JPS60231620A - 変性された生きている偽狂犬病ウイルス、それを含有する偽狂犬病ワクチン、それを生産する方法およびそれを使用する方法 - Google Patents

変性された生きている偽狂犬病ウイルス、それを含有する偽狂犬病ワクチン、それを生産する方法およびそれを使用する方法

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JPS60231620A
JPS60231620A JP59274980A JP27498084A JPS60231620A JP S60231620 A JPS60231620 A JP S60231620A JP 59274980 A JP59274980 A JP 59274980A JP 27498084 A JP27498084 A JP 27498084A JP S60231620 A JPS60231620 A JP S60231620A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、変性された生きている偽狂犬病ウィルス、そ
れを含有する偽狂犬病ワクチン、それを生産する方法お
よびそれを使用する方法に関する。
偽狂犬病、ブタおよび他の家畜類、例えば、ウシ、ヒツ
ジおよびヤギの高度に伝染性の病気、はヘルペスウィル
ス・スイス（Ｈｅｒ　ｅｓｖｉｒ■　５ｕｉｓ）（以後
「偽狂犬病ウィルス」またはｒＰＲＶＪと呼ぶ）により
引き起こされる。
ブタにおいて、この病気は死へ進行しうる呼吸の病およ
び脳炎を引き起こす、ブタにおける感染の他の共通の結
果は、流産、新生児の死、同席群のサイズの減少、およ
び成長速度の遅延である。他の家畜類において、最も顕
著には畜生において、ＰＲＹの感染は致死の脳炎に進行
することをほとんど避けることができない。
偽狂犬病は主要な脅威となり、そして世界を通じてブタ
の産業への経済的損失を引き起こした。
また、畜生および他の飼育場の動物に対する偽狂犬病の
広がりについてかなりの驚きが存在する。
最近１０年以内に、より悪性のＰＲＹの株の出現および
前記病気の広がった散在のため、経済的損失が増大した
。今日、１０年前の０．８％より小に比較して、米国に
おいて飼育場の８Ｘ１０’匹の食用豚の８．０％が感染
していると推定される。
ＰＲＹ感染の臨床的徴候および結果は、ＰＲＹの殺した
株または弱毒した株からなるワクチンの使用により減じ
あるいは防止することができるであろう。しかしながら
、現存するワクチンは、ＰＲＶおよび他のアルファヘル
ペスウィルス、例えば、ヘルペス単純ウィルスｌ型およ
び２型（以後、そえぞれｒＨ５Ｖ−ＩＪ　およびｒＨＳ
Ｖ−２］と呼ぶ）、水痘帯状庖疹、ウシの感染性リノト
ラデイチス（ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉＳ）ウィル
ス（以後、ｒＩＢＲＶＪと呼ぶ）、マーモセットのヘル
ペスウィルス（以後、ｒＭａｒＨＶＪ　と呼ぶ）、およ
びウマのヘルペスウィルス１型の独特の特徴のため、偽
狂犬病の広がりを抑制することはできなかった。
より詳しくは、アルファヘルペスウィルスは潜伏状態へ
入ることができる特別の能力を有する。
この潜伏状態は他の族のウィルスでは起こらない、すな
わち、動物が初期の分化していない（ｇｅｎｅｒａｌｉ
ｚｅｄ）感染から回復するとき。
アルファヘルペスウィルスは体の免疫防御に対して静止
性および不浸透性となる神経系の部分へ後退する。この
潜伏の感染、すなわち、潜伏期は予期せざることには再
活性化され、病気の再発または保菌状態として知られる
伝染状態を生ずることがあり、ここで感染された動物は
病気の外部の症候を示さないが、感染性アルファヘルペ
スウィルスを不連続的に伝搬しあるいは「発しく５ｈｅ
ｄ）」て、感染を広がらせる。
既知の・　された　きているウィルスＰＲＶのワクチン 従来の変性された生きているウィルスＰＲＹのワクチン
は、ニワトリおよび／またはサルの組織培養細胞中のウ
ィルスの多数の継代により生産されてきた（Ｓｋｏｄａ
、Ｒ，、Ｂｒａｕｎｅｒ　。
Ｔ　、、５ａｄｅｃｋｙ、Ｅ、、および　Ｍａｙｅｒ　
Ｖ、Ａｃｔａ　Ｖｉｒｏｌ、８　：　１−９（１９Ｂ４
）　および　Ｂａｒｔｈａ、Ａ、Ｍ１１１エ　Ａ１１ａ
ｔｏｒｖ、　ｌＡ上」」　↓６　：　４２−４５　（１
９６１）参照）。組織培養の継代の間、突然変異はウィ
ルスがその新しい環境に適合するとき蓄積する。これら
の特定されない突然変異は自然宿主中のウィルスの増殖
に悪影響を及ぼし、ウィルスの減衰を生ずる。
現在市販されている変性された生きているウィルスＰＲ
Ｖのワクチンを使用するときの問題は、動物が潜伏する
ワクチンのウィルスの保菌体となることである。結局、
これらのワクチンはそれらの安全性および有効性を妨害
する２つの望まｌ、　＜ない場合を生ずる。第１に、新
生児の流産、死産および致死の感染は、ライスルがワク
チン接種された保菌体により発せられるとき、あるワク
チンのウィルスにより引き起こされうる。第２に、ある
群内のワクチンのウィルスの反復循環は、ワクチンのウ
ィルスが病原性親株に復帰するように、減衰の過程の逆
転を生じうる。このような環境下に、広がったワクチン
接種は病気を散在を望ましくないように促進する。
前述の不適当性に加えて、既知のＰＲＹワクチンは、病
気の症候を実質的に最小とするが、病原性の場の菌株（
ｆｉｅｌｄ　５ｔｒａｉｎ）で潜伏感染を動物が獲得す
ることを防止しない、こうして、ワクチン接種にかかわ
らず、動物は病気の保菌体となり、ウィルスを感受性の
動物へ伝搬することがある。病気のこれらの保菌体は、
飼育場と市場との間を動くが、前述のような潜伏のワク
チンのウィルスばかりでなく、また病気のウィルスを発
する。これは地理学的障壁および国境を横切って病気の
望ましくない伝搬を生ずる。
アルファヘルペスウィルスの　のモード許容細胞が感染
すると、アルファヘルペスウィルスはウィルスのライフ
サ・イクルに対して重要なウィルス符合化酵素（ｖｉｒ
ｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ）の合成を誘発
する（Ｋｉｔ、Ｓ、Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。
ａｎｄ　Ｔｈｅｒａ　ｅｕｔｉｃｓ、Ｅｄ。
Ａ、Ｃ，５ａｔｏｒｅｌｌｉ；５ｐｅｃｉａｌｉｓｔ　
５ｕｂｊｅｃｔ、　Ｅｄ、　Ｄ、　Ｓｈｕｇａｒ　（Ｐ
ｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｔｄ、：０ｘｆｏｒｄ
）　Ｖｏｌ、４：５０１−５８５　（１９７９）参照）
。チミジンキナーゼ（以後「ＴＫ」）はアルファヘルペ
スウィルスのゲノムにより符合化された酵素、例えば、
Ｈ３Ｖ、ＩＢＲＶ、Ｍ　ａ　ｒ　ＨＶおよびＰＲＹ　（
Ｄｕ　ｂｂｓ、Ｄ、Ｒ，および　Ｋｉｔ、Ｓ、Ｖｉエユ
↓ユＪＪ　２’ヱ：　４９３−５０２　（１９６４）；
Ｋｉｔ　、Ｓ、、Ｌｅｕｎｇ、Ｗ、−Ｃ，。
Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ｇ、Ｎ、、Ｔｒｋｕｌａ、Ｄ、、
および　Ｄｕｂｂｓ、Ｄ、Ｒ，Ｐｒｏｇｒ、Ｍｅｄ、Ｖ
ｉｒｏｌ、２　１　：１３−３４　（１９７５）；Ｋｉ
ｃｉ、Ｓ、、およびＱａｖｉ、Ｈ，、Ｖｉｒｏｌｏ　１
３遼：　３８１−３８９　（１９８３）、および　Ｋｆ
ｄ、Ｓ、、Ｑａ’ｖｉ、Ｈ，、Ｄｕｂｂｓ、Ｉ）。
Ｒ８，および　０ｔｓｕｋａ、Ｈ，Ｊ、Ｍｅ３）参照）
。正常の組織培養条件下に、ＴＫはウィルスの増殖に必
須ではない。しかしながら、ＴＫは動物における感染の
病理学において重要な役割を演する。
ＴＫの機能はデオキシチミジンをデオキシチミジンモノ
ホスペード（以ｉ　ｒｄＴＭＰＪ　）へのホスホリル化
を触媒する。デオキシチミジンモノホスフェートは、順
次に、さらにｄＴＴＰ、すなわち、ＤＮＡの必須のピル
ディングブロックにホスホリル化される。ＴＫはまたＤ
ＮＡの他の必須のピルディングブロック、すなわち、ｄ
ｃＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰの合成を間接的の促進
する。アルファヘルペスウィルスは、これらのビルディ
ングブロックの不存在下にそれら自体増殖することはで
きない（Ｋｉｔ、Ｓ、、Ｌｅｕｎｇ、Ｗ、−Ｃ，、Ｊｏ
ｒｇｅｎｓｅｎ、Ｇ。
Ｎ、、Ｔｒｋｕｌａ、Ｄ、、および　Ｄｕｂｂｓ、Ｄ、
Ｒ，ｌ工」」ゴユ　Ｍｅｄ、Ｖｉ照）。
宿主のほとんどの組織は、十分な量の内生細胞ＴＫ、す
なわち、宿主のゲノムにより符合化されたＴＫを生成し
て、デオキシチミジンからｄＴＭＰおよびｄＴＴＰの合
成を可能とし、こうしてウィルスの増殖を可能とする。
しかしながら、非分割組織、例えば、神経組織はほんの
低いレベルの内生細胞ＴＫを生成し、こうして十分なウ
ィルスのＤＮＡの合成を支持するだけであり、こうして
ＴＫが感染性ウィルスにより提供されるとき、ウィルス
の増殖を支持するだけである。神経組織の感染の支持お
よび神経節における潜伏の感染の確立におけるウィルス
符合化ＴＫの重要な役割は、この酵素の誘発に欠ける（
以後ｒｔｋ−Ｊ）ＨＳＶ、ＭａｒＨＶおよびＰＲＹ突然
変異体の研究において立証された。
より詳しくは、ＨＳＶ　ｔｋ−突然変異体は、神経節に
おいて複製する能力あるいは潜伏の感染を確立する能力
が減少している（Ｆｉｅｌｄ。
Ｈ，Ｊ、および　Ｗｉｌｄｙ、Ｐ、Ｊ。
旦１」ユ、Ｃａｍｂ、８１：２６７−２７７（１９７８
）；Ｆｉｅｌｄ、Ｈ，、Ｊ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｊ、Ｒ
，および　Ｗｉｌｄｙ。
Ｐ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　５　９　：９１
−９９　（１９８２）；Ｋｌｅｉｎ、Ｒ。
Ｊ、、ＤｅＳｔｅｆａｎｏ、Ｅ、、Ｂｒａｄｙ。
Ｅ、、Ｂｒａｓｙ、Ｅ、、および　Ｆｒｉｅｄｍａｎ−
Ｋｉｅｎ、Ａ、　Ｅ、　Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、旦５
，２３７−２４６　（１９８０）；Ｐｒ１ｃｅ、Ｒ，Ｗ
、および　Ｋｈａｎ。
Ａ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、３４：５７１−５８０
　（１９８１）；および　Ｔｅｎ５ｅｒ、Ｒ，Ｂ、、Ｒ
ｅ５ｓｅｌ、Ｓ、、およびＤｕｎＳｔａｎ、Ｍ、Ｅ、Ｖ
土ｒｏユ１１１１ヱ：　３２８−３４１　（１９８１）
参照）。潜在の感染の時折の場合において、ＨＳＶ　ｔ
ｋ−突然変異体はウィルスの再現および発散（ｓｈｅｄ
ｄｉｎｇ）により検出されるように、再活性化すること
が困笛であった。さらに、動物が非常に大きい投与量の
ウィルスにより感染された後ウィルスが潜伏を確立しか
つウィルスが再活性化さるた場合にいて、発散されたウ
ィルスは非発病性、すなわち、無毒性にとどまった。ま
た、Ｈ３Ｖｔｋ−突然変異体が抹消神経を上昇して脳の
中へ入って脳炎を引き起こす能力は削減される。さらに
、脳内に注入されたＨＳＶ　ｔｋ−突然変異体は比較的
有毒ではない。
さらに、マウスはｔｋ”ウィルスについての致死投与量
よりも数ログ（ｌ　ｏ　ｇ）多い投与量の突然変英体Ｐ
ＲＶ　ｔｋ−または突然変異体ＭａｒＨＶ　ｔｋ−を安
全に接種することができる（Ｋｉｔ、Ｓ、、Ｑａｖｉ、
Ｍ、Ｄｕｂｂｓ、Ｄ。
Ｒ１および　０ｔｓｕｋａ、Ｈ，Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏ
ｌ、１２：２５−３６　（１９８３）；および　Ｔｅｎ
５ｅｒ、Ｒ，Ｂ、、Ｒｅ５ｓｅｌ、Ｓ、Ｊ、、Ｆｒａｌ
ｉｓｈ、Ｆ。
Ａ、　および　Ｊｏｎｅｓ、Ｊ、Ｃ，Ｊ。
Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６４：１３６９−１３７３　（１
９８３）参照）。
物ＬＬ！−ウィルス　１、′　体 多くのヌクレオシド類似体はアルファヘルペスウィルス
の複製を阻害することが示された。抗ウイルスヌクレオ
シドは、次のものを包含する：チミジンの類似体、例え
ば、５−ブロモデオキシウリジン、５−ヨードデオキシ
ウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、トリフルオ
ロデオキシチミジン、５−ブロモビニルデオキシウリジ
ンおよび５゛−アミノ−５−ヨードデオキシウリジン（
以後、それぞれｒＢｒｄＵｒｄ］、ｒＩｄＵｒｄ］、ｒ
ＦｄＵｒｄ］、ｒＦ３ｄＴｈｄ］、［ＢＶＤＵＪおよび
ｒＡＩｄＵｒｄ］）；デオキシシチジンの類似体、例え
ば、ヨードデオキシウジンおよびブロモデオキシシチジ
ン（以後、それぞれｒＩ　ｃＣｙｄＪおよびｒＢｒｄＣ
ｙｄＪ）；チミジンおよびデオキシシチジンのアテビノ
シル類似体、例えば、アルピノシルチミジン、２′−フ
ルオロー５−ヨードアラビノシルシトシンおよび２′−
フルオロ−５−メチル−アルピノシルウラシル（以後、
それぞれｒａｒａＴＪ、ｒＦＩＡＣ」およびｒＦＭＡＵ
Ｊ　）：およびグアニンのアシグロ誘導体、例えば、ア
シクログアノシンおよび９−１．３−ジヒドロキシ−２
−プロポキシメチルグアノシン（以後、それぞれｒＡｃ
Ｇ」およびｒＤＨＰＧＪ）　（Ｃｈｅｎｇ、Ｙ、−Ｃ，
、Ｄｕｔｓｃｈｍａｎ、Ｇ、、Ｆｏｘ、Ｊ、Ｊ、。
Ｗａｔａｎａｂｅ、に、Ａ、および　Ｍａｃｈｉｄａ、
Ｈ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、　Ａｌ見１ま」　Ｃｈｅｍ
ｏｔｈｅｒ、２０　：　４２０−４２３（１９８１）；
Ｅｌｉｏｎ　Ｇ。
Ｂ、、Ｆｕｒｍａｎ、Ｐ、Ａ、、Ｆｙｆｅ。
Ｊ、Ａ、、Ｄｅｍｉｒａｎｄａ、Ｐ、、Ｂｅａｕｃｈａ
ｍｐ、Ｌ、、および　５ｃｈａｅｆｆｅｒ、Ｈ，Ｊ、Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａ　ｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　７４：
５７１５−５７２０　（１９７７）：Ｐｒｕｓｏｆｆ、
Ｗ。
Ｅ、、Ｃｈｅｎ、Ｍ、Ｓ、、Ｌｉｎ、Ｔ、−５，、およ
び　Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｐ、Ｈ，ＩＥｄ、　Ｋ、　Ｋ、　
Ｇａｕｒｉ、　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎ
ｃ、：　ＮｅｗＹｏｒｋ）、ｐｐ、１９７−２０６　（
１９８１）：　および　ｖｅｅｒｉｓｅｔｔｙ、■、お
よびＧｅｎｔｒｙ、Ｇ、　Ａ、　Ｊ、　Ｖｉｒ。
上２　４６　：　９０　１−９０８　（１９８３）　参
照）。
前述のヌクレオシド類似体はそれらの活性において異る
０例えば、Ｈ５Ｖ−１の複製を阻害するために必要なり
ＶＤＵおよびＡＣＧの濃度はＨ３Ｖ−２の複製を阻害す
るために必要な濃度よりも有意に低い。さらに、ＦＩＡ
Ｃ，ＡＣＧおよびＤＨＰＧはＨ３Ｖ−１おＪ：びＨ３Ｖ
−２の両者に対して有用な薬物であるが、ＰＲＹおよび
Ｉ　ＢＲＶに対して無効である。
これらの薬物がアルファヘルペスウィルスの複製を阻害
する機構は変る。しかしながら、ヌクレオシド類似体の
すべては、それらが抗ウィルス作用を及ぼすことができ
る前に、ヌクレオシドトリホスフェートに活性化しなく
てはならない、この活性化における第１工程は、再利用
経路（ｓａｌｖａｇｅ　ｐａｔｈｗａｙ）酵素、ＴＫ（
７）触媒作用を必要とする。ＴＫ活性の不存在において
、これらの抗ウイルス薬物のほとんどは阻害性ではない
。
前述のように、内生細胞ＴＫはデオキシチミジンのｄＴ
ＭＰへのホスホリル化を触媒する。内生側１１ｉｊＴＫ
は、また、デオキシウリジンのデオキシウリジンモノホ
スフェート（以後、ｒｄＵＭＰ」）、すなわち、ｄＴＭ
Ｐの前駆物質、へのホスホリル化を触媒する。さらに、
内生細胞ＴＫはいくつかのヌクレオシド、すなわち、Ｂ
ｒｄＵｒｄ、Ｉ　ｄＵｒｄ、ＦｄＵｒｄ、Ｆ、ｄＴｈｄ
のホスホリル化を触媒する。こうして、これらの類似体
は細胞毒性ならびに抗ウィルス活性を有する。
他方において、ａｒａＴ、ＢＶＤＵ、ＦＩＡＣｌＡＣＧ
およびＤＨＰＧは内生細胞ＴＫのための尖った基質であ
