JPH104956A - マレク病ワクチン製造のための維持可能な細胞株の改良 - Google Patents
マレク病ワクチン製造のための維持可能な細胞株の改良Info
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- JPH104956A JPH104956A JP8345881A JP34588196A JPH104956A JP H104956 A JPH104956 A JP H104956A JP 8345881 A JP8345881 A JP 8345881A JP 34588196 A JP34588196 A JP 34588196A JP H104956 A JPH104956 A JP H104956A
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- C12N5/16—Animal cells
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- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＭＤＶワクチンの製造に適した維持可能な細
胞株、その製造方法、および該細胞株を用いて鳥を感染
させてマレク病に対する免疫を与えるを提供する。 【解決手段】 ニワトリヘルパー因子陰性であり、ウイ
ルスが存在せず、化学的突然変異誘発物質で処理したニ
ワトリ胚細胞を、培地中でＭＤＶと組合せて、ＣＥＣを
ＭＤＶで感染させ；未感染ＣＥＣからＭＤＶが感染した
ＣＥＣを精製し；そしてＭＤＶが感染したＣＥＣを増殖
させて単層培養物中で細胞株を産生させる（ここで、Ｍ
ＤＶは細胞株中で非溶菌または溶菌感染として維持され
る）、ことを含んでなる、コンフルエンスでない単層培
養物中で、マレク病ウイルスが潜伏感染した維持可能な
ニワトリ細胞株を産生する方法。
胞株、その製造方法、および該細胞株を用いて鳥を感染
させてマレク病に対する免疫を与えるを提供する。 【解決手段】 ニワトリヘルパー因子陰性であり、ウイ
ルスが存在せず、化学的突然変異誘発物質で処理したニ
ワトリ胚細胞を、培地中でＭＤＶと組合せて、ＣＥＣを
ＭＤＶで感染させ；未感染ＣＥＣからＭＤＶが感染した
ＣＥＣを精製し；そしてＭＤＶが感染したＣＥＣを増殖
させて単層培養物中で細胞株を産生させる（ここで、Ｍ
ＤＶは細胞株中で非溶菌または溶菌感染として維持され
る）、ことを含んでなる、コンフルエンスでない単層培
養物中で、マレク病ウイルスが潜伏感染した維持可能な
ニワトリ細胞株を産生する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、マレク病ウイルス
（ＭＤＶ）のワクチン株に感染した維持可能なニワトリ
細胞株に関する。特に本発明は、マレク病に対して家禽
を防御するための生きたウイルスワクチンとして使用で
きる、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）のワクチン株
および血清型−２ＭＤＶのワクチン株に関し、ここでこ
れらの培養物中でＭＤＶは、増殖条件により溶菌または
非溶菌感染として存在する。
（ＭＤＶ）のワクチン株に感染した維持可能なニワトリ
細胞株に関する。特に本発明は、マレク病に対して家禽
を防御するための生きたウイルスワクチンとして使用で
きる、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）のワクチン株
および血清型−２ＭＤＶのワクチン株に関し、ここでこ
れらの培養物中でＭＤＶは、増殖条件により溶菌または
非溶菌感染として存在する。
【０００２】
【従来の技術】マレク病（ＭＤ） マレク病（ＭＤ）は、地球上のヒトを含むすべての動物
の最も一般的な臨床的新生物症である（エィチ・ジー・
パーチェス（Ｈ．Ｇ．Ｐｕｒｃｈａｓｅ）、「マレク
病：制御の科学的基礎と方法：臨床的疾患とその経済的
影響」（”Ｍａｒｅｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ Ｂａｓｉｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉｓｅａ
ｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｉｍｐａｃ
ｔ”）中（エル・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．
Ｎ．）編）、マリヌスニジョフ出版（Ｍａｒｉｎｕｓ
Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂ．）、ボストン、マサチューセ
ッツ州、１７−４２頁、（１９８５））。マレク病（Ｍ
Ｄ）は、非常に感染しやすいリンパ球増殖性の疾患であ
る。ＭＤＶは３つの血清型がある：発ガン性血清型−１
（ＭＤＶ−１）；非発ガン性血清型−２（ＭＤＶ−
２）；および非発ガン性血清型−３の七面鳥ヘルペスウ
イルス（ＨＶＴ）（ビー・ダブリュー・カルネック（Ｃ
ａｌｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）とアール・エル・ウィッター
（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、「家禽類の疾患：マレク
病」（ビー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，
Ｂ．Ｗ．）編）、アイオワ州立大学出版、エームス（Ａ
ｍｅｓ）、アイオワ、３４２−３８５頁、（１９９
１））。
の最も一般的な臨床的新生物症である（エィチ・ジー・
パーチェス（Ｈ．Ｇ．Ｐｕｒｃｈａｓｅ）、「マレク
病：制御の科学的基礎と方法：臨床的疾患とその経済的
影響」（”Ｍａｒｅｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ Ｂａｓｉｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉｓｅａ
ｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｉｍｐａｃ
ｔ”）中（エル・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．
Ｎ．）編）、マリヌスニジョフ出版（Ｍａｒｉｎｕｓ
Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂ．）、ボストン、マサチューセ
ッツ州、１７−４２頁、（１９８５））。マレク病（Ｍ
Ｄ）は、非常に感染しやすいリンパ球増殖性の疾患であ
る。ＭＤＶは３つの血清型がある：発ガン性血清型−１
（ＭＤＶ−１）；非発ガン性血清型−２（ＭＤＶ−
２）；および非発ガン性血清型−３の七面鳥ヘルペスウ
イルス（ＨＶＴ）（ビー・ダブリュー・カルネック（Ｃ
ａｌｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）とアール・エル・ウィッター
（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、「家禽類の疾患：マレク
病」（ビー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，
Ｂ．Ｗ．）編）、アイオワ州立大学出版、エームス（Ａ
ｍｅｓ）、アイオワ、３４２−３８５頁、（１９９
１））。
【０００３】ＭＤＶとＨＶＴの複製は、他の細胞結合性
ヘルペスウイルスに特徴的であり、詳細な総説がある
（エル・ジェイ・エヌ・ロス（Ｌ．Ｊ．Ｎ．Ｒｏｓ
ｓ）、「マレク病：制御の科学的基礎と方法：ウイルス
の分子生物学」（”Ｍａｒｅｋ’ｓＤｉｓｅａｓｅ：Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａｓｉｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ”）中（エル
・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．）編）、マリヌ
スニジョフ出版（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐ
ｕｂ．）、ボストン、マサチューセッツ州、１１３−１
５０頁、（１９８５））。一般的に認識されているタイ
プの細胞−ウイルスの相互作用は：ウイルス産生性感
染、潜伏、および形質転換である。ＭＤＶ−１に感染し
た鳥が形質転換に至る事象の順序は、１）Ｂ細胞におけ
る初期溶菌性増殖、２）感染したＴ細胞が関与する潜伏
期、３）永久的免疫抑制と一致する、２回目の溶菌性感
染、および４）発癌性形質転換である（ビー・ダブリュ
ー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）とアール・
エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、「家禽類
の疾患：マレク病」（ビー・ダブリュー・カルネック
（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）編）、アイオワ州立大学出
版、エームス（Ａｍｅｓ）、アイオワ、３４２−３８５
頁、（１９９１））。
ヘルペスウイルスに特徴的であり、詳細な総説がある
（エル・ジェイ・エヌ・ロス（Ｌ．Ｊ．Ｎ．Ｒｏｓ
ｓ）、「マレク病：制御の科学的基礎と方法：ウイルス
の分子生物学」（”Ｍａｒｅｋ’ｓＤｉｓｅａｓｅ：Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａｓｉｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ”）中（エル
・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．）編）、マリヌ
スニジョフ出版（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐ
ｕｂ．）、ボストン、マサチューセッツ州、１１３−１
５０頁、（１９８５））。一般的に認識されているタイ
プの細胞−ウイルスの相互作用は：ウイルス産生性感
染、潜伏、および形質転換である。ＭＤＶ−１に感染し
た鳥が形質転換に至る事象の順序は、１）Ｂ細胞におけ
る初期溶菌性増殖、２）感染したＴ細胞が関与する潜伏
期、３）永久的免疫抑制と一致する、２回目の溶菌性感
染、および４）発癌性形質転換である（ビー・ダブリュ
ー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）とアール・
エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、「家禽類
の疾患：マレク病」（ビー・ダブリュー・カルネック
（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）編）、アイオワ州立大学出
版、エームス（Ａｍｅｓ）、アイオワ、３４２−３８５
頁、（１９９１））。
【０００４】ＭＤＶ−２とＨＶＴに感染した鳥における
事象の順序は、初期の溶菌性相の後、非Ｔ細胞での潜
伏、または発癌性形質転換のない潜伏期に限定されてい
るようである（ビー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌ
ｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）とアール・エル・ウィッター（Ｒ．
Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、「家禽類の疾患：マレク病」（ビ
ー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．
Ｗ．）編）、アイオワ州立大学出版、エームス（Ａｍｅ
ｓ）、アイオワ、３４２−３８５頁、（１９９１））。
事象の順序は、初期の溶菌性相の後、非Ｔ細胞での潜
伏、または発癌性形質転換のない潜伏期に限定されてい
るようである（ビー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌ
ｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）とアール・エル・ウィッター（Ｒ．
Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、「家禽類の疾患：マレク病」（ビ
ー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．
Ｗ．）編）、アイオワ州立大学出版、エームス（Ａｍｅ
ｓ）、アイオワ、３４２−３８５頁、（１９９１））。
【０００５】鳥類細胞株 家禽産業では、マレク病ワクチンの製造に使用でき、多
価ワクチンのための組換えＭＤＶベクターの開発を簡便
にできる継続性のある鳥類細胞株を必要としてきた。本
発明までに多くの鳥類細胞株が開発されている（ケー・
ナザリアン（Ｎａｚａｒｉａｎ，Ｋ．）、Ａｖｉａｎ
Ｐａｔｈｏｌ．１６：５２７−５４４（１９８７））
が、いずれの細胞株もワクチン製造においてニワトリ胚
繊維芽（ＣＥＦ）細胞を代替することができない。従来
の細胞株は、ウイルスで形質転換した細胞に由来する
か、または、化学的に形質転換した細胞に由来する場合
は、ニワトリに接種すると癌を引き起こしたため、また
は細胞株から回収されるウイルスの最大力価は、商業的
生産のためには不十分であったため、うまくいかなかっ
た。従って、家禽業のワクチン製造者は、マレク病ワク
チンおよび他の生きたワクチンおよび死滅ワクチンを製
造するのに、初代ＣＥＦ細胞を使用し続けており、これ
は、ＣＥＦの製造に特異的病原体を含まない（ＳＰＦ）
卵の継続的供給に依存する費用のかかる労働集約的な工
程である。
価ワクチンのための組換えＭＤＶベクターの開発を簡便
にできる継続性のある鳥類細胞株を必要としてきた。本
発明までに多くの鳥類細胞株が開発されている（ケー・
ナザリアン（Ｎａｚａｒｉａｎ，Ｋ．）、Ａｖｉａｎ
Ｐａｔｈｏｌ．１６：５２７−５４４（１９８７））
が、いずれの細胞株もワクチン製造においてニワトリ胚
繊維芽（ＣＥＦ）細胞を代替することができない。従来
の細胞株は、ウイルスで形質転換した細胞に由来する
か、または、化学的に形質転換した細胞に由来する場合
は、ニワトリに接種すると癌を引き起こしたため、また
は細胞株から回収されるウイルスの最大力価は、商業的
生産のためには不十分であったため、うまくいかなかっ
た。従って、家禽業のワクチン製造者は、マレク病ワク
チンおよび他の生きたワクチンおよび死滅ワクチンを製
造するのに、初代ＣＥＦ細胞を使用し続けており、これ
は、ＣＥＦの製造に特異的病原体を含まない（ＳＰＦ）
卵の継続的供給に依存する費用のかかる労働集約的な工
程である。
【０００６】マレク病ワクチン マレク病ワクチンは、家禽産業で最も広く使用されてい
るワクチンである。１９７０年代の生きたウイルスのマ
レク病ワクチンの開発以来、マレク病による死亡は大幅
に低下した（ビー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌｎ
ｅｋ，Ｂ．Ｗ．）とアール・エル・ウィッター（Ｒ．
Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、「家禽類の疾患：マレク病」（ビ
ー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．
Ｗ．）編）、アイオワ州立大学出版、エームス（Ａｍｅ
ｓ）、アイオワ、３４２−３８５頁（１９９１））。最
も広く使用されているマレク病ワクチンは、生きたＨＶ
Ｔまたは、または生きたＨＶＴとＭＤＶの病原性血清型
２（ＭＤＶ−２）の２価混合物である。ＨＶＴと血清型
２ＭＤＶの２価混合物は、ＨＶＴが充分に有効でない場
合に特に、マレク病に対して相乗的防御作用を示す（ア
ール・エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、Ａ
ｖｉａｎ Ｐａｔｈ．１１：４９−６２（１９８２）；
アール・エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）と
エル・エフ・リー（Ｌ．Ｆ．Ｌｅｅ）、Ａｖｉａｎ Ｐ
ａｔｈｏｌ．１３：７５−９２（１９８４）；アール・
エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、「マレク
病：制御の科学的基礎と方法：予防接種の原理」（エル
・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．）編）、マリヌ
スニジョフ出版（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐ
ｕｂ．）、ボストン、マサチューセッツ州、２０３−２
５０頁（１９８５））。
るワクチンである。１９７０年代の生きたウイルスのマ
レク病ワクチンの開発以来、マレク病による死亡は大幅
に低下した（ビー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌｎ
ｅｋ，Ｂ．Ｗ．）とアール・エル・ウィッター（Ｒ．
Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、「家禽類の疾患：マレク病」（ビ
ー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．
Ｗ．）編）、アイオワ州立大学出版、エームス（Ａｍｅ
ｓ）、アイオワ、３４２−３８５頁（１９９１））。最
も広く使用されているマレク病ワクチンは、生きたＨＶ
Ｔまたは、または生きたＨＶＴとＭＤＶの病原性血清型
２（ＭＤＶ−２）の２価混合物である。ＨＶＴと血清型
２ＭＤＶの２価混合物は、ＨＶＴが充分に有効でない場
合に特に、マレク病に対して相乗的防御作用を示す（ア
ール・エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、Ａ
ｖｉａｎ Ｐａｔｈ．１１：４９−６２（１９８２）；
アール・エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）と
エル・エフ・リー（Ｌ．Ｆ．Ｌｅｅ）、Ａｖｉａｎ Ｐ
ａｔｈｏｌ．１３：７５−９２（１９８４）；アール・
エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、「マレク
病：制御の科学的基礎と方法：予防接種の原理」（エル
・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．）編）、マリヌ
スニジョフ出版（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐ
ｕｂ．）、ボストン、マサチューセッツ州、２０３−２
５０頁（１９８５））。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】マレク病ワクチンは、
その製造のために毎週ＣＥＦ細胞を製造する必要がある
が、世界的に使用されている（エム・パチソン（Ｍ．Ｐ
ａｔｔｉｓｏｎ）、「マレク病：制御の科学的基礎と方
法：家禽産業によるマレク病の制御：実際的考察」（エ
ル・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．）編）、マリ
ヌスニジョフ出版（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ
Ｐｕｂ．）、ボストン、マサチューセッツ州、３４１−
３５０頁（１９８５））。従って、ワクチン製造は、特
異的病原体を含まない（ＳＰＦ）群の受精卵の継続的か
つ信頼できる供給に依存している。ＳＰＦ群は特殊な条
件下で飼育され、鳥類病原体が存在しないことを定期的
に証明されている（ディー・エィチ・ソーントン（Ｄ．
Ｈ．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ）、「マレク病：制御の科学的基
礎と方法：ワクチンの品質管理と標準化」（エル・エヌ
・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．）編）、マリヌスニジ
ョフ出版（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕ
ｂ．）、ボストン、マサチューセッツ州、２６７−２９
２頁（１９８５））。ＳＰＦ受精卵の供給が途絶える
と、マレク病ワクチンの製造が途絶えるであろう。ＭＤ
Ｖワクチン製造の継続的な細胞株は、世界の家禽産業に
大きな経済的利益を持たらすであろう。
その製造のために毎週ＣＥＦ細胞を製造する必要がある
が、世界的に使用されている（エム・パチソン（Ｍ．Ｐ
ａｔｔｉｓｏｎ）、「マレク病：制御の科学的基礎と方
法：家禽産業によるマレク病の制御：実際的考察」（エ
