BR112014013276B1 - Vetores hvt recombinantes expressando antígenos de patógenos aviários e usos dos mesmos - Google Patents

Vetores hvt recombinantes expressando antígenos de patógenos aviários e usos dos mesmos Download PDF

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Abstract

vetores hvt recombinantes expressando antígenos de patógenos aviários e usos dos mesmos. a presente invenção fornece vetores de herpesvírus de peru recombinates (hvt) que contêm e expressam antígenos de agentes patogênicos de aves, composições que compreendem os vetores de hvt recombinantes, vacinas polivalentes compreendendo os vetores de hvt recombinantes e um ou mais vírus do tipo selvagem ou vetores recombinantes. a presente invenção fornece ainda métodos de vacinação contra uma variedade de patógenos aviários e um método de produzir os vetores de hvt recombinantes

Description

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica a prioridade ao pedido de patente provisório Norte-Americano US 61/564,877, depositado em 30 de novembro de 2011 e ao pedido de patente provisório Norte-Americano US 61/694,957, depositado em 30 de agosto de 2012.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A invenção se refere a vetores virais recombinantes para a inserção e expressão de genes estrangeiros para uso como veículos seguros de vacinação para proteger contra uma variedade de patógenos. Refere-se também à composição ou vacina multivalente compreendendo um ou mais vetores virais recombinantes para a proteção contra uma variedade de patógenos. A presente invenção se refere a métodos de preparação e utilização dos vetores virais recombinantes.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] vacinação das aves é amplamente utilizada para proteger os bandos de aves contra as doenças devastadoras, incluindo a doença de Newcastle (ND), doença de Gumboro (IBD), doença de Marek (MD), bronquite infecciosa (IB), laringotraqueíte infecciosa (ILT) e gripe aviária (AI). ND é causada pelo paramixovírus aviário 1 (APMV-1), também designado vírus da ND (NDV) que pertence à família Paramyxoviridae. MD é causada por herpesvírus Gallid 2 (família Herpesviridae) também designada por serotipo 1 do vírus da MD (MDV1). IB é causada pelo vírus da IB (IBV), pertencente à família Coronaviridae, ILT é causada por um herpesvírus Gallid 1 (família Herpesviridae) também designado vírus ILT (ILTV) e AI é causada por vírus AI (AIV), pertencente à família Orthomyxoviridae.
[0004] Uma série de vetores virais aviários recombinantes foram propostos com o objetivo de vacinar aves contra estes patógenos avícolas. Os vetores virais utilizados compreendem vírus avipox, especialmente para aves de capoeira (EP - A - 0,517,292), do vírus de Marek, tais como os serotipos 2 e 3 (HVT) (WO-A-87/04463), ou, alternativamente, o ITLV, NDV e adenovírus aviário. Quando alguns destes vetores virais aviários recombinantes foram utilizados para a vacinação, eles exibem níveis variáveis de proteção.
[0005] Vários herpesvírus recombinante de perus (HVT, também designado Meleagrid herpesvírus 1 ou sorotipo 3 de MDV) vetores expressando antígenos de diversos patógenos (Patente Norte-Americana US nos 5,980,906, 5,853,733, 6, 183,753, 5,187,087), incluindo IBDV, NDV, VLT e AIV têm sido desenvolvidos e licenciado. De particular interesse é um gene de proteção VP2 expressando vetor HVT que vantagens evidentes sobre as vacinas clássicas IBD (Bublot et al J.Comp Path.2007, Vol.137, S81-S84;. US 5,980,906). Outros vetores HVT de interesse são aqueles que expressam tanto NDV (Morgan et al 1992, dis Avian 36, 858-70;. US 6,866,852; US 5,650,153) ou gene protector (s)VLT (Johnson et al, 2010 Avian Dis 54, 1251 -1259; US 6,299,882; US 5,853,733). Um dos problemas práticos do uso de várias vacinas recombinantes baseados em HVT em conjunto é a sua interferência. Proteção inferior é induzida pelo menos contra uma das doenças quando dois HVT recombinantes expressando antígenos diferentes são misturados (Rudolf Heine 2011; Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vacinas which May Cause an Effect on the Economic Benefits of those Vacinas; artigo apresentado no XVII World Veterinary Poultry Association (WVPA) Congress in Cancún, Mexico, August 14-18, 2011; Slacum G, Hein R. and Lynch P., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek’s disease vacinas, 58th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, CA, USA, March 23rd-25th, p 84)).
[0006] A combinação de HVT e SB-1, uma cepa vacinal Gallid herpesvírus 3 (MDV do serotipo 2 ou MDV-2) demonstrou um efeito sinérgico sobre a proteção MD (Witter e Lee, 1984, Avian Pathology 13, 75-92). Para resolver o problema de interferência, o qual é de interesse para avaliar o vírus HVT como um vetor de vacina para expressar um ou mais antígeno protector (s) contra uma variedade de patógenos avícolas.
[0007] O SB-1 do genoma foi clonado e caracterizado por cromossoma bacteriano artificial (BAC) (Petherbridge, et al., J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009; Singh et al., Research in Veterinary Science 89, 140-145, 2010). A sequ~encia MDV2 SB-1 foi recentemente obtida e analisada (Spatz e Schat, Vírus Gene 42, 331-338, 201 1). Uma deleção a glicoproteína E de SB-1 do vírus foi descrito por Petherbridge, et al. (J. Virol. Métodos 158, 01-17 janeiro de 2009). No entanto, nenhuma pesquisa foi relatada usando SB-1 como um vetor viral expressando genes protetores estrangeiros.
[0008] Considerando o efeito potencial de patógenos animais, como NDV e IBDV na saúde pública veterinária e da economia, são necessários métodos eficientes de prevenção da infecção e proteger os animais. Há uma necessidade de uma solução de vacinas de vetor eficazes combinadas e um método apropriado para produzir a vacina, o qual pode aliviar o problema de interferência observada entre duas vacinas de vetor baseado em HVT.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0009] A presente invenção mostrou resultado surpreendente quando composições polivalentes ou vacinas que compõem vetor HVT única ou dupla foram eficazes para proteger os animais contra uma variedade de patógenos aviários sem interferência. Resultados surpreendentes foram também observados quando várias combinações de promotores, gene com códons otimizados, caudas poli-A e os locais de inserção conferiram diferentes níveis de eficácia e estabilidade para a expressão de um ou mais genes heterólogos in vivo.
[0010] A presente invenção se refere a um vetor HVT recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codifica para e expressa pelo menos um antígeno de um agente patogênico aviário.
[0011] A presente invenção fornece uma composição ou uma vacina compreendendo um ou mais vetores de HVT recombinantes compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um agente patogênico aviário.
[0012] A presente invenção fornece uma composição ou vacina polivalente que compreende um ou mais vetores de HVT recombinantes compreendendo polinucleotídeos heterólogos que codifica para e expressa pelo menos um antígeno de um agente patogênico aviário, e um ou mais vetores recombinantes SB1 que compreendem polinucleotídeos heterólogos que codifica para e expressa pelo menos um antígeno de um agente patogênico aviário.
[0013] A presente invenção se refere a um método de vacinação de um animal, ou a indução de uma resposta imunogênica ou protetora em um animal, compreendendo, pelo menos, uma única administração da composição ou do vetor da presente invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0014] A seguinte descrição detalhada, dada por meio de exemplo, e que não se destina a limitar a invenção às concretizações específicas descritas, podem ser entendidas em conjunto com as figuras que as acompanham, aqui incorporadas por referência, em que:
[0015] A Figura 1 é uma tabela que mostra a SEQ ID NO atribuída a cada sequência de DNA e proteína.
[0016] A figura 2 ilustra a estrutura do genoma de HVT e os seus locais de inserção.
[0017] A Figura 3 mostra o mapa do plasmídeo pHM103.
[0018] A Figura 4 mostra os resultados da análise por PCR de vHVTl 14.
[0019] A Figura 5 mostra os resultados do ensaio de imunofluorescência dupla.
[0020] A Figura 6 apresenta os resultados de Southern blot de vHVTl 14.
[0021] A Figura 7 representa as análises de resultados de imunoprecipitação e Western blot para vHVTl 14.
[0022] A Figura 8 representa a análise de transferência de Western de amostra imunoprecipitada a partir de células infectadas vHVT306.
[0023] A Figura 9 representa a análise de Western blot de amostras imunoprecipitadas a partir de células infectadas VSB 1-009.
[0024] A Figura 10 representa o resultado de estudo de desafio de vHVT304 e vHVTl 14 contra NDV ZJ1 e CA02.
[0025] A Figura 11 mostra o resultado de excreção viral após o desafio NDV CA02 e ZJ1.
[0026] A Figura 12 mostra o resultado excreção viral após o desafio de NDV Chimalhuacan.
[0027] A Figura 13 mostra o alinhamento da sequência e identidade porcentagens.
[0028] A Figura 14 mostra as sequências de DNA e proteínas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0029] Deve ser observado que nesta divulgação e, particularmente, nas reivindicações, os termos como "compreende", "compreenderam", "compreendendo" e similares podem ter o significado que lhe é atribuído na lei de patentes dos EUA; por exemplo, eles podem significar "incluir", "inclui", "incluindo", e outros semelhantes; e que os termos tais como "consistindo essencialmente em" e “consiste essencialmente de” tem o significado que lhes foi atribuído na lei de Patentes dos EUA, por exemplo, eles permitem a elementos não explicitamente recitados, mas excluem elementos que se encontram no estado da técnica ou que afetam uma base ou nova característica da invenção.
[0030] Salvo disposição em contrário, os termos técnicos de acordo com o uso convencional. As definições dos termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V. publicado pela Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (Eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Biologia Molecular e Biotecnologia: a Reference Desk Global, publicado pelo VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0031] Os termos singulares "um,""uma," e "o" incluem referências ao plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra "ou" destina-se a incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário. A palavra "ou" qualquer um membro de uma lista especial e também inclui qualquer combinação dos membros dessa lista.
[0032] O termo "animal"é aqui utilizado para incluir todos os mamíferos, aves e peixes. O animal, tal como aqui utilizado pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de equino (por exemplo, cavalos), canino (por exemplo, cães, raposas, lobos, chacais, coiote), felino (por exemplo, leões, tigres, gatos domésticos, gatos selvagens, outros grandes gatos e outros felinos, incluindo leopardos e lynx), bovinos (por exemplo, gado), suíno (por exemplo, porco), ovinos (por exemplo, ovinos, caprinos, lamas, bisontes), aves (por exemplo, galinha, pato, ganso, peru, codorna, faisão, papagaio, tentilhões, falcão, corvo, avestruz, ema e casuar), primata (por exemplo, prosimian, Tarsier, macaco, gibão, macaco), seres humanos e peixes. O termo "animal" inclui também um animal individual em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo estágios embrionários e fetais.
[0033] Os termos "polipeptídeo"e "proteína" são utilizados alternadamente aqui para referir a um polímero de resíduos de aminoácidos consecutivos.
[0034] O termo "ácido nucleico", "nucleotídeo"e "polinucleotídeo" é utilizado alternadamente e se referem a RNA, DNA, DNAc, ou RNAc e seus derivados, tais como os que contêm esqueletos modificados. Deve ser apreciado que a invenção proporciona polinucleotídeos compreendendo sequências complementares as aqui descritas. O "polinucleotídeo"contemplado na presente invenção inclui tanto a cadeia de frente (5' para 3') quanto a cadeia reversa complementar (de 3' para 5'). Os polinucleotídeos, de acordo com a invenção podem ser preparados de maneiras diferentes (por exemplo, por síntese química, por clonagem de genes, etc.) e pode assumir diversas formas (por exemplo, lineares ou ramificados, cadeia simples ou dupla, ou seu híbrido, iniciadores, sondas, etc).
[0035] O termo "DNA genômico"ou "genoma"são utilizados alternadamente e se referem à informação genética hereditária de um organismo hospedeiro. O DNA genômico compreende o DNA do núcleo (também referido como DNA cromossômico), mas também o DNA dos plastos (p.ex., cloroplastos) e outras organelas celulares (por exemplo, mitocôndrias). O DNA genômico ou genoma contemplado na presente invenção se refere também com o RNA de um vírus. O RNA pode ser uma cadeia positiva ou um RNA de cadeia negativa. O termo "DNA genômico"contemplado na presente invenção inclui o DNA genômico que contém as sequências complementares para as aqui descritas. O termo "DNA genômico"se refere também a RNA mensageiro (mRNA), o DNA complementar (cDNA), e o RNA complementar (cRNA).
[0036] O termo "gene"é utilizado amplamente para se referir a qualquer segmento de polinucleotídeo associado a uma função biológica. Assim, os genes ou polinucleotídeos incluem íntrons e exons como na sequência genômica, ou apenas as sequências de codificação, como no DNAc, tal como um quadro de leitura aberta (ORF), começando a partir do códon de iniciação (códon de metionina) e terminando com um sinal de terminação (códon final). Os genes e os polinucleotídeos podem também incluir regiões que regulam a sua expressão, tais como iniciação da transcrição, tradução e terminação da transcrição. Assim, também estão incluídos os promotores e regiões de ligação ao ribossoma (em geral, estes elementos reguladores encontram aproximadamente entre 60 e 250 nucleotídeos a montante do códon de iniciação da sequência de codificação ou o gene; Doree SM ei ai; Pandher K et al; Chung JY et al), terminadores de transcrição (em geral, o terminador situa-se dentro de aproximadamente 50 nucleotídeos a jusante do códon de terminação da sequência de codificação ou o gene CK; Ward et al). Gene ou polinucleotídeo também se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa o RNAm ou RNA funcional, ou codifica para uma proteína específica, e que inclui sequências reguladoras.
[0037] O termo "DNA heterólogo", tal como aqui utilizado se refere ao DNA derivado de um organismo diferente, tal como um tipo de célula ou de uma espécie diferente da do receptor. O termo também se refere a um DNA ou fragmento do mesmo genoma do DNA do hospedeiro, em que o DNA heterólogo é inserido em uma região do genoma que é diferente da sua localização original.
[0038] Tal como aqui utilizado, o termo "antígeno"ou "imunogênico"designa uma substância que induz uma resposta imunológica específica de um animal hospedeiro. O antígeno pode compreender um conjunto organismo, morto, atenuado ou vivo; uma subunidade ou parte de um organismo; um vetor recombinante contendo uma inserção com propriedades imunogênicas; uma parte ou fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune contra a apresentação de um animal hospedeiro; um polipeptídeo, um epítopo, um hapteno, ou qualquer combinação dos mesmos. Alternativamente, o imunógeno ou antígeno pode compreender uma toxina ou antitoxina.
[0039] O termo "proteína ou peptídeo imunogênica", tal como aqui utilizado inclui os polipeptídeos que são imunologicamente ativos no sentido de que, uma vez administrado ao hospedeiro, o qual é capaz de evocar uma resposta imunológica humoral e / ou do tipo celular dirigida contra a proteína. De preferência, o fragmento de proteína é, tal que tem, substancialmente, a mesma atividade imunológica da proteína total. Assim, um fragmento de proteína, de acordo com a invenção compreende, ou consiste essencialmente de, ou consiste de pelo menos um epítopo ou determinante antigênico. Uma proteína "imunogênica"ou polipeptídeo, tal como aqui utilizado, inclui a sequência de comprimento completo da proteína, os seus análogos, ou seus fragmentos imunogênicos. Por "fragmento imunogênico"entenda-se um fragmento de uma proteína que inclui um ou mais epítopos e, assim, induz a resposta imunológica descrita acima. Tais fragmentos podem ser identificados usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopos, bem conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados por, por exemplo, sintetizando concorrentemente um grande número de peptídeos em suportes sólidos, peptídeos correspondentes a porções da molécula de proteína, e que reagem com anticorpos contra os peptídeos, enquanto os peptídeos são ainda ligados aos suportes. Do mesmo modo, os epítopos conformacionais são facilmente identificados determinando a conformação espacial de aminoácidos, tais como, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional.
[0040] O termo "proteína ou peptídeo imunogênico"contempla ainda a deleções, adições e substituições para a sequência, desde que as funções de polipeptídeos para produzir uma resposta imunológica, tal como aqui definido. O termo "variação conservativa" designa a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente semelhante, ou a substituição de um nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico, de tal modo que o resíduo de aminoácidos codificada não muda um outro resíduo biologicamente semelhante. A este respeito, substituições, particularmente, preferidas serão geralmente de natureza conservativa, isto é, aquelas substituições que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos. Por exemplo, os aminoácidos estão geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácido-aspartato e glutamato; (2) básicos; lisina, arginina, histidina; (3) não polar ~ alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares sem carga-glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosina são, por vezes, classificadas como aminoácidos aromáticos. Exemplos de variações conservativas incluem a substituição de um resíduo metionina por um outro resíduo hidrofóbico, ou a substituição de um resíduo polar por outro resíduo polar, tal como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por aspártico ácido, ou glutamina por asparagina, e semelhantes; ou uma substituição conservativa similar de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado, que não terá um efeito importante sobre a atividade biológica. Proteínas tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a molécula de referência, mas que possuem pequenas substituições de aminoácidos que não afetam substancialmente a imunogenicidade da proteína estão, portanto, dentro da definição do polipeptídeo de referência. Todos os polipeptídeos produzidos por estas modificações estão aqui incluídos. O termo "variação conservativa"também inclui a utilização de um aminoácido substituído no lugar de um aminoácido progenitor não substituído, desde que os anticorpos criados para o polipeptídeo substituído também imunorreajam com o polipeptídeo não substituído.
[0041] O termo "epítopo"se refere ao local em um antígeno ou hapteno ao qual as células específicas B e / ou células T respondem. O termo é também utilizado alternadamente com "determinante antigênico"ou "local determinante antigênico". Anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados em um imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo.
[0042] Uma "resposta imunológica"a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celular e / ou mediada por anticorpos à composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma "resposta imunológica"inclui, mas não está limitado a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos, células B, células T células auxiliares, e / ou T citotóxicas, dirigidas, especificamente, para um antígeno ou antígenos incluído na composição ou vacina de interesse. De preferência, o anfitrião irá exibir uma resposta terapêutica ou de proteção imunológica, tais que a resistência à nova infecção será reforçada e / ou a severidade clínica da doença reduzida. Essa proteção será demonstrada por qualquer uma redução ou a falta de sintomas normalmente apresentados por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e / ou de um título viral reduzido no hospedeiro infectado.
[0043] O termo "recombinante" e "geneticamente modificado"são utilizados de forma intercambiável e se referem a qualquer modificação, alteração ou engenharia de um polinucleotídeo ou a proteína na sua forma nativa ou estrutural, ou qualquer modificação, alteração ou engenharia de um polinucleotídeo ou a proteína no seu ambiente nativo ou circundante. A modificação, alteração ou engenharia de um polinucleotídeo ou de proteína pode incluir, mas não está limitado a, a deleção de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, deleção de um gene inteiro, códon de otimização de um gene, substituição conservativa de aminoácidos, inserção de um ou mais polinucleotídeos heterólogos.
[0044] O termo "construção dupla HVT" ou "vetor duplo de HVT" se refere a um vetor viral de HVT que compreende dois polinucleotídeos heterólogos.
[0045] Os termos "composição de vacina ou polivalente", " vacina ou composição de combinação ou combo" e "vacina ou composição multivalente"são utilizados indiferentemente para se referir a uma composição ou vacina contendo mais do que uma composição ou vacina. A vacina ou composição polivalente pode conter duas, três, quatro ou mais composições ou vacinas. A vacina ou composição polivalente pode compreender vetores virais recombinantes, vírus de tipo selvagem ativos ou atenuados ou mortos, ou de uma mistura de vetores virais recombinantes e vírus do tipo selvagem, em formas ativas ou atenuados ou mortos.
[0046] Uma concretização da invenção proporciona um vetor viral de HVT recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codifica para e expressa pelo menos um antígeno de polipeptídeo ou de um agente patogênico aviário. As cepas de HVT utilizadas para o vetor viral recombinante pode ser qualquer cepas HVT, incluindo, mas não limitado a, a cepa HVT FC126 (Igarashi T. et al, J. Gen. Virol. 70, 1789-1804, 1989).
[0047] Uma outra concretização da invenção proporciona um vetor viral recombinante SB-1 compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de polipeptídeo ou de um agente patogênico aviário. As cepas SB-1 podem ser quaisquer cepas SB-1, incluindo, mas não se limitando a, Vacina comercial da Doença de Marek (vacina SB-1) (Merial Select Inc., Gainesville, GA 30503, EUA), a cepa SB-1 possuindo a sequência de genoma como definido pelo número de acesso GenBank HQ840738.1.
[0048] Os genes que codificam para antígenos ou polipeptídeo podem ser aqueles que codificam para a proteína de fusão do vírus da Doença de Newcastle (NDV-F), hemaglutinina neuraminidase do vírus da Doença de Newcastle (NDV-HN), glicoproteína C do Vírus da Doença de Marek (gC), glicoproteína B do Vírus da Doença de Marek (gB), glicoproteína E do vírus da doença de Marek (gE), glicoproteína I do vírus da doença de Marek (gl), glicoproteína H do vírus da doença de Marek (gH), glicoproteína G do vírus da doença de Marek (gG), glicoproteína L do vírus da doença de Marek (gL), VP2 do Vírus Doença de Gumboro (IBDV), IBDV VPX, IBDV VP3, VP4 IBDV, glicoproteína B de ILTV, glicoproteína I de ILTV, ILTV UL32, glicoproteína D de ILTV, glicoproteína E de ILTV, glicoproteína C de ILTV, hemaglutinina de influenza (HA), neuraminidase de influenza (NA), genes protetores derivados de Mycoplasma gallisepticum (MG), ou Mycoplasma synoviae (MS), ou suas combinações. O antígeno ou o polipeptídeo pode ser qualquer antígeno de patógenos de aves selecionado do grupo que consiste em vírus da gripe encefalomielite, reovírus avícola, paramixovírus aviário, vírus metapneumo aviária, virus da gripe aviária, adenovirus das aves, o vírus da varíola aviária, coronavírus gripe, rotavírus aviário, pintainho vírus da anemia, astrovirus aviária, parvovírus aviária, coccidiose (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Pasteurella sp., Avibacterium sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Clostridium sp., e E. coli.