る。すなわち、これらの類似体はウィルスの複製を阻害
するが、細胞の複製を阻害しない。
Ｈ５Ｖ符合化（ｅｎｃｏｄｅ、ｄ）ＴＫはその広い基質
特異性について類似する。すなわち、Ｈ３Ｖ符合化ＴＫ
は、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンおよびそ
れらの類似体：デオキシチミジンおよびデオキシシチジ
ンのアラビノシル誘導体、例えば、ＦＭＡＵそしてＦＩ
ＡＣ；ＡＣＧおよびＤＨＰＧのホスホリル化を効率よく
触媒する。
ＰＲＹ符合化ＴＫはＨ３Ｖ符合化ＴＫと多くの生化学的
性質において類似するが、ＨＳＶ符合化ＴＫと抗原決定
基および基質特異性において異る（Ｋｉｔ、Ｓ、、Ｌｕ
ｎｇ、Ｗ、　−Ｇ、、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ｇ、Ｎ、、
Ｔｒｋｕｌａ。
Ｄ、、および　Ｄｕｂｂｓ、Ｄ、Ｒ，Ｐｒ。
ｌエエ　Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、２１：１３−３２　（１
９７５）；および　Ｋｉｔ、Ｓ、Ｉｎ：　Ｐｈａｍａｃ
ｏユニＪ」ａ　ｎ　ｄ　Ｔ　ｈ　ｅ　ｒａ　ｅｕｔｉｃ
ｓ、Ｅｄ、Ａ、Ｃ，５ａｒｔｏｒｅｌｌｉ；　５ｐｅｃ
ｉａｌｉｓｔ　５ｕｂｊｅｃｔ　Ｅｄ、Ｓｈｕｇａｒ、
　（Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｔｄ、：　０ｘ
ｆｏｒｄ）、ｖｏｌ、４：５０１−５８５　（１９７９
）参照）。すなわち、ＰＲＶ符合化ＴＫは、デオキシチ
ミジン類似体、例えば、ＢｒｄＵｒｄ、Ｆ、ｄＴｈｄ；
およびａｒａＴｃ７）ホスボリル化を触媒するが、デオ
キシシチジンおよびその類似体；またはＡＣＧおよびＤ
ＨＰＧを効率よくホスホリル化しない。
抗ウイルス薬物がデオキシリポヌクレオシドトリホスフ
ェートに活性化された後、各々はアルファヘルペスウィ
ルス感染細胞内で異るように代謝される。ＢｒｄＵｒｄ
、ＩｄＵｒｄおよびＢＹｄＵはウィルスのＤＮＡ中にデ
オキシチミジンの代わりに広範に組み込まれる（Ａｌｌ
ａｕｄｅｅｎ、Ｈ，Ｓ、、Ｃｈｅｎ、Ｍ、Ｓ、、Ｌｅｅ
、Ｊ、Ｊ、、Ｄｅ　Ｃ１ｅｒｃｑ、Ｅ、。
および　Ｐｒｕｓｏｆｆ、Ｗ、Ｈ，Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、２５７：６０３−６０６（１９８２）；Ｄｅ　Ｃ
１ｅｒｃｑ、Ｅ、Ａｒｃｈ、Ｉｎｔ、Ｐｈ　５ｉｏ１．
　Ｂｉｏｃｈｉｍ、８７：３５３−３９５　（１９７９
）；Ｌａｒｓｓｏｎ、Ａ、および　Ｏｂｅｒｇ。
Ｂ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、ムｌ！工工」Ｃｈｅｍｏｔ
ｈｅｒ、上９：９２７−９２９（１９８１）；　Ｐｒｕ
ｓｏｆｆ、Ｗ、Ｅ、。
Ｃｈｅｎ、Ｍ、Ｓ、Ｌｉｎ、Ｔ、　−５，、および　Ｆ
ｉｓｃｈｅｒ、Ｐ、Ｈ，Ｉｎ：　Ａｄ、　Ｋ、　Ｋ、　
Ｇａｕｒｆ、　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎ
ｃ、：　Ｎｅｗ　Ｙ。
ｒｋ）、ｐｐ、　１９７−２０６（１９８１）；および
　Ｓｉｍ、１．　Ｓ、、ＧｏｏｄｃｈｉＩｄ、Ｊ、、Ｍ
ｅｒｅｄｉｔｈ、Ｄ、　Ｍ、　Ｐｏｒｔｅｒ、Ｒ，Ａ、
、　Ｒｕｐｅｒ、　Ｒ。
Ｈ，、Ｖｉｎｅｙ、Ｊ、、および　Ｗ　ａ　ｄ　ｓｗｏ
ｒｔｈ、Ｈ，Ｊ、　Ａｎｔｉｍｔｃｒ。
ｂ、　八」Ｌｌ」ＬＬＪ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、　２旦
：　４１６−４２１　（１９８３）参照）。この組み込
みはウィルスのゲノムを不安定化し、後にその転写およ
び翻訳を不安定化することがある。ＢｒｄＵｒｄ、Ｉｄ
ＵｒｄおよびＢＶＤＵのトリホスフェートは、また、デ
オキシリポヌクレオシドトリホスフェートのプールを徹
底的に変更する。
トリホスフェートのプールにおいて得られる不均衡は突
然変異の頻度を増大しおよび／またはＤＮＡの生合成の
他の鍵酵素、すなわち、リボヌクレオシドジホスフェー
トリダクダーゼを阻害することがある（Ｎａｋｙａｍａ
、に、、Ｒｕｔｈ。
Ｊ、Ｌ、、および　Ｃｈｅｎｇ、Ｙ、−Ｃ。
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４３：３２５−３２７（１９８２）参
照）。
多くの類似体、例えば、ａｒａＴ、ＦＭＡＵおよびＦＩ
ＡＣのトリホスフェートは、アルファヘルペスウィルス
ＤＮＡポリメラーゼにより優先的に結合され、そしてＤ
ＮＡ合成における自然トリホスフェートの利用を拮抗的
に阻害する（Ｒｕｔｈ、Ｊ、Ｌ、および　Ｃｈｅｎｇ、
Ｙ、−Ｃ，Ｍｏ１．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２０＋４１
５−５２２　（１９８１）参照）。それらは、また、非
解離性錯体を形成するアルファヘルペスウィルスＤＮＡ
ポリメラーゼへ結合することができる。
ＡＣＧのトリホスフェートはＨ５Ｖ感染細胞中のＤＮＡ
合成に選択的に利用されるが、薬物が３′−ヒドロキシ
基を欠くため、ＤＮＡ鎖を停止する。ａ　ｒ　ａＴ、Ｆ
ＭＡＵおよびＦＩＡＣはＨ３ＶのＤＮＡ合成を選択的に
阻害するが、複製するＤＮＡ鎖中に有意に組み込まれな
い。
ヌクレオシド類似体の抗ウイルス効果を回避するために
、アルファヘルペスウィルスは薬物抵抗性に突然変異す
る。薬物抵抗性突然変異体は、すべての反復するアルフ
ァヘルペスウィルス集団中に約１０−３〜１０−５の発
生率で、ＤＮＡの反復機構の不完全性のために生ずる。
薬物抵抗性アルファヘルペスウィルス突然変異体の３つ
の型、すなわち、次のものをもつアルファヘルペスウィ
ルスが検出された：　（１）ウィルスのｔｋ遺伝子にお
ける突然変異；　（２）ウィルスのＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子における突然変異；および（３）両者の遺伝子に
おける突然変異。
ウィルスのＴＫおよびウィルスのＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子における突然変異は、追加の部類に再分割すること
ができる。すなわち、ウィルスのＴＫおよびウィルスの
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の突然変異のあるものは活性
を完全に損失させるが、他のものは活性を部分的にのみ
損失させるか、あるいはそれらの基質を認識する突然変
異体酵素の能力を選択的に減少させるだけである（Ｖｅ
ｅｒｉｓｅｔｔｙ、Ｖ−および　Ｇｅｎｔｒｙ、Ｇ、Ａ
、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４６：９０１−９０８　（１９８３
）；Ｌａｒｄｅｒ、Ｂ。
Ａ、、Ｄｅｒｓｅ、Ｄ、、Ｃｈｅｎｇ、Ｙ、−Ｃ１，お
よび　Ｄａｒｂｙ、Ｇ、Ｊ、Ｂｉ。
上、Ｃｈｅｍ、２５９：２０２７−２０３３（１９８３
）：Ｒｕｔｈ、Ｊ、Ｌ、＄よびＣｈｅｎｇ、Ｙ、−Ｃ，
Ｍｏ１．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１副：４１５−５２２
　（１９８１）；および　Ｓｉｍ、１．　Ｓ、、Ｇｏｏ
ｄｃｈｉｌｄ、Ｊ、、Ｍｅｒｅｄｉｔｈ、Ｄ、Ｍ、、Ｐ
。
ｒｔｅｒ、Ｒ，Ａ、　Ｒｕｐｅｒ、Ｒ。
Ｈ，、Ｖｉｎｅｙ、Ｊ、、および　Ｗ　ａ　ｄ　ｓ　ｗ
　。
ｒｔｈ、Ｈ，Ｊ、　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ。
Ａ　ｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、　２３：４１６−
４２１　（１９８３）参照）。
薬物抵抗性を発現する最も有効な機構は、ウィルスのＴ
Ｋ活性の表現を排除することである（Ｄｕｂｂｓ、Ｄ、
Ｒ，および　Ｋｉｔ、Ｓ；Ｌ１工土↓」」」　１ヱ：２
１４−２２５　（１９６４）；および　Ｄｕｂｂｓ、Ｄ
、Ｒ，および　Ｋｉｔ、Ｓ、　Ｖｉｒｏｌｏ　２２：４
９３−５０２　（１９６４）参照）。すなわち、機能的
ＴＫポリペプチドを合成することができないアルファヘ
ルペスウィルス突然変異体は、ウィルスのＤＮＡポリメ
ラーゼが変更されるか否かに無関係に、ヌクレオシド類
似体を毒性の代謝物にホスホリル化することができない
。それにもかかわらず、これらの突然変異体は正常の組
織培養条件下に増殖させることができない。こうして、
ヌクレオシド類似体の存在下のアルファヘルペスウィル
スの培養は、ＴＫ活性に欠ける自発的なおよび誘発され
た突然変異体の選択および強化（ｅｎｒｉ　ｃ　ｈｍｅ
　ｎ　ｔ）を８午容しない。
ＴＫ活性に欠けるウィルスのＴＫ突然変異体のいくつか
の異る型は既知である。これらの突然変異体のあるもの
は、無傷であるが、非機能的なＴＫの合成を誘発する。
これらの突然変異体は、ポリペプチドの折りたたみ（ｆ
ｏｌｄｉｎｇ）を変更する酵素または突然変異、すなわ
ち、温度感受性のＴＫ、の活性中心に変化したアミノ酸
を有する。他の突然変異体、例えば、Ｈ３Ｖ−１（Ｂ２
００６）は、多分ポリペプチドのアミノ末端付近のコド
ンにナンセンス突然変異の結果、ＴＫＯ生産を誘発する
ことができない。なお、他の突然変異体は、ｔｋ遺伝子
の中央におけるナンセンス突然変異の結果、不活性の短
いポリペプチドを誘発する。この型の突然変異は、部分
的ＴＫの活性が回復されうるので、「サプレッサーｔ　
ＲＮＡ　ｓＪで「抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）Ｊされうる
。最後に、ＴＫ活性をもたない突然変異体はｔｋ遺伝子
の解読区域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）内のヌクレ
オチドの欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）から生ずる。
）（ＳＶ　ｔｋ−またはワクシニアｔｋ−を得るために
従来使用されて第１手順は、ＢｒｄＵｒｄを含有する生
長培地におけるいくつかの継代のために、ｔｋ−マウス
線維芽細胞、すなわち、ＬＭ（ＴＫ−）細胞中において
ＨＳＶ−１またはワクシニアのウィルスの増殖１次いで
ＢｒｄＵｒｄを含有する培地中の子孫のウィルスのプラ
ーク精製を必然的に伴なった（Ｄｕｂｂｓ、Ｄ、Ｒ。
および　Ｋｉｔ、Ｓ、Ｖｉｒｏ−Ｌ１１］　２２２１４
−２２５　（１９６４）；Ｄｕｂｂｓ。
Ｄ、Ｒ，および　Ｋｉｔ、Ｓ、Ｖｉｒｏｌヨげ　■：４
９３−５０２（１９６４）、および　Ｋｉｄ、Ｓ、およ
び　Ｄｕｂｂｓ、Ｄ。
Ｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ。
Ｃｏｍｍｕｎ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１旦：　
５００−５０４　（１９６３）参照）。ＨＳＶ−２（株
３３３）、ＰＲＶ　（株Ａｕｊｅｓｚｋｙ）およびＭａ
ｒＨＶ（株Ｆａｌｋ）のｔｋ−突然変異体も同様な手順
により後に単離された（Ｋｉｔ、Ｓ、、Ｌｅｕｎｇ、Ｗ
、−Ｃ，、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ｇ、Ｎ、、Ｔｒｋｕｌ
ａ、Ｄ、。
および　Ｄｕｂｂｓ、Ｄ、Ｒ，Ｐｒｏ　ｒ。
Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、２１　：１３−３４（１９７５）
参照）。
ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＰＲＶおよびＩＢＲ■のｔｋ
−突然変異体は、また、宿主としてｔｋ＋組織培養細胞
および、選択のため、非細胞毒性薬物、例えば、ａｒａ
Ｔ、ＢＶＤＵおよびＡＣＧを使用することにより得られ
た（ＢｅｎＰｏｒａｔ、Ｔ、、Ｖｅａｃｈ、Ｒ，Ａ、、
およびＩｈａｒａ、Ｓ、Ｖｉｒｏ↓工ＩＪｌ　２７　：
１９４−２０４（１９８３）；Ｆｉｅｌｄ、Ｈ。
Ｊ、、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｊ、Ｒ，、および　Ｗｉｌｄ
ｙ、Ｐ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｌ↓、　４９：９ｌ
−９９（１９８２）；Ｆｉｅｌｃｌ、Ｈ，Ｊ、および　
Ｎｅｄｅｎ、Ｊ　。
Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｓ、　２：２４３−２５４　
（１９８２）　；Ｇｏｒｄｏｎ、Ｙ、、Ｇｆ　１ｄｅｎ
、Ｄ、　Ｈ，、Ｓｈｔｒａｍ、Ｙ’、　Ａｓｈｅｒ、Ｔ
、、　Ｔａｂｏｒ、Ｅ、、Ｗｅｌｌｉｓｈ、Ｍ、、Ｄｅ
ｖｌｉｎ、Ｍ、、５ｎｉｐｐｅｒ、Ｄ、、Ｈａｄａｒ、
Ｊ、、および　Ｂｅｃｋｅｒ、Ｙ、　Ａｒｃｈ、　Ｖｉ
ｒｏｌ、　７６：３９−４９　（１９８３）　；Ｋｅｉ
ｎ、Ｒ，Ｊ　。
Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、　７２：１４３−１６８　（
１９８２）　；Ｌａｒｄｅｒ、Ｂ、　Ａ、。
Ｄｅｒｓｅ、Ｄ、、Ｃｈｅｎｇ、Ｙ、−Ｃ，、および　
Ｄａｒｂｙ、Ｇ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５８：
２０２７−２０３３　（１９８３）　；Ｔｅｎ５ｅｒ、
Ｒ，Ｂ、、Ｒｅ５ｓｅ１、Ｓ、、および　Ｄｕｎｓｔａ
ｎ、Ｍ、Ｅ。
￥」−工」ＬＬ」−Ｌｌ　１　１　３　：　３２８−３
４１（１９８１）；および　Ｗｅ　ｉ　ｎｍａｓｔ　ｅ
　ｒ　、−Ｇ、、Ａ、、Ｍｉｓｒａ、Ｖ、、ＭｃＧｕｉ
ｒｅ、Ｒ，、Ｂａｂｉｕｋ、Ｌ、Ａ、、およびＤｅ　Ｃ
ｌｅｒｃｇ、Ｅ、、Ｖｉｒｏｌ。
１１８：１９１−２０１　（１９８２）参照）。
高度に減衰することは別として、ＨＳＶ−１、）（ＳＶ
−２およびＭａｒＨＶｃ７）ｔｋ−突然変異体は有効な
ワクチンとして機能する。これらのｔｋ−ウィルスの突
然変異体を接種した動物は、致死量のｔｋ＋ウィルスを
用いる対抗（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に抵抗する（Ｆｉｅ
ｌｄ、Ｈ，Ｊ。
および　Ｗ　ｉ　ｌ　ｄ　Ｖ　、　Ｐ　、ム　ＬロＬユ
Ｃａｍｂ、８１：２６７−２７７（１９７８）；Ｋｌｅ
ｉｎ、Ｒ，Ｊ、Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、７ヱ：１４３−
１６８　（１９８２）；および　Ｋｉｔ　、Ｓ、、Ｑａ
ｖｉ　、Ｈ，、Ｄｕｂｂｓ、Ｄ、Ｒ１および　Ｏｔ　５
ｕｋａ。
Ｈ，Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ　１２：２５−３６　（１
９８３）参照）。さらに、Ｈ５Ｖｉ、：っいて、ｔｋ−
ウィルスを接種した動物は、ｔｋ”ウィルスで対抗した
とき、潜伏的感染を発現する傾向が少ないことが証明さ
れた。
これまで単離されてきたアルファヘルペスウィルスｔｋ
−薬物誘発突然変異体の多くは、それらをワクチンとし
て不適当とさせる２つの欠点を有する。第１に、部分的
ＴＫ活性をもつ突然変異体は有毒である（Ｇｏｒｄｏｎ
、Ｙ、、Ｇｉ　１ｄｅｎ、Ｄ、Ｈ，、Ｓｈｔｒａｍ、Ｙ
、、Ａｓｈｅｒ、Ｙ、、Ｔａｂｏｒ、Ｅ、、Ｗｅｌｌｉ
ｓｈ。
Ｍ、、Ｄｅｖｌｉｎ、Ｍ、、５ｎｉｐｐｅｒ。
Ｄ、、Ｈａｄａｒ、Ｊ、、および　Ｂｅｃｋｅｒ、Ｙ、
Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、７６：３９−４９　（１９８３
）；Ｋｌｅｉｎ　Ｒ，Ｊ　。
Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、７ヱ：１４３−１６８　（１９
８２）；および　Ｔｅｎ５ｅｒ、Ｒ。
Ｂ、、Ｒｅ５ｓｅｌ、Ｓ、および　Ｄｕｎｓｔａｎ、Ｍ
、Ｅ、Ｖｉｒｏｌｏ　上↓」：　３２８−３４１　（１
９８１）参照）、第２に、ｔｋ−突然変異体のあるもの
の作業プール（ＷＯｒｋｉｎｇ　ｐｏｏｌ）は、１０−
３〜１０−５の頻度で自然ｔｋ＋復帰異性体（ｒｅｖｅ
ｒｔａｎｔ）を含有しうる。次いで、これらのｔｋ＋復