ル・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．）編）、マリ
ヌスニジョフ出版（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ
Ｐｕｂ．）、ボストン、マサチューセッツ州、３４１−
３５０頁（１９８５））。従って、ワクチン製造は、特
異的病原体を含まない（ＳＰＦ）群の受精卵の継続的か
つ信頼できる供給に依存している。ＳＰＦ群は特殊な条
件下で飼育され、鳥類病原体が存在しないことを定期的
に証明されている（ディー・エィチ・ソーントン（Ｄ．
Ｈ．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ）、「マレク病：制御の科学的基
礎と方法：ワクチンの品質管理と標準化」（エル・エヌ
・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．）編）、マリヌスニジ
ョフ出版（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕ
ｂ．）、ボストン、マサチューセッツ州、２６７−２９
２頁（１９８５））。ＳＰＦ受精卵の供給が途絶える
と、マレク病ワクチンの製造が途絶えるであろう。ＭＤ
Ｖワクチン製造の継続的な細胞株は、世界の家禽産業に
大きな経済的利益を持たらすであろう。
【０００８】現在のマレク病ワクチンは、感染したＣＥ
Ｆの懸濁物、またはマレク病ウイルスの種々の株で感染
させた超音波処理したＣＥＦから作成した、細胞を含ま
ないウイルス懸濁物のいずれかである。ＭＤＶを増殖さ
せるのに適した維持可能な細胞株がないため、ＭＤＶワ
クチン産業ではワクチンウイルスの製造に初代ＣＥＦを
使用している（エー・イー・チャーチル（Ｃｈｕｒｃｈ
ｉｌｌ，Ａ．Ｅ．）、ワクチンの製造。「マレク病：制
御の科学的基礎と方法：ワクチンの製造」（”Ｍａｒｅ
ｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａ
ｓｉｓ ａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏ
ｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ
ｓ”）。（エル・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．
Ｎ．）編）、２５１−２６６頁、マリヌスニジョフ出版
（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂ．）、ボス
トン、マサチューセッツ州（１９８５））。初代ＣＥＦ
の寿命は限られている（約２〜３週間）ため、毎週製造
する必要があり、これがＭＤＶワクチン製造のコストを
引き上げる。
Ｆの懸濁物、またはマレク病ウイルスの種々の株で感染
させた超音波処理したＣＥＦから作成した、細胞を含ま
ないウイルス懸濁物のいずれかである。ＭＤＶを増殖さ
せるのに適した維持可能な細胞株がないため、ＭＤＶワ
クチン産業ではワクチンウイルスの製造に初代ＣＥＦを
使用している（エー・イー・チャーチル（Ｃｈｕｒｃｈ
ｉｌｌ，Ａ．Ｅ．）、ワクチンの製造。「マレク病：制
御の科学的基礎と方法：ワクチンの製造」（”Ｍａｒｅ
ｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａ
ｓｉｓ ａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏ
ｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ
ｓ”）。（エル・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．
Ｎ．）編）、２５１−２６６頁、マリヌスニジョフ出版
（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂ．）、ボス
トン、マサチューセッツ州（１９８５））。初代ＣＥＦ
の寿命は限られている（約２〜３週間）ため、毎週製造
する必要があり、これがＭＤＶワクチン製造のコストを
引き上げる。
【０００９】ＣＥＦ細胞培養物中の継代数は、ＭＤＶに
ついて限りがある。ＣＥＦ中で３つのすべてのＭＤＶ血
清型を連続的に培養すると、血清型−１ＭＤＶの弱毒
化、および血清型−２と３についてはＭＤＶに対して防
御効率の低下を引き起こす。培養物中の血清型−１ＭＤ
Ｖの弱毒化は、広く研究されており、ウイルスゲノムの
ｈｅｔ領域の拡張に相関している。この拡張は、サザン
解析またはＰＣＲにより容易に追跡できる。高継代血清
型−２および−３ＭＤＶの防御効率の低下の理由は、不
明である。
ついて限りがある。ＣＥＦ中で３つのすべてのＭＤＶ血
清型を連続的に培養すると、血清型−１ＭＤＶの弱毒
化、および血清型−２と３についてはＭＤＶに対して防
御効率の低下を引き起こす。培養物中の血清型−１ＭＤ
Ｖの弱毒化は、広く研究されており、ウイルスゲノムの
ｈｅｔ領域の拡張に相関している。この拡張は、サザン
解析またはＰＣＲにより容易に追跡できる。高継代血清
型−２および−３ＭＤＶの防御効率の低下の理由は、不
明である。
【００１０】エィチ・オグラ（Ｏｇｕｒａ，Ｈ．）とテ
ィー・フジワラ（Ｔ．Ｆｕｊｉｗａｒａ）（Ａｃｔａ
Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ ４１：１４１−１４３（１９
８７））は、ニワトリ胚細胞を化学的に形質転換して細
胞株（ＣＨＣＣ−ＯＵ２）を樹立した。この細胞株は、
外観が繊維芽細胞様であり、接触阻害され、寒天中でコ
ロニーを形成しなかった。著者は、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細
胞株は悪性に形質転換されず、内因性鳥類レトロウイル
スを産生しないが、ニューカッスル病ウイルスおよびい
くつかの鳥類レトロウイルスの亜群の複製を支持するこ
とができることを証明した。しかし、著者はその研究
を、マレク病ウイルスや感染性滑液嚢ウイルスのような
他の鳥類ウイルスの複製に拡大しなかった。
ィー・フジワラ（Ｔ．Ｆｕｊｉｗａｒａ）（Ａｃｔａ
Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ ４１：１４１−１４３（１９
８７））は、ニワトリ胚細胞を化学的に形質転換して細
胞株（ＣＨＣＣ−ＯＵ２）を樹立した。この細胞株は、
外観が繊維芽細胞様であり、接触阻害され、寒天中でコ
ロニーを形成しなかった。著者は、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細
胞株は悪性に形質転換されず、内因性鳥類レトロウイル
スを産生しないが、ニューカッスル病ウイルスおよびい
くつかの鳥類レトロウイルスの亜群の複製を支持するこ
とができることを証明した。しかし、著者はその研究
を、マレク病ウイルスや感染性滑液嚢ウイルスのような
他の鳥類ウイルスの複製に拡大しなかった。
【００１１】
【課題を解決するための手段】従って、本発明の目的
は、ＭＤＶワクチンの製造に適した維持可能な細胞株を
提供することである。さらに本発明の目的は、維持可能
なＭＤＶワクチン細胞株を製造する方法を提供すること
である。さらに本発明の目的は、経済的なＭＤＶワクチ
ン細胞株の製造方法および有効なワクチン細胞株の使用
方法を提供することである。さらに本発明の目的は、Ｍ
ＤＶワクチン細胞株で鳥を感染させてマレク病に対する
免疫を与える方法を提供することである。これらおよび
他の目的は、以下の説明および図面により明らかになる
であろう。
は、ＭＤＶワクチンの製造に適した維持可能な細胞株を
提供することである。さらに本発明の目的は、維持可能
なＭＤＶワクチン細胞株を製造する方法を提供すること
である。さらに本発明の目的は、経済的なＭＤＶワクチ
ン細胞株の製造方法および有効なワクチン細胞株の使用
方法を提供することである。さらに本発明の目的は、Ｍ
ＤＶワクチン細胞株で鳥を感染させてマレク病に対する
免疫を与える方法を提供することである。これらおよび
他の目的は、以下の説明および図面により明らかになる
であろう。
【００１２】本発明は、ニワトリヘルパー因子（Ｃｈ
ｆ）陰性であり、ウイルスが存在せず、化学的突然変異
誘発物質で処理し次にマレク病ウイルス（ＭＤＶ）で感
染させたニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）から得られる、単層
培養物中のマレク病ウイルスに感染した維持可能なニワ
トリ細胞株に関し、該細胞株はインビボで鳥類に感染す
ることができ、ＭＤＶは細胞株中で非溶菌または溶菌感
染として維持できる。
ｆ）陰性であり、ウイルスが存在せず、化学的突然変異
誘発物質で処理し次にマレク病ウイルス（ＭＤＶ）で感
染させたニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）から得られる、単層
培養物中のマレク病ウイルスに感染した維持可能なニワ
トリ細胞株に関し、該細胞株はインビボで鳥類に感染す
ることができ、ＭＤＶは細胞株中で非溶菌または溶菌感
染として維持できる。
【００１３】さらに本発明は、コンフルエンスでない単
層培養物中で維持可能なマレク病ウイルス潜伏感染ニワ
トリ細胞株を産生させる方法に関し：ニワトリヘルパー
因子陰性であり、ウイルスが存在せず、化学的突然変異
誘発物質で処理したニワトリ胚細胞を、培地中でＭＤＶ
と組合せて、ＣＥＣをＭＤＶで感染させ；未感染ＣＥＣ
からＭＤＶが感染したＣＥＣを精製し；そしてＭＤＶが
感染したＣＥＣを増殖させて単層培養物中で細胞株を産
生させる（ここで、ＭＤＶは細胞株中で非溶菌または溶
菌感染として維持される）、ことを含んでなる、コンフ
ルエンスでない単層培養物中で、マレク病ウイルスが潜
伏感染した維持可能なニワトリ細胞株を産生する方法に
関する。
層培養物中で維持可能なマレク病ウイルス潜伏感染ニワ
トリ細胞株を産生させる方法に関し：ニワトリヘルパー
因子陰性であり、ウイルスが存在せず、化学的突然変異
誘発物質で処理したニワトリ胚細胞を、培地中でＭＤＶ
と組合せて、ＣＥＣをＭＤＶで感染させ；未感染ＣＥＣ
からＭＤＶが感染したＣＥＣを精製し；そしてＭＤＶが
感染したＣＥＣを増殖させて単層培養物中で細胞株を産
生させる（ここで、ＭＤＶは細胞株中で非溶菌または溶
菌感染として維持される）、ことを含んでなる、コンフ
ルエンスでない単層培養物中で、マレク病ウイルスが潜
伏感染した維持可能なニワトリ細胞株を産生する方法に
関する。
【００１４】さらに本発明は、鳥をマレク病ウイルスで
感染させる方法に関し：ニワトリヘルパー因子陰性であ
り、ウイルスが存在せず、化学的突然変異誘発物質で処
理し、次にインビボで鳥類に感染することができるＭＤ
Ｖ（ここで、ＭＤＶは細胞株中で非溶菌または溶菌感染
として維持される）で感染させたニワトリ胚細胞から得
られた、単層培養物として維持されるマレク病ウイルス
に感染した維持可能なニワトリ細胞株により産生される
ワクチンを提供し；そして、鳥にこのワクチンを接種す
る、ことを含んでなる。
感染させる方法に関し：ニワトリヘルパー因子陰性であ
り、ウイルスが存在せず、化学的突然変異誘発物質で処
理し、次にインビボで鳥類に感染することができるＭＤ
Ｖ（ここで、ＭＤＶは細胞株中で非溶菌または溶菌感染
として維持される）で感染させたニワトリ胚細胞から得
られた、単層培養物として維持されるマレク病ウイルス
に感染した維持可能なニワトリ細胞株により産生される
ワクチンを提供し；そして、鳥にこのワクチンを接種す
る、ことを含んでなる。
【００１５】本発明は、ニワトリヘルパー因子陰性であ
り、ウイルスが存在せず、化学的突然変異誘発物質で処
理し、次にＭＤＶ（ここで、ＭＤＶは細胞株中で非溶菌
または溶菌感染として維持される）で感染させた、長期
間維持されるニワトリ胚細胞から得られた、マレク病ウ
イルスに感染した維持可能な繊維芽細胞細胞株を含有す
る、投薬単位型の鳥類ワクチンに関する。
り、ウイルスが存在せず、化学的突然変異誘発物質で処
理し、次にＭＤＶ（ここで、ＭＤＶは細胞株中で非溶菌
または溶菌感染として維持される）で感染させた、長期
間維持されるニワトリ胚細胞から得られた、マレク病ウ
イルスに感染した維持可能な繊維芽細胞細胞株を含有す
る、投薬単位型の鳥類ワクチンに関する。
【００１６】
【発明の実施の態様】ＭＤＶは、ＭＤＶの３つの血清型
（すなわち、血清型１、血清型２、または血清型３（Ｈ
ＶＴとしても知られている））のいずれかを記載するの
に使用され、そしてＭＤＶ ＯＣＬは３つのＭＤＶ血清
型の単独または組合せよりなる、任意の細胞株を意味す
る。ＭＤＶまたはＭＤＶ ＯＣＬは本発明の主題であ
り、具体的な実施態様（特定のＭＤＶ株よりなる細胞
株）が例として記載されている場合以外に、本明細書中
で使用される。ＭＤＶの特定の株で感染された細胞株
は、以下のように記載する：ＭＤＶ−ＯＵ２すなわちＭ
ＤＶ−ＯＵ２．２またはＭＤＶ−ＯＵ２．１は、血清型
１ＭＤＶ株Ｍｄ１１を含んでなる任意の細胞株を意味す
る。ＳＢ１−ＯＣＬは具体的には、血清型２ＭＤＶ株Ｓ
Ｂ１を含んでなる任意の細胞株を意味する。ＦＣ１２６
−ＯＣＬは具体的には、血清型３ＭＤＶ株ＦＣ１２６を
含んでなる任意の細胞株を意味する。
（すなわち、血清型１、血清型２、または血清型３（Ｈ
ＶＴとしても知られている））のいずれかを記載するの
に使用され、そしてＭＤＶ ＯＣＬは３つのＭＤＶ血清
型の単独または組合せよりなる、任意の細胞株を意味す
る。ＭＤＶまたはＭＤＶ ＯＣＬは本発明の主題であ
り、具体的な実施態様（特定のＭＤＶ株よりなる細胞
株）が例として記載されている場合以外に、本明細書中
で使用される。ＭＤＶの特定の株で感染された細胞株
は、以下のように記載する：ＭＤＶ−ＯＵ２すなわちＭ
ＤＶ−ＯＵ２．２またはＭＤＶ−ＯＵ２．１は、血清型
１ＭＤＶ株Ｍｄ１１を含んでなる任意の細胞株を意味す
る。ＳＢ１−ＯＣＬは具体的には、血清型２ＭＤＶ株Ｓ
Ｂ１を含んでなる任意の細胞株を意味する。ＦＣ１２６
−ＯＣＬは具体的には、血清型３ＭＤＶ株ＦＣ１２６を
含んでなる任意の細胞株を意味する。
【００１７】標題「マレク病ウイルスに感染した維持可
能なニワトリ細胞株」の、１９９５年１０月２７日出願
の米国特許出願第０８／５４９，０４５号に記載された
実験は、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株が血清型−１ＭＤＶで
感染されることを証明した。ＭＤＶはこの細胞株中で安
定に維持され、感染した細胞は継続的に増殖した。しか
し、感染の方法は予想外であった。ＣＥＦまたは他の鳥
類細胞のＭＤＶ感染と異なり、感染したＣＨＣＣ−ＯＵ
２単層上のプラーク形成は見られず、単層がコンフルエ
ンスになるまで感染性ウイルスは産生されず、細胞株は
接触阻害された。接触阻害では、ＭＤＶ感染の細胞変性
作用（ＣＰＥ）が明らかになり、感染性ウイルスが産生
された。接触阻害の前に、ＭＤＶは潜伏または半潜伏状
態で、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株中で維持され、一方、Ｍ
ＤＶの感染したＣＥＦまたは他の鳥類細胞は、プラーク
を形成し、細胞単層がコンフルエンスであるかまたはサ
ブコンフルエンスであるかにかかわらず、感染性ウイル
スを産生する。従って、ＣＥＦについて使用される典型
的な濃度に匹敵する濃度で培養プレートに蒔かれたＣＨ
ＣＣ−ＯＵ２細胞の感染は、プラークや感染性ウイルス
を２週間またはそれ以上形成せず、一方感染したＣＥＦ
の場合は、感染後約２〜３日でプラークが出現する。こ
れは、倍加時間が２４時間であるＣＥＦに比較して、Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞株の倍加時間が約３〜５日であるた
めである。
能なニワトリ細胞株」の、１９９５年１０月２７日出願
の米国特許出願第０８／５４９，０４５号に記載された
実験は、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株が血清型−１ＭＤＶで
感染されることを証明した。ＭＤＶはこの細胞株中で安
定に維持され、感染した細胞は継続的に増殖した。しか
し、感染の方法は予想外であった。ＣＥＦまたは他の鳥
類細胞のＭＤＶ感染と異なり、感染したＣＨＣＣ−ＯＵ
２単層上のプラーク形成は見られず、単層がコンフルエ
ンスになるまで感染性ウイルスは産生されず、細胞株は
接触阻害された。接触阻害では、ＭＤＶ感染の細胞変性
作用（ＣＰＥ）が明らかになり、感染性ウイルスが産生
された。接触阻害の前に、ＭＤＶは潜伏または半潜伏状
態で、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株中で維持され、一方、Ｍ
ＤＶの感染したＣＥＦまたは他の鳥類細胞は、プラーク
を形成し、細胞単層がコンフルエンスであるかまたはサ
ブコンフルエンスであるかにかかわらず、感染性ウイル
スを産生する。従って、ＣＥＦについて使用される典型
的な濃度に匹敵する濃度で培養プレートに蒔かれたＣＨ
ＣＣ−ＯＵ２細胞の感染は、プラークや感染性ウイルス
を２週間またはそれ以上形成せず、一方感染したＣＥＦ
の場合は、感染後約２〜３日でプラークが出現する。こ
れは、倍加時間が２４時間であるＣＥＦに比較して、Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞株の倍加時間が約３〜５日であるた
めである。
【００１８】サブコンフルエンスなＭＤＶ感染ＣＨＣＣ
−ＯＵ２細胞株（ＭＤＶ−ＯＵ２細胞株）から単離した
蛋白のウェスタンブロット解析により、典型的に潜伏期
に発現されるＭＤＶ蛋白（ｐｐ３８とｐｐ１４）が検出
されたが、後期蛋白（例えば、ｇＢ、ｇＣ、ｇＥ、およ
びｇＩ（これらはすべてウイルス産生性感染で発現され
る蛋白である））は、検出されなかった（標題「マレク
病ウイルスに感染した維持可能な細胞株」の、１９９５
年１０月２７日出願の米国特許出願第０８／５４９，０
４５号）。サブコンフルエンスなＭＤＶ−ＯＵ２細胞株
の免疫蛍光測定法でも、ｐｐ３８とｐｐ１４のみが検出
された。コンフルエンスな細胞株の免疫蛍光測定法で
は、ｇＢのような後期蛋白のみが検出された。これらの
結果は、サブコンフルエンスなＭＤＶ−ＯＵ２細胞株中
で潜伏感染として存在することを示した。
−ＯＵ２細胞株（ＭＤＶ−ＯＵ２細胞株）から単離した
蛋白のウェスタンブロット解析により、典型的に潜伏期
に発現されるＭＤＶ蛋白（ｐｐ３８とｐｐ１４）が検出
されたが、後期蛋白（例えば、ｇＢ、ｇＣ、ｇＥ、およ
びｇＩ（これらはすべてウイルス産生性感染で発現され
る蛋白である））は、検出されなかった（標題「マレク
病ウイルスに感染した維持可能な細胞株」の、１９９５
年１０月２７日出願の米国特許出願第０８／５４９，０
４５号）。サブコンフルエンスなＭＤＶ−ＯＵ２細胞株
の免疫蛍光測定法でも、ｐｐ３８とｐｐ１４のみが検出
された。コンフルエンスな細胞株の免疫蛍光測定法で
は、ｇＢのような後期蛋白のみが検出された。これらの
結果は、サブコンフルエンスなＭＤＶ−ＯＵ２細胞株中
で潜伏感染として存在することを示した。
【００１９】ＭＤＶ−ＯＵ２細胞株は、ＭＤＶ感染を初
代ＣＥＦに移し、ＭＤＶ−ＯＵ２細胞株を接種した感受
性のあるニワトリでマレク病の臨床症状を誘発した（１
９９５年１０月２７日出願の米国特許出願第０８／５４
９，０４５号）。感染後種々の時間で感染した鳥から採
取した末梢血リンパ球は、ＣＥＦ単層で培養するときＭ
ＤＶプラークを産生した。感染した鳥の腎臓から単離し
たＤＮＡはまた、ＰＣＲによりＭＤＶ感染が証明され
た。最後に、組織学的評価により、接種した鳥から単離
した種々の組織で、リンパ球浸潤と初期の活性なリンパ
腫が見られた。これらの結果は、ＭＤＶ−ＯＵ２細胞株
が初代細胞およびニワトリにＭＤＶを移動させることが
できることを明確に証明している。
代ＣＥＦに移し、ＭＤＶ−ＯＵ２細胞株を接種した感受
性のあるニワトリでマレク病の臨床症状を誘発した（１
９９５年１０月２７日出願の米国特許出願第０８／５４
９，０４５号）。感染後種々の時間で感染した鳥から採
取した末梢血リンパ球は、ＣＥＦ単層で培養するときＭ
ＤＶプラークを産生した。感染した鳥の腎臓から単離し
たＤＮＡはまた、ＰＣＲによりＭＤＶ感染が証明され
た。最後に、組織学的評価により、接種した鳥から単離
した種々の組織で、リンパ球浸潤と初期の活性なリンパ
腫が見られた。これらの結果は、ＭＤＶ−ＯＵ２細胞株
が初代細胞およびニワトリにＭＤＶを移動させることが
できることを明確に証明している。
【００２０】本発明は、１）ＭＤＶ細胞株は、潜伏様状
態のＭＤＶを含有すること、２）感染ＭＤＶは、細胞を
コンフルエンスになるまで増殖させることにより、ＭＤ
Ｖ細胞株から回収できること、３）ＭＤＶ細胞株は無期
限に維持できること、および４）ＭＤＶはＭＤＶ細胞株
中で安定に維持されることを示す。
態のＭＤＶを含有すること、２）感染ＭＤＶは、細胞を
コンフルエンスになるまで増殖させることにより、ＭＤ
