt-VIId NDV-F SV40 IG2
vHVT302 vHVT13 US10 Opt-VIId NDV-F US10 US10
vHVT303 vHVT13 US10 Opt-V (CA02) NDV-F US10 US10
vHVT304 vHVT13 SV40 Opt-VIId NDV-F 합성 IG2
vHVT306 vHVT13 SV40 Opt-VIId NDV-F 합성 SORF3-US2
vHVT307 vHVT13 SV40 Opt-V (CA02) NDV-F 합성 SORF3-US2
vHVT202 vHVT306 기니아 피그 CMV IBDV E VP2 합성 SORF3-US2
실시예 8 gC-결실된 SB-1 돌연변이체의 수평적 전염의 결여
본 연구의 목적은, 부모 SB-1 로써 유도된 수평적 전염 및 바이러스혈증 수준을 gC 유전자가 결실되어 있는 재조합 SB-1 바이러스 (실시예 3 참조) 의 수준과 비교하는 것이다.
30 마리의 1일령 특정 무병원체 (SPF) 백색 레그혼종 닭의 두 그룹 (A 및 B) 을 무작위로 구성시켰다. A 그룹에서의 20 종의 새는, 피하 경로를 통해 (목 덜미; 0.2ml/새) 2000 PFU 의 부모 SB-1 로 백신접종하고, B 그룹에서의 20 종은 2000 PFU 의 SB-1 gC-결실된 돌연변이로 백신접종했다. 10 종의 새들은, 백신접종된 새와 동일 격리실에 백신접종하지 않은 채로 두었다 (그룹 Ac 및 Bc). 2주령에서 (D14), 20 종의 백신접종된 새 그룹 A 및 B 의 비장 및 두 깃털을 안락사 후에 제거했다. 4 주령 (D28) 에서, 그룹 Ac 및 Bc 의 10 종의 접촉 새들의 비장을 또한 바이러스 단리를 위해 제거했다. 림프구 분리 배지에 넣어 원심분리된 분쇄된 비장의 연막 (buffy coat) 으로부터, 백혈구 세포를 수집했다. 각각의 새에 대해서, 106 백혈구를, 하루 전에 준비한 1차 닭 배아 섬유모세포 (CEF) 의 교회 단층 (confluent monolayer) 을 포함하는 60 mm 조직 배양 디쉬에 첨가했다. 감염 5 일 후에, MDV 플라크를 각 디쉬마다 카운팅하고, 양성 새의 개수 및 플라크의 평균 개수를 산출했다. 우포 (feather follicle) 샘플에 있어서, 우수 (feather pulp) 를 SPGA 배지에 첨가하고, 그 배지가 제거되어진 1차 CEF 의 교회 단층 상에 놓기 전 10 초간 초음파 처리했다. 상기 우수 현탁액을, 1% 소 혈청을 갖는 새 배지 첨가 전 45 분 동안 흡수되게 정치시켰다.
D14 때 백신접종된 새의 우포 및 비장에서의 바이러스 단리 결과를 표 13 에 기록한다. 양쪽 그룹 모두의 새들은 비장에서부터의 바이러스 단리에 있어서 양성이고, 그룹 A 및 B 각각에 있어서 142.5 및 176.0 의 유사한 플라크 평균 개수를 갖는다. 바이러스는 그룹 A 의 모든 새의 우포에서 단리될 수 있고, 그룹 B 에서는 90% 의 새에서 단리될 수 있다.
D28 때에 백신접종되지 않은 접촉 새의 비장으로부터의 바이러스 단리 결과를 표 14 에 기록한다. 그룹 Ac 에서 10 종의 새 중 7 종은 비장으로부터의 바이러스 단리에 양성인데, 이는 부모 SB-1 이 접촉 새로 수평적으로 퍼졌음을 시사한다. 바이러스는 그룹 Bc 의 새로부터 단리될 수 없으며, 이는 gC-결실된 돌연변이가 접촉 새로 전파되지 않았음을 나타낸다.
D14 에서 그룹 A 및 B 의 백신접종된 새의 비장 연막 (BC) 및 우포 (FF) 로부터의 바이러스 단리 결과

샘플 번호 		그룹 A- SB1 그룹 B - SB-1 gC 결실
비장 BC * FF** 비장 BC* FF
1 46 + 179 +
2 92 + 129 +
3 80 + 108 +
4 135 + 111 +
5 18 + 38 +
6 55 + 109 -
7 187 + 83 -
8 233 + 383 +
9 51 + 31 +
10 213 + 251 +
11 100 + 345 +
12 50 + 44 +
13 271 + 331 +
14 128 + 106 +
15 155 + 80 +
16 226 + TNTC (563) +
17 145 + 145 +
18 114 + 224 +
19 88 + 181 +
20 TNTC*** (462) + 78 +
평균 또는 양성/전체 142.5 20/20 176.0 18/20
표준오차 103.3 - 137.6 _
* 비장 연막 (BC) 로부터의 평균 플라크 카운트
** 우포로부터의 양성 샘플
*** TNTC (too numerous to count; 카운트하기에는 과수임)
D28 에서 그룹 Ac 및 Bc 의 백신접종되지 않은 접촉 새의 비장 연막 (BC) 으로부터의 바이러스 단리 결과

샘플 번호 		그룹 Ac -
SB-1 		그룹 Bc -
SB-1 gC 결실
비장 BCE * 비장 BCE *
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 8 0
5 129 0
6 3 0
7 25 0
8 1 0
9 108 0
10 1 0
* 평균 플라크 카운트
본 연구는, D14 백신접종후에 측정된 gC-결실된 SB-1 돌연변이의 바이러스혈증 수준이 부모 SB-1 바이러스의 수준과 유사하다는 점을 나타내며, 이는 gC 결실이 백신접종된 새에서 SB-1 바이러스의 복제 능력을 손상시키지 않는다는 점을 시사한다. gC-결실 돌연변이시, 우포에서 바이러스의 수준은, 2/20 새들이 검출가능한 양의 바이러스를 갖지 않은 바, 약간 낮았다. 수평적 전염이, 부모 SB-1 으로 백신접종된 새와 접촉된 7/10 새에서 검출될 수 있다. 반대로, gC-결실된 돌연변이로 백신접종된 새와 접촉된 새로부터는 바이러스가 검출될 수 없는데, 이는 gC 결실이 수평적 전염을 심각하게 손상시킨다는 점을 나타낸다.
실시예 9 1일령 SPF 닭에서 HVT-IBD 벡터 백신과 조합되거나 또는 단독으로 하는 SB-1 재조합체에 의해 유도된 ND 효능
본 연구의 목적은, vSB1-004 단독 또는 HVT-IBD 벡터 백신과 조합되어 백신접종된 SPF 닭에서 4주령 때 실시된 ND 챌린지에 대항하는, NDV F 유전자를 발현하는 vSB1-004 의 효능을 평가하는 것이다.
15 마리의 1일령 특정 무병원체 (SPF) 백색 레그혼종 닭의 3 그룹 (1, 2 및 3) 을 무작위로 구성시켰다. 2 종의 벡터 백신을 이용했다: 실시예 1 에 기재된 vSB1-004, 및 vHVT13, 즉 전염성 점액낭병 바이러스 Faragher 52/70 균주의 VP2 유전자를 발현하는 칠면조 헤르페스바이러스의 (HVT) 벡터 (Merial 허가 VAXXITEK®HVT+IBD 백신의 활성 성분, US 5,980,906 및 EP 0 719 864). 그룹 1, 2 및 3 의 새는 오로지 vHVT13 만 (대조군), 오로지 vSB1-004 만을, 및 vHVT13 와 vSB1-004 의 혼합물을, 각각 수여 받았다 (표 6 참조). 모든 새들을 2000 PFU 의 vSB1-004 및/또는 vHVT13 (D0) 로 피하 경로 (목덜미) 로써 백신접종하였다. 백신접종 후 27 일 후 (D27), 각 그룹의 새들을 유전형 V Mexican Chimalhuacan; Mex V 강독형 (velogenic; 벨로제닉) NDV 균주로 챌린지했다. 상기 챌린지는, 0.2 ml 의 생리적 멸균수 중 희석된 105 종의 계란 감염량 50 (EID50) 을 이용해 근육내 (IM) 수행했다. 새들을 임상적 징후 및 사망율에 대해 챌린지 후 14 일 동안 매일 관찰했다. 구강인두 면봉을 챌린지 후 5, 7 및 9 일 후에 그룹 당 10 마리로부터 샘플링하였다. RNA 바이러스량을, Wise et al. (2004; Development of a Real-Time Reverse-Transcription PCR for Detection of Newcastle Disease Virus RNA in Clinical Samples; J. Clin. Microbiol. 42, 328- 338) 에 의해 기재되고 M 유전자를 바탕으로 하는 정량적 역전사효소 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (qRT-PCR) 을 이용해 RNA 추출 후 상기 면봉에서 평가했다. 셰딩 수준은, mL 당 log10 계란 감염량 50% (EID50) 로서 표시했다. 혈액을 챌린지 시간에서 (D27) 샘플링했다. 혈청을 항-IBD ELISA (Synbiotics ELISA ProFlok PLUS IBD) 로 시험해, vHVT13-유도된 IBDV 항체에 대한 vSBA-004 의 영향을 평가하였다.
보호 및 혈청테스트 결과를 표 15 에 요약한다. 모든 대조군 새들은 ND 챌린지 후 5 일 이내에 죽었다. vSB1-004 재조합 바이러스는 단독으로 또는 vHVT13 과 조합되었을 경우, 완전한 임상적 보호를 유도했다. 셰딩 검출량의 챌린지 ND 바이러스를 셰딩하는 새의 개수는, 양 백신접종 그룹에서 매우 낮았다. 그룹 1 및 3 에서 평균 IBD ELISA 역가는 거의 동일하였으며, 이는 vSB1-004 의 vHVT13-유도 IBDV 항체에 대한 간섭 결여를 나타낸다.
D27 에서 챌린지된 SPF 1일령 닭 (15/그룹) 에서 NDV F 유전자를 발현하는 SB-1 재조합체에 의해 유도된 ND 보호 결과
그룹 백신 (D0) ND 보호 IBD ELISA 역가 (log10±SD*) 구강인두 면봉에서 셰딩**
D5*** D7 D9
1 vHVT13 0% 4.04±0.15 -**** - -
2 vSB1-004 100% 0.26±0.50 1/10 (2.2) 0/10 0/10
3 vSB1-004 + vHVT13 100% 4.02±0.08 3/10 (4.1) 2/10 (2.8) 1/9 (3.4)
* 표준편차
** 셰딩의 새 개수/전체 (평균 log10 EID50 당량/mL)
*** 챌린지 후 일
**** 그룹 1 의 모든 새들은 D5 이전에 죽었고, 따라서, 이 그룹에서 셰딩은 평가하지 않았다.
유전형 V Chimalhuacan 강독형 NDV 로의 ND 챌린지 모델은 매우 가혹하다. 이러한 심각한 챌린지 조건 하에서, vSB1-004 는 구강인두 경로로써 챌린지 바이러스의 셰딩에 대항해서 완전한 임상적 보호 및 우수한 보호를 유도했다. vSB1-004 에 삽입된 F 유전자는 유전형 VIId NDV 균주로부터의 것이고, 여기서 사용된 챌린지 균주는 유전형 V 인 점에 주목할만한 가치가 있다. 따라서, SB-1 벡터에 삽입된 유전형 VIId F 유전자는 유전형 V 챌린지에 대항하는 새를 교차-보호한다. vHVT13 의 첨가는 vSB1-004 에 의해 유도된 ND 보호를 손상시키지 않았으며, vSB1-004 는 vHVT13-유도 IBD 항체 역가에 간섭을 일으키지 않으므로, 이는 SB-1 벡터와 HVT 벡터의 양립 가능성을 증명한다.
실시예 10 1일령 SPF 닭에서 SB-1 재조합체에 의해 유도된 ND 조기 효능
본 연구의 목표는, 2 종의 상이한 NDV 챌린지 균주로 수행된 SPF 닭에서 조기 (D14) ND 챌린지에 대항하는 NDV F 를 발현하는 vSB1-004 재조합체의 효능을 평가하는 것이다.
20 마리의 1일령 특정 무병원체 (SPF) 백색 레그혼종 닭의 2 그룹 (1 및 2) 을 무작위로 구성시켰다. 그룹 2 의 새들을 피하 경로 (목덜미)로써 2000 PFU 의 vSB1-004 로 백신접종했다. 그룹 1 의 닭들을 백신접종시키지 않고, 대조군 새들로써 유지시켰다. 2 주령때, 각 그룹의 절반의 새들을 유전형 V Mexican Chimalhuacan (Mex V) 강독형 NDV 균주로 챌린지시키고, 나머지 반은 유전형 VIId Malaysia 04-1 (Mal VIId) 강독형 NDV 균주로 챌린지시켰다. 상기 챌린지를 근육내 (IM) 경로로써, 0.2 ml 의 생리 멸균수 중 희석된 105 종의 계란 감염량 50 (EID50) 를 이용해 수행했다. 새들을 매일 챌린지 후 14 일 동안 임상적 징후 및 사망율에 대해 관찰했다.
보호 결과를 표 16 에 요약한다. 모든 대조군 새들은 ND 챌린지 후 5 일 이내에 죽었다. 상기 가혹한 조기 챌린지 조건에서, vSB1-004 재조합 바이러스는 사망 (각각, Mal VIId 및 Mex V 으로의 챌린지 후 70% 및 40% 보호) 및 이병 (morbidity) (각각, Mal VIId 및 Mex V 으로의 챌린지 후 50% 및 30% 보호) 에 대항하는 부분적인 보호를 유도했다.
SPF 1일령 닭에서 NDV F 유전자 발현 SB-1 재조합체에 의해 유도된 조기 ND 보호의 결과
그룹 백신 챌린지 균주 사망에 대항하는 보호 이병에 대항하는 보호
1 - Mal VIId 0/10 0/10
Mex V 0/9 0/9
2 vSB1-004 Mal VIId 7/10 5/10
Mex V 4/10 3/10
vSB1-004 재조합체의 효능을 평가하는데 사용된 조기 ND 챌린지 모델을 선택하였는데, 그 이유는 NDV F 유전자 발현 마렉병 바이러스 벡터가 일반적으로 상기 모델에서 완전한 보호를 제공하지 않기 때문이다. 실제로, 이들의 면역성 개시는 생 NDV 백신과 비교시 지연된다 (Morgan et al. (1993) Avain Dis 37, 1032-40; Heckert et al. (1996) Avain Dis 40, 770-777). 따라서, 백신 후보들을 평가 및 비교하는데 이것은 양호한 모델이다. 이러한 가혹한 조기 챌린지 조건 하에서, vSB1-004 재조합체는 Mexican Chimalhuacan 유전형 V 것에 대항하는 것보다 Malaysian 유전형 VIId 챌린지에 대항해서 단지 약간 높게 부분적인 보호를 유도했는데, 이는 아메리카 및 유럽/ 아프리카에서 퍼져있는 두 종의 가장 만연된 유전형 각각에 대항해서 광범위하게 보호한다는 점을 시사한다.
실시예 11 모체 항체를 갖는 1일령 육용계에서 HVT-IBD 벡터 백신과 조합되거나 또는 단독으로 하는 SB-1 재조합체에 의해 유도된 ND 효능
본 연구의 목적은, vSB1-004 단독 또는 HVT-IBD 벡터 백신과 조합되어 백신접종된 육용계에서 4 주령 때에 수행된 2 종의 ND 챌린지에 대항하는 NDV F 유전자 발현 vSB1-004 재조합체의 효능을 평가하는 것이다.
12 마리의 1일령 육용계 (Hubbard JA957 라인) 의 6 그룹 (1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b) 을 무작위로 구성시켰다. 2 종의 벡터 백신을 이용했다: 실시예 1 에 기술된 vSB1-004 및 vHVT13, 전염성 점액낭병 바이러스 Faragher 52/70 균주의 VP2 유전자를 발현하는 칠면조 헤르페스바이러스 (HVT) 벡터 (Merial 허가 VAXXITEK®HVT+IBD 백신의 활성 성분). 그룹 1 (1a & 1b) 의 새들은 오로지 vHVT13 만으로 백신접종시키고 (대조군); 그룹 2 의 새들은 vSB1-004 만으로 백신접종시키고 그룹 3 의 새들은 vHVT13 및 vSB1-004 의 혼합물로 백신접종시켰다 (표 17 참조). 모든 새들을 2000 PFU 의 vSB1-004 및/또는 vHVT13 (D0) 로 피하 경로 (목덜미) 로써 백신접종하였다. 백신접종 후 28 일 후 (D28), 각 하위그룹 "a" 의 모든 새들을 유전형 VIId Malaysia 04-1 (Mal VIId) 강독형 NDV 균주로 챌린지하고, 각 하위그룹 "b" 의 모든 새들은 유전형 V Mexican Chimalhuacan (Mex V) 강독형 NDV 균주로 챌린지하였다. 상기 챌린지는, 0.2 ml 의 생리적 멸균수 중 희석된 105 종의 계란 감염량 50 (EID50) 을 이용해 근육내 (IM) 수행했다. 새들을 임상적 징후 및 사망율에 대해 챌린지 후 14 일 동안 매일 관찰했다. 챌린지 때 (D28) 각 그룹에서 5 마리의 새들로부터 혈액을 또한 샘플링하였다. 혈청을 항-IBD ELISA (Synbiotics ELISA ProFlok PLUS IBD) 로 테스트해, 육용계에서 vHVT13-유도 IBDV 항체에 대한 vSB1-004 의 영향을 평가했다.
보호 및 혈청테스트 결과를 표 17 에 요약한다. 모든 대조군 새들은 ND 챌린지 후 5 일 이내에 죽었다. vSB1-004 재조합 바이러스는 vHVT13 과 조합 또는 그렇지 않은 경우에 유의한 수준의 임상적 보호를 유도했다. 검출가능한 양의 바이러스를 셰딩하는 새들의 개수는, 양쪽 백신접종한 그룹에서 매우 낮았다. 그룹 2 에서 평균 IBD 항체 역가는 D27 에서 여전히 높았고 (3 log10), 이는 높은 수준의 모체-유래 IBD 항체를 지시하였다; 그럼에도 불구하고, vHVT13 은 vSB1-004 와 혼합시 영향받지 않은 클리어한 IBD 항체 반응을 유도했다.
D28 에서 챌린지된 육용계 1일령에서 (그룹 1b (11 마리) 를 제외하고는 그룹당 12 마리) NDV F 유전자를 발현하는 SB-1 재조합체에 의해 유도된 ND 보호 결과
그룹 백신 (D0) ND 챌린지 ND 보호 IBD ELISA 역가(log10±SD*)
1a vHVT13 Mal VIId 0% 3.94±0.24
1b vHVT13 Mex V 0%
2a vSB1-004 Mal VIId 83% 3.03±0.44
2b vSB1-004 Mex V 75%
3a vSB1-004+vHVT13 Mal VIId 75% 4.02±0.23
3b vSB1-004+vHVT13 Mex V 83%
*표준 편차
상기 연구의 결과는, NDV MDA 를 갖는 육용계에서 vSB1-004 로써 유도된 유효한 수준의 보호를 나타낸다. vHVT13 의 첨가는 vSB1-004-유도된 ND 보호에 대해 부정적인 영향을 미치지 않고, 이는 vHVT13 간섭의 부재를 나타낸다. 더욱이, vSB1-004 는 vHVT13-유도된 IBD 항체에 대해 간섭하지 않았으므로, 이는 육용계에서 이들 두 벡터의 양립성을 확인시켰다.
실시예 12 1 일령 SPF 닭에서 HVT-IBD 벡터 백신에 의해 유도된 IBD 조기 효능에 대한 vSB1-004 의 간섭 결여
본 연구의 목적은, SPF 닭에서 조기 (D14) IBD 챌린지 모델에서 HVT-IBD 벡터 백신 (vHVT13) 에 의해 유도된 IBD 효능에 대한 vSB1-004 재조합체의 잠재적인 간섭을 평가하는 것이다.
10 마리의 1일령 특정 무병원체 (SPF) 백색 레그혼종 닭의 3 그룹 (1 내지 3) 을 무작위로 구성시켰다. 그룹 1 의 새들을 2000 PFU 의 vSB1-004 로 피하 경로를 통해 (목덜미) 백신접종했다 (대조군). 그룹 2 의 닭들은 2000 PFU 의 vHVT13 로, 그룹 3 의 새들은 2000 PFU 의 vHVT13 및 2000 PFU 의 vSB1-004 로 백신접종했다. 2주령때, 각 그룹의 모든 새들을, 2.5 log10 EID50 의 IBDV 고전적 균주 Faragher 52/70 를 함유하는 50㎕ 로 안구 경로를 통해 챌린지했다. 새들을 챌린지 후 10 일동안 매일 임상적 징후 및 사망에 대해 관찰했다. 모든 새들은 챌린지 후 10 일 후에 안락사시키고, 체중 및 파부리키우스 점액낭 중량을, 점액낭/바디 중량비 평가를 위해 기록했다. 이의 점액낭을 또한 IBD 의 전형인 조직학적 병변에 대해 체크했다. 표 18 에 나타낸 바와 같이 병변의 중증도를 기초로 각 점액낭에 대해 점수를 부여했다. 각 그룹에서 발병 새 (비(非)보호화된) 의 수를 산출했다. 새가 죽고/죽거나 주목할만한 질병 징후 및/또는 중간 또는 심각한 병변의 파브리키우스 점액낭을 보이는 경우 발병된 것으로 간주했다 (즉, 조직학적 점수 ≥ 3).
[표 18]
파브리키우스 점액낭의 조직학적 병병의 규모 점수
Figure pct00004