[0049] Além disso, os homólogos do antígeno acima mencionado ou polinucleotídeos são entendidos como estando dentro do escopo da presente invenção. Tal como aqui utilizado, o termo "homólogo"inclui ortólogos, análogos e parálogos. O termo "análogo"refere-se a dois polinucleotídeos ou polipeptídeos que têm a mesma função ou similar, mas que evoluíram separadamente em organismos estranhos. O termo "ortólogos"refere-se a dois polinucleotídeos ou polipeptídeos de diferentes espécies, mas que evoluíram a partir de um gene ancestral comum por especiação. Normalmente, ortólogos codificam polipeptídeos tendo as mesmas funções ou funções semelhantes. O termo "parálogos"refere-se a dois polinucleotídeos ou polipeptídeos que são relacionadas por duplicação dentro de um genoma. Parálogos geralmente têm funções diferentes, mas estas funções podem estar relacionadas. Análogos, ortólogos e parálogos de um polipeptídeo do tipo selvagem podem diferir do polipeptídeo de tipo selvagem através de modificações pós- translacionais, por diferenças na sequência de aminoácidos, ou por ambos. Em particular, os homólogos da invenção exibem, em geral, pelo menos, 80 - 85%, 85 - 90%, 90 - 95%, ou 95%, 96%, 97%, 98%), 99%) de identidade de sequência, com a totalidade ou parte do polinucleotídeo ou sequências de polipeptídeos de antígenos acima descritos, e irão apresentar uma função semelhante.
[0050] Em uma concretização, a presente invenção proporciona um vetor viral recombinante HVT ou SB-1 compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codifica para e expressa o antígeno de NDV-F ou polipeptídeo. Em um aspecto da concretização, o antígeno de NDV-F ou polipeptídeo tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência a um polipeptídeo tendo a sequência, tal como definida na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 33, 35, ou 37, ou uma sua variante conservativa, uma variante alélica, que é um homólogo ou um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos oito, ou pelo menos dez aminoácidos consecutivos de um destes polipeptídeos, ou uma combinação destes polipeptídeos. Em um outro aspecto da concretização, o polinucleotídeo heterólogo codifica um antígeno de NDV-F ou polipeptídeo possuindo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identidade de sequência com um polipeptídeo possuindo a sequência, tal como definida na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 33, 35, ou 37. Em ainda outro aspecto da concretização, o polinucleotídeo heterólogo tem, pelo menos, 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de um polinucleotídeo possuindo a sequência, tal como definido na SEQ ID NO: l, 3, 5, 32, 34, ou 36.
[0051] As variantes incluem variantes alélicas. O termo "variante alélica"refere-se a um polinucleotídeo ou um polipeptídeo contendo polimorfismos que levam a alterações nas sequências de aminoácidos de uma proteína e que existem dentro de uma população natural (por exemplo, uma espécie de vírus ou variedade). Tais variações alélicas naturais podem tipicamente resultar em 1 - 5% de variância de um polinucleotídeo ou um polipeptídeo. As variantes alélicas podem ser identificadas por sequenciamento da sequência de ácido nucleico de interesse em várias espécies diferentes, o que pode ser facilmente realizado por utilização de sondas de hibridização para identificar o mesmo locus genético do gene em tais espécies. Qualquer e todas as variações de ácidos nucleicos e de aminoácidos resultantes de polimorfismos ou variações que são o resultado de variação alélica natural e que não alteram a atividade funcional do gene de interesse, são entendidas como estando dentro do escopo da invenção.
[0052] O termo "identidade" com relação a sequências pode referir-se, por exemplo, o número de posições com nucleotídeos ou aminoácidos idênticos, dividido pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos na mais curta das duas sequências, em que o alinhamento das duas sequências pode ser determinado, de acordo com o algoritmo de Wilbur e Lipman (Wilbur e Lipman). A identidade de sequências ou semelhança de sequências entre duas sequências de aminoácidos, ou identidade da sequência entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada usando o pacote de software Vetor NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave.., Carlsbad, CA). Quando as sequências de RNA são referidas como sendo semelhantes, ou possuem um grau de identidade de sequência ou de homologia com as sequências de DNA, a timidina (T) na sequência de DNA que é considerada igual à uracila (U) na sequência de RNA. Assim, as sequências de RNA estão dentro do escopo da invenção, e podem ser derivadas a partir de sequências de DNA, por timidina (T) na sequência de DNA sendo considerada igual a uracil (U), nas sequências de RNA.
[0053] Os polinucleidos da divulgação incluem sequências que são degeneradas como resultado do código genético, por exemplo, a utilização de códons otimizados para um hospedeiro específico. Tal como aqui utilizado, "optimizado" refere-se a um polinucleotídeo que é geneticamente modificado para aumentar a sua expressão em uma dada espécie. Para fornecer polinucleotídeos otimizados codificadores de polipeptídeos NDV-F, a sequência de DNA do gene da proteína de NDV-F pode ser modificada para 1) compreender os códons preferidos por genes altamente expressos de uma espécie em particular; 2) compreender um teor de A + T ou G+ C na composição de bases de nucleotídeo a que substancialmente encontrada na referida espécie; 3) formar uma sequência de iniciação das referidas espécies; ou 4) eliminar as sequências que causam desestabilização, poliadenilação imprópria, degradação e extinção de RNA, ou aquela que forma grampos de estrutura secundária ou locais de splicing de RNA. O aumento da expressão da proteína de NDV F nas referidas espécies pode ser alcançado através da utilização da frequência de utilização de códons de distribuição em eucariotas e procariotas, ou em uma espécie em particular. O termo "Frequência de utilização de códon preferencial" refere-se a preferência exibido por uma célula hospedeira específica em utilização de códons de nucleotídeos para especificar um dado aminoácido. Existem 20 aminoácidos naturais, a maioria dos quais são especificados por mais de um códon. Por isso, todas as sequências nucleotídicas degeneradas estão incluídas na descrição, enquanto a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de NDV-F codificada pela sequência de nucleotídeos é funcionalmente inalterada.
[0054] Expressão bem sucedida dos polinucleotídeos heterólogos pelo vírus infeccioso recombinante / modificado exige duas condições. Em primeiro lugar, os polinucleotídeos heterólogos devem ser inseridos, ou inserido em uma região do genoma do vírus, de modo a que o vírus modificado permaneça viável. A segunda condição para a expressão de polinucleotídeos heterólogos inseridos é a presença de sequências reguladoras que permitam a expressão do gene na base viral (por exemplo: promotoras, potenciadoras, locais doadores e aceitadores de splicing e de íntron, sequência de consenso de tradução de Kozak de iniciação, sinais de poliadenilação, elementos de sequência não traduzidos).
[0055] O local de inserção pode ser qualquer região não essencial do genoma de HVT, incluindo, mas não limitado a, a região compreendida entre o ATG da ORF UL55 e a junção de UL, com a região de repetição adjacente (US 5,980,906), o locus IG1, o locus IG2, o locus IG3, o locus UL43, o lócus US10, o locus SORF3/US2 (ver Fig. 2.)
[0056] Em geral, é vantajoso utilizar um promotor forte funcional de células eucarióticas. Os promotores incluem, mas não estão limitados a, um citomegalovirus precoce imediato (CMV), promotor CMV de cobaia, um promotor SV40, promotores do vírus da pseudo-raiva, como a o promotor da glicoproteína X, Virus-1 da Herpes Simplex, tais como o promotor alfa 4, promotores do vírus da doença de Marek (incluindo MDV-1, MDV-2 e HVT) tais como, aquelas de direção da expressão das glicoproteínas gC, gB, GE, gl, promotores de vírus infeccioso laringotraqueíte, tais como os da glicoproteína gB, gE, gl, genes gD, ou outros promotores de herpesvírus.
[0057] Uma concretização da invenção proporciona um vetor HVT recombinante que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica para e expressa o antígeno o NDV-F ou polipeptídeo. Em um aspecto da concretização, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de NDV-F está operacionalmente ligado ao promotor do SV40 com a sequência tal como definido na SEQ ID NO: 9 e, portanto, a expressão do antígeno de NDV-F ou polipeptídeo é regulada pela promotor SV40. Em um outro aspecto da concretização, a expressão do antígeno de NDV-F ou polipeptídeo é regulada pelo sinal poliA de SV40 com a sequência tal como definida na SEQ ID NO: 11. Ainda em outro aspecto da concretização, o polinucleotídeo que codifica o NDV-F ou polipeptídeo está operacionalmente ligado ao promotor MDV gB possuindo a sequência tal como definida na SEQ ID NO: 38 e, portanto, a expressão do antígeno de NDV-F ou polipeptídeo é regulada pelo promotor MDV gB.
[0058] Uma outra concretização da invenção proporciona um vetor HVT recombinante duplo que compreende um primeiro polinucleotídeo heterólogo que codifica para e expressa o antígeno de NDV-F ou polipeptídeo e um segundo polinucleotídeo que codifica para e expressa o antígeno de IBDV VP2 ou polipeptídeo. Em um aspecto da concretização, o antígeno de NDV-F ou polipeptídeo tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identidade de sequência com um polipeptídeo possuindo a sequência, tal como definida na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 33, 35, ou 37. Em outro aspecto da concretização, o antígeno de IBDV VP2 ou polipeptídeo tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo possuindo a sequência, tal como definido na SEQ ID NO: 8 ou 42. Em outro aspecto, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de NDV-F está operacionalmente ligado ao promotor do SV40 com a sequência, tal como definido na SEQ ID NO: 9 e a expressão de antígeno de NDV-F ou polipeptídeo é regulada pelo promotor de SV40. Ainda em outro aspecto, a expressão de antígeno de NDV-F ou polipeptídeo é regulada pelo sinal poliA de SV40 com a sequência, tal como definida na SEQ ID NO: 1l ou o sinal de poliA sintético possuindo a sequência tal como definida na SEQ ID NO: 12. Em outro aspecto, a expressão de antígeno de IBDV VP2 ou polipeptídeo é regulada pelo promotor de CMV-IE possuindo a sequência, tal como definida na SEQ ID NO: 10 e o sinal poliA de SV40 com a sequência, tal como definida na SEQ ID NO: ll.
[0059] Ainda uma outra concretização, a invenção fornece um vetor de HVT duplo recombinante compreendendo dois polinucleotídeos que codificam e que expressam os antígenos de IBDV VP2 ou polipeptídeos. Em um aspecto da concretização, o antígeno de IBDV VP2 ou polipeptídeo tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo possuindo a sequência tal como definido na SEQ ID NO: 8 ou 42. Em um aspecto, o polinucleotídeo que codifica para um primeiro antígeno de IBDV VP2 ou polipeptídeo está operativamente ligado ao promotor de CMV-IE possuindo a sequência, tal como definida na SEQ ID NO: 10, e o polinucleotídeo que codifica para um segundo antígeno de IBDV VP2 ou polipeptídeo está operacionalmente ligado ao promotor de CMV de cobaia possuindo a sequência tal como definido na SEQ ID NO: 43. Em outro aspecto, a expressão de um primeiro antígeno de IBDV VP2 ou polipeptídeo é regulada pelo promotor de CMV-IE possuindo a sequência, tal como definida na SEQ ID NO: 10 e o sinal poliA de SV40 com a sequência tal como definido na SEQ ID NO: l1, e a expressão de um segundo antígeno de IBDV VP2 ou polipeptídeo é regulada pelo promotor de CMV de cobaia possuindo a sequência, tal como definido na SEQ ID NO: 43 e o sinal de poliA sintético possuindo a sequência, tal como definido na SEQ ID NO: 12. Ainda em outro aspecto da concretização, os polinucleotídeos que codificam o antígeno de IBDV VP2 ou polipeptídeo pode ser inserido em uma ou mais regiões do locus selecionados a partir do grupo que consiste em IG1, IG2, US10, SORF3-US2 e gD do genoma de HVT. Em uma concretização, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica ou vacina compreendendo um ou mais vetores virais recombinantes HVT ou SB-1 da presente invenção e um transportador, excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.
[0060] Em uma outra concretização, a presente invenção fornece uma composição ou uma vacina compreendendo um vetor viral de HVT que compreende um polinucleotídeo que codifica um antígeno de NDV-F, um promotor de SV40 e, opcionalmente, um transportador, excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em uma outra concretização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica ou vacina compreendendo um primeiro vetor de HVT compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de NDV-F, um segundo vetor de HVT compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno VP2 de IBDV, e opcionalmente, um transportador, excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em uma outra concretização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica ou de vacina compreendendo um vetor de HVT compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de NDV-F, um vetor de SB-1 que compreende um polinucleotídeo que codifica um antígeno de NDV-F, opcionalmente, um transportador, excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. A composição farmacêutica ou vacina da presente invenção pode compreender um primeiro vetor HVT compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de NDV-F, um segundo vetor de HVT compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de IBDV VP2, um vetor de SB-1 que compreende um polinucleotídeo que codifica um NDV antígeno F, opcionalmente, um transportador, excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.
[0061] Ainda em outra concretização, a presente invenção fornece uma composição ou uma vacina que compreende um duplo vetor viral HVT compreendendo: i) um primeiro polinucleotídeo heterólogo que codifica para e expressa um antígeno de NDV-F ou polipeptídeo; ii) um segundo polinucleotídeo que codifica para e expressa um antígeno de IBDV VP2 ou polipeptídeo; e iii) opcionalmente, um transportador, excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em uma outra concretização, a presente invenção fornece uma composição ou uma vacina compreendendo um duplo vetor viral HVT compreendendo dois polinucleotídeos que codificam e que expressam os antígenos de IBDV VP2 ou polipeptídeos, e, opcionalmente, um transportador, excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Ainda em outra concretização, a composição que compreende o duplo vetor viral de HVT compreende ainda um vetor de HVT compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de IBDV VP2 ou um vetor de SB-1 que compreende um polinucleotídeo que codifica um antígeno de NDV-F, ou uma combinação dos mesmos. Os transportadores, adjuvantes, veículos ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bem conhecidos pelos técnicos versados no assunto. Por exemplo, um transportador ou um adjuvante ou um veículo, ou excipiente ou diluente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser um diluente de vacina de doença de Marek utilizada para vacinas MD. Outro transportador, ou um adjuvante ou um veículo, ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável que podem ser utilizados para os métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, solução de NaCl a 0,9% (por exemplo, soro fisiológico) ou um tampão de fosfato, poli-(L-glutamato) ou polivinilpirrolidona. O transportador, ou um veículo ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável podem ser qualquer composto ou combinação de compostos que facilitem a administração do vetor (ou proteína expressa a partir de um vetor da invenção, in vitro), ou para facilitar a transfecção ou infecção e / ou melhorar a conservação do vetor (ou proteína). Os volumes de dose e as doses são aqui discutidos na descrição geral e também pode ser determinados por um técnico versado no assunto a partir desta divulgação, em combinação com o conhecimento do estado da técnica, sem qualquer experimentação indevida.
[0062] Opcionalmente, outros compostos podem ser adicionados como transportadores ou adjuvantes ou veículos ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis, incluindo, mas não limitadas a, alúmen; oligonucleotídeos CpG (ODN), em particular, o ODN 2006, 2007, 2059, ou 2135 (Pontarollo RA et al, Vet Immunol Immunopath, 2002, 84:43 - 59; Wernette CM et al, Vet Immunol Immunopath, 2002, 84: 223 -236; Mutwiri G. et al, Vet Immunol Immunopath, 2003, 91:89 - 103); poli-PolyU, brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA) ("Vacina Design Subunidade e Abordagem adjuvante", editado por Michael F. Powell e Mark J. Newman, Biotecnologia Farmacêutica, 6: P.03, p.157); N,N-dioctadecil-N',N'-bis (2- hidroxietil) propanodiamina (tal como, avridina® ) {Ibid, p. 148); carbômero, quitosana (ver, por exemplo, Patente Norte- Americana No. US 5,980,912).
[0063] As composições farmacêuticas e vacinas, de acordo com a invenção podem compreender ou consistir essencialmente de um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes adequados para utilização na prática da presente invenção são: (1) polímeros de ácido acrílico ou metacrílico, anidrido maleico e os polímeros derivados de alquenila, (2) sequências de imunoestimulante (ISS), tais como sequências de oligodesoxirribonucleotídeo com um ou mais unidades CpG não- metilado (Klinman et al, 1996; W098/16247), (3) uma emulsão de óleo em água, tal como a emulsão SPT descrita na p 147 de "Vacina Design, Subunidade e Adjuvante Approach", publicado por M. Powell, M. Newman, Pleem um Press 1995, e a emulsão MF59 descrita na p 183 do mesmo trabalho, (4) os lípidos catiônicos contendo um sal de amônio quaternário, por exemplo, DDA (5) citoquinas, (6) de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, (7) saponina ou (8) outros adjuvantes discutidos em qualquer documento citado e incorporado por referência a aplicação imediata, ou (9) quaisquer combinações ou misturas.
[0064] Outro aspecto da invenção se refere a um método para induzir uma resposta imunológica de um animal contra um ou mais antígenos ou uma resposta protetora em um animal contra um ou mais agentes patogênicos de aves, em que o método compreende inocular o animal, pelo menos uma vez com a composição farmacêutica ou vacina da presente invenção. Ainda um outro aspecto da invenção se refere a um método para induzir uma resposta imunológica em um animal a um ou mais antígenos ou uma resposta protetora em um animal contra um ou mais agentes patogênicos de aves em um regime de administração prime-boost, o qual é composto por pelo menos uma administração primária e pelo menos uma administração de reforço com pelo menos um polipeptídeo comum, antígeno, epítopo ou imunógeno. A composição imunológica ou vacina utilizada na administração primária pode ser a mesma, pode ser de natureza diferente daqueles utilizados como um reforço.
[0065] Os patógenos de aves pode ser vírus da Doença de Newcastle (NDV), vírus da Doença de Gumboro (isto é, IBDV ou vírus da doença de Gumboro), doença de vírus de Marek (MDV), Vírus da Laringotraqueíte Infecciosa (VLT), vírus da encefalomielite aviária, reovírus aviário, paramyxovirus aviária, metapneumovirus aviário, vírus da gripe aviária, adenovírus aviário, vírus da varíola aviária, coronavirus aviário, rotavírus aviário, parvovírus aviário, astrovirus aviário e vírus da anemia aviária, coccidiose (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Pasteurella sp., Avibacterium sp., E. coli ou Clostridium sp.
[0066] Geralmente, uma administração da vacina é realizada quer em um dia de idade, por via subcutânea ou intramuscular ou in ovo no embrião de 17 - 19 dias de idade. Uma segunda administração pode ser feita dentro dos primeiros 10 dias de idade. Os animais são, de preferência, pelo menos 17 dias de embrião ou de um dia de idade no momento da primeira administração.
[0067] Uma variedade de vias de administração em pintos de um dia podem ser utilizadas, tais como por via subcutânea ou intramuscular, intradérmica, transdérmica. A vacinação in ovo pode ser realizada no saco amniótico e / ou para o feto. Comercialmente disponível em dispositivos de administração in ovo e SC podem ser utilizados para a vacinação.
[0068] A invenção será agora adicionalmente descrita por meio dos seguintes exemplos não limitativos.
EXEMPLOS
[0069] A construção de inserções de DNA, plasmídeos e vetores virais recombinantes foi realizada usando as técnicas convencionais de biologia molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 aEdição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989).
Exemplo 1 Construção de vHVT114 recombinante expressando NDV- F Preparação de plasmídeo doador pHM103 + Fopt
[0070] O plasmídeo pHM103 (Merial Ltd.) contendo os braços Intergênico I de HVT FC126 (ver Fig. 2), promotor de SV40 e SV40 poli A foram digeridos com NotI, desfosforilado, e o fragmento de 5.6kb foi extraído em gel. Um fragmento NotI flanqueado 1,7 kb de um genótipo com códons otimizados quimicamente sintetizados Vlld gene de NDV-F (SEQ ID NO: l, que codifica para a SEQ ID NO: 2) foi também digerido com NotI e o fragmento de 1,7 kb foi extraído em gel. Os fragmentos de 5,6 e 1,7 kb foram ligados para criar pHM103 + Fopt (fig. 3).
Geração de vetor viral recombinante HVT
[0071] Uma recombinação in vitro (IVR) foi realizada por co-eletroporação de células de fibroblastos de embrião de galinha secundárias (2° células CEF) usando pHM103 + Fopt como o plasmídeo doador e o DNA viral isolado a partir da cepa HVT FC126. A co-eletroporação foi realizada com l x l07 2 ° CEF em 300 ul de Opti-MEM e chocado com 150 volts com 950 capacitância em uma tina de eletroporação de 2 mm. As células transfectadas foram semeadas em placa de 96 poços e incubadas durante 5 dias. As células cultivadas em placas de 96 poços foram então repetidas em duas placas de 96 poços. Um conjunto de placas de 96 poços foi usado para IF A usando soros policlonais de galinha contra NDV-F para identificar poços positivos que contêm recombinantes e um outro conjunto de placas de 96 poços foi usado para recuperar as células infectadas a partir dos poços positivos.
[0072] A purificação viral recombinante foi realizada pela primeira vez por placa de 96 poços duplicação e selecção IFA para os poços que contêm a maioria das placas positivas IFA com a menor quantidade de placas de IFA negativos. Poços combinando estes critérios foram então recolhidos e ajustados a 1 ml de DMEM + 2% de FBS. A partir do estoque de 1 ml, 5 - 20ul foram removidos e misturados com 1 X 107 CEFs em 10 mL de DMEM + 2% de FBS e aliquotados para uma nova placa de 96 poços tendo placas HVT individuais por poço. O sobrenadante dos poços que continham as placas individuais foram testados quanto à ausência de vírus parental por PCR. Depois de cinco ciclos de purificação de placas, um vírus recombinante designado como vHVTl 14 foi isolado e a pureza foi testado por IFA e por PCR para confirmar a expressão de NDV-F e a ausência de vírus parental.