Ｖ細胞株から回収できること、３）ＭＤＶ細胞株は無期
限に維持できること、および４）ＭＤＶはＭＤＶ細胞株
中で安定に維持されることを示す。
【００２１】ＭＤＶが、サブコンフルエンスなＣＨＣＣ
−ＯＵ２細胞株中で潜伏または潜伏様状態で維持される
こと、そしてＭＤＶが誘発したＣＰＥは、細胞がコンフ
ルエンスなレベルになるまで明瞭にならないことは、予
想外であった。潜伏様状態でＭＤＶを有するＣＨＣＣ−
ＯＵ２細胞株は、分裂することができ、ＭＤＶを娘細胞
に移すことができる。ＭＤＶ感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞
株が、培養物中でサブコンフルエンスレベルで継代され
る限り、純粋なＭＤＶ−ＯＣＬ細胞株を樹立することが
できる。ＭＤＶ−ＯＣＬ細胞株をコンフルエンスにする
ことで、ＣＰＥと感染ウイルスを産生することができ
る。しかし、サブコンフルエンスなＭＤＶ−ＯＣＬ細胞
株は、ウイルスをＣＥＦに移し、ワクチン中で免疫を誘
導することができる。
−ＯＵ２細胞株中で潜伏または潜伏様状態で維持される
こと、そしてＭＤＶが誘発したＣＰＥは、細胞がコンフ
ルエンスなレベルになるまで明瞭にならないことは、予
想外であった。潜伏様状態でＭＤＶを有するＣＨＣＣ−
ＯＵ２細胞株は、分裂することができ、ＭＤＶを娘細胞
に移すことができる。ＭＤＶ感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞
株が、培養物中でサブコンフルエンスレベルで継代され
る限り、純粋なＭＤＶ−ＯＣＬ細胞株を樹立することが
できる。ＭＤＶ−ＯＣＬ細胞株をコンフルエンスにする
ことで、ＣＰＥと感染ウイルスを産生することができ
る。しかし、サブコンフルエンスなＭＤＶ−ＯＣＬ細胞
株は、ウイルスをＣＥＦに移し、ワクチン中で免疫を誘
導することができる。
【００２２】血清型３ＭＤＶ（ＨＶＴ株ＦＣ１２６−Ｏ
ＣＬ）感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株は、ブダペスト条約
に従い、１９９６年２月２２日にＡＴＣＣ １２０５２
として寄託され、名称と番号で依頼することにより入手
可能である。同様に、血清型２ＭＤＶ（株ＳＢ１−ＯＣ
Ｌ）感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株は、ブダペスト条約に
従い、１９９６年２月２２日にＡＴＣＣ １２０５３と
して寄託され、名称と番号で依頼することにより入手可
能である。血清型１は、ブダペスト条約に従い、１９９
５年９月２８日にＡＴＣＣ ＣＲＬ １１９８５として
寄託された（ＭＤＶ ＯＵ２．２）。寄託物として要求
される以外には、許可またはライセンスは認められな
い。
ＣＬ）感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株は、ブダペスト条約
に従い、１９９６年２月２２日にＡＴＣＣ １２０５２
として寄託され、名称と番号で依頼することにより入手
可能である。同様に、血清型２ＭＤＶ（株ＳＢ１−ＯＣ
Ｌ）感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株は、ブダペスト条約に
従い、１９９６年２月２２日にＡＴＣＣ １２０５３と
して寄託され、名称と番号で依頼することにより入手可
能である。血清型１は、ブダペスト条約に従い、１９９
５年９月２８日にＡＴＣＣ ＣＲＬ １１９８５として
寄託された（ＭＤＶ ＯＵ２．２）。寄託物として要求
される以外には、許可またはライセンスは認められな
い。
【００２３】ＣＨＣＣ−ＯＵ２、ＳＢ１−ＯＣＬ、ＭＤ
Ｖ−ＯＣＬおよびＦＣ１２６−ＯＣＬ細胞株の区別でき
る特徴 ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株は、細胞培養で継続性のある増
殖が可能であり、メチルニトロニトロソグアニジン（Ｍ
ＮＮＮＧ）で処理して形質転換したニワトリ胚細胞から
得られた。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、繊維芽細胞様外観
を示し、足場非依存性増殖を示す。
Ｖ−ＯＣＬおよびＦＣ１２６−ＯＣＬ細胞株の区別でき
る特徴 ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株は、細胞培養で継続性のある増
殖が可能であり、メチルニトロニトロソグアニジン（Ｍ
ＮＮＮＧ）で処理して形質転換したニワトリ胚細胞から
得られた。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、繊維芽細胞様外観
を示し、足場非依存性増殖を示す。
【００２４】本発明の主題であるＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞
株は、以下の基準により他の鳥類細胞株から区別され
る。本発明のＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、初期細胞密度に
依存して倍加時間は３〜５日である。低密度（３．３×
１０4 細胞／ｃｍ2 以下）で蒔いた細胞は、細胞密度
３．３×１０4 〜５．６×１０4 細胞／ｃｍ2 の範囲の
細胞密度で蒔いた細胞より遅い初期速度で複製する。さ
らに、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の複製は接触阻害され、Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞は軟寒天中でコロニーを形成しな
い。他の鳥類細胞株は接触阻害表現型を示さず、ＭＮＮ
ＮＧで処理して得られた多くの形質転換細胞株は、軟寒
天中でコロニーを形成するため、この特徴は本発明のＣ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞にユニークである。ＣＨＣＣ−ＯＵ
２単層が平均細胞密度１．７×１０5 細胞／ｃｍ2 に達
すると、細胞はＧ0 期に入り、複製を停止する。すべて
の他の鳥類細胞株と異なり、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は非
悪性であり、鳥に注入しても癌を形成しない。
株は、以下の基準により他の鳥類細胞株から区別され
る。本発明のＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、初期細胞密度に
依存して倍加時間は３〜５日である。低密度（３．３×
１０4 細胞／ｃｍ2 以下）で蒔いた細胞は、細胞密度
３．３×１０4 〜５．６×１０4 細胞／ｃｍ2 の範囲の
細胞密度で蒔いた細胞より遅い初期速度で複製する。さ
らに、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の複製は接触阻害され、Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞は軟寒天中でコロニーを形成しな
い。他の鳥類細胞株は接触阻害表現型を示さず、ＭＮＮ
ＮＧで処理して得られた多くの形質転換細胞株は、軟寒
天中でコロニーを形成するため、この特徴は本発明のＣ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞にユニークである。ＣＨＣＣ−ＯＵ
２単層が平均細胞密度１．７×１０5 細胞／ｃｍ2 に達
すると、細胞はＧ0 期に入り、複製を停止する。すべて
の他の鳥類細胞株と異なり、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は非
悪性であり、鳥に注入しても癌を形成しない。
【００２５】本発明のＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞のさらなる
区別できる特徴は、以下を含んでなる。
区別できる特徴は、以下を含んでなる。
【００２６】１）ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株は、主要組織
適合遺伝子複合体クラス１（ＭＨＣクラス１）分子を発
現する。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、ＭＨＣクラス１Ｂ13
ハプロタイプを示し、ＭＨＣクラス１Ｂ5 ハプロタイプ
に対して強い交差反応性を有する。ニワトリ胚繊維芽細
胞は、検出できるＭＨＣクラス１分子はほとんど発現し
ない。他の鳥類細胞株または移植可能な癌は、いずれも
ＭＨＣクラス１Ｂ13／Ｂ5 遺伝子型を有さないようであ
る（Ｎａｚｅｒｉａｎ Ａｖｉａｎ ｐａｔｈ．１６：
５２７−５４４（１９８７））。
適合遺伝子複合体クラス１（ＭＨＣクラス１）分子を発
現する。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、ＭＨＣクラス１Ｂ13
ハプロタイプを示し、ＭＨＣクラス１Ｂ5 ハプロタイプ
に対して強い交差反応性を有する。ニワトリ胚繊維芽細
胞は、検出できるＭＨＣクラス１分子はほとんど発現し
ない。他の鳥類細胞株または移植可能な癌は、いずれも
ＭＨＣクラス１Ｂ13／Ｂ5 遺伝子型を有さないようであ
る（Ｎａｚｅｒｉａｎ Ａｖｉａｎ ｐａｔｈ．１６：
５２７−５４４（１９８７））。
【００２７】２）ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII またはＳａ
ｃＩ消化したＣＨＣＣ−ＯＵ２ ＤＮＡを鳥類レトロウ
イルスプローブＲＡＶ−２にサザン移動したものに証明
されるように、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、内因性鳥類レ
トロウイルスｅｖ１、ｅｖ６、ｅｖ１５からの配列を含
む。２０以上の内因性鳥類レトロウイルスサブタイプが
存在する。サブタイプはメンデル遺伝学に従って遺伝す
るために、細胞株または鳥の中のｅｖの特異的組合せ
は、細胞株または鳥のマーカーとなる。ＣＨＣＣ−ＯＵ
２細胞の内因性レトロウイルス表現型は、群特異的抗原
陰性（ｇａ- ）で、ニワトリヘルパー因子陰性（ｃｈｆ
- ）である。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、ゲノム中に取り
込まれたｅｖ配列を含有するが、この細胞は、逆転写酵
素活性の欠如および電子顕微鏡によりウイルス粒子が存
在しないことが証明されるように、感染性レトロウイル
スを産生しない。
ｃＩ消化したＣＨＣＣ−ＯＵ２ ＤＮＡを鳥類レトロウ
イルスプローブＲＡＶ−２にサザン移動したものに証明
されるように、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、内因性鳥類レ
トロウイルスｅｖ１、ｅｖ６、ｅｖ１５からの配列を含
む。２０以上の内因性鳥類レトロウイルスサブタイプが
存在する。サブタイプはメンデル遺伝学に従って遺伝す
るために、細胞株または鳥の中のｅｖの特異的組合せ
は、細胞株または鳥のマーカーとなる。ＣＨＣＣ−ＯＵ
２細胞の内因性レトロウイルス表現型は、群特異的抗原
陰性（ｇａ- ）で、ニワトリヘルパー因子陰性（ｃｈｆ
- ）である。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、ゲノム中に取り
込まれたｅｖ配列を含有するが、この細胞は、逆転写酵
素活性の欠如および電子顕微鏡によりウイルス粒子が存
在しないことが証明されるように、感染性レトロウイル
スを産生しない。
【００２８】鳥は、同型接合性、異型接合性、または任
意の特異的ｅｖサブタイプを完全に欠失していてもよ
い。ＰＣＲ増幅測定法は、鳥がｅｖ１またはｅｖ１５に
対して同型接合性または異型接合性であるかを測定する
ために開発された。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞からのＤＮＡ
のＰＣＲ増幅は、細胞がｅｖ１（図３）またはｅｖ１５
（図４）に対して同型接合性であることを明らかにし
た。ｅｖ６のＰＣＲ測定法はまだ利用できない。
意の特異的ｅｖサブタイプを完全に欠失していてもよ
い。ＰＣＲ増幅測定法は、鳥がｅｖ１またはｅｖ１５に
対して同型接合性または異型接合性であるかを測定する
ために開発された。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞からのＤＮＡ
のＰＣＲ増幅は、細胞がｅｖ１（図３）またはｅｖ１５
（図４）に対して同型接合性であることを明らかにし
た。ｅｖ６のＰＣＲ測定法はまだ利用できない。
【００２９】３）ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、ある亜群の
鳥類レトロウイルスによる感染を受けやすい。異なる鳥
類細胞株は、異なる亜群の鳥類レトロウイルスに対して
感受性である。亜群Ａ（ＳＲＡ株）はＣＨＣＣ−ＯＵ２
細胞中でよく複製し、亜群Ｂ（ＳＲＢ株）およびＤ（Ｓ
ＲＤ株）複製は、かろうじて検出され、亜群Ｃ（ＢＨ−
ＲＳＶ（ＲＡＶ−７）株）およびＥ（ＱＶ２ｆ株）は、
ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞中で複製しない。
鳥類レトロウイルスによる感染を受けやすい。異なる鳥
類細胞株は、異なる亜群の鳥類レトロウイルスに対して
感受性である。亜群Ａ（ＳＲＡ株）はＣＨＣＣ−ＯＵ２
細胞中でよく複製し、亜群Ｂ（ＳＲＢ株）およびＤ（Ｓ
ＲＤ株）複製は、かろうじて検出され、亜群Ｃ（ＢＨ−
ＲＳＶ（ＲＡＶ−７）株）およびＥ（ＱＶ２ｆ株）は、
ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞中で複製しない。
【００３０】ＭＤＶ−ＯＣＬ、ＦＣ１２６−ＯＣＬおよ
びＳＢ１−ＯＣＬ細胞株は、親ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株
と同じ増殖特性を示す。これらの細胞はＭＤＶウイルス
を有するが、形質転換はされず、鳥に注入したとき癌を
誘発しない。これらの細胞株は、サブコンフルエンスな
時、親ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞と同じ形態的特徴のすべて
を有する。ＦＣ１２６−ＯＣＬ細胞株内での感染性ウイ
ルスの産生は、細胞単層がある細胞密度（各細胞が、付
近の細胞と接触している、約４×１０4 〜６×１０4 細
胞／ｃｍ2 の範囲）に達した時、ＦＣ１２６−ＯＣＬ細
胞株中で感染性ウイルスの産生が開始する。ＣＰＥと感
染性ウイルスの出現は非常に急速であり、細胞接触後２
日以内に完了する。一方、ＳＢ１−ＯＣＬとＭＤＶ−Ｏ
Ｕ２細胞株は、細胞が６×１０4 〜１×１０5 細胞／ｃ
ｍ2 のおよその範囲の密度に達した３〜４日後までＣＰ
Ｅと感染性ウイルスを示さない。各細胞株からのＦＣ１
２６−ＯＣＬとＳＢ１−ＯＣＬウイルスの発現は、細胞
株に依存し、ウイルスが検出される前に５０％を越える
コンフルエンスの細胞培養密度に達する。
びＳＢ１−ＯＣＬ細胞株は、親ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株
と同じ増殖特性を示す。これらの細胞はＭＤＶウイルス
を有するが、形質転換はされず、鳥に注入したとき癌を
誘発しない。これらの細胞株は、サブコンフルエンスな
時、親ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞と同じ形態的特徴のすべて
を有する。ＦＣ１２６−ＯＣＬ細胞株内での感染性ウイ
ルスの産生は、細胞単層がある細胞密度（各細胞が、付
近の細胞と接触している、約４×１０4 〜６×１０4 細
胞／ｃｍ2 の範囲）に達した時、ＦＣ１２６−ＯＣＬ細
胞株中で感染性ウイルスの産生が開始する。ＣＰＥと感
染性ウイルスの出現は非常に急速であり、細胞接触後２
日以内に完了する。一方、ＳＢ１−ＯＣＬとＭＤＶ−Ｏ
Ｕ２細胞株は、細胞が６×１０4 〜１×１０5 細胞／ｃ
ｍ2 のおよその範囲の密度に達した３〜４日後までＣＰ
Ｅと感染性ウイルスを示さない。各細胞株からのＦＣ１
２６−ＯＣＬとＳＢ１−ＯＣＬウイルスの発現は、細胞
株に依存し、ウイルスが検出される前に５０％を越える
コンフルエンスの細胞培養密度に達する。
【００３１】ＭＤＶ感染細胞株は、ワクチンの製造に使
用することができる。ＭＤＶ感染細胞株はまた、細胞応
答を抑制または増強（例えば、クラス１主要組織適合遺
伝子複合体分子産生を刺激して、ＭＤＶに対する細胞性
応答を刺激）する種々の薬剤または条件の試験に使用す
ることもできる。
用することができる。ＭＤＶ感染細胞株はまた、細胞応
答を抑制または増強（例えば、クラス１主要組織適合遺
伝子複合体分子産生を刺激して、ＭＤＶに対する細胞性
応答を刺激）する種々の薬剤または条件の試験に使用す
ることもできる。
【００３２】好適なＭＤＶウイルスは、血清型１、２、
および３から選択される。血清型３は、七面鳥ヘルペス
ウイルス（ＨＶＴ）と呼ばれる。ＭＤＶは、ワクチンま
たは他の目的に使用される外来遺伝子または欠失突然変
異体を含んでなる組換えウイルスでもよい。ＭＤＶはま
た、複製開始点と外来ＤＮＡ配列を含んでなる欠陥ウイ
ルスでもよい。
および３から選択される。血清型３は、七面鳥ヘルペス
ウイルス（ＨＶＴ）と呼ばれる。ＭＤＶは、ワクチンま
たは他の目的に使用される外来遺伝子または欠失突然変
異体を含んでなる組換えウイルスでもよい。ＭＤＶはま
た、複製開始点と外来ＤＮＡ配列を含んでなる欠陥ウイ
ルスでもよい。
【００３３】本発明は特に、ＨＶＴ株ＦＣ１２６で安定
に感染させた維持可能なニワトリ細胞株（ＦＣ１２６−
ＯＣＬ）、および血清型２ＭＤＶ株ＳＢ１で安定に感染
させたニワトリ細胞株（ＳＢ１−ＯＣＬ）に関する。Ｆ
Ｃ１２６−ＯＣＬとＳＢ１−ＯＣＬ細胞株は、培養物中
で継続的に増殖し、いったんコンフルエンスになると、
ＭＤＶ感染に特徴的なプラークを示す。ＦＣ１２６−Ｏ
ＣＬとＳＢ１−ＯＣＬは、別々にまたは一緒にワクチン
として使用して、ＭＤＶの病原性株に対して鳥類に免疫
を与える。凍結保存および連続的培養後に、ＦＣ１２６
−ＯＣＬとＳＢ１−ＯＣＬ細胞は、生存活性を維持しＭ
ＤＶを産生し続ける。
に感染させた維持可能なニワトリ細胞株（ＦＣ１２６−
ＯＣＬ）、および血清型２ＭＤＶ株ＳＢ１で安定に感染
させたニワトリ細胞株（ＳＢ１−ＯＣＬ）に関する。Ｆ
Ｃ１２６−ＯＣＬとＳＢ１−ＯＣＬ細胞株は、培養物中
で継続的に増殖し、いったんコンフルエンスになると、
ＭＤＶ感染に特徴的なプラークを示す。ＦＣ１２６−Ｏ
ＣＬとＳＢ１−ＯＣＬは、別々にまたは一緒にワクチン
として使用して、ＭＤＶの病原性株に対して鳥類に免疫
を与える。凍結保存および連続的培養後に、ＦＣ１２６
−ＯＣＬとＳＢ１−ＯＣＬ細胞は、生存活性を維持しＭ
ＤＶを産生し続ける。
【００３４】例に示すように、細胞株はＭＤＶで感染さ
せられる。コンフルエンスな単層中の明確なプラークの
存在は、初代ＣＥＦで観察されるものと類似して、細胞
溶解性限定ウイルス産生性感染に一致する。コンフルエ
ンスな時に細胞株による産生される感染性ウイルスの力
価は、ＭＤＶを有する細胞株の複製から予測されるよう
に、各培養細胞の継代後に増加した。この細胞株はＭＤ
Ｖ感染を初代ＣＥＦ培養物、未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細
胞、そして鳥類に移すことができる。最後にこの細胞株
は、ＭＤＶの病原性株（例えば、血清型１ＭＤＶ株ＧＡ
継代８およびＭｄ１１ｐ１５）に対して鳥類に防御能を
与える。
せられる。コンフルエンスな単層中の明確なプラークの
存在は、初代ＣＥＦで観察されるものと類似して、細胞
溶解性限定ウイルス産生性感染に一致する。コンフルエ
ンスな時に細胞株による産生される感染性ウイルスの力
価は、ＭＤＶを有する細胞株の複製から予測されるよう
に、各培養細胞の継代後に増加した。この細胞株はＭＤ
Ｖ感染を初代ＣＥＦ培養物、未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細
胞、そして鳥類に移すことができる。最後にこの細胞株
は、ＭＤＶの病原性株（例えば、血清型１ＭＤＶ株ＧＡ
継代８およびＭｄ１１ｐ１５）に対して鳥類に防御能を
与える。
【００３５】維持可能なＭＤＶワクチン細胞株のマスタ
ーストックは、維持可能なＭＤＶワクチン細胞株または
ＭＤＶ感染ＣＥＦのいずれかの培養物を感染させたＣＨ
ＣＣ−ＯＵ２細胞の複数の大きな培養物から作成され
る。ウイルスプラークが明確になったとき、これらの培
養物をトリプシン処理、または培養容器をこすり取るこ
とにより、ＭＤＶ感染細胞を新しい培養物に移す。大部
分のＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞がＭＤＶワクチンで感染され
るまで、培養継代を続ける。こうしてＭＤＶワクチン産
生のマスター種菌ストックとして使用できる、維持可能
なＭＤＶワクチン細胞株が作成される。このマスター種
菌ストックは、米国農務省により、ワクチンとしての使