보호 결과를 표 19 에 요약한다. 모든 대조군 새들은 챌린지 후에 병들었고, 한 마리는 죽은 반면에, 모든 백신접종된 새들은 건강한 채 남아 있었다. 그룹 2 및 3 의 점액낭 체중 비율은 유사했고, 그룹 1 의 것보다 유의하게 높았다. 챌린지에 살아남은 그룹 1 의 모든 8 마리의 새들은 4 또는 5 점수의 점액낭 병변을 가졌다.
SPF 1일령 닭에서 NDV F 유전자 발현 vSB1-004 재조합체와 조합되어 또는 단독으로서의 vHVT13 에 의해 유도된 조기 (D14) IBD 보호 결과
그룹 백신 사망률 이병률 점액낭/바디 중량 비율*100 ≥3 의 점수를 갖는 점액낭 보호
1 vSB1-004 1/9* 9/9 0.14±0.02 8/8 0%
2 vHVT13 0/10 0/10 0.47±0.10 0/10 100%
3 vHVT13+ vSB1-004 0/9* 0/9 0.46±0.20 1/9 89%
* 이들 그룹에서 1 마리의 새가 챌린지 전에 죽음.
vHVT13-유도 IBD 보호에 대한 vSB1-004 재조합체의 간섭 결여를 평가하는데 사용한 조기 IBD 챌린지 모델을 선택했는데, 그 이유는 이것이 vHVT13 보호에 대한 간섭을 검출하는데 매우 민감하기 때문이다. vSB1-004+vHVT13 로 수득된 결과는 우수한 수준의 IBD 보호 (89%) 를 나타내었고, 이는 조기 IBD 챌린지에서 측정시에서 조차도 vSB1-004 와 vHVT13 의 양립가능성을 나타낸다.
실시예 13 21 일령 SPF 닭에서 NDV ZJ1 (유전형 VIId) 및 California/02 (유전형 V) 으로의 챌린지에 대항하는 vHVT114, vHVT116, vSB1-007, vSB1-008 (단독 또는 vHVT13 과) 및 vHVT 304 의 효능
본 연구의 목적은, 21 일령 SPF 닭에서 수행된 NDV ZJ1 (유전형 VIId) 및 California/02 (유전형 V) 으로의 뉴캐슬 질환 챌린지에 대항하는 이중 HVT 재조합체 (vHVT304) 및 NDV F 유전자를 발현하는 2 종의 SB1 재조합 구축물 (vSB1-007 & vSB1-008), 2 종의 단일 HVT 재조합 구축물 (vHVT114 및 vHVT116) 의 효능을 평가하는 것이다.
이들 5 종의 백신 후보의 특징을 하기 표 20 에 기재한다.
챌린지 연구에서 사용된 벡터의 특징
명칭 부모 바이러스 프로모터 F 유전자 Poly-A 유전자좌
vHVT114 HVT SV40 Opt-VIId SV40 IG1
vHVT116 HVT SV40 Opt-V SV40 IG1
vSB1-007 SB-1 SV40 Opt-VIId gC gC
vSB1-008 SB-1 SV40 Opt-V SV40 IG1
vHVT304 vHVT13* SV40 Opt-VIId 합성 IG2
*vHVT13 는 IBDV VP2 유전자를 발현하는 HVT 벡터를 기재로 하는 허가된 Vaxxitek HVT-IBD 백신의 활성 성분이다 (US 5,980,906 및 EP 0 719 864 참조).
D0 때에, 158 마리의 1일령의 SPF 닭을 24 마리 새의 6 그룹 (백신접종됨) 및 12 마리의 새의 1 그룹 (백신접종되지 않은 대조군) 으로 무작위 할당했다. 하기 표 21 에 기재된 바와 같이 1000 pfu 의 표적 용량을 함유하는 재조합 백신 0.2 mL 을 D0 에서 목에 피하 주사로써 새에 주입했다. 이후, 새들을 두 하위그룹으로 나누고, 각 하위 그룹은 5 log10 EID50 의 NDV ZJ1 (유전형 VIId) 또는 California/02 (유전형 V) 강독형 균주로 D21 때 근육내 경로로써 챌린지하였다.
[표 21]
효능 결과
Figure pct00005

각 그룹을 챌린지 전후에 모니터링했다. 격리실에서 관찰된 기술적 문제점으로 인해 그룹 2 에서의 새의 개수 (vHVT114: 24 → 14) 및 그룹 3 에서의 새의 개수 (vHVT116: 24 → 20) 가 감소되었다. NDV 임상적 징후를 챌린지 후에 기록했다. 항원으로서 각 챌린지 균주를 이용하는 HI 테스트로써 NDV 혈청 테스트에 대한 챌린지 (D21) 전, 그룹 2 및 7 의 새에서 취한 혈액 샘플에서 혈청을 수집했다.
사망 및 이병에 대항하는 보호% 를 상기 표에 보고한다. 완전한 감수성이 비백신접종된 챌린지 대조군 G1 에서 관찰되어, 양쪽 챌린지의 고 심각도가 입증되었다. 모든 백신은 높은 수준 (≥75%) 의 양 챌린지에 대항하는 보호를 유도했다. 양 챌린지에 대항하는 완전한 임상적 보호를 vHVT114 및 vSB1-008 로써 유도했다.
챌린지 후 2 일 및 4 일에 취한 경구 및 배설강 면봉에서 실시간 RT-PCR 로써 셰딩을 챌린지 후에 평가했다. 양성 (Ct<40) 새의 백분율을 도 17A 및 17B 에서 양 챌린지에 대해 나타낸다. 6 마리의 모든 새들이 CA/02 단리물로 챌린지된 대조군에서 4 dpch (첼린지 후 일) 때 죽었고, (6 마리 중) 오직 한 마리의 새가 ZJ1 로 챌린지된 대조군에서 4 dpch 때에 여전히 살아 있었다. 셰딩이 모든 대조군 새에서 검출되었다. 셰딩에 양성인 새들의 백분율 감소가 모든 백신접종된 그룹에서 관찰되었다.
결론적으로, 상기 연구의 결과는 시험된 마렉병 벡터 백신으로써 유도된 3주령때의 ND 보호가 매우 양호한 것을 나타내었다.
실시예 14 28 일령의 SPF 닭에서 NDV Texas GB 균주로의 챌린지에 대항하는 vHVT114, vSB1-007, vSB1-009, vHVT306 및 vHVT307 백신의 효능
본 연구의 목적은 28 일령의 SPF 닭에서 수행된 뉴캐슬 질환 챌린지 (Texas GB 균주, 유전형 II) 에 대항하는 NDV F 및/또는 IBDV VP2 유전자 발현 상이한 마렉병 벡터 백신의 조합 효능을 평가하는 것이다
당해 연구에서 시험된 5 종의 재조합 백신 후보의 특징을 하기 표 22 에 기재한다.
챌린지 연구에서 사용된 벡터의 특징
명칭 부모 바이러스 프로모터 F 유전자 Poly-A 유전자좌
vHVT114 HVT SV40 Opt-VIId SV40 IG1
vSB1-007 SB-1 SV40 Opt-VIId gC gC
vSB1-009 SB-1 SV40 Opt-V (CA02) gC gC
vHVT306 vHVT13 SV40 Opt-VIId 합성 SORF3-US2
vHVT307 vHVT13 SV40 Opt-V (CA02) 합성 SORF3-US2
마렉병 바이러스 혈청형 1 (CVI988 (또는 Rispens) 균주; 칠면조 헤르페스바이러스 2) 및 혈청형 2 (SB-1 균주; 칠면조 헤르페스바이러스 3) 백신을, 또한 일부 그룹에서 재조합 바이러스와 조합하여 사용했다.
D0 때에, 135 마리의 1일령의 SPF 닭을 15 마리 새의 9 그룹으로 무작위 할당했다. 부모 마렉병 백신 균주 (SB-1 및 CVI988) 에 대해서 1000 pfu 및 재조합 백신 (vSB1-007, vSB1-009, vHVT13, vHVT306, vHVT307, vHVT114) 에 대해서 2000 pfu 의 표적 용량을 함유하는 0.2 mL 을, 새에 D0 때에 목에 피하 주사로써 주사했다. 연구 설계는 하기 표 23 에 나타낸다. 새들을 4.0 log10 EID50 강독형 ND Texas GB (유전형 II) 균주로 D28 때에 근육내 경로로써 챌린지하였다.
[표 23]
효능 결과
Figure pct00006

각 그룹을 챌린지 전후로 모니터링했다. 챌린지 후 NDV 임상적 징후를 기록했다.
사망 및 이병에 대항하는 보호% 를 상기 표 23 에 보고한다. 완전한 감수성이 비백신접종된 챌린지 대조군 G1 에서 관찰되어, 양쪽 챌린지의 고 심각도가 입증되었다. 모든 백신접종된 군에서 우수한 수준의 보호가 관찰되었다. G3, G6, G7 및 G9 의 새들은 완전히 보호되었다. 이 연구는 vSB1-ND 후보가 vHVT13 및 CVI988 와 공동 투여될 수 있고, 여전히 매우 양호한 ND 보호를 제공할 수 있다는 점을 나타낸다. 마찬가지로, 이중의 HVT-IBD+ND 가 SB-1 와 양립가능하며, vHVT-ND (vHVT114) 는 vHVT13 및 SB-1 와 양립가능하다.
결론적으로, 상기 연구의 결과는 시험된 마렉병 부모 및 벡터 백신에 의해 유도된 ND 보호에 대한 간섭 결여를 나타냈다.
실시예 15 D28 의 SPF 닭에서, NDV Chimalhuacan 균주 (유전형 V) 로의 챌린지에 대항하는 vHVT13 와 조합된 HVT114, vHVT307, vSB1-007 및 vSB1-009 의 효능
본 연구의 목표는 28일령의 SPF 닭에서 수행된 뉴캐슬 질환 챌린지 (Chimalhuacan, 유전형 V) 에 대항하는 NDV F 및 IBDV VP2 양자 모두를 발현하는 이중의 HVT vHVT307 뿐 아니라 vHVT-IBD (vHVT13) 와 조합된 NDV F 유전자를 발현하는 2 종의 SB1 재조합 구축물 (vSB1-007 및 vSB1-009) 및 1 종의 HVT 재조합 구축물 (vHVT114) 의 효능을 평가하는 것이다.
이들 4 종의 백신 후보의 특징을 하기 표 24 에 기재한다.
챌린지 연구에서 사용된 벡터의 특징
명칭 부모 바이러스 프로모터 F 유전자 Poly-A 유전자좌
vHVT114 HVT SV40 Opt-VIId SV40 IG1
vSB1-007 SB-1 SV40 Opt-VIId gC gC
vSB1-009 SB-1 SV40 Opt-V (CA02) gC gC
vHVT307 vHVT13* SV40 Opt-V (CA02) 합성 SORF3-US2
D0 때에, 45 마리의 1일령의 SPF 닭을 10 마리 새들의 4 그룹 및 5 마리 새들의 1 그룹으로 무작위 할당했다 (비백신접종된 대조군). 하기 표 25 에 기재된 바와 같이 2000 pfu 의 표적 용량을 함유하는 0.2 mL 의 재조합 백신을, 새에 D0 때 목에 피하 주사로써 주사했다. 새는, 5.0 log10 EID50 강독형 Chimalhuacan (유전형 V) 균주로 D28 때에 근육내 경로로써 챌린지하였다.
[표 25]
연구 설계 및 ND 효능의 결과
Figure pct00007

각 그룹을 챌린지 전후에 모니터링했다. NDV 임상적 징후를 챌린지 후에 기록했다. 챌린지 후 5 및 7 일 후에 백신접종된 군에서 구강인두 면봉을 취해 실시간 RT-PCR 로써 바이러스량을 평가했다.
사망 및 이병에 대항하는 보호% 를 상기 표에 보고한다. 완전한 감수성이 비백신접종된 챌린지 대조군 G1 에서 관찰되어, 챌린지의 고 심각도가 입증되었다. 4 종의 모든 백신접종된 그룹에서 매우 양호한 보호가 관찰되었고, 완전한 임상적 보호는 vHVT114+vHVT13 로써 유도된다.
양성 새 백분율 및 평균 셰딩 역가 (mL 당 log10 EID50 당량으로서 표시) 를 도 18A 및 18B 에 나타낸다. 놀랍게도, G2 에서 셰딩은 검출되지 않았고, 이는 시험 조건 하에서 vHVT13 와의 공동투여될지라도 vHVT114 에 의해 유도된 완전한 (임상적 징후 및 셰딩 양자 모두에 대항해서) ND 보호를 시사한다. 기타 백신접종된 그룹에서 검출된 셰딩 수준은 낮았고 오로지 감염후 (pi) 5 일 후에 G3 (vHVT307) 에서 약간 높은 수준이 검출되었다.
결론적으로, 상기 실시예는 이중의 HVT-IBD+ND 재조합체, 또는 SB1-ND 또는 HVT-ND 와 HVT-IBD (vHVT13) 재조합 바이러스의 조합물에 의해 유도된 우수한 ND 보호를 추가로 설명한다. 제 2 의 HVT 백신 (보통의 HVT 백신 또는 재조합 HVT 백신) 이 제 1 재조합 HVT 백신에 삽입된 외래 유전자에 대한 면역성을 간섭한다는 이 분야에서의 일반적인 믿음과는 반대로, 본 발명은 vHVT13 과 조합된 vHVT114 가 NDV 에 대항해 우수한 보호를 제공하고, 어떠한 간섭 작용도 관찰되지 않는 놀라운 결과를 보였다.
실시예 16 D28 의 SPF 닭에서 NDV Chimalhuacan 균주 (유전형 V) 로의 챌린지에 대항하는 SC 또는 난 내 경로로써 투여된 vHVT13 와 조합된 vHVT306, vSB1-008 의 효능
본 연구의 목표는 28 일령의 SPF 닭에서 수행된 뉴캐슬 질환 챌린지 (Chimalhuacan, 유전형 V) 에 대항해 난 내 또는 피하 경로로써 투여된, vHVT-IBD (vHVT13) 와 조합된 NDV F 유전자를 발현하는 vSB1-008 SB1 재조합체 및 NDV F 및 IBDV VP2 유전자 양자를 발현하는 vHVT306 이중 HVT 의 효능을 평가하는 것이다.
그룹 설계는 표 26 에 나타낸다. 60 마리의 SPF 부화 계란 (약 18 일 및 18 시간의 인큐베이션 후; D-3) 을 난 내 투여에 사용했다 (G1, G2 및 G3 에 있어서 그룹 당 20 마리). 2000 PFU 함유 50 마이크로리터의 백신을, AviTech LLC (Salisbury, MD, USA) 사의 IntelliLab System 장치를 이용해 난 내 경로로써 투여했다. 부화력 및 생존을 난 내 투여 후 기록했다. D0 때에, 20 마리의 1일령 SPF 닭을 10 마리 새의 2 종의 그룹 (G4 및 G5) 로 무작위 할당했다. 새에, 하기 표 26 에 기재된 바와 같이 2000 pfu 의 표적 용량을 함유하는 0.2 mL 의 재조합 백신을 D0 때 목에 피하 (SC) 주사로써 주사했다. 그룹 당 10 마리의 새를 5.0 log10 EID50 강독형 Chimalhuacan (유전형 V) 균주로 D28 때 근육내 경로를 통해 챌린지했다.
[표 26]
연구 설계 및 ND 효능 결과
Figure pct00008

각 그룹을 챌린지 전후에 모니터링했다. NDV 임상적 징후를 챌린지 후 기록했다. 실시간 RT-PCR 로써 바이러스량을 평가하기 위해 챌린지 후 5 및 7 일 후에 백신접종된 그룹에서 구강인두 면봉채취를 취했다.
그룹 G1 및 G2 의 새에 대해서 D28 (챌린지 일) 때까지 완전한 부화력 및 생존능을 기록했다. G3 에서의 부화력은 85% 였고, 한마리의 추가적인 새가 상기 그룹에서 부화 이후에 죽었다. 그 그룹의 더 낮은 부화력은, 난 인큐베이터 문제로 인한 것일 수 있다. G1, G2 및 G3 에서 수컷 및 암컷의 체중은 D1 및 D28 에서 유사했다.
사망 및 이병에 대항하는 보호% 를 표 26 에 기록한다. 완전한 감수성이 비백신접종된 챌린지 대조군 G1 에서 관찰되어, 챌린지의 고 심각도가 입증되었다. 모든 4 종의 백신접종된 그룹에서 매우 양호한 보호가 관찰되었고, 완전한 임상적 보호는 양쪽 경로로써 투여된 vHVT306 에 의해 유도된다.
양성 새 백분율 및 평균 셰딩 역가 (mL 당 log10 EID50 당량으로서 표시) 를 표 27 에 나타낸다. 검출가능하거나 또는 매우 낮은 셰딩의 부재가 vHVT306 으로 백신접종된 G2 및 G4 에서 관찰되었다. vSB1-008+vHVT13 으로 백신접종된 그룹에서 검출된 셰딩 수준은 특히 감염 후 (pi) 5 일째에 더 높았다.
[표 27]
NDV 챌린지 후 D5 및 D7 에서 평가된 셰딩에 대항하는 보호 결과 (log10 으로의 검출가능한 셰딩 및 평균 바이러스량을 가진 새의 백분율)
Figure pct00009
* 당량 log10 EID50 으로 표시된 평균 정량적 실시간 PCR 값; 역치는 2.7 log10 으로 설정.
결론적으로, 상기 실시예는 난 내 또는 SC 경로로써 투여된 vHVT306 이중 HVT 재조합체에 의해 유도된 우수한 ND 보호를 보인다. vSB1-008+vHVT13 의 성능은 특히 난 내 투여 후 약간 낮았으나, 이것은 적어도 부분적으로 달걀 인큐베이터 문제 때문일 수 있다. 실제로, 6000 PFU 의 cHVT13 과 연합된 1000 또는 4000 PFU 에서의 또 다른 SB1-ND 재조합체 (vSB1-009) 의 난 내 안전성 시험은, 6000 PFU 의 vHVT13 만을 수여받은 그룹과, 부화력 및 조기 생존에서 어떠한 차이도 보이지 않았다.
실시예 17 시판중인 육용계에서 D42 때에 NDV Chimalhuacan 균주 (유전형 V) 로의 챌린지에 대항하는 vHVT13 과 조합된 vHVT304, vHVT306, vSB1-007 및 vSB1-008 의 효능
본 연구의 목표는 시판중인 육용계에서 42 일령에서 수행된 뉴캐슬 질환 챌린지 (Chimalhuacan, 유전형 V) 에 대항하는 vHVT-IBD (vHVT13) 과 조합된 NDV F 유전자 발현 2 종의 SB1 재조합체 (vSB1-007 및 vSB1-008), 및 NDV F 와 IBDV VP2 유전자 양자 발현 2 종의 이중 HVT (vHVT304 및 vHVT306) 의 효능을 평가하는 것이다.
상기 그룹의 설계는 표 28 에 나타낸다. D0 때에, 55 마리의 1일령의 시판중인 육용계를 11 마리 새의 5 그룹으로 무작위 할당했다. 하기 표 28 에 기재된 바와 같이 2000 pfu 의 표적 용량을 함유하는 0.2 mL 의 재조합 백신을 새에 D0 때에 목에 피하 (SC) 주사로써 주사했다. 그룹 당 10 마리의 새를, 5.0 log10 EID50 강독형 Chimalhuacan (유전형 V) 균주로 D42 때 근육내 경로로써 챌린지시켰다.
[표 28]
연구 설계 및 ND 효능 결과
Figure pct00010