Análise de PCR de vHVTl14 Recombinante
[0073] O DNA foi extraído do vHVTl14 por extração com fenol / clorofórmio, precipitado com etanol, e foi novamente suspenso em 20 mM de HEPES. Os iniciadores de PCR (mostrados na Tabela 1) foram desenhados especificamente para identificar a presença de códons otimizados de NDV-F, o promotor de SV40, bem como, a pureza do vírus recombinante a partir FC126 CL2 vírus parental. PCR foi realizado usando 200 ng de DNA molde, juntamente com os pares de iniciadores indicados na Tabela 1 e as condições dos ciclos de PCR são como se segue: 94° C durante 2 minutos; 30 ciclos de 94° C por 30 seg, a 55 ° C durante 30 seg, 68 ° C durante 3 minutos; 68 ° C durante 5 minutos. Os produtos de PCR esperados são mostrados na Tabela 2. Os resultados de PCR são apresentados na Figura 4. Como mostrado na Figura 4, os tamanhos dos produtos de PCR após a eletroforese em gel correspondem bem com os tamanhos esperados e os padrões de bandas. Tabela 1
Figure img0001
Tabela 2
Figure img0002
[0074] O teste de imunofluorescência foi realizado utilizando o vHVTl14 que foi passado mais de dez vezes para além de uma semente pré-master experimental (pré-MSV). Os materiais pré-MSV e pré-MSV 12 foram diluídos 1:100 em média. Cinquenta microlitros do vírus diluído foram adicionados a 10 ml de DMEM + 2% FBS com 1 X 107 CEFs e então divididos em alíquotas para um prato de 96 poços (lOO ul / poço). As placas foram incubadas durante 3 dias a 37° C, 5% C02 até as placas virais tenham sido visíveis. As placas foram fixadas com 95% de acetona gelada durante três minutos e lavadas três vezes com PBS. antissoros de galinha contra o vírus da Doença de Newcastle (lote # C0139, Charles Rivers Laboratory) em 1:1000 foram adicionados juntamente com o anticorpo monoclonal G-78 (Merial limitada) a 1:3000 e as placas foram incubadas a 37° C durante 1 hora. Após a incubação de 1 hora as placas foram lavadas três vezes com PBS e FITC anti- galinha (lote # F8888, Sigma) foi adicionado juntamente com Alexz Fluor 568 donkey anti-camundongo (IgG) (lote # A 10037, Molecular Probe) a 1:500. Mais uma vez, as placas foram incubadas a 37° C durante 1 hora. Após a incubação de 1 hora, as células foram lavadas três vezes com PBS. Uma pequena quantidade de PBS foi adicionada para impedir a monocamada de secagem e fazendo auto fluorescência. As células foram então visualizadas com um microscópio fluorescente utilizando tanto filtro de isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) quanto de isotiocianato de fluoresceína (FITC) em combinação.
[0075] As placas virais vHVTl14 foram visualizadas utilizando ambos os filtros FITC e TRITC para a coloração dupla. O teste de FITC mostrou a expressão de NDV-F e o teste TRITC mostrou a expressão de HVT. Por causa das pequenas cavidades das placas de 96 poços, cada poço foi registrado com as placas contadas com o primeiro filtro TRITC e, em seguida, contou com o filtro FITC. Mais de 500 placas foram contadas para a passagem pré-MSV e pré-MSV 12. Todas as placas eram positivas tanto para a FITC e TRITC em ambas as placas. (FIG. 5)
Southern blot de vHVTl14 recombinante
[0076] DNA genômico total foi extraído a partir de HVT FC126 e vHVTl14, de acordo com o protocolo de extração de DNA genômico padrão. Para cada digestão de restrição, 3 ug de DNA genômico (1 ng de plasmídeo doador) foi usado com um volume total de digestão de 20 l para cada amostra. O DNA genômico de HVT FC126 (controle negativo), pHM103 + Fopt plasmídeo doador, e vHVTl14 foram digeridos durante a noite a 37° C com BamHI, PstI, Sphl, e endonucleases de restrição Ncol. Os fragmentos de restrição de HVT FC126 (controle negativo), pHM103 + Fopt plasmídeo doador, e vHVTl14 de DNA genômico foram separados por um gel de agarose a 1% e transferido para uma membrana de nylon carregada positivamente. Após a hibridização e Kit de Detecção quimioluminescente North2South (Thermo Scientific) as instruções dos fabricantes, a membrana foi pré-hibridizada durante 1 hora e, em seguida, hibridizados com uma sonda de NDV-F biotinilada durante a noite a 55° C. Após a hibridização durante a noite, diversas lavagens de rigor foram realizadas até que a membrana tenha sido colocada em um tampão de bloqueio, com a adição de Streptavidin-HRP. Após a lavagem da membrana de qualquer desacoplado Estreptavidina-HRP foi adicionada a solução de substrato de luminal e peróxido. A membrana foi, então, exposta a película de raios-X e desenvolvida. Zonas em que a sonda biotinilada ligada ao DNA foi quimioluminescente e foram capturados na membrana de raios-X. A Tabela 3 mostra as bandas de Southern blot esperada usando a sonda de NDV-F. Os resultados de transferência Southern revelou os padrões de digestão como esperado (Fig. 6). Tabela 3 Sonda NDV-F
Figure img0003
Análise da sequência da região inserida no vHVTl14 recombinante
[0077] Análise de vHVTl14 região de DNA genômico foi realizada por amplificação por PCR. Total de 10 iniciadores foram utilizados para amplificar toda o cassete, bem como, para os braços flanqueadores BamHI-I utilizados no plasmídeo doador. O produto de PCR de 4,727 kb foi purificado em gel e todo o fragmento foi sequenciado usando os iniciadores de sequenciamento. O resultado confirmou que a sequência de vHVTl14 contém o promotor de SV40 correto, os códons otimizados de NDV-F e as sequências de poliA do SV40, que correspondem exatamente a sequência descrita para o plasmídeo doador pHM103 + Fopt na SEQ ID NO: 18.
Análise de Western blot de vHVTl14 recombinante
[0078] Aproximadamente 2 x l06células de fibroblastos de galinha foram infectados em ~ 0,1 MOI com vHVTl14 Pre-MSV. Após dois dias de incubação a 37° C, infectados, bem como as células não infectadas foram colhidas usando um raspador de células, após a remoção do meio e de lavagem com PBS. As células foram colhidas com 1 ml de PBS e centrifugadas. As pelotas de células foram lisadas, seguindo o Kit clássico IP Pierce (lote # 26146, Thermo Scientific). 100 l do anticorpo monoclonal anti-NDV-F 001C3 (Merial Ltd.) foi usado para formar o complexo de sistema imunológico. A amostra de anticorpo / lisado foi adicionado a Proteína A / G Plus agarose para capturar o complexo imune. O complexo imune foi lavado três vezes para remover o material não ligado e depois eluído no volume de 50 ul usando tampão de eluição da amostra sob condições não redutoras. Após ebulição durante 5 minutos, 10 l das amostras foram carregadas em um gel de acrilamida a 10% (Invitrogen). O gel de PAGE foi executado em tampão de MOPS (Invitrogen) em 200volts durante 1 hora. Em seguida, o gel foi transferido para uma membrana de PVDF.
[0079] A proteína de Western Blot Detector System Kit TMB (KPL, cat # 54 - 11-50), foi usada para secar a membrana de PVDF, utilizando os reagentes e seguindo as instruções do fabricante. Depois de bloquear a membrana durante 1 hora a temperatura ambiente, a membrana foi então lavada três vezes em tampão de lavagem IX, cinco minutos cada e depois embebido em tampão de bloqueio contendo 1: 1000 de diluição de soro de galináceo criado contra vírus NDV (Lote # 139 CO, Charles River Laboratories). Depois de lavar três vezes em um tampão de lavagem, a membrana foi incubada com uma peroxidase de cabra anti-IgG de galinha (KPL, cat # 14-24-06) a uma diluição de 1:2000 por 1 hora à temperatura ambiente. A membrana foi então lavada três vezes em tampão de lavagem IX, cinco minutos cada. 5 ml de substrato de peroxidase TMB membrana foi adicionada à membrana e suavemente agitada durante cerca de 1 minuto. A reação de desenvolvimento foi parada através da colocação da membrana na água.
[0080] A técnica de imunoprecipitação e Western blot detectaram uma proteína de aproximadamente 55 kD na amostra vHVTl 14 que corresponde ao tamanho esperado do componente Fl da proteína de NDV-F (FIG. 7).
Exemplo 2: Construção de vHVTHO, vHVTlll, vHVT112, VHVT113 e vHVT116 recombinante expressando NDV-F.
[0081] Geração e caracterização de recombinantes HVT vHVT 110, vHVT 111, vHVTl 12, vHVTl 13, e vHVTl 16 foi feito essencialmente da mesma maneira como para vHVTl 14 descrito no exemplo 1. A Tabela 4 mostra as características únicas para cada construção em torno dos cassetes de expressão, incluindo as respectivas sequências. Tabela 4. Características dos cassetes de expressão de HVT recombinates individuais
Figure img0004
[0082] O plasmídeo pCD046 (material de propriedade de Merial) contendo os braços Intergênico I de HVT FC126, rato do promotor de CMV e SV40 poli A foi digerido com NotI, desfosforilado, e um fragmento de 6.6kb foi extraído em gel. Um fragmento NotI flanqueado 1,7 kb de um gene sintetizado quimicamente NDV-F contendo a sequência F de tipo selvagem (SEQ ID NO: 3, que codifica para a SEQ ID NO: 4) foi também digerido com NotI e o fragmento de 1,7 kb foi extraído em gel. Os fragmentos de 6,6 kb e 1,7 foram ligados para criar um plasmídeo doador pCD046 + NDV-F wt (SEQ ID NO: 21 para vHVTl10) usado na transfecção para gerar vHVTl10 recombinante por sequenciamento da região de inserção confirmou que vHVTl10 contém a correta sequência de promotor de mCMV, o tipo selvagem do gene de NDV-F e o SV40 poliA. A sequência também coincide exactamente com a sequência descrita para o doador do plasmídeo pCD046 + NDV-F em peso na SEQ ID NO: 21.
vHVTlll
[0083] O plasmídeo pHM103 (material de propriedade da Merial), contendo o Braços Intergênico I de HVTFC126, o promotor de SV40 e SV40 poliA foi digerido com NotI, desfosforilado, e o fragmento de 5,6 kb foi extraído em gel. Um fragmento NotI flanqueado 1,7 kb de um gene sintetizado quimicamente NDV-F contendo a sequência de tipo selvagem F (SEQ ID NO: 3, que codifica para a SEQ ID NO: 4) foi também digerido com Notl e um fragmento de 1,7 kb foi extraído em gel. Os fragmentos de 5,6 kb e 1,7 foram ligados para criar um plasmídeo doador (SEQ ID NO: 22 para vHVTl110). Utilizado na transfecção para gerar vHVTl11 recombinante. O sequenciamento da região de inserção confirmou que vHVTl11 contém as sequências corretas do promotor de SV40, o de tipo selvagem do gene de NDV-F e o SV40 poliA, como mostrado na sequência do plasmídeo doador pHM103 + NDV-F wt (SEQ ID NO: 22).
vHVTl12
[0084] Um fragmento que engloba o gene sintético de NDV- F YZCQ tipo selvagem (SEQ ID NO: 34 que codifica a SEQ ID NO: 35) foi excisado a partir do plasmídeo pUC57 NDV-F YZCQ (sintetizado por GeneScript) utilizando NotI e inseridos no mesmo sítio do plasmídeo pCD046 que contém o promotor de mCMV e poliA de SV40 cauda. O material ligado foi transformado usando kit Top 10 Oneshot (Cat # C404002, Invitrogen). As colônias bacterianas foram cultivadas em caldo de LBamp, plasmídeo extraído usando kit Qiagens MiniSpin Prep, e rastreadas para a orientação de inserção. O plasmídeo doador correta foi designado pCD046 + NDV-F VII YZCQ. Culturas de larga escala foram desenvolvidas e a extração de plasmídeo foi realizada utilizando kit Qiagens Maxi Prep. A expressão transiente dos preps maxi foi verificada utilizando Reagente Fugene transfecção em Chicken Embryo fibroblastos Cells (CEF 's) e soros policlonais de galinha contra NDV.
[0085] O plasmídeo pCD046 + NDV-F VII YZCQ (SEQ ID NO: 29). Foi utilizado na transfecção para gerar vHVTl12 recombinante. O sequenciamento da região de inserção confirmou que vHVTl12 contém as sequências corretas do promotor mCMV, o tipo selvagem de NDV-Gene F YZCQ e o SV40 poliA. A sequência também coincide exatamente com a sequência descrita para o plasmídeo doador pCD046 + NDV-F VII YZCQ na SEQ ID NO: 29.
vHVT113
[0086] Um fragmento que engloba o gene sintético de NDV Texas F (SEQ ID NO: 36 que codifica a SEQ ID NO: 37) foi excisado a partir do plasmídeo pUC57 NDV Texas F (sintetizado por GeneScript) utilizando NotI e inseridos no mesmo local do plasmídeo pCD046 que contém promotor de mCMV e poliA de SV40 cauda. O material ligado foi transformado usando kit Top 10 Oneshot (Cat # C404002, Invitrogen). As colônias bacterianas foram cultivadas em caldo de LBamp, o plasmídeo extraído usando kit Qiagens MiniSpin Prep, e rastreado para a orientação de inserção. O plasmídeo correto do doador foi designado pCD046 + Texas NDV-F. Culturas de larga escala foram desenvolvidas e a extração de plasmídeo foi realizada utilizando kit Qiagens Maxi Prep. A expressão transiente dos preps maxi foi verificada utilizando Reagente Fugene transfecção em Chicken Embryo fibroblastos Cells (CEF 's) e soros policlonais de galinha contra NDV.
[0087] O plasmídeo pCD046 Texas + NDV-F (SEQ ID NO: 30) foi utilizado na transfecção para gerar vHVTl13 recombinante. O sequenciamento da região de inserção confirmou que vHVTl13 contém as sequências corretas promotor mCMV, a de tipo selvagem NDV. F Texas gene F e o SV40 poliA. A sequência também coincide exatamente com a sequência descrita para o doador do plasmídeo pCD046 Texas + NDV-F na SEQ ID NO: 30.
vHVT039
[0088] O promotor MDV gB (SEQ ID NO: 38) foi amplificado a partir de DNA extraído MDV1 cepa RB1B por PCR usando o primers HM101 (5’ -CCG-GAA-TTC-AGC-TGT-ATT-ACG-TCG-ATA- GAC- 3') (SEQ ID NO: 44) e HM102 (51 -ATA-AGA-GCG-GCC-CGC-GTG-AGA- TCT-TGA-TAA-TGA-TG-3 ') (SEQ ID NO: 45). O primeiro contém um sítio EcoRI e o último contém um site Notl para ligadura da EcoRI / NotI digerido 630 pb produto de PCR em EcoRI / NotI digerido pCD046 plasmídeo. O produto de ligação foi usado para transformar células competentes DH5a. As colônias foram recolhidas e testadas quanto à presença do fragmento de PCR inserido por análise de restrição com EcoRI e NotI. O plasmídeo resultante foi designado pHM102.
[0089] A cepa velogênica NDV Texas (genótipo IV) foi cultivada em 11 dias de idade, os ovos embrionados SPF e semi-purificada. O RNA total foi extraído e um PCR RT foi realizada utilizando dois iniciadores F-ATG (5'TAT-AGC-GGC- CGC-AAG-ATG-GGC-CCT-AGA-TCT-TCT-ACC-AG 3') (SEQ ID NO: 46) e F-STOP (5'CGA-GCG-GGC-CGC-TAT-TCA-TTT-TGT-AGT-GGC-TCT-C 3') (SEQ ID NO: 47). Eles permitem que toda a amplificação do gene NDV F com adição de local Notl a montante de ATG e códons de terminação a jusante. O fragmento de 1,7 kb de PCR foi digerido com Notl e ligado em NotI-digerido pHM102. O plasmídeo resultante foi designado pHMl19 e foi usado como um plasmídeo doador no estudo in vitro de recombinação por co- transfecção de células CEF com DNA parental HVT para gerar vHVT039 como descrito acima. A sequenciamento da região de inserção confirmou que vHVT039 contém as sequências corretas do promotor MDV gB, o tipo selvagem não modificado do gene de NDV-F a partir da cepa Texas (SEQ ID NO: 32 que codifica a SEQ ID NO: 33) e o SV40 poliA, como mostrado na sequência parcial do plasmídeo doador pHMl 19 (SEQ ID NO: 31).
vHVT116
[0090] O plasmídeo pHM103 (material de propriedade da Merial), contendo o Braços Intergênico I de HVT FC126, o promotor de SV40 e SV40 poliA foi digerido com NotI, desfosforilado, e o fragmento de 5.6kb foi extraído em gel. A Notl ladeado 1,7 kb de um fragmento, genótipo CA02 gene V NDV-F otimizado do códon sintetizado quimicamente(SEQ ID NO: 5, que codifica para a SEQ ID NO: 6) foi também digerido com No ti e o fragmento de 1,7 kb foi extraído em gel. Os fragmentos de 5,6 e 1,7 kb foram ligados para criar pHM103 + NDV-F CA02 (SEQ ID NO: 23 para vHVTl 16) usado na transfecção para gerar vHVTl16 recombinante. O sequenciamento da região de inserção confirmou que vHVTl16 contém as sequências corretas do promotor SV40 do gene CA02 de NDV-F com códons otimizados e poliA de SV40, como mostrado na sequência do plasmídeo doador pHM103 + NDV-F wt (SEQ ID NO: 23).
Discussão
[0091] Vários cassetes sob o promotor mCMV ou não-CMV foram inseridos em diferentes loci do genoma de HVT (Tabela 4). Apesar de tentativas repetidas, a geração de uma construção com uma combinação de mCMV e a sequência F com códons otimizados não foi bem sucedido além da passagem 2. No entanto, quando a sequência de tipo selvagem foi conduzido por um promotor mCMV construção estável, vHVTl 10 poderia ser gerado. Além disso, vHVTl11 recombinante com a sequência F de tipo selvagem sob o promotor de SV40 foi também estável durante mais de 10 passagens in vitro. Surpreendentemente, uma sequência de códons otimizados F sob o promotor de SV40 foi igualmente encontrado para ser estável por mais de 10 passagens in vitro (por exemplo, vHVTl14 e vHVTl16). Estes resultados indicam o equilíbrio delicado entre a força do promotor e da natureza do gene que controla a geração de uma construção de HVT geneticamente estável (ou não otimizado com códons optimizados).
Exemplo 3 Construção de vHVT306, um vetor duplo HVT expressando NDV-F e IBDV VP2
[0092] O plasmídeo doador pHVT US2 SV-Fopt-synPA foi construído contendo o promotor de SV40, o NDV F sintético códons optimizados VII gene sintético cauda poliA flanqueada pelo SORF3 e sequências de US2 braço de HVT FC126.
Geração de vírus recombinantes
[0093] Um processo de recombinação homóloga padrão foi seguido por co-eletroporação de células CEF secundárias usando plasmídeo doador pHVT US2 SV-Fopt-synPA e DNA viral isolado a partir de vHVT13 (um vetor HVT expressando o gene IBDV VP2, Merial Limited). Essencialmente, o processo descrito no exemplo 1 para vHVTl14 foi seguido para gerar, purificar e caracterizar placas recombinantes por imunofluorescência.
[0094] Depois de cinco ciclos de purificação de placas, o vírus recombinante puro (vHVT306) foi isolado e a pureza de vHVT306 foi testado e confirmado por IFA e PCR.
Análise por PCR
[0095] O DNA viral foi extraído de vHVT306 pré-master vírus semente (pré-MSV) estoque por QIA DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen cat # 69506). Os iniciadores de PCR foram concebidos para identificar a presença do NDV F optimizado, o tipo selvagem de NDV F, o promotor de SV40, o promotor de mCMV, os braços flanqueadores de US2 do vírus HVT e SB-1 do vírus.
[0096] A amplificação por PCR com diferentes iniciadores confirmou que o vHVT306 tem os padrões de amplificação esperado e amplicons.
Análise da Expressão
[0097] Ensaio imunofluorescente indireto (IFA) foi realizada no estoque vHVT306 pré-MSV. Os CEFs que foram inoculados com vHVT306 foram fixados com gelo frio de 95% de acetona durante três minutos à temperatura ambiente e durante 10 min, secou-se ao ar. Após três lavagens com PBS, dois anticorpos primários, soro do virus anti- Doença de Newcastle de galinha (Charles Rivers Laboratories cat # 10100641, lote # C0117A) a 1:500 de diluição e anticorpo monoclonal L78 contra HVT (Merial Select, Gainesville, GA) a 1:3000 de diluição foram adicionados e incubados durante 45 min a 37° C. Após três lavagens com PBS, dois anticorpos secundários, de cabra anti-IgG de galinha ~ fluoresceína (KPL cat # .02-24-06, lote # 10020 l) a 1: 500 de diluição e de burro anti-IgG de ratinho-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe # A10037, lote # 989784) a 1:300 diluição foram adicionados. As placas foram incubadas a 37° C durante 45 min e seguido de três lavagens com PBS. As células foram observadas para identificar as placas positivas IFA com um microscópio fluorescente utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC) - e isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC)-filtros de Nikon Eclipse Ti microscópio invertido.
[0098] Do mesmo modo a expressão da proteína IBDV VP2 (SEQ ID NO: 8 codificada pela SEQ ID NO: 7) de vHVT306 foram examinados através de IFA utilizando galinha anti-soros de IBDV (Charles River Laboratories cat # 10100610 Lote # G0117) (1: 500 de diluição) e anti-F de NDV anticorpo monoclonal 001C3 (fluido Asceitic, Lote 10/09/044, 02/11/2010) (1:300 de diluição) como anticorpos primários; seguido pelo de cabra anti-IgG de galinha com fluoresceína (KPL cat # .02-24-06, lote # l 10020) (1: 500 de diluição) e burro anti-IgG-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe # A10037, lote # 989784 ) (1: 300 de diluição) como anticorpos secundários.
[0099] Por IFI, indicam que vHVT306 expressa os genes NDV F em CEFs infectadas com vírus.
[0100] Mais de 400 placas de vHVT306 foram contadas utilizando o filtro FITC e TRITC-filtro de microscópio. A expressão geral do conjunto de gene NDV F e IBDV VP2 com as placas HVT (Tabela 5). Tabela 5 - Duplo IFA de vHVT306
Figure img0005
Análise de Southern Blot
[0101] DNA genômico total foi extraído a partir de material CEFs pré-vHVT306 MSV infectados. A análise Southern blot foi realizada de acordo com o protocolo padrão.