用について検定される。出発物質としてＭＤＶワクチン
感染ＣＥＦが使用される時、寿命が約２週間のＣＥＦは
すべて死滅していることを確認するために、細胞を３週
間培養するように継代の数を増やさなければならない。
ーストックは、維持可能なＭＤＶワクチン細胞株または
ＭＤＶ感染ＣＥＦのいずれかの培養物を感染させたＣＨ
ＣＣ−ＯＵ２細胞の複数の大きな培養物から作成され
る。ウイルスプラークが明確になったとき、これらの培
養物をトリプシン処理、または培養容器をこすり取るこ
とにより、ＭＤＶ感染細胞を新しい培養物に移す。大部
分のＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞がＭＤＶワクチンで感染され
るまで、培養継代を続ける。こうしてＭＤＶワクチン産
生のマスター種菌ストックとして使用できる、維持可能
なＭＤＶワクチン細胞株が作成される。このマスター種
菌ストックは、米国農務省により、ワクチンとしての使
用について検定される。出発物質としてＭＤＶワクチン
感染ＣＥＦが使用される時、寿命が約２週間のＣＥＦは
すべて死滅していることを確認するために、細胞を３週
間培養するように継代の数を増やさなければならない。
【００３６】維持可能なＭＤＶワクチンマスター種菌ス
トックを作成する別の方法は、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞
を、ワクチンウイルスゲノムよりなるＤＮＡでトランス
フェクションすることである。トランスフェクションの
方法は、細胞にＤＮＡをトランスフェクションするため
に使用される、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、
分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ）（第２版）、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリン
グ・ハーバー（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ）、ニューヨーク（１９８９）、１６．３０−１６．
５５頁に記載の任意の方法、例えば、リン酸カルシウム
沈殿、ポリブレン、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェ
クチン、電気穿孔法、またはプロトプラスト融合があ
る。ＤＮＡトランスフェクションは、遺伝子操作により
作成したウイルスベクターまたは欠陥ウイルスベクター
のマスター種菌ストックの調製に特に有用である。
トックを作成する別の方法は、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞
を、ワクチンウイルスゲノムよりなるＤＮＡでトランス
フェクションすることである。トランスフェクションの
方法は、細胞にＤＮＡをトランスフェクションするため
に使用される、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、
分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ）（第２版）、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリン
グ・ハーバー（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ）、ニューヨーク（１９８９）、１６．３０−１６．
５５頁に記載の任意の方法、例えば、リン酸カルシウム
沈殿、ポリブレン、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェ
クチン、電気穿孔法、またはプロトプラスト融合があ
る。ＤＮＡトランスフェクションは、遺伝子操作により
作成したウイルスベクターまたは欠陥ウイルスベクター
のマスター種菌ストックの調製に特に有用である。
【００３７】維持可能なＭＤＶワクチン細胞株のマスタ
ー種菌ストックを作成するさらに別の方法は、感染細胞
集団の細胞培養物拡張である。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の
培養物を、低感染多重度で本明細書に記載の任意の方法
でＭＤＶで感染産生させる。プラークが明らかになった
時、感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞から１つのプラークを取
り出し、細胞を全く含まない組織培養プレートに移す。
培養物がコンフルエンスになるまで細胞を培養する。培
養物をトリプシン処理により採取し、低速度遠心分離に
よりＭＤＶが感染した細胞を濃縮し、より大きな培養プ
レートに移す。細胞を再びコンフルエンスになるまで培
養する。前述のように細胞を採取し、より大きな培養プ
レートに移す。こうして、大部分の細胞が感染され、感
染した細胞のすべてが、１つのＭＤＶプラークから得ら
れた。培養物をコンフルエンスにするだけで、ＭＤＶ感
染細胞株の拡張の任意の段階で、感染性ＭＤＶの産生が
達成される。
ー種菌ストックを作成するさらに別の方法は、感染細胞
集団の細胞培養物拡張である。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の
培養物を、低感染多重度で本明細書に記載の任意の方法
でＭＤＶで感染産生させる。プラークが明らかになった
時、感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞から１つのプラークを取
り出し、細胞を全く含まない組織培養プレートに移す。
培養物がコンフルエンスになるまで細胞を培養する。培
養物をトリプシン処理により採取し、低速度遠心分離に
よりＭＤＶが感染した細胞を濃縮し、より大きな培養プ
レートに移す。細胞を再びコンフルエンスになるまで培
養する。前述のように細胞を採取し、より大きな培養プ
レートに移す。こうして、大部分の細胞が感染され、感
染した細胞のすべてが、１つのＭＤＶプラークから得ら
れた。培養物をコンフルエンスにするだけで、ＭＤＶ感
染細胞株の拡張の任意の段階で、感染性ＭＤＶの産生が
達成される。
【００３８】ＭＤＶワクチン産生のためのＭＤＶ−ＯＣ
Ｌ細胞株の使用は以下の通りである。ＭＤＶ−ＯＣＬ細
胞株のマスター種菌ストックを、コンフルエンスに近い
密度まで培養する。培養物がコンフルエンスレベルに達
するまで、ＭＤＶは、分裂細胞中で潜伏状態にあり、コ
ンフルエンスでは感染はウイルス産生性となる。感染が
視覚的に明らかになった時（通常コンフルエンスになっ
てから２日後）、細胞をＭＤＶワクチン産生の分野で公
知の方法により細胞を採取する（エー・イー・、チャー
チル（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｅ．）、「マレク病：
制御の科学的基礎と方法：ワクチンの製造」（”Ｍａｒ
ｅｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂ
ａｓｉｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒ
ｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ
ｓ”）。（エル・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．
Ｎ．）編）、２５１−２６５頁、マリヌスニジョフ出版
（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂ．）、ボス
トン、マサチューセッツ州（１９８５））。典型的に
は、ＭＤＶワクチンのための感染細胞の産生は、以下の
工程を含む。１）細胞をトリプシン処理するかまたは培
養物支持体から掻き取る、２）ウイルス産生性感染した
細胞を、低速度遠心分離により濃縮する、そして３）濃
縮された感染細胞を、適当量の希釈液中に再懸濁して、
規定濃度のＭＤＶプラーク形成単位／ｍｌ（ＰＵＦ／ｍ
ｌ）のワクチンを産生する。好適には、マスター種菌ス
トックからＭＤＶ−ＯＣＬ細胞株の複数の培養物を、シ
リーズの各培養物がその前の培養物よりコンフルエンス
レベルが少し小さくなるように、シリーズで並べる。例
えば、９０％、８０％、７０％、６０％、および５０％
のサブコンフルエンスレベルで準備する。９０％培養物
がコンフルエンスに達するとき、ＭＤＶ感染はウイルス
産生性感染であり、ＭＤＶワクチン用に培養物を採取
し、新しい培養物を５０％コンフルエンスでマスター種
菌ストックから準備する。こうしてＭＤＶワクチンを継
続的に産生させる。
Ｌ細胞株の使用は以下の通りである。ＭＤＶ−ＯＣＬ細
胞株のマスター種菌ストックを、コンフルエンスに近い
密度まで培養する。培養物がコンフルエンスレベルに達
するまで、ＭＤＶは、分裂細胞中で潜伏状態にあり、コ
ンフルエンスでは感染はウイルス産生性となる。感染が
視覚的に明らかになった時（通常コンフルエンスになっ
てから２日後）、細胞をＭＤＶワクチン産生の分野で公
知の方法により細胞を採取する（エー・イー・、チャー
チル（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｅ．）、「マレク病：
制御の科学的基礎と方法：ワクチンの製造」（”Ｍａｒ
ｅｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂ
ａｓｉｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒ
ｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ
ｓ”）。（エル・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．
Ｎ．）編）、２５１−２６５頁、マリヌスニジョフ出版
（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂ．）、ボス
トン、マサチューセッツ州（１９８５））。典型的に
は、ＭＤＶワクチンのための感染細胞の産生は、以下の
工程を含む。１）細胞をトリプシン処理するかまたは培
養物支持体から掻き取る、２）ウイルス産生性感染した
細胞を、低速度遠心分離により濃縮する、そして３）濃
縮された感染細胞を、適当量の希釈液中に再懸濁して、
規定濃度のＭＤＶプラーク形成単位／ｍｌ（ＰＵＦ／ｍ
ｌ）のワクチンを産生する。好適には、マスター種菌ス
トックからＭＤＶ−ＯＣＬ細胞株の複数の培養物を、シ
リーズの各培養物がその前の培養物よりコンフルエンス
レベルが少し小さくなるように、シリーズで並べる。例
えば、９０％、８０％、７０％、６０％、および５０％
のサブコンフルエンスレベルで準備する。９０％培養物
がコンフルエンスに達するとき、ＭＤＶ感染はウイルス
産生性感染であり、ＭＤＶワクチン用に培養物を採取
し、新しい培養物を５０％コンフルエンスでマスター種
菌ストックから準備する。こうしてＭＤＶワクチンを継
続的に産生させる。
【００３９】ＭＤＶワクチンを産生する別の同様に有効
な方法は、未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の培養物を維持
することである。これらの培養物を、適当なＭＤＶ−Ｏ
ＣＬ細胞株マスター種菌ストックで感染させる。この方
法は、ＣＥＦからＭＤＶワクチンを製造するために現在
使用されている方法と同様である（エー・イー・、チャ
ーチル（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｅ．）、「マレク
病：制御の科学的基礎と方法：ワクチンの製造」（”Ｍ
ａｒｅｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｂａｓｉｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｏｎ
ｔｒｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎ
ｅｓ”）。（エル・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．
Ｎ．）編）、２５１−２６６頁、マリヌスニジョフ出版
（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂ．）、ボス
トン、マサチューセッツ州（１９８５））。
な方法は、未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の培養物を維持
することである。これらの培養物を、適当なＭＤＶ−Ｏ
ＣＬ細胞株マスター種菌ストックで感染させる。この方
法は、ＣＥＦからＭＤＶワクチンを製造するために現在
使用されている方法と同様である（エー・イー・、チャ
ーチル（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｅ．）、「マレク
病：制御の科学的基礎と方法：ワクチンの製造」（”Ｍ
ａｒｅｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｂａｓｉｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｏｎ
ｔｒｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎ
ｅｓ”）。（エル・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．
Ｎ．）編）、２５１−２６６頁、マリヌスニジョフ出版
（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂ．）、ボス
トン、マサチューセッツ州（１９８５））。
【００４０】以下図面について説明する。図１Ａ〜１Ｄ
は、ＦＣ１２６−ＯＣＬとＳＢ１−ＯＣＬの光学顕微鏡
写真である。ＦＣ１２６−ＯＣＬの単層培養物は、いく
つかの大きな感染細胞と多くの小さな感染細胞の混合物
よりなるプラーク（図１Ａ）を示し、ＣＥＦ上のＦＣ１
２６プラークは、均一な大きさの感染細胞よりなる（図
１Ｂ）。ＳＢ１−ＯＣＬの単層培養物は、大きな感染細
胞よりなるプラーク（図１Ｃ）を示し、ＣＥＦ上のＳＢ
１プラークは、小さな感染細胞よりなる（図１Ｄ）。
は、ＦＣ１２６−ＯＣＬとＳＢ１−ＯＣＬの光学顕微鏡
写真である。ＦＣ１２６−ＯＣＬの単層培養物は、いく
つかの大きな感染細胞と多くの小さな感染細胞の混合物
よりなるプラーク（図１Ａ）を示し、ＣＥＦ上のＦＣ１
２６プラークは、均一な大きさの感染細胞よりなる（図
１Ｂ）。ＳＢ１−ＯＣＬの単層培養物は、大きな感染細
胞よりなるプラーク（図１Ｃ）を示し、ＣＥＦ上のＳＢ
１プラークは、小さな感染細胞よりなる（図１Ｄ）。
【００４１】図２は、１３２塩基対のＤＲ配列のＰＣＲ
増幅である。Ｍｄ１１継代１４（レーン１）、Ｍｄ１１
継代４８（レーン２）、およびＭＤＶ−ＯＵ２．２継代
４８（レーン３）から単離したＤＮＡを、ＰＣＲ増幅に
使用した。右側の番号を付けた矢印は、１３２塩基対Ｄ
Ｒ配列の１〜５個のコピーを有するＤＲ断片の位置を示
す。左の矢印は、１ｋｂのＤＮＡラダー（ｌａｄｄｅ
ｒ）マーカー（ギブコ・ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ）、ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサーズバーグ（Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）からの選択
されたバンドの位置を示す。
増幅である。Ｍｄ１１継代１４（レーン１）、Ｍｄ１１
継代４８（レーン２）、およびＭＤＶ−ＯＵ２．２継代
４８（レーン３）から単離したＤＮＡを、ＰＣＲ増幅に
使用した。右側の番号を付けた矢印は、１３２塩基対Ｄ
Ｒ配列の１〜５個のコピーを有するＤＲ断片の位置を示
す。左の矢印は、１ｋｂのＤＮＡラダー（ｌａｄｄｅ
ｒ）マーカー（ギブコ・ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ）、ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサーズバーグ（Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）からの選択
されたバンドの位置を示す。
【００４２】図３は、ｅｖ１に対するＣＨＣＣ−ＯＵ２
ＤＮＡのＰＣＲ増幅測定法を示すアガロースゲルの写真
である。ｅｖ１に対する異型接合性またはｅｖ１の欠如
したＣＨＣＣ−ＯＵ２のＤＮＡを、ＰＣＲ増幅に使用し
た。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、臭
化エチジウムで染色し、紫外線によりＰＣＲ産物を肉眼
で観察した。ＣＨＣＣ−ＯＵ２ ＤＮＡ ＰＣＲ産物はレ
ーン１であり、ｅｖ１を含有するＤＮＡ鋳型からのＰＣ
Ｒ産物はレーン２であり、ｅｖ１とｅｖ６を含有するＤ
ＮＡ鋳型からのＰＣＲ産物はレーン３であり、ｅｖ１５
を含有するがｅｖ１を含有しないＤＮＡ鋳型からのＰＣ
Ｒ産物はレーン４である。レーン５は、ｅｖ１プライマ
ーセットを含有しＤＮＡ鋳型を含有しない対照である。
隣接する１ｋｂラダー（ｌａｄｄｅｒ）マーカー（ギブ
コ・ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ライフテ
クノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ）、ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）、メリーランド州）は、ＰＣＲ産物のサイズの決定
に使用した。
ＤＮＡのＰＣＲ増幅測定法を示すアガロースゲルの写真
である。ｅｖ１に対する異型接合性またはｅｖ１の欠如
したＣＨＣＣ−ＯＵ２のＤＮＡを、ＰＣＲ増幅に使用し
た。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、臭
化エチジウムで染色し、紫外線によりＰＣＲ産物を肉眼
で観察した。ＣＨＣＣ−ＯＵ２ ＤＮＡ ＰＣＲ産物はレ
ーン１であり、ｅｖ１を含有するＤＮＡ鋳型からのＰＣ
Ｒ産物はレーン２であり、ｅｖ１とｅｖ６を含有するＤ
ＮＡ鋳型からのＰＣＲ産物はレーン３であり、ｅｖ１５
を含有するがｅｖ１を含有しないＤＮＡ鋳型からのＰＣ
Ｒ産物はレーン４である。レーン５は、ｅｖ１プライマ
ーセットを含有しＤＮＡ鋳型を含有しない対照である。
隣接する１ｋｂラダー（ｌａｄｄｅｒ）マーカー（ギブ
コ・ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ライフテ
クノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ）、ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）、メリーランド州）は、ＰＣＲ産物のサイズの決定
に使用した。
【００４３】図４は、ｅｖ１５に対するＣＨＣＣ−ＯＵ
２ＤＮＡのＰＣＲ増幅測定法を示すアガロースゲルの写
真である。ｅｖ１５に対する異型接合性またはｅｖ１５
の欠如したＣＨＣＣ−ＯＵ２のＤＮＡを、ＰＣＲ増幅に
使用した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動
し、臭化エチジウムで染色し、紫外線によりＰＣＲ産物
を肉眼で観察した。ＣＨＣＣ−ＯＵ２ ＤＮＡ ＰＣＲ産
物はレーン１であり、ｅｖ１５を含有するＤＮＡ鋳型か
らのＰＣＲ産物はレーン２であり、ｅｖ１を含有するが
ｅｖ１５を含有しないＤＮＡ鋳型からのＰＣＲ産物はレ
ーン３である。レーン４は、ｅｖ１５プライマーセット
を含有するがＤＮＡ鋳型を含有しない対照である。隣接
する１ｋｂラダー（ｌａｄｄｅｒ）マーカー（ギブコ・
ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ライフテクノ
ロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ）、ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）、メリーランド州）は、ＰＣＲ産物のサイズの決定
に使用した。
２ＤＮＡのＰＣＲ増幅測定法を示すアガロースゲルの写
真である。ｅｖ１５に対する異型接合性またはｅｖ１５
の欠如したＣＨＣＣ−ＯＵ２のＤＮＡを、ＰＣＲ増幅に
使用した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動
し、臭化エチジウムで染色し、紫外線によりＰＣＲ産物
を肉眼で観察した。ＣＨＣＣ−ＯＵ２ ＤＮＡ ＰＣＲ産
物はレーン１であり、ｅｖ１５を含有するＤＮＡ鋳型か
らのＰＣＲ産物はレーン２であり、ｅｖ１を含有するが
ｅｖ１５を含有しないＤＮＡ鋳型からのＰＣＲ産物はレ