帰異性体は、ｔｋ−突然変異体よりも生体内反復につい
て選択的利点を有する。はとんどの薬物誘発ｔｋ−ウィ
ルスの突然変異体は復帰する潜在的能力を有するが、復
帰（ｒｅｖｅ　ｒｓ　ｉ　ｏ　ｎ）の頻度は自然復帰の
頻度より低く、−すなわち、約１０−５〜１０−７程度
である（Ｃａｍｐｉｏｎｅ−Ｐｉｃｃａｒｄ、Ｊ、、Ｒ
ａｗｌｓ、Ｗ。
Ｅ、、および　Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ、Ｓ、Ｊ。
Ｖｉｒｏｌ、’３１：２８１−２８７（１９７９）参照
）。
ｔｋ遺伝子中に欠失をもつｔｋ−ウィルスは、ｔｋ＋に
復帰することができないので、ヌクレオ羊ド変更（ｃｈ
ａｎｇｅ）のみを含有するｔｋ−突然変異体よりも優れ
る。
ｔｋ遺伝子の解読区域において欠失を含有する組み換え
ＨＳＶ−１ｔｋ−またはＭ　ａ　ｒ　ＨＶｔｋ−を構成
する方法は既知である（Ｓ　ｉ　ｍ　１　ｅｙ、Ｊ、Ｒ
，Ｎａｔｕｒｅ　３８５：３３３−３３５　（１９８０
）；Ｐｏ５ｔ　、Ｌ、Ｅ、。
Ｍａｃｋｅｍ、Ｓ、、Ｒｏｉｚｍａｎ、Ｂ、Ｃｅ　１１
　２４　：　５５５−５６５）；および　Ｋｉｔ、Ｓ、
、Ｑａｖｉ、Ｈ，、Ｄｕｂｂｓ、Ｄ。
Ｒｏ、および　０ｔｓｕｋａ、Ｈ，Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒ
ｏｌ、↓２　：　２５−３６　（１９８３）参照）。こ
れらの欠失突然変異体は、対応するウィルスのｔｋ遺伝
子中に欠失されたヌクレオチド配列を含有するＨＳＶ−
１ｔｋ＋またはＭａｒＨＶ　ｔｋ＋および交雑プラスミ
ドの感染性ＤＮＡを同時トランスフェクションする（Ｃ
Ｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）ことにより得られる。
得られる組み換えウィルスは、ｔｋ−ウィルスを選択す
る薬物、例えば、ａｒａＴ、ＢｒｄＵｒｄおよびＢｒｄ
Ｃｙｄを含有する培地中でウィルスの収穫物（ｈａｒｖ
ｅｓｔ）をプラーキング（ｐｌａｑｕｉｎｇ）した後、
単離する。ｔｋ−欠失ウィルスは、例えば、それらのＤ
ＮＡを制限ヌクレアーゼで分析することにより、適当な
プローブを用いる分子の交雑化の研究により、および組
み換えウィルス感染細胞からの抽出についてのＴＫ検定
により、認識される。
アルファヘルペスウィルスのｔｋ−欠失突然変異体を構
成する前述の方法において、ｔｋ＋ウィルスのＤＮＡお
よび交雑プラスミドのＤＮＡで細胞を最初に同時トラス
フェクションすることから得られた子孫は、ウィルスの
混合物から成る。子孫の大部分は親のｔｋ＋ウィルスで
あり、そして集団の非常に小部分、すなわち、約１０−
３〜１０−’、は組み換えｔｋ−ウィルスから成る。
ｔｋ−ウィルスを単離するためには、大過剰のｔｋ＋ウ
ィルスにもかかわらず、ｔｋ−ウィルスの複製を可能と
すると同時にｔｋ＋ウィルスの複製を阻止する選択的手
順が必要である。選択条件がきわめて有効である場合、
すなわち、ｔｋ−ウィルスの反復の関連する阻止または
ｔｋ＋ウィルスの顕著な生長が存在しない場合、ｔｋ−
ウィルスは単一の工程において選択することができる。
しかしながら、選択条件が部分的にのみ有効である場合
、多数の選択工程はそれらが集団の有意の分画を表わす
までｔｋ−ウィルスを濃縮するために必要である。
ＨＳ　Ｖ　−１ニー’）イテ、ＨＳＶ−１ｔｋ”による
プラークの形成を防止するためにＢｒｄＵｒｄ、ａｒａ
ＴまたはＢｒＣｙｄを使用して効率よい選択が可能であ
る。すなわち、ＨＳＶ−１ｔｋ＋およびＨＳＶ−１ｔｋ
−の混合物のプラーク滴定（ｐｌａｑｕｅ　ｔｉｔｒａ
ｔｉｏｎ）を、これらの薬物を含有する培地中で実施す
るとき、約１０”　〜１０’（７）ＨＳＶ−１ｔｋ”の
中から１つのＨＳＶ−１ｔｋ−を同定しかつ単離するこ
とができる。得られるＨＳＶ−１ｔｋ−のプラークは大
きく、良好に定められ、モしてＨＳＶ・−１ｔｋ＋ウィ
ルスの汚染は最小である。
しかしながら、大量のＰＲＹ　ｔｋ”を含有する混合物
からＰＲＶ　ｔｋ−突然変異体を単離するために有効で
はない。なぜなら、ＢｒｄＵｒｄおよびａｒａＴＰＲＶ
　ｔｋ＋プラークの大きさおよび数を部分的にのみ減少
するだけであるからである。さらに、ＢｒｄＣｙｄはＰ
ＲＹでは無効である。
Ｈ５’Ｖ−１の応答およびＰＲＹの応答との間の差は、
ＰＲＶおよび）！５Ｖ−１符合化酵素、すなわち、ＴＫ
、ＤＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオシドジホスフ
ェートリダクターゼの性質の不類似；前記２種のウィル
スにより感染された細胞のデオキシリポヌクレオシドト
リホスフェートのプールの組成の差；および多分ＰＲＶ
およびＨＳＶＭ導ヌクレアーゼがウィルス合成のために
細胞ｃ７）ＤＮＡを分解（ｄ　ｅ　ｇ　ｒ　ａ　ｄ　ｅ
）　Ｌがっそれを利用する能力の差に帰することができ
る。こうして、ＰＲＶの場合において、強化（ｅｎｒｉ
ｃｈｍｅ　ｎ　ｔ）工程はプラーク滴定における末端希
釈（ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ）のおいて候
補のプラークを単離する前に、ＰＲＹ　ｔｋ−の集団を
増加することを必要とする。このような強化工程の使用
および開発の必要性は、本発明の以前において知られて
いなかった。
要約すると、前述の方法は異質のＤＮＡ配列の欠失をＨ
ＳＶ−１組み換え体のｔｋ遺遺伝子軸導入するために適
切であるが、欠失を）ＩＳＶ−１組み換え体のｔｋ遺遺
伝子軸導入する仕方を、次の理由で、教示または示唆し
ていない：　（１）ＰＲＶ　ｔｋｋ伝子の解読領域を限
界決定するヌクレオシド配列の大体の境界は従来決定さ
れていない；　（２）適切な欠失をクローンニングされ
たＰＲＶ　ｔｋ遺遺伝子軸作ることを許すＰＲＶ　ｔｋ
遺遺伝円内制限部位についての教示が存在しない：およ
び（３）曲の老容ｉ、たように　）（ＳＶ−１とともに
使用する薬物はＰＲＶについて不適当であるので、修正
された強化および選択の手順を開発しなくてはならない
。結局、既知の手順をＰＲＶ　ｔｋ遺遺伝子軸欠失突然
変異体の単離に使用するための情報は不十分であるばか
りでなく、かつまた既知の手順はＰＲＶ系に有効に働か
ない。
したがって、本発明の目的は、偽狂犬病の広がりを抑制
するために有効な偽狂犬病ワクチンを提供することであ
る。
本発明の本発明の目的は、偽狂犬病ワクチンを接種され
た動物がワクチンのウィルスの保菌体になり難い偽狂犬
病ワクチンを提供することである。
本発明のほかの目的は、偽狂犬病ワクチンを接種された
動物が病原性の場の菌株（ｆｉｅｌｄｓｔｒａｉｎ）の
菌株による潜伏の感染を獲得し難い偽狂犬病ワクチンを
提供することである。
本発明のなおほかの目的は、ワクチンのウイルスが機能
的（ｆｕｎｃｔ　１ｏｎａｌ）ＴＫを生成することがで
きない偽狂犬病ワクチンを提供することである。
本発明のさらになおほかの目的は、ワクチンのウィルス
が低い、すなわち、自然の、復帰頻度を有する偽狂犬病
ウィルスの高度に減衰した（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）突
然変異原誘発ｔｋ−□突然変異体である偽狂犬病ワクチ
ンを提供することである。
本発明の追加の目的は、ワクチンのウィルスがｔｋ＋に
復帰することができない偽狂犬病ウィルスのｔｋ−欠失
突然変異体でありかつｔｋ＋ウィルスから容易に単離さ
れる偽狂犬病ワクチンを提供することである。
本発明の他の目的は、低い、すなわち、自然の、復帰頻
度を有する高度に減衰した突然変異原誘発ｔｋ−偽狂犬
病ウイルスを生産しかつ使用する方法を提供することで
ある。
本発明のほかの目的は、ｔｋ＋に復帰しない偽狂犬病ウ
ィルスのｔｋ−欠失突然変異体を生産しかつ使用する方
法を提供することである。
ＴＫを生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウィ
ルス、および（１）製薬学的に有効量の前記ウィルス、
および（２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤
からなる偽狂犬病のための変性された生きているウィル
スのワクチンにより達成された。
本発明のほかの実施態様において、前述の目的は、（１
）温度感受性ウィルスのための許容温度においてｔｋ−
宿主細胞中でＰＲＶ　ｔｋ十株をプラーク精製（ｐｌａ
ｑｕｅ−ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ）Ｌ；　（２）工程（１）
の得られるウィルスをｔｋ−宿主細胞中で突然変異原の
存在下に温度感受性ウィルスのための許容温度において
２〜５回増殖させ；　（３）工程（２）の得られるウィ
ルスをｔｋ＋宿主細胞中で突然変異原の存在下に温度感
受性ウィルスのための非許容温度において増殖させ；　
（４）工程（３）の得られるウィルスをｔｋ＋宿主細胞
中で突然変異原の存在下に温度感受性ウィルスのための
許容温度において増殖させ；（５）工程（４）の得られ
るウィルスをｔｋ＋宿主細胞中で選択剤（ｓｅｌｅｃｔ
ｉｖｅ　ａｇｅｎｔ）の存在下に温度感受性ウィルスの
ための許容温度において増殖させ；そして（６）工程（
５）の得られるウィルスをｔｋ＋宿主細胞中で突然変異
原の存在下に温度感受性ウィルスのための許容温度にお
いて増殖させて、温度抵抗性ＰＲＶ　ｔｋ−突然変異原
誘発突然変異体を生産する、ことからなる、突然変異原
誘発突然変異の結果として機能的ＴＫを生産することが
できない温度抵抗性偽狂犬病ウィルスを生産する方法に
よって、達成された。
本発明のほかの実施態様において、前述の目的は、ｔｋ
遺伝子の欠失の結果として機能的ＴＫを生産することが
できない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス、および（１）製
薬学的に有効量の前記ウィルス、および（２）製薬学的
に許容されうる担体または希釈剤からなる偽狂犬病のた
めの変性された生きているウィルスのワクチンによって
、達成された。
本発明のなおほかの実施態様において、前述の目的は、
（１）クローニングベク９−１−とＰＲｖｔｋ遺伝子の
実質的にすべてを含有するＰＲＶのＤＮＡ断片とからな
る交雑プラスミドを構成し；（２）工程（１）の交雑プ
ラスミドを、ｔｋ＋宿主細胞中において、温度抵抗性Ｐ
ＲＹ　ｔｋ−突然変異原誘発突然変異体からのＤＮＡで
同時トランスフェクションしくｃｏ−ｔ　ｒａｎｓｆ　
ｅ　ｃｔｉｎｇ）；　（３）ｔｋ−宿主細胞中において
、工程（２）において生産されたウィルスからのＰＲＶ
　ｔｋ＋について選択Ｌ；　（４）ＰＲＶ　ｔ　ｋ遺伝
子の実質的にすべてより少ないものが存在し、同時に欠
失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）の各側に隣接してＰＲＶ　ＤＮ
Ａ配列を保持するように、工程（１）の交雑プラスミド
からＤＮＡ配列を欠失させ；　（５）ｔｋ＋宿主細胞中
において、工程（３）において得られたＰＲＶ　ｔｋ＋
から誘導されたＰＲＶ　ｔｋ”　ＤＮＡを工程（４）の
得られる交雑プラスミドで同時トランスフェクションし
；そして（６）ｔｋ−宿主細胞中において、工程（５）
において生産されたウィルスからのＰＲＶ　ｔｋ−につ
いて選択して、温度抵抗性ＰＲＶ　ｔｋ−欠失突然変異
体を生産する；ことからなるｔｋ遺伝子の欠失の結果と
して機能的ＴＫを生産することができない温度抵抗性偽
狂犬病ウィルスを生産する方法によって小達成された。
１つの実施態様において、木発明は自然復帰割合が１０
−５より小であるようにｔｋ遺伝子中に１または２以上
の突然変異体を含有しかつ突然変異体体ウィルスが機能
的ＴＫを生産しない、高度に減衰した温度抵抗性ＰＲＶ
ｔｋ−突然変異原誘発突然変異体、およびその生産方法
に関する。
木発明のこの実施態様はｔｋ−突然変異体を単に単離す
る方法を越えるが、ウィルスの病気を引き起こす能力が
減少するように、多数の遺伝的変更を蓄積する方法に関
する。
本発明のこの実施態様の方法は、次の工程からなる＝　
（１）温度感受性ウィルスのための許容温度においてｔ
ｋ−宿主細胞中でＰＲＶ　ｔｋ十株をプラーク精製（ｐ
ｌａｑｕｅ−ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ）Ｌ：　（２）工程（
１）の得られるウィルスをｔｋ−宿主細胞中で突然変異
原の存在下に温度感受性ウィルスのための許容温度にお
いて２〜５回増殖（ｐｒｏｐａｇａｔ　ｉｎｇ）させ；
　（３）工程（２）の得られるウィルスをｔｋ＋宿主細
胞中で突然変異原の存在下に温度感受性ウィルスのため
の非許容温度において増殖させ；　（４）工程（３）の
得られるウィルスをｔｋ＋宿主細胞中で突然変異原の存
在下に温度感受性ウィルスのための許容温度において増
殖させ；　（５）工程（４）の得られるウィルスをｔ、
に＋宿主細胞中で選択剤の存在下に温度感受性ウィルス
のための許容温度において増殖させ；そして（６）工程
（５）の得られるウィルスをｔｋ＋宿主細胞、中で突然
変異原の存在下に温度感受性ウィルスのための許容温度
において増殖させて、温度抵抗性ＰＲＶ　ｔｋ−突然変
異原誘発突然変異体を生産する、からなる。
プラーク精製は、場の分離物（ｆｉｅｌｄ　１ｓｏｌａ
ｔｅｓ）および既知の減衰した菌株は異るウィルスの混
合物からしばしばなるので、ワクチンのウィルスの形成
に使用すべき出発物質を精製する手段を提供する。
本発明において出発物質と１、て伸出す六姑密のＰＲＶ
　ｔｋ−菌株は臨界的ではない。このようなＰＲＶ　ｔ
ｋ−の例は、次のものを包含する：より知られた減衰し
た菌株、例えば、ブカレスト（Ｂｕｃｈａｒｅｓｔ）菌
株（以後、ｒＰＲＶ（ＢｔｒＫ）Ｊ　）、５ｕｃＨ−を
菌株（Ｓ　ｋ　ｏ　ｄａ、Ｒ，、Ｂｒａｕｎｅｒ、１．
．５ａｄｅｃｋＹ、Ｅ、、および　Ｍａｙｅｒ、Ｖ、Ａ
ｃｔａＶｉｒｏｌ、　溢：１−９（１９６４）参照）　
、Ｂａｒｔｈａとしても知られているに菌株（Ｂａｒｔ
ｈａ、Ａ、、Ｍａｇｙ、Ａ１１ａｔＯｒｂ、旦工上ユａ
　１６：４２−４５　（１９６１）参照）、および　ノ
ルデン（Ｎｏｒｄｅｎ）菌株（Ｐａｕｌ、Ｐ、Ｓ、、Ｍ
ｅｎｇｅｌｉｎｇ、Ｗ、Ｌ、および　Ｐｉｒｔｌｅ。
Ｅ、Ｃ，Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、７３：１９３−１９８
　（１９８２）参照）：動物から直接分離されあるいは
実験室においてしばしば継代接種（ｐλｓｓａｇｅ）さ
れる有毒の菌株、例えば、ＡＴＣＣＮｏ、ＶＲ−１３５
を有するＡｕｊｅｓｚｋｙ菌株（以後、ｒＰＲＶ　（Ａ
ｕ　Ｄ株Ｊ、Ｐ−２２０８菌株　、ＫＣ−１５２Ｄ菌株
（Ｍａｅｓ、Ｒ，Ｋ、　Ｋａｎｉｔｚ、Ｃ。
Ｌ、　および　Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ、Ｄ、Ｐ。
Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ、　４４：２０８３−
２０８６　（１９８３）参照）、Ｓ６２／２６　Ｉｏｗ
ａ菌株、Ｉｎｄ−ＦＨ菌株、Ｉｎｄ−８菌株、Ｉｎｄ−
Ｒ菌株およびショウブ（ｓｈｏｐｅ）菌株（Ｐａｕｌ、
Ｐ、Ｓ、Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ、Ｗ、Ｌ、、および　Ｐｉ
ｒｔｌｅ、Ｅ、Ｃ，Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、７３：１９
３−１９８　（１９８２）参照）、ＰＲＶ（Ｂ　Ｕ　Ｋ
）は本発明において使用する好ましい菌株である。
本発明の文脈において、温度抵抗性ウィルスは非温度感
受性であるウィルスである。こうして、温度抵抗性ウィ
ルスは、非許容温度（ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ　
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）、すなわち、約３８．５℃〜
４０°Ｃ１好ましくは３９．１°Ｃにおいて、ＰＲＶの
親ウィルスまたは場の単離物が許容温度において複製す
るのとほぼ同様によく複製することができる。これと対