각 그룹을 챌린지 전후로 모니터링했다. NDV 임상적 징후를 챌린지 후 14 일 동안 기록했다. 실시간 RT-PCR 로써 바이러스량을 평가하기 위해 챌린지 후 5 및 7 일 후에 백신접종된 그룹에서 구강인두 면봉채취를 취했다.
표 28 에 사망 및 이병에 대항하는 보호 백분율을 보고한다. 완전한 감수성이 비백신접종된 챌린지 대조군 G1 에서 관찰되어, 챌린지의 고 심각도가 입증되었다. 매우 양호한 보호가 4 종의 모든 백신접종된 그룹에서 관찰되었고, 완전한 임상적 보호는 vHVT306 및 vSB1-007+vHVT13 에 의해 유도된다.
양성 새 백분율 및 평균 셰딩 역가 (mL 당 log10 EID50 당량으로서 표시) 를 표 29 에 나타낸다. 가장 최고의 셰딩 감소는 임상적 보호에 대한 최고의 후보자이기도 한 vHVT306 및 vSB1-007+vHVT13 에 의해 유도되었다.
[표 29]
NDV 챌린지 (pi) 후 D5 및 D7 때에 평가된 셰딩에 대항하는 보호 결과 (검출가능한 셰딩 및 평균 바이러스량 (log10) 을 갖는 새 백분율)
Figure pct00011
* 평균 정량적 실시간 PCR 값은 당량 log10 EID50 으로 표시; 역치는 2.7 log10 으로 설정
vSB1-007+vHVT13 가 vSB1-008+vHVT13 보다 더 잘 수행하였다. vSB1-007 게놈 구조는 하기 상이한 측면에서 vSB1-008 의 것과 상이하다: 삽입 유전자좌, 프로모터, 폴리-아데닐화 신호 및 F 유전자 기원. 이들 외래 서열의 조합 및 vSB1-007 에서의 삽입 유전자좌는 마찬가지로 더 나은 ND 보호 성능에 있어서 책임이 있었다.
요약하면, 상기 실시예는 HVT 및 MDV 혈청형 2 벡터에 의해 유도된 ND 보호에서 NDV 발현 카세트의 삽입 유전자좌 및 기타 조절 서열의 중요성을 설명한다.
실시예 18 SPF 닭에서 D14 때 고전의 IBDV 단리물로의 챌린지에 대항하는, vHVT13 재조합 백신과 조합된 이중의 HVT-ND+IBD (vHVT304 및 vHVT306) 또는 SB1-ND (vSB1-008) 의 효능
상기 연구의 목표는 14 일령의 SPF 닭에서 수행된 독성 전염성 점액낭병 바이러스 (vIBDV) 챌린지 (Faragher 52/70 균주) 에 대항하는 SB1-ND (vSB1-008) 재조합 구축물과 공동 투여된 vHVT13 의 것뿐 아니라 이중의 HVT 재조합체 vHVT304 및 vHVT306 의 조기 IBD 효능을 평가하는 것이다.
D0 때에, 95 마리의 1일령의 SPF 닭을 10 마리 새의 9 그룹 및 5 마리 새의 1 그룹(비백신접종된 챌린지되지 않은 대조군) 으로 무작위 할당했다. 하기 표 30 에 기재된 바와 같이 300 또는 1000 pfu 의 표적 용량을 함유하는 0.2 mL 의 재조합 백신을 D0 때 새에 목에 피하 주사시켜 주입시켰다. D14 때에, 혈액 샘플을 혈청학 시험을 위해 Kit ProFLOK®plus IBD (Synbiotics Corp) 를 이용해 그룹 당 5 마리의 새로부터 수집했다. 새들 (챌린지 전에 1 마리의 새가 죽은 그룹 7 을 제외하고는 그룹 당 10 마리의 새) 을, 2.5 log10 EID50 을 가진 점안액 (새 당 0.05 mL) 으로써 챌린지시켰다.
[표 30]
연구 설계 및 IBD 효능 결과
Figure pct00012
1 평균 IBD+ ELISA 역가는 챌린지 전 D14 때에 샘플링된 그룹 당 5 마리의 새의 혈청에서 log10 으로 표시;
2 2 일 초과 동안 아프거나 또는 D25 때에 여전히 아픈 새들을 아픈 새로 간주했음.
3 임상적 징후 및 심각한 점액낭 병변에 대항하는 보호 (점액낭 점수 <3)
4 비백신접종/챌린지되지 않은 그룹의 점액낭/바디 중량비는 0.0047 이었음.
각 그룹을 챌린지 전후에 모니터링했다. IBDV 임상적 징후를 챌린지 후 11 일 동안 기록했다 (D15 ~ D25). 챌린지후 관찰 기간의 말미에서 (D25), 생존한 모든 새들을 안락사시키고, 부검했다. 체중 및 점액낭 중량을 기록했다. 각 파브리키우스 점액낭 (BF) 을 칭량한 다음, 조직학 연구를 위해 4% 포름알데히드를 함유하는 각 수령체에서 보관했다. 점액낭의 조직학적 병변을 표 31 에 제시된 규모에 따라 스코어링하였다.
[표 31]
피브리키우스의 점액낭의 조직학적 병변의 스코어링 규모*
Figure pct00013
* 출처: EU Pharmacopoeia "Avian Infectious Bursal Disease vaccine (live)" 의 Monograph No. 01/2008:0587
새가 죽고/죽거나 주목할만한 질병 징후 및/또는 심각한 병변의 파브리키우스 점액낭을 보이는 경우 발병된 것으로 간주했다 (즉, 조직학적 점수 ≥ 3).
챌린지 전 log10 으로 표시된 평균 ELISA IBD+ 항체 역가를 표 30 에 나타낸다. 유의한 역가가 대조군 G1 의 것보다 상당히 더 높은 백신접종된 모든 그룹에서 검출되었다. 혈청학 역가는 용량-의존적이지 않았다.
심각한 임상적 징후가 대조군 G1 의 모든 새에서 챌린지 후에 관찰되었다. 상기 그룹의 10 마리 새들 중 7 마리는 11 일의 관찰 기간 이내에 죽었는데, 이는 고 심각도의 챌린지를 시사한다. 죽은 1 마리의 G4 새를 제외하고는 백신접종된 새들 중 어떤 새들도 챌린지 후 심각한 임상적 징후를 보이지 않았다. 심각한 점액낭 병변에 대항하는 보호% 는 상기 표 30 에 나타낸다. 유의한 IBD 보호를 모든 그룹에서 관찰하였고, 최고의 보호는 G2 및 G3 (vHVT13 단독) 에서 관찰되었다. vSB1-008+vHVT13 및 이중의 vHVT304 및 vHVT306 구축물의 공동 투여가 유사한 수준의 IBD 보호를 유도했다. 상기 보호는 시험된 용량에서 용량-의존적이지 않았다. 평균 점액낭/바디 중량비를 또한 표 30 에 나타낸다. 모든 백신접종된 그룹에서의 비율은 챌린지된 대조군의 것보다 더 높았다.
결론적으로, 이들 데이타는 SB1-ND 벡터의, 단일 HVT-IBD 또는 NDV-F 및 IBDV-VP2 모두를 발현하는 이중의 HVT 의 조합이 심각한 IBDV 챌린지 모델에서 IBD 항체 및 조기 IBD 보호를 유도한다는 점을 가리킨다.
실시예 19 시판중인 육용계에서 D23 때 고 독성 IBDV 단리물로의 챌린지에 대항하는, vHVT13 재조합 백신과 조합된, 단일의 HVT-ND (vHVT114) 또는 SB1-ND (vSB1-007 및 vSB1-009) 의 효능
본 연구의 목표는 23일령의 시판중인 육용계에서 수행된 고 독성 전염성 점액낭병 바이러스 (vvIBDV) 챌린지 (91-168/980702 단리물) 에 대항하는 HVT-ND (vHVT114) 또는 SB1-ND (vSB1-007 및 vSB1-009) 재조합 구축물로 공동 투여된 vHVT13 의 IBD 효능을 평가하는 것이다.
D0 때에, 90 마리의 1일령 육용계를 12 마리 새의 그룹 7 종 및 6 마리 새의 그룹 1 종 (비백신접종된 비챌린지된 대조군) 으로 무작위 할당했다. 표 32 에 기재된 바와 같이 3000 pfu 의 표적 용량을 함유하는 0.2 mL 의 재조합 백신을 D0 때 목에 피하 주사로써 새에 주입했다. D14 때에, Kit ProFLOK®plus IBD (Synbiotics Corp) 을 이용해 혈청학적 시험을 위해 그룹 당 5 마리의 새들로부터 혈액 샘플을 수집했다. 10 마리의 여분의 1일령 육용계의 혈청을 D0 때에 동일한 키트로 시험해 IBDV 모체 항체의 수준을 평가했다. 새 (그룹 당 10 마리의 새) 를 D23 때에 4.3 log10 EID50 의 vvIBDV 91-168 단리물을 가진 점안액 (새 당 0.05 mL) 으로써 챌린지하였다.
각 그룹을 챌린지 전후에 모니터링했다. IBDV 임상적 징후를 챌린지 후 11 일 동안 기록했다 (D23 ~ D33). 챌린지 후 관찰 기간의 말미에 (D33), 생존한 모든 새들을 안락사시켜 부검했다. 체중 및 점액낭 중량을 기록했다. 각 파브리키우스 점액낭 (BF) 을 칭량해, 조직학 시험을 위해 4% 포름알데히드를 포함하는 각각의 수령체에서 보관했다. 점액낭의 조직학적 병변을 표 31 에 제시된 규모에 따라 스코어링했다.
새가 죽고/죽거나 주목할만한 질병 징후 및/또는 파브리키우스 점액낭의 심각한 병변을 보이는 경우 발병된 것으로 간주했다 (즉, 조직학적 점수 ≥ 3).
[표 32]
연구 설계 및 혈청학 결과
Figure pct00014
1 평균 IBD+ ELISA 역가는 챌린지 전 D23 때 샘플링된 그룹 당 5 마리의 새의 혈청에서 log10 으로 표시;
2 비백신접종된/비챌린지된 그룹의 점액낭/바디 중량비는 0.0047 였음.
D0 때 평균 ELISA IBD+ 혈청학 역가는 4.36±0.01 log10 였으며, 이는 부화때 매우 높은 수준의 IBD 모체 항체를 나타낸다. D23 때, 평균 ELISA IBD+ 역가는 여전히 대조군 G1 에서 높았다 (3.9). 백신접종된 그룹에서 ELISA 평균 역가는 대조군의 것과 유의하게 상이하지 않았다.
챌린지 후 어느 그룹에서도 이병도 사망도 관찰되지 않았다. 심각한 점액낭 병변에 대항하는 보호% 는 상기 표 32 에 나타낸다. 그 결과는, vHVT114, vSB1-007 또는 vSB1-009 의 공동 투여가 vHVT13-유도 IBD 보호를 간섭하지 않는 것을 보여주며, 이는 간섭 결여를 나타낸다. 마찬가지로, 백신접종된 그룹의 평균 점액낭/바디 중량비는 유사했고, 분명히 대조군의 것보다 높았는데, 이는 백신접종 요법 사이에서 IBD 보호 및 차이가 없음을 나타낸다.
결론적으로, 데이타는 IBD 보호에 있어서 vHVT114, vSB1-007 또는 vSB1-009 및 vHVT13 사이의 양립 가능성을 나타낸다.
실시예 20 SPF 닭에서 D28 때에 변이체 E IBDV 단리물로의 챌린지에 대항하는, HVT13 재조합 백신과 조합된 SB1-ND (vSB1-007 및 vSB1-008) 및 SB-1 과 연결 또는 그렇지 않은 이중의 HVT-ND+IBD (vHVT304 및 vHVT306) 의 효능
본 연구의 목표는 1일령 SPF 닭에 피하 (SC) 투여되고 백신접종후 28 일 때 IBDV-변이체 (VAR-E) 로 챌린지에 대항하는 HVT13 (vSB1-007+vHVT13, vSB1-008+vHVT13) 벡터 백신과 조합된 2 종의 이중의 HVT (HVT-ND+IBD: vHVT304 및 vHVT306) 또는 2 종의 vSB-1-ND 의 효능을 평가하는 것이다.
D0 때에, 105 마리의 1일령 SPF 닭을, 챌린지된 대조군 (G6) 및 비챌린지된 대조군 (G7) 의 그룹을 포함한 15 마리 새의 7 그룹으로 무작위 할당했다. 그룹 G1 내지 G5 의 새들에, 각 표준 용량 2000 pfu 를 함유하는 0.2 ml 의 재조합 및/또는 SB-1 백신을 D0 때에 목에 피하 주사로써 주입했다. 연구 설계는 하기 표 33 에 나타낸다. D28 때에, G1 내지 G6 의 모든 새들을, 델라웨어 대학교 (USA) 의 IBDV 변이체 E 단리물의 점안액 (새 당 3 log10 EID50 함유 0.03 mL) 으로써 챌린지하였다. 각 그룹을 챌린지 전후에 모니터링했다. 챌린지 11 일 후, 새들을 칭량하고 부검했다. 점액낭을 수집하고 칭량했다. 점액낭/바디 중량비 (점액낭 중량/체중 비 x 100) 을 산출했다.
[표 33]
연구 설계 및 IBD 효능 결과
Figure pct00015

평균 점액낭/체중 중량 비를 표 33 에 나타낸다. 챌린지된 대조군 새들은 비챌린지된 새와 비교시 심각하게 점액낭이 위축되었다. vSB1-007 및 vSB1-008 백신은 vHVT13-유도 보호에 대해 간섭하지 않았다 (G4 및 G5). 이중 HVT (HVT-ND+IBD) 로 백신접종된 새의 점액낭/바디 중량비는 비챌린지된 대조군보다 약간 낮았으나, 분명히 챌린지된 대조군보다는 높았다. 더욱이, SB-1 혈청형 2 마렉병 백신은 vHVT304-유도 IBD 보호를 간섭하지 않았다.
결론적으로, 상기 데이타는 단일의 HVT-IBD 또는 이중의 HVT (NDV-F 및 IBDV-VP2 모두 발현) 와의 SB1-ND 벡터의 조합 모두가 변이체 E IBDV 챌린지 모델에서 IBD 보호를 유도한다는 점을 나타낸다.
실시예 21 SPF 닭에서 vHVT13 유도된 변이체 E IBD 보호에 대한 vHVT114, vSB1-009 및/또는 SB-1 의 간섭 결여
본 연구의 목표는 D28 챌린지 모델인 IBDV-변이체 (VAR-E) 에서 SPF 닭에서 vHVT114, vSB1-009 및/또는 SB-1 와 수반하여 SC 또는 난 내 경로로써 투여시 vHVT13 의 IBD 효능을 평가하는 것이다.
75 마리의 1일령 SPF 닭 및 75 마리의 SPF 18 내지 19 일령 닭 배아를, 챌린지된 대조군의 그룹 (각각, G4 및 G9) 및 비챌린지된 대조군 (각각, G5 및 G10) 을 포함해 5 그룹으로 무작위 할당했다 (각각, G1 내지 G5 및 G6 내지 G10). 그룹 G1 내지 G3 의 새들에, 1000 pfu 의 표적 용량을 갖는 SB-1 을 제외하고는 3000 pfu 의 표적 용량을 각각 포함하는 0.2 mL 의 백신을 DO 때 목에 피하 주사로써 주입했다. G6 내지 G8 의 새들은 동일 백신 용량을 수여받았으나, 부화 전 2-3 일 전에 난 내 경로로써 0.05 mL 부피였다. 연구 설계는 하기 표 34 에 나타낸다. 28 일령 때에, 그룹 G1 내지 G4 및 G6 내지 G9 의 모든 새들을 델라웨어 대학교 (USA) 의 IBDV 변이체 E 단리물의 점안액 (새 당 3 log10 EID50 을 포함하는 0.03 mL) 으로써 챌린지시켰다. 각 그룹을 챌린지 전후로 모니터링했다. 11 일의 챌린지 후, 새들을 칭량하고 부검했다. 점액낭을 수집하고 칭량했다. 점액낭/바디 중량비 (점액낭 중량/체중 비율 x 100) 을 산출했다.
[표 34]
연구 설계 및 IBD 효능 결과
Figure pct00016

평균 점액낭/바디 중량비를 표 34 에 나타낸다. 챌린지된 대조군 새 (G4 및 G9) 는 비챌린지된 것과 비교시 심각한 점액낭 위축을 보였다. 백신접종된 그룹 (G1 ~ G3 및 G6 ~ G8) 의 점액낭/바디 중량비는 비챌린지되 대조군의 것 (G5 및 G10) 과 유사했고, 챌린지된 대조군 (G4 및 G9) 의 것보다는 훨씬 높았다. SC 또는 난 내 경로 모두 후에 vHVT114 의 vHVT13-유도 IBD 보호에 대한 간섭 결여가 놀라웠고, 이는 실시예 15 및 19 에서 얻은 데이타를 확인시켜 주었다.
결론적으로, 이들 데이타는 변이체 E IBDV 챌린지 모델에서 SC 또는 난 내 경로로써 투여시, vHVT114+vSB1-009 또는 +SB-1 및 vSB1-009 의 vHVT13 과의 양립가능성을 분명히 나타낸다.
실시예 22 고 독성 플러스 마렉병 챌린지에 대항하는 vHVT114 및 vHVT13 및 SB1 또는 vSB1-009 벡터의 효능
본 연구의 목표는, 1일령 SPF 닭에, 고 독성 + 마렉병 바이러스 (vv+MDV) T-King 단리물로 4 일 후에 챌린지시키고, SC 경로로써 투여된 vHVT114, vHVT13, SB-1 및/또는 vSB1-009 을 비롯한 상이한 백신 조합물에 의해 유도되는 마렉병 효능을 평가하는 것이다.
D0 때에, 100 마리의 1일령 SPF 닭을, 20 마리 새의 5 그룹으로 무작위 할당했다. 그룹 1 내지 3 의 새들에, 표적 용량이 100 pfu 인 SB-1 을 제외하고는 각 백신에 대해서 표적 용량 2000 pfu 을 포함하는 백신 0.2 mL 를, D0 때 목에 피하 주사로써 주입했다. 그룹 4 및 5 의 새들은 백신접종하지 않고, 챌린지된 (그룹 4) 또는 비챌린지된 (그룹 5) 모의 대조군으로서 이용했다. 연구 설계를 표 35 에 나타낸다. D4 때에, 그룹 1 내지 4 의 모든 새들에, 복강내 경로 투여를 이용해 vv+MDV T-King 단리물 0.2 mL 로 챌린지 하였다.
[표 35]
연구 설계 및 MD 보호 결과
Figure pct00017