ーン３である。レーン４は、ｅｖ１５プライマーセット
を含有するがＤＮＡ鋳型を含有しない対照である。隣接
する１ｋｂラダー（ｌａｄｄｅｒ）マーカー（ギブコ・
ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ライフテクノ
ロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ）、ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）、メリーランド州）は、ＰＣＲ産物のサイズの決定
に使用した。
【００４４】
【実施例】例１ 細胞とウイルス ＣＥＦ細胞の調製、増殖、およびＨＶＴによる感染はす
でに記載されているように行なった（シー・グラウビガ
ー（Ｇｌａｕｂｉｇｅｒ，Ｃ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４
５：１２２８−１２３４（１９８３）；ピー・エム・ク
センス（Ｐ．Ｍ．Ｃｏｏｕｓｓｅｎｓ）とエル・エフ・
ベリサー（Ｌ．Ｆ．Ｖｅｌｉｃｅｒ）、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６２：２３７３−２３７９（１９８８））。本試験
には、継代レベル１０の細胞培養物（ＦＣ１２６ｐ１
０）を使用した。本試験で使用した血清型２ワクチン株
ＳＢ１は、細胞培養継代レベル２９（ＳＢ１ｐ２９）で
あった。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞（エィチ・オグラ（Ｏｇ
ｕｒａ，Ｈ．）とティー・フジワラ（Ｔ．Ｆｕｊｉｗａ
ｒａ）、Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ ４１：１
４１−１４３（１９８７））は、ドナルド・サルター博
士（Ｄｒ．ＤｏｎａｌｄＳａｌｔｅｒ）（鳥類疾患およ
び腫瘍学研究所（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅａｎｄ
Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＡＤ
ＯＬ）、米国農務省（ＵＳＤＡ）、イーストランシング
（Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ）、ミシガン州）から得
て、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）と２％トリプトンリン
酸ブロス（ＴＰＢ）を補足したライボビッツ（Ｌｅｉｂ
ｏｖｉｔｚ）Ｌ１５−ＭｃＣｏｙ５Ａ（ＬＭ）（ギブコ
社（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｃ．）、グランドアイランド（Ｇ
ｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州）培地で、
３７℃で５％ＣＯ2 含有加湿雰囲気中で培養した。
でに記載されているように行なった（シー・グラウビガ
ー（Ｇｌａｕｂｉｇｅｒ，Ｃ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４
５：１２２８−１２３４（１９８３）；ピー・エム・ク
センス（Ｐ．Ｍ．Ｃｏｏｕｓｓｅｎｓ）とエル・エフ・
ベリサー（Ｌ．Ｆ．Ｖｅｌｉｃｅｒ）、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６２：２３７３−２３７９（１９８８））。本試験
には、継代レベル１０の細胞培養物（ＦＣ１２６ｐ１
０）を使用した。本試験で使用した血清型２ワクチン株
ＳＢ１は、細胞培養継代レベル２９（ＳＢ１ｐ２９）で
あった。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞（エィチ・オグラ（Ｏｇ
ｕｒａ，Ｈ．）とティー・フジワラ（Ｔ．Ｆｕｊｉｗａ
ｒａ）、Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ ４１：１
４１−１４３（１９８７））は、ドナルド・サルター博
士（Ｄｒ．ＤｏｎａｌｄＳａｌｔｅｒ）（鳥類疾患およ
び腫瘍学研究所（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅａｎｄ
Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＡＤ
ＯＬ）、米国農務省（ＵＳＤＡ）、イーストランシング
（Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ）、ミシガン州）から得
て、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）と２％トリプトンリン
酸ブロス（ＴＰＢ）を補足したライボビッツ（Ｌｅｉｂ
ｏｖｉｔｚ）Ｌ１５−ＭｃＣｏｙ５Ａ（ＬＭ）（ギブコ
社（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｃ．）、グランドアイランド（Ｇ
ｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州）培地で、
３７℃で５％ＣＯ2 含有加湿雰囲気中で培養した。
【００４５】例２ ＭＤＶ−ＯＵ２血清型１細胞株 ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞のＭｄ１１ｐ１５による感染 米国特許出願第０８／５４９，０４５号（１９９５年１
０月２７日出願）に示されるように、５．０×１０7 Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞を２．０×１０7 Ｍｄ１１ｐ１５感
染ＣＥＦと一緒にした後、４％ウシ血清（ＣＳ）を補足
したＬＭ培地で１５０ｍｍの培養プレートに蒔いて、Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞をＭＤＶ株Ｍｄ１１細胞培養継代１
５（Ｍｄ１１ｐ１５）で感染させた。ＣＨＣＣ−ＯＵ２
細胞とＭｄ１１感染ＣＥＦ細胞の同時培養を４継代続け
た。各継代の細胞を、２０％ＣＳと１０％ジメチルスル
ホキシドを補足した凍結培地（ＬＭ培地（ライフテクノ
ロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ）、ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）、メリーランド州）中で、−１３５℃で保存した。
感染後４継代目に、ＣＥＦ細胞中にＭＤＶ感染に特徴的
な多くのプラーク（１５０ｍｍの培養プレート当たり約
１００プラーク）が観察された。これらのプラークのう
ち２つを、無菌クローニングシリンダーを用いて単離し
た。シリンダーを各プラークの上に置き、細胞をトリプ
シン処理し、クローニングシリンダーから吸引した。吸
引した細胞を拡張させるために、４％ＣＳを補足したＬ
Ｍ培地を含有する３５ｍｍの培養プレートに移した。拡
張させている間、細胞をコンフルエンスにならないよう
にして、４８〜７２時間毎に培地を交換した。拡張した
クローンをＭＤＶ ＯＵ２．１およびＭＤＶ ＯＵ２．
２と名付けた。
０月２７日出願）に示されるように、５．０×１０7 Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞を２．０×１０7 Ｍｄ１１ｐ１５感
染ＣＥＦと一緒にした後、４％ウシ血清（ＣＳ）を補足
したＬＭ培地で１５０ｍｍの培養プレートに蒔いて、Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞をＭＤＶ株Ｍｄ１１細胞培養継代１
５（Ｍｄ１１ｐ１５）で感染させた。ＣＨＣＣ−ＯＵ２
細胞とＭｄ１１感染ＣＥＦ細胞の同時培養を４継代続け
た。各継代の細胞を、２０％ＣＳと１０％ジメチルスル
ホキシドを補足した凍結培地（ＬＭ培地（ライフテクノ
ロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ）、ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）、メリーランド州）中で、−１３５℃で保存した。
感染後４継代目に、ＣＥＦ細胞中にＭＤＶ感染に特徴的
な多くのプラーク（１５０ｍｍの培養プレート当たり約
１００プラーク）が観察された。これらのプラークのう
ち２つを、無菌クローニングシリンダーを用いて単離し
た。シリンダーを各プラークの上に置き、細胞をトリプ
シン処理し、クローニングシリンダーから吸引した。吸
引した細胞を拡張させるために、４％ＣＳを補足したＬ
Ｍ培地を含有する３５ｍｍの培養プレートに移した。拡
張させている間、細胞をコンフルエンスにならないよう
にして、４８〜７２時間毎に培地を交換した。拡張した
クローンをＭＤＶ ＯＵ２．１およびＭＤＶ ＯＵ２．
２と名付けた。
【００４６】ＭＤＶ ＯＵ２．１とＭＤＶ ＯＵ２．２
の精製の間、ＣＰＥは、出現も拡張もゆるやかであっ
た。融合細胞（ｓｙｎｃｔｉａ）と丸くゆるく結合した
細胞の拡張した領域よりなる十分に進展したプラーク
は、感染後４週間まで見られなかった。感染後１４日目
の見えるプラークの出現、コンフルエンスに達した細胞
へのプラーク形成の依存および接触阻害は予測されなか
った。比較すると、ＭＤＶ株Ｍｄ１１に感染した典型的
ＣＥＦ単層は、感染後５〜７日に容易に見えるプラーク
となり、１０〜１４日以内に単層の完全な破壊が起き
る。ＣＥＦにおけるプラーク形成は、細胞単層のコンフ
ルエンスには依存しない。４週間同時培養後、細胞を−
１３５℃で２週間凍結保存した。細胞培養物は、感染細
胞（Ｍｄ１１ｐ１５／ＯＵ２）および未感染ＣＨＣＣ−
ＯＵ２細胞を組合せて、凍結細胞から再樹立した。ＭＤ
Ｖ感染に一致するプラークは、細胞がコンフルエンスに
達する（蒔いてから約１４日後）まで観察されなかっ
た。
の精製の間、ＣＰＥは、出現も拡張もゆるやかであっ
た。融合細胞（ｓｙｎｃｔｉａ）と丸くゆるく結合した
細胞の拡張した領域よりなる十分に進展したプラーク
は、感染後４週間まで見られなかった。感染後１４日目
の見えるプラークの出現、コンフルエンスに達した細胞
へのプラーク形成の依存および接触阻害は予測されなか
った。比較すると、ＭＤＶ株Ｍｄ１１に感染した典型的
ＣＥＦ単層は、感染後５〜７日に容易に見えるプラーク
となり、１０〜１４日以内に単層の完全な破壊が起き
る。ＣＥＦにおけるプラーク形成は、細胞単層のコンフ
ルエンスには依存しない。４週間同時培養後、細胞を−
１３５℃で２週間凍結保存した。細胞培養物は、感染細
胞（Ｍｄ１１ｐ１５／ＯＵ２）および未感染ＣＨＣＣ−
ＯＵ２細胞を組合せて、凍結細胞から再樹立した。ＭＤ
Ｖ感染に一致するプラークは、細胞がコンフルエンスに
達する（蒔いてから約１４日後）まで観察されなかっ
た。
【００４７】例３ ＦＣ１２６−ＯＣＬ細胞株 ＦＣ１２６−ＯＣＬ．１について、継代０は、２．５×
１０6 ＰＦＵのＦＣ１２６継代１０（ＦＣ１２６ｐ１
０）感染ＣＥＦによる、１００ｍｍ組織培養プレートの
コンフルエンスなＣＨＣＣ−ＯＵ２の感染である。ＣＰ
Ｅが明瞭になった時、感染細胞を採取し、５％ＬＭ中の
１０％ＤＭＳＯ、２０％ウシ血清よりなる凍結保存緩衝
液（ＦＳＢ）中で−１３５℃で凍結した（継代０）。感
染凍結細胞の１０-2希釈を用いて、２４ウェルの組織培
養プレートのウェルのコンフルエンスなＣＨＣＣ−ＯＵ
２を感染させた。ＣＰＥがほとんど１００％になった
後、細胞をＦＳＢ中で−１３５℃で凍結した（継代
１）。−１３５℃で保存後、細胞を融解し、２４ウェル
の組織培養プレート中のコンフルエンスなＣＨＣＣ−Ｏ
Ｕ２の１０-1、１０-2、および１０-3希釈の３つのウェ
ルを感染させた（継代２）。３つの希釈物をプールし、
１２ウェルの組織培養プレートに再び蒔いた（継代
３）。細胞がコンフルエンスになり、ＣＰＥが明瞭にな
った時、感染細胞を採取し、１２ウェルの組織培養プレ
ートの２つのウェルに分割した（継代４）。ＣＰＥが明
瞭になった時、両方のウェルから細胞を採取しプールし
た。０．１ｍｌを取り、１２ウェル組織培養プレートの
１つのウェルに感染させた（継代５）。ＣＰＥが明瞭に
なった時、細胞を採取し−１３５℃でＦＳＢ中で凍結し
た。次に凍結細胞を用いて、１００ｍｍ組織培養プレー
トのコンフルエンスなＣＨＣＣ−ＯＵ２を感染させた
（継代６）。ＣＰＥが明瞭になった時、細胞を採取し、
１０分の１量の試料を取り、継代５についてＰＦＵ／ｍ
ｌを測定し、残りの感染細胞を１００ｍｍ組織培養プレ
ートに再び蒔いた（継代６）。ＣＰＥが明瞭になった
時、細胞を採取し、１０分の１量の試料を取り、継代７
についてＰＦＵ／ｍｌを測定し、残りの感染細胞を１０
０ｍｍ組織培養プレートに再び蒔いた（継代８）。ＣＰ
Ｅが明瞭になった時、細胞を採取し、１０分の１量の試
料を取り、継代８についてＰＦＵ／ｍｌを測定し、残り
の感染細胞を−１３５℃でＦＣ１２６−ＯＣＬ．１とし
て凍結した。
１０6 ＰＦＵのＦＣ１２６継代１０（ＦＣ１２６ｐ１
０）感染ＣＥＦによる、１００ｍｍ組織培養プレートの
コンフルエンスなＣＨＣＣ−ＯＵ２の感染である。ＣＰ
Ｅが明瞭になった時、感染細胞を採取し、５％ＬＭ中の
１０％ＤＭＳＯ、２０％ウシ血清よりなる凍結保存緩衝
液（ＦＳＢ）中で−１３５℃で凍結した（継代０）。感
染凍結細胞の１０-2希釈を用いて、２４ウェルの組織培
養プレートのウェルのコンフルエンスなＣＨＣＣ−ＯＵ
２を感染させた。ＣＰＥがほとんど１００％になった
後、細胞をＦＳＢ中で−１３５℃で凍結した（継代
１）。−１３５℃で保存後、細胞を融解し、２４ウェル
の組織培養プレート中のコンフルエンスなＣＨＣＣ−Ｏ
Ｕ２の１０-1、１０-2、および１０-3希釈の３つのウェ
ルを感染させた（継代２）。３つの希釈物をプールし、
１２ウェルの組織培養プレートに再び蒔いた（継代
３）。細胞がコンフルエンスになり、ＣＰＥが明瞭にな
った時、感染細胞を採取し、１２ウェルの組織培養プレ
ートの２つのウェルに分割した（継代４）。ＣＰＥが明
瞭になった時、両方のウェルから細胞を採取しプールし
た。０．１ｍｌを取り、１２ウェル組織培養プレートの
１つのウェルに感染させた（継代５）。ＣＰＥが明瞭に
なった時、細胞を採取し−１３５℃でＦＳＢ中で凍結し
た。次に凍結細胞を用いて、１００ｍｍ組織培養プレー
トのコンフルエンスなＣＨＣＣ−ＯＵ２を感染させた
（継代６）。ＣＰＥが明瞭になった時、細胞を採取し、
１０分の１量の試料を取り、継代５についてＰＦＵ／ｍ
ｌを測定し、残りの感染細胞を１００ｍｍ組織培養プレ
ートに再び蒔いた（継代６）。ＣＰＥが明瞭になった
時、細胞を採取し、１０分の１量の試料を取り、継代７
についてＰＦＵ／ｍｌを測定し、残りの感染細胞を１０
０ｍｍ組織培養プレートに再び蒔いた（継代８）。ＣＰ
Ｅが明瞭になった時、細胞を採取し、１０分の１量の試
料を取り、継代８についてＰＦＵ／ｍｌを測定し、残り
の感染細胞を−１３５℃でＦＣ１２６−ＯＣＬ．１とし
て凍結した。
【００４８】ＦＣ１２６−ＯＣＬ．２について、継代０
は、３．７５×１０3 ＰＦＵのＦＣ１２６ｐ１０感染Ｃ
ＥＦによる、２４ウェル組織培養プレートのコンフルエ
ンスなＣＨＣＣ−ＯＵ２の感染である。ＣＰＥが１００
％になった後、細胞をＦＳＢ中で−１３５℃で凍結し
た。−１３５℃で保存後、細胞を融解し、２４ウェルの
組織培養プレート中のコンフルエンスなＣＨＣＣ−ＯＵ
２の１０-1、１０-2、および１０-3希釈の３つのウェル
を感染させた（継代１）。３つの希釈物をプールし、１
２ウェルの組織培養プレートに再び蒔いた（継代２）。
細胞がコンフルエンスになり、ＣＰＥが明瞭になった
時、５５プラークを計測した。感染細胞を採取し、１２
ウェルの組織培養プレートの２つのウェルに分割した
（継代３）。ＣＰＥが明瞭になった時、両方のウェルか
ら細胞を採取しプールした。およその力価は５．５×１
０3 ＰＦＵ／ｍｌであった。０．１ｍｌを取り、１２ウ
ェル組織培養プレートの１つのウェルを感染させた（継
代４）。ＣＰＥが明瞭になった時、細胞を採取し−１３
５℃でＦＳＢ中で凍結した。次に凍結細胞を用いて、１
００ｍｍ組織培養プレートのコンフルエンスなＣＨＣＣ
−ＯＵ２を感染させた（継代５）。ＣＰＥが明瞭になっ
た時、細胞を採取し、１０分の１量の試料を取り、継代
５についてＰＦＵ／ｍｌを測定し、残りの感染細胞を１
００ｍｍ組織培養プレートに再び蒔いた（継代６）。Ｃ
ＰＥが明瞭になった時、細胞を採取し、１０分の１量の
試料を取り、継代６についてＰＦＵ／ｍｌを測定し、残
りの感染細胞を１００ｍｍ組織培養プレートに再び蒔い
た（継代７）。ＣＰＥが明瞭になった時、細胞を採取
し、１０分の１量の試料を取り、継代７についてＰＦＵ
／ｍｌを測定し、残りの感染細胞を−１３５℃でＦＣ１
２６−ＯＣＬ．２として凍結した。
は、３．７５×１０3 ＰＦＵのＦＣ１２６ｐ１０感染Ｃ
ＥＦによる、２４ウェル組織培養プレートのコンフルエ
ンスなＣＨＣＣ−ＯＵ２の感染である。ＣＰＥが１００
％になった後、細胞をＦＳＢ中で−１３５℃で凍結し
た。−１３５℃で保存後、細胞を融解し、２４ウェルの
組織培養プレート中のコンフルエンスなＣＨＣＣ−ＯＵ
２の１０-1、１０-2、および１０-3希釈の３つのウェル
を感染させた（継代１）。３つの希釈物をプールし、１
２ウェルの組織培養プレートに再び蒔いた（継代２）。
細胞がコンフルエンスになり、ＣＰＥが明瞭になった
時、５５プラークを計測した。感染細胞を採取し、１２
ウェルの組織培養プレートの２つのウェルに分割した
（継代３）。ＣＰＥが明瞭になった時、両方のウェルか
ら細胞を採取しプールした。およその力価は５．５×１
０3 ＰＦＵ／ｍｌであった。０．１ｍｌを取り、１２ウ
ェル組織培養プレートの１つのウェルを感染させた（継
代４）。ＣＰＥが明瞭になった時、細胞を採取し−１３
５℃でＦＳＢ中で凍結した。次に凍結細胞を用いて、１
００ｍｍ組織培養プレートのコンフルエンスなＣＨＣＣ
−ＯＵ２を感染させた（継代５）。ＣＰＥが明瞭になっ
た時、細胞を採取し、１０分の１量の試料を取り、継代
５についてＰＦＵ／ｍｌを測定し、残りの感染細胞を１
００ｍｍ組織培養プレートに再び蒔いた（継代６）。Ｃ
ＰＥが明瞭になった時、細胞を採取し、１０分の１量の
試料を取り、継代６についてＰＦＵ／ｍｌを測定し、残
りの感染細胞を１００ｍｍ組織培養プレートに再び蒔い
た（継代７）。ＣＰＥが明瞭になった時、細胞を採取
し、１０分の１量の試料を取り、継代７についてＰＦＵ
／ｍｌを測定し、残りの感染細胞を−１３５℃でＦＣ１
２６−ＯＣＬ．２として凍結した。
【００４９】ＨＶＴ感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞（ＦＣ１
２６−ＯＣＬ．３）の作成方法 １５０ｍｍ培養プレート中２０×１０6 ＣＨＣＣ−Ｏ
Ｕ２細胞を含有するＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞のコンフルエ
ンスな単層を２×１０6 ＰＦＵのＦＣ１２６ｐ１０感
染ＣＥＦで感染させた。培養３日後、ウイルス感染に特
徴的な多くのプラークが観察された。感染細胞をトリプ
シン処理し、無菌の１５０ｍｍ培養プレートに移した。
１０分の１量の細胞をＰＦＵの数を測定するために保存
した。継代１感染細胞をさらに２日間培養し、次にトリ
プシン処理し、無菌の１５０ｍｍ培養プレートに移し
て、１０分の１量の細胞をＰＦＵの数を測定するために
保存した。継代２感染細胞をさらに１日培養し、次にト
リプシン処理し、２つの無菌の１５０ｍｍ培養プレート
に等量を移した。１０分の１量の細胞をＰＦＵを測定す
るために保存し、５分の１量を、ＦＳＢ中で−１３５℃
で保存した。感染細胞の比率（すなわちＰＦＵ）は、あ
らかじめ記載した方法で、感染細胞の各連続継代で増加
させた。
２６−ＯＣＬ．３）の作成方法 １５０ｍｍ培養プレート中２０×１０6 ＣＨＣＣ−Ｏ
Ｕ２細胞を含有するＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞のコンフルエ
ンスな単層を２×１０6 ＰＦＵのＦＣ１２６ｐ１０感
染ＣＥＦで感染させた。培養３日後、ウイルス感染に特
徴的な多くのプラークが観察された。感染細胞をトリプ
シン処理し、無菌の１５０ｍｍ培養プレートに移した。
１０分の１量の細胞をＰＦＵの数を測定するために保存
した。継代１感染細胞をさらに２日間培養し、次にトリ
プシン処理し、無菌の１５０ｍｍ培養プレートに移し
て、１０分の１量の細胞をＰＦＵの数を測定するために
保存した。継代２感染細胞をさらに１日培養し、次にト
リプシン処理し、２つの無菌の１５０ｍｍ培養プレート
に等量を移した。１０分の１量の細胞をＰＦＵを測定す
るために保存し、５分の１量を、ＦＳＢ中で−１３５℃
で保存した。感染細胞の比率（すなわちＰＦＵ）は、あ
らかじめ記載した方法で、感染細胞の各連続継代で増加
させた。
【００５０】ＦＣ１２６−ＯＣＬ細胞株の３つの異なる
作成方法を説明し、３つの方法のそれぞれから得られた
細胞をそれぞれＦＣ１２６−ＯＣＬ．１、ＦＣ１２６−
ＯＣＬ．２、およびＦＣ１２６−ＯＣＬ．３と呼んだ。