照的に、温度感受性ＰＲＶ菌株は複製に必須なウィルス
の遺伝子中に突然変異を含有し、これにより機能的遺伝
子生産物は許容温度、すなわち、約３３°Ｃ〜３７．５
℃、好まししくは３４．５℃において生産されるが、非
許容温度においては生産されない。したがって、温度感
受性ウィルスにおいて、感染性ウィルスの粒子の生産は
、許容温度における生産に比較して、非許容温度におい
て４〜７０グ（ｌｏｇ）低い。温度抵抗性ウィルスの菌
株を用いると、感染性ウィルスの粒子の生産は非許容温
度において許容温度におけるのとほぼ同一である。
ある温度感受性の呼吸ウィルス菌株、例えば、ＩＢＲＶ
の温度感受性突然変異体、は従来変性された生きている
ウィルスＰＲＶのワクチンとして使用されてきた（Ｐａ
ｓｔｏｒｅｔ、Ｐ。
Ｐ、、Ｔｈ１ｒｙ、Ｅ、、Ｂｒｏｃｈｉｅｒ。
ｂ、、および　Ｄｅｒｂｏｖｅｎ、Ｇ、、Ａｎｎ、　Ｒ
ｅｃｈ、　Ｙｅｔ、　１３：２２１−２３５（１９８１
）および　Ｃｈａｎｏｃｋ、Ｒ。
Ｍ、、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１４旦：　３
６４−３７４　（１９８１）参照）。このような使用の
原理的説明は、温度感受性ウィルスが特別に許可された
部位において限定された複製を行ない、そして局所的な
免疫学的応答を引き出すことができるということである
。しかしながら、温度感受性ウィルスは宿主動物のより
深い、温度がウィルスの複製に非許容性である組織中に
おける複製を害される。
温度抵抗性ウィルスは、変性された生きているウィルス
ＰＲＶのワクチンとして温度感受性のウィルスよりも次
の理由で優れる＝　（１）減衰（ａｔ　ｔ　ｅｎｕａｔ
　ｉ　ｏｎ）は、複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に必
要な有害ウィルスの遺伝子からよりもむしろ特定の病原
性ウィルスの遺伝子における変更（ａ　ｌｔ　ｅ　ｒａ
ｔ　ｉ　ｏｎ）から生ずる；および（２）温度抵抗性ウ
ィルス菌株は、接種部位においてより広範に複製し、そ
してより完全な延長した免疫学的応答を引き出すことが
できる。
本発明において用いる特定のｔｋ−宿主細胞は、それら
がＰＲＶの許容生長を許すかぎり、臨界的ではない。こ
のようなｔｋ−宿主細胞の例は、次のものを包含する：
ウサギＲａｂ（ＢＵ）、マウスＬＭ　（ＴＫ−）、ヒト
ＨｅＬａ（ＢＵ２５）（Ｋｉｔ　、Ｓ、　、Ｑａｖｉ　
、Ｈ，、ＡＤｕｂｂｓ、Ｄ、Ｒ，および　０ｔｓｕｋａ
。
Ｈ，Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、↓λ：２５−３６　（１
９８３）参照）、シリアン（ｓｙｒｉａｎ）ハムスター
ＢＨＫ　２１　（ＴＫ−）（Ｓａｎｄｕｓ、Ｐ、Ｇ、、
Ｗｉｌｋｉｅ、Ｎ。
Ｍ、　および　Ｄａｖｉｄｓｏｎ、Ａ、Ｊ。
Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、旦３：２７７−２９５　（１
９８２）参照）、およびヒト系列（ｌｉｎｅ）１４３　
（Ｃａｍｐｉｏｎｅ−Ｐｉｃａｒｄｏ’，Ｒａｗｌｓ，
Ｗ．　Ｅ．　および　Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ．ｓ．　Ｊ．
　Ｖｉｒｏｌ．　３１：　２８　１−２８７　（１　９
７９）参照），Ｒａｂ（ＢＵ）は本発明において使用す
る好ましいｔｋ一宿主細胞である。
本発明において使用する特定のｔｋ”宿主細胞は、それ
らがＰＲＶの許容生長を許すかぎり、臨界的ではない。
このよラなｔｋ＋宿主細胞の例は、次のものを包含する
：ＡＴＣＣ　Ｎｏ．１４１４を有するＲａｂ−９；１次
ウサギ腎細胞；２次ウサギ腎細胞；サル細胞、例えば、
ａｙ−ｉおよびＯＭＫ　；ヒト細胞、例えば、ＨｅＬａ
（Ｓ３）およびヒト胚腎細胞；およびニワトリ胚線維芽
細胞。Ｒａｂ−９は本発明において使用する好ましいｔ
ｋ＋宿主細胞である。しかしながら、野（ｆｉｅｌｄ）
における動物のワクチン接種に使用すべきウイルスの生
産のために、米国の農務省が認証した、好ましくはワク
チン接種すべき動物と同一種でありかつ他の感染性物質
（ａｇｅｎｔ）を含まない、ＰＲＶに許容される細胞系
統を使用すべきである。例えば、適当なブタ細胞系統は
マイコプラズマおよび他のウイルスを含まなＩ／）認証
された倍数（ｄ　ｔ　ｐ　ｌ　ｏ　ｉ　ｄ）非腫瘍発生
ブタ腎細胞系列であろう。
本発明において使用する特定の突然変異原は臨界的では
ない。このような突然変異原の例は次の通りである：　
ＢｒｄＵｒｄ．ＮＨ２　０Ｈ．ＨＯＮＯ、ニトロソグア
ニジンおよび紫外線（Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｐ．　Ａ．．
Ａｒｏｎ，Ｇ．　Ｍ．，Ｂｉ　ｓｗａ　ｌ　，Ｎ．　お
よび　Ｂｅｎｙｅｓｈ−Ｍｅｌ　Ｘｎｉｃｋ．Ｖｔｒｏ
ｌｏ　５２：５７−７１　（１９７３）および　Ｓａｎ
ｄｒｉ−Ｇｏ１ｄｉｎ．Ｒ．　Ｍ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ
．および　Ｇｌｏｒｉｏｓｏ，Ｊ．　Ｃ．　Ｊ．　Ｖｉ
ｒｏｌ．　３８：４１二４９（１９８１）参照）。Ｂｒ
ｄＵｒｄは、その組み合わせられた突然変異原性および
選択の活性のために、好ましレ）突然変異原である。す
なわち、ＢｒｄＵｒｄはよく知られた効力のある突然変
異原であるばかりでなく、またｔｋ−ウイルスの選枳に
有用である。
低濃度のＢｒｄＵｒｄにおけるＰＲＶの順次の継代培養
（ｓｅｒｉａｌ　ｐａＳｓａｇｅ）はウイルスを生長さ
せると同時にその中に突然変異体を蓄積させる。これら
の突然変異体は毒性を減少させ、こうしてワクチンの安
全性を高める。より高いＢｒｄＵｒｄの濃度におけるａ
ｒａＴの存在下の引き続く継代培養は、ｔｋ−の表現型
の選択を可能とする。本発明はＰＲＶ　ｔｋ一突然変異
体を得るための最近用いられている方法と異る。なぜな
ら、ａ　ｒ　ａＴは薬物抵抗性のＰＲＶを得るためにの
みその方法において使用されたからである（Ｂｅｎ−Ｐ
ｏｒａｔ　，Ｔ．，Ｖｅａｃｈ．Ｒ．Ａ．，および　Ｉ
ｈａｒａ，Ｓ．　Ｖｉｒｏｌヨ巨　１２７：１９４−２
０４　（１９８３）参照）。すなわち、ａｒａＴは突然
変異原ではな？のみがこの方法により起こる。さらに、
ａｒａＴの選択により分離された多くのヘルペスウイル
スはＴＫの生産において部分的に欠けるだけであり、そ
れゆえ有毒である。
ＢｒｄＵｒｄを突然変異原としてかつ選択剤として使用
することにより、多数の突然変異をウイルスのｔｋ遺伝
子中にのみならず、かつまたウイルスのゲノム全体に導
入することが可能であり、こうしてＴＫ活性に欠けかつ
低い復帰速度、すなわち、約１０−５〜ｌＯ−７の復帰
速度を示す減衰されたＰＲＶ突然変異体を得ることが可
能である。
本発明において使用する特定の選択剤は、選択剤がｔｋ
−をｔｋ＋偽狂犬病ウィルスから選択することができる
かぎり、臨界的ではない。このような選択剤の例は次の
通りである：ＢｒｄＵｒｄ．ａ　ｒａＴ．ＢＶＤＵ．Ｆ
ＭＡＵおよびＡＩｄＵｒｄ．ａｒａＴはｔｋ＋宿主細胞
に対して毒性１つ　Ｉ−１−　ナ＋　ｌ．Ｘ　／ｌへ　
−１　二　■島−１　こ　一＼　４℃　体一　ｎ＼　Ｊ
＋　ｓｋ−　７Ｉ〜　＾フ　ー訃−　１　ζ〜　・ａ択
剤である。ＢｒｄＵｒｄはｔｋ−宿主細胞のための好ま
しい選択剤である。
同様な手順がまた異るｔｋ−アルファヘルペスウィルス
、すなわち、ＩＢＲＶの分離に適用された（Ｋｉｔ、Ｓ
、および　Ｑａｖｆ、Ｈ，Ｖｉｒｏｌｏ　上３０：３８
１−３８９　（１９８３）および米国特許出願第５１６
，１７９号、１９８３年７月２１日出願参照）。しかし
ながら、これらの手順において、ｔｋ−宿主細胞は使用
されず、そして出発物質はＰＲＶではなかった。
他の実施態様において、本発明はｔｋ遺伝子の欠失の結
果として機能的ＴＫを生産することができないＰ’ＲＶ
の温度抵抗性ｔｋ−欠失突然変異体およびその生産方法
に関する。突然変異体はＴＫを解読するＤＮＡ配列の部
分に欠けるので、ｔｋ＋への復帰は起こらない。
本発明のこの実施態様の方法は、（１）クローニングベ
ク９〒（ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖ　ｅ　ｃ　ｔ　。
ｒ）とＰＲＶ　ｔｋ遺伝子の実質的にすべてを含有する
ＰＲＶのＤＮＡ断片とからなる交雑プラスミドを構成し
、（２）工程（１）の交雑プラスミドを、ｔｋ＋宿主細
胞中において、温度抵抗性ＰＲＶ　ｔｋ−突然変異原誘
発突然変異体からのＤＮＡで同時トランスフェクション
しくｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅ墾ｃｔｉｎｇ）、（３）ｔｋ
−宿主細胞中において、工程（２）において生産された
ウィルスからのＰＲＶｔｋ＋について選択し、（４）Ｐ
ＲＶ　ｔｋ遺伝子の実質的にすべてより少ないものが存
在し、同時に欠失の各側に隣接してＰＲＶ　ＤＮＡ配列
を保持するように、工程（１）の交雑プラスミド（ｈｙ
ｂｒｉｄ　ｐｌａｓｍｉｄ）からＤＮＡ配列を欠失させ
、（５）ｔｋ“宿主細胞中において、工程（３）におい
て得られたＰＲＶ　ｔｋ＋から誘導されたＰＲＶ、ｔｋ
”　ＤＮＡを工程（ｄ）の得られる交雑プラスミドで同
時トランスフェクションし、そして（６）ｔｋ−宿主細
胞中において、工程（５）において生産されたウィルス
からのＰＲＶ　ｔｋ−について選択して、温度抵抗性Ｐ
ＲＶ　ｔｋ−欠失突然変異体を生産する、工程からなる
。
ｔｋ遺伝子はほぼ１５００ｂｐの大きさである。欠失突
然変異体は、５７〜ｔｓｏｏｂｐのＤＮＡ断片をｔｋ遺
伝子の適当な解読区域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）
から排除し、こうしてＴＫの適切な折りたたみ（ｆｏｌ
ｄｉｎｇ）または基質の結合を防止することによって生
成することができる。あるいは、欠失突然変異体は、遺
伝子の適切なリーディングフレーム（ｒｅａｄ　ｉ　ｎ
ｇｆｒａｍｅ）が転位（ｓ　ｈ　ｉ　ｆ　ｔ）されるよ
うに、１０〜１００ｂｐのＤＮＡ断片を排除することに
よって生成することができる。後者の場合において、ナ
ンセンスポリペプチドが生成されうるか、あるいはポリ
ペプチドの合成はフレーム−シフト４８発停止コドンの
ため伴出（ａｂｏｒｔ）されうる。欠失の好ましい大き
さは約７５〜５７０ｂｐである。
ここで使用するとき、「フランキング配列（ｆｌａｎｋ
ｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）Ｊは、ｔｋ遺伝子の解読配
列から一ヒ流、下流、または北流および下流の両者の配
列を意味する。上流の配列は転写制御信号、すなわち、
プロモーターおよびエンハンサ−（ｅｎｈａｎｃｅｒ）
を含有する。下流の配列は、ｔｋ遺伝子の転写のための
ポリアデニル化信号を含有する。
工程（１）の交雑プラスミド中に存在しなくてはならな
い精確なｔｋ遺伝子の配列は、欠失のために選択した配
列および欠失突然変異体の１作（ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎ
ｇ）において使用すべき制限ヌクレアーゼに依存するで
あろう。
この実施態様において使用するＰＲＶ　ｔｋ−突然変異
体は、ｔｋ遺伝子の解読区域中に１または２以−Ｈの点
の突然変異を含有する。したがって、工程（１）におい
て使用する交雑プラスミドは、ＰＲＶｔｋ−突然変異体
において突然変異する特定の配列と置換するＰＲＶ　ｔ
！＜”遺伝子配列を含有しなくてはならない。ＰＲＶ　
ｔｋ−ＤＮＡと工程（１）の交雑プラスミドとの間の組
み換え事象（ｅｖｅｎｔ）は、ＰＲＶ　ｔｋ−遺伝子に
おける１または２以上の突然変異原誘発突然変異から上
流および下流の両者において起こらなくてはならない。
工程（１）の交雑プラスミドが突然変異したＰＲＶ　ｔ
ｋ−ＤＮＡとそれにより置換する交差事象、すなわち、
遺伝標識救済（ｍａｒｋｅｒ　ｒｅｓｃｕｅ）は、救済
ＰＲＶＤＮＡ断片が小さい、例えば、５Ｏ−１００ｂｐ
であるときでさえ理論的には起こりうるが、実際には、
このような小さいＤＮＡ断片により遺伝標識救済は起こ
りそうもない。これと対照的に、遺伝標識救済の確率は
、救済ＤＮＡ断片が約１〜４ｋｂであるとき、大きく増
大する。注、後述するＰＢＢ−１１中（７）ＰＲＶ　Ｄ
ＮＡ（７）挿入は３゜５ｋｂである。
工程（４）において要求されるプラスミド中の欠失に隣
接する特定のＰＲＶ　ＤＮＡ配列は、交雑プラスミド中
の欠失の特異性に依存する。一般に、欠失の３゛および
５′の両者の側に隣接するＰＲＶ　ＤＮＡ配列の大きさ
は少なくとも約４００ｂｐであろう。例えば、後述する
プラスミドｐＢＢ−１１ｄｉ　５ａｃＡ２６が工程（５
）におけるＰＲＶ　ｔｋ”　ＤＮＡによるトランスフェ
クションに使用される場合、ＰＲＶ　ｔｋ遺伝子の欠失
された０、ｌｋｂのヌクレオチド配列は図単位２．８に
おけるＢａｍＨＩ開裂（ｃｌｅａｖａｇｅ）部位から約
８００ｂｐである（第４図参照）。これは５ａｃｌ−Ｃ
欠失の５゛ト流側において交差事象を許すために十分で
ある。同様に、５ａｃｌ開裂部位（０，９図単位）から
ｐＢＢ−１１ｄｌ　５ａｃＡ２６の５ａｃｌ部位（２，
０図単位）へ延びるヌクレオチド断片中に１１００ｂｐ
が存在する。これは５ａｃＩ欠失の３“下流における交
差よりも適切である。
ＰＲＶ　ｔｋ遺伝子およびそのフランキング配列を含有
するＰＲＶのＤＮＡ断片からなる交雑プラスミドを構成
するために本発明のこの実施態様において使用する特定
のクローニングベクトルは、クローニングベクターが選
択的特性（ｔｒａｉｔ）、すなわち、薬物抵抗性を解読
する遺伝子を含有するかぎり、臨界的ではない。このよ
うなりローニングベクトルは、次のものを包含する＝ｐ
ＢＲ３２２およびｐＢＲ３２２に基づくベクトル（Ｓｅ
ｋｉｇｕｃｈｉ、Ｔ、、ＮＮ１５ｈｉ。
ｔｏ、Ｔ、、Ｋａｉ、Ｒ，および　Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ
、Ｍ、Ｇｅｎｅ　２１：２６７−２７２（１９８３）参
照）、ｐＭＢ９、ＰＢＢ３２５、ｐＫＨ４７（Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）、ｐＢＲ３２８、ｐＨＣｐＨＣ７９（Ｂｏｅｈｅｒ
ｉｎ　Ｍａｎｎｅｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
）、ファージＣｈａｒｏｎ　２８　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｄ６ｅａａｆＩ＋ｌ−Ｔａ１−ｔｓｖａ＋Ａ？Ｔ＾ｓ）
、ｐＫＢｌｌ、ｐＫＳＶ−１０（Ｐ−Ｌ　Ｂｉ　ｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）、ｐＭＡＲ４２０（Ｏｔｓｕｋａ、Ｈ
，、Ｈａｚｅｎ、Ｍ、、Ｋｉｔ。
Ｍ、、Ｑａｖｉ、Ｈ，および　Ｋｉｔ、Ｓ。
Ｖｉｒｏｌｏ　１土３：１９６−２１３　（１９８１）
参照）およびオリゴ（ｄＧ）−ティルト（ｔａｉｌｅｄ
）ｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅ
ａｒ）参照）。
ＰＲＹ　（ＢＵＫ）ＢａｍＨＩ−１１断片がＰＲｖ　ｔ
ｋ遺伝子を含有することが発見され、下を参照、そして
ｐＢＲ３２２はただ１つのＢａｍＨ■クローニング部位
を有するので、ＰＢＲ３２２は本発明において使用する
好ましいクローニングベクトルである。この部位におけ
るＤＮＡ断片の挿入はクローニングベクターテトラサイ
クリン遺伝子を不活性化するが、アンピシリン遺伝子を
不活性化しないので、挿入によりｐＢＲ３２２より大き
いテトラサイクリン感受性、アンピシリン抵抗性交雑プ
ラスミドは’＋８ＥＪｌ＋に分離されう６−ＢａｍＨＩ
断片は別として、ＰＲＶｃ７）Ｂ　ｇ　Ｉ　Ｉ工、Ｂｃ
ｌＩおよびＭ　ｂ　ｏ　Ｉ断片は、それらの断片がＢ　
ａｍＨＩ断片と同じ結合端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ　ｅｎｄ
ｓ）を有するので、ｐＢＢ３２２ｔ７）ＢａｍＨＩ部位
においてクローニングされうる。
ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８、
ｐＨＣ７９およびファージＣｈａｒｏｎ２８ＤＮＡも単
一のクローニング部位を有する。
しかしながら、ＭｂｏＩ断片は小さくかつｔｋ遺伝子の
一部分のみを含有し、一方ＢｇｉＩＩ断片は大きすぎて
ファージＣｈａｒｏｎ　２Ｂを除外してクローニングベ
クタ轡のいずれにおいても便利にクローニングされない
。
ＰＲＶ（ＢＵＫ）　Ｋｐｎ！−Ｊ　断片はＰＲＶ　ｔｋ
遺伝子を含有することがまた発見された（下を参照）。
こうして、ｐＢＢ−１１，ｐＫＳＶ−１０およびｐＭＡ
Ｒ４２０は、ただ１つのＫｐｎＩクローニング部位を含
有するので、この断片をクローニングするための有用な
りローニングベクタ→・である。同様にオリゴ（ｄＧ）
−ティルトｐＢＲ３２２はＰＲＶのオリゴ（ｄＣ）−テ
イル）’ＫｐｎＩ−Ｊ　断片と一緒にクローニングベし り９−として使用することができる。
本発明において有用な独特のクローニング部位を含有す
る他のクローニングベクター・は、ＰＲＶｔｋ遺伝子を
含有する断片を生産するＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ以外
の制限ヌクレアーゼの評価のときに決定することができ
る。ＰＲＶ　ｔｋ遺伝子を含有する断片を生産するため
に使用することができる他の制限ヌクレアーゼ、こうし
て本発明において有用でありうる他のクローニングベク
ターは、下により詳しく考察する第５図に示すＰＲＶ　
ｔｋ遺伝子配列から容易に明らかである。
本発明のプラスミドを生長させるために用いる特定の宿
主は必須ではない、このような宿主の例は、次のものを
包含する：旦ユ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＲＩ　（Ｂｏｌ
ｉｖａｒ、Ｆ、、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｒ，Ｌ、、Ｇｒ
ｅｅｎｅ、Ｐ。
Ｊ、、Ｂｅｔｌａｃｈ、Ｍ、Ｃ，Ｈｅｙｎｅｋｅｒ、Ｈ
，Ｌ、、Ｂｏｙｅｒ、Ｈ，Ｗ、。
Ｃｒｏｓａ、Ｊ、Ｈ，、および　Ｆａｌｋ。
ｗ、Ｓ、Ｇｅｎｅ　２：９５−１１３　（１９７７）参
照）；旦ユ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＨＢＩＯｌ　（ＡＴＣ
ＣＮｏ　、３３６９４）’；旦ユ　且」上ｉ　ＭＭ２１
　（ＡＴＣＣＮｏ、３３６７８）；および旦ユ　ｃｏｌ
ｉ　ＤＨＩ　（ＡＴＣＣＮｏ、３３８４９）、Ｅ、ｃｏ
ｌｔ　Ｋ１２　ＲＲｌは好ましい宿主であり、そしてＦ
”’ｈｓｄＲｈｓｄ　Ｍ　遺伝子型を有する。
同様に、別のベタ９＋／クローニング系、例えば、次の
ものを使用することができる：ｌエ　５ｏ１ｉ　または
　Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
または両者の中で生長するプラスミドベクター、あるい
はさらには　旦ユ５ｕｂｔ　ｉ　ｌｕｓ　の中で生長す
るプラスミドベクトル、あるいは動物の細胞、マウスの
細胞（ＡＴＣＣＲＬ１６１６）中で生長するウシ乳頭腫
ウィルス（ＡＴＣＣＮｏ、３７１１２）のようなベク９
−１−（Ｅｌｄｅｒ、Ｊ、Ｔ、、５ｐｒｉｔｚ、Ｒ，Ａ
、および　Ｗｅｉｓｓｍａｎ、Ｓ、Ｍ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ
、Ｇｅｎ。
１５　：　２９５−３４０　（１９８１）および　Ｕｒ
ｅ、Ｒ，、Ｇｒｏｓｓｍａｎ、Ｌ、および　Ｍｏ１ｄａ
ｖｅ、に、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ２　ｍｏｌｏ　
”ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ”　、ｖｏｌ、ｌｏｌ
、Ｐａｒｔ　Ｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、
Ｙ、（１９８３）参照）。
本発明の前述の変性された生きているウィルスの製薬学
的に有効な量は、製薬学的に許容されうる担体または希
釈剤と一緒に、動物、例えば、ブタ、ウシ、ヒツジおよ
びヤギにおける偽狂犬病に対するワクチンとして使用す
ることができる。
本発明において有用な製薬学的に許容されうる担体また
は希釈剤の例は、次のものを包含する：ＰＲＶに対する
抗体を含有しない、すなわち、ＰＲＶに対して血清陰性
である約２．５〜１５％の血清を含有する生理学的な緩
衝された、すなわち、約ｐＨ７，０〜７．４の媒質。無
ガンマグロブリン血清は、ガンマグロブリンを含有する
血清よりも好ましい。本発明において使用すべき血清の
例は、次のものを包含する：ブタ血清、φシ血清、ウシ
胎児血清、ウマ血清および子羊血清。ＰＲＶについて血
清陰性であるブタからの無ガンマグロブリンブタ血清は
ブタのワクチン接種に好ましく、そしてウシ胎児血清ま
たは無ガンマグロプリウシ血清はウシのワクチン接種に
好ましいであろう。血清タンパク質、例えば、ブタアル
ブミンまたはウシ血清アルブミンを約０．５〜３．０％
゛　の量で血清の代わりに使用することができる。しか
しながら、ワクチン接種される動物においてアレルギー
性応答を誘発する異質のタンパク質を担望ましい。
本発明の変性された生きているウィルスは少なくとも１
０’　〜５Ｘ１０８ｐ、ｆ、ｕ、／ｍｌの力価で一７０
℃〜−９０℃において、あるいは凍結乾燥された状態で
４°Ｃ〜−２０°Ｃにおいて貯蔵することが好ましい。
凍結乾燥されたウィルスは無菌の蒸留水で再構成するこ
とができる。
投与すべき有用な適量は、ワクチン接種する動物の年令
、体重および種、および投与方法に依存して変化するで
あろう。適当な適量は、例えば、約１０！ｉ〜５Ｘ１０
８ｐ、ｆ、ｕ、、好ましくは約１０”　〜５Ｘ１０’　
ｐ、ｆ、ｕ、であることができる。
本発明のワクチンは、鼻内に、筋肉内におよび皮下に投
与することができる。筋肉内投与は好ましい投与方法で
ある。
次の実施例は例示を目的として提供され、そして本発明
の範囲をいかなる方法においても限定するものではない
。下の実施例１および２は第１図に概略的に示されてい
る。
以下の実施例において、すべての媒質および緩衝溶液は
、特記しないかぎり、ガラス蒸留水中で構成した。
一犬ム勇ニー ＰＲＶの温度抵抗性ｔｋ−突然変異原誘発突の ＰＲＹ　（ＢＵＫ）はよく知られたＰＲＶ　ｔｋ＋株で
あり（Ｓｋｏｄａ、Ｒ，、Ｂｒａｕｎｅｒ、１．．５ａ
ｄｅｃｋｙ、Ｅ、＋およびＭ　ａ　ｙｅｒ、Ｖ、　Ａｃ
ｔａ　Ｖｉｒｏｌ、　８：１−９（１９６４）参照）そ
してこの実施例において出発物質として使用した。ＰＲ
Ｖ　（ＢＵＫ）は、ドナルド博士（Ｄｒ、Ｄｏｎａｌｄ
　Ｐ、Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏ
ｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｐｕｒｄ
ｕｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｉ
ｎｄｉａｎａ）により提供された。
このウィルスは本来ニワトリ胚細胞培養物中で８００・
以上継代培養（ｐａｓｓａｇｅ）することにより減衰さ
れており、そしてヨーロッパにおいてワクチンとして使
用されていた。このウィルスは場の分離物（ｆｉｅｌｄ
　１ｓｏｌａｔｅ）よりもウシおよびブタについて有毒
ではない。パーデユー（Ｐｕｒｄｕｅ）において、この
ウィルスはまたブタ腎（ＰＫ−１５）細胞中で数回継代
培養されていた。受は取った後、ＰＲＶ　（ＢＵＫ）を
Ｒａｂ−９細胞中で１回継代培養し、後述するようにプ
ラーク精製してＰＲＶ　（ＢＵＫ−５）およびＰＲＶ　
（ＢＵＫ−７）を得た。
プラーク精製は次の方法で実施した二６つのくぼみ（ｗ
ｅ　ｌ　ｌ）のプラ長チックのコスタ−（Ｃｏｓｔａｒ
））レー、直径３．５ｍｍ、の各くぼみに、イーグル（
Ｅａｇｌｅ）の最小必須培地（ＡｕｔｏＰｏｗ、ＡＰＭ
ＥＭ、Ｆｌｏｗ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅＳ、Ｉｎｃ、
）プラスｌθ％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清、５０ルｇ　／
　ｍ　１のネオマイシンおよび２ｍＭのグルタミンおよ
び１０ｍＭのへペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝液、ｐＨ７，３
（以後「生長培地」）の２．５ｍｌ中の２５０゜０００
Ｒａｂ（ＢＵ）細胞を接種（ｓｅｅｄ）した。次いでト
レーを３７℃において３日間湿潤Ｃ０２のインキュベー
ター内でインキュページ讐ンし、その時細胞は全面単分
子層を形成した。
次いで一７０°Ｃにおいて貯蔵したウィルスを融解し、
４°Ｃにおいて１分間超音波処理してウィルスの凝集体
を細胞破片から開放した。各ウィルスの希釈物について
重複の試料を使用して、１０−’、１０−５およびｌｏ
−６において希釈した１０倍の連続的希釈を生長培地で
行った。
連続的に希釈したＰＲＹ　（ＢＵＫ）　でＲａｂ（Ｂ　
Ｕ）細胞を感染させる前に、コスタ−のくぼみからの生
長培地を吸引する。次いで、連続的に希釈した試料の各
々の０．１ｍｌを細胞の単分子層に添加した。３４．５
℃におけるｌ水素の吸収期間後、２．５ｍ１ｃ７）寒天
の上層（ｏｖｅｒｌａｙ）溶液を各くぼみに添加した。
寒天の上層溶液は、次のように調製した＝ｌＯＯｍ　ｌ
の２．５％（ｗ／ｖ）ＢａｃｔｏＡｇａｒ（ＤＩＦＣＯ
）を沸騰水の浴中で溶融した。次に、等体積（１００ｍ
　ｌ　）の２倍強度のＭ　ｃ　Ｃ。
ｙの５Ａ溶液（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｉｎｃ、）を溶融した寒天に添加した。２倍強度のＭ　
ｃ　Ｃｏ　ｙの５Ａ溶液は、２８０ｍＭｃ７）ＮａＣ１
および０．６７ｍＭ（７）Ｎａ２　ＨＰＯ４，０、８８
ｍＭ（７）Ｋ　Ｈ２Ｐ　０４．１１ｍＭのＫＣｌ、１　
、６　ｍＭ（７）Ｍｇ　Ｓ　０４　（７Ｈ２０）　、２
　。
５ｍＭのＣａＣｌ、１１ｍＭのグルコース、ｐＨ７，１
２およびフェノールレッド（４ｍ　ｇ　／　ｍｌ）（以
後ｒＢｓｓＪ　）、アミノ酸およびビタミンの強化混合
物、０．２％（Ｗ／Ｖ）の重炭酸ナトリウム、および０
．４％（Ｗ／Ｖ）のグルコースからなる２ｘ−バンク（
Ｈａ　ｎ　ｋ）の均衡塩溶液を含有する。次いで、上の
２００ｍ１の溶液を２　、０　ｍ　ｌの２００ｍＭのグ
ルタミン、１．Ｏｍｌの１０　ｍ　ｇ　／　ｍ　１のネ
オマイシンの溶液、ｌ。
Ｏｍｌのマイコスタチン（１０，０００単位／ｍ１）、
２．４ｍｌの１　、０Ｍｃｙ）Ｈｅ　ｐｅ　ｓ緩衝液、
ｐＨ７，３，８，０ｍ１（７）１．０％（７／Ｖ）プロ
タミン硫酸塩溶液および２０ｍ１のウシ胎児血清で補充
して寒天上層を生成した。
寒天上層を固化させた後、コスタ−・トレーを００２イ
ンキユベーター内に３４．５℃において３日間配置した
。次いで、第２上層を添加した。
第２寒天上層は第１寒天上層と同一の組成を有したが、
ただしそれはｌｏｍｌの０．１％（Ｗ／Ｖ）の中性レッ
ド指示薬色素を補充されていた。
次いで、トレーをインキュベーターに戻し、３４．５℃
にさらに１２〜２４水素保持した。
ウィルスのプラーク、すなわち、ピンクのバックグラウ
ンドに対して純粋な白色の区域、が検出された。プラー
クは細胞の集団の破壊を伴う単−筒内ノｌ、づ轄ヱｌＴ
Ｓ愉−１ハオ鎗＾オ鎗＾田１．１ル１゜た。これと対照
的に、無傷の非感染細胞はピンクに着色され、そして顕
微鏡検査により明瞭に見ることができた。次いで、プラ
ークを計数し、プラークの上の寒天の中に毛管ピペット
を挿入することにより、特定のプラークにおけるウィル
スを［採取（ＰｉＣｋ）ＪＬ、そしてその物質を吸引し
、０．５ｍｌの生長培地中に分散させた。「採取」した
プラークは約１０４〜１０’ｐ、ｆ。
ｕ　、　／　ｍ　ｌの量でウィルスを含有し、そして−
７０℃において貯蔵した。このようにして、ウィルス（
１）りａ−７ＰＲＶ　（ＢＵＫ−５）　およびＰＲＶ（
ＢＵＫ−７）が得られた。
ＰＲＹ　（ＢＵＫ−５）　およびＰＲＹ　（ＢＵＫ−７
）は、遺伝的に同一であり、同一の制限ヌクレアーゼ地
図を有することがわかった。さらに、酵素のアッセイに
より、ＰＲＶ　（ＢＵＫ−５）およびＰＲＶ　（ＢＵＫ
−７）はそれで感染された細胞中にウィルスのＴＫ活性
を３〜５ｐ、ｆ、ｕ、／細胞の感染の多重１ｔ（ｍｕｌ
ｔｉｎｌ＋＜＋＋ｖｏｆ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）（以後
ｒｍ、ｏ。
ｉ、］）で３７℃において６時間で誘発することが立証
された。下に記載する手順において、ＰＲＶ　（ＢＵＫ
−５）　およびＰＲＹ　（ＢＵＫ−７）は互換的に使用
することができた。
「採取された」プラークからのウィルスの作業原料（ｗ
ｏｒｋｉｎｇ　５ｔｏｃｋ）は、約１０７Ｒａｂ−９細
胞を採取した各プラークからの０．５ｍｌのウィルスで
感染させ、そして３４．５℃において３〜５日間、広範
な細胞病気効果が観察されるまで、インキュベーション
することにより調製した。
次に、生長培地中のＲａｂ（ＢＵ）細胞の全面単分子層
の培養物（Ｋｉｔ、Ｓ、および　Ｑ　ａ　ｖｉ、Ｈ，Ｖ
ｉｒｏｌｏ　１３０：３８１−３８９（１９８３）参照
）を、ＰＲＶ　（ＢＵＫ−５）　で２．０ｐ、ｆ、ｕ、
／細胞のｍ、ｏ、ｉ。
において接種した。
３７°Ｃにおいて１時間の吸収期間後、培地を５　、０
　ｇ　ｇ　／　ｍ　ｌのＢｒｄＵｒｄ　（Ｃ１ａｂｉ。
ｃｈｅｍ′−Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｃｏ　ｐ　、）で補充し
、そしてウィルスを２日間３４．５℃で増殖させ、感染
した培養物を一４０°Ｃにおいて水平位置で凍結させ、
次いで融解し、浸透して感染した細胞をガラスから分離
し、細胞の破片を含有する生長培地の７リコートをピペ
ットで上下させ、そして無菌の２オンスの処方びん内に
入れることによって、ウィルスを収穫した。
後述する第２の継代培養の直前に、１つのびんのウィル
スを融解し、ソニヶイター・セル・ディスラブター（Ｓ
ｏｎｉｃａｔｏｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）Ｗ
２２０Ｆ型（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｕｌｔｒａｓ
ｏｎｉｃｓ　Ｉ　ｎｃ、）を使用して４℃において１分
間超音波処理した。
次に、上で収穫したウィルスの１　＋　１００希釈物の
第２継代培養をＲａｂ（ＢＵ）細胞中で３４．５°Ｃに
おいて実施したが、ただし生長培地を１０ｇｇ／ｍ１ｃ
７）ＢｒｄＵｒｄで補充した。
次いで、第２継代培養後収穫したウィルスのｌ：１００
希釈物の第３継代培養をＲａｂ（ＢＵ）細胞中で３４．
５℃において実施したが、ただし生長培地を２５ｐｇ／
ｍ１ｃ７）ＢｒｄＵｒｄで補充した。
その後、第３継代培養後収穫したウィルスの１：１００
希釈物の第４継代培養をＲａｂ（ＢＵ）細胞中で３４．
５°Ｃにおいて実施したが、ただし生長培地を２５ｐｇ
／ｍｌのＢｒｄＵｒｄで補充した。得られるウィルスを
生長培地中で一７０°Ｃにおいて貯蔵し、そして前述の
ようのプラーク精製した。
次いで、得られるプラーク精製したウィルスを１１０１
Ｌ／ｍｌのＢｒｄＵｒｄを含有する生長培地中で３９．
１℃および３４．５℃の両者においてＲａｂ−９細胞中
で増殖させた。この工程は、生長培地中にＢｒｄＵｒｄ
、すなわち、温度抵抗性のＢｒｄｌＪｒｄ抵抗性ｔｋ−
ウィルスの存在にかかわらず、ＰＲＹゲノム中に追加の
不規則の突然変異を誘発させかつ３９．１”０において
ｔｋ”細胞中で生長することができるウィルスを選択す
るために用いた。
Ｒａｂ−９細胞はＢｒｄＵｒｄをホスホリル化するＴＫ
を有する。こうして、細胞のＴＫ活性をもつ生産物はウ
ィルスの複製を阻害することもできるのでウィルスはｔ
ｋ−でなくてはならず、また、ウィルスは薬物抵抗性、
すなわち、ＢｒｄＵｒｄ抵抗性でなくてはならない。両
者の温度において等しくよく生長したウィルス、すなわ