각 그룹을 챌린지 전후 유리하지 않은 임의의 반응에 대해 매일 모니터링했다. 제 49 일에, 살아 있는 모든 새들을 죽이고 부검해 마렉병과 연관된 총체적인 병변에 대해 조사했다. 신경 징후, 예컨대 마비, 질병에 기인하는 운동성 징후, 및 심각히 수척해지거나 또는 우울증이 관찰되는 경우, 직접적으로 마렉병에 기인하는 사망이 발생하거나, 또는 총체적 병변이 부검때 관찰되는 경우, 마렉병으로의 감염에 양성인 것으로서 닭들을 분류했다. 병변에는, 이에 제한되는 것은 아니나 하기가 포함될 수 있다: 간, 심장, 비장, 생식샘, 신장 및 근육 병변.
보호 결과는 상기 표 35 에 나타낸다. 상기 매우 심각한 및 조기 챌린지 모델에서 기대되는 바, 부분 (65%) MD 보호를 포함해, 모든 백신접종된 그룹 (G1 내지 G3) 은 동등하게 수행한다. 이들 결과는, 벡터 백신 후보가 마렉병에 대항하는 그들의 보호 능력을 보유하고 있음을 나타낸다.
실시예 23 HVT-IBD 벡터와 조합된 SB1-ND 벡터의 마렉병 효능의 평가
마렉병에 대항하는 보호를 유도하는데 있어서 부모 HVT 와 SB-1 사이의 시너지는 익히 공지되어 있다. 외래 유전자를 발현하는 SB-1 벡터는 그에 따라 또 다른 외래 유전자를 발현하는 부모 HVT 또는 벡터화 HVT 와 혼합되어 각각 2가 또는 3가 백신 용액을 얻을 수 있다. vSB1-009 의 vHVT114 및 vHVT13 와의 조합에 의해 유도된 마렉병 효능의 평가 예를 상기에 나타낸다 (실시예 22). 마렉병 (MD) 효능은 또한, 독성 마렉병 (vMD) 챌린지, 예컨대 GA22, 고 독성 마렉병 (vvMD) 챌린지, 예컨대 RB1B 및/또는 고 독성 + 마렉병 (vv+MD) 챌린지, 예컨대 T. King 바이러스를 비롯한 기타 MD 챌린지 모델에서, 단독 또는 조합된 마렉병 벡터화 재조합체에 대해서 입증되어 있다. 1일령 닭을 피하 접종하고, 18~ 19 일령 부화 계란을 각각 0.2 ml 용량 또는 0.05 ml 용량의 시험 바이러스로 접종한다. 5 일령때, 백신접종된 닭 및 경험이 없는 (naive) 대조군을, 관련 마렉 챌린지 바이러스 (v, vv, 또는 vv+ MDV) 로 챌린지시켰다. 챌린지된 새들을, 7주령이 될 때까지 관찰한다. 모든 새들을 죽이고 부검해, 실시예 22 에 기재된 바와 같이 마렉병과 관련된 총제적인 가시적 병변에 대해 관찰했다.
실시예 24 14 일령 및/또는 28 일령의 SPF 닭에서, NDV Texas GB 균주로의 챌린지에 대항하는 vHVT302 및 vHVT304 백신, 및 vHVT13 HVT-벡터 IBD 백신과 결부된, 또는 단독의 vSB1-004, vSB1-006, vSB1-007, vSB1-008, SB1-벡터 ND 백신의 효능
본 연구의 목표는, 14 및/또는 28일령의 SPF 닭에서 수행된 뉴캐슬 질환 챌린지 (Texas GB 균주, 유전형 II) 에 대항하는 NDV F 및/또는 IBDV VP2 유전자를 발현하는 상이한 마렉병 벡터 백신들의 조합의 효능을 평가하는 것이다.
이 연구에서 시험되는 6 종의 NDV 재조합 백신 후보의 특징을 하기 표 36 에 기재한다.
이 연구에서 시험된 6 종의 NDV 재조합 백신 후보의 특징
명칭 부모 바이러스 프로모터 F 유전자 Poly-A 유전자좌
vSB1-004 SB-1* mCMV IE Wt-VIId SV40 SORF4/US10
vSB1-006 SB-1 SV40 Opt-VIId 합성 UL55/LORF5
vSB1-007 SB-1 SV40 Opt-VIId (gC 유전자의 내인성) gC
vSB1-008 SB-1 SV40 Opt-CA02 합성 UL55/LORF5
vHVT302 vHVT13 US10 Opt-VIId US10 US10
vHVT304 vHVT13 SV40 Opt-VIId 합성 IG2
D0 때에, 225 마리의 1일령 SPF 닭을, 15 마리 새의 9 그룹 (G1a 내지 G9a, D14 때 챌린지됨) 및 15 마리 새의 6 그룹 (G1b, G3b, G4b, G5b, G8b, G9b, D28 때 챌린지됨) 으로 무작위 할당했다. 새들에, 2000 pfu 표적 용량을 포함하는 재조합 백신에 있어서 0.2 mL 를 목에 D0 때 피하 주사로써 주입했다. 연구 설계는 하기 표 37 에 나타낸다. 상기 새들은, D14 또는 D28 때, 4.3 및 4.2 log10 EID50 (0.1 mL) 강독형 ND Texas GB (유전형 II) 균주로 각각 근육내 경로로써 챌린지하였다.
[표 37]
ND 효능의 평가
Figure pct00018

각 그룹을 챌린지 전후에 모니터링했다. 챌린지 후 NDV 임상적 징후를 기록했다. 챌린지 전 G6 및 G7 에서 1 마리의 새가 죽어, 이들 그룹에서 새의 개수는 15 에서 14 로 감소했다.
임상적 보호% (사망 및 이병 모두에 대항하는 보호 포함) 를 상기 표 37 에 기록한다. 완전한 감수성이 비백신접종되고 챌린지된 대조군 G1a 및 G1b 에서 관찰되어, 챌린지의 고 심각도가 입증되었다. 13.3 내지 46.6% 범위의 부분적 보호가 D14 때 챌린지 후 관찰되었고, 가장 높은 수준의 보호는 vSB1-008, vSB1-007 및 vHVT304 에 의해 유도된다. D28 때 ND 챌린지 후 보호 수준은 모든 백신접종된 그룹에서 훨씬 높았고, vSB1-008, vSB1-007 또는 vHVT304 로 백신접종된 그룹에서는 또다시 약간 높았다. 이들 결과는, ND 보호 수준이 챌린지 날짜 및 구축물에 의존적이라는 점을 나타낸다. vSB1-008 및 vSB1-007 구축물은 vSB1-004 및 vSB1-006 보다 약간 더 양호하게 수행하고, vHVT304 는 vHVT302 보다 약간 더 양호하게 수행하는데, 이는 구축물의 상이한 특징이, MDV-기재 벡터 백신의 성능에서 한 몫을 한다는 점을 나타낸다.
결론적으로, 상기 연구의 결과는, NDV F 유전자 발현 마렉병 벡터에 의해 유도된 ND 보호 수준이 벡터, 삽입 유전자좌, F 유전자, 프로모터, 폴리-아데닐화 부위 및 챌린지 조건을 비롯한 상이한 파라미터에 따라 좌우될 수 있음을 나타내었다.
실시예 25 SPF 닭에서 14 및/또는 28 일령때에 NDV Texas GB 균주로의 챌린지에 대항하는 이중의 HVT-ND+IBD vHVT304 및 vHVT306 백신의 효능
본 연구의 목표는 14 및/또는 28 일령의 SPF 닭에서 수행된 뉴캐슬 질환 챌린지 (Texas GB 균주, 유전형 II) 에 대항하는 NDV F 및 IBDV VP2 유전자 양자를 발현하는 HVT-벡터 백신의 효능을 평가하는 것이다.
상기 연구에서 시험된 2 종의 재조합 백신 후보의 특징을 하기 표 38 에 기재한다.
상기 연구에서 이용된 재조합 백신 후보의 특징
명칭 부모 바이러스 프로모터 F 유전자 Poly-A 유전자좌
vHVT304 vHVT13 SV40 Opt-VIId 합성 IG2
vHVT306 vHVT13 SV40 Opt-VIId 합성 SORF3-US2
D0 때에, 90 마리의 1일령 SPF 닭을, 15 마리 새의 3 그룹 (G1a 내지 G3a, D14 때 챌린지됨) 및 15 마리 새의 3 그룹 (G1b 내지 G3b, D28 때에 챌린지됨) 로 무작위 할당했다. 새들에, 2000 pfu 표적 용량 포함하는 재조합 백신 0.2 mL 를 목에 D0 때 피하 주사로써 주입했다. 연구 설계는 하기 표 39 에 나타낸다. 상기 새들은, D14 또는 D28 때, 4.0 log10 EID50 (0.1 mL) 강독형 ND Texas GB (유전형 II) 균주로 근육내 경로로써 챌린지하였다.
[표 39]
ND 효능 결과
Figure pct00019

각 그룹을 챌린지 전후에 모니터링했다. 챌린지 후 NDV 임상적 징후를 기록했다. 1 마리의 새가 G2b 에서 챌린지 전에 죽어, 새의 개수는 이 그룹에서 15 에서 14 로 줄었다.
임상적 보호% (사망 및 이병 모두에 대항하는 보호 포함) 를 상기 표 39 에 기록한다. 완전한 감수성이 비백신접종되고 챌린지된 대조군 G1a 및 G1b 에서 관찰되어, 챌린지의 고 심각도가 입증되었다. D14 에서 챌린지 후 보호 수준은 D28 에서 챌린지 후 수득된 것보다 훨씬 더 낮았다. 이들 백신 후보는 vHVT13 게놈의 2 종의 상이한 유전자좌에 삽입된 동일한 NDV F 발현 카세트를 가졌다. 이들은 시험 조건에서 ND 보호 측면에서 동일하게 수행하였는데, 이는 두 삽입 유전자좌 (IG2 및 SORF3-US2) 가 NDV F 카세트 삽입에 동등하게 적합하다는 점을 나타낸다.
결론적으로, 상기 연구 결과는, NDV F 유전자 발현 마렉병 벡터로써 유도된 ND 보호 수준이 벡터, 삽입 유전자좌, F 유전자, 프로모터, 폴리-아데닐화 부위 및 챌린지 조건을 비롯한 상이한 파라미터에 의존한다는 것을 보였다.
실시예 26 강독형 유전형 V NDV 챌린지에 대항하는, 1일령 SPF 닭에서 이중의 HVT-ND+IBD (vHVT302, vHVT303, 및 vHVT304) 또는 SB1-벡터 (vSB1-006 및 vSB1-007) 에 의해 유도된 ND 조기 효능
본 연구의 목적은, D14 때에 수행된 강독형 유전형 V (Chimalhuacan) NDV 챌린지에 대항하는, 1 일령 SPF 닭에서의 3 종의 이중 HVT-ND+IBD (vHVT302, vHVT303, 및 vHVT304) 및 2 종의 SB1-ND 벡터 (vSB1-006 및 vSB1-007) 의 효능을 평가하는 것이다.
상기 연구에서 시험된 5 종의 재조합 백신 후보의 특징을 하기 표 40 에 기재한다.
상기 연구에서 사용된 재조합 백신 후보의 특징
명칭 부모 바이러스 프로모터 F 유전자 Poly-A 유전자좌
vHVT302 vHVT13 US10 Opt-VIId US10 US10
vHVT303 vHVT13 US10 Opt-V (CA02) US10 US10
vHVT304 vHVT13 SV40 Opt-VIId 합성 IG2
vSB1-006 SB-1 SV40 Opt-VIId 합성 UL55/LORF5
vSB1-007 SB-1 SV40 Opt-VIId (gC 유전자로부터의 내인성) gC
10 마리의 1일령 특정 무병원체 (SPF) 백색 레그혼종 닭의 6 그룹 (1 및 2) 을 무작위로 구성시켰다. 그룹 2 내지 6 의 새들은, 하기 표 41 에 나타낸 바와 같이 2000 PFU 의 표적 용량으로 피하 경로로써 (목덜미) 백신접종하였다. 그룹 1 의 닭은 백신접종하지 않고, 대조군 새로서 유지하였다. 2주령때, 모든 새들을, 유전형 V Mexican Chimalhuacan (Mex V) 강독형 NDV 균주로 챌린지하였다. 상기 챌린지는 0.2 ml 의 생리 멸균수 중 희석된 105 계란 감염량 50 (EID50) 를 이용해 근육내 (IM) 경로로써 수행되었다. 모든 새들을 챌린지 후14 일까지 모니터링했다. 챌린지 후, 각 새의 건강 상태를 매일 하기와 같이 스코어링하였다: 건강/특정 증후군 (주름진 깃털, 탈진, 사경, 떨림)/ 사망. 2 일 초과 동안 특정 증후군을 보이거나, 또는 D28 때 아픈 임의의 새를, 이병률 산출을 위해 고려하였다.
SPF 1일령 닭에서 NDV F 유전자를 발현하는 상이한 MDV 벡터화 후보에 의해 유도된 조기 ND 보호의 결과
그룹 백신 0.2 mL (실제 용량)
하 표적 용량 (PFU)		 사망에 대항하는 보호 이병에 대항하는 보호
G1 - - 0% 0%
G2 vHVT302 2000 (4427) 50% 10%
G3 vHVT303 2000 (ND) 10% 0%
G4 vHVT304 2000 (1169) 80% 60%
G5 vSB1-006 2000 (1720) 60% 40%
G6 vSB1-007 2000 (1564) 80% 50%
보호 결과를 표 41 에 요약한다. 모든 대조군 새들은 ND 챌린지 후 사망하였다. 가변 수준의 ND 보호는, 사망 및 이병에 대항하는 보호 측면에서 각각 10% 내지 80%, 및 0% 내지 60% 범위로 상이한 시험된 백신에 의해 유도되었다. vHVT304 후보는 vHVT303 및 vHVT302 후보보다 더 양호한 보호를 유도했다; 이는 NDV F 유전자 앞에 놓인 외인성 SV40 프로모터로 인한 것일 수 있다. vSB1-007 는 vSB1-006 보다 약간 더 양호하게 수행했다. 더욱이, vHVT304 로 수득된 성능은, vSB1-007 로 수득된 것과 필적될만했고, 이는 상이한 마렉병 벡터가 동일 수준의 ND 보호에 다다를 수 있다는 점을 나타낸다.
결론적으로, 상기 연구는 이중 HVT-ND+IBD 및 SB1-ND 벡터화 백신 모두가 고 중증 및 조기 NDV 챌린지 모델에서 유의한 수준의 ND 보호를 달성할 수 있음을 증명한다.
실시예 27 D28 때 수행된 강독형 유전형 V NDV 챌린지에 대항하는, 1일령 SPF 닭에서 난 내 또는 SC 경로로써 투여된 이중 HVT-ND+IBD vHVT306 에 의해 유도된 ND 효능
본 연구의 목적은 28 일령에 수행된 강독형 유전형 V (Chimalhuacan) NDV 챌린지에 대항하는, SPF 닭에서의 난 내 또는 SC 경로로써 투여된 1 종의 이중 HVT-ND+IBD (vHVT306) 의 효능을 평가하는 것이다.
이 연구에서 시험된 vHVT306 재조합 백신 후보의 특징은 하기 표 42 에 기재한다. 단일의 HVT-IBD 벡터 백신 vHVT13 을 대조군으로서 이용했다.
상기 연구에서 이용된 재조합 백신 후보의 특징
명칭 부모 바이러스 프로모터 F 유전자 Poly-A 유전자좌
vHVT306 vHVT13 SV40 Opt-VIId 합성 SORF3-US2
-3 일에, 대략 18 일 및 18 시간의 인큐베이션된 40 마리의 SPF 부화 계란을, 각각 20 알의 2 그룹으로 무작위 할당했다. D0 때, 12 일령 SPF 닭의 1 그룹을 부가했다. 하기 표 43 에 그룹 정의를 제공한다. 백신접종은 D-3 대 (난 내 경로) 또는 D0 때 (SC 경로, 목 후미) 수행하고, vHVT306 및 vHVT13 의 표적 용량은 2000 pfu/새였다. 난 내 경로에 있어서, 부화력, 생존력 (D28 까지) 및 새 성장 (부화와 D28 사이) 를 모니터링했다.
D28 때, 그룹 당 10 마리의 새를, 독성 ND Chimalhuacan 균주로 챌린지하였다. 상기 챌린지는, 0.2 ml 의 생리 멸균 수 중 희석된 105 계란 감염량 50 (EID50) 를 이용해 근육내 (IM) 경로로써 수행했다. 새들을, 챌린지 후 14 일까지 모니터링했다. 특정 임상적 징후 및 사망을 기록했다. 2 일 초과 동안 특정 증후군을 보이거나 또는 D42 때 아픈 임의의 새들을, 이병률 산출을 위해 고려하였다. 챌린지 후 5 일 및 7 일에 (즉, D33 및 D35), 구강인두 면봉채취를 각각의 생존한 새들로부터 취했다. 모든 면봉들을 특정 NDV qRT-PCR 로써 분석했다.
SPF 닭 내로 SV 또는 난 내 경로로써 투여된 NDV F 및 IBDV VP2 유전자 양자 모두를 발현하는 vHVT306 MDV 벡터화 후보에 의해 유도되는 ND 보호의 결과
그룹 백신/경로 부화력/생존능 (%) 사망/이병에 대항하는 보호 5 dpi/7 dpi 애서 셰딩하는 새% (평균 log10 역가*)
G1 vHVT13/난 내 100%/100% 0%/0% (시험되지 않음)
G2 vVHT306/난 내 100%/100% 100%/100% 0% (2.7)/0% (2.7)
G3 vHVT306/SC - 100%/100% 20% (3.2)/10% (2.9)
* 실시간 RT PCR 의 역치 역가는 2.7 log10 당량 EID50 으로 설정하였음
완전한 부화력을 그룹 1 및 2 에서 난 내 백신접종 후 기록하고, 부화된 모든 새들은 D28 까지 생존했다. 체중의 차이는 D0 및 D28 때 두 그룹 사이에서 탐지되지 않았으며, 이로써 난 내 투여시 vHVT306 의 완전한 안전성을 확인되었다. 보호 결과는 표 43 에 요약한다. ND 챌린지 후 4 일까지 모든 vHVT13-백신접종된 대조군 새들은 죽었다. 완전 임상적 ND 보호는, 양 경로로써 투여된 vHVT306 에 의해 유도되었다. 더욱이, 난 내 투여 후 어떠한 셰딩도 탐지되지 않은 반면에, 오로지 몇 새들만이 SC 투여 후 탐지가능한 양의 챌린지 바이러스를 셰딩했다.
결론적으로, 상기 연구는, 이중 HVT-ND+IBD vHVT306 이 매우 심각한 이종 NDV 챌린지 모델에서 SC 또는 난 내 투여에 의해 우수한 수준의 ND 보호를 유도한다는 점을 입증한다.
실시예 28 SPF 닭에서 D15 때 고전적 IBDV 단리물로의 챌린지에 대항하는, 이중 HVT-ND+IBD (vHVT302, vHVT303 및 vHVT304) 재조합 백신의 효능
연구 목표는, SPF 닭 15 일령 때에 수행된 독성 전염성 점액낭병 바이러스 (vIBDV) 챌린지 (Faragher 52/70 균주) 에 대항하는 이중 HVT 재조합 vHVT302, vHVT303 및 vHVT304 재조합 구축물의 조기 IBD 효능을 평가하는 것이다.
이 연구에서 시험된 3 종의 이중 HVT-ND+IBD 재조합 백신 후보의 특징을 하기 표 44 에 기재한다.
이중 HVT 재조합체의 발현 카세트의 특징
명칭 부모 바이러스 프로모터 F 유전자 Poly-A 유전자좌
vHVT302 vHVT13 US10 Opt-VIId US10 US10
vHVT303 vHVT13 US10 Opt-V (CA02) US10 US10
vHVT304 vHVT13 SV40 Opt-VIId 합성 IG2
D0 때, 40 마리의 1일령 SPF 닭을, NDV F 유전자 발현 SB-1 벡터, vSB1-004 로 백신접종된 1 종의 대조군 (G1) 을 포함해 10 마리의 4 그룹으로 무작위 할당했다. 5 마리의 기타 SPF 새들은 점액낭/바디 중량 평가를 위해 백신접종하지 않고 챌린지시키지 않은 채 유지했다. 상기 새들에, 하기 표 45 에 기재된 바와 같이 2000 pfu 의 표적 용량을 함유하는 0.2 mL 의 재조합 백신으로 D0 때 목에 피하 주사로써 주입했다. D15 때, 혈액 샘플을, Kit ProFLOK®plus IBD (Synbiotics Corp) 로의 혈청학적 시험을 위해 그룹 당 모든 새들로부터 수집했다 (1 마리의 새가 혈액 샘플링 이전에 죽은 그룹 1 및 3 을 제외하고는 그룹 당 10 마리의 새). D15 때에, 모든 4 그룹으로부터의 새들은, 2.5 log10 EID50 을 갖는 점안액 (새 당 0.05 mL) 로써 챌린지 시켰다.
[표 45]
연구 설계 및 IBD 효능 결과
Figure pct00020
1 2 일 초과 동안 아프거나 또는 D25 때에도 여전히 아픈 새는 병든 새로 간주했음. 괄호 안의 숫자는 챌린지된 그룹에서 새의 전체 개수임.
2 임상적 징후 및 심각한 점액낭 병변의 보호 (점액낭 점수 <3)
4 비백신접종된/비챌린지된 그룹의 점액낭/바디 중량비는 0.0043 이었음.
각 그룹을 챌린지 전후에 모니터링했다. IBD 임상적 징후는 챌린지 후 11 일 동안 기록했다 (D15 에서 D25). 챌린지 후 관찰 기간의 말미에 (D25), 살아 남은 모든 새들은 안락사시켜 부검했다. 체중 및 점액낭 중량을 기록했다. 각 파브리키우스 점액낭 (BF) 를 칭량한 다음, 조직학 연구를 위해 4% 포름알데히드를 포함하는 개별 수용체에 보관했다. 점액낭의 조직학적 병변은 표 46 에 제시된 규모에 따라 스코어링했다.
[표 46]
파브리키우스의 점액낭의 조직학적 병변의 스코어링 규모*
Figure pct00021
* 출처: EU Pharmacopoeia "Avian Infectious Bursal Disease vaccine (live)" 의 Monograph No. 01/2008:0587
새가 죽고/죽거나 주목할만한 질병 징후 및/또는 심각한 병변의 파브리키우스 점액낭을 보이는 경우 발병된 것으로 간주했다 (즉, 조직학적 점수 ≥ 3).
챌린지 전 log10 으로 표시된 평균 ELISA IBD+ 항체 역가를 표 45 에 나타낸다. 유의한 역가가 대조군 G1 의 것보다 상당히 더 높은 백신접종된 모든 그룹에서 검출되었다. 혈청학 역가는 G3 (vHVT303) 에서 약간 높았다.
심각한 임상적 징후가 대조군 G1 의 모든 9 마리 새에서 챌린지 후에 관찰되었고, 1 마리 새는 사망에 이르렀다. G2 (vHVT302) 내 단지 1 마리의 백신접종된 새만이 챌린지 후 임상적 징후를 보였다. 심각한 점액낭 병변에 대항하는 보호% 는 상기 표 45 에 나타낸다. 유의한 IBD 보호를 모든 백신접종된 군에서 관찰하였고, 완전한 보호가 G3 (vHVT303) 에서 관찰되었다. 평균 점액낭/바디 중량비는 또한 표 45 에 나타낸다. 모든 백신접종된 그룹에서의 상기 비율은, 챌린지된 대조군 G1 의 것보다 더 컸고, 백신접종되지 않고 비(非)챌린지된 대조군과 유의하게 상이하지 않았다.
결론적으로, 이들 데이타는 상기 연구에서 시험된 3 종의 이중 HVT-IBD+ND 가 심각한 IBDV 챌린지 모델에서 IBD 항체 및 조기 IBD 보호를 유도함을 나타낸다.
실시예 29 14일령의 SPF 닭에서 강독형 NDV ZJ1 (유전형 VIId) 단리물로의 챌린지에 대항하는 5 종의 상이한 HVT-ND 백신 후보의 효능
본 연구의 목표는 14 일령의 SPF 닭에서 수행된 강독형 NDV ZJ1 (유전형 VIId) 단리물로의 뉴캐슬 질환 채린지에 대항하는, NDV F 유전자를 발현하는 5 종의 단일의 HVT 재조합 구축물 (vHVT39, vHVT110, vHVT111, vHVT112 및 vHVT113) 의 효능을 평가하는 것이다.
이들 5 종의 백신 후보의 특징을 하기 표 47 에 기재한다.
챌린지 연구에 사용된 HVT-ND 재조합 바이러스의 특징
명칭 부모 바이러스 프로모터 F 유전자* Poly-A 유전자좌
vHVT039 HVT MDV gB Wtnm-Texas SV40 IG1
vHVT110 HVT MCMV IE Wt-VIId SV40 IG1
vHVT111 HVT SV40 Wt-VIId SV40 IG1
vHVT112 HVT MCMV IE Wt-YZCQ SV40 IG1
vHVT113 HVT MCMV IE Wt-Texas SV40 IG1
*Wt 는 야생형 강독형 F 유전자 서열을 사용했으나, 절단 부위가 약독형 바이러스의 것으로 개질되었음을 의미한다. Wtnm 은, 야생형 서열의 절단 부위가 개질되지 않았음을 의미한다. Texas 강독형 균주는 유전형 IV 에, YZCQ 는 유전형 VIId 에 속한다.
D0 때에, 72 마리의 1일령 SPF 닭을 12 마리 (백신접종) 새의 5 그룹 및 12 마리 (백신접종하지 않은 대조군) 새의 1 그룹으로 무작위 할당했다. 새들에, 하기 표 48 에 기재된 바와 같이 6000 pfu 의 표적 용량을 함유하는 재조합 백신 0.2 mL 를 D0 때 목에 피하 주사로써 주입했다. 새들을, 5 log10 EID50 의 NDV ZJ1/2000 (유전형 VIId) 강독형 균주로 D14 때 근육 내 경로로써 챌린지하였다.
[표 48]
ND 효능의 결과
Figure pct00022