この３つの細胞株は同じストックのＦＣ１２６ｐ１０感
染ＣＥＦで作成されたため、実質的に同じである。継代
レベルと培養方法のみがわずかに異なる。３つの細胞株
間の培養のわずかな変動により、３つの細胞株が異なる
ことはないと予測される。細胞株の名前は実験を追跡す
るために便宜上付けたものであり、３つの細胞株間のＦ
Ｃ１２６ウイルスの生物学的性質の差を反映するもので
はない。この３つの方法は、使用する方法に関係なくＭ
ＤＶ細胞株が作成されることを示す。３つのすべての細
胞株は、まとめてＦＣ１２６−ＯＣＬと記載することが
できる。
作成方法を説明し、３つの方法のそれぞれから得られた
細胞をそれぞれＦＣ１２６−ＯＣＬ．１、ＦＣ１２６−
ＯＣＬ．２、およびＦＣ１２６−ＯＣＬ．３と呼んだ。
この３つの細胞株は同じストックのＦＣ１２６ｐ１０感
染ＣＥＦで作成されたため、実質的に同じである。継代
レベルと培養方法のみがわずかに異なる。３つの細胞株
間の培養のわずかな変動により、３つの細胞株が異なる
ことはないと予測される。細胞株の名前は実験を追跡す
るために便宜上付けたものであり、３つの細胞株間のＦ
Ｃ１２６ウイルスの生物学的性質の差を反映するもので
はない。この３つの方法は、使用する方法に関係なくＭ
ＤＶ細胞株が作成されることを示す。３つのすべての細
胞株は、まとめてＦＣ１２６−ＯＣＬと記載することが
できる。
【００５１】例４ ＳＢ１−ＯＣＬ細胞株 ＳＢ１感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２（ＳＢ１−ＯＣＬ．１）の
作成方法は、ＦＣ１２６−ＯＣＬ．３について記載した
ものと同じである。１５０ｍｍ培養プレート中の２０×
１０6 ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を含有するＣＨＣＣ−ＯＵ
２細胞のコンフルエンスな単層を、３×１０5 ＰＦＵの
ＳＢ１継代２９（ＳＢ１ｐ２９）感染ＣＥＦで感染させ
た。３日間培養後、ウイルス感染に特徴的な多くのプラ
ークが観察された。感染細胞をトリプシン処理し、無菌
の１５０ｍｍ培養プレートに移した。１０分の１量の細
胞をＰＦＵを測定するために保存した。継代１感染細胞
をさらに２日間培養し、次にトリプシン処理し、無菌の
１５０ｍｍ培養プレートに移して、１０分の１量の細胞
をＰＦＵを測定するために保存した。継代２感染細胞を
さらに１日培養し、次にトリプシン処理し、２つの無菌
の１５０ｍｍ組織培養プレートに等量を移した。１０分
の１量の細胞をＰＦＵを測定するために保存した。感染
細胞の比率（すなわちＰＦＵ）は、あらかじめ記載した
方法で、感染細胞の各連続継代で増加させた。同じ前述
の方法で、継代３、４から２０までのＳＢ１−ＯＣＬス
トックを作成した。
作成方法は、ＦＣ１２６−ＯＣＬ．３について記載した
ものと同じである。１５０ｍｍ培養プレート中の２０×
１０6 ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を含有するＣＨＣＣ−ＯＵ
２細胞のコンフルエンスな単層を、３×１０5 ＰＦＵの
ＳＢ１継代２９（ＳＢ１ｐ２９）感染ＣＥＦで感染させ
た。３日間培養後、ウイルス感染に特徴的な多くのプラ
ークが観察された。感染細胞をトリプシン処理し、無菌
の１５０ｍｍ培養プレートに移した。１０分の１量の細
胞をＰＦＵを測定するために保存した。継代１感染細胞
をさらに２日間培養し、次にトリプシン処理し、無菌の
１５０ｍｍ培養プレートに移して、１０分の１量の細胞
をＰＦＵを測定するために保存した。継代２感染細胞を
さらに１日培養し、次にトリプシン処理し、２つの無菌
の１５０ｍｍ組織培養プレートに等量を移した。１０分
の１量の細胞をＰＦＵを測定するために保存した。感染
細胞の比率（すなわちＰＦＵ）は、あらかじめ記載した
方法で、感染細胞の各連続継代で増加させた。同じ前述
の方法で、継代３、４から２０までのＳＢ１−ＯＣＬス
トックを作成した。
【００５２】例５ ＨＶＴ−ＯＣＬおよびＳＢ１−ＯＣＬ細胞株のウイルス
力価の測定 各継代レベルの１０分の１量の保存した試料の連続希釈
物をＣＥＦで培養して、ＦＣ１２６−ＯＣＬ細胞株であ
る、ＦＣ１２６−ＯＣＬ．１、．２、および．３につい
てＰＦＵを測定した。連続希釈は、４％ウシ血清含有Ｌ
Ｍ中で行ない、希釈物を１０倍ずつ増加し、１０-1〜１
０-7の範囲であった。
力価の測定 各継代レベルの１０分の１量の保存した試料の連続希釈
物をＣＥＦで培養して、ＦＣ１２６−ＯＣＬ細胞株であ
る、ＦＣ１２６−ＯＣＬ．１、．２、および．３につい
てＰＦＵを測定した。連続希釈は、４％ウシ血清含有Ｌ
Ｍ中で行ない、希釈物を１０倍ずつ増加し、１０-1〜１
０-7の範囲であった。
【００５３】表１は、細胞株ＦＣ１２６−ＯＣＬとＦＣ
１２６−ＯＣＬ．３の組織培養継代５、６、７、および
８について、そしてＦＣ１２６−ＯＣＬ．２とＳＢ１−
ＯＣＬ．１の最初の３つの継代についての、力価の上昇
を示す。継代は、空の組織培養プレートに感染細胞を再
び蒔くことにより行われ、組織培養プレートの未感染細
胞を感染しただけではないため、各培養継代後の力価の
上昇は、ウイルスを含有する細胞株の濃縮を示す。高力
価ストックのＦＣ１２６感染ＣＥＦで最初の感染後は、
いくつかの理由で細胞株精製で以後の継代で生存するこ
とができないであろう。１）ＣＥＦの寿命は限られてお
り、組織培養では２または３週間以上生存できない、従
って未感染ＣＥＦは、最初のＣＨＣＣ−ＯＵ２感染後２
週間を越えて生存できないであろう。２）ＣＨＣＣ−Ｏ
Ｕ２の最初の感染は、ほとんど１００％ＣＰＥの感染Ｃ
ＥＦで行なった。１００％ＣＰＥで各細胞を感染し、感
染された細胞は、組織培養プレートから離れ始めた。感
染のこの段階でＣＥＦを再び蒔いても、単層は樹立され
ないであろう、および３）ＣＥＦは凍結−融解に非常に
感受性であり、数回以上の凍結−融解には普通耐えられ
ない。ＦＣ１２６−ＯＣＬ．３細胞株のＰＦＵ／ｍｌ
は、ＣＥＦで増殖したＦＣ１２６のＰＦＵ／ｍｌより２
オーダー大きい。ＳＢ１−ＯＣＬ．１のＰＦＵ／ｍｌ
は、ＣＥＦで増殖したＳＢ１のＰＦＵ／ｍｌより１オー
ダー大きい。両方の細胞株の最大のＰＦＵ／ｍｌは、測
定されていない。
１２６−ＯＣＬ．３の組織培養継代５、６、７、および
８について、そしてＦＣ１２６−ＯＣＬ．２とＳＢ１−
ＯＣＬ．１の最初の３つの継代についての、力価の上昇
を示す。継代は、空の組織培養プレートに感染細胞を再
び蒔くことにより行われ、組織培養プレートの未感染細
胞を感染しただけではないため、各培養継代後の力価の
上昇は、ウイルスを含有する細胞株の濃縮を示す。高力
価ストックのＦＣ１２６感染ＣＥＦで最初の感染後は、
いくつかの理由で細胞株精製で以後の継代で生存するこ
とができないであろう。１）ＣＥＦの寿命は限られてお
り、組織培養では２または３週間以上生存できない、従
って未感染ＣＥＦは、最初のＣＨＣＣ−ＯＵ２感染後２
週間を越えて生存できないであろう。２）ＣＨＣＣ−Ｏ
Ｕ２の最初の感染は、ほとんど１００％ＣＰＥの感染Ｃ
ＥＦで行なった。１００％ＣＰＥで各細胞を感染し、感
染された細胞は、組織培養プレートから離れ始めた。感
染のこの段階でＣＥＦを再び蒔いても、単層は樹立され
ないであろう、および３）ＣＥＦは凍結−融解に非常に
感受性であり、数回以上の凍結−融解には普通耐えられ
ない。ＦＣ１２６−ＯＣＬ．３細胞株のＰＦＵ／ｍｌ
は、ＣＥＦで増殖したＦＣ１２６のＰＦＵ／ｍｌより２
オーダー大きい。ＳＢ１−ＯＣＬ．１のＰＦＵ／ｍｌ
は、ＣＥＦで増殖したＳＢ１のＰＦＵ／ｍｌより１オー
ダー大きい。両方の細胞株の最大のＰＦＵ／ｍｌは、測
定されていない。
【００５４】
【表１】
【００５５】例７ ＦＣ１２６−ＯＣＬ．１と従来のＦＣ１２６ワクチンと
の比較 市販のＨＶＴワクチン株ＦＣ１２６（ＦＣ１２６−ＯＣ
Ｌ）を含有する維持可能な細胞株が、ＭＤＶに対してニ
ワトリを防御する能力を、ＣＥＦで増殖したＨＶＴワク
チン株ＦＣ１２６（ＦＣ１２６−ＣＥＦ）と比較した。
この実験では、現在のＦＣ１２６ワクチンについて推奨
されている投与レベルで投与した時、１日齢のヒヨコを
防御するＦＣ１２６−ＯＣＬの効率について比較した。
の比較 市販のＨＶＴワクチン株ＦＣ１２６（ＦＣ１２６−ＯＣ
Ｌ）を含有する維持可能な細胞株が、ＭＤＶに対してニ
ワトリを防御する能力を、ＣＥＦで増殖したＨＶＴワク
チン株ＦＣ１２６（ＦＣ１２６−ＣＥＦ）と比較した。
この実験では、現在のＦＣ１２６ワクチンについて推奨
されている投与レベルで投与した時、１日齢のヒヨコを
防御するＦＣ１２６−ＯＣＬの効率について比較した。
【００５６】４群の１日齢のヒヨコ（特異的病原体を含
まない、ＭＤＶ感受性のヒヨコ、エスピーエーエフエー
エス（ＳＰＡＦＡＳ）、シカゴ、イリノイ州）を、１）
２，０００ＰＦＵの細胞培養継代１７のＦＣ１２６−Ｏ
ＣＬ（ヒヨコ１６羽）、２）２，０００ＰＦＵの細胞培
養継代１０のＦＣ１２６−ＣＥＦ（ヒヨコ１６羽）、そ
して３）ＦＣ１２６−ＯＣＬとして同じ濃度の未感染Ｏ
ＣＬ（ヒヨコ１０羽）で、予防接種を行なった。第４群
のヒヨコを対照とした。予防接種後７日目に、第１群と
２群の１３羽のヒヨコ、そして第３群と対照の８羽のヒ
ヨコに、２，０００ＰＦＵの毒性ＭＤＶ株ＧＡを抗原投
与した。抗原投与の３２日後、ヒヨコの剖検を行い、Ｍ
ＤＶ感染の病理的症状を調べた。末梢神経系の広い領域
でＭＤＶの病理的症状が明らかであり、種々の臓器（例
えば、生殖腺、肝臓、腎臓、心臓、および脾臓）におけ
るリンパ腫の存在、およびファブリキウス嚢の萎縮が見
られた。
まない、ＭＤＶ感受性のヒヨコ、エスピーエーエフエー
エス（ＳＰＡＦＡＳ）、シカゴ、イリノイ州）を、１）
２，０００ＰＦＵの細胞培養継代１７のＦＣ１２６−Ｏ
ＣＬ（ヒヨコ１６羽）、２）２，０００ＰＦＵの細胞培
養継代１０のＦＣ１２６−ＣＥＦ（ヒヨコ１６羽）、そ
して３）ＦＣ１２６−ＯＣＬとして同じ濃度の未感染Ｏ
ＣＬ（ヒヨコ１０羽）で、予防接種を行なった。第４群
のヒヨコを対照とした。予防接種後７日目に、第１群と
２群の１３羽のヒヨコ、そして第３群と対照の８羽のヒ
ヨコに、２，０００ＰＦＵの毒性ＭＤＶ株ＧＡを抗原投
与した。抗原投与の３２日後、ヒヨコの剖検を行い、Ｍ
ＤＶ感染の病理的症状を調べた。末梢神経系の広い領域
でＭＤＶの病理的症状が明らかであり、種々の臓器（例
えば、生殖腺、肝臓、腎臓、心臓、および脾臓）におけ
るリンパ腫の存在、およびファブリキウス嚢の萎縮が見
られた。
【００５７】未感染細胞株を接種した鳥および対照とも
に、ＭＤＶ感染の多くの病理的症状を有していた。重要
なことは、ＦＣ１２６−ＯＣＬ細胞株で予防接種し、Ｍ
ＤＶを抗原投与したヒヨコのいずれもＭＤＶ感染の病理
的証拠を有さなかった。効率実験の結果は、表２に示
す。この実験は、ＦＣ１２６−ＣＥＦについて推奨され
ている市販薬の投与量に等しい投与量レベルでＦＣ１２
６−ＯＣＬで予防接種すると、伝統的なＣＥＦ増殖ＦＣ
１２６のように、ＭＤＶに対してニワトリが防御される
ことを証明している。
に、ＭＤＶ感染の多くの病理的症状を有していた。重要
なことは、ＦＣ１２６−ＯＣＬ細胞株で予防接種し、Ｍ
ＤＶを抗原投与したヒヨコのいずれもＭＤＶ感染の病理
的証拠を有さなかった。効率実験の結果は、表２に示
す。この実験は、ＦＣ１２６−ＣＥＦについて推奨され
ている市販薬の投与量に等しい投与量レベルでＦＣ１２
６−ＯＣＬで予防接種すると、伝統的なＣＥＦ増殖ＦＣ
１２６のように、ＭＤＶに対してニワトリが防御される
ことを証明している。
【００５８】
【表２】 1 １日目に２０００ＰＦＵで予防接種したヒヨコ。2 ２０００ＰＦＵのＦＣ１２６−ＯＣＬｐ１７中の細
胞と等しい数のＯＣＬ細胞を接種したヒヨコ。3 予防接種の７日後、すべてのヒヨコに２０００ＰＦ
ＵＭＤＶ株ＧＡを抗原投与した。実験は、抗原投与後３
２日目に終了した。防御は、剖検でＭＤＶの症状が存在
しなかったことで示される。4 防御指数：対照の％ＭＤ−予防接種中の％ＭＤ／対
照の％ＭＤ×１００。
胞と等しい数のＯＣＬ細胞を接種したヒヨコ。3 予防接種の７日後、すべてのヒヨコに２０００ＰＦ
ＵＭＤＶ株ＧＡを抗原投与した。実験は、抗原投与後３
２日目に終了した。防御は、剖検でＭＤＶの症状が存在
しなかったことで示される。4 防御指数：対照の％ＭＤ−予防接種中の％ＭＤ／対
照の％ＭＤ×１００。
【００５９】例８ 細胞株中のＭＤＶの安定性 ＭＤＶ−ＯＵ２細胞株の３１継代後、ウイルスＤＮＡを
ｈｅｔ領域の拡張についてＰＣＲで解析した。予想外
に、ｈｅｔ領域の拡張は認められなかった。従って、Ｃ
ＥＦ中のＭＤＶ増殖と異なり、本発明ではＭＤＶは安定
化され、従ってＭＤＶ細胞がワクチン効率を低下させる
ことなく無期限に増殖することを可能にする。
ｈｅｔ領域の拡張についてＰＣＲで解析した。予想外
に、ｈｅｔ領域の拡張は認められなかった。従って、Ｃ
ＥＦ中のＭＤＶ増殖と異なり、本発明ではＭＤＶは安定
化され、従ってＭＤＶ細胞がワクチン効率を低下させる
ことなく無期限に増殖することを可能にする。
【００６０】ＰＣＲを、細胞培養物中の連続継代後のＭ
ＤＶ ＯＵ２．２とＭＤＶ ＯＵ２．１中の１３２塩基
対ＤＲ配列の数を測定するための測定法として用いた。
ＤＶ ＯＵ２．２とＭＤＶ ＯＵ２．１中の１３２塩基
対ＤＲ配列の数を測定するための測定法として用いた。
【００６１】Ｍｄ１１細胞培養物継代１４を感染させた
ＣＥＦ、Ｍｄ１１細胞培養物継代４８を感染させたＣＥ
Ｆ、およびＭＤＶ−ＯＵ２．２細胞培養物継代４８か
ら、総細胞性ＤＮＡを標準的方法（サムブルーク（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング：実験室マニュア
ル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第２版）、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（１９８
９）、９．１６−９．１９頁）で抽出し、１３２塩基対
ＤＲ配列のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。上
流オリゴヌクレオチドプライマーは、5'-TGCGATGAAAGTG
CTATGGAGG-3'（配列番号１）であった。下流オリゴヌク
レオチドプライマーは、5'-GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC-3'
（配列番号２）であった。上流プライマーは、ＤＲ配列
の３塩基対５’である。下流プライマーは、ＤＲ配列の
３’末端から６塩基対である。この２つのプライマー
は、ＤＲ配列の２つのコピーの場合は３１７塩基対断片
を増幅する（アール・エフ・シルバ（Ｒ．Ｆ．Ｓｉｌｖ
ａ）、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３６：５２１−５２８（１
９９２））。ＰＣＲ条件は元々の条件を少し修飾した
（Ｒ．Ｆ．Ｓｉｌｖａ）、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３６：
５２１−５２８（１９９２））。簡単に説明すると、５
００ｎｇの総細胞性ＤＮＡを、２０ｍＭの各ｄＮＴＰ，
２０μＭの各オリゴヌクレオチドプライマー対、１０μ
ｌの１０×ＰＣＲ反応緩衝液（ギブコ・ビーアールエル
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ライフテクノロジー社（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサー
ズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド
州）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、および１．０ＵのＴａ
ｑポリメラーゼ（ギブコ・ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ）、ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサーズバーグ（Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）と混合し
た。ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）９６００サーマル
サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ
ｓ）、ノーワーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット
州）を用いて、ＰＣＲ反応を行なった。９５℃で５分の
最初の変性工程の後、９５℃で４５秒、６７℃で４５
秒、そして７２℃で４５秒を２５サイクル行い、ＤＮＡ
を増幅した。７２℃で１０分の最終延長工程により、Ｐ
ＣＲ反応を完了した。ＰＣＲ産物を６％ポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、紫外
線下で写真を撮った。増幅した断片のサイズは、１ｋｂ
のＤＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）（ギブコ・ビーアール
エル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ライフテクノロジー社
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲ
イサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリー
ランド州）と比較して測定した。
ＣＥＦ、Ｍｄ１１細胞培養物継代４８を感染させたＣＥ
Ｆ、およびＭＤＶ−ＯＵ２．２細胞培養物継代４８か
ら、総細胞性ＤＮＡを標準的方法（サムブルーク（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング：実験室マニュア
ル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第２版）、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（１９８
９）、９．１６−９．１９頁）で抽出し、１３２塩基対
ＤＲ配列のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。上
流オリゴヌクレオチドプライマーは、5'-TGCGATGAAAGTG
CTATGGAGG-3'（配列番号１）であった。下流オリゴヌク
レオチドプライマーは、5'-GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC-3'
（配列番号２）であった。上流プライマーは、ＤＲ配列
の３塩基対５’である。下流プライマーは、ＤＲ配列の
３’末端から６塩基対である。この２つのプライマー
は、ＤＲ配列の２つのコピーの場合は３１７塩基対断片
を増幅する（アール・エフ・シルバ（Ｒ．Ｆ．Ｓｉｌｖ
ａ）、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３６：５２１−５２８（１
９９２））。ＰＣＲ条件は元々の条件を少し修飾した
（Ｒ．Ｆ．Ｓｉｌｖａ）、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３６：
５２１−５２８（１９９２））。簡単に説明すると、５
００ｎｇの総細胞性ＤＮＡを、２０ｍＭの各ｄＮＴＰ，
２０μＭの各オリゴヌクレオチドプライマー対、１０μ
ｌの１０×ＰＣＲ反応緩衝液（ギブコ・ビーアールエル
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ライフテクノロジー社（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサー
ズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド
州）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、および１．０ＵのＴａ
ｑポリメラーゼ（ギブコ・ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ）、ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサーズバーグ（Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）と混合し
た。ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）９６００サーマル
サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ
ｓ）、ノーワーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット
州）を用いて、ＰＣＲ反応を行なった。９５℃で５分の
最初の変性工程の後、９５℃で４５秒、６７℃で４５