[0102] Um total de três sondas foram usadas para confirmar o cassete NDV F (promotor de SV40, o códon NDV F do gene optimizado, cauda poliA sintética) entre SORF3 e US2 de vHVT306 bem como a retenção do cassete de VP2 IBDV (mCMV promotor, o gene VP2 de IBDV, cauda poli A SV40).
[0103] Os resultados de Southern blot mostraram os padrões de digestão como esperado com base no Vetor NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA), a análise do mapa. O cassete NDV F (promotor de SV40, códons optimizados NDV F, cauda poli A sintética) está localizado entre SORF3 e US2, e cassete de VP2 IBDV (mCMV promotor, o gene VP2 de IBDV, SV40 poli A cauda) está intato como o vírus progenitor (vHVT13).
Análise genômica
[0104] O DNA genômico de vHVT306 estoque pré-MSV foi sequenciado para verificar a seqüência de braço região de recombinação, bem como o gene inserido no cassete.
[0105] Os iniciadores foram concebidos para amplificar o cassete de gene inserido inteiro, incluindo o braço de recombinação utilizada no plasmídeo doador. Análise de DNA genômico vHVT306 foi realizada por amplificação de PCR, seguido de determinação da sequência de nucleotídeos.
[0106] O vHVT306 (plasmídeo doador pHVT US2 SV-Fopt-synPA) contendo os braços de recombinação, o promotor de SV40 e o gene com códons optimizados NDV F foi confirmado ser correta, como mostrado na SEQ ID NO: 20.
Análise Western blot
[0107] A monocamada de CEF foi infectada com vHVT306 pré-MSV a MOI - 0,1. Após uma incubação de quatro dias, os CEFs foram sedimentados e lavados com PBS, seguido por lise com tampão de lise de IP / Wash Kit de clássico IP Pierce (Thermo Scientific cat # 26146) de acordo com os protocolos do fabricante. O lisado foi pré-limpo e incubado com 100 ul de anticorpo monoclonal anti-NDV F 001C3 para tornar o complexo imune. O complexo imune foi capturado pela proteína A / G Plus agarose e após a remoção do complexo imune ilimitado por passos de lavagem, a 50 ul de tampão de amostra foi utilizado para eluir sob condições não redutoras. Os CEFs não infectados foram incluídas como controles. 20 ul das amostras eluídas foram separadas em 10% Bis-Tris Gels por eletroforese. Após a eletroforese, as proteínas separadas foram transferidas para uma membrana de PVDF. A Proteína de detecção TMB Western Blot Kit (PL cat # 54-l 1-50) foi utilizada para detectar os antígenos NDV sobre membrana PVDF com soro de galinha anti-NDV (Charles River Laboratories Laboratories lote # l0.100.641, lote # C0117A), e cabra anti- IgG de galinha-peroxidase conjugada (KPL cat # 14-24-06) seguindo os protocolos dos fabricantes.
[0108] A expressão da proteína de NDV F de vHVT306 foi confirmada por duas etapas de imunodetecção. Em primeiro lugar, as proteínas NDV F expressas a partir de vHVT306 CEF infectadas foram capturados pela imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-NDV F anticorpo monoclonal 001C3. Análise de de Western blot utilizando subsequentemente anti-soro policlonal de NDV (Charles River Laboratories cat # 10100641, lote # C0117 A) foi utilizada para a detecção da proteína de NDV F nas amostras captadas (complexos anticorpo-proteína monoclonal de NDV F) (Fig. 8). Uma proteína de 55 kDa nos lisados pré-vHVT306 MSV foi detectado pelo anti-soro de NDV que corresponde ao tamanho esperado da proteína de fusão Fl NDV (Fig. 8).
Exemplo 4 Construção de vetores duplos vHVT301, vHVT302, vHVT303, VHVT304 e vHVT307 de HTV expressando NDV-F e IBDV VP2, e dê um duplo vetor HVT vHVT202 expressando variantes IBDV VP2 Exemplo 4.1 Construção de vHVT301, vHVT302, vHVT303, VHVT304 e vHVT307
[0109] Geração e caracterização de HVT duplo recombinantess vHVT301, vHVT302, vHVT303, vHVT304, e vHVT307 foram realizados essencialmente do mesmo modo como para vHVT306 descrito no exemplo 3. Tabela 6.1 mostra as características únicas para cada construção em torno dos cassetes de expressão, incluindo as respectivas sequências. Tabela 6.1 Características dos cassetes de expressão de HTV duplos recombinants
Figure img0006
vHVT301
[0110] O plasmídeo pHVT IG2 Sbfl (material de propriedade da Merial), contendo sequências braços 2 Intergênicas de vHVT13 que foi digerido com Smal, desfosforilado, e o fragmento de 4.3kb foi extraído em gel. O plasmídeo doador pHM103 + NDV-F em peso contendo um promotor de SV40, o tipo selvagem de NDV-F genótipo Vlld de NDV-F tipo selvagem, SV40 cauda poli A foi digerido com EcoRI e Sail, tratado com Klenow e o fragmento 2.3kb gel foi extraído. Os dois fragmentos foram ligados para criar um plasmídeo doador pHVT IG2 SV FWT SbfI (SEQ ID NO: 24) utilizado na infecção trans para gerar vHVT301 recombinante.
[0111] Um plasmídeo sintetizado sinteticamente, pHVTUS10 cds, contendo sequências de braço US10 de vHVT13 foi digerido com NotI, desfosforilada, e o fragmento de 4.7kb foi extraído em gel. A Notl franquada de fragmento 1,7 kb de um genótipo NDV-F Vlld sintetizadas quimicamente, códon otimizado foi Notl digerida e extraída por gel. Os dois fragmentos foram ligados para criar um plasmídeo doador pHVT EUA 10 cds F opt utilizado em transfecção para gerar vHVT302 recombinante. A transcrição do gene F inserido deve ser conduzido pelo promotor nativo US10 e ser finalizada pelo sinal poliA US10 nativa. Nenhum promotor exógeno ou polyA é adicionado para expressar essa inserção. A sequenciamento da região de inserção confirmou que vHVT302 contém a sequência correta do gene de NDV-F Vlld com códons otimizados, como mostrado na sequência do plasmídeo doador pHVT US10 cds opt F (SEQ ID NO: 25).
VHVT303
[0112] O plasmídeo sintetizado sinteticamente pHVT US10 cds contendo as sequências de braço US10 de vHVT13 foi digerida com NotI, desfosforilada, e o fragmento de 4.7kb foi extraído em gel. A Notl flanqueada de fragmento 1,7 kb de um genótipo V de NDV-F sintetisazo quimicamente, otimizado para códon, foi Notl digerido e gel extraído. Os dois fragmentos foram ligados para criar um plasmídeo doador pHVT US10 cds F CA02 opt utilizado na transfecção para gerar vHVT303 recombinante. Tal como acontece com vHVT302, a transcrição deste gene F inserida também deve ser conduzido pelo promotor nativo US10 e ser finalizada pelo sinal poliA US10 nativo. Nenhum promotor exógeno ou polyA é adicionado para expressar essa inserção. A sequenciamento da região de inserção confirmou que vHVT303 contém a sequência correta dos códons optimizados de NDV-F genótipo V como mostrado na sequência do plasmídeo doador pHVT US10 cds F CA02 (SEQ ID NO: 26).
vHVT304
[0113] O plasmídeo doador pHVTIG2SbfI contendo duas sequências Intergênica de braço de vHVT13 foi digerido com SbfI, desfosforilada, e o fragmento de 4,3 kb foi extraído em gel. Um plasmídeo sinteticamente sintetizados contendo um promotor de SV40 + códons optimizados de genótipo Vlld de NDV-F + cauda poliA sintética flanqueada por Sbfl foi digerido com SbfI e o fragmento de 2.3kb foi extraído em gel. Os dois fragmentos foram ligados para criar um plasmídeo doador pHVTIG2SV Fopt syn cauda utilizado na transfecção para gerar vHVT304 recombinante. O sequenciamento da região de inserção confirmou que vHVT304 contém as sequências corretas do promotor de SV40, o gene de NDV-F Vlld com códons otimizados, e a cauda poli A sintética, como mostrado na sequência do plasmídeo doador pHVT IG2 SV Fopt syn cauda (SEQ ID NO: 27).
vHVT307
[0114] O plasmídeo doador pHVT US2-SORF3 contendo sequências de braço SORF3 e US2 de vHVT13 foi digerido com SbfI, desfosforilado, e o fragmento de 5.1kb foi extraído em gel. O plasmídeo de SB-1 UL55 SV CaF syn SbfI cauda contendo um promotor de SV40 + códons optimizados de genótipo V de NDV-F + cauda poliA sintética flanqueada por SbfI foi digerido com SbfI e o fragmento de 2.3kb foi extraído em gel. Os dois fragmentos foram ligados para criar um plasmídeo doador pHVT US2 SV-FCA02 opt-synPA utilizado na transfecção para gerar vHVT307 recombinante. O sequenciamento da região de inserção confirmou que vHVT307 contém as sequências corretas do promotor de SV40, do gene de NDV-F Vlld com códons optimizados, e a cauda poli A sintética, como mostrado na sequência do plasmídeo doador pHVT US2 SV-FCA02 opt-synPA ( SEQ ID NO: 28).
Discussão
[0115] Um dos principais objetivos deste trabalho foi desenvolver um vetor aviário multivalente baseado em Herpesvírus, incorporando vários genes de proteção de interesse para uma cadeia principal de Herpesvírus aviário (por exemplo, HVT). Um pré-requisito para esta abordagem é definir cassetes de expressão contendo combinações promotor- gene-poli-apropriados e avaliar a sua estabilidade genética e capacidade de proteger contra a doença específica.
[0116] Para a finalidade de criar uma vacina trivalente vetor DM-IBD-ND eficaz, ou códons otimizados ou não- optimizado de sequências de genes (NDV)-F do Vírus da Doença de Newcastle foram clonados na cadeia principal vHVT13 (HVT- DII, uma vacina licenciada para proteger simultaneamente galinhas contra a MD e IBD) sob CMV humano (mouse CMV já é utilizado em vHVT13). Todos vHVT-IBD-F construídos sob promotor de CMV humano perderam a expressão de proteína-F dentro de seis passagens de se ou não a sequência de NDV-F tem códons otimizados e, independentemente, do local de inserção. A perda de expressão da proteína C foi rapidamente (dentro de duas passagens) quando hCMV foi combinado com proteína F com códons otimizados, em comparação com uma combinação de hCMV com F de tipo selvagem de sequência (a perda de expressão da proteína C no prazo de 6 passagens). Tomados em conjunto, os dados mostram que o CMV humano não é um promotor ideal para a produção de HVT recombinantes estáveis que expressam a proteína NDV-F. Surpreendentemente, este exemplo mostra que o promotor de SV40 e o promotor endógeno de HVT (promotor US10) geraram HVT recombinantes estáveis que expressam a proteína NDV-F.
Exemplo 4.2 Construção de vHVT202 Construção do Plasmídeo Doador HVT SORF3-US2 gpVar- Ewtsvn
[0117] Um fragmento que engloba a Variente sintética E de tipo selvagem do gene VP2 de IBDV (SEQ ID NO: 41 que codifica a SEQ ID NO: 42) foi excisado a partir de pUC57 Varient E plasmídeo em peso (sintetizado por GeneScript) utilizando NotI e inseridos no mesmo local SORF3 e US2 do plasmídeo contendo promotor gpCMV e uma cauda poli A sintética. O material ligado foi transformado usando kit Top 10 Oneshot (Cat # C404002, Invitrogen). As colônias bacterianas foram cultivadas em caldo de LBamp, plasmídeo extraído usando kit Qiagens MiniSpin Prep, e rastreadas para orientação de inserção utilizando digestão com HindIII + Saci. O plasmídeo doador correto foi designado pHVT SORF3-US2 gpVar-Ewt Syn. Tabela 6.2 mostra as características únicas para a construção em torno dos cassetes de expressão, incluindo as respectivas sequências. Culturas de larga escala foram desenvolvidas e a extração de plasmídeo foi realizada utilizando kit Qiagens Maxi Prep. A expressão transiente dos preps maxi foi verificada utilizando Reagente Fugene de transfecção em células de fibroblastos de embrião de galinha (CEF 's) e soros policlonais de galinha contra IBDV. Tabela 6.2 - Características dos cassetes de expressão de HVT duplo recombinante
Figure img0007
Geração Recombinante
[0118] Um processo de recombinação homóloga padrão foi seguido por co-eletroporação de células CEF secundárias usando plasmídeo doador pHVTSORF3-US2 gpVar-Ewt Syn e DNA viral isolado a partir vHVT306 e digerido com SbfI. vHVT306, expressando VP2 de IBDV clássico e NDV-F, foi escolhido como um parental para simplificar o processo de corte, tal como descrito abaixo. A variante do plasmídio doador E VP2 foi desenhado para substituir o gene F e recombinantes foram inicialmente selecionados por ausência de expressão do gene F e depois por PCR para detectar a presença da variante E VP2. Co-eletroporação foi realizada com l x l07 2 ° CEF em 300 l Opti-MEM e chocado com 150 volts com 950 capacitância em um tina de eletroporação de 2 mm. As células transfectadas foram semeadas em placa de 96 poços e incubou-se durante 5 - 7 dias. As células cultivadas em placas de 96 poços foram então repetida em duas placas de 96 poços e incubadas durante mais 5 dias. Um conjunto de placas de 96 poços foi usada para IFA utilizando soros policlonais de galinha contra NDV-F para identificar poços positivos que contêm os parentais vHVT306 e um outro conjunto de placas de 96 poços foi usado para recuperar as células infectadas dos poços IFA negativos.
[0119] Métodos de purificação de vírus recombinantes foram realizados primeiro por placa de 96 poços a duplicação e seleção IFA para os poços que contêm as placas mais negativa IFA (contra NDV-F) com a menor quantidade de placas positivas IFA. Poços combinando estes critérios foram então recolhidos e ajustados a 1 ml de DMEM + 2% de FBS. A partir do estoque 1ml 5 - 20 l (dependendo do número de placas visíveis) foram removidos e misturados com 1 X 107 de CEFs em 10 ml de DMEM + 2% de FBS e aliquotadas para uma nova placa de 96 cavidades, em uma tentativa para ter placas HVT individuais por poço. As placas de 96 poços foram duplicados após 4 dias de incubação e os poços que continham as placas foram testadas para a presença de HVT recombinante e ausência de vírus parental por IFA e por PCR. Novamente as cavidades que parecem ter mais vírus recombinante e menos vírus progenitor, por comparação dos resultados de bandas de PCR, foram recolhidas e ajustadas a 1 ml e aliquotas em novas placas de 96 poços (a mesma como antes). Depois de cinco ciclos de purificação de células infectadas pelo vírus, de HVT recombinante contendo duas proteínas de IBDV VP2 foi isolado e a pureza do vírus recombinante foi testada por PCR para confirmar a ausência de vírus parental.
[0120] O sequenciamento da região de inserção confirmou que vHVT202 contém as sequências corretas do promotor CMV de cobaia, o gene tipo selvagem de VP2 de variante IBDV E, e a cauda poli A sintética, como mostrado na sequência do plasmídeo doador HVT SORF3-US2-gpVar Ewtsyn (SEQ ID NO: 39).
Análise de Recombinação por PCR
[0121] O DNA foi extraído a partir de um estoque de vírus por extracção com fenol / clorofórmio, precipitado com etanol e ressuspenso em 20 mM de HEPES. Os iniciadores de PCR foram desenhados especificamente para identificar o gene de E Varient em peso, promotor, a poliA, bem como, a pureza do vírus recombinante a partir do vírus HVT parental. O PCR foi realizado utilizando 200 ug de DNA molde, juntamente com os pares de primers específicos indicados na tabela 1, as condições dos ciclos de PCR são como se segue (a menos que indicado de outra forma): De 94 ° C - 2 min; 30 ciclos de 94° C - 30 segundos, 55° C - 30 segundos, 68° C - 3 min; 68° C - 5 min.
[0122] A pureza dos vírus recombinantes foi verificada por meio de PCR utilizando os pares de iniciadores que são específicos para os braços HVT flanqueados, o promotor gpCMV, o gene Varient E e a cauda sin. Os iniciadores, específicos para SB1, MDV do serotipo 2 (SB1US1.FP + SBlSorf4.RP) foram também incluídos na análise. Os resultados da PCR demonstram que o vírus recombinante vHVT202 carrega o cassete de expressão pretendido e o estoque de vírus está livre de quantidades detectáveis de vírus HVT parental.
Coloração por imunofluorescência do vírus recombinante vHVT202 expressando duas proteínas VP2 de IBDV
[0123] Para os testes de imunofluorescência, o material P3 foi diluído 1:100 em meio. Aproximadamente 50 l do vírus diluído foi adicionado a 10 ml de DMEM + 2% FBS com l x l07 CEFs e então divididos em alíquotas para uma placa de 96 poços (100 l / poço). As placas foram incubadas durante 4 dias a 37° C, 5% C0 2 até as placas virais tenha sido visíveis. As placas foram fixadas com 95% de acetona gelada durante três minutos e lavadas três vezes com PBS. Um poço foi usado para a anti-soros de galinha contra o vírus da Doença de Newcastle (lote # C0139, Charles Rivers Laboratory) em 1:1000 foi adicionado e as placas foram incubadas a 37° C durante 1 hora. A outra foi usada também para anti-soros de galinha contra o IBDV (lote # G0117) Após uma hora de incubação, as placas foram lavadas três vezes com PBS e FITC anti-galinha (cat # F8888, Sigma) foi adicionado a 1:500. Mais uma vez, as placas foram incubadas a 37° C durante 1 hora. Após uma hora de incubação, as células foram lavadas três vezes com PBS e visualizadas com um microscópio fluorescente utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC) de filtro.
[0124] Os resultados da coloração de imunofluorescência indicam que vHVT202 exibiram uma expressão da proteína VP2 muito forte, quando foram utilizados os soros policlonais contra proteínas VP2 E tanto clássicos e variantes.
Conclusão
[0125] Com base em PCR e análise por imunofluorescência, vHVT202 é um HVT recombinante, no qual um gene de VP2 de IBDV variante E sob o controle do promotor gpCMV foi introduzido com sucesso em uma base de HVT recombinante que já expressa o gene de VP2 de IBDV clássico. Consequentemente vHVT202 carrega dois genes VP2 da variante E e IBDV clássica e é livre de qualquer vírus vHVT306 parental detectável.
Exemplo 5 Construção de vSBl-009, vSBl-004, vSBl-006, vSBl- 007, vSBl-008, e vSBl-010 recombinante expressando NDV-F Exemplo 5.1 Construção de vSBl-009, vSBl-004, vSBl-006, vSBl- 007, e 008-vSBl
[0126] O objetivo deste estudo é o de construir um vetor viral recombinante VSB 1-009 de SB-1, em que um cassete de expressão contendo o promotor de SV40 e a proteína de fusão do vírus da doença de Newcastle (NDV-F) é introduzido para substituir a sequência de codificação UL44 (gC ) de SB-1.
[0127] Um plasmídeo doador PSBL 44 cds SV FCAopt foi construído contendo braços UL44 flanqueado de vírus SB1, o promotor de SV40 e a sequencia do códon NDV F do gene otimizado (SEQ ID NO: 5, que codifica para a SEQ ID NO: 6).
Geração de vírus Recombinantes
[0128] Um processo de recombinação homóloga padrão foi seguido por co-electroporação de células CEF secundárias usando plasmídeo doador PSBL 44 cds SV FCAopt e DNA virais isoladas de CEFs infectadas SB-1 do vírus. Essencialmente, o processo descrito no exemplo 1 para vHVTl 14 foi seguido para gerar, purificar e caracterizar placas recombinantes por imunofluorescência.
[0129] Depois de cinco ciclos de purificação de placas, o vírus recombinante puro (VSB 1-009) foi isolado e a pureza do VSB 1-009 foi testado por IFA e por PCR para confirmar a inserção apropriada, bem como nenhum vírus parental remanescente.
Análise por PCR
[0130] O DNA viral foi extraído do VSB 1-009 pré-master vírus semente (pré-MSV) estoque por QIA DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen cat # 69506). Os iniciadores de PCR foram concebidos para identificar a presença do NDV F optimizado, o tipo selvagem de NDV F, o promotor de SV40, o promotor de mCMV, braços UL44 de flanqueamento de SB-1 e vírus HVT. As amplificações de PCR foram realizadas utilizando cerca de 200 ng de molde de DNA, juntamente com os pares de iniciadores.
[0131] A amplificação por PCR com diferentes iniciadores confirmou que o vSBl-009 tem os padrões de amplificação esperado e amplicons.
Análise da Expressão
[0132] imunofluorescência indireta (IFI) foi realizada sobre o estoque pré-MSV VSB 1-009 para examinar a expressão de gene NDV F e antígeno do vírus SB-1. As CEFs que foram inoculadas com 1-009 VSB foram fixadas com gelo frio de 95% de acetona durante três minutos à temperatura ambiente e durante 10 min, secou-se ao ar. As placas foram lavadas com PBS, em seguida, dois anticorpos primários anti- soro de galinha de viris da doença de Newcastle (Charles Rivers Laboratories cat # 10100641, lote # C0117A) a 1:500 e de diluição do anticorpo monoclonal contra Y5.9 SB-1 do vírus (Merial Select , Gainesville, GA) a 1: 3000 de diluição foram adicionados e as placas foram incubadas durante 45 min a 37° C. Após três lavagens com PBS, dois anticorpos secundários, de cabra anti-IgG de galinha com fluoresceína (KPL cat # .0224-06, lote # 10020 l) a 1:500 de diluição e de burro anti- IgG de ratinho-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe # A10037, lote # 989784) a 1: 250 diluição foram adicionados. As placas foram incubadas a 37° C durante 45 min e seguido de três lavagens com PBS. Os poços foram examinados para placas positivas de IFA com um microscópio fluorescente utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC) e isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC)-filtros de Nikon Eclipse Ti microscópio invertido. De igual modo, a reatividade dos VSB 1-009 com NDV F Mab foi analisada por dupla IFA usando anti- soro de MDV (Charles River Laboratories, cat # 10100628, lote # D0111) (1/300) e diluição do anticorpo monoclonal anti-F de NDV (1 / 300 diluição) como anticorpo primário. A cabra anti- galinha com IgG-fluoresceína (KPL cat # .02-24-06, lote # l 10020) (1: 500 de diluição) e burro anti-IgG-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe # A10037, lote # 989784) (1: 250 de diluição) foram utilizados como anticorpos secundários. Os poços foram observados para identificar as placas positivas IFA com um microscópio fluorescente utilizando-FITC e TRITC- filtros de Nikon Eclipse Ti microscópio invertido.