각 그룹을 챌린지 전후에 모니터링했다. NDV 임상적 징후 및 사망률을 챌린지 후에 기록했다. Wise et al. (2004; Development of a Real-Time Reverse-Transcription PCR for Detection of Newcastle Disease Virus RNA in Clinical Samples. J Clin Microbiol 42, 329-338) 에 의해 기재된 방법을 이용해 실시간 RT-PCR 로써 바이러스량을 평가하기 위해, 2 및 4 일 감염후 (dpi) 구강인두 면봉 채취를 행했다.
사망 및 이병에 대항하는 보호% 를 상기 표 48 에 기록한다. 완전한 감수성이 비백신접종되고 챌린지된 대조군 G1 에서 관찰되어, 챌린지의 고 심각도가 입증되었다. 백신은 사망에 대항하는 가변적인 보호 수준 (25~ 100%) 또는 이병에 대항하는 가변적인 보호 수준 (8~ 83%) 을 유도했다. 최고의 보호 수준은, vHVT110 에 의해 유도되는 반면, 가장 낮은 수준은 vHVT039 에 의해 유도되었고, 기타 후보들은 중간 결과를 제공했다. 2 및 4 dpi 때에 구강인두 셰딩 결과를 상기 표 48 에 나타내고, 이는 임상적 보호의 것과 비슷했다. 이들 백신 후보는 그들의 프로모터 및 F 유전자 서열 면에서 상이하다. 이러한 결과는, 이들 양자 모두의 파라미터가 최적의 HVT-ND 백신 후보의 설계에 중요하다는 점을 나타낸다.
결론적으로, 상기 연구의 결과는, HVT-벡터화 ND 백신 후보에 의해 유도된 ND 효능에서 프로모터 및 F 유전자 서열의 중요성을 나타냈다.
실시예 30 IBDV VP2 및 NDV F 를 발현하는 이중 SB1 구축물에 의해 유도된 뉴캐슬 질환 효능의 평가
상기 연구의 목표는, 뉴캐슬 질환 챌린지에 대항하는, IBDV VBP2 및 NDV F 를 발현하는 이중 SB1 구축물의 효능을 평가하는 것이다.
D0 때에, 1일령의 SPF 닭을, 백신접종된 그룹과 백신접종하지 않은 그룹을 포함해 10-20 마리 새의 여러 그룹으로 무작위 할당한다. 백신접종된 그룹의 새들에는 1000 내지 5000 pfu 의 표적 용량을 함유하는 0.2 mL 재조합 백신을 DO 때 목에 피하 주사로써 주입한다. 대안적으로, 0.05 mL 중 동일 용량을, 부화 전 2 또는 3 일 전에 난 내 투여할 수 있다. 새 (적어도 하나의 백신접종된 그룹 및 하나의 백신접종되지 않은 그룹) 를, 백신접종 후 상이한 시간에서 근육내 경로로써 챌린지한다: 예를 들어, D14, D28 또는 D42 때, 약 4.0 log10 EID50 (0.1 mL) 의 강독형 NDV 균주, 예컨대 Texas GB (유전형 II), ZJ1 (유전형 VIId), Chimalhuacan (유전형 V) 균주로.
각 그룹을, 챌린지 전후에 임상적으로 모니터링한다. NDV 임상적 징후 (이병률) 및 사망률을 챌린지 후 기록한다. 모든 그룹에서 임상적 보호% 를 산출한다. 적어도 90% 의 백신접종되지 않은 챌린지된 SPF 새들은 죽거나 또는 챌린지 후 심각하게 병을 앓아 챌린지의 심각도를 입증하였다. 구강인두 및 배설강 면봉은 챌린지 후 3, 5, 7 및 9 일 후와 같은 챌린지 후 상이한 시간 때에서의 샘플일 수 있고, 바이러스량은 실시간 RT-PCR 로써 추정될 수 있다. 최고의 후보는 가장 높은 수준의 임상적 보호 및 면봉에서 가장 낮은 수준의 바이러스량을 유도하는 것일 것이다. 유사한 연구를 NDV 모체 항체를 포함하는 육용계에서 수행할 수 있다; 그러나, 이들 모체 항체는 챌린지를 조기에 수행하는 경우 백신접종되지 않은 새를 잠재적으로 보호할 것이다. 이중 SB1 구축물이 또한 기타 마렉병 백신 또는 벡터 백신과 조합되어 시험될 수 있다.
실시예 31 IBDV VP2 및 NDV F 를 발현하는 이중 SB1 구축물에 의해 유도된 전염성 점액낭병 효능의 평가
이 연구의 목표는, IBDV VP2 및 NDV F 양자 모두를 발현하는 이중 SB1 의 IBD 효능을 평가하는 것이다.
1일령의 SPF 닭을, 백신접종된 그룹과 백신접종되지 않은 대조군을 포함해 10 내지 20 마리 새의 여러 그룹으로 무작위 할당한다. 백신접종되지 않은 대조군은 챌린지된 새 및 챌린지되지 않은 새를 포함하는 2 종의 하위그룹으로 분리될 것이다. 백신접종된 그룹의 새를, 각각 1000 내지 5000 pfu 의 표적 용량을 포함하는 0.2 mL 의 백신으로 D0 때 목에 피하 주사로써 주입한다. 대안적으로, 0.05 mL 중 동일 용량을 부화 전 2 또는 3 일 전에 난 내 투여할 수 있다. 백신접종 후 상이한 시간에, 예컨대 백신접종 후 14, 21, 28 또는 42 일에, 백신접종된 그룹 및 챌린지된 대조군으로부터의 모든 새들을, 독성 IBDV (예컨대, Faragher 또는 US 표준 균주), 고 독성 IBDV, 예컨대 91-168 단리물 또는 변이체 IBDV 단리물, 예컨대 US Delaware 변이체 E 단리물의 점안액 (새 당 2 내지 4 log10 EID50 포함 0.03 mL) 으로써 챌린지한다. 각각의 그룹을 챌린지 전후에 임상적으로 모니터링한다. 새들을 챌린지 후 4 또는 5 일 후에 총체적인 점액낭 병변 평가를 위해 부검할 수 있다. 이들을 또한 챌린지 후 10 내지 11 일 후에 부검할 수도 있다. 전체 및/또는 조직학적 병변을 평가할 수 있다. 나아가, 새 및 점액낭을 칭량하여, 점액낭/바디 중량비 (점액낭 중량/체중 비 x 100) 를 백신접종하지 않은 비챌린지된 그룹의 것과 비교해 산출한다. 대조군 SPF 챌린지된 새들은 임상적 징후를 보이고, 유의한 전체 및/또는 조직학적 병변을 가지며, 및/또는 백신접종되지 않은 비챌린지된 새보다 유의하게 낮은 점액낭/바디 중량비를 가지므로, 이로써 챌린지의 심각도를 입증했다. 백신의 효능은, 비백신접종/챌린지된 그룹 및 비백신접종/비챌린지된 그룹으로 이들 파라미터를 비교함으로써 평가된다. 상기 연구는 IBDV 모체 항체를 포함하는 육용계에서 수행될 수 있다; 그러나, 이들 모체 항체는 챌린지를 조기에 수행하는 경우, 비백신접종된 새를 잠재적으로 보호할 수 있다. 이중 SB1 구축물도 또한 기타 마렉병 백신 또는 벡터 백신과 조합되어 시험될 수 있다.
실시예 32 IBDV VP2 및 NDV F 를 발현하는 이중 SB1 구축물에 의해 유도된 마렉병 효능의 평가
당해 연구의 목표는 IBDV VP2 및 NDVF 양자 모두를 발현하는 SB1 벡터에 의해 유도된 마렉병 효능을 평가하는 것이다.
1일령 SPF 닭을, 백신접종 및 백신접종되지 않은 대조군을 포함해, 20 내지 50 마리 새의 몇몇의 그룹으로 무작위 할당한다. 비백신접종된 대조군은 챌린지 및 비챌린지된 새를 포함하는 2 종의 하위그룹으로 분리될 수 있다. 백신접종된 그룹의 새에, 각각 1000 내지 5000 pfu 의 표적 용량을 포함하는 0.2 mL 의 백신으로 D0 때 목에 피하 주사로써 주입한다. 대안적으로, 0.05 mL 중 동일 용량을 부화 전 2 또는 3 일 전에 난 내 투여될 수 있다. 3 내지 10 일 후의 백신접종 후와 같은 백신접종 후 상이한 시간에, 백신접종된 그룹 및 챌린지된 대조군의 모든 새들을 복강 내 경로를 통해 0.2 mL 의 마렉병 바이러스 (MDV) 균주로 챌린지한다. MDV 균주는 JM 또는 GA22 단리물, 고 독성 MDV (vvMDV), 예컨대 RB-1B 또는 Md5 단리물, 고 독성 플러스 (vv+MDV), 예컨대 T-King 또는 648A 단리물을 비롯한 독성 MDV (vMDV) 와 같은 몇몇의 병원형의 것일 수 있다. 닭을 감염시키고, 이의 혈액 세포를 수집하고 DMSO 와 같은 냉동 보존제의 존재 하에 액체 질소에 동결함으로써 MDV 챌린지 균주 접종원을 제조한다. 닭 감염 용량 50 (CID50) 를 백신접종/챌린지 연구를 수행하기 전에 각 챌린지 뱃치 (batch) 에 대해서 수립했다. 각 그룹을 챌린지 전후에 임상적으로 모니터링한다. 새들을 백신접종 후 적어도 7 주 후에 부검하고, 마렉병 총 병변의 존재를 각 새에서 체크했다. 병변은 이에 제한되는 것은 아니나 하기를 포함할 수 있다: 간, 심장, 비장, 생식샘, 신장, 신경 및 근육 병변. 상기 연구는 MDV 모체 항체를 포함하는 육용계에서 수행될 수 있다. 이중 SB1 구축물이 또한 기타 마렉병 백신 (예를 들어, HVT 및/또는 CVI988 Rispens 균주) 또는 MD 벡터 백신과 조합되어 시험될 수도 있다. MD 챌린지가 또한, 백신접종된 새와 MDV 감염된 비백신접종된 SPF 닭 사이의 접촉에 의해 수행될 수도 있다.
***
본 발명의 바람직한 구현예에서 이와 같이 상세히 기술했지만, 상기 실시예에 의해 규정되는 본 발명은, 본 발명의 취지 또는 범주에서 이탈하지 않으면서 그의 많은 명백한 변형이 가능하기 때문에 상기 기술에서 제시된 특정 세부사항에 제한되지 않음을 이해해야 한다.
본원에서 언급되거나 참조된 모든 문헌 ("본원에서 언급된 문헌"), 및 본원에서 언급된 문헌에서 언급되거나 참조된 모든 문헌은, 본원에서 또는 본원에서 참조에 의해 포함된 임의의 문헌에서 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조사의 지침, 설명, 제품 사양, 및 제품 설명서와 함께, 이로써 본원에 참조로 포함되며, 본 발명의 실시에 이용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Merial Limited Bublot, Michel Mebatsion, Teshome Pritchard, Nikki Linz, Perry <120> RECOMBINANT GALLID HERPESVIRUS 3 (MDV SEROTYPE 2) VECTORS EXPRESSING ANTIGENS OF AVIAN PATHOGENS AND USES THEREOF <130> MER 11-178 <150> 61/564,877 <151> 2011-11-30 <150> 61/694,957 <151> 2012-08-30 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1665 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> NDV-F codon-optimized gene from modified wt VIId <400> 1 atgggcagca agcccagcac aagaatccca gcccccctga tgctgatcac ccgcatcatg 60 ctgatcctgg gctgcatcag acccacaagc tccctggatg gacgccccct ggccgctgcc 120 ggcatcgtgg tgaccggcga caaggccgtg aacgtgtaca ccagcagcca gaccggcagc 180 atcatcgtga agctgctgcc caacatgccc agagacaaag aggcctgcgc caaggccccc 240 ctggaagcct acaacagaac cctgaccacc ctgctgaccc ccctgggcga cagcatcaga 300 aagatccagg gctccgtgag cacaagcggc ggaggaaagc agggcagact gatcggcgcc 360 gtgatcggca gcgtggccct gggagtggct acagctgccc agattaccgc tgcagccgcc 420 ctgatccagg ccaaccagaa cgccgccaac atcctgagac tgaaagagag cattgccgcc 480 accaacgagg ccgtgcacga agtgaccgac ggcctgagcc agctgtccgt ggccgtgggc 540 aagatgcagc agttcgtgaa cgaccagttc aacaacaccg ccagagagct ggactgcatc 600 aagatcaccc agcaggtggg cgtggagctg aacctgtacc tgaccgagct gaccacagtg 660 ttcggccccc agatcacaag cccagccctg acacagctga ccatccaggc cctgtacaac 720 ctggctggcg gcaacatgga ctatctgctg acaaagctgg gaatcggcaa caaccagctg 780 tccagcctga tcggaagcgg cctgatcacc ggctacccca tcctgtacga cagccagaca 840 cagctgctgg gcatccaggt gaacctgccc agcgtgggca acctgaacaa catgcgcgcc 900 acctacctgg aaaccctgag cgtgtccacc accaagggct acgccagcgc cctggtgccc 960 aaggtggtga cacaggtggg cagcgtgatc gaggaactgg acaccagcta ctgcatcgag 1020 agcgacctgg acctgtactg caccagaatc gtgaccttcc caatgagccc cggcatctac 1080 agctgcctga gcggcaacac cagcgcctgc atgtacagca agaccgaagg cgcactgaca 1140 acaccctaca tggccctgaa gggaagcgtg atcgccaact gcaagatcac cacctgcaga 1200 tgcaccgacc ccccaggcat catcagccag aactacggcg aggccgtgag cctgatcgat 1260 cgccattcct gtaacgtgct gtccctggac ggcatcacac tgagactgag cggcgagttc 1320 gatgccacct accagaagaa catcagcatc ctggacagcc aggtgatcgt gaccggcaac 1380 ctggacatca gcaccgagct gggcaacgtg aataacagca tcagcaacgc cctggacaga 1440 ctggccgaga gcaacagcaa gctggaaaaa gtgaacgtgc gcctgacatc cacttccgct 1500 ctgatcacct acatcgtgct gaccgtgatc agcctggtgt tcggcgccct gagcctggtg 1560 ctggcctgct acctgatgta caagcagaag gcccagcaga aaaccctgct gtggctgggc 1620 aacaacaccc tggaccagat gagagccacc accagagcct gatga 1665 <210> 2 <211> 553 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NDV-F protein of modified wt VIId of codon-optimized gene <400> 2 Met Gly Ser Lys Pro Ser Thr Arg Ile Pro Ala Pro Leu Met Leu Ile 1 5 10 15 Thr Arg Ile Met Leu Ile Leu Gly Cys Ile Arg Pro Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys 35 40 45 Ala Val Asn Val Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys 50 55 60 Leu Leu Pro Asn Met Pro Arg Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro 65 70 75 80 Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly 85 90 95 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aacaggttgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660 ttcgggccac agatcacctc ccctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720 ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtatagggaa caatcaactc 780 agctcgttaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta tactgtatga ctcacagact 840 caactcttgg gcatacaagt gaatttaccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900 acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960 aaagtagtga cacaagtcgg ttccgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020 tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080 tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140 acgccgtata tggcccttaa aggctcagtt attgccaatt gtaaaataac aacatgtaga 1200 tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattatggag aagctgtatc cctgatagat 1260 agacattcgt gcaatgtctt atcattagac gggataactc taaggctcag tggggaattt 1320 gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ctagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380 cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggatagg 1440 ttggcagaaa gcaacagcaa 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acggattatc acaactatca gtggcagttg ggaagatgca gcagtttgtc aatgaccagt 600 ttaataatac ggcgcgagaa ttggactgta taaaaatcac acaacaggtt ggtgtagaac 660 tcaacctata cctaactgaa ttgactacag tattcgggcc acagatcacc tcccctgcat 720 taactcagct gaccatccag gcactttata atttagctgg tggcaatatg gattacttat 780 taactaagtt aggtataggg aacaatcaac tcagctcgtt aattggtagc ggcctgatca 840 ctggttaccc tatactgtat gactcacaga ctcaactctt gggcatacaa gtgaatttac 900 cctcagtcgg gaacttaaat aatatgcgtg ccacctattt ggagacctta tctgtaagta 960 caaccaaagg atatgcctca gcacttgtcc cgaaagtagt gacacaagtc ggttccgtga 1020 tagaagagct tgacacctca tactgtatag agtccgatct ggatttatat tgtactagaa 1080 tagtgacatt ccccatgtcc ccaggtattt attcctgttt gagcggcaac acatcagctt 1140 gcatgtattc aaagactgaa ggcgcactca ctacgccgta tatggccctt aaaggctcag 1200 ttattgccaa ttgtaggata acaacatgta gatgtacaga ccctcctggt atcatatcgc 1260 aaaattatgg agaagctgta tccctgatag atagacattc gtgcaatgtc ttatcattag 1320 acgggataac tctaaggctc agtggggaat ttgatgcaac ttatcaaaag aacatctcaa 1380 tactagattc tcaagtcatc gtgacaggca atcttgatat atcaactgaa cttggaaacg 1440 tcaacaattc aatcagcaat gccttggata ggttggcaga aagcaacagc aagctagaaa 1500 aagtcaatgt cagactaacc agcacatctg ctctcattac ctatattgtt ctaactgtca 1560 tttctctagt tttcggtgca cttagtctgg gtttagcgtg ttacctgatg tacaaacaga 1620 aggcacaaca aaagaccttg ctatggcttg ggaataatac cctcgatcag atgagagcca 1680 ctacaagagc atgaa 1695 <210> 5 <211> 553 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NDV-F protein with GenBank accession No. AAP97877.1 <400> 5 Met Gly Ser Lys Pro Ser Thr Arg Ile Pro Ala Pro Leu Met Leu Ile 1 5 10 15 Thr Arg Ile Met Leu Ile Leu Gly Cys Ile Arg Pro Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys 35 40 45 Ala Val Asn Val Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys 50 55 60 Leu Leu Pro Asn Met Pro Arg Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro 65 70 75 80 Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly 85 90 95 Asp Ser Ile Arg Lys Ile Gln Gly Ser Val Ser Thr Ser Gly Gly Arg 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cgtcgaactc aatttgtatc taactgaatt gaccacagtg 660 ttcgggccac aaatcacctc ccctgcttta actcagctga ctatccaggc actttataat 720 ttagccggtg gcaatatgga ttacctgttg actaagttgg gtgtagggaa taatcaactc 780 agttcgttaa ttggtagtgg cttgataact ggcaacccta tactatatga ctcacagacc 840 caactcttag gcatacagat aaatttaccc tcagtcggga gcctaaataa tatgcgtgcc 900 acctacttgg agaccttatc cgtaagcacg accaaagggt tcgcctcagc acttgtcccg 960 aaagttgtga cgcaagtcgg ctctgtgata gaagaacttg acacctcata ttgtatagaa 1020 tccgatatag atctatattg tacaagggta gtgacattcc ccatgtctcc tggtatttac 1080 tcctgtctga gcggcaatac gtcagcttgt atgtattcaa agaccgaagg tgcactcact 1140 acaccataca tggccctcaa aggctcagtt attgccaatt gcaagatgac tacatgcaga 1200 tgcgcagatc ccccaggtat catatcacag aattatgggg aagctgtgtc tctaatagat 1260 aaacattcat gcagtgtctt gtccctagac gggataactc tgaggctcag tggggaattt 1320 gatgcgacct atcaaaagaa catctcaata ctagattctc aagtcatcgt gacaggaaat 1380 ctcgatatat caactgagct tgggaatgtt aacaactcga taagcagtac cctggacaaa 1440 ttagcagaaa gcaacaacaa gctaaacaag gtcaatgtaa acctaaccag cacatctgct 1500 ctcatcactt atattgtctt agctatcgta tctcttgctt tcggcgtaat tagcctggtt 1560 ctagcatgct acctgatgta taaacaaaga gcacaacaaa agaccttact atggctcggg 1620 aacaacaccc ttgatcagat gagagccacc acaagaacct ga 1662 <210> 7 <211> 553 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NDV-F protein wildtype V (CA02 strain) with GenBank accession No. ABS84266 <400> 7 Met Gly Ser Lys Pro Ser Thr Trp Ile Ser Val Thr Leu Met Leu Ile 1 5 10 15 Thr Arg Thr Met Leu Ile Leu Ser Cys Ile Cys Pro Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys 35 40 45 Ala Val Asn Ile Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Ile Lys 50 55 60 Leu Leu Pro Asn Met Pro Lys Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro 65 70 75 80 Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly 85 90 95 Asp Ser Ile Arg Arg Ile Gln Gly Ser Ala Thr Thr Ser Gly Gly Arg 100 105 110 Arg Gln Lys Arg Phe Val Gly Ala Ile Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly 115 120 125 Val Ala Thr Ala Ala Gln 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ctggctggcg gcaacatgga ctatctgctg actaagctgg gagtgggcaa caaccagctg 780 tccagcctga tcgggtccgg gctgatcaca ggcaacccca tcctgtacga cagccagaca 840 cagctgctgg gcatccagat caacctgcca tccgtgggaa gcctgaacaa catgagagcc 900 acctacctgg aaaccctgag cgtgtccacc accaagggct tcgccagcgc cctggtgccc 960 aaggtggtga cacaggtggg cagcgtgatc gaggaactgg acaccagcta ctgcatcgag 1020 agcgacatcg acctgtactg caccagagtg gtgaccttcc caatgagccc cggcatctac 1080 agctgcctga gcggcaacac cagcgcctgc atgtacagca agaccgaagg agcactgaca 1140 acaccctaca tggccctgaa gggaagcgtg atcgccaact gcaagatgac cacctgcaga 1200 tgcgccgacc ccccaggcat catcagccag aactacggcg aggccgtgag cctgatcgac 1260 aaacattcct gtagcgtgct gtccctggat ggcatcacac tgagactgag cggcgagttc 1320 gacgccacct accagaagaa catcagcatc ctggacagcc aggtgatcgt gaccggcaac 1380 ctggacatca gcaccgagct gggcaacgtg aacaacagca tcagcagcac cctggacaag 1440 ctggccgagt ccaacaacaa gctgaacaaa gtgaacgtga acctgaccag cacaagcgcc 1500 ctgatcacct acatcgtgct ggccatcgtg tccctggcct tcggcgtgat cagcctggtg 1560 ctggcctgct acctgatgta caagcagaga gcccagcaga aaaccctgct gtggctgggc 1620 aataacaccc tggaccagat gagggccacc accagaacct gatga 1665 <210> 9 <211> 553 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NDV-F protein of codon-optimized NDV-F gene of modified wildtype V (CA02 strain) <400> 9 Met Gly Ser Lys Pro Ser Thr Trp Ile Ser Val Thr Leu Met Leu Ile 1 5 10 15 Thr Arg Thr Met Leu Ile Leu Ser Cys Ile Cys Pro Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys 35 40 45 Ala Val Asn Ile Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Ile Lys 50 55 60 Leu Leu Pro Asn Met Pro Lys Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro 65 70 75 80 Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly 85 90 95 Asp Ser Ile Arg Arg Ile Gln Gly Ser Ala Thr Thr Ser Gly Gly Gly 100 105 110 Lys Gln Gly Arg Leu Val Gly Ala Ile Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly 115 120 125 Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala 130 135 140 Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala 145 150 155 160 Thr Asn Asp Ala Val His Glu Val Thr Asn Gly Leu Ser Gln Leu Ala 165 170 175 Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asn Gln Phe Asn Asn 180 185 190 Thr Ala Arg Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Ala Gln Gln Val Gly Val 195 200 205 Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln 210 215 220 Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn 225 230 235 240 Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Val Gly 245 250 255 Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Asn 260 265 270 Pro Ile Leu Tyr Asp Ser Gln Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Ile Asn 275 280 285 Leu Pro Ser Val Gly Ser Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu 290 295 300 Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Phe Ala Ser Ala Leu Val Pro 305 310 315 320 Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser 325 330 335 Tyr Cys Ile Glu Ser Asp Ile Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Val Val Thr 340 345 350 Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr 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cctaacccta acggcctaac cctaacccta 120 accctaaccc taaccctaac cctaacccta accctaaccc taaccctaac cctaacccta 180 accctaaccc taaccaactt aatatccccc cctgcatttc accccccccc caaaaaagga 240 acatagcaca acaattaacg cggctgggcc gcagcctccc gccgccacag gtgcactcag 300 cccgcgggct gccgcacccc gcgaactgtc ggctacaggc agaatgaacg cgcagcattg 360 cgcggacaca gtgggtgacc gaagcacacc accacagact ctgaccctgc catagccccg 420 accgtgaaat gaggcccggc gaggcctaac agtcaccccg accgtgatac atgacaccaa 480 cgctgcccgt tacattaaaa ggtcctagcc ctacatgccg taaccgccaa agccgctacc 540 cttaatatgt cctgaccccg actatggact attaccctaa ccctgaaagg ccataacagt 600 gaccctaaca gtcctgacgc cgaccccgag aggccctaac cgccaccgta aacggccctg 660 gcccaagccc ttaatgtggc cctaacaggc actaaaacga ataagacagg ccctaacccc 720 gaccgtgatg acaggccgaa cccccgaccc taacagaccc tatcgcgggg tccaataatc 780 cgctttccca ccccgtcctt caacggaaga gtgcgtgctt cagacccgcg gacccgggca 840 acttgtaccc ggccccgagc gtctctgtgc aacgcactac attgaaagta aacaacaggt 900 aggcggtgtc gactcaggtc