ち、非温度感受性ウィルスまたは「温度抵抗性」ウィル
スのみをさらに処理した。
次いで、ａｒａＴ選択工程を用いて、ＰＲＶがＢｒｄＵ
ｒｄ以外のヌクレオシド類似体の非常に高濃度に対して
交差抵抗性であることを確保した。また、ＢｒｄＵｒｄ
と異り、ａｒａＴはＲａｂ−９ＴＫではなくＲＶ　ＴＫ
により選択的にホスホリル化されるので、ａｒａＴをま
た使用した。
ａｒａＴ選択工程において、温度抵抗性ウィルスの１：
２００希釈物の１．０ｍｌを使用して生長培地中のＲａ
ｂ−９細胞の全面単分子層の培養物を３７°Ｃにおける
１時間の吸収により感染させた。次いで、１００ｇｇ／
ｍｌのａｒａＴを含有する生長培地（Ｙａｍａｓａ　５
ｈｏｙｕ　Ｃ００）を添加し、そして３４．５℃におけ
るインキュベーションを広範な細胞病気の効果が観察さ
れるまで進行させた。
他の選択工程を上のようにＲａｂ−９細胞中で３４．５
℃において実施したが、ただし生長培地を２００　ｇ　
ｇ　／　ｍ　ｌのａｒａＴで補充した。
次に、選択工程を上のようにＲａｂ−９細胞中で３４．
５℃において実施したが、ただし生長培地を２５ｐｇ／
ｍ１ｃｒ＋ＢｒｄＵｒｄで補充して、得られるウィルス
がｔｋ＋宿主細胞中においてさえＢ　ｒ　ｄＵ　ｒ　ｄ
に対して高度に抵抗性であることを確保した。
上の最後の工程から収穫したウィルスを前述のヨウにＲ
ａｂ−９細胞についてプラーク精製し、そして個々のプ
ラークを採取し、Ｒａｂ−９細胞中で３９．１’０およ
び３４．５℃の両者における生長について試験して、温
度抵抗性およびｔｋ−ウィルスのクローンを選択した。
１つのこのようなりローン［これはＰＲＶ　（ＢＵＫ−
５Ａ）と表示した］は、アメリカンΦタイプ・カルチャ
ーコレクシ目ン（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にイテＡＴ
ｃ　ＣＮ　ｏ　、　ＶＲ２０７８テ受ｔＥすｌｎた。
−実ＪＬ医」− ＰＲＶの温度抵抗性ｔｋ−欠失突然変異体のＰＲＶ　Ｄ
ＮＡはＨ３Ｖ　ＤＮＡの調製についてＰｉｇｎａｔｔｉ
　ｅｔ　ａｌが記載するようにして本質的調製した（Ｐ
ｉｇｎａｔｔｉ、Ｐ。
Ｆ、、Ｃａ５ｓａｉ　、Ｅ、、Ｍｅｎｅｇｕｚｚｉ　、
Ｇ、、Ｃｈｅｍｃｉｎｅｒ、Ｎ、および　Ｍｉｌａｎｅ
ｓｉ、Ｇ、Ｖｉｒｏｌｏ　９３：　２６０−２６４　（
１９７９）参照）。
さらに詳しくは、２０ｍ１の生長培地を含有するＲａｂ
−９細胞（約５Ｘ　１０”細胞／培養）の２０個の８オ
ンスの処方ガラスびんの単分子層培養物を、上の実施例
１におけるようにして生産したＰＲＶ　（ＢＵＫ−７）
の５．０ｐ、ｆ　、ｕ　、／細胞のｍ、ｏ、ｉ、で感染
させ、そして３４．５００において３時間インキュベー
ジ式ンし、その時細胞のＤＮＡ合成はウィルスの感染に
より阻害された０次いで、１．０ＪＬＣｉ／ｍｌおよび
０．２５　ＪＬ　ｇ　／　ｍ　ｌの［３Ｈ］−チミジン
を添加してウィルスのＤＮＡを放射線標識し、そしてイ
ンキュベーションを３４．５°Ｃにおいて１７時間さら
に続けた。細胞をゴムのポリスマンによりガラスからこ
すり取ることにより分離し、６００Ｘｇで遠心分離し、
１０＃Ｌｇ／ｍｌの非放射性チミジンを含有する０　、
　１４Ｍ（７）Ｎ　ａＣｌ、０．００３ＭのＫＣＩ、０
　、ＯＯＩＭ（７）ＣａＣ１２，０，０００５ＭのＭｇ
Ｃ１２，および０　、　ＯＬＭのリン酸塩、ＰＨ７，５
からなる水冷リン酸塩緩衝食塩溶液（以後ｒＰＢＳＪ　
）で洗浄した。次に、細胞６００×ｇで遠心分離し、次
いでエタノール−ドライアイス浴中で凍結させた。
融解後、０．２５％（Ｗ／Ｖ）のトリドア（Ｔｒ　ｉ　
ｔ　ｏ　ｎ）Ｘ−１００，ｌ　ＯｍＭのＥＤＴＡ。
１０ｍＭｃ７））リス（Ｔｒｉ　５）−ＨＣＩ、ｐＨ７
，９からなる溶解溶液（ｉｙｓｔｎｇ　５ｏｔｕｔｉｏ
ｎ）の９容積中に細胞沈殿物を再懸濁させた。次に、細
胞懸濁液をダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーへ
移し、そして室温において２０〜３０分間おだやかに攪
拌しながらインキュベーションした。
次いで、細胞懸濁液をガラスの遠心分離管へ移し、Ｎａ
Ｃ１を０．２Ｍの最終濃度に添加した。
次に、管を数回倒立させ、そして溶液を１０００×ｇで
４℃において１０分間直ちに遠ｌｑ分離した。
得られる上澄みをガラス管中にデカンテーションし、そ
してｌｏｍＭｃ７）Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，１
，０ｍＭのＥＤＴＡからなる緩衝液（以後ｒＴＥ緩衝液
」）中で１１００ｐ／ｍ＋のプロテアーゼ　Ｋ、（Ｅ、
Ｍ、Ｓｃｉ　ｅｎｃｅ）と−緒に３７℃において１時間
インキュベーションすることにより脱タンパク質した。
次いで、ｌ容量の９０％（ｖ／ｖ）の再蒸留フェノール
を添加し、この溶液を反転により混合し、２０，０００
Ｘｇで遠心分離し、そして水相、すなわち、上相をボリ
アローｖ−（ｐｏｌｙａｌｌｏｍ’ｅｒ）遠心分離管へ
移した。次いで、固体の酢酸ナトリウムを４％（ｗ／ｖ
）の濃度に添加し、拡散を２容量の水冷エタノールで沈
殿させ、そして−２０℃において一夜インキユベーショ
ンした。その後、沈殿を１６，０００ｒｐｍにおける遠
心により４℃においてスピンコ（Ｓｐｉ　ｎｅｏ）ＳＷ
２５０−ター内で集め、２．０ｍｌのＴＥ緩衝液中に溶
解し、そして４℃においてＴＥ緩衝液に対して透析した
。
次いで、得られるＤＮＡ溶液をポリアロマ−遠心分離管
へ移し、ＴＥ緩衝液中のＣｓＣ１を５７％（ｗ／ｗ）（
ρ＝１．７１５ｇ／ｃｍ２）に添加した。次に、ＤＮＡ
を４６時間２２．５℃および４４．００Ｏｒｐｍにおい
てスピン：Ｉ　Ｎｏ。
５０　Ｔｉ　ローター内で遠心した。次いで、１２滴の
分画をポリアロマ−管の底から集め、４゜０ｇｌの７リ
コートを液体シンチレーション分光光度計内で計数して
ＰＲＶ　ＤＮＡ含有分画（ρ＝約１．７１５ｇ／Ｃｍ２
）を探した。合計２５分画が集められたとき、一般に分
画１３〜１５はＰＲＶ　ＤＮＡを含有した。
次いで、ＰＲＹ　ＤＮＡ含有分画をプールし、モしてＴ
Ｅ緩衝液に対して前記緩衝液を数回交換して４℃におい
て２４時間透析した。ＤＮＡの濃度を蛍光光度計により
決定した。ＰＲＹ　（ＢＵＫ−７）ＤＮＡの収量は、ｔ
ＯＳ細胞からは約５０ルｇであった。
ＰＲＶ　（ＢＵＫ−７）ＤＮＡ（７）同一性は、後述す
るようにサブマリンゲル（ｓｕｔＢｎａｒ　ｉ　ｎｅｇ
ｅｌ）装置により４°Ｃにお【する電気泳動後に得られ
た制限ヌクレアーゼ消化ＰＲＹ　（ＢＵＫ−７）ＤＮＡ
断片のパターンにより評価した。
さらに詳しくは、ＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ制
限ヌクレアーゼで、製造業者（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　
ＢｉＬａｂｓ、Ｉｎｃ、）が推奨する反応条件下で切り
離した０次に、０．４％（Ｖ／Ｖ）のブロモフェノール
・ブルー、１２５ｍＭのＥＤＴＡおよび５０％（Ｖ／Ｖ
）（７）グリセロールからなる溶液の１／ｌＯ容量を添
加して反応を停止させ、次いで６５℃に１０分間加熱し
た。各試料の２０ｐｌのアリコートをアガロースゲルの
試料くぼみへ適用し、電気泳動を後述するように実施し
た。
制限ヌクレアーゼ断片の電気泳動は、０．６％（Ｗ／Ｖ
）のアガロースのスラブゲル（Ｋｉｔ。
Ｓ、、Ｑａｖｉ、Ｈ，、Ｄｕｂｂｓ、Ｄ、Ｒ。
および　０ｔｓｕｋａ、Ｈ，Ｊ、Ｍｅｄ。
Ｖｉｒｏｌ、１２：２５−３６（１９８３）参照）上に
おいて、３０ｍＭ（７）ＮａＨ２ＰＯ４，１，０ｍＭ（
７）ＥＤＴＡ、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８，
１からなる電気泳動緩衝液（以後「電気泳動緩衝液」）
中で４５ボルトおよび４℃において１６時間実施した。
電気泳動後、ゲルを０　、５　ｇ　ｇ　／　ｍ　ｌの臭
化エチジウムを含有する電気泳動緩衝液中でソーキング
することによりＤＮＡ断片を着色し、長波ＵＶ照明器の
上で可視化させ、そして写真撮影した。ＰＲＶ　（ＢＵ
Ｋ−５）およびＰＲＶ　（ＢＵＫ−７）の制限ヌクレア
ーゼのパターンを第２図および第３図に示し、そして断
片の大きさを下表１に記載する。
この方法で調製したＰＲＹ　（ＢＵＫ−７）ＤＮＡ　ハ
、標準トランスフェクションアッセイにおいて約１００
０ｐ、ｆ、ｕ、／１１ｇＤＮＡの感染性を有した（Ｇｒ
ａｈａｍ、Ｆ、Ｌ、およびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、Ａ、
Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１幻ＬＪ　５２：４５６−４６７　（
１９７３）参照）。
Ｂ、　ＰＲＹ　ＢＵＫ−７ＤＮＡのクローニング ＰＲＶ　（ＢＵＫ−７）　から分離１．りＤＮＡ（７）
ＢａｍＨＩ断片を、次の手順によりｐＢＲ３２２のＢａ
ｍＨＩ切り離し部位においてクローニングした。
１５ｍＭのＮａＣ１，６，０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ７，９および６．０ｍＭのＭｇＣｌ２からなる培養
緩衝液（以後「切断緩衝液」）および１００　ｇ　ｇ　
／　ｍ　ｌのウシ血清アルブミン（以後「ＢＳＡ」）中
に、ＰＲＹ　（ＢＵＫ−７）からの４．０ｇｇのＤＮＡ
を溶解した。次いでＤＮＡを３７℃において１時間４０
単位のＢａｍＨＩで消化した。反応を等容量の９０％（
Ｖ／Ｖ）の再蒸留フェノールの添加により停止させ、混
合し、そして相分離のため遠心した。水相を０．１ＸＴ
Ｅ緩衝液に対して透析した後、酢酸ナトリウムを０．１
Ｍに添加し、次いで２容量のエタノールを添加し、そし
てＤＮＡの沈殿を一２０℃において一夜貯蔵した。ＤＮ
Ａの沈殿を遠心により集め、そして０．ＩＸＴＥ緩衝液
中に溶解した。
次いで、制限ヌクレアーゼ断片をＢａｍＨＩで切り離し
てｐＢＲ３２２と組み合わせ、次の方法で脱ホスホリル
化（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙ　１ａｔｅ）ｌ、た： ５０ｍＭ（７）Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ１，ｐＨ７，８，１
０ｍＭのＭｇＣ１２，２０ｍＭのジチオスレイトール、
１．０ｍＭのＡＴＰおよび５０　ｐ−ｇ　／　ｍｌのＢ
ＳＡからなりかつ１０００単位のファージＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎ
ｃ、）を含有する結合緩衝液中において、４．ＯｐＬｇ
のＢａｍＨＩ切り離しＰＲＶ　（ＢＵＫ−７）ＤＮＡを
０．２ｇｇのＢａｍＨＩ消化脱ホスホリル化ｐＢＲ３２
２ＤＮＡ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）
と混合し、そして４℃において一夜インキユベーション
した。反応をＥＤＴＡの２０ｍＭまでの添加および６５
℃の３０分間の加熱により停止した。
組み換えプラスミドＤＮＡをＴＥ緩衝液中で希釈し、後
述するように、旦ユ　ｃｏｌｉ、Ｋ１２　ＲＲＩ　バク
テリアを形質転換するために使用した（Ｂｏｌｉｖａｒ
、Ｆ、、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｒ，Ｌ、Ｇｒｅｅｎｅ、
Ｐ、Ｊ、。
Ｂｅｔｌａｃｈ、Ｍ、Ｃ，、Ｈｅｙｎｅｋｅｒ、Ｈ，Ｌ
、、Ｂｏｙｅｒ、Ｈ，Ｗ、、Ｃｒｏｓａ、Ｊ、Ｈ，およ
び　Ｆａｌｋｏｗ。
Ｓ、Ｇｅ、ｎｅ　２：９５−１１３　（１９７７）参照
）。
バクテリアはＣａＣｌ２を使用して形質転換のために調
製した（Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ、およびＨｉｇａ、Ａ、Ｊ、
Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。
互３　：１５９−１６２　（１９７０）参照）、詳しく
は、２．０（Ａ　）の密度のＥ、ｃｏ１００ 上エ　Ｋ１２　ＲＲＩの一夜の培養物を使用して、１．
０％（Ｗ／Ｖ）のバクトドリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ
）の酵母エキス、および０．５％（ｗ／　ｖ）　ｃ７）
Ｎ　ａ　Ｃｌからなる肉汁（以後「ＭＬ肉汁Ｊ）（７）
２００ｍｌを０．０２（Ａ　）　００ のバクテリア密度において接種した。バクテリアを、約
０．５（Ａ　）の密度が達成されるま００ で、約２時間インキュベーションした。次いで、バクテ
リアを遠心により沈殿させ、モしてｌ／４容量の冷５０
ｍＭのＣａＣｌ２中に再懸濁させた。氷上で５分間イン
キュベーションした後、バクテリアを再び沈殿させ、そ
して１／４０容量の氷冷５０ｍＭのＣａＣｌ２中に再懸
濁させた。
次に、ＴＥ＠衝液中の１　／　１０　ｍ　ｌの組み換え
プラスミドＤＮＡ、約１１０Ｎ１００ｎ、を０゜２ｍｌ
のＣａＣｌ２処理バクテリアへ添加した。
この混合物を４℃に３０分間保持した。次いで。
温度を３７℃に５分間上げ、０．３ｍｌのＭ　Ｔ、緩衝
液を添加した。その後、インキュベーションを３７℃に
おいておだやかに振盪しながら４５分間続け゛た。試料
を３０７Ｌ　ｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリンを補充した
トリブチカーゼ大豆寒天（ｓａｙ　ａｇａｒ）ペトリ皿
（ＢＢＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
ｇｙ　Ｓｙ　ｓ　ｔ　ｅｍｓ）上で平板培養した。
得られたクローンを、次にようにして、望の組み換えプ
ラスミドＤＮＡについて急速にスクリーニングした： 組み換えプラスミドＤＮＡを含有するバクテリアの一夜
の培養物を、３０　ｇ　ｇ　／　ｒｎ　ｌのアンピシリ
ンを含有する５、０ｍｌのＭＬ肉汁中に接種し、３７℃
において約１．５（Ａ　）の密度００ にインキュベーションした。次いで、このバクテリア培
養物を１．５ｍｌのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ）ポリプロピレン管へ移し、エッペンドルフ遠心機で
約１分間室温において遠心してバクテリアを沈殿させた
。次に、バクテリアを２　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌの卵リソ
チーム；５０ｍＭのグルコース；１０ｍＭのシクロヘキ
サンジアミンテトラアセテート；および２５ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣ１緩衝液、ｐＨ８，０からなるリソチーム溶
液Ｎ００ｌ　（以後「リソチーム溶液Ｎｏ、１）の００
１ｍ１中に再懸濁させ、次いで４℃において３０分間イ
ンキュベーションした。次に、０．２ｍｌの０．２Ｎｃ
７）ＮａＯＨプラス１．０％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸
ナトリウムをバクテリア溶液へ添加し、管内に渦を形成
させ、４°Ｃに５分間保持した。その後、０．１５ｍ１
の３．０Ｍの酢酸ナトリウム、ｐ）１４．８を添加し、
この管をおだやかに倒立させ、その間に「凝塊（ｃｌｏ
ｔ）Ｊが形成した。このＤＮＡを４℃に１時間保持して
染色体のＤＮＡ、タンパク質、および高分子量ＲＮＡを
沈殿させた０次に、沈殿をエッペンドルフ遠心機内で５
分間室温において遠心し、そして組み換えプラスミドＤ
ＮＡを含有する透明な上澄み流体、はぼ０．４ｍ１．を
第２エツペンドルフ遠心管へ移した０次いで、２．５容
量のエタノール（はぼ１．０ｍ１）を第２管へ添加し、
この管を−２０・０Ｃにおいて３０分間配置した。沈殿
した組み換えプラスミドＤＮＡを、エッペンドルフ遠心
機内で室温において２分間遠心により集めた。次いで、
組み換えプラスミドをＯ，１ｍｌの０．１Ｍ（７）酢酸
ナトリウム、０　、０Ｍ（７）Ｔ　ｒ　ｉ　５−ＨＣｌ
、ｐＨ８，０中に溶解し、エタノールで再沈殿させ、再
び遠心により集め、最後に５０ＪＬｌの水中に溶解した
。
次いで、プラスミドＤＮＡを切断緩衝液中で希釈し、そ
して２．０単位のＢａｍＨＩを添加した。３７℃におい