[0133] os resultados indicam que o IFA VSB 1-009 expressa a proteína F de NDV em CEF infectadas com vírus. Mais de 500 placas VSB 1-009 foram contadas para a expressão da proteína de NDV F, bem como a expressão da proteína específica SB-1 com vírus dupla IFA. A expressão da proteína de NDV F completamente combinada com a expressão do antígeno do vírus SB-1 em cada placa de vírus (Tabela 7). Tabela 7 - IFA duplo de vSB1-009
Figure img0008
[0134] Reatividade de NDV F Mab foi confirmada pelo IFA duplo. Mais de 200 placas VSB-1-009 foram examinadas para reatividade NDV F Mab, bem como reatividade do soro anti-MDV. A reatividade com NDV F Mab completamente combinada com reaatividade do soro anti-MDV em cada placa de vírus (Tabela 8). Reatividade do VSB 1 -009 com anti-ND VF Mab
Figure img0009
Análise de Southern Blot
[0135] DNA genômico total foi extraído de VSB 1-009 pré- MSV a partir de estoque de CEFs infectadas. O DNA genômico de VSB 1-009, SB-1 do vírus (controle negativo), 44 PSBL cds SV FCA opt plasmídeo doador foram digeridos a 37° C, com EcoRI, NcoI, e endonucleases de restrição Kpnl separadamente. Os fragmentos de restrição foram separados por eletroforese em gel de agarose a 0,8% e transferido para uma membrana de nylon carregada positivamente. Após a transferência, a membrana foi tratada com NaOH 0,4 M e, em seguida, neutralizou-se com tampão 2 X SSC-HC1. A membrana foi então seca ao ar e reticulada em UV.
[0136] Após a hibridização e Kit Nortfi2South quimioluminescente Detection (Thermo Scientific cat # 89880) as instruções dos fabricantes, a membrana foi pré-hibridizada durante 1 hora e, em seguida, hibridizda com a sonda, a 55° C durante a noite. Para hibridização, utilizaram-se duas sondas; 1) o fragmento Sbfl de PSBL 44 cds SV FCA opt como sonda cassete NDV F, 2) o fragmento Smal-EcoRI de pUC57 SB1 44 braço (GenScript) como sonda de recombinação de braço. Após a hibridização durante a noite, diversas lavagens a rigor foram conduzidas até que a membrana tenha sido colocada em um tampão de bloqueio, com a adição de Streptavidin-HRP. Após a lavagem da membrana de qualquer desacoplado Estreptavidina-HRP, foram adicionados a solução de substrato de luminal e peróxido. A membrana foi, então, exposto a película de raios-X e a membrana foi revelada.
[0137] Os resultados de Southern blot foram como o esperado com base na análise do mapa do Vetor NTI. O cassete NDV F (Promotor SV40, gene de códon otimizado NDV-F CA02) substituiu as sequências de codificação UL44 do vírus SB-1.
Análise genômica
[0138] O DNA genômico de material VSB 1-009 pré-MSV foi realizado por determinação da sequência de nucleotídeos da região de recombinação do braço, bem como cassetes de genes inseridos. Os iniciadores foram concebidos e utilizados para amplificar o cassete inteira do gene de NDV-F, incluindo os braços de recombinação.
[0139] A sequEncia vSB1-009 seqüência (doador do plasmídeo pSB1 44 cds SV FCAopt) contendo os braços recombinantes, promotor SV40 e códon de gene-optimizado NDV F foi confirmado para estar corretos como mostrado na SEQ ID NO: 19.
Análise de Western blot
[0140] A monocamada CEF estava infectado com VSB 1 -009 pré-MSV em MOI - 0,1. Após uma incubação de 5 dias, as CEFs foram sedimentadas e lavadas com PBS, seguido por lise com tampão de lise de kit IP / agua de pedaços de IP clássicos o (Thermo Scientific cat # 26146) de acordo com os protocolos dos fabricantes. O lisado foi pré-clareado e incubado com 100 l de anticorpo monoclonal anti-F de NDV para tornar o complexo imune. O complexo imune foi capturado pela proteína A / G Plus agarose e após a remoção do complexo imune delimitada por passos de lavagem, 50 1 de tampão de amostra foi utilizado para eluir sob condições não redutoras. As CEFs não infectadas foram incluídas como um controle. 20 1 de amostras eluídas foram separadas em 10% Bis-Tris gel por eletroforese. Após a eletroforese, as proteínas separadas no gel foram transferidas para uma membrana de PVDF. A Proteína de Detecção TMB Western Blot Kit (KPL comer # 54 - 11-50) foi usado para detectar o NDV antígenos para membrana PVDF com frango anti-NDV soro (Charles River Laboratories Laboratories cat # 0100641 l, lote # C0117A) e cabra anti-IgG de galinha- peroxidase conjugada (KPL cat # 14-24-06) seguindo os protocolos dos fabricantes.
[0141] A expressão da proteína de NDV F de VSB1 -009 foi confirmada por duas etapas de imunodetecção. Em primeiro lugar, as proteínas NDV F expressas a partir de VSB 1-009 infectado lisado de CEF foram capturadas pela imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-NDV F anticorpo monoclonal 001C3. Análise de Western blot utilizando subsequentemente anti-soro policlonal de NDV (Charles River Laboratories cat # l 0.100.641, lote # C0117 A) foi utilizada para a detecção da proteína de NDV F nas amostras captadas (complexos anticorpo-proteína monoclonal de NDV F) (fig. 9). Uma proteína de cerca de 55 kDa em VSB 1-007 pré-MSV lisada foi detectada por soro anti-NDV que corresponde ao tamanho esperado da proteína de fusão Fl NDV (Fig. 9).
[0142] Geração e caracterização de HVT recombinantes vSB1-004, vSB1-006 1, vSB1-007 e vSB1-008 foram feitas essencialmente da mesma maneira que para VSB1-009 descrito neste exemplo. A Tabela 9.1 mostra as características únicas de cada construção em torno dos cassetes de expressão, incluindo as respectivas sequências. A geração e a caracterização dos vetores virais SB recombinantes foram também descritas no pedido de patente Norte-americano N° US 13/689,572 depositado em 29 de novembro de 2012 (Merial Limited), a qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Tabela 9.1 - Características dos cassetes de expressão de SB1 recombinantes
Figure img0010
Exemplo 5.2 - Construção do duplo constructo vSBl-010 Constructo do Plasmídeo Donor SB1US2 gpVIIdwtsyn
[0143] Utilizando o plasmídeo HVT SOrf3-US2 gpVar-Ewt Syn, o gpCMV, Varient E, cauda Syn foi removido por digestão SbfI. Este fragmento foi ligado ao plasmídeo doador SB1 US2. O gene Varient E foi cortado por Notl e substituído por NDV-F Vlld wt. O gene sintético de NDV-F Vlld tipo selvagem (SEQ ID NO: 3 que codifica a SEQ ID NO: 4) foi excisado a partir do plasmídeo pUC57 NDV-F Vlld wt (sintetizado por GeneScript) utilizando digestão NotI. O material ligado foi transformado usando kit Top 10 Oneshot (Cat # C404002, Invitrogen). As colônias bacterianas foram cultivadas em caldo de LBamp, plasmídeo extraído usando kit Qiagens MiniSpin Prep, e rastreadas para orientação de inserção utilizando digestão com Ncol + Sall. O plasmídeo doador correto foi designado PSBL US2 gpVlldwt Syn. A Tabela 9.2 mostra as características únicas para a construção em torno dos cassetes de expressão, incluindo as respectivas sequências. Culturas de larga escala foram desenvolvidas e a extração de plasmídeo foi realizada utilizando kit Qiagens Maxi Prep. A expressão transiente dos preps maxi foi verificada utilizando Reagente de transfecção Fugene em células de fibroblastos de embrião de galinha (CEF's) e soros policlonais de galinha contra NDV-F.
Geração Recombinante
[0144] Um processo de recombinação homóloga padrão foi seguido por co-eletroporação de células CEF secundárias usando plasmídeo doador PSBL US2 gpVIIdWt Syn e DNA viral isolado a partir de vSB1-009 (vSB1-009 já é um vírus recombinante que exprime o gene CA02 F de NDV). Essencialmente, o processo descrito no exemplo 1 para vHVTl14 foi seguido para gerar, purificar e caracterizar placas recombinantes por imunofluorescência.
[0145] Depois de cinco ciclos de purificação de placas, o vírus recombinante puro (vSB1-010) foi isolado e a pureza do vSBl-010 foi testado por IFA e por PCR para confirmar a inserção apropriada, bem como nenhum vírus parental remanescente. Tabela 9.2 Características do cassete de expressão de vSBl- 010
Figure img0011
[0146] O sequenciamento da região de inserção confirmou que vSB 1-010 contém as sequências corretas do promotor de CMV de cobaia e o gene de NDV-F Vlld wt como mostrado na sequência do plasmídeo doador SB1US2 gpVIIdwtsyn (SEQ ID NO: 40).
Análise de Recombinação por PCR
[0147] O DNA foi extraído a partir de um estoque de vírus por extração com fenol / clorofórmio, precipitado com etanol e ressuspenso em 20 mM de HEPES. Os iniciadores de PCR foram desenhados especificamente para identificar o gene de NDV-F Vlld wt, o promotor, a poli A, bem como, a pureza do vírus recombinante a partir de vírus parental SB1. O PCR foi realizado utilizando 200 μg de DNA molde, juntamente com os pares de iniciadores indicados indiciados na Tabela 1. As condições dos ciclos de PCR são como se segue (a menos que indicado de outra forma):de 94° C - 2 min; 30 ciclos de 94° C - 30 segundos, 55° C - 30 segundos, 68° C - 3 min; 68° C - 5 min.
[0148] A pureza dos vírus recombinantes foi verificada por meio de PCR utilizando os pares de iniciadores que são específicos para os braços flanqueadores SB1, o promotor gpCMV, o gene de NDV-F wt Vlld e a cauda syn. Os iniciadores, específicos para HVT, MDV do serotipo 3 (MB080 + MB081) também foram incluídos na análise. Os resultados da PCR demonstram que o vírus recombinante vSBl-010 carrega o cassete de expressão pretendido e o estoque de vírus está livre de quantidades detectáveis de vírus parental SB1-009.
Coloração imunofluorescente do vírus recombinante vSBl-010 expressando duas proteínas NDV-F
[0149] Para os testes de imunofluorescência, o material P3 foi diluído 1:100 em meio. Aproximadamente 50 1 do vírus diluído foi adicionado a 10 ml de DMEM + 2% FBS com l x l07 CEFs e então divididas em alíquotas para uma placa de 96 poços (100 l / poço). As placas foram incubadas durante 5 dias a 37° C, 5% C02 até as placas virais fossem visíveis. As placas foram fixadas com 95% de acetona gelada durante três minutos e lavadas três vezes com PBS. Anti-soros de galinha contra o vírus da doença de Newcastle (lote # C0139, Charles Rivers Laboratory) em 1:1000 foi adicionado e as placas foram incubadas a 37° C durante 1 hora. Após uma hora de incubação, as placas foram lavadas três vezes com PBS e FITC anti- galinha (cat # F8888, Sigma) foi adicionado a 1:500. Mais uma vez, as placas foram incubadas a 37 ° C durante 1 hora. Após uma hora de incubação, as células foram lavadas três vezes com PBS e visualizadas com um microscópio fluorescente utilizando filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC).
[0150] Os resultados da coloração imunofluorescentes indicam que vSBl-010 exibiram uma expressão da proteína de NDV-F muito forte quando foi utilizado o soro policlonal contra ambas proteínas CA02 e Vlld F de NDV.
Conclusão
[0151] Com base em testes de PCR e análise de imunofluorescência, vSBl-010 é um SB-1 recombinante, em que o gene VII dF de NDV sob o controle do promotor gpCMV foi introduzido com sucesso em um vSB1-009, que já expressa o gene CA02-F de NDV. Consequentemente vSBl-010 transporta genes tanto genótipos Vlld e CA02 F de NDV e é livre de qualquer VSB 1-009 parental detectável.
Exemplo 6 - Eficácia da vHVT110, vHVTlll, vHVT114 e vSBl-004 expressando o gene NDV F contra desafios com cepas NDV de Chimalhuacan e Malásia (MAL04-01), aos 14 dias de idade nas galinhas SPF
[0152] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia de três constructos recombinantes HVT (vHVTl10, vHVT111 e vHVTl14) e um constructo SB1 recombinante (vSB1-004) expressando o gene NDV F contra os desafios da doença de Newcastle (cepas dos vírus Chimalhuacan e Malásia), realizado aos 14 dias de idade em galinhas SPF.
[0153] As características destes cinco candidatos a vacinas encontram-se descritos na Tabela 10 abaixo. Tabela 10 - Características dos vetores utilizados no estudo de desafio
Figure img0012
[0154] Em D O (zero), galinhas SPF de 100 dias de idade foram distribuídas aleatoriamente em 10 grupos de 10 aves. As aves foram injetadas por via subcutânea no pescoço no D 0 com 0,2 mL das vacinas recombinantes, contendo uma dose alvo de 2000 pfu, como descrito na Tabela 11 abaixo. Refira-se que o título do vSB1-004 (31600 pfu), administrado às aves dos grupos 6 foi bem acima da meta. As aves foram desafiadas por via intramuscular em D14 com velogénica ND cepa Malásia (genótipo Vlld) (subgrupos "a") ou com cepa virulenta (genótipo V) ND Chimalhuacan (sub-grupos "b"). Tabela 11 estudo Challenge com vHVT 110, vHVT 111, 114 e vHVT VSB 1 -004
Figure img0013
[0155] Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Os sinais clínicos após o desafio foram marcados por dia da seguinte forma: saudável / com sintomas específicos (penas eriçadas, prostração, torcicolo, tremor) / morto. No D14, as amostras de soro foram coletadas em cada grupo para a sorologia (teste de inibição da hemaglutinação do vírus da Doença de Newcastle (HI)).
[0156] Tal como esperado, os animais não vacinados (GLA e GIB) apresentaram nenhum anticorpo NDV em D14. A seroconversão de baixo título (HI significa título < 0,6 log 10) foi obtido em cada um dos grupos vacinados (sub-grupos de "a" e "b" de G2 para G5) confirmando a vacina precisa. O número de aves positivo / total de testado foi dependente do grupo e foi a mais elevada (90%) em vHVTl14 de aves vacinadas (ver tabela acima).
[0157] As porcentagens de proteção contra a mortalidade e morbidade são relatados na tabela acima. Susceptibilidade completa foi observada nos grupos de controle Gla e Gib validando, assim, a alta gravidade de ambos os desafios. Níveis de proteção mais baixos foram observados nos grupos vacinados com vHVTl11 ou VSB 1-004. Taxas de proteção mais elevados contra a morbidade e mortalidade foram obtidas nos grupos vacinados com vHVTl10 ou vHVTl14 qualquer que seja a cepa desafio utilizada (cepa homólogo ou seja, genótipo Malásia Vlld ou cepa heteróloga, ou seja, genótipo V de Chimalhuacan). Houve correlação entre a % de aves positivas pelo teste HI antes do desafio e da % de proteção.
[0158] A diferença de proteção obtida entre vHVTl10 e vHVTl11 ilustra claramente a importância do promotor, o promotor IE do mCMV sendo mais potente do que o promotor de SV40 para a transcrição do genótipo tipo selvagem (wt) do gene F Vlld. A diferença de proteção obtida entre vHVTl11 e vHVTl14 ilustra a importância da sequência de nucleotídeos do gene F, a sequência otimizada de ser mais potente do que a a sequência do tipo selvagem (ou nativa).
[0159] Em conclusão, os resultados deste estudo demonstraram a importância do promotor e a sequência de nucleotídeos do gene F na proteção ND induzida por vacinas de vetor da doença de Marek. Uma combinação ideal desses fatores precisa ser encontrado para alcançar as melhores performances de eficácia como para vHVTl14.
Exemplo 7 - Eficácia de vHVT114, vHVT116, vHVT301, vHVT302 e vHVT303 expressando o gene NDV F contra desafios com cepas NDV Texas GB aos 14 dias de idade em galinahs SPF
[0160] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia de 2 constructos únicos de HVT recombinantes (vHVTl14 e vHVTl16) que expressam o gene NDV F e 3 constructos duplos de HVT recombinantes (vHVT301, vHVT302 e vHVT303) expressando tanto NDV F e genes VP2 IBDV contra o desafio da doença de Newcastle (cepas Texas GB, genótipo II) realizada aos 14 dias de idade em galinhas SPF.
[0161] As características destes quatro candidatos a vacinas encontram-se descritos na Tabela 12 abaixo. Tabela 12- Características dos vetores utilizados no estudo de desafio
Figure img0014
* vHVT13 é o ingrediente ativo da vacina licenciada Vaxxitek HVT-DII com base em um vetor HVT expressando o gene VP2 de IBDV (ver patentes US 5,980,906 e EP 0 719 864).
[0162] No DO, galinhas SPF de 120 dias de idade foram distribuídas aleatoriamente em 6 grupos de 20 aves. As aves foram injetadas por via subcutânea no pescoço no OD com 0,2 mL das vacinas recombinantes, contendo uma dose alvo de 1.000 pfu, como descrito na Tabela 13 abaixo. As aves foram desafiados por via intramuscular em D14 com 4,5 log 10 de cepa velogênica DIO50 ND Texas GB (genótipo II). Tabela 13 - Resultados de eficácia
Figure img0015
[0163] Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Sinais clínicos NDV e mortalidade foram registrados após o desafio.
[0164] Os porcentagens de proteção clínica são relatados na tabela acima. susceptibilidade completa foi observada no grupo de controle desafiados não vacinados Gl validando, assim, a elevada gravidade de ambos os desafios. Proteção parcial foi observada para os cinco candidatos a vacinas, sendo as melhores performances obtidas com vHVTl14 e vHVTl16. Entre os recombinantes duplos HVT, o vHVT302 foi o mais protetor. É um desempenho melhor do que vHVT303 sugerindo que o genótipo otimizado do gene Vlld NDV F pode ser melhor proteção-cruzada contra genótipo II desafio que o genótipo otimizado do gene V NDV F. Uma tendência semelhante foi observada com o único HVT, o vHVTl 14 (gene Vlld) realizando um pouco melhor do que vHVTl16 (gene V), mas a diferença foi menos acentuada. Estes resultados indicam que ambos os genótipos dos genes Vlld e V NDV F inseridos no vetor HVT fornece proteção cruzada contra um heteróloga genótipo II desafio NDV; o gene Vlld podem potencialmente ser mais cruzada protectora. O vHVT302 induziu uma melhor proteção do que vHVT301 ND confirmando a importância do promotor, poli-A e do locus de inserção. Em conclusão, os resultados deste estudo demonstraram a proteção precoce muito boa ND induzida por vacinas testadas do vetor da doença de Marek, em particular para o único HVT-ND testado.
Exemplo 8 - Eficácia de vHVT114, vHVT116, vSBl-007, vSBl-008 (sozinho ou com vHVT13) e vHVT304 contra desafios com NDV ZJ1 (genótipo Vlld) e California/02 (genótipo V) aos 21 dias de idade em galinhas SPF
[0165] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia de 2 constructos únicos de HVT recombinantes (vHVTl 14 e vHVTl 16), 2 constructos recombinantes SB1 (VSB 1-007 e VSB 1-008) que expressam o gene NDV F e um duplo HVT recombinante (vHVT304) contra o desafio da doença de Newcastle com NDV ZJ1 (genótipo Vlld) e California/02 (genótipo V) realizada aos 21 dias de idade em galinhas SPF.
[0166] As características destes cinco candidatos a vacinas encontram-se descritas na Tabela 14 abaixo. Tabela 14 - Características dos vetores utilizados no estudo de desafio
Figure img0016
*VHVT13 é o ingrediente ativo da vacina licenciada Vaxxitek HVT-DII com base em um vetor HVT expressando o gene VP2 de IBDV (ver patente US 5,980,906 e EP 0 719 864).
[0167] No DO, aves SPF de 158 dias de idade foram distribuídas aleatoriamente em 6 grupos de 24 aves (vacinadas) e um grupo de 12 aves (controles não vacinados). As aves foram injetadas por via subcutânea no pescoço no OD com 0,2 mL das vacinas recombinantes contendo uma dose alvo de 1.000 pfu, como descrito na Tabela 15 abaixo. As aves foram então separadas em dois sub-grupos, cada sub-grupo que está sendo desafiado pela via intramuscular em D21 com 5 log 10 EID50 de tanto cepa NDV ZJ1 (genótipo Vlld) quanto cepa velogênica California/02 (genótipo V). Tabela 15 - Resultados de eficácia
Figure img0017
[0168] Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Os problemas técnicos observados com isoladores reduziu o número de aves no grupo 2 (vHVTl 14: de 24 a 14) e no grupo 3 (vHVTl 16: de 24 a 20). Sinais clínicos NDV foram registrados após o desafio. O soro foi coletado de amostras de sangue de aves de grupos 2 e 7 antes do desafio (D21) para NDV sorologia por meio do teste HI utilizando cepas cada desafio como antígeno.
[0169] Média sorológica de títulos IH em G2 e G7 antes do desafio são apresentadas na Figura 10. Títulos IH foram maiores com o antígeno ZJ1 em ambos os grupos. Os títulos de anticorpos inibidores induzidos por vHVTl 14 foram superiores as induzidas por vHVT304.
[0170] As porcentagens de proteção contra a mortalidade e morbidade são relatados na tabela acima. Susceptibilidade completa foi observada no grupo de controle desafiados não vacinados Gl validando, assim, a elevada gravidade de ambos os desafios. Todas as vacinas induziu níveis elevados (> 75%) de proteção contra ambos os desafios. Proteção clínica completa contra os dois desafios foi induzida por vHVTl14 e VSB 1-008. Seguindo uma tendência semelhante, como os títulos de anticorpos inibidores, a proteção induzida por ND de vHVT304 foi ligeiramente mais baixa do que a induzida por vHVTl14.