tgtgcgaacg ccaaccgctt 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cgcctaactt tggaccccaa 2640 ccctaacctt aacggcatat ccctgtccat gaccctgaca cccgaccctg gcactaaccc 2700 ttaccccgag cccctgcccc taagggccca accatcaccc taaaggcccg accctgcccc 2760 taaagaccta agcatgacct taaaggccta accctgacca tgaccctaag ggcccgaccc 2820 taaccctaac ctagtaccct ccttccacac cccccccccg aaaaccgagc atagcccaac 2880 aatgaactcg gccggtttaa agatttattt cgatgcgatg cgcggtcacg cccaccacaa 2940 aaatagaccc tgcaatattg atgccggaac cagcccatcg cagagcgggc gaccgctaca 3000 cgggacgcgt attcgtcggg accgcctttc tccggcaggt agcctacacg tacctcacta 3060 tggccataaa gatgcagcca tagagaggta cgtgaagaag acccgtcgga atcagaagca 3120 acatttcagg acgtacgact cgagccggac atgataccag acaccggagt ccacagcgac 3180 cgcgatttcc tctgcgccta ccctcggccg acgaacaacg ccgagggtag gcgtcgagaa 3240 aatcgcgacc gagggtgcgc cctcgttcca cgcgatcccg cagaacgctt cgcgcccagt 3300 ctccgtccat cgacgtggtg cttgatgaca ggatccacct ctaacaccac gcgatgcgct 3360 ccgcagcgcc ttcgtcccgg agtagagcgc catctccttc ctccagcacg gtgctcgacg 3420 cggcaataca aaagtctcac gcctcgaaca ccggacgaag 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ccagcatatc gccgtaagat 4320 ttacagacat tcctccctcc ccacccaacc gaacactgca cagcggcagc ctaaaagtcg 4380 ctctgcggtc gcatatcccc cccacccccc ttcgatggtc cggtgtacgg agacctctca 4440 cacaacacag gacaccgtac cacggaccat ccgaacggcg ggcgaacagt cacgcaggac 4500 gtggacacga gtcctgcgct cgcacaggca gctgggcggc ggtgctgtct tcctccgacg 4560 gacagcctac aagcaagcca ctaggactac cgatacgacc agagtgacgt gcgtgtaaga 4620 cggcccagga cgaagtcccg cgccccgccg aaaataacag caccgacctg aaagagacca 4680 cgtcttaccc aacagccgac ccccgaacga tgcacgctcc caagagtcgg ccgtaggaga 4740 gcacgcgccc ccccatactc ggcgcgcgta cccgcggcca tccctgcagc gcggcccggc 4800 ctcgttgcga ttcagtgaac gtaccgcgcg ccatctccgt ccatcggcgt ggtgctcgat 4860 cccgtcattc ggtgatctca agcaccccgc gaaggaggaa gcggagcgtg taacgatttc 4920 cgcggcgcgc gacgacgccg cgccgtcccg tccgacgttt ggaacgccgc ctcggtcctt 4980 gcgcgcagta cttgagacga tacgtgttaa aatctcaggc accacgctaa ggacggagca 5040 gagctcggtt cgcttcgctc gcgcgccgac gcatctctgc ttcgcagaac ctgttttgaa 5100 aagaccgcag cgaccaccgc gtgctaccct cggagggggg catgaggacg gcgcccgata 5160 ctcccgtgca caccgccgag gggggacacg gcgcgcgcgc cgatgctcag ccggttcttc 5220 gcccagagcc ctcccaacct tgtcccacac gacggggagc ggcacgggga atcaattcgt 5280 ctttctctcc gcaggcattg cacaacggca atgacacgtg caatgccagc ctgagagaaa 5340 acatacgaac agtcccgagt tccgagtagt aactctcgct ttcgcgccct tccccgactc 5400 gttccgagca tatcaggcga tacgaggcat ttcgcgcgcg tcgccctgtc cgtcccggtt 5460 gtcctagaac gtgacacctc taggggaccc gggaaggact ggacgacgcg ccgtcgtgcg 5520 gtccgaccgc aatacggcgt cgttacccct tcctcacaac acctgatctc gtggcctaaa 5580 tacccgctca tcgccccgca tccgacgcct ctacctcccc tttgtcccca accgagaaac 5640 ctatccgggg cccgctaagg tcgaaccgcc gagactccgt cgtccggcta ttacccgcca 5700 taacaagtcg ctagtcgaag gatggaatcg cagcggtccg agcggctctc ctctgatatc 5760 ccggcacggc ctattgggat taaggtccgg gcctattcag attacggtta gagtcctcga 5820 gaaacatttc agtctctctg gcatctgaca acggctacgc gccactcaga tgccaaaaca 5880 gactggatgc gtttccaaag gccatcgtgt ctaacaaagg ccagtccctg taactaggcc 5940 aaacatctca tcaccgtcca agtcacaggt acttcaggtt tacggtcgtc tgctatctac 6000 aacgaagaat tcagagccga tctcgccagg gccccttctc ccccctccct tcttcccccc 6060 tcccttctcc ccccctccct tctcccccct cccttcttcc cccctccctt cttcccccct 6120 cccttcttcc cccctccctt cttcccccct cccttcttcc cccctccctt cttcccccct 6180 cccttcttcc cccctccctt cttcccccct cccttcttcc tcccttcccc ccccctcccc 6240 tcttcctccc ttccccctcc cttccccccc tcccttcccc ccctcccttc cccccctccc 6300 ttccccccct cccttccccc cctcccttcc ccccttcccc cttcccctct tctccccccc 6360 ccctccccac tccctccctt cttccccctt ctcccacctc cgttcagcct tccccctccc 6420 ccctcccttc tcccccctcc gttcagcctt ccccctcccc cctcccttct cccccctccg 6480 ttcagacttc ctcctcccca atcgcccccc ttcgcaactt gcgaaatcta gtctaacacg 6540 ggtttactta cgcggtttac attcacacag cgggtgcatg ttttccgctg acatttccca 6600 agccggccac aagaaacgaa gcaaaaaaaa aaaagatagg ggtattaatg cgcgccaccc 6660 gtcgctacgc agcccgactc caaatttcga ataatgccct tctaggcatt ggaccgccgc 6720 cccactcccc gcgcaatatc taggcttaat cgccaagatt gaccacgtat cccttatcgc 6780 gccggccgtt caggccctcc cccccccccc acgcctctcg 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tgcgtctgat cggggggggg gggggggcgc gactccaagc gttagaccgc cgaccgccgg 165480 cggctccgcg cggccagtag gccgagccgc acgctgcatc cccgccggac atgcccgccg 165540 gccgcgcggg cgctcgctag gccgcccgga aatgcgtagc ggacccgtgc gcgcatgcgc 165600 gcagtcgaca tttgcgagca tgcgcgcggc ggaccctagc gagcatgcgc gcggcggacc 165660 gtagggagca tgcgcgcggc ggaccgtagg gagcatgcgc gcggcggacc ctggccacca 165720 ccaaacgtca taccaaaact ctcgcggcgg cgaactgaat aaaaaaaatt caccctaacc 165780 ctaaccctaa aggcctaacc ctaaccctaa aggcctaacc ctaaccctaa cggcctaacc 165840 ctaaccctaa ccctaaccct aaccctaacc ctaaccctaa ccctaaccct aaccctaacc 165900 ctaaccctaa ccctaaccct aaccaactta atatcccccc ctgcatttca cccccccccc 165960 aaaaaaggaa catagcacaa caattaacgc ggct 165994 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> MB080 primer <400> 15 cgaacaaact tcatcgctat gc 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> MB081 primer <400> 16 taactcaaat gcgaagcgtt gc 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SB-1 US10 primer <400> 17 tcaacgtgcg acaatcgtct g 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SB-1 SORF4 primer <400> 18 atgtggagga acgatcctat a 21 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> ALLNDVFprimer <400> 19 atggcttggg aataatac 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> mCMVF primer <400> 20 aactccgccc gttttatg 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SV40tailR primer <400> 21 tcgactctag aggatccg 18 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> newSB-1 UL55R primer <400> 22 atggctatag agggactgtg t 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> New SB-1 ORF5F primer <400> 23 gatctcaacg ctataccggc g 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OptF primer <400> 24 actgacaaca ccctacatgg c 21 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> VIIoptF RP primer <400> 25 gccagcacca ggctcaggg 19 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SV40promoterF primer <400> 26 agcttggctg tggaatgt 18 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SB1 43.F primer <400> 27 gctctcggag acgcggctcg c 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SB1 45.R primer <400> 28 gctcttgtaa catcgcggac g 21 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SV40 promoter F primer <400> 29 agcttggctg tggaatgt 18 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> HVTUS10 FP primer <400> 30 ccggcaacat acataatgtg 20 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> HVTUS10 RP primer <400> 31 ggcactatcc acagtacg 18 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CaoptF RP primer <400> 32 gccagcacca ggctcatca 19 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SynTailR primer <400> 33 atgttctggc acctgcac 18 <210> 34 <211> 1437 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA sequence encoding glycoprotein C of SB-1 strain with GenBank accession No. HQ840738 <400> 34 atgcacgcgt cacgcgcgtt gcgagctttg gggtggacga gactcttatt tgtcgtttta 60 ttttcgggcc gcgtcctaag cgctagcatt aaccccgatc tagctacacc cccggtcatt 120 gctttcaacc cgtcaagtat tccggccgat gatgggcctt tggccaaagt tcctgcatcc 180 ccgccggcag gggagaaaga ggagagccac aagaatgcaa gcgacgcgcg taggatgcct 240 agtatagttt gcgataaaga agaagttttc gttttcctga acaagaccgg gcgtttcgtg 300 tgcactctta agatcgcccc tccctccgac aacgaatggt cgaactttgc tctggacctt 360 attttcaatc cgatcgaata ccatgctaat gagaagaacg tggaagcagc gcgtattgct 420 ggcctctatg gggtgcccgg atcagattac gcctacccgc gtccttctga attaatctct 480 tctattcggc gagaccccca agggaccttt tggacaagcc catcggcaca tggagacaag 540 tacttcatat ggctaaacaa aacgacgaat acgatgggcg tggaaattag gaacgtcgac 600 tacgcagaca acggttacat ccaagttgcc atgcgggatc ctttcaatcg gcctttacta 660 gataagcacg tgtacatccg cgtgtgtcaa cgacccgcct cggtcgacgt tctagccccc 720 cccgtcctca gtggcgataa gtacaaggct tcatgcatcg ttaggcattt ttatccaccg 780 ggctccgtct atgtgttctg gaggcaagat gggaatatcg ttacaccacg taaggacacg 840 gacggaagtt tttggtggtt tgaatcagcc cggggagcca ccctggtatc tacgataacg 900 ctgggcaact cggccatcga ccctcctccc aagatttcat gtctggtagc ctggaagcag 960 ggaaatatga tgagtactac gaacgccact gcaatcccga ccgtatatca tcatccccgg 1020 atatccctgg ctttcaaaga tgggtatgca atatgtacta cgcaatgtgt gccgttcgga 1080 attaccatac gatggttagt acacgatgaa cccaaaccta atacaactta tgatactgtg 1140 gttacaggtc tttgcaggac cctcaagcgg catagaaata tcatcagccg aatattactc 1200 caagatgact ggcagaaaac aaagtataca tgtcgtctca tcggctatcc tttcgacgaa 1260 gacaaatttc aagctttcga ttacttcgac gcgacgccat cgacgagggg gtcccccatg 1320 gttctcgcga tagcggctgt tgtgggacta gctttgattt tgggaatggg tacactcctg 1380 acggctctgt gtttctacgc ctccgggaaa aaatacatat tactttcgtc cgtctag 1437 <210> 35 <211> 478 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> glycoportein C of SB-1 strain with GenBank accession No. AEI00252 <400> 35 Met His Ala Ser Arg Ala Leu Arg Ala Leu Gly Trp Thr Arg Leu Leu 1 5 10 15 Phe Val Val Leu Phe Ser Gly Arg Val Leu Ser Ala Ser Ile Asn Pro 20 25 30 Asp Leu Ala Thr Pro Pro Val Ile Ala Phe Asn Pro Ser Ser Ile Pro 35 40 45 Ala Asp Asp Gly Pro Leu Ala Lys Val Pro Ala Ser Pro Pro Ala Gly 50 55 60 Glu Lys Glu Glu Ser His Lys Asn Ala Ser Asp Ala Arg Arg Met Pro 65 70 75 80 Ser Ile Val Cys Asp Lys Glu Glu Val Phe Val Phe Leu Asn Lys Thr 85 90 95 Gly Arg Phe Val Cys Thr Leu Lys Ile Ala Pro Pro Ser Asp Asn Glu 100 105 110 Trp Ser Asn Phe Ala Leu Asp Leu Ile Phe Asn Pro Ile Glu Tyr His 115 120 125 Ala Asn Glu Lys Asn Val Glu Ala Ala Arg Ile Ala Gly Leu Tyr Gly 130 135 140 Val Pro Gly Ser Asp Tyr Ala Tyr Pro Arg Pro Ser Glu Leu Ile Ser 145 150 155 160 Ser Ile Arg Arg Asp Pro Gln Gly Thr Phe Trp Thr Ser Pro Ser Ala 165 170 175 His Gly Asp Lys Tyr Phe Ile Trp Leu Asn Lys Thr Thr Asn Thr Met 180 185 190 Gly Val Glu Ile Arg Asn Val Asp Tyr Ala Asp Asn Gly Tyr Ile Gln 195 200 205 Val Ala Met Arg Asp Pro Phe Asn Arg Pro Leu Leu Asp Lys His Val 210 215 220 Tyr Ile Arg Val Cys Gln Arg Pro Ala Ser Val Asp Val Leu Ala Pro 225 230 235 240 Pro Val Leu Ser Gly Asp Lys Tyr Lys Ala Ser Cys Ile Val Arg His 245 250 255 Phe Tyr Pro Pro Gly Ser Val Tyr Val Phe Trp Arg Gln Asp Gly Asn 260 265 270 Ile Val Thr Pro Arg Lys Asp Thr Asp Gly Ser Phe Trp Trp Phe Glu 275 280 285 Ser Ala Arg Gly Ala Thr Leu Val Ser Thr Ile Thr Leu Gly Asn Ser 290 295 300 Ala Ile Asp Pro Pro Pro Lys Ile Ser Cys Leu Val Ala Trp Lys Gln 305 310 315 320 Gly Asn Met Met Ser Thr Thr Asn Ala Thr Ala Ile Pro Thr Val Tyr 325 330 335 His His Pro Arg Ile Ser Leu Ala Phe Lys Asp Gly Tyr Ala Ile Cys 340 345 350 Thr Thr Gln Cys Val Pro Phe Gly Ile Thr Ile Arg Trp Leu Val His 355 360 365 Asp Glu Pro Lys Pro Asn Thr Thr Tyr Asp Thr Val Val Thr Gly Leu 370 375 380 Cys Arg Thr Leu Lys Arg His Arg Asn Ile Ile Ser Arg Ile Leu Leu 385 390 395 400 Gln Asp Asp Trp Gln Lys Thr Lys Tyr Thr Cys Arg Leu Ile Gly Tyr 405 410 415 Pro Phe Asp Glu Asp Lys Phe Gln Ala Phe Asp Tyr Phe Asp Ala Thr 420 425 430 Pro Ser Thr Arg Gly Ser Pro Met Val Leu Ala Ile Ala Ala Val Val 435 440 445 Gly Leu Ala Leu Ile Leu Gly Met Gly Thr Leu Leu Thr Ala Leu Cys 450 455 460 Phe Tyr Ala Ser Gly Lys Lys Tyr Ile Leu Leu Ser Ser Val 465 470 475 <210> 36 <211> 4734 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> plasmid pSB1 44cds for gC deletion <400> 36 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420 tgcatctaga tgccaatgaa ttcgcgatag cttcgattag aattttcgca tgagtaaagt 480 cgacaagctt gctgttatgt cgggagcacg tatctagggc ttctagctcg gtagcgttgc 540 tccccatcgc gcgcatacaa ctatagccta aaccgatcca ttcgtgagga catgtaccgg 600 actccaggga catgtaagag aatgcaaaca gcgaagctag cacgaccgta gctgtgatga 660 cgaacacagt aagagcgatc ccgatcgtac aaccgcataa caaccggggg catcctgaac 720 gcgaacgttt gtgtcgctca gatgtggtct cgtccatcat ccggagcagc ccacgtactg 780 cgaccaagtc gcggtcgtct tcgggagtag gggacatcat acttacatat ttaaggaccg 840 agtagctata tagagaccgt atttcgcgat tgtacggtac tcgcagtcat attcgatttc 900 taaaattgtt accgacgtat tcgtcggtag gcgcgcagcc acttttcaac ggacccgcgg 960 ggtccgacaa ccttatcccg caaacgacgc ttccgttaaa ctctgttcgt gcgtggctgg 1020 ggtcgcgtgt acctcgtccc ttagctttcc agccgtggaa caaagaaggc ctaggttcac 1080 tgacacttat ctactctaga ggtttgcttt ttaggcgctg ccgagggaat aattccggtc 1140 caaacgaagt tcgagagaac ctgtgtagtg tacgttattt agtctgtgcc gtgtggaaaa 1200 ggatctacct ttttttagaa ataccgtact gctagagggt tacatactat tcctcatcac 1260 ctgaggagtc taaagctgaa gttttccggt ggatatatgc cctaccgact gtaagcaggg 1320 ccggatgtac ctatacggtt gacatgccgc ttttgcattt gagatgtgcc tactacggaa 1380 atcgcgtccg cgatgttaca agagctcggg gcatataatg agccagatca atgtcaccgc 1440 aaacctgcag ggatatcggg ccccctgcag gggggaaaat atttcagctg gcgtgcgagc 1500 cgcgtctccg agagcgtata tggagtggcc tctgcctgcg caacttagct ttaaatcggc 1560 cctttcatgt tttcgacagc gcataaaccc acgataggcc cctttagtag ccacgaaagt 1620 tttattcgca gttcgaaaga acgctatgag cacatgatat aaaaattaat cgctccgcga 1680 tcaggaatat tgtattaaca cgcaaaccaa catgctcgag atggcagttc ctaatatgca 1740 tttaccagct gcggcggccg ccaattgctt tattccgcta ttcgcgttgc gtacatttat 1800 acaagtgtag cagcacagaa ccgcggctgt cgcggaaaac aatgtcggcc cgagaagtaa 1860 accgaagccg gctaaggtag tagccattgc cccgaatatt aacagtaata caagaattgg 1920 acggaacaga acctcgtggt agcgcgacgg aaggaatatc gcgacacttg tacccaccaa 1980 gaaaccgcat atactgcgta acgtgtcagt caatgttgac tggtgcttag ttgcgttcga 2040 catgtacttt tgaaagctgg ctatggctgg aatcgagatg accgctatga ggctcagaat 2100 tatcgtagga atattccccc ccagcgtatc gtaactggat acgtcttctt cgcgcgtcgc 2160 ctcggcgtcc gtgctgggcg ggagacgcgc gcgaccgagg cgatatgcac cgttcacagt 2220 aatttcccga cgtgcacggt agtagcacgt gttcattaga gaccgactgg cgtctctgac 2280 cacgtgaata gctaacgccg tatacgccga aagaaagccg gctagaggag aaatgtctcc 2340 atacggagcc gtgatgccgg caatcgtccc tgccgccaca actaaaaacc cggtcttcca 2400 cgtcacgtct ccagacgttg ctatgcagac gtaatgataa gatgcgatca gagctccgag 2460 catgacaaaa gcccgactgc agaggcctgc atgcaagctt ggcgtaatca tggtcatagc 2520 tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 2580 taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 2640 cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 2700 gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 2760 tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 2820 tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 2880 ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 2940 agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 3000 accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 3060 ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 3120 gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 3180 ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 3240 gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 3300 taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 3360 tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 3420 gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 3480 cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 3540 agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 3600 cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 3660 cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 3720 ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 3780 taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 3840 tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 3900 ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 3960 atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 4020 gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 4080 tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 4140 cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 4200 taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 4260 ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 4320 ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 4380 cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 4440 ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 4500 gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 4560 gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 4620 aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 4680 ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 4734 <210> 37 <211> 4085 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> partial plasmid sequence of pSB1 44cds SV FCAopt for vSB1-009 <400> 37 cttttgtcat gctcggagct ctgatcgcat cttatcatta cgtctgcata gcaacgtctg 60 gagacgtgac gtggaagacc gggtttttag ttgtggcggc agggacgatt gccggcatca 120 cggctccgta tggagacatt tctcctctag ccggctttct ttcggcgtat acggcgttag 180 ctattcacgt ggtcagagac gccagtcggt ctctaatgaa cacgtgctac taccgtgcac 240 gtcgggaaat tactgtgaac ggtgcatatc gcctcggtcg cgcgcgtctc ccgcccagca 300 cggacgccga ggcgacgcgc gaagaagacg tatccagtta cgatacgctg ggggggaata 360 ttcctacgat aattctgagc ctcatagcgg tcatctcgat tccagccata gccagctttc 420 aaaagtacat gtcgaacgca actaagcacc agtcaacatt gactgacacg ttacgcagta 480 tatgcggttt cttggtgggt acaagtgtcg cgatattcct tccgtcgcgc taccacgagg 540 ttctgttccg tccaattctt gtattactgt taatattcgg ggcaatggct actaccttag 600 ccggcttcgg tttacttctc gggccgacat tgttttccgc gacagccgcg gttctgtgct 660 gctacacttg tataaatgta cgcaacgcga atagcggaat aaagcaattg gcggccgccg 720 cagctggtaa atgcatatta ggaactgcca tctcgagcat gttggtttgc gtgttaatac 780 aatattcctg