秒、そして７２℃で４５秒を２５サイクル行い、ＤＮＡ
を増幅した。７２℃で１０分の最終延長工程により、Ｐ
ＣＲ反応を完了した。ＰＣＲ産物を６％ポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、紫外
線下で写真を撮った。増幅した断片のサイズは、１ｋｂ
のＤＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）（ギブコ・ビーアール
エル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ライフテクノロジー社
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲ
イサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリー
ランド州）と比較して測定した。
【００６２】すべての反応で、１３２塩基対ＤＲの１つ
のコピーに対応する１８５塩基対の増幅断片が見られ
た。しかし、Ｍｄ１１継代１４では（図２、レーン
１）、病原性Ｍｄ１１に特徴的なように、１３２塩基対
ＤＲの２つのコピーに対応する３１７塩基対断片が主で
あった（図２、レーン２）。この３１７塩基対断片は、
継代４８により減弱化されたＭｄ１１中には存在しない
（図２、レーン２）。重要なことは、継代４８のＭＤＶ
ＯＵ２．２は、病原性Ｍｄ１１に特徴的な３１７塩基
対断片を保持していることである（図２、レーン３）。
のコピーに対応する１８５塩基対の増幅断片が見られ
た。しかし、Ｍｄ１１継代１４では（図２、レーン
１）、病原性Ｍｄ１１に特徴的なように、１３２塩基対
ＤＲの２つのコピーに対応する３１７塩基対断片が主で
あった（図２、レーン２）。この３１７塩基対断片は、
継代４８により減弱化されたＭｄ１１中には存在しない
（図２、レーン２）。重要なことは、継代４８のＭＤＶ
ＯＵ２．２は、病原性Ｍｄ１１に特徴的な３１７塩基
対断片を保持していることである（図２、レーン３）。
【００６３】ＰＣＲ解析の結果は、ＭＤＶ ＯＵ２．２
とＭＤＶ ＯＵ２．１のＭＤＶ（データは示していな
い）細胞株は、インビトロで４８回の継代後も減弱化さ
れていないことを示す。これに対して、かつ予測された
ように、インビトロでＣＥＦで４８回の継代後Ｍｄ１１
は、減弱化されている。これらの結果は、ＣＨＣＣ−Ｏ
Ｕ２細胞中でインビトロの増殖中、ＭＤＶは安定に維持
されていることを示す。本発明はワクチンウイルスがイ
ンビトロで無期限にまたは少なくとも４８回の細胞継代
でも増殖することを可能にするため、この予想外の結果
は、ワクチン製造業者にとっては非常に重要である。こ
れは、インビトロの継代で防御効率が低下する、ＣＥＦ
上のＭＤＶのワクチン株の増殖とは対照的である。典型
的にはＭＤＶのワクチン株は、マスター種菌ストックを
５継代だけ越えて増殖させることができる。米国農務省
の認可を受けるには、５を越える各継代は、それぞれ継
代５と同様の効率を有することを証明しなければならな
い。いったん米国農務省に証明できれば、本発明は、継
代５を越える各継代を再度認可をとることなく、ワクチ
ン株がマスター種菌ストックを越えて無期限に増殖する
ことを可能にするであろう。
とＭＤＶ ＯＵ２．１のＭＤＶ（データは示していな
い）細胞株は、インビトロで４８回の継代後も減弱化さ
れていないことを示す。これに対して、かつ予測された
ように、インビトロでＣＥＦで４８回の継代後Ｍｄ１１
は、減弱化されている。これらの結果は、ＣＨＣＣ−Ｏ
Ｕ２細胞中でインビトロの増殖中、ＭＤＶは安定に維持
されていることを示す。本発明はワクチンウイルスがイ
ンビトロで無期限にまたは少なくとも４８回の細胞継代
でも増殖することを可能にするため、この予想外の結果
は、ワクチン製造業者にとっては非常に重要である。こ
れは、インビトロの継代で防御効率が低下する、ＣＥＦ
上のＭＤＶのワクチン株の増殖とは対照的である。典型
的にはＭＤＶのワクチン株は、マスター種菌ストックを
５継代だけ越えて増殖させることができる。米国農務省
の認可を受けるには、５を越える各継代は、それぞれ継
代５と同様の効率を有することを証明しなければならな
い。いったん米国農務省に証明できれば、本発明は、継
代５を越える各継代を再度認可をとることなく、ワクチ
ン株がマスター種菌ストックを越えて無期限に増殖する
ことを可能にするであろう。
【００６４】以下の例は、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の特徴
を示す。これらの特徴は、ＭＤＶ感染細胞と同じであ
る。
を示す。これらの特徴は、ＭＤＶ感染細胞と同じであ
る。
【００６５】例９ ビー・エフ・ベンケル（Ｂ．Ｆ．Ｂｅｎｋｅｌ）ら（Ｐ
ｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７１：１５２０−１５
２６（１９９２））の方法を用いて、ＣＨＣＣ−ＯＵ２
細胞がｅｖ１に対して同型接合性であることを証明し
た。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞とｅｖ１、ｅｖ１とｅｖ６、
またはｅｖ１５を含有する鳥類細胞から標準的方法（サ
ムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニン
グ：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ： Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）
（第２版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨ
ーク（１９８９）、９．１６−９．１９頁）で、総細胞
性ＤＮＡを抽出した。プライマーＰＲ−Ａ（5'-GCACCAA
ACAATCTAGTCTGTGC）、ＰＲ−Ｂ（5'-AAGTACTCACTTCTCTG
AAC ）、およびＰＲ−Ｃ（5'-GCCAAGCTTCAATGAAGCAGAAG
GCTTC ）、それぞれ配列番号３、配列番号４、および配
列番号５よりなるプライマーセットを用いるＰＣＲ増幅
の鋳型として、総細胞性ＤＮＡを使用した。プライマー
ＰＲ−Ａは、ｅｖ１挿入体の上流のゲノム領域に特異的
であり、プライマーＰＲ−Ｂは、ｅｖ１挿入体の下流の
ゲノム領域に特異的であり、そしてプライマーＰＲ−Ｃ
は、ｅｖ１長い末端反復配列に特異的である。これらの
プライマーによるｅｖ１に同型接合性の鳥からのＤＮＡ
のＰＣＲは、長さ３００塩基対のＤＮＡを産生するであ
ろう。これらのプライマーによるｅｖ１に異型接合性の
鳥からのＤＮＡのＰＣＲは、長さ３００塩基対と５１０
塩基対のＤＮＡを産生し、ｅｖ１の欠如した鳥からのＤ
ＮＡのＰＣＲは５１０塩基対のＤＮＡ断片を産生するで
あろう。ＰＣＲ反応は、ビー・エフ・ベンケル（Ｂ．
Ｆ．Ｂｅｎｋｅｌ）ら（ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ
７１：１５２０−１５２６（１９９２））が記載した
ように、ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）９６００サー
マルサイクラー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ
ｓ）、ノーワーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット
州）を用いて行なった。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲ
ルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、紫外線下で
写真を撮った（サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、
分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）（第２版）、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリ
ング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）、ニューヨーク（１９８９）、６．２−６．１
９）。増幅した生成物のサイズは、１ｋｂのＤＮＡラダ
ー（ｌａｄｄｅｒ）マーカー（ギブコ・ビーアールエル
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ライフテクノロジー社（Ｌｉ
ｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサーズ
バーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド
州）と比較して決定した。図３では、ＣＨＣＣ−ＯＵ２
細胞は３００塩基対の単一の生成物を産生しており、Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞がｅｖ１に対して同型接合性である
ことを示している。異型接合性ｅｖ１、およびｅｖ１と
ｅｖ６、陽性対照ＤＮＡは、３００塩基対と５１０塩基
対の２つの生成物を産生した。陰性対照ｅｖ１５ＤＮＡ
は、ｅｖ１を含まないＤＮＡに予測されるように、５１
０塩基対の１つの生成物のみを産生した。
ｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７１：１５２０−１５
２６（１９９２））の方法を用いて、ＣＨＣＣ−ＯＵ２
細胞がｅｖ１に対して同型接合性であることを証明し
た。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞とｅｖ１、ｅｖ１とｅｖ６、
またはｅｖ１５を含有する鳥類細胞から標準的方法（サ
ムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニン
グ：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ： Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）
（第２版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨ
ーク（１９８９）、９．１６−９．１９頁）で、総細胞
性ＤＮＡを抽出した。プライマーＰＲ−Ａ（5'-GCACCAA
ACAATCTAGTCTGTGC）、ＰＲ−Ｂ（5'-AAGTACTCACTTCTCTG
AAC ）、およびＰＲ−Ｃ（5'-GCCAAGCTTCAATGAAGCAGAAG
GCTTC ）、それぞれ配列番号３、配列番号４、および配
列番号５よりなるプライマーセットを用いるＰＣＲ増幅
の鋳型として、総細胞性ＤＮＡを使用した。プライマー
ＰＲ−Ａは、ｅｖ１挿入体の上流のゲノム領域に特異的
であり、プライマーＰＲ−Ｂは、ｅｖ１挿入体の下流の
ゲノム領域に特異的であり、そしてプライマーＰＲ−Ｃ
は、ｅｖ１長い末端反復配列に特異的である。これらの
プライマーによるｅｖ１に同型接合性の鳥からのＤＮＡ
のＰＣＲは、長さ３００塩基対のＤＮＡを産生するであ
ろう。これらのプライマーによるｅｖ１に異型接合性の
鳥からのＤＮＡのＰＣＲは、長さ３００塩基対と５１０
塩基対のＤＮＡを産生し、ｅｖ１の欠如した鳥からのＤ
ＮＡのＰＣＲは５１０塩基対のＤＮＡ断片を産生するで
あろう。ＰＣＲ反応は、ビー・エフ・ベンケル（Ｂ．
Ｆ．Ｂｅｎｋｅｌ）ら（ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ
７１：１５２０−１５２６（１９９２））が記載した
ように、ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）９６００サー
マルサイクラー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ
ｓ）、ノーワーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット
州）を用いて行なった。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲ
ルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、紫外線下で
写真を撮った（サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、
分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）（第２版）、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリ
ング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）、ニューヨーク（１９８９）、６．２−６．１
９）。増幅した生成物のサイズは、１ｋｂのＤＮＡラダ
ー（ｌａｄｄｅｒ）マーカー（ギブコ・ビーアールエル
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ライフテクノロジー社（Ｌｉ
ｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサーズ
バーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド
州）と比較して決定した。図３では、ＣＨＣＣ−ＯＵ２
細胞は３００塩基対の単一の生成物を産生しており、Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞がｅｖ１に対して同型接合性である
ことを示している。異型接合性ｅｖ１、およびｅｖ１と
ｅｖ６、陽性対照ＤＮＡは、３００塩基対と５１０塩基
対の２つの生成物を産生した。陰性対照ｅｖ１５ＤＮＡ
は、ｅｖ１を含まないＤＮＡに予測されるように、５１
０塩基対の１つの生成物のみを産生した。
【００６６】ビー・エフ・ベンケル（Ｂ．Ｆ．Ｂｅｎｋ
ｅｌ）とイー・ジェイ・スミス（Ｅ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ）
（Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７２：１６０１−
１６０５（１９９３））の方法を使用して、ＣＨＣＣ−
ＯＵ２細胞がｅｖ１５に対して同型接合性であることを
証明した。プライマー１５−１（5'-CAAATGAGGGTAATAAG
GGAG）および１５−２（5'-CACTACCAAATATAATTCTGTA
G）、それぞれ、配列番号６、および配列番号７よりな
るプライマーセットを用いて、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞と
ｅｖ１またはｅｖ１５を含有する鳥細胞からの総細胞性
ＤＮＡを、ＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。プライマ
ー１５−１は、ｅｖ１５挿入体の上流のゲノム領域に特
異的であり、そしてプライマーＰＲ−１５は、ｅｖ１５
挿入体の下流のゲノム領域に特異的である。これらのプ
ライマーによるｅｖ１５に同型接合性の鳥からのＤＮＡ
のＰＣＲは、長さ４３４塩基対のＤＮＡを産生するであ
ろう。これらのプライマーによるｅｖ１５に異型接合性
の鳥からのＤＮＡのＰＣＲは、長さ４３４塩基対と１８
１塩基対のＤＮＡを産生し、ｅｖ１５の欠如した鳥から
のＤＮＡのＰＣＲは１８１塩基対のＤＮＡ断片を産生す
るであろう。ＰＣＲ反応は、ビー・エフ・ベンケル
（Ｂ．Ｆ．Ｂｅｎｋｅｌ）とイー・ジェイ・スミス
（Ｅ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ）（Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ７２：１６０１−１６０５（１９９３））が記載
したように、ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）９６００
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ）、ノーワーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカッ
ト州）を用いて行なった。ＰＣＲ産物は１％アガロース
ゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、紫外線下
で写真を撮った（サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）
ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ）（第２版）、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・ス
プリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ）、ニューヨーク（１９８９）、６．２−６．１
９）。増幅した生成物のサイズは、１ｋｂのＤＮＡラダ
ー（ｌａｄｄｅｒ）マーカー（ギブコ・ビーアールエル
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ライフテクノロジー社（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサー
ズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド
州）と比較して決定した。図４では、ＣＨＣＣ−ＯＵ２
細胞は４３４塩基対の単一の生成物を産生しており、Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞がｅｖ１５に対して同型接合性であ
ることを示している。異型接合性ｅｖ１５、陽性対照Ｄ
ＮＡは、４３４塩基対と１８１塩基対の２つの生成物を
産生した。陰性対照ｅｖ１ＤＮＡは、ｅｖ１５を含まな
いＤＮＡに予測されるように、１８１塩基対の１つの生
成物のみを産生した。
ｅｌ）とイー・ジェイ・スミス（Ｅ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ）
（Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７２：１６０１−
１６０５（１９９３））の方法を使用して、ＣＨＣＣ−
ＯＵ２細胞がｅｖ１５に対して同型接合性であることを
証明した。プライマー１５−１（5'-CAAATGAGGGTAATAAG
GGAG）および１５−２（5'-CACTACCAAATATAATTCTGTA
G）、それぞれ、配列番号６、および配列番号７よりな
るプライマーセットを用いて、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞と
ｅｖ１またはｅｖ１５を含有する鳥細胞からの総細胞性
ＤＮＡを、ＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。プライマ
ー１５−１は、ｅｖ１５挿入体の上流のゲノム領域に特
異的であり、そしてプライマーＰＲ−１５は、ｅｖ１５
挿入体の下流のゲノム領域に特異的である。これらのプ
ライマーによるｅｖ１５に同型接合性の鳥からのＤＮＡ
のＰＣＲは、長さ４３４塩基対のＤＮＡを産生するであ
ろう。これらのプライマーによるｅｖ１５に異型接合性
の鳥からのＤＮＡのＰＣＲは、長さ４３４塩基対と１８
１塩基対のＤＮＡを産生し、ｅｖ１５の欠如した鳥から
のＤＮＡのＰＣＲは１８１塩基対のＤＮＡ断片を産生す
るであろう。ＰＣＲ反応は、ビー・エフ・ベンケル
（Ｂ．Ｆ．Ｂｅｎｋｅｌ）とイー・ジェイ・スミス
（Ｅ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ）（Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ７２：１６０１−１６０５（１９９３））が記載
したように、ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）９６００
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ）、ノーワーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカッ
ト州）を用いて行なった。ＰＣＲ産物は１％アガロース
ゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、紫外線下
で写真を撮った（サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）
ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ）（第２版）、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・ス
プリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ）、ニューヨーク（１９８９）、６．２−６．１
９）。増幅した生成物のサイズは、１ｋｂのＤＮＡラダ
ー（ｌａｄｄｅｒ）マーカー（ギブコ・ビーアールエル
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ライフテクノロジー社（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサー
ズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド
州）と比較して決定した。図４では、ＣＨＣＣ−ＯＵ２
細胞は４３４塩基対の単一の生成物を産生しており、Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞がｅｖ１５に対して同型接合性であ
ることを示している。異型接合性ｅｖ１５、陽性対照Ｄ
ＮＡは、４３４塩基対と１８１塩基対の２つの生成物を
産生した。陰性対照ｅｖ１ＤＮＡは、ｅｖ１５を含まな
いＤＮＡに予測されるように、１８１塩基対の１つの生
成物のみを産生した。
【００６７】ＭＤＶ複製を支持し、ＭＤＶワクチンの製
造に使用できる継続性のある細胞株は、家禽産業に対し
て極めて大きな経済的意味を持っている。このような細
胞株の利点は：１）ＳＰＦ群の受精卵の継続的供給の必
要性を排除し、ＳＰＦ卵供給の中断によるワクチン製造
の損害の危険性を低下させ、そして受精ＳＰＦ卵の価格
変動の影響を排除することにより、ＭＤＶワクチン製造
に関するコストを実質的に低下させる；２）マスター細
胞ストックの検定が可能であり、従って各バッチのＣＥ
Ｆ細胞を製造する危険を避けることができる；３）ＭＤ
Ｖのワクチン株で感染したＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は無期
限に増殖でき、感染細胞をコンフルエンスにすることで
ウイルスの産生を誘発することができる；４）ＣＥＦ細
胞のＭＤＶワクチンを産生するのと同じ製造方法を、Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞について使用することができる；
５）ＭＤＶは細胞株中で安定化される。コストの低下
は、家禽産業業者および消費者に有益となるであろう。
本発明において、ＭＤＶを産生しワクチンとして用いて
マレク病に対して鳥類を防御する、維持可能な細胞株が
特許請求される。
造に使用できる継続性のある細胞株は、家禽産業に対し
て極めて大きな経済的意味を持っている。このような細
胞株の利点は：１）ＳＰＦ群の受精卵の継続的供給の必
要性を排除し、ＳＰＦ卵供給の中断によるワクチン製造
の損害の危険性を低下させ、そして受精ＳＰＦ卵の価格
変動の影響を排除することにより、ＭＤＶワクチン製造
に関するコストを実質的に低下させる；２）マスター細
胞ストックの検定が可能であり、従って各バッチのＣＥ
Ｆ細胞を製造する危険を避けることができる；３）ＭＤ
Ｖのワクチン株で感染したＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は無期
限に増殖でき、感染細胞をコンフルエンスにすることで
ウイルスの産生を誘発することができる；４）ＣＥＦ細
胞のＭＤＶワクチンを産生するのと同じ製造方法を、Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞について使用することができる；
５）ＭＤＶは細胞株中で安定化される。コストの低下
は、家禽産業業者および消費者に有益となるであろう。
本発明において、ＭＤＶを産生しワクチンとして用いて
マレク病に対して鳥類を防御する、維持可能な細胞株が
特許請求される。
【００６８】前述の説明は本発明を例示するためのもの
であり、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定され
る。
であり、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定され
る。
【００６９】
配列番号：１ （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：１：
【００７０】配列番号：２ （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：２：
【００７１】配列番号：３ （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：鳥類レトロウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー：Ｎ／Ａ （xi）配列：配列番号：３：
【００７２】配列番号：４ （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：鳥類レトロウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー：Ｎ／Ａ （xi）配列：配列番号：４：
【００７３】配列番号：５ （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：鳥類レトロウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー：Ｎ／Ａ （xi）配列：配列番号：５：
【００７４】配列番号：６ （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：鳥類レトロウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー：Ｎ／Ａ （xi）配列：配列番号：６：
【００７５】配列番号：７ （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：鳥類レトロウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー：Ｎ／Ａ （xi）配列：配列番号：７：
【図１】ＡはＦＣ１２６−ＯＣＬの単層培養物の光学顕
微鏡写真を示す。ＢはＣＥＦ上のＦＣ１２６プラークの
光学顕微鏡写真を示す。ＣはＳＢ１−ＯＣＬの単層培養
物の光学顕微鏡写真を示す。ＤはＣＥＦ上のＳＢ１プラ
ークの光学顕微鏡写真を示す。
微鏡写真を示す。ＢはＣＥＦ上のＦＣ１２６プラークの
光学顕微鏡写真を示す。ＣはＳＢ１−ＯＣＬの単層培養
物の光学顕微鏡写真を示す。ＤはＣＥＦ上のＳＢ１プラ
ークの光学顕微鏡写真を示す。
【図２】１３２塩基対のＤＲ配列のＰＣＲ増幅を示す。
【図３】ｅｖ１に対するＣＨＣＣ−ＯＵ２ＤＮＡのＰＣ
Ｒ増幅測定法を示すアガロースゲルの写真を示す。
Ｒ増幅測定法を示すアガロースゲルの写真を示す。
【図４】ｅｖ１５に対するＣＨＣＣ−ＯＵ２ＤＮＡのＰ
ＣＲ増幅測定法を示すアガロースゲルの写真を示す。
ＣＲ増幅測定法を示すアガロースゲルの写真を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｅ // Ｃ０７Ｋ 14/055 9282−4Ｂ ＺＮＡＡ (72)発明者 アミン アブジョウブ アメリカ合衆国ミシガン州イースト ラン シング，ウィンタークレスト 1626
Claims (43)
- 【請求項１】 ニワトリヘルパー因子（Ｃｈｆ）陰性で
あり、ウイルスが存在せず、化学的突然変異誘発物質で
処理し次にマレク病ウイルス（ＭＤＶ）で感染させたニ
ワトリ胚細胞（ＣＥＣ）から得られる、単層培養物中の
ＭＤＶに感染した維持可能なニワトリ細胞株であって、
該細胞株はインビボで鳥類に感染することができ、ＭＤ
Ｖは細胞株中で非溶菌または溶菌感染として維持され得
る、細胞株。 - 【請求項２】 ＭＤＶは、鳥類に免疫能を引き出すため
のウイルスワクチンの製造に使用されるウイルスであ
る、請求項１に記載の細胞株。 - 【請求項３】 ＭＤＶは、血清型１、血清型２、または
血清型３ＭＤＶ（ここで、血清型３は七面鳥ヘルペスウ
イルス（ＨＶＴ）である）よりなる群から選択されるウ
イルスである、請求項１または２のいずれか１項に記載
の細胞株。 - 【請求項４】 ＭＤＶは、遺伝子操作により作成され、
ＭＤＶ内の１つまたはそれ以上の部位に挿入された１つ
またはそれ以上の外来遺伝子を含んでなる、請求項１ま
たは２のいずれか１項に記載の細胞株。 - 【請求項５】 ＭＤＶは、遺伝子操作により作成され、
ＭＤＶの１つまたはそれ以上の領域が欠失された、請求
項１または２のいずれか１項に記載の細胞株。 - 【請求項６】 ＭＤＶは、細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ １
２０５２で寄託された七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶ
Ｔ）株ＦＣ１２６−ＯＣＬ、および細胞株ＣＲＬ １２
０５３で寄託されたマレク病ウイルス（ＭＤＶ）株ＳＢ
１−ＯＣＬよりなる群から選択される、請求項１に記載
の細胞株。 - 【請求項７】 ＣＥＣはＣＨＣＣ−ＯＵ２である、請求
項１、２、または６のいずれか１項に記載の細胞株。 - 【請求項８】 ＭＤＶは、細胞ストレスまたはセセネン
ス（ｓｅｓｃｅｎｅｎｃｅ）により、溶菌感染するよう
に再活性化される、請求項１、２、または６のいずれか
１項に記載の細胞株。 - 【請求項９】 マレク病ウイルス（ＭＤＶ）に潜伏感染
した維持可能なニワトリ細胞株を、コンフルエンスでな
い単層培養物中で産生する方法であって： （ａ）ニワトリヘルパー因子が存在せず、ウイルスが存
在せず、化学的突然変異誘発物質で処理したニワトリ胚
細胞（ＣＥＣ）を、培地中でＭＤＶと合わせて、ＣＥＣ
をＭＤＶで感染させ； （ｂ）ＭＤＶが感染したＣＥＣを未感染ＣＥＣから精製
し、そして （ｃ）ＭＤＶが感染したＣＥＣを増殖させて単層培養物
中で細胞株を産生させ、ここでＭＤＶは細胞株中で非溶
菌または溶菌感染として維持され得る、ことを含んでな
る、上記方法。 - 【請求項１０】 ＭＤＶウイルスは、初代胚繊維芽細胞
から得られる細胞結合ＭＤＶウイルス、細胞のないＭＤ
Ｖ、およびＣＥＣにトランスフェクションされたＭＤＶ
ＤＮＡよりなる群から選択される、請求項９に記載の
方法。 - 【請求項１１】 ＭＤＶは、鳥類で免疫能を引き出すた
めのウイルスワクチンの製造に使用されるウイルスであ
る、請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１２】 ＭＤＶは、血清型１、血清型２、また
は血清型３ＭＤＶ（ここで、血清型３は七面鳥ヘルペス
ウイルス（ＨＶＴ）である）よりなる群から選択される
ウイルスである、請求項９または１０のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項１３】 ＭＤＶは、遺伝子操作により作成さ
れ、ＭＤＶ内の１つまたはそれ以上の部位に挿入された
１つまたはそれ以上の外来遺伝子を含んでなる、請求項
９または１０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】 ＭＤＶは、遺伝子操作により作成さ
れ、１つまたはそれ以上のＭＤＶ遺伝子が欠失された、
請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１５】 ＭＤＶは、細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１２０５２で寄託された七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶ
Ｔ）株ＦＣ１２６−ＯＣＬ、および細胞株ＣＲＬ １２
０５３で寄託されたマレク病ウイルス（ＭＤＶ）株ＳＢ
１−ＯＣＬよりなる群から選択される、請求項９または
１０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１６】 ＣＥＣ細胞はＣＨＣＣ−ＯＵ２であ
る、請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１７】 鳥をマレク病ウイルス（ＭＤＶ）によ
り感染させる方法であって： （ａ）ニワトリヘルパー因子（Ｃｈｆ）陰性であり、ウ
イルスが存在せず、化学的突然変異誘発物質で処理し次
にマレク病ウイルス（ＭＤＶ）で感染させたニワトリ胚
細胞（ＣＥＣ）から得られる、単層培養物として維持さ
れる、ＭＤＶに感染した維持可能なニワトリ細胞株によ
り産生されるワクチンを提供し、ここでＭＤＶは細胞株
中で非溶菌または溶菌感染として維持され、該細胞株は
インビボで鳥類に感染することができ、そして （ｂ）鳥にこのワクチンを接種する、ことを含んでな
る、上記方法。 - 【請求項１８】 接種は注射により、または卵に（ｉｎ
ｏｖｏ）行われる、請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 ＭＤＶは、免疫能を引き出すためのウ
イルスワクチンの製造に使用されるウイルスである、請
求項１７または１８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２０】 ＭＤＶは、血清型１、血清型２、また
は血清型３ＭＤＶ（ここで、血清型３は七面鳥ヘルペス
ウイルス（ＨＶＴ）である）よりなる群から選択される
ウイルスである、請求項１７または１８のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項２１】 ＭＤＶは、遺伝子操作により作成さ
れ、ＭＤＶ内の１つまたはそれ以上の部位に挿入された
１つまたはそれ以上の外来遺伝子を含んでなる、請求項
１７または１８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２２】 ＭＤＶは、遺伝子操作により作成さ
れ、ＭＤＶの１つまたはそれ以上の遺伝子が欠失され
た、請求項１７または１８のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項２３】 ＭＤＶは、細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１２０５２で寄託された七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶ
Ｔ）株ＦＣ１２６−ＯＣＬ、および細胞株ＣＲＬ １２
０５３で寄託されたマレク病ウイルス（ＭＤＶ）株ＳＢ
１−ＯＣＬよりなる群から選択される、請求項１７に記
載の方法。 - 【請求項２４】 細胞株は、ＣＨＣＣ−ＯＵ２であるＣ
ＥＣ繊維芽細胞を含有する、請求項１７、１８、または
２３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２５】 ワクチンは、細胞株を含有する、請求
項１７に記載の方法。 - 【請求項２６】 ニワトリヘルパー因子（Ｃｈｆ）陰性
であり、ウイルスが存在せず、化学的突然変異誘発物質
で処理し次にマレク病ウイルス（ＭＤＶ）で感染させた
ニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）から得られる、単層培養物と
して長時間維持される、ＭＤＶに感染した維持可能な繊
維芽細胞株を含有する、投薬単位型の鳥類ワクチンであ
って、ＭＤＶは細胞株中で非溶菌または溶菌感染として
維持され得る、上記鳥類ワクチン。 - 【請求項２７】 ＭＤＶは、鳥類に免疫能を引き出すた
めのウイルスワクチンの製造に使用されるウイルスであ
る、請求項２６に記載のワクチン。 - 【請求項２８】 ＭＤＶは、血清型１、血清型２、また
は血清型３ＭＤＶ（ここで、血清型３は七面鳥ヘルペス
ウイルス（ＨＶＴ）である）よりなる群から選択される
ウイルスである、請求項２６または２７のいずれか１項
に記載のワクチン。 - 【請求項２９】 ＭＤＶは、遺伝子操作により作成さ
れ、ＭＤＶ内の１つまたはそれ以上の部位に挿入された
１つまたはそれ以上の外来遺伝子を含んでなる、請求項
２６または２７のいずれか１項に記載のワクチン。 - 【請求項３０】 ＭＤＶは、遺伝子操作により作成さ
れ、ＭＤＶの１つまたはそれ以上の遺伝子が欠失され
た、請求項２６または２７のいずれか１項に記載のワク
チン。 - 【請求項３１】 ＭＤＶは、細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１２０５２で寄託された七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶ
Ｔ）株ＦＣ１２６−ＯＣＬ、および細胞株ＣＲＬ １２
０５３で寄託されたマレク病ウイルス（ＭＤＶ）株ＳＢ
１−ＯＣＬよりなる群から選択される、請求項２６に記
載のワクチン。 - 【請求項３２】 細胞株は、ＣＨＣＣ−ＯＵ２である繊
維芽細胞を含有する、請求項２６、２７、または３１の
いずれか１項に記載のワクチン。 - 【請求項３３】 マレク病七面鳥ヘルペスウイルス（Ｈ
ＶＴ）株ＦＣ１２６−ＯＣＬを含有する、ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ １２０５２として寄託された、不死化マレク病ヘ
ルペスウイルス細胞株。 - 【請求項３４】 マレク病（ＭＤＶ）血清型２株ＳＢ１
−ＯＣＬを含有する、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １２０５３と
して寄託された、不死化マレク病ヘルペスウイルス細胞
株。 - 【請求項３５】 ワクチンは、細胞株から得られるウイ
ルスを含有する、請求項１７に記載の方法。 - 【請求項３６】 ニワトリヘルパー因子（Ｃｈｆ）陰性
であり、非悪性であり、鳥類レトロウイルスのＤＮＡ配
列を含有し、細胞培養で継続的に増殖するニワトリ胚細
胞（ＣＥＣ）から得られる単層培養物中のマレク病ウイ
ルス（ＭＤＶ）に感染した維持可能なニワトリ細胞株。 - 【請求項３７】 ＭＤＶは、鳥類に免疫能を引き出すた
めのウイルスワクチンの製造に使用されるウイルスであ
る、請求項３６に記載の細胞株。 - 【請求項３８】 ＭＤＶは、遺伝子操作により作成さ
れ、ＭＤＶ内の１つまたはそれ以上の部位に挿入された
１つまたはそれ以上の外来遺伝子を含んでなる、請求項
３６または３７のいずれか１項に記載の細胞株。 - 【請求項３９】 ＭＤＶは、遺伝子操作により作成さ
れ、ＭＤＶの１つまたはそれ以上の領域が欠失された、
請求項３６または３７のいずれか１項に記載の細胞株。 - 【請求項４０】 ＣＥＣはＣＨＣＣ−ＯＵ２である、請
求項３６または３７のいずれか１項に記載の細胞株。 - 【請求項４１】 ＭＤＶは、細胞ストレスまたはセセネ
ンス（ｓｅｓｃｅｎｅｎｃｅ）により、溶菌感染するよ
うに再活性化することができる、請求項３６または３７
のいずれか１項に記載の細胞株。 - 【請求項４２】 ＭＤＶは、七面鳥ヘルペスウイルス
（ＨＶＴ）である、請求項２６に記載のワクチン。 - 【請求項４３】 ＭＤＶは、血清型２ＭＤＶである、請
求項２６に記載のワクチン。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US08/670,272 US5833980A (en) | 1995-10-27 | 1996-06-21 | Sustainable cell line for the production of the Marek's disease vaccines |
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| Publication Number | Publication Date |
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| JPH104956A true JPH104956A (ja) | 1998-01-13 |
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ID=24689728
Family Applications (1)
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| JP8345881A Pending JPH104956A (ja) | 1996-06-21 | 1996-12-25 | マレク病ワクチン製造のための維持可能な細胞株の改良 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2013116869A (ja) * | 2011-12-02 | 2013-06-13 | Vaxxinova Kk | 細胞内在ウイルスを主成分とする伝染性ファブリキウス嚢病生ワクチン |
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