[0171] A proteção foi avaliada após o desafio por RT-PCR em tempo real em swabs orais e cloacais tomadas 2 e 4 dias após o desafio. Porcentagemagem de aves positivas (Ct <40) são mostradas para os dois desafios na FIG. 11 A e 11B. Note- se que todos as 6 aves estavam mortas em 4 DPCH no grupo controle desafiados com o isolado CA/02 e apenas uma ave (de 6) ainda estava viva a 4 DPCH no grupo controle desafiados com ZJ1. proteção foi detectada em todas as aves controle. A redução da porcentagemagem de positivos para a proteção de aves foi observada em todos os grupos vacinados.
[0172] Em conclusão, os resultados deste estudo demonstraram a proteção muito boa ND com 3 semanas de idade induzidas por vacinas de vetor de doenças de Marek testadas.
Exemplo 9 - Eficácia de vacinas vHVTl 14, vSBl-007, vSBl-009, vHVT306 e vHVT307 contra desafios com cepas NDV Texas GB aos 28 dias de idade em aves SPF.
[0173] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia das combinações de diferentes vacina de vetor de Doença de Marek expressando o gene NDV F e / ou o VP2 de IBDV contra o desafio da doença de Newcastle (cepa Texas GB, genótipo II) realizada aos 28 dias de idade em aves SPF.
[0174] As características dos cinco candidatos a vacinas recombinantes testados neste estudo estão descritos na Tabela 16 abaixo. Tabela 16 - Características dos vetores utilizados no estudo de desafio
Figure img0018
[0175] As vacinas do vírus sorotipo 1 da doença de Marek sorotipo 1 (cepa CVI988 (ou Rispens); herpesvírus Gallid 2) e o serotipo 2 (cepa SB-1; herpesvírus Gallid 3) foram usados também em combinação com os vírus recombinantes em alguns dos grupos.
[0176] No DO, aves SPF de 135 dia de idade foram distribuídas aleatoriamente em 9 grupos de 15 aves. As aves foram injetadas por via subcutânea no pescoço no DO com 0,2 mL contendo uma dose alvo de 2.000 pfu para vacinas recombinantes (vSB1-007, vSB1-009, vHVT13, vHVT306, vHVT307, vHVTl14), e 1000 pfu para cepas parentais vacinais da doença de Marek (SB-1 e CVI988). O design dos nove grupos é apresentado na Tabela 17 abaixo. As aves foram desafiadas por via intramuscular em D28 com 4,0 log 10 de DIO50 cepa velogénica ND Texas GB (genótipo II). Tabela 17 - Resultados de eficácia
Figure img0019
[0177] Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Foram registrados sinais clínicos de NDV após o desafio.
[0178] As porcentagens de proteção contra a mortalidade e morbidade são relatadas na tabela acima. A susceptibilidade completa foi observada no grupo de controle desafiados não vacinados Gl validando, assim, a alta severidade do desafio. Excelentes níveis de proteção foram observadas em todos os grupos vacinados. Aves dos grupos G3, G6, G7 e G9 foram totalmente protegidas. Este estudo mostra que os candidatos vSBl-ND podem ser co-administrados com vHVT13 e CVI988 e ainda fornecer uma proteção muito boa de ND. Da mesma forma, duplo HVT-DII + ND são compatíveis com o SB-1 e vHVT-ND (vHVTl14) é compatível com vHVT13 e SB-1.
[0179] Em conclusão, os resultados deste estudo mostraram a ausência de interferência sobre a proteção ND induzida por vacinas de vetor e parental de doença de Marek testada.
Exemplo 10 - Eficácia de vHVT114, vHVT307, vSBl-007 e vSBl- 009 em combinação com vHVT13 contra desafios com cepas NDV Chimalhuacan (Genótipo V) no D28 em aves SPF.
[0180] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia de um constructo recombinante HVT (vHVTl 14) e 2 constructos SB1 recombinantes (vSB1-007 e vSB1-009) expressando o gene NDV F em combinação com vHVT-IBD (vHVT13), bem como um duplo HVT vHVT307 expressando tanto NDV F quanto IBDV VP2 contra o desafio da doença de Newcastle (Chimalhuacan, genótipo V) realizada aos 28 dias de idade em aves SPF.
[0181] As características destes quatro candidatos a vacinas encontram-se descritos na Tabela 18 abaixo. Tabela 18 - Características dos vetores utilizados no estudo de desafio
Figure img0020
[0182] No DO, 45 aves SPF de um dia de idade foram distribuídas aleatoriamente em 4 grupos de 10 aves e um grupo de cinco aves (grupo controle não vacinado). As aves foram injetadas por via subcutânea no pescoço no OD com 0,2 mL das vacinas recombinantes, contendo uma dose alvo de 2.000 pfu, como descrito na Tabela 19 abaixo. As aves foram desafiados por via intramuscular em D28 com 5,0 log 10 de DIO50 cepa velogênica Chimalhuacan (genótipo V). Tabela 19 - Resultados de eficácia
Figure img0021
[0183] Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Sinais clínicos NDV foram registrados após o desafio. Amostras de orofaringe foram tomadas nos grupos vacinados em 5 e 7 dias após o desafio para avaliar a carga viral por RT- PCR em tempo real.
[0184] As porcentagens de proteção contra a mortalidade e morbidade são relatadas na tabela acima. A susceptibilidade completa foi observada no grupo de controle desafiados não vacinados Gl validando, assim, a alta severidade de desafio. Muito boa proteção foi observada em todos os 4 grupos vacinados, uma proteção clínica completo que está sendo induzida pelo vHVTl 14 + vHVT13.
[0185] A porcentagemagem de aves positivas e a média de título de proteção (expresso como log 10 de EID50 equivalentes por ml) são mostrados na FIG. 12A e 12B. Surpreendentemente, nenhuma proteção foi detectada no G2, indicando uma completa proteção ND (contra ambos os sinais clínicos e proteção) induzida por vHVTl14 mesmo co- administrado com vHVT13, nas condições testada. Os níveis de proteção detectados nos outros grupos vacinados eram baixos, com um nível ligeiramente mais elevado detectado no G3 (vHVT307) no 5 ° dia pós-infecção (pi) somente.
[0186] Em conclusão, este exemplo ilustra ainda mais a excelente proteção ND induzida por duplo HVT-IBD + ND recombinante ou uma combinação de vírus SB1-ND ou HVT-ND e HVT-IBD (vHVT13) recombinantes. Contrariamente à crença geral de que o campo de uma segunda vacina de HVT (vacinas de HVT regulares ou vacinas recombinantes HVT) interfere com a imunidade para os genes estranhos inseridos na primeira vacina de HVT recombinante, a presente invenção mostrou resultado surpreendente que vHVTl14 em combinação com vHVT13 ofereceu excelente proteção contra NDV e nenhum efeito foi observada de interferência.
Exemplo 11 - Eficácia de vHVT306, vSBl-008 em combinação com vHVT13 administrado por SC ou em rota ovo contra o desafio com cepa NDV Chimalhuacan (genótipo V) no D28 em aves SPF.
[0187] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia do duplo HVT vHVT306 expressando NDV F e os genes de VP2 de IBDV, e o VSB 1-008 SB1 recombinante expressando o gene NDV F em combinação com vHVT-IBD (vHVT13), administrado por in ovo ou por via subcutânea contra o desafio da doença de Newcastle (Chimalhuacan, genótipo V) realizada aos 28 dias de idade em aves SPF.
[0188] As características destes 2 candidatas de vacinas ND são reportados na tabela 14 (VSB1-008) e na tabela 16 (vHVT306).
[0189] A concepção dos grupos é apresentada na Tabela 20. Sessenta ovos SPF embrionados (após cerca de 18 dias e 18 horas de incubação; D-3) foram utilizados para a administração in ovo (20 por grupo de Gl, G2 e G3). Cinquenta microlitros de vacina contendo 2.000 UFP foram administrados pela via in ovo, utilizando o dispositivo Sistema IntelliLab da AviTech LLC (Salisbury, MD, EUA). Eclodibilidade e sobrevivência foram registradas após a administração in ovo. No DO, 20 aves SPF de um dia de idade foram distribuídas aleatoriamente em dois grupos de 10 aves (G4 e G5). As aves foram injetadas por (SC) de injeção subcutânea no pescoço no OD com 0,2 mL das vacinas recombinantes, contendo uma dose alvo de 2000 pfu, como descrito na Tabela 20 abaixo. Dez aves por grupo foram desafiados pela via intramuscular em D28 com 5,0 log 10 de DIO50 cepa velogênica Chimalhuacan (genótipo V). Tabela 20 - Modelo de estudo e resultados de eficácia ND
Figure img0022
[0190] Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Sinais clínicos NDV foram registrados após o desafio. Amostras de orofaringe foram tomadas nos grupos vacinados em 5 e 7 dias após o desafio para avaliar a carga viral por RT- PCR em tempo real.
[0191] A eclodibilidade total e viabilidade foram registradas até D28 (dia desafio) para as aves de grupos Gl e G2. A eclodibilidade em G3 foi de 85% e uma ave morreu após a eclosão neste grupo. A eclosão inferior desse grupo pode ser devido a problemas das incubadoras de ovos. O peso corporal de machos e fêmeas em Gl, G2 e G3 foram semelhantes em Dl e no D28.
[0192] As porcentagens de proteção contra a mortalidade e morbidade são reportadas na tabela 20. A susceptibilidade completa foi observada no grupo de controle desafiados não vacinados Gl validando, assim, a alta severidade de desafio. Muito boa proteção foi observada em todos os 4 grupos vacinados, uma proteção clínica completo foi induzida pelo vHVT306 administrados por ambas as rotas.
[0193] A porcentagemagem de aves positivas e a média de proteção título (expresso como equivalente log 10 de EID50 por mL) estão indicados na Tabela 21. Ausência de desprendimento detectável ou muito baixo foi observado nos grupos G2 e G4 vacinados com vHVT306. Os níveis de proteção detectados nos grupos vacinados com vSBl-008 + vHVT13 foram maiores especialmente aos 5 dias pós-infecção (pi). Tabela 21 - Resultados de proteção contra mudança (porcentagem de aves com mudança detectável e média de carga viral em log 10) avaliados em D5 e D7 após desafio NDV
Figure img0023
* valor de PCR- tempo Real quantitativo, expresso em equivalente de média de log 10 DIO50; o limite é definido em 2,7 log 10.
[0194] Em conclusão, este exemplo mostra uma excelente proteção ND induzida por vHVT306 recombinante HVT duplo administrado por in ovo ou por via SC. O desempenho de vSBl- 008 + vHVT13 foi ligeiramente inferior, especialmente, após a administração in ovo, mas pode ser pelo menos parcialmente devido a problemas das incubadoras de ovos. Na verdade, os testes de segurança in ovo de outra recombinante SB1-ND (VSB 1-009) em 1000 ou 4000 PFU associada a 6000 UFP de vHVT13 não demonstrou qualquer diferença na eclodibilidade e sobrevivência precoce com um grupo que recebeu 6.000 PFU de apenas vHVT13.
Exemplo 12 - Eficácia de vHVT304, vHVT306, vSBl-007 e vSBl- 008 em combinação com vHVT13 contra o desafio com cepa NDV Chimalhuacan (Genótipo V) no D42 em aves de corte comerciais.
[0195] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia de dois duplos HVT (vHVT304 e vHVT306) expressando tanto genes NDV F quanto IBDV VP2 e dois recombinantes SB1 (VSB 1-007 e 1-008 VSB) expressando o gene NDV F em combinação com vHVT- IBD (vHVT13) contra o desafio de doença de Newcastle (Chimalhuacan, genótipo V) realizada aos 42 dias de idade em frangos de corte comerciais.
[0196] As características desses 4 vacinas candidatas ND são indicadas nas Tabelas 14 e 16. O modelos dos grupos é mostrado na Tabela 22. No DO, 55 frangos de corte comerciais de um dia de idade foram alocados aleatoriamente em 5 grupos de 11 aves. As aves foram injetadas por injeção subcutânea (SC) no pescoço no OD com 0,2 mL das vacinas recombinantes, contendo uma dose alvo de 2.000 pfu, como descrito na Tabela 22 abaixo. Dez aves por grupo foram desafiados por via intramuscular em D42 com 5,0 log 10 em DIO50 de cepas velogênica Chimalhuacan (genótipo V). Tabela 22 - Modelo do estudo e resultados de eficácia ND
Figure img0024
[0197] Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Sinais clínicos NDV foram registrados durante 14 dias após o desafio. Amostras de orofaringe foram tomadas nos grupos vacinados em 5 e 7 dias após o desafio para avaliar a carga viral em RT-PCR em tempo real.
[0198] As porcentagens de proteção contra a mortalidade e morbidade são reportadas na tabela 22. A susceptibilidade completa foi observada no grupo de controle desafiados não vacinados Gl validando, assim, a alta severidade de desafio. Uma proteção muito boa foi observada em todos os 4 grupos vacinados, uma proteção clínica completa está sendo induzida pelo vHVT306 e por vSBl-007 + vHVT13.
[0199] A porcentagemagem de aves positivas e a média de mudança de título (expresso como log 10 EID50 equivalentes por ml) são mostradas na Tabela 23. A melhor redução da proteção foi induzida por vHVT306 e vSBl-007 + vHVT13, que foram também o melhor candidato para a proteção clínica. Tabela 23 - Resultados de proteção contra mudança (porcentagem de aves com mudança detectável e a média de carga viral em log 10) avaliados em D5 e D7 após o desafio NDV (pi)
Figure img0025
* valor de PCR Tempo real quantitativo, expresso em equivalente médio log lo DIO50; o limite foi fixado em 2,7 log 10.
[0200] A proteção vHVT306 ND foi encontrada para ser melhor do que a de vHVT304. Estes dois HVT duplo contem o mesma cassete de expressão NDV F, mas inserido em dois loci diferentes, o que VP2 de IBDV a ser inserido na mesma posição. Por conseguinte, este exemplo ilustra a importância do locus de inserção na concepção de HVT recombinantes. O vSBl-007 + vHVT13 foi melhor do que vSBl-008 + vHVT13. A estrutura genômica vSBl-007 difere da do VSB1-008 em diferentes aspectos: locus de inserção, promotor, sinal de poliadenilação e origem do gene F. A combinação dessas sequências estrangeiras e locus de inserção no vSB1-007 foram provavelmente responsáveis por suas melhores performances de proteção ND.
[0201] Em resumo, este exemplo ilustra a importância do local de inserção e outras sequências reguladoras do cassete de expressão de NDV na proteção ND induzida por HVT e MDV de vetores serotipo 2.
Exemplo 13 - Eficácia do duplo HVT + IBD-ND (vHVT304 e vHVT306) ou SB1-ND (vSBl-008) em combinação com vacinas recombinantes vHVT13 contra o desafio com um IBDV clássico isolado no D14 em aves SPF
[0202] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia IBD precoce do duplo HVT recombinantes vHVT304 e vHVT306, bem como a de vHVT13 co-administrado com um constructo recombinante SB1-ND (VSB1-008) contra um desafio ao vírus da doença infecciosa bursal virulento (vIBDV) (cepa Faragher 52/70 tensão), realizado aos 14 dias de idade em aves SPF.
[0203] As características do duplo HVT e SB1 recombinantes usados neste estudo são apresentados nas Tabelas 14 e 16.
[0204] No DO, 95 aves SPF de um dia de idade foram distribuídas aleatoriamente em 9 grupos de 10 aves e um grupo de cinco aves (grupo controle não vacinado). As aves foram injetadas por via subcutânea no pescoço no OD com 0,2 mL das vacinas recombinantes, contendo uma dose alvo de 300 ou 1.000 pfu como descrito na Tabela 24 abaixo. No D14, amostra de sangue foi coletada de cinco aves por grupo para testes ® sorológicos com o Kit ProFLOK ® plus IBD (simbióticos Corp). As aves (10 aves por grupo, exceto para o grupo 7, em que 1 pássaro morreu antes do desafio) foram desafiados pelo colírio (0,05 mL por ave) em D14 com 2,5 log 10 de DIO50. Tabela 24 - Modelo de estudo e os resultados de eficácia IBD
Figure img0026
1 títulos médios + IBD de ELISA, expressos em log 10 no soro de 5 animais por grupo amostrado em D14 antes do desafio; 2 aves doentes por mais de 2 dias ou ainda doente em D25 foram considerados como doentes. 3 Proteção contra sinais clínicos e lesão bursal grave (pontuação bursal < 3) 4relação peso bursal / corpo do grupo não vacinado / não desafiado foi de 0,0047.
[0205] Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Sinais clínicos de IBDV foram registrados para um dia após o desafio (de D15 a D25). No final do período de observação pós-desafio (D33), todas as aves sobreviventes foram sacrificadas e autopsiadas. Foram registrados os pesos corporais e bursal. Cada bolsa de Fabrício (BF) foi ponderada então armazenada em recipientes individuais contendo formaldeído 4% para histologia. As lesões histológicas da bursa foram pontuadas, de acordo com a escala apresentada na Tabela 25. Tabela 25 - Escala de pontuação das lesões histológicas da bolsa de Fabrício
Figure img0027
*Proveniente da Monografia n º 01/2008: 0587 da Farmacopeia Europeia “Avian infectious Bursal Disease vaccine" (live).
[0206] Uma ave foi considerada como afetada se ela morreu e / ou demonstrou sinal notável de doenças e / ou lesões graves da bursa de Fabricius (ou seja, pontuação histologia > 3).
[0207] A título de anticorpo ELISA significativo DII + expressos em log 10 antes do desafio é mostrada na Tabela 24. Títulos significativos foram detectados em todos os grupos vacinados que foram significativamente mais elevados do que a do grupo de controle Gl. O título de sorologia não foi dose- dependente.
[0208] Foram observados sinais clínicos graves após o desafio em todas as aves do grupo controle Gl. Sete em cada 10 aves desse grupo morreu dentro do período de observação de 11 dias, indicando a alta gravidade do desafio. Nenhum dos animais vacinados apresentaram sinais clínicos graves após o desafio, exceto uma ave do G4 que morreu. As porcentagens de proteção contra lesões bursal graves são mostradas na tabela acima. Proteção IBD significativa foi observada em todos os grupos, a melhor proteção que está sendo observado no G2 e G3 (vHVT13 sozinho). A co-administração de vSBl-008 + vHVT13 e os duplos constructos vHVT304 e vHVT306 induziu a níveis semelhantes de proteção IBD. A proteção não foi dependente da dose, nas doses testadas. As razões médias de peso bursal / corporal também são mostrados na Tabela 24. Coeficientes em todos os grupos vacinados foram mais elevados do que os do grupo de controle desafiados.
[0209] Em conclusão, estes dados indicam que a combinação de um vetor de SB1-ND com um único HVT-IBD ou dupla HVT expressando NDV-F e-IBDV VP2 induziu anticorpos IBD e proteção precoce DII em um modelo de desafio de IBDV grave.
Exemplo 14 - Eficácia do único HVT-ND (vHVT114) ou SB1-ND (vSBl-007 e vSBl-009) em combinação com vacinas recombinantes vHVT13, contra o desafio com um IBDV muito virulento isolado em D23 em frangos de corte comerciais.
[0210] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia do IBD vHVT13 co-administrado com um constructos recombinantes (VSB 1-007 e 1-009) VSB contra um desafio ao virus infeccioso muito virulenta HVT-ND (vHVTl 14) ou SB1-ND O da doença de bursal (wIBDV) (91 - 168/980702), realizado aos 23 dias de idade em frangos de corte comerciais.
[0211] As características dessas quatro vacinas candidatas estão descritas nas Tabelas 14 e 16. No DO, 90 frangos de corte de um dia de idade foram distribuídos aleatoriamente em 7 grupos de 12 aves e um grupo de 6 aves (grupo controle não vacinado incontestada) . As aves foram injetadas por via subcutânea no pescoço no OD com 0,2 mL das vacinas recombinantes contendo uma dose alvo de 3.000 pfu, tal como descrito na Tabela 26. No D14, amostra de sangue foi recolhida a partir de 5 aves por grupo para testes ® O soro de 10 frangos adicionais de um dia de idade foi testada para ver com o mesmo kit para avaliar o nível de anticorpos maternos IBDV. As aves (10 aves por grupo) foram desafiadas por colírio (0,05 mL por ave) em D23 com 4,3 log 10 de EID50 do isolado wIBDV 91-168.
[0212] Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Sinais clínicos de IBDV foram registrados durante 11 dias após o desafio (de D23 a D33). No final do período de observação pós-desafio (D33), todas as aves sobreviventes foram sacrificados e autopsiados. Foram registados os pesos corporais e bursal. Cada bolsa de Fabrício (BF) foi ponderada então armazenados em recipientes individuais contendo formaldeído 4% para histologia. As lesões histológicas da bursa foram pontuados de acordo com a escala apresentada na Tabela 25.
[0213] Uma ave foi considerada como afetada se ela morreu e / ou mostrou sinais notórios de doença e / ou lesões graves da bursa de Fabricius (ou seja, pontuação de histologia > 3). Tabela 26 - Modelo de estudo e resultados de sorologia
Figure img0028
1títulos médios + IBD de ELISA, expressos em log 10 no soro de 5 animais por grupo amostrado a D23 antes do desafio; 2A relação peso bursal / corporal do grupo não vacinado / não desafiado foi 0,0047
[0214] A média de título sorológico ELISA + IBD foi 4,36 ± 0,01 log 10 indicando um nível muito elevado de anticorpos maternos IBD na ninhada. No D23, a média de tpítulo ELISA + IBD ainda foi alta (3,9) no controle Gl. Os títulos médios de ELISA dos grupos vacinados não foi significativamente diferente dos do grupo de controle.
[0215] Nem morbidade nem mortalidade foram observadas em nenhum dos grupos após o desafio. As porcentagens de proteção contra lesões bursal graves são mostradas na tabela 26 acima. O resultado mostrou que a co-administração de vHVTl14, VSB1- 007 ou VSB1-009 VSB não interferiu com vHVT 13 induzida pela proteção IBD indicando uma falta de interferência. Da mesma forma, as proporções médias de peso bursal / corporais dos grupos vacinados eram semelhantes e claramente superior ao do grupo de controle, indicando a proteção IBD e não houve diferença entre os regimes de vacinação.