atcgcggagc gattaatttt tatatcatgt gctcatagcg ttctttcgaa 840 ctgcgaataa aactttcgtg gctactaaag gggcctatcg tgggtttatg cgctgtcgaa 900 aacatgaaag ggccgattta aagctaagtt gcgcaggcag aggccactcc atatacgctc 960 tcggagacgc ggctcgcacg ccagctgaaa tattttcccc cctgcaggtc gacccaattc 1020 gagctcggta cagcttggct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc 1080 tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga 1140 aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 1200 accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat 1260 tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc 1320 tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag 1380 ctcccggggc ggccgccacc atgggcagca agcccagcac ctggatcagc gtgaccctga 1440 tgctgatcac cagaaccatg ctgatcctga gctgcatctg ccccacaagc agcctggacg 1500 gcagacccct ggccgctgcc ggcatcgtgg tgaccggcga caaggccgtg aacatctaca 1560 ccagcagcca gaccggcagc atcatcatca agctgctgcc caacatgccc aaggacaaag 1620 aggcctgcgc caaggccccc ctggaagcct acaacagaac cctgaccacc ctgctgaccc 1680 ccctgggcga cagcatcaga agaatccagg gcagcgccac cacaagcggc ggaggaaagc 1740 agggcagact ggtgggcgct atcatcggga gcgtggccct gggcgtggcc acagctgccc 1800 agattaccgc tgcagccgcc ctgattcagg ccaatcagaa cgccgccaac atcctgagac 1860 tgaaagagag cattgccgcc accaacgacg ccgtgcacga agtgacaaac ggactgtccc 1920 agctggctgt cgctgtcggc aagatgcagc agttcgtgaa caaccagttc aacaacaccg 1980 ccagagagct ggactgcatc aagatcgccc agcaggtggg cgtggagctg aacctgtacc 2040 tgaccgagct gaccacagtg ttcggccccc agatcacaag ccccgctctg acccagctga 2100 caatccaggc cctgtacaac ctggctggcg gcaacatgga ctatctgctg actaagctgg 2160 gagtgggcaa caaccagctg tccagcctga tcgggtccgg gctgatcaca ggcaacccca 2220 tcctgtacga cagccagaca cagctgctgg gcatccagat caacctgcca tccgtgggaa 2280 gcctgaacaa catgagagcc acctacctgg aaaccctgag cgtgtccacc accaagggct 2340 tcgccagcgc cctggtgccc aaggtggtga cacaggtggg cagcgtgatc gaggaactgg 2400 acaccagcta ctgcatcgag agcgacatcg acctgtactg caccagagtg gtgaccttcc 2460 caatgagccc cggcatctac agctgcctga gcggcaacac cagcgcctgc atgtacagca 2520 agaccgaagg agcactgaca acaccctaca tggccctgaa gggaagcgtg atcgccaact 2580 gcaagatgac cacctgcaga tgcgccgacc ccccaggcat catcagccag aactacggcg 2640 aggccgtgag cctgatcgac aaacattcct gtagcgtgct gtccctggat ggcatcacac 2700 tgagactgag cggcgagttc gacgccacct accagaagaa catcagcatc ctggacagcc 2760 aggtgatcgt gaccggcaac ctggacatca gcaccgagct gggcaacgtg aacaacagca 2820 tcagcagcac cctggacaag ctggccgagt ccaacaacaa gctgaacaaa gtgaacgtga 2880 acctgaccag cacaagcgcc ctgatcacct acatcgtgct ggccatcgtg tccctggcct 2940 tcggcgtgat cagcctggtg ctggcctgct acctgatgta caagcagaga gcccagcaga 3000 aaaccctgct gtggctgggc aataacaccc tggaccagat gagggccacc accagaacct 3060 gatgagcggc cgcgatacct gcaggtttgc ggtgacattg atctggctca ttatatgccc 3120 cgagctcttg taacatcgcg gacgcgattt ccgtagtagg cacatctcaa atgcaaaagc 3180 ggcatgtcaa ccgtataggt acatccggcc ctgcttacag tcggtagggc atatatccac 3240 cggaaaactt cagctttaga ctcctcaggt gatgaggaat agtatgtaac cctctagcag 3300 tacggtattt 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acaccagcta ctgcatcgag agcgacctgg acctgtactg 2640 caccagaatc gtgaccttcc caatgagccc cggcatctac agctgcctga gcggcaacac 2700 cagcgcctgc atgtacagca agaccgaagg cgcactgaca acaccctaca tggccctgaa 2760 gggaagcgtg atcgccaact gcaagatcac cacctgcaga tgcaccgacc ccccaggcat 2820 catcagccag aactacggcg aggccgtgag cctgatcgat cgccattcct gtaacgtgct 2880 gtccctggac ggcatcacac tgagactgag cggcgagttc gatgccacct accagaagaa 2940 catcagcatc ctggacagcc aggtgatcgt gaccggcaac ctggacatca gcaccgagct 3000 gggcaacgtg aataacagca tcagcaacgc cctggacaga ctggccgaga gcaacagcaa 3060 gctggaaaaa gtgaacgtgc gcctgacatc cacttccgct ctgatcacct acatcgtgct 3120 gaccgtgatc agcctggtgt tcggcgccct gagcctggtg ctggcctgct acctgatgta 3180 caagcagaag gcccagcaga aaaccctgct gtggctgggc aacaacaccc tggaccagat 3240 gagagccacc accagagcct gatgagcggc cgcgatatca ataaaatatc tttattttca 3300 ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgaa tcgatagtac taacatacgc tctccatcaa 3360 aacaaaacga aacaaaacaa actagcaaaa taggctgtcc ccagtgcaag tgcaggtgcc 3420 agaacatttc tcttctagac 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gcaatcgatc gcattcgtct agtaaagtga cgagagttat 4320 catgcacaca cccat 4335 <210> 46 <211> 5381 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Partial plasmid pCD046+NDV-F VII YZCQ sequence for vHVT112 <400> 46 gagctcaggg tatgatactc agctgttatt gtggccgacc aggaggactc caatgcttag 60 cattcataag aacgctagag atgctattta acgatgtgct gtcgtctaaa gaatttgtgc 120 atttagcctt taaatgtaaa accaatgacg cattcactac gctcgtgcgt gcaatttctg 180 ggccagggta tgcatattcc ataacagaaa tcgacacttg agaagaggat ctgactgttt 240 gggataaagg tcgtttgggt ctgtcctagc gatataattt atatgacgat atacattaaa 300 catctgtgtg cagtacttag gtatttaatc atgtcgatga aatgttatgt gtaaatatcg 360 gacaatatag ataacgggca cgctgctatt gtaacgtgcg cccgcgcgct agtgctgact 420 aatagtgtgg atgatgtata cagtatatta caaacggaaa tgatacgtaa taaattatgt 480 actcttattg atttataaaa acatacatgc agtgttgcta tgtcacataa ttagcctcgc 540 ccgtctacgc tccactgaag ataatgggct cccgctgttc aaaaaaatca gcgtgcgtcg 600 ataagacttt ggtgcagtct cttcggggtc gcaatttaga tttgccgcat ggagggtatc 660 tggggatttt tgccaatgct ggagcgacga ctgtacgatt cgtcccatcg ggatctagca 720 gaccaatgat gttgacacac atcggccatg catgtacgga cggtctattg cgcgagtttg 780 ttattttcga aggacaagat ggaagtgtat atggaaccga caataatgtt agtttgcatt 840 tcttagggcg gaatctacat gatatcttat ccaagcgggg tatgagccag agagatgtga 900 tggtcataaa gggtaaattt tttagatctg aaataacgca gttgcccaaa caacgatcgc 960 gattaaaaga aaaatcggat ggttcaatta ggacatgcat ggattctgtg cgcataaacc 1020 ataaccgcag cactgttggg cacttcggta actcaaatgc gaagcgttgc acgtctgcga 1080 taactacgcc tactatgcac attgttactc ctgcatctta aaaatatatc ctgtagtaat 1140 tttcacagca atgtcataac atcatctcgc taaagaatga cctgggattg gagaagtaat 1200 gaatatttgc aaccaatgca ttgaataaac taacattaaa cgaattcaat agtggatccc 1260 ccaactccgc ccgttttatg actagaacca atagttttta atgccaaatg cactgaaatc 1320 ccctaatttg caaagccaaa cgccccctat gtgagtaata cggggacttt ttacccaatt 1380 tcccacgcgg aaagccccct aatacactca tatggcatat gaatcagcac ggtcatgcac 1440 tctaatggcg gcccataggg actttccaca tagggggcgt tcaccatttc ccagcatagg 1500 ggtggtgact caatggcctt tacccaagta 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tcaactgaac ttggaaacgt caacaattca 4080 atcagcaatg ccttggataa gttggcaaaa agcaacagca agctagaaaa agtcaatgtc 4140 agactaacca gcacatccgc tctcattacc tatattgttc tgactgtcat ttctctagtt 4200 ttcggtgcac taagtctggg tttaacatgt tacctgatgt acaaacaaaa ggcacaacaa 4260 aagaccttgc tatggcttgg gaataatacc ctcgatcaga tgagagccac tacaagagca 4320 tgagcggccg cggggatcca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa 4380 ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg 4440 taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattgat tttatgtttc 4500 aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt cggatcctct agagtcgaca attattttat 4560 ttaataacat atagcccaaa gacctctatg aacatttagt ttcccgtata ctcaacggcg 4620 cgtgtacaca cgcatctctt tgcatagcga tgaagtttgt tcggcagcag aaaatgcaga 4680 tatccaacaa tctggagaaa acttatcatc acagtggcag tggaaacata ccccctctat 4740 attcatggta taattatcgt ctacagcgtc caggatagtg gcgtgagaaa atggagatct 4800 gcagccctcc tttccatggc atgccgcttt attgttcatt aaacgcacaa tggtctcaac 4860 gccagatatg ggcatagatt ctgaagaacc 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cctgatagat 1260 agacattcgt gcaatgtctt atcattagac gggataactc tgaggctcag tggagaattt 1320 gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ctagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380 cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggataag 1440 ttggcaaaaa gcaacagcaa gctagaaaaa gtcaatgtca gactaaccag cacatccgct 1500 ctcattacct atattgttct gactgtcatt tctctagttt tcggtgcact aagtctgggt 1560 ttaacatgtt acctgatgta caaacaaaag gcacaacaaa agaccttgct atggcttggg 1620 aataataccc tcgatcagat gagagccact acaagagcat ga 1662 <210> 54 <211> 553 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NDV-F protein from wildtype Texas strain (Amino Acid Sequence of NDV-F VIId wt YZCQ with lentogenic cleavage site sequence) <400> 54 Met Gly Ser Lys Pro Ser Thr Arg Ile Pro Ala Pro Leu Met Leu Ile 1 5 10 15 Thr Arg Ile Met Leu Ile Leu Asp Cys Ile Arg Pro Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys 35 40 45 Ala Val Asn Val Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys 50 55 60 Leu Leu Pro 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agataacagc agctgcggcc ctaatacaag ccaaccagaa tgccgccaac atcctccggc 2460 ttaaggagag cattgctgca accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac 2520 aactatcagt ggcagttggg aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagttt aataatacgg 2580 cgcgagaatt ggactgtata aaaatcacac aacaggttgg tgtagaactc aacctatacc 2640 taactgaatt gactacagta ttcgggccac agatcacctc ccctgcatta actcagctga 2700 ccatccaggc actttataat ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag 2760 gtatagggaa caatcaactc agctcgttaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta 2820 tactgtatga ctcacagact caactcttgg gcatacaagt gaatttaccc tcagtcggga 2880 acttaaataa tatgcgtgcc acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat 2940 atgcctcagc acttgtcccg aaagtagtga cacaagtcgg ttccgtgata gaagagcttg 3000 acacctcata ctgtatagag tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc 3060 ccatgtcccc aggtatttat tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa 3120 agactgaagg cgcactcact acgccgtata tggcccttaa aggctcagtt attgccaatt 3180 gtaaaataac aacatgtaga tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattatggag 3240 aagctgtatc cctgatagat agacattcgt gcaatgtctt atcattagac gggataactc 3300 taaggctcag tggggaattt gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ctagattctc 3360 aagtcatcgt gacaggcaat cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa 3420 tcagcaatgc cttggatagg ttggcagaaa gcaacagcaa gctagaaaaa gtcaatgtca 3480 gactaaccag cacatctgct ctcattacct atattgttct aactgtcatt tctctagttt 3540 tcggtgcact tagtctggtg ttagcgtgtt acctgatgta caaacagaag gcacaacaaa 3600 agaccttgct atggcttggg aataataccc tcgatcagat gagagccact acaagagcat 3660 gagcggccgc gatatcaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt 3720 gtgtgaatcg atagtactaa catacgctct ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact 3780 agcaaaatag gctgtcccca gtgcaagtgc aggtgccaga acatttctct tctagacctg 3840 caggggagtc tgtgcaaggt taatgaccct cgcagttcat tcggaagtta taactgccgc 3900 cttcgcacat ttctttttgt cctgttttgt attgccataa cagataggaa ttgaaacctg 3960 atcctcctgt tttttgcagc atggccagca acagaatact ttgtcggatc gactacttgc 4020 gcgagatggt tccgttcttg gaggtttcgg cgggtcgggt ggagaaccta ttattttata 4080 cacacacgtc ataccgttgt cgcgaaaatg ttctttgtct tctgccgtct cgaacgtcgg 4140 ttcccacgta gacgttagga gcgttggaat ggtatcagga agagcccacg gcatgccgga 4200 ccaagtaccc gctactttga ccgcgagcag tctcttcggt aatgggatgt attccagagc 4260 agcgcggcag agatcagcgg cccccactat ccacagactg tatgaagtgt tttctgaaac 4320 atcggactcc aacatcaaat atccagacat aacatcttgc cattcggaag cacatccgcc 4380 gacatcttca aatagcctaa ctataaacga gtctctagtt cctgctaacc cagtacctcg 4440 aatgccagtc ccatccggtg ggttcgtcct gataatcggt ctctgacgcc gaggaagaac 4500 taaaaggggt ctggaaaagc ggaacagatc tgcagaccga acgactacag acacgcccac 4560 atcatcatgt atctgttcca tgcattgctt tatgagaaaa atccataagg ccgaggcggc 4620 atctctagat ctcccgggga gtctctcgca ctcatctagg agagtgacga cagttatcat 4680 agacacgccc atttgtgcac caaacgaaaa gttcctgtac tggtggagcg tcggcgcggg 4740 aatcggtccg tgctctgaaa ccagtgtcta gacagaagac catccggtaa attctggtgt 4800 atgaactgac ggtctccaga cgaacgtcga agacattaac gatggaaact aacgagcttt 4860 cttcaaaagt gtctgattac aacgctaata gaccttacga aactatacgc agcgatacca 4920 gtgacacaga tccgtcggtg tcg 4943 <210> 58 <211> 1362 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> IBDV DNA encoding VP2 protein of IBDV E strain <400> 58 atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60 ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctgg agaagcacac tctcaggtca 120 gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180 cctggattcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240 aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300 ctagtgagtc ggagtctcac agtaaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360 aacggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420 tacaacgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaattgggaa cgtcctagta 480 ggggaagggg taaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgaggctt 540 ggtgacccca tacccgctat agggcttgac ccaaaaatgg tagcaacatg tgacagcagt 600 gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgataatt accaattctc atcacagtac 660 caaacaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagccaaca ttgatgccat cacaagtctc 720 agcgttgggg gagagctcgt gttcaaaaca agcgtccaaa gccttgtact gggcgccacc 780 atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcaaacaat 840 gggctgacgg ccggcatcga caatcttatg ccattcaatc ttgtgattcc aaccaatgag 900 ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tgatggtcag 960 gcaggggaac agatgtcatg gtcggcaagt gggagcctag cagtgacgat ccatggtggc 1020 aactatccag gagccctccg tcccgtcaca ctagtggcct acgaaagagt ggcaacagga 1080 tctgtcgtta cggtcgctgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140 aagaacctgg ttacagaata tggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacgaaattg 1200 atactgagtg agagggaccg ccttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact 1260 gactttcgtg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320 gcatttggct tcaaagacat aatccgggcc ataaggaggt ga 1362 <210> 59 <211> 453 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> IBDV VP2 protein of IBDV E strain <400> 59 Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg 1 5 10 15 Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr 20 25 30 Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr 35 40 45 Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro 50 55 60 Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr 65 70 75 80 Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr 85 90 95 Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr 100 105 110 Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr 115 120 125 Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu 130 135 140 Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val 145 150 155 160 Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly 165 170 175 Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys 180 185 190 Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile 195 200 205 Thr Ala Ala Asp Asn Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Thr Gly Gly 210 215 220 Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu 225 230 235 240 Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Lys Thr Ser Val Gln Ser Leu Val 245 250 255 Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile 260 265 270 Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Ala Gly Ile Asp Asn 275 280 285 Leu Met Pro Phe Asn Leu Val Ile Pro Thr Asn Glu Ile Thr Gln Pro 290 295 300 Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Asp Gly Gln 305 310 315 320 Ala Gly Glu Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr 325 330 335 Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val 340 345 350 Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val 355 360 365 Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val 370 375 380 Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu 385 390 395 400 Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr 405 410 415 Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu 420 425 430 Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile 435 440 445 Arg Ala Ile Arg Arg 450 <210> 60 <211> 884 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Guinea pig CMV promoter <400> 60 ttagtcatat gttacttggc agaggccgca tggaaagtcc ctggacgtgg gacatctgat 60 taatacgtga ggaggtcagc catgttcttt ttggcaaagg actacggtca ttggacgttt 120 gattggcatg ggatagggtc agccagagtt aacagtgttc ttttggcaaa gggatacgtg 180 gaaagtcccg ggccatttac agtaaactga tacggggaca aagcacagcc atatttagtc 240 atgtattgct tggcagaggg tctatggaaa gtccctggac gtgggacgtc tgattaatat 300 gaaagaaggt cagccagagg tagctgtgtc ctttttggca aagggatacg gttatgggac 360 gtttgattgg actgggatag ggtcagccag agttaacagt gttcttttgg caaaggaaac 420 gtggaaagtc ccgggccatt tacagtaaac tgatactggg acaaagtaca cccatattta 480 gtcatgttct ttttggcaaa gagcatctgg aaagtcccgg gcagcattat agtcacttgg 540 cagagggaaa gggtcactca gagttaagta catctttcca gggccaatat tccagtaaat 600 tacacttagt tttatgcaaa tcagccacaa aggggatttt cccggtcaat tatgactttt 660 tccttagtca tgcggtatcc aattactgcc aaattggcag tacatactag gtgattcact 720 gacatttggc cgtcctctgg aaagtccctg gaaaccgctc aagtactgta tcatggtgac 780 tttgcatttt tggagagcac gccccactcc accattggtc cacgtaccct atgggggagt 840 ggtttatgag tatataaggg gctccggttt agaagccggg caga 884 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer HM101 <400> 61 ccggaattcc gatgtttagt cacgatagac 30 <210> 62 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer HM102 <400> 62 ataagagcgg ccgcagtgag atgatcttaa tgatg 35 <210> 63 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer F-ATG <400> 63 tatagcggcc gcaagatggg ctccagatct tctaccag 38 <210> 64 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer F-STOP <400> 64 cgaggcggcc gctcatattt ttgtagtggc tctc 34