て６０分の消化期間後、試料を１／１０容量の０．４％
（ｗ／ｖ）のブロモフェノール・ブルー、１２５ｍＭｃ
７）ＥＤＴＡおよび５０％（Ｖ／Ｖ）のグリコールから
なる溶液と混合し、約２０１ｔｌを前述のように電気泳
動分析のために０．６％（Ｗ／Ｖ）のアガロースのスラ
ブゲルへ適用した。この分析により、組み換えプラスミ
ドがＢａｍＨＩ挿入体を含有するかどうか、そして、含
有した場合、挿入体の大きさくｋ　ｂ）が明らかになっ
た（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃ。
および　Ｄｏｌｙ、Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ａｃｔｄｓ　Ｒｅｓ
、ヱ：１５１３−１５２３　（１９７３）参照）。
組み換えプラスミドＤＮＡを大規模に調製するため、前
述の急速スクリーニング手順のために組み換えプラスミ
ドＤＮＡの生産に使用したバクテリアに比較して２００
倍の量のプラスミド形質転換バクテリアを処理したが、
ただし第１回のエタノール沈殿後、１００℃に１０分間
加熱した５゜０ｍＭのＴ　ｒ　ｉ　５−ＨＣｌ、　ｐＨ
８、０中の１゜０　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのＲＮａｓｅか
らなる原料溶液からの０．５ｍｇｃ７）膵１１ＲＮａｓ
ｅ　Ａ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ）で試料を３７において３０分間処理した。この
処理後、３７℃においてＴＥ緩衝液中の５００ｇｇのプ
ロテイナーゼ　Ｋ　（Ｅ、Ｍ、５ｃｉｅｎｃｅ）を添加
した。引き続いて、等容量のフェノールを誹加し、試料
を渦の形成により撹拌し、前述のように蓮心して相を分
離した０次いで、水相を取り出し、エタノールで沈殿さ
せ、前述のように遠心により集めた。沈殿を次いで０．
２ｍｌのＴＥ緩衝液中に溶解し、そして５０ｍＭのＮａ
Ｃ１，１０ｍＭ（７）Ｔ　ｒ　ｉ　５−ＨＣｌ、　ｐ、
Ｈ７、５，１，Ｏｍ　Ｍ　ｃ７）　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ中ｃ
７）ＩＯ，４ｍｌの直線の１０−４０％（Ｗ／Ｖ）スク
ロース勾配で層状化させ、次いでスピンコ（Ｓ　ｐ　ｉ
　ｎｅｏ）ＳＷ４１０−ター内で４℃および２４．００
Ｏｒｐｍにおいて２０時間遠心した。１５滴の分画をポ
リアロマ−遠心管の底から集めてプラスチックトレーの
くぼみに入れた。合計３５の分画が得られた６次いで、
５＃Ｌｌの７リコートを前述のようにアガロースゲルの
電気泳動によりスクリーニングした。組み換えプラスミ
ドＤＮＡを含有する分画をプールし、０．１ＸＴＥ緩衝
液に対して透析し、さらに研究するため４℃において貯
蔵した。
Ｃ，ｔｋ遺伝子を符合化するＰＲＹ　（ＢＵＫ−７ＤＮ
Ａ　’に 精製されたウィルスのＤＮＡ断片間、あるいはプラスミ
ドベクトル中のクローニングにより増幅されたウィルス
のＤＮＡ断片よる、動物細胞における相同組み換え、お
よびゲノムのウィルスのＤＮＡを使用して、ＤＮＡ断片
またはウィルスのゲノムの中の突然変異体配列を救済し
た。「遺伝標識救済（ｍａｒｋｅｒ　ｒｅｓｃｕｅ）Ｊ
または「遺伝標識転移（ｍａｒｋｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ）」として知られる手順を用いて自然突然変異および
全体のウィルスＤＮＡ中の突然変異原により誘発された
突然変異をマツピングしくｍａＰ）、ならびに突然変異
を交雑プラスミドからゲノムのウィルスＤＮＡ中に転移
させた（Ｍａｔｚ、Ｂ、、５ｕｂａｋ−，５ｈａｒｐｅ
、Ｊ　。
Ｈ，、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６４：２２６１−２２
７０　（１９８３）参照）。
遺伝標識転移手順を使用して、ｔｋ遺伝子を符合化（ｅ
ｎｃｏｄｅ）するＰＲＶ　（ＢＵＫ−７）ＢａｍＨＩ断
片を同定した。すなわち、感染性ＰＲＶ’（ＢＵＫ−５
Ａ）ＤＮＡとＰＲＶ　（ＢＵＫ−７）ＢａｍＨＩ断片の
異る挿入体を含有する候補の組み換えプラスミドとの混
合物を、リン酸カルシウム沈殿法によりＲａｂ−９細胞
へ同時トランスフェクションした（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ、
Ｌ。
および　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、Ａ、Ｊ。
Ｖｉ　ｒｏｌｏ　５２：４５６−４６７　（１９７３）
参照）。詳しくは、次の無菌溶液を順番に試験管へ添加
した： （１）ＴＥ緩衝液中のＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ）ＤＮＡ
のｌｏＯｇｇ／ｍｌの溶液の０．４ｍ１（２）０　、Ｉ
ＸＴＥ緩衝液中（７）ＰＲＹ　（ＢＵＫ−７）ＢａｍＨ
Ｉ断片を含有する組み換えプラスミドの１１０１Ｌ／ｍ
ｌの溶液の０．４ｍｌ；（３）０．２５ｍ１の水； （４）ＴＥＩＩｉ液中のキャリヤー（ｃａｒｒｉｅｒ）
マウス繊維芽（ＬＭ　（ＴＫ　）　）細胞ＤＮＡの１１
００１Ｌ／ｍｌの溶液の０．２ｍｌ；（５）２．０Ｍｃ
７）ＣａＣ１２の０．１２５ｍ１；および （６）　２　Ｘ　Ｂ　Ｓ　Ｓ　（１）　ｌ　ｍ　ｌ　。
得られた溶液を反転により混合し、室温に３０分間保持
し、その間ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈殿が形成した。
次いで、沈殿したＤＮＡ−リン酸カルシウムを含有する
懸濁液の０．５ｍｌを５．−０ｍ１の生長培地へ直接添
加し、そして６０ｍｍのプラスチックペトリ皿中で３６
時間早く接種しであるＲａｂ−９細胞上で平板培養した
。細胞を３７℃において５時間インキュベーションした
。
次いで、新鮮な生長培地を添加し、そして培養物を３４
．５℃において２〜３日間、広範な細胞病気の効果が起
こるまでインキュベーションした。
ウィルスの収穫物を前述のようにしてつくった。
得られるウィルスは小さい数の組み換えＰＲＹｔ−に＋
を含有した。組み換えｔｋ＋ウィルスを強化するため、
１０−４のハイポキサンチン、ｌＯ−６Ｍのアミノプテ
リン、４．０ＸｌＯ−’Ｍのチミジンおよび１０−６Ｍ
のグリシンを含有する生長培地（以後ｒＨＡＴＧＪ　）
（Ｋｉ　ｔ　、Ｓ　。
および　Ｑａｖｔ、Ｈ，Ｖｉｒｏｌ。
１３０：３８１−３８９　（１９，８３）参照）継代培
養した（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ、Ｊ、Ｗ。
５ｃｉｅｎｃｅ　上４５ニア０９−７１０　（ｔ９６４
）；Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ、Ｊ、Ｗ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、ＡｃｔＡ　長：１４
−２２　（１９６５）　；および　５ｚｙｂａｌｓｋａ
、Ｅ、Ｈ，および　５ｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｗ、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　４８：２０２６
−２０３４　（１９６２）参照）中で収穫物をＲａｂ（
Ｂ　Ｕ）細胞、すなわち、ｔｋ−細胞中で、次のように
継代培養した。
Ｒａｂ−９細胞におけるトランスフェクシゴンのウィル
ス収穫物を超音波処理し、およびＨＡＴＧを含有する生
長培地中で１　：　５００に希釈し、およびＲａｂ（Ｂ
Ｕ）の全面単分子層をウィルスで約０．０１のｍ、ｏ、
ｉ、において接種した。
３７℃において１時間吸収した後、ＨＡＴＧを含有する
新しい生長培地を添加し、感染を４８時間３４．５℃に
おいて進行させ、その時ウィルスを再び収穫した。第２
の選択工程を同一の方法で実施し、ただしウィルスを１
：５００に希釈した。
第２選訳書代培養から収穫したウィルスを前述のように
Ｒａｂ−９細胞中でプラーク精製した（Ｋｉｔ、Ｓ、、
Ｑａｖｉ、Ｈ，Ｖｉｒｏｌ。
１３０：３８１−３８９　（１９８３）；およびＫｉｔ
、５．、Ｑａｖｉ、Ｈ，、Ｄｕｂｂｓ。
Ｄ、Ｒ，、および　０ｔｓｕｋａ、Ｈ，Ｊ。
Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、　１２　：　２５−３６（１９
８３）参照）、下の表に示すように、遺伝標識転移方法
により試験した組み換えプラスミド、すなわち、プラス
ミドｐＢＢ−１１、はＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ）のｔｋ
−突然変異を救済し、すなわち、ＰＲＶ　（ＢＵＫ−５
Ａ）で組み換えしてＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ　Ｒ１）と
表示するｔｋ“ウィルスを生成した。これと対照的に、
下表２に示すように、ＰＲＶ　ＤＮＡ断片ＢａｍＨＩ−
４およＵＢ　ａｍＨＩ−９を含有するプラスミド［これ
はＢａｍＨＩ−ｉｔｃｙ）両側（第２図参照）、すなわ
ち、それぞれプラスミドｐＢＢ−４およびｐＢＢ−９で
マツピングされている］はＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ）（
７）ｔ　ｋ−突然変異を救済しなかった。これらの結果
により、ＢａｍＨＩ−４およびＢａｍＨＩ−９の断片は
ＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ）　ｔｋ遺伝子中に突然変異部
位に関する配列を含有しないことが立証される。
−１ 交雑プラスミドＩＩＢＢ−１１からＰＲＶ　（ＢＵＫ−
５Ａ＞へのＰＲＶ　ｔｋ　＋Ｑｅｎｅ遺伝子の遺伝標識
転移Ｉ　ＰＲＶ（ＢＵＫ−５Ａ＞ＤＮＡのみ　１．０Ｘ
１０３（対照） Ｉ［ＰＲＶ（ＢＵＫ−５Ａ＞ＤＮＡプ７ス　３．２Ｘ１
０’プラスミドｐＢＢ−１１ＤＮＡ ＩＩＩ　ＰＲＶ（ＢＵＫ−５Ａ）ＤＮＡプラス　７．０
Ｘ１０’プラスミドｐＢＢ−４ＤＮＡ ＩＶ　ＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ＞ＤＮＡプラス　２．０
Ｘ１０”プラスミドｐＢＢ−９ＤＮＡ ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ切り離し部位に挿入されたＰ
ＲＶ　（ＢＵＫ−７）の３．５ｋｂのＢａｍＨＩ断片、
すなわち、ＢａｍＨＩ−１１を含有するプラスミドｐＢ
Ｂ−１１の制限ヌクレアーゼ地図は第４図に示されてい
る。この断片は、前述の遺伝標識転移アッセイにより立
証されるように、ＰＲＶ　ｔｋ遺伝子を含有する。ＰＲ
Ｙ　ｔｋ遺伝子の近似の境界を定めるために、３．５ｋ
ｂのＢ　ａｍＨＩ断片の部分を利用する遺伝標識転移ア
ッセイを前述のように実施した。これらの実験により、
５ａｃＩ−Ｂ断片の配列は野生型ｔｋ＋配列（７）ＰＲ
Ｖ　（ＢＵＫ−５Ａ）　へ（７）遺伝標識転移に必須で
あるが、ｐＢＢ−１１ｃ７）ＳａｃＩ　−Ａ断片の配列
は野生型ｔｋ＋配列のＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ）への遺
伝標識転移に必要ではないことが立証された。また、Ｐ
ＲＶ　（ＢＵＫ−７）の６゜ｌｋｂのＫｐｎＩ−Ｊ　断
片（表１および第２図り 参照）はＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ）のｔｋ−突然変異を
救済することが発見された。この事実は、ＰＲＶ　（Ｂ
ｔＴＫ−５Ａ）における突然変異、すなわち、ｔｋ遺伝
子の解読区域がｐＢＢ−１１のＫｐｎＩ制限部位（２，
１図単位）とＢａｍＨＩ制限部位（３，９図単位）との
間に位置することを証明する。
Ｄ、　ＰＲＶ　ｔｋｉ　のヌクレオチドｐＢＢ−１１（
７）３．５ｋｂのＢａｍＨＩ断片の部分を、後述するよ
うにファージ　Ｍ１３ｍｐ８〜ｍ　ｐ　１１中でサブク
ローニングしく５ｕｂＣ１ｏｎｅ）してＰＲＶ　ｔｋ遺
伝子を順番に配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）した（Ｈｕ、Ｎ
、−Ｔ、および　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、Ｇｅｎｅ　上二
二２７１−２７７　（１９８２）；および　Ｍ　ｅ　ｓ
　ｓｉｎｇ、Ｊ、および　Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、Ｇｅｎｅ
　１９：２６９−２７６　（１９８２）参照）。
半合成１ａｃ配列および適当なりローニング部位を含有
するファージ　Ｍ１３誘導体の系列が設計された（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ、Ｊ、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅ　ｎ　１ｎｅｅｒ
ｉｎ　Ｅｄｓ、　Ｒ。
Ｓｅｔｌｏｗ　および　Ａ、Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ（Ｐｌ
ｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｉｎｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ。
Ｙ、）　Ｖｏ　ｌ　、４：１９−３５　（１９８２）参
照）。これらの誘導体はファージ　Ｍ１３の非必須区域
における小さいＤＮＡ断片のクローニングおよび簡単な
カラー試験による挿入体の検出を可能とする。この系は
ＤＮＡ配列化反応（ｓ　ｅ　ｑ　ｕｎｃｉｎｇ　ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ）およびＤＮＡプローブの調製において広い
用途を見い出した。
ＰＲＹ　ｔｋ遺伝子の断片をファージ　Ｍ１３誘導体、
例えば、Ｍ１３ｍｐ８、Ｍ１３ｍｐ９、Ｍ１３　ｍｐｌ
ＯｌおよびＭ１３ｍｐＨの複製型（以後ｒＲＦＪ）（Ｎ
ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ、）中
でサブクローニングするとき、同一の断片を両方の可能
な配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）でクローニングする
ことができる。組み換えファージ　Ｍ１３誘導体の複製
は、１本鎖のファージ　ＤＮＡの合成に導く。Ｍ１３の
ペンタデカ−Ｆ−（ｐｅｎｔａｄｅｃａｍｅｒ）を使用
して１本鎖ＤＮＡの配列を開始した（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ、またはＰ、Ｌ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｅ　ａ　ｌ　ｓ）。
ＲＦ　Ｍ１３誘導体を調製するために、旦ユｃｏｌｉ、
Ｋ１２　３Ｍ１０３バクテリアの一夜培養物（Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ、またはＰ、
Ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｅ　ａ　１　ｓ）からの１．０ｍｌ
を１０７ｐ、ｆ。
Ｕ、のＭ１３　ｍｐｌＯｔ’感染させた。９．０ｍｌの
ＭＬ肉汁と混合した後、感染させた培養物を３７℃にお
いて３時間インキュベーションした。
次いで、１ｍｌの感染させた培養物および９．０ｍｌの
非感染バクテリアをｏ、ｉｉのＭＬ肉汁に添加し、そし
て培養物を３７°Ｃにおいて７時間さらにインキュベー
ションした。培養物を遠心により収穫し、リソチーム溶
液Ｎｏ、ｌ中に懸濁させ１．そしてＲＦ　ＭＬ３　ｍｐ
ｌｏ　ＤＮＡを抽出し、前述のように１０−４０％（ｗ
、／ｖ）スクロース勾配およびＴＥ緩衝液中の５７％（
Ｗ／ｖ）ＣｓＣ１勾配の遠心により精製した。
ＰＲＶ　ｔｋ遺伝子の５ａｃＩ断片Ａ、ＢおよびＣ１す
なわち、ＰＲＶ　（ＢＵＫ）ＢａｍＨＩ−１１の５ａｃ
Ｉ断片（第４図参照）を次の方法でＭｌＳ中においてサ