[0216] Em conclusão, os dados indicam a compatibilidade entre vHVTl14, vSBl-007 ou VSB 1-009 e vHVT13 para proteção IBD. A ausência de interferência entre os dois vetores de HVT para a proteção de IBD foi novamente surpreendente e confirmaram os resultados observados para a proteção ND (ver exemplo 10),
Exemplo 15 A eficácia da dupla HVT + IBD-ND (vHVT304 e vHVT306) associada ou não a SB-1 e de SB1-ND (vSBl-007 e vSBl-008) em combinação com vHVT13 vacinas recombinantes, contra o desafio com uma variante E IBDV isolar em D28 em galinhas SPF
[0217] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia de dois duplos vetores vacinais HVT (HVT + IBD-ND: vHVT304 e vHVT306) ou dois VSB-l-NDV em combinação com vHVT13 (vSBl-007 + vHVT13, vSBl-008 + vHVT13) administrados por via subcutânea (SC) para aves SPF por dias de idade, e desafiados com variante IBDV (VAR-E) em 28 dias pós-vacinação.
[0218] No DO, 105 aves SPF de um dia de idade foram distribuídas aleatoriamente em 7 grupos de 15 aves, incluindo um grupo de controles desafiados (G6) e controles não desafiadas (G7). As aves do grupo Gl a G5 foram injetados por via subcutânea no pescoço no OD com 0,2 mL de vacinas recombinantes e / ou CGS-1 contendo cada um uma dose alvo de 2.000 pfu. O modelo do estudo é apresentado na Tabela 27 abaixo. No D28, todas as aves de grupos G1 a G6 foram desafiadas por colírio (0,03 mL contendo 3 log 10 EID50 por ave) de variante IBDV E isolado da Universidade de Delaware (EUA). Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Onze dias após o desafio, as aves foram pesadas e necropsiadas. A bolsa foram recolhidas e pesadas. As relações de peso bursal / corporais (relação peso bursal / peso corporal x 100) foram calculados. Tabela 27 - Modelo do estudo e os resultados de eficácia IBD
Figure img0029
[0219] As relações de peso médio bursal / corporal são mostrados na Tabela 27. As aves de controle desafiadas tinham uma atrofia bursal grave em comparação com as não desafiadas. Vacinas VSB 1-007 e VSB1-008 VSB não interferiu sobre a proteção vHVT13 induzida por (G4 e G5). As relações de peso bursal / corporal de aves vacinadas com a dupla HVT (HVT + IBD-ND) foram ligeiramente mais baixos do que o grupo controle não desafiado, mas eram claramente maiores do que os grupos de controle desafiados. Além disso, o sorotipo 2 da vacina SB-1 contra a doença de Marek não interferiu com a proteção induzida por vHVT304 IBD.
[0220] Em conclusão, estes dados indicam que a combinação de um vetor de SB1-ND com um único HVT-IBD ou duplo HVT expressando NDV-F e-IBDV VP2 induziu proteção IBD em um modelo de desafio de variante IBDV E.
Exemplo 16 - Falta de interferência do vHVT114, vSBl-009 e / ou SB-1 na variante vHVT13 induziu proteção na variente E de IBD em frangos SPF.
[0221] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia IBD de vHVT13 quando administrado pela rota SC ou in ovo concomitantemente com vHVTl14, VSB 1-009 e / ou SB-1 em aves SPF em uma variente IBDV (VAR-E) no modelo de desafio em D28.
[0222] 75 aves SPF de um dia de idade e 75 embrião de galinha SPF de 18 a 19 dias de idade foram alocados aleatoriamente em 5 grupos (GL para G5 e G6 para G10, respectivamente), incluindo um grupo de controles desafiados (G4 e G9, respectivamente) e controles não desafiados (G5 e G10, respectivamente). As aves dos grupos GL para G3 foram injetados por via subcutânea no pescoço no DO com 0,2 ml de vacinas contendo cada uma dose alvo de 3.000 pfu exceto para SB-1, que teve uma dose alvo de 1.000 UFP. Aves de G6 a G8 receberam as mesmas doses de vacina, mas em 0,05 mL de volume pela rota in ovo de 2 - 3 dias antes da ninhada. O modelo do estudo é apresentado na Tabela 28 abaixo. Aos 28 dias de idade, todas as aves de grupos G1 a G4 e G6 a G9 foram desafiados pelo colírio (0,03 mL contendo 3 log 10 EID50 por ave) de variente E de IBDV isolado da Universidade de Delaware (EUA). Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Onze dias após o desafio, as aves foram pesadas e necropsiados. A bolsa foi recolhida e pesada. As relações de peso bursal / corporal (relação peso bursa / peso corporal x 100) foram calculados. Tabela 28 - Modelo de estudo e os resultados da eficácia IBD
Figure img0030
[0223] As relações de peso médio bursal / corporal são mostrados na Tabela 28. As aves de controle desafiadas (G4 e G9) tiveram uma atrofia bursal grave em comparação com os não desafiadas. As relações de peso bursal / corporais dos grupos vacinados (G1 a G3 e G6 a G8) foram semelhantes aos dos grupos de controle não desafiados (G5 e G10) e bem acima dos grupos controle desafiados (G4 e G9). A falta de interferência de vHVTl 14 em vHVT13 induziu proteção IBD após ambos vias SC ou in ovo foi surpreendente e os dados obtidos nos exemplos 10 e 14 confirmado.
[0224] Em conclusão, estes dados indicam claramente a compatibilidade de vHVTl14 + VSB 1-009 ou + SB-1 e do VSB 1009 com vHVT13 quando administrado por rota SC ou in ovo em um modelo de desafio de variante E de IBDV.
Exemplo 17 - Eficácia de vetores vHVT114 e vHVT13 e SB1 ou vSBl-009 contra desafio muito mais virulento na doença de Marek
[0225] O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da doença de Marek induzida por diferentes combinações de vacinas, incluindo vHVTl 14, vHVT13, SB-1 e / ou VSB 1-009 administrada por via SC de aves SPF de um dia de idade e desafiou quatro dias mais tarde, com o isolado T-King do vírus da doença de Marek muito mais virulento (w + MDV).
[0226] No DO, 100 aves SPF de um dia de idade foram distribuídas aleatoriamente em 5 grupos de 20 aves. As aves do grupo 1 a 3 foram injetados por via subcutânea no pescoço no OD com 0,2 mL de vacinas contendo uma dose alvo de 2.000 pfu para cada vacina, exceto para o SB-1, para o qual a dose alvo foi de 1.000 pfu. Aves dos grupos 4 e 5 foram não- vacinados e foram usados como controles desafiado (grupo 4) ou sem desafio (grupo 5). O modelo do estudo é apresentado na Tabela 29. Em D4, todas as aves dos grupos 1 a 4 foram inoculadas com 0,2 mL de o MDV w + isolado T-King usando a via de administração intraperitoneal. Tabela 29 - Modelo do estudo e resultados d proteção MD
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[0227] Cada grupo foi monitorado diariamente por quaisquer reações adversas, antes e após o desafio. No dia 49, todas as aves vivas foram sacrificadas e necropsiadas para examinar por lesões macroscópicas associadas à doença de Marek. Galinhas foram classificadas como positivas para a infecção com a doença de Marek se sinais nervosos, como paralisia, sinais locomotivos atribuíveis à doença e emagrecimento grave ou depressão são observados, se a mortalidade diretamente atribuível à doença de Marek ocorre, ou se as lesões macroscópicas são observadas na necropsia. As lesões podem incluir, mas não se limitando a, as seguintes: lesões hepáticas, coração, baço, gônadas, rins e músculos.
[0228] Os resultados de proteção são apresentados na Tabela 29 acima. Todos os grupos vacinados (G1 a G3) realizaram igualmente, induzindo uma proteção parcial (65%) MD como esperado neste modelo de desafio muito grave e precoce. Estes resultados indicaram que as vacinas de vetor retem a sua capacidade para proteger contra a doença de Marek.
Exemplo 18 - Eficácia de vetores HVT e SB1 recombinantes contra a Doença de Marek
[0229] A eficácia da doença de Marek é também demonstrada para os vetores HVT e SB-1 recombinantes, quer isoladamente ou em combinação. As cepas de desafio incluem o desafio a doença de um Marek virulenta (VMD) como GA22, uma desafio da doença de Marek muito virulenta (ADM) como RB1B e / ou um desafio a doença de Marek muito mais virulenta (w + MD) como o vírus T. King. Aves com um dia de idade foram inoculadas subcutaneamente ou 18 - 19 dias de idade, os ovos embrionados são inoculados com uma dose de 0,2 mL ou 0,05 mL de dose, respectivamente, dos vírus de teste. Aos cinco dias de idade as aves vacinadas e os controles nativos são desafiados com desafio do vírus de Marek relevante (v, w, w + ou MDV). As aves desafiadas são observadas até sete semanas de idade. Todas as aves são sacrificadas e necropsiadas para observar lesões visíveis grosseiramente associados com a doença de Marek, tal como descrito no Exemplo 17.
Exemplo 19 - Interferência de HVT IBDV em anticorpos induzidos por vHVT13 em frangos comerciais
[0230] O objetivo deste estudo foi determinar se a co- administração de HVT com vHVT13 teve um impacto sobre vHVT 13 induzida por resposta de IBDV de anticorpos em frangos comerciais.
[0231] Oitenta frangos comerciais de um dia de idade foram utilizados em três unidades de isolamento. Quinze foram coletados o sangue em um dia de idade para testar anticorpos maternos IBD (MDA). As aves restantes foram divididas em três grupos, conforme mostrado na Tabela 30. Aves do grupo 2 e 3 foram vacinadas por via SC na nuca com doses comerciais de vHVT13. (Vaxxitek HVT + IBD; Merial SAS, Lyon, França) e / ou HVT Bio HVT (Merial SpA, Noventa, Itália) associada à célula. As colheitas de sangue foram realizadas com a idade de 25, 35 e 45 dias de idade. O kit ELISA para avaliar a resposta sorológica IBDV era o PROFLOK PLUS IBD (DII +) kit Ab ELISA de simbióticos (simbióticos Corp, Kansas City, MO, EUA). Tabela 30 - Modelo do estudo e resultados de sorologia
Figure img0033
[0232] os títulos médios de ELISA são apresentados na Tabela 30. Títulos no grupo não vacinado Gl diminuiu de Dl a D45, o que correspondeu ao declínio dos anticorpos maternos IBD V. Tal como esperado; Os títulos de ELISA no grupo G2 vHVT13, permaneceram elevado até D45 indicando anticorpos maternos foram progressivamente substituídas por anticorpos vHVT 13 induzidas. A adição de HVT para vHVT13 teve um impacto negativo claro desde os títulos de anticorpos observados no G3 foram semelhantes Gl. Estes resultados contrastam com os obtidos com vHVTl 14 + vHVT13 desde o vHVTl 14 não diminua induzidas vHVT13 títulos + IBD de ELISA (ver Exemplo 14, Tabela 26). Eles confirmam a propriedade inesperada de vHVTl14 em não interferir com a imunogenicidade vHVT13.
[0233] Em conclusão, ao contrário do que foi observado com vHVTl14, a adição de HVT para vHVT13 teve um claro impacto negativo sobre vHVT 13 induzida por imunidade humoral IBDV.
Exemplo 20 - Interferência de HVT-ND ou vHVT13 comercial induzida por proteção IBD
[0234] O objetivo deste estudo foi determinar se a co- administração de vacinas vetoriais HVT-ND comerciais com vHVT13 teve um impacto sobre vHVT 13 induzida pela proteção IBD em frangos SPF.
[0235] Setenta e cinco frangos SPF (3 grupos (G2, G3 e G4), de 25) foram vacinadas em um dia de idade, por via SC com uma dose comercial de vHVT13 (Vaxxitek HVT + IBD), com ou sem um comercial dose de vacina em vetor licenciado ND-HVT (vHVT-NDL e vHVT-ND2), como mostrado na Tabela 31. Quinze aves foram mantidas como controlos não-vacinados (Gl). Três semanas após a vacinação, as aves (20 galinhas em G2, G3 e G4 e 10 galinhas em Gl) foram desafiados com pelo menos 2,0 log 10 de DIO50 em 0,05 ml de cepa do vírus IBD Ph / Bl (isolado nas Filipinas), administrado por via ocular. Foram observados todos os frangos durante 5 dias por sinais clínicos ou morte por causas atribuíveis à desafios do IBD vírus e submetidos à eutanásia com humanidade no final de observação pós-desafio para exame de necropsia de lesão IBD, especialmente, a partir da bolsa de Fabrício. As aves foram consideradas protegidas, se a sua bolsa não mostrou lesões bursal típicos de IBD: atrofia bursal, edema peri-bursa e / ou hemorragias nos tecidos bursa. Tabela 31 - Modelo do estudo e proteção de dados IBD
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[0236] Os resultados são apresentados na Tabela 31. Todas as 10 aves de controle desafiadas mostraram sinais clínicos e 8 das 10 morreram 4 ou 5 dpi indicando que o desafio de IBDV foi muito grave. Todos elas tiveram lesões graves da bursa, incluindo graves manchas atrofia e hemorrágicas. O vHVT13 sozinho induziu proteção total ao passo que ambas as combinações com vHVT-ND induziu proteção clínica e bursal parcial.
[0237] Em conclusão, estes resultados indicam claramente que as duas vacinas comerciais ND vetoradas-HVT interferem com vHVT13 induzida por proteção IBD.
Exemplo 21 - Eficácia de vacinas vSBl-004, vSBl-006, vSBl- 007, vSBl-008, ND SB1-vetoradas sozinho ou em associação com a vacina vetorizada IBD-HVT vHVT13, e as vacinas vHVT302 e vHVT304 contra desafios com cepa NDV Texas GB a 14 e / ou 28 dias de idade em galinhas SPF.
[0238] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia das combinações de diferentes vacinas de vetor de Doença de Marek expressando o NDV F e / ou o gene de VP2 de IBDV contra o desafio da doença de Newcastle (cepa Texas GB, genótipo II) realizada a 14 e / ou 28 dias de idade em galinhas SPF.
[0239] As características das 6 vacinas recombinantes NDV testada neste estudo estão descritas na Tabela 32 abaixo. Tabela 32 - Características das 6 vacinas recombinantes NDV testadas neste estudo
Figure img0035
[0240] No DO, 225 frangos SPF de um dia de idade foram distribuídos aleatoriamente em 9 grupos de 15 aves (G1a a G9a desafiado a D14) e 6 grupos de 15 aves (G1b, G3b, G4b, G5b, G8b, G9b desafiado a D28). As aves foram injetadas por via subcutânea no pescoço no DO com 0,2 mL contendo uma dose alvo de 2.000 pfu para vacinas recombinantes. O modelo do estudo é apresentado na Tabela 33 abaixo. As aves foram desafiadas por via intramuscular em D14 ou D28 com 4,3 e 4,2 log 10 de DIO50 (0,1 mL) cepa velogênica ND Texas GB (genótipo II), respectivamente. Tabela 33 - Resultados da eficácia ND
Figure img0036
[0241] Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Foram registrados sinais clínicos NDV após o desafio. Uma ave morreu em G6 e G7 antes do desafio da redução do número de aves 15 - 14 nestes grupos.
[0242] As porcentagens de proteção clínica (incluindo a proteção contra a mortalidade e morbidade) são apresentados na Tabela 33 acima. A susceptibilidade completa foi observada no grupo controle não vacinado desafiado Gla e G1b validando assim a alta gravidade do desafio. Proteções parciais que vão 13,3 - 46,6 % foram observados após o desafio em D14, os mais altos níveis de proteção a ser induzidas por vSBl-008, vSBl- 007 e vHVT304. Níveis de proteção após o desafio ND em D28 eram muito mais elevados para todos os grupos vacinados e foram novamente ligeiramente mais elevado nos grupos vacinados com vSBl-008, VSB 1-007 ou vHVT304. Estes resultados indicam que os níveis de proteção foram ND dependente da data de desafio e no constructo. Constructos VSB1-008 e VSB 1-007 realizadas ligeiramente melhor do que VSB1-004 e VSB1-006, e o vHVT304 realizada ligeiramente melhor do que vHVT302, indicando que características diferentes dos constructos estão desempenhando um papel nas performances de vacinas de vetor baseados em MDV.
[0243] Em conclusão, os resultados deste estudo mostraram que os níveis de proteção ND induzidas por vetores da doença de Marek que expressam genes de NDV F podem depender de diferentes parâmetros, incluindo o vetor, o local de inserção, o gene F, o promotor, o local de poli-adenilação e as condições de desafio.
Exemplo 22 - Eficácia de vacinas duplas HVT + IBD-ND vHVT304 e vHVT306 contra desafios com cepas NDV Texas GB em 14 e / ou 28 dias de idade em frangos SPF
[0244] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia da vacina em vetor-HVT expressando NDV F e os genes de VP2 IBD V contra o desafio da doença de Newcastle (cepa Texas GB, genótipo II) realizada a 14 e / ou 28 dias de idade em galinhas SPF.
[0245] As características das duas vacinas recombinantes testados neste estudo estão descritos na Tabela 34 abaixo. Tabela 34 - Características dos candidatos a vacinas recombinantes utilizado neste estudo
Figure img0037
[0246] No DO, 90 frangos SPF de um dia de idade foram distribuídos aleatoriamente em 3 grupos de 15 aves (G1a a G3a desafiado em D14) e 3 grupos de 15 aves (G1b a G3b desafiado em D28). As aves foram injetadas por via subcutânea no pescoço no DO com 0,2 mL contendo uma dose alvo de 2.000 pfu para vacinas recombinantes. O modelo do estudo é apresentado na Tabela 35 abaixo. As aves foram desafiadas por via intramuscular em D14 ou D28 com uma dose-alvo de 4,0 log 10 de DIO50 (0,1 mL) de cepa velogênica ND Texas GB (Genótipo II). Tabela 35 - Resultados da eficácia ND
Figure img0038
[0247] Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Foram registrados sinais clínicos NDV após o desafio. Uma ave morreu no G2b antes do desafio com a redução do número de aves 15 - 14 neste grupo.
[0248] As porcentagens de proteção clínica (incluindo a proteção contra a mortalidade e morbidade) são apresentados na Tabela 35 acima. A susceptibilidade completa foi observada no grupo controle não vacinado desafiado Gla e G1b validando assim a alta gravidade do desafio. Proteções níveis após o desafio no D14 foram muito menores do que os obtidos após o desafio em D28. Essas vacinas candidatas tinham o mesmo cassete de expressão NDV F inserido em 2 loci diferente do genoma vHVT13. Eles realizaram igualmente em termos de proteção ND nas condições testadas, indicando que ambos loci de inserção (IG2 e SORF3-US2) são igualmente adequados para inserção do cassete NDV F.
[0249] Em conclusão, os resultados deste estudo mostraram que os níveis de proteção ND induzidas por vetores da doença de Marek que expressam genes NDV F dependem de diversos parâmetros, tais como o vetor, o local de inserção, o gene F, o promotor, o local de poliadenilação e as condições de desafio.
Exemplo 23 - Eficácia ND precoce induzida pela dupla de vetores HVT-ND + IBD (vHVT302, VHVT303 e vHVT304) ou vetores SB-1 (vSBl-006 e vSBl-007) em um dia de idade em frangos SPF contra um desafio velogênica genótipo V NDV.
[0250] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia de três duplas HVT + IBD-ND (vHVT302, vHVT303 e vHVT304) e dois vetores SB1-ND (vSBl-006 e VSB 1-007) em um dia de idade em galinhas SPF contra um desafio velogênica genótipo V (Chimalhuacan) NDV realizada no D14.
[0251] As características dos cinco candidatos a vacinas recombinantes testadas neste estudo estão descritos na Tabela 36 abaixo. Tabela 36- Características dos candidatos a vacinas recombinantes utilizado neste estudo
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[0252] Seis grupos (1 e 2) de 10 Pintos Leghorn brancos de um dia de idade livre de patógeno específico (SPF) foram constituídos de forma aleatório. Aves de grupos de 2 a 6 foram vacinados por via subcutânea (nuca do pescoço) com uma dose alvo de 2.000 UFP como mostrado na Tabela 37 abaixo. Galinhas do grupo 1 não foram vacinadas e foram mantidos como aves de controle. Às duas semanas-de-idade, todas as aves foram desafiadas com o genótipo velogênica V de cepa mexicano Chimalhuacan (Mex V) NDV. O desafio foi realizado por via intramuscular (IM) por meio de 105 Ovo da dose infeciosa 50 (EID50) diluído em 0,2 ml de água estéril fisiológica. Todas as aves foram monitoradas até 14 dias após o desafio. Após o desafio, o estado de saúde de cada ave foi marcada diária da seguinte forma: saudável / com sintomas específicos (penas eriçadas, prostração, torcicolo, tremor) / morto. Qualquer ave que apresentaram sintomas específicos para mais de 2 dias ou doente foi observado em D28 foi tida em conta para o cálculo da morbidade. Tabela 37 - Resultados de proteção ND precoce induzida por diferentes candidatos vetoradas MDV expressando gene NDV F em aves SPF de um dia
Figure img0040
[0253] Os resultados de proteção encontram-se resumidos na Tabela 37. Todas as aves de controle morreram após o desafio ND. Níveis variáveis de proteção ND foram induzidos pelas diferentes vacinas testadas variando de 10% a 80% e entre 0% e 60%, em termos de proteção contra a mortalidade e morbilidade, respectivamente. O candidato vHVT304 induziu uma proteção melhor do que os candidatos vHVT303 e vHVT302; isto pode ser devido ao promotor de SV40 exógeno colocado em frente do gene NDV F. O VSB 1-007 realizada ligeiramente melhor do que o VSB 1-006. Além disso, os desempenhos obtidos com vHVT304 foram comparáveis aos obtidos com VSB1-007 indicando que vetores diferentes de doenças de Marek podem alcançar o mesmo nível de proteção ND.