Claims (43)

  1. 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩 및 발현하는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 벡터, 또는 돌연변이화 당단백질 C (gC) 유전자를 포함하는 하나 이상의 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (MDV-2) 벡터를 포함하는 조성물 또는 백신.
  2. 제 1 항에 있어서, 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩 및 발현하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 HVT 벡터 (또는 MDV-3 또는 멜리아그리드 헤르페스바이러스-1), 야생형 HVT (MDV-3), 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩 및 발현하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 MDV-1 벡터 (또는 칠면조 헤르페스바이러스-2), 야생형 MDV-1 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조성물 또는 백신을 추가로 포함하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 야생형 HVT (MDV-3) 을 포함하는 조성물 또는 백신.
  4. 제 2 항에 있어서, 재조합 HVT (MDV-3) 을 포함하는 조성물 또는 백신.
  5. 제 2 항에 있어서, 야생형 MDV-1 을 포함하는 조성물 또는 백신.
  6. 제 2 항에 있어서, 재조합 MDV-1 을 포함하는 조성물 또는 백신.
  7. 제 2 항에 있어서, 야생형 HVT (MDV-3) 및 야생형 MDV-1 을 포함하는 조성물 또는 백신.
  8. 제 2 항에 있어서, 재조합 HVT (MDV-3) 및 야생형 MDV-1 을 포함하는 조성물 또는 백신.
  9. 제 2 항에 있어서, 야생형 HVT (MDV-3) 및 재조합 MDV-1 을 포함하는 조성물 또는 백신.
  10. 제 2 항에 있어서, 재조합 HVT (MDV-3) 및 재조합 MDV-1 을 포함하는 조성물 또는 백신.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 칠면조 헤르페스바이러스 3 내 이종 폴리뉴클레오티드가 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터의 독특 장 (UL) 영역에서 ORF UL55 와 ORF LORF5 사이의 영역에 삽입되는 조성물 또는 백신.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 칠면조 헤르페스바이러스 3 내 이종 폴리뉴클레오티드가 삽입되거나 또는 삽입되어 칠면조 헤르페스바이러스 3 당단백질 C 가 대체된 조성물 또는 백신.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 재조합 벡터 내 이종 폴리뉴클레오티드가 가금류 병원체 뉴캐슬 질환 바이러스 F (NDV-F) 에 대한 유전자에 상응하는 조성물 또는 백신.
  14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 재조합 벡터 내 이종 폴리뉴클레오티드가 가금류 병원체 뉴캐슬 질환 바이러스 적혈구응집소 뉴라미니다아제 (NDV-HN) 에 대한 유전자에 상응하는 조성물 또는 백신.
  15. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 재조합 벡터 내 이종 폴리뉴클레오티드가 가금류 병원체 마렉병 바이러스로부터의 하나 이상의 유전자(들)에 상응하는 조성물 또는 백신.
  16. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 재조합 벡터 내 이종 폴리뉴클레오티드가 마렉병 바이러스 당단백질 C (gC), 마렉병 바이러스 당단백질 B (gB), 마렉병 바이러스 당단백질 E (gE), 마렉병 바이러스 당단백질 I (gI), 마렉병 바이러스 당단백질 H (gH) 또는 마렉병 바이러스 당단백질 L (gL), 및 그 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 상응하는 조성물 또는 백신.
  17. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 재조합 벡터 내 이종 폴리뉴클레오티드가 가금류 병원체 전염성 점액낭병 바이러스 (즉, IBDV 또는 검보로 질환 바이러스) 에 대한 유전자에 상응하는 조성물 또는 백신.
  18. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 가금류 병원체 IBDV VP2, IBDV VPX, IBDV VP3, 및/또는 IBDV VP4 에 대한 유전자에 상응하는 조성물 또는 백신.
  19. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 재조합 벡터 내 이종 폴리뉴클레오티드가 가금류 병원체 전염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 에 대한 유전자에 상응하는 조성물 또는 백신.
  20. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 재조합 벡터 내 이종 폴리뉴클레오티드가 가금류 병원체 ILTV 당단백질 B, ILTV 당단백질 I, ILTV 당단백질 D, ILTV 당단백질 E, ILTV 당단백질 C, 또는 그 조합물에 대한 유전자에 상응하는 조성물 또는 백신.
  21. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 재조합 벡터 내 이종 폴리뉴클레오티드가 조류 뇌척수염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 조류 아데노바이러스, 계두 바이러스, 조류 코로나바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 아스트로바이러스 및 닭 빈혈 바이러스 및 콕시디아증 (에이머리아 종), 캄필로박터 종, 살모넬라 종, 마이코플라스마 갈리셉티쿰 및 시노비애, 대장균, 파스테우렐라 종, 아비박테리움 종, 클로스트리듐 종으로 이루어진 군으로부터 선택된 가금류 병원체에 대한 유전자에 상응하는 조성물 또는 백신.
  22. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 재조합 벡터 내 이종 폴리뉴클레오티드가 마이코플라스마 갈리셉티쿰 (MG) 및/또는 마이코플라스마 시노비애 (MS) 로부터의 보호 유전자, 인플루엔자 적혈구응집소 (HA), 인플루엔자 뉴라미니다아제 (NA) 로 이루어진 군으로부터 선택된 가금류 병원체에 대한 유전자에 상응하는 조성물 또는 백신.
  23. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3, 재조합 HVT (MDV-3), 및 재조합 MDV-1 에서의 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩 및 발현하는 임의의 재조합 벡터 내 이종 폴리뉴클레오티드가 상이한 항원을 인코딩하는 조성물 또는 백신.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터가 프로모터를 포함하는 조성물 또는 백신.
  25. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클 또는 아쥬반트를 추가로 포함하는 조성물 또는 백신.
  26. 조류 병원체의 하나 이상의 항원을 코딩 및 발현하는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터, 또는 돌연변이화 gC 유전자를 포함하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터.
  27. 제 26 항에 있어서, 임의의 재조합 벡터 내 이종 폴리뉴클레오티드가 가금류 병원체 뉴캐슬 질환 바이러스 F (NDV-F) 에 대한 유전자에 상응하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터.
  28. 제 26 항에 있어서, 임의의 재조합 벡터 내 이종 폴리뉴클레오티드가 가금류 병원체 마렉병 바이러스에 대한 유전자에 상응하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터.
  29. 제 26 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 마렉병 바이러스 당단백질 C (gC), 마렉병 바이러스 당단백질 B (gB), 마렉병 바이러스 당단백질 E (gE), 마렉병 바이러스 당단백질 I (gI), 마렉병 바이러스 당단백질 H (gH) 또는 마렉병 바이러스 당단백질 L (gL), 및 그 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 상응하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터.
  30. 제 26 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 가금류 병원체 전염성 점액낭병 바이러스 (즉, IBDV 또는 검보로 질환 바이러스) 에 대한 유전자에 상응하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터.
  31. 제 26 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 가금류 병원체 IBDV VP2, IBDV VPX, IBDV VP3, 및/또는 IBDV VP4 에 대한 유전자에 상응하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터.
  32. 제 26 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 가금류 병원체 전염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 에 대한 유전자에 상응하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터.
  33. 제 26 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 가금류 병원체 ILTV 당단백질 B, ILTV 당단백질 I, ILTV 당단백질 D, ILTV 당단백질 E, ILTV 당단백질 C, 또는 그 조합물에 대한 유전자에 상응하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터.
  34. 제 26 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 조류 뇌척수염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 조류 아데노바이러스, 계두 바이러스, 조류 코로나바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 아스트로바이러스 및 닭 빈혈 바이러스 및 콕시디아증 (에이머리아 종), 캄필로박터 종, 살모넬라 종, 마이코플라스마 갈리셉티쿰, 마이코플라스마 시노비애, 대장균, 파스테우렐라 종, 아비박테리움 종, 및 클로스트리듐 종으로 이루어진 군으로부터 선택된 가금류 병원체에 대한 유전자에 상응하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터.
  35. 제 26 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 인플루엔자 적혈구응집소 (HA), 인플루엔자 뉴라미니다아제 (NA), 또는 양자 모두로 이루어진 군으로부터 선택된 가금류 병원체에 대한 유전자에 상응하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터.
  36. 제 26 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터가 프로모터를 포함하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터.
  37. 제 36 항에 있어서, 프로모터가 전초기 CMV 프로모터, 기니아 피그 CMV 프로모터, SV40 프로모터, 거짓광견병 바이러스 당단백질 X 프로모터, 단순 헤르페스 바이러스-1 알파 4 프로모터, 마렉병 바이러스 당단백질 A (또는 gC) 프로모터, 마렉병 바이러스 당단백질 B 프로모터, 마렉병 바이러스 당단백질 E 프로모터, 전염성 후두기관염 바이러스 당단백질 B, 전염성 후두기관염 바이러스 당단백질 E, 전염성 후두기관염 바이러스 당단백질 D 또는 전염성 후두기관염 바이러스 당단백질 I 프로모터, 및 소 헤르페스바이러스 1.1 VP8 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 벡터.
  38. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제 26 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 벡터의 1 회 이상의 투여를 포함하는 동물의 백신접종 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 방법이 프라임-부스트 투여 체제를 포함하는 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제 26 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 벡터의 1 회 이상의 투여를 포함하는 하나 이상의 조류 병원체에 대항하는 동물에서의 면역원성 또는 보호 반응의 유도 방법.
  41. 제 38 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 조류인 방법.
  42. SB-1 게놈 내, SB-1 게놈의 비필수 영역 내 하나 이상의 단리된 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함하는 재조합 SB-1 바이러스 벡터의 제조 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 독특 장 (UL) 영역 또는 독특 단 (US) 영역 내 삽입되거나, 또는 삽입되어 SB-1 당단백질 C 유전자가 대체되는 방법.
KR1020147017914A 2011-11-30 2012-11-29 조류 병원체의 항원을 발현하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 3 (ｍｄｖ 혈청형 2) 벡터 및 그의 용도 KR102013135B1 (ko)

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