[0254] Em conclusão, este estudo demonstra que tanto a vacina vetorada SB1-ND quanto a dupla HVT + IBD-ND pode atingir níveis significativos de proteção ND em um modelo de desafio NDV muito grave e precoce.
Exemplo 24 - Eficácia ND induzida pelo duplo HVT-ND + IBD vHVT306 administrado por via in ovo ou SC a um dia de idade, contra a galinhas SPF com um desafio de genótipo velogênico V NDV realizada em D28
[0255] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia de um duplo HVT + IBD-ND (vHVT306) administrado pela via in ovo ou SC para frangos SPF contra um desafio velogênico de genótipo V (Chimalhuacan) NDV realizada aos 28 dias de idade.
[0256] As características do candidato a vacina recombinante vHVT306 testados neste estudo estão descritos na Tabela 38 abaixo. A vacina de vetor de HVT-IBD único vHVT13 foi utilizado como um controle. Tabela 38 Características da vacina recombinante candidata utilizada neste estudo
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[0257] No dia 3, 40 ovos embrionados SPF com idade em torno de 18 dias e 18 horas de incubação foram alocados aleatoriamente em dois grupos de 20 ovos cada. Em DO, adicionou-se um grupo de pintos SPF de 12 dias de idade. A definição dos grupos está apresentada na Tabela 39 abaixo. A vacinação foi realizada em D-3 (em via in ovo) ou em OD (via SC, na parte de trás do pescoço) e a dose alvo de vHVT306 e vHVT13 foi 2000PFU/pássaro. Para o em rota de ovo, eclodibilidade, viabilidade (até D28) e crescimento das aves (entre eclosão e D28) foram monitorados.
[0258] Em D28, 10 aves por grupo foram desafiadas com cepa virulenta ND Chimalhuacan. O desafio foi realizado por via intramuscular (IM) por meio de 105 Ovo da dose infecciosa 50 (EID50) diluído em 0,2 ml de água estéril fisiológica. As aves foram monitoradas até 14 dias após o desafio. Foram registrados sinais clínicos específicos e mortalidade. Qualquer ave que apresentasse sintomas específicos para mais de 2 dias ou doente foi observada em D42 levado em conta para o cálculo da morbidade. Cinco e sete dias após o desafio (ou seja, em D33 e D35), swab de orofaringe foi tirado de cada ave sobrevivente. Todos os cotonetes foram analisados por NDV de qRT-PCR específico. Os resultados da proteção induzida por ND vHVT306 MDV vetoradas candidato expressando NDV F e genes de IBDV VP2 administrados pela rota SC ou in ovo em pintos SPF
Figure img0042
G3 vHVT306/SC - 100% / 100% 20% (3,2) / 10% (2.9) * O título limiar do RT PCR em tempo real foi de 2,7 log 10 DIO50 equivalente
[0259] A eclodibilidade total foi registrada após a vacinação in ovo nos grupos 1 e 2 e todos as aves nascidas sobreviveram até D28. Não houve diferença no peso corporal que foi detectada entre os dois grupos, tanto para D28 confirmando a segurança perfeita de vHVT306 quando administrado in ovo. Resultados de proteção estão resumidos na Tabela 39. Todas as aves controle vHVT13 vacinadas morreram por 4 dias após o desafio ND. Proteção ND clínica completa foi induzida por vHVT306 administrados por ambas as rotas. Além disso, nenhum proteção foi detectada após a administração in ovo. Considerando que só algumas aves altera a quantidade detectável do desafio do vírus após a administração SC.
[0260] Em conclusão, este estudo demonstra que a dupla HVT + IBD-ND vHVT306 induziu excelente nível de proteção ND por SC ou em vias de administração in ovo em um modelo de desafio heterólogo muito grave NDV.
Exemplo 25 - Eficácia das vacinas recombinantes dupla IBD (vHVT302, vHVT303 e vHVT304) contra o desafio com um IBDV clássica HVT-ND + isolaado em D15 em galinhas SPF.
[0261] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia precoce de IBD de constructos duplos HVT recombinantes vHVT302, vHVT303 e vHVT304 contra um desafio do vírus virulento da doença infecciosa bursal (vIBDV) (Faragher 52/70 tensão), realizado aos 15 dias de idade em galinhas SPF.
[0262] As características de 3 vacinas recombinante dupla HVT-ND + IBD candidatos testados neste estudo estão descritos na Tabela 40 abaixo. Tabela 40 - Características dos cassetes de expressão de recombinantes duplos HVT
Figure img0043
[0263] No DO, 40 frangos SPF de um dia de idade foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos de 10 aves, incluindo um grupo controle (OG), que foi vacinado com VSB 1-004, um vetor SB-1 expressando gene NDV F. Cinco outras aves SPF foram mantidos não vacinadas e desafiadas para avaliação pesos bursal / corporal. As aves foram injetadas por injeção subcutânea no pescoço no OD com 0,2 mL das vacinas recombinantes contendo uma dose alvo de 2.000 pfu, tal como descrito na Tabela 41 abaixo. No D15, amostra de sangue foi coletada de todas as aves por grupo (10 aves por grupo, exceto para os grupos 1 e 3, em que uma ave morreu antes da amostragem de sangue) para o teste sorológico com o Kit ProFLOK ® plus IBD (simbióticos Corp). No D15, aves de todos os 4 grupos foram desafiadas pelo colírio (0,05 mL por ave) com 2,5 loglo DIO50. Tabela 41 - Modelo do estudo e os resultados de eficácia IBD
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Aves doentes por mais de 2 dias ou ainda doente no D25 foram considerados como doentes. O número entre parênteses é o número total de aves no grupo que foram desafiados. 2Proteção contra sinais clínicos e lesão bursal grave (pontuação bursal <3) 4A relação peso bursal / corporal do grupo não vacinado / não desafiado foi 0,0043.
[0264] Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Sinais clínicos de IBDV foram registrados para um dia após o desafio (de D15 a D25). No final do período de observação pós-desafio (D25), todas as aves sobreviventes foram sacrificadas e autopsiadas. Foram registrados os pesos corporais e bursal. Cada bolsa de Fabrício (BF) foi ponderada então armazenada em recipientes individuais contendo formaldeído 4% para histologia. As lesões histológicas da bursa foram pontuadas, de acordo com a escala apresentada na Tabela 42. Tabela 42 - Escala de pontuação das lesões histológicas da bolsa de Fabrícius*
Figure img0045
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[0265] Uma ave foi considerada como afetada se ela morreu e / ou demonstrou sinal notável de doenças e / ou lesões graves da bursa de Fabricius (ou seja, a pontuação histologia > 3).
[0266] A título de anticorpo ELISA significativo DII + expressos em log 10 antes do desafio é mostrada na Tabela 41. Títulos significativos foram detectados em todos os grupos vacinados que foram significativamente mais elevado do que a do grupo de controlo Gl. O título de sorologia foi ligeiramente superior no G3 (vHVT303).
[0267] Foram observados sinais clínicos graves após o desafio em todos os 9 aves do grupo controle Gl, que levou à morte de uma ave. Apenas uma ave vacinada em G2 (vHVT302) apresentou sinais clínicos após o desafio. As porcentagens de proteção contra lesões bursal graves são apresentadas na Tabela 41 acima. A proteção IBD significativa foi observada em todos os grupos vacinados, uma proteção total sendo observada em G3 (vHVT303). Os índices médios de peso bursal / corporais também são apresentados na Tabela 41. Índices em todos os grupos vacinados foram superiores aos do grupo controle desafiado Gl e não significativamente diferente do grupo controle não vacinado e sem desafio.
[0268] Em conclusão, estes dados indicam que as três duplas HVT-DII + ND testados neste estudo de anticorpos induzidos IBD e proteção precoce DII em um modelo de provocação de IBDV grave.
Exemplo 26 - A eficácia de cinco diferentes vacinas candidatas HVT-ND contra desafios com velogénica NDV ZJL (genótipo Vlld) isolados aos 14 dias de idade em frangos SPF.
[0269] O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia de 5 constructos individuais HVT recombinantes (vHVT39, vHVTl10, vHVTl11, vHVTl12 e vHVTl13) que expressam o gene NDV F contra o desafio da doença de Newcastle com velogénica NDV ZJ1 (genótipo Vlld ) isolado realizada aos 14 dias de idade em galinhas SPF.
[0270] As características destes cinco candidatos a vacinas encontram-se descritos na Tabela 43 abaixo. Tabela 43 - Características da vírus recombinantes HVT-ND utilizado no estudo de desafio.
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* Wt significa que a sequência do gene do tipo selvagem velogénica F foi utilizado, mas o local de clivagem foi modificado para que de um vírus lentogénico. Wtnm significa que o local de clivagem da sequência de tipo selvagem não foi modificado. A cepa velogênica Texas pertence ao genótipo IV e YZCQ ao genótipo Vlld.
[0271] No DO, 72 aves SPF de um dia de idade foram distribuídas aleatoriamente em 5 grupos de 12 aves (vacinados) e um grupo de 12 aves (controles não vacinados). As aves foram injetadas por via subcutânea no pescoço no OD com 0,2 mL das vacinas recombinantes, contendo uma dose alvo de 6.000 pfu, como descrito na Tabela 44 abaixo. As aves foram desafiados por via intramuscular em D14 com 5 log 10 EID50 de cepa velogênica NDV ZJ1/2000 (genótipo Vlld). Tabela 44 - Resultados da eficácia ND
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[0272] Cada grupo foi monitorado antes e após o desafio. Sinais clínicos NDV e mortalidade foram registrados após o desafio. Orofaríngicos foram tomadas em 2 a 4 dias pós-infecção (dpi), para a avaliação da carga viral por tempo real de RT-PCR, utilizando o método descrito por Wise et al. (2004; Development of a Real-Time Reverse-Transcription PCR for Detection of Newcastle Disease Virus RNA in Clinical Samples. J Clin Microbiol 42, 329-338).
[0273] As porcentagens de proteção contra a mortalidade e morbidade são relatadas na tabela 44 acima. A susceptibilidade completa foi observada no grupo de controle desafiado não vacinado Gl validando, assim, a elevada gravidade do desafio. Vacinas induziu a níveis variáveis de proteção contra a mortalidade (25 - 100%) ou contra a morbidade (8% - 83%). O melhor nível de proteção foi induzida por vHVTl10, enquanto o menor foi induzido por vHVT039, os outros candidatos dando resultados intermediários. Resultados de proteção de orofaringe em 2 e 4 dpi também são apresentados na Tabela 44 acima e estão em linha com os de proteção clínica. Estas vacinas candidatas diferem no seu promotor e sequência do gene F. Estes resultados mostram que os dois parâmetros são importantes para a concepção de candidato a vacina de HVT-ND ideal.
[0274] Em conclusão, os resultados deste estudo mostram a importância do promotor e a sequência do gene F na eficácia ND induzida por vacinas vetoradas-HVT ND candidatas.
Exemplo 27 - Avaliação da eficácia da doença de Newcastle induzida por constructos duplo SB1 que expressam IBDV VP2 e NDV F.
[0275] O objetivo do estudo é avaliar a eficácia de constructos duplos SB1 expressando IBDV VP2 e NDV F contra o desafio da doença de Newcastle.
[0276] Em DO, frangos SPF com um dia de idade são distribuídos aleatoriamente em vários grupos de 10 - 20 aves, incluindo os grupos vacinados e não vacinados. As aves dos grupos vacinados foram injectados por via subcutânea no pescoço no OD com 0,2 ml contendo uma dose alvo de vacinas recombinantes 1.000 pfu e 5000 pfu. Em alternativa, a mesma dose de 0,05 ml pode ser administrada in ovo nos 2 ou 3 dias antes da eclosão. As aves (pelo menos, um grupo vacinado e um grupo não vacinado) são desafiadas por via intramuscular no momento diferente após a vacinação: por exemplo, D14, D28 ou D42 com cerca de 4,0 log 10 de DIO50 (0,1 mL) de uma cepa velogênica cepa NDV como Texas GB (genótipo II), ZJ1 (Genótipo Vlld), Chimalhuacan (genótipo V).
[0277] Cada grupo é acompanhado clinicamente antes e após o desafio. Sinais clínicos NDV (morbidade) e mortalidade são registrados após o desafio. Porcentagens de proteção clínica em todos os grupos são calculados. Pelo menos 90% das aves SPF desafiadas não vacinados devem morrer ou ficar gravemente doentes após o desafio para validar a gravidade de desafio. Amostras de orofaringe e cloaca pode ser retiradas em diferentes tempos após o desafio, como 3, 5, 7 e 9 dias após o desafio e a carga viral pode ser estimada por RT-PCR em tempo real. Os melhores candidatos serão aqueles que induziram o maior nível de proteção clínica e menor nível de carga viral nos swabs. Um estudo semelhante pode ser realizado em frangos contendo anticorpos maternos NDV; no entanto, estes anticorpos maternos podem potencialmente proteger as aves não vacinadas se o desafio é efetuado precocemente. O constructo duplo SB1 também podem ser testado em combinação com a vacina contra a doença de Marek ou outras vacinas vetoriais.
Exemplo 28 - Avaliação da eficácia da doença da bursa infecciosa induzida pelo conctructo duplo SB1 expressando IBDV VP2 e NDV F.
[0278] O objetivo do estudo é avaliar a eficácia IBD do constructo duplo SB1 expressando tanto o IBDV VP2 e o NDV F.
[0279] Frangos SPF de um dia de idade são alocados aleatoriamente em vários grupos de 10 a 20 aves, incluindo controles vacinados e não vacinados. Controles não-vacinados serão separados em dois subgrupos, incluindo aves desafiadas e não desafiadas. As aves de grupos vacinados foram injetados por via subcutânea no pescoço no OD com 0,2 mL de vacinas que contêm cada um uma dose alvo de 1000 e 5000 pfu. Em alternativa, a mesma dose de 0,05 ml pode ser administrada in ovo nos 2 ou 3 dias antes da eclosão. Em diferentes momentos após a vacinação, como 14, 21, 28 ou 42 dias pós-vacinação, todas as aves dos grupos vacinados e os controles desafiados são desafiados pelo colírio (0,03 mL contendo 2 a 4 log 10 de EID50 por ave) de um IBDV virulente (tal como, a cepa Faragher ou a cepa padrão US), um VDBI muito virulento, tal como o isolado de 91 - 168 ou um IBDV variante isolado, tal como isolado variante E Delawerw US. Cada grupo é clinicamente monitorado antes e após o desafio. As aves podem ser necropsiadas 4 ou 5 dias pós-desafio para avaliações de lesões macroscópicas bursal. Elas também podem ser necropsiadas 10 a 11 dias após o desafio. As lesões macroscópicas e / ou histológicas podem ser avaliadas. Além disso, as aves e bursa são pesadas o peso bursal / corporal, de proporções (proporção em peso do peso bursa / corpo x 100) é calculado em relação aos do grupo não vacinado desafiado. Aves SPF controle desafiadas devem apresentar sinais clínicos e / ou têm significativa dos valores brutos e / ou lesões histológicas e / ou deve ter uma razão de peso bursal / corporal significativamente menor do que as aves de controle não desafiadas não vacinados para validar a gravidade do desafio. A eficácia da vacina é avaliada comparando esses parâmetros com grupos não vacinados / desafiados e grupos não vaciados / nçao desafiados. Tal estudo pode ser realizado em frangos de corte contendo anticorpos maternos IBDV; no entanto, estes anticorpos maternos podem potencialmente proteger as aves não vacinadas se o desafio é efetuado precocemente. O constructo duplo SB1 também podem ser testados em combinação com a vacina contra a doença de Marek ou outras vacinas vetoriais.
Exemplo 29 - Avaliação da eficácia da doença de Marek induzida por constructos duplos SB1 que expressam IBDV VP2 e NDV F.
[0280] O objetivo deste estudo é avaliar a eficácia da doença de Marek induzida pelos vetores SB1 que expressam tanto IBDV VP2 quanto NDVF.
[0281] Frangos SPF de um dia de idade são distribuídos aleatoriamente em vários grupos de 20 a 50 aves, incluindo os controles vacinados e não vacinados. Controles não-vacinados podem ser separados em dois subgrupos, incluindo aves desafiadas e não desafiadas. As aves de grupos vacinados foram injetados por via subcutânea no pescoço no OD com 0,2 mL de vacinas que contêm cada um uma dose alvo de 1.000 e os 5000 pfu. Em alternativa, a mesma dose de 0,05 ml pode ser administrada in ovo nos 2 ou 3 dias antes da eclosão. Em diferentes momentos após a vacinação, como 3 a 10 dias após a vacinação, todas as aves dos grupos vacinados e os controles desafiados são desafiados por via intraperitoneal com 0,2 mL da cepa do vírus da doença de Marek um (MDV). Cepa MDV pode ser de vários patótipos como MDV virulenta (vMDV), incluindo o JM ou GA22 isolado, MDV muito virulenta (wMDV) como os isolados RB-1B ou MD5, muito mais virulenta (+ w MDV), como os isolados T- King ou 648A. Desafio com o inóculo da cepa MDV são preparados por infecção de galinhas, colheita e congelando suas células sanguíneas em nitrogênio líquido na presença de um criopreservativo, tal como DMSO. A dose 50 infecciosa ao frango (CID50) é estabelecida para cada batelada do desafio antes de realizar estudos de vacinação / desafio. Cada grupo é clinicamente monitorado antes e após o desafio. Aves são autopsiadas após pelo menos 7 semanas após a vacinação e a presença de lesões macroscópicas da doença de Marek é verificada em cada ave. As lesões podem incluir, mas não se limitam a, as seguintes: fígado, coração, baço, gônada, rins, nervos e lesões musculares. Tal estudo pode ser realizada em frangos de corte contendo anticorpos maternos MDV. O constructo duplo SB1 também pode ser testado em combinação com outras vacinas da doença de Marek (por exemplo, cepas HVT e ou CVI988 Rispens) ou vacinas vetoriais MD. O Desafio MD também pode ser realizado pelo contato entre aves vacinadas e aves SPF MDV infectado não-vacinadas.
[0282] Tendo assim descrito em detalhe as concretizações preferidas da presente invenção, é para ser entendido que a invenção definida pelos exemplos acima não é para ser limitada aos detalhes específicos definidos na descrição acima de como muitas variações evidentes da mesma são possíveis sem se afastar do espírito ou escopo da presente invenção.
[0283] Todos os documentos citados ou mencionados neste relatório ("documentos aqui citados"), e todos os documentos citados ou referenciados aqui citaram documentos, juntamente com quaisquer instruções do fabricante, descrições, especificações do produto, e folhas de produtos de todos os produtos aqui ou em qualquer documento incorporado por referência aqui mencionada, são aqui incorporadas por referência, e podem ser empregados na prática da invenção.

Claims (10)

1. Composição ou vacina caracterizada pelo fato de que compreende: um primeiro vetor de herpesvírus de peru recombinante (HVT) que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica para e expressa um antígeno do Vírus da Doença de Newcastle (NDV-F) ligado operacionalmente a um promotor de SV40 e a um sinal poliA de SV40, em que o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de NDV-F, o promotor SV40 ligado operacionalmente e o sinal poliA de SV40 são ainda inseridos na região intergênica 1 (IG1) do locus do genoma de HVT, em que o polinucleotídeo que codifica para e expressa o NDV-F possui a sequência definida na SEQ ID NO: 1, em que o sinal poli A de SV40 possui uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 11 ou 12, e o promotor SV40 possui uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 10; e um segundo vetor de HVT recombinante que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica para e expressa um antígeno VP2 do Vírus da Doença de Gumboro (IBDV), em que o segundo vetor de HTV recombinante é vHVT13, em que o antígeno VP2 tem uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 7.
2. Composição ou vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um ou mais vetores recombinantes SB1, em que o vetor SB1 é selecionado do grupo que consiste em vSB1-009 compreendendo um promotor SV40 e um polinucleotídeo com códon otimizado que codifica um antígeno NDV-F do genótipo CAOQ2 inserido no locus UL44 do genoma SB1; vSB1-010 compreendendo um promotor de CMV de cobaia e um polinucleotídeo que codifica um antígeno NDV-F do genótipo VIId inserido no locus SORF4-US2 do genoma de SB1; vSB1-004 compreendendo um promotor mCMV IE e um polinucleotídeo que codifica um antígeno NDV-F do genótipo VIId inserido no locus US10 do genoma de SB1; vSB1-006 compreendendo um promotor SV40 e um polinucleotídeo de códon otimizado que codifica um antígeno NDV-F do genótipo VIId inserido no locus UL55/LORF5 do genoma SB1; vSB1-007 compreendendo um promotor SV40 e um polinucleotídeo de códon otimizado que codifica um antígeno NDV-F do genótipo VIId inserido no locus UL44 do genoma SB1, e vSB1-008 compreendendo um promotor SV40 e um polinucleotídeo de códon otimizado que codifica um antígeno NDV-F do genótipo CA02 inserido no locus UL55/LORF5 do genoma SB1, em que o promotor SV40 tem uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 9, o polinucleotídeo com códon otimizado que codifica um antígeno NDV-F do genótipo CAOQ2 tem uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5, o promotor CMV de cobaia tem uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 43, o polinucleotídeo que codifica um antígeno NDV-F do genótipo VIId tem uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3, o promotor mCMV IE tem uma sequência conforme estabelecido nos nucleotídeos 1241 a 2661 da SEQ ID NO: 29 e o polinucleotídeo com códon otimizado que codifica um antígeno NDV-F do genótipo VIId tem uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1.
3. Composição ou vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro vetor HVT recombinante compreende uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 18.
4. Composição ou vacina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o vetor SB1 compreende uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 40.
5. Uso da composição ou vacina conforme definida por qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para vacinação de um animal.
6. Uso da composição ou vacina conforme definida por qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para induzir uma resposta imunogênica ou protetora em um animal contra o Vírus da Doença de Newcastle (NDV), o vírus da Doença Bursal Infecciosa (ou seja, IBDV ou vírus da doença de Gumboro) e o vírus da doença de Marek (MDV).
7. Uso, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o animal é uma ave.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a ave é uma galinha, pato, ganso, peru, codorna, faisão, papagaio, tentilhão, falcão, corvo, avestruz, ema ou casuar.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a ave é uma galinha, pato, ganso, peru, codorna, faisão, avestruz, ema ou casuar
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a ave é uma galinha, pato, ganso, peru, codorna ou faisão.
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