ブクローニングした。約１゜ｏｇｇのｐＢＢ−１１ＤＮ
Ａを１１００ｎのＲＦ　ＭＬ３　ＤＮＡと混合し、そし
てこの混合物を６．０ｍＭのＴｒ　ｉ　５−ＨＣ１，ｐ
Ｈ７，４，６，０ｍＭ（７）ＭｇＣｔ２．６．０ｍＭの
２−メルカプトエタノールおよび１１００ＪＬのＢＳＡ
中において１０単位の５ａｃＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ、）で３７℃において１
時間切り離した。この反応をＥＤＴＡの２０ｍＭまでの
添加および６５℃の２０分間の加熱により停止させた。
次いで、この反応生成物をエタノールで沈殿させ、結合
緩衝液中に溶解し、１０００単位のファージ　Ｔ４　Ｄ
ＮＡ　リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａ
ｂｓ、Ｉｎｃ、）と結合した。次に、この反応混合物を
１６℃において４時間インキュベーションし、そして反
応を４容量のＴＥ緩衝液の添加および６５℃の１０分間
の加熱により停止させた。
組み換えＭＬ３をＰＲＹ　５ａｃＩ断片ＤＮＡ挿入体で
選択するために、前述のように調製した０、２ｍｌのＣ
ａＣ１処理Ｅ、ｃｏｌｉ、Ｋ１２　ＪＭ１０３バクテリ
アをｉｏ〜５０ＩＬｆＬの結合したＭＬ３　ｍｐｌｏ　
ＤＮＡと混合し、そして水浴中に４０分間保持した。次
いで、この混合物を３７℃において５分間ＬＯｕｌの１
００ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シドおよび５０ル文の２．０％（Ｗ／Ｖ）のブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドと一緒に５０％（Ｖ／Ｖ）のジメチルホルムアミド中
でインキュベーションした。
次に、０．２ｍｌの新しく生長するバクテリアおよび１
文中の５．０ｇの酵母エキス；５．ＯｇのＮａ　Ｃ１＋
および６．０ｇのバクトアガ−（ｂａｃｔｏａｇａｒ）
からなる３、０ｍｌの軟質寒天を添加した。この混合物
を６０ｍｍのペトリ皿上へ注ぎ、３７℃において一夜イ
ンキユベーションした。
その後、ファージ感染バクテリアから成る無色のプラー
クを採取し、微小力価’（ｍｉｃｒｏｔｉｔ　ｅ　ｒ）
のベトリ皿へ接種し、３７℃において３時間インキュベ
ーションした。次いで、０．２ｍｌの新しく生長するｌ
ユ　ｃｏｌｉ、Ｋ１２ＪＭ１０３をファージ感染バクテ
リアへ添加した；この混合物を５　、０　ｍ　ｌのＭＬ
を含有する試験管へ移し、３７℃において一夜インキユ
ベーションした。
次に、１．０ｍｌの感染したバクテリアを遠心し、上澄
みを他の試験管へ移し、０．５ｍｌの１２％（Ｗ　／、
　Ｖ　）のポツリエチレグリコール（６０００）および
１．５ｍＭのＮａＣ１を含有する溶液を添加し、この懸
濁液を４°Ｃに１０分間保持し、次いで遠心した。上澄
みを廃棄し沈殿したファージをＱ　、１ｍｌの０．２％
（Ｗ／Ｖ）（７）ドデシル硫酸ナトリウム、０．２５ｍ
ＭのＥＤＴＡ中に溶解した０次いで、ファージＤＮＡを
前述のようにアガロースゲルの電気泳動により分析した
。組み換えファージを、挿入体をもたない１木鎖フアー
ジＤＮＡに比較して遅い移動度の、すなわち、大きい大
きさの挿入体含有１本鎖ファージＤＮＡにより認識させ
た。
ファージ　ＭＬ３　ｍｐｌｏ中に２つの挿入体が相補的
であるかどうかを知るために、相補試験（ｃｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔａｒｙ　ｔｅｓｔ）を後述するように用いた。
より詳しくは、２つの候補の組み換え１本鎖Ｍ１３　ｍ
ｐ１０ファージを０．１５ＭのＮａＣ１，０，０１５Ｍ
のクエン酸ナトリウム、ＰＨ７，０（以後ｒｓｓｃＪ）
からなる６×緩衝液中−で６５６Ｃにおいて１時間混合
した。次いで、反応混合物の部分を前述のようにアガロ
ースゲルの電気泳動により分析した。２つの挿入配列が
相補的であるとき、それらは互いに交雑化し、電気泳動
においてもとの１本鎖ファージＤＮＡよりも遅く動く帯
を誘導体した。
前述のようにＭ１３ｍｐｌＯ組み換えＤＮＡのＲＦ型か
ら分離したクローニングしたＳａｃ、Ｉ断片を、Ｍ　ｓ
　ｐ　ＩまたはＴａｑＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　
ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ、）により切り離し、そして木
質的にＳａ、ｃＩ断片のサブクローニングについて前述
したようにＭ１３ｍｐ９のＡｃｃＩ部位においてクロー
ニングした。ＰＲＶ　（ＢＵＫ）　ＢａｍＨＩ　１ｌ−
３ａｃＩ　−Ｂ　断片を含有するＭ１３　ｍｐｌＯのＲ
Ｆ　ＤＮＡを、ＫｐｎＩにより、すなわち、ＰＲＹ　（
ＢＵＫ）　ＢａｍＨＩ　ｌ　１−５ａｃＩ　−Ｂ　断片
内の切り離し部位により；およびＳｍａＩにより、すな
わち、Ｍ１３　ｍｐｌｏ中のクローニング部位に対して
切り離し部位３゛により切り離した。ＫｐｎＩの結合端
を、後述するように、ファ一ジ　Ｔ４　ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｂ　ｅ　ｔ　ｈｅ、ｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉ　ｅ　ｓ）の３゛ヌクレーゼ活性を
使用してプラン）（ｂｌｕｎｔ）単に転化した。
すべての４種のデオキシリポヌクレオシドトリホスフェ
ートの存在下に、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼは、制限断
片から対でない３゛テイルを除去し、そして相補的ｄＮ
ＴＰが存在する場合、それが第１対の塩基に到達すると
き、停止するであろう。ＫｐｎＩ結合端をプラント端に
転化するために、１０ｇＪｌのＤＮＡ断片からなる反応
混合物は１．０ルｇのＤＮＡ、２．０経文の１０倍のＴ
４　ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、すべて４種のデオキシ
リポヌクレオシドトリホスフェートの２゜０ｍＭの誘導
体の１．０ｇＪｌ、ｔ、ｏｐｉのＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼ、約２．５単位、および１９延文の水を含有する。１
０倍のＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液は、０．３３Ｍ
のＴｒｉｓ−アセテ−）　（ｐＨ７，９）、０．６６Ｍ
の酢酸カリウム、０．１０Ｍの酢酸マグネシウム、５．
０ｍＭのジチオスレイトール、および１．０ｍｇ／ｍ１
のＢＳＡ（Ｐｅｎｔａｘ　ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）からな
っていた。この反応混合物を３７℃において５分間イン
キュベーションした。次いで、１．０終文の０．５Ｍの
ＥＤＴＡを添加して反応を停止させた。この溶液をフェ
ノール／クロロホルム（１：　Ｄ　（ｖ／ｖ）溶液で１
回抽出し、そしてＤＮＡを２容量のエタノールで沈殿さ
せた。
ＤＮＡを遠心により集め、７０％（Ｗ／Ｖ）のエタノー
ルで洗浄し、再遠心し、真空乾燥した。ＤＮＡを２０ｇ
１（１）ＴＥ緩衝液（ｐＨ７，６）中に溶解し、プラン
ト端のＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１０断片のＳｍａＩ切り
離し部位へ再結合し、配向１ｊｋ存Ｌ−’（，０，８ｋ
ｂ；ｌ：たｔｉｏ、２ｋｂ（７）Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ　／　
Ｓ　ｍ　ａ　Ｉ配列を排除した（第４図参照）。
ＰＲＶ　ｔｋ遺伝子の５ａｃＩ断片に加えて、３つのＳ
ｍａ　Ｉ断片を、前述の５ａｃＩ断片のサブクローニン
グに用いたのと同一の方法でファージ　Ｍ１３ｍｐ８中
でサブクローニングした（第４図）。
配列のために１本鎖ファージＤＮＡを調製するために、
１．０ｍｌのファージ感染見よ　ｃｏｌ上、Ｋ１２　Ｊ
Ｍ１０３および１．０ｍ１（７）新しく生長する非感染
バクテリアを１００ｍ１のＭ１肉社中に接種し、３７℃
において７時間イン＋１＜　’ｙヨ′した・ファ一ジを
上澄みから１２％（Ｗ　／　Ｖ　）のポリエチレングリ
コール（６０００）および１．５ｍＭのＮａＣ１−ｃ’
沈殿させ、遠心により集め、５　、０　ｍ　ｌのＴＥ＠
衝液プラス０．１ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）　ドデシル硫
酸ナトリウムおよび５．０ｍｌの９０％（ｖ　／　ｖ　
）水性フェノール中に懸濁させた。この混合物を遠心し
、水相を５．０ｍｌのフェノール：クロロホルム（１：
　１）で１回・抽出した。次に、ＤＮＡを２容量ノエタ
ノールで沈殿させ、沈［７０％（Ｖ／Ｖ）で、次いで１
００％のエタノールで洗浄し、真空乾燥し、そして０．
２ｍｌのＴＥ緩衝液中に溶解した。
ＤＮＡの配列化（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、ジデオキ
シヌクレオチド鎖の停止法により、鋳型とし−ｃｐＲｖ
　（ＢＵＫ）ＢａｍＨＩ−１１ＤＮＡの１本鎖Ｍ１３サ
ブクローン、ペンタデカマー合成プライマー（Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ、）、標識基
質としテ［α−３２ｐコーｄＴＴＰ、Ｍｇ”　、適当な
非標識デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートおよ
びジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、およ
びｌユ　ｃｏｌｉ、ＤＮＡ　ポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ　断片、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して実施した。この反応混
合物を３８°Ｃにおいて１５分間インキュベーションし
た後、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを含
有するチェース溶液を添加した。反応を３８℃において
ｌＯ分後酵母ｔＲＮＡ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏ、）を含有するＥＤＴＡ溶液の添加により停止
させ、反応生成物をエタノールで沈殿させ、９０％（Ｖ
／Ｖ）のホルムアミド、３０ｍＭのＮ　ａＯＨｌｌｏｍ
ＭのＥＤＴＡ、０．３％（Ｗ／Ｖ）のブロモフェノール
・ブルー、および０．３％（Ｗ７’Ｖ）のキシレンシア
ツールからなる溶液の１０＃Ｍ中に溶解し、９０℃に１
分間加熱し、そして７．６％（Ｗ／Ｖ）のアクリルアミ
ド、０．４％（Ｗ／Ｖ）のビスアクリルアミド、０．０
０７％（Ｗ／Ｖ）の過硫酸アンモニウムおよび１７％（
Ｖ／Ｖ）のホルムアミドからなる８、０％（Ｗ　／　Ｖ
　）の配列化ゲル中に挿入した（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、
Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ。
Ｒ，、Ｂａｒｒｅｌｌ、Ｂ、Ｇ、、Ｓｍ１ｔｈ、Ａ、Ｊ
、Ｈ，および　Ｒｏｅ、Ｂ。
Ａ、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１４３：１６１−１７８
　（９８０）および　Ｓａｎｇｅ　ｒ　。
Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、および　Ｃｏｕｌｓｏｎ、
Ａ、　Ｒ，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Δｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ　７４：５４３６　−５４７６　（１９７７
）参照）。
ＰＲＶ　ｔｋ遺伝子の解読区域を含有する１６８６ｂｐ
のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、実質的に第５図中
に示す通りである。第５図に示すヌクレオチド配列はＰ
ＲＹ　（ＢＵＫ−７）により得られるが、ｔｋ遺伝子の
高度に進化的な保存性（ｈｉｇｈｌｙ　ｅｖｏｌｕｔｉ
ｏｎａｒｙ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｓｍ）のために、上
に例示した他のＰＲＶ　ｔｋ＋株は実質的に同様なヌク
レオチド配列をもつｔｋ遺伝子を有することが期待され
、こうして、下に考察するように、第５図におけるヌク
レオチド配列を使用して、出発物質としてＰＲＶ　（Ｂ
ＵＫ）以外（７）ＰＲＶ　ｔｋ＋株を用いて、追加のＰ
ＲＹ　ｔｋ−欠失突然変異体を構成することができる。
ｍ６ｉ７ｔプ松１．Ｘ−ｙ−Ｍ　Ｏロー１１小ワ　０固
出りにおけるＢａｍＨＩ部位に相当するＢａｍＨＩ部位
（ＧＧＡＴＣＣ）（第４図参照）はヌクレオチド３１８
において開始する。ＢａｍＨ１部位に対するヌクレオチ
ド５′は、ＰＲＹ　ＤＮＡのＢａｍＨＩ−１１断片に隣
接するＢａｍＨＩ−９断片中に存在する（第２図参照）
。次いで、１３６８ヌクレオチドについて、この配列は
ｐＢＢ−１１のＢａｍＨＩ部位から反時計回りに延びる
（３゜９固型位；第４図）。ＰＲＶ　ＴＲのための推定
上の翻訳開始信号、すなわち、ＡＴＧはヌクレオチソ１
２２に存在する。ＰＲＹ　ＴＫのための推定上の１訳停
止信号、すなわち、ＴＧＡはヌクレオチソ１２２９に存
在する。ＰＲＹ　ＴＫのための推定上の転写のポリアデ
ニル化信号、すなわち、ＡＡＴＡＡＡはヌクレオチソ１
４１１に存在する。こうして、第５図における配列から
予測さｈ６ＰＲＶ　ＴＫ（７）分子量は４０，６１０ダ
ルトンである。これは他のアルファヘルペスウィルスＴ
Ｋの分子量に類似する。
５０を超える異る制限ヌクレアーゼについての制限ヌク
レアーゼ部位が、第４図に示されるヌクレオチド配列か
ら予測される０例えば、５ａｃＩ部位はヌクレオチド１
１５．９２５．１００７．１０３４および１０７３にお
ける配列から予測されるノテ、ｐＢＢ−１１ｄｉ　５ａ
ｃＡ２６において欠失したＳ　ａ　ｃ　Ｉ−Ｃ断片（下
を参照）は、長さが１４８ｂｐ、すなわち、ヌクレオチ
ド９２５から１０７３までであろう。この欠失はまた翻
訳リーディングフレームを変化させる。なぜなら、欠失
は３つに分画不可能である、すなわち、コドンは３つの
ヌクレオチドを含有するからである。さらに、ＳｍａＩ
部位はヌクレオチド４．４０２および７６３において予
測され、そしてＸ　ｈ　ｏ　ＩおよびＭ　ｌ　ｕ　Ｉ部
位はそれぞれヌクレオチド１１００および１１１０にお
いて予測される。これらの予測はｐＢＢ−１１の制限ヌ
クレオチド地図と一致しく第４図参照）そして他の欠失
突然変異体を作るための一緒に密接する部位にっいて精
確なデータを提供する。さらに、２つの部位がＸｍａＩ
ＩＩについて予測され、３つの部位がＢｇｌＩおよびＨ
ｉｎｃＩＩについて予測され、そして５つの部位が５ａ
ｃＩＩについて予測される。これらの制限部位を使用し
て、本発明の代わりの交雑プラスミド、こうして他のｔ
ｋ−欠失突然変異体を構成することができる。
Ｅ、　ＢＢ−１１プラスミ　ゝ 前述のように、ＰＲＹの組み換えｔｋ−欠失突然変異体
の特異的なかつ高い効率の工学（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ）について、ｔｋ遺伝子の解読区域中に欠失をもち、
しかも欠失に隣接する５′および３′部位の両者に少な
くとも４００　ｂ　ｐのＰＲＹヌクレオチド配列を含有
してＰＲＶ　ｔｋ”　ＤＮＡのｔｋ遺伝子との相同組み
換えを促進するプラスミドを必要とする。これらの性質
をもつプラスミドを構成するために、プラスミドｐＢＢ
−１１を制限ヌクレアーゼ５ａｃＩで消化し、次いで前
述のようにファージ　Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼで再結合し
た（第４図参照）。
次いで、Ｅ、ｃｏｌｔ、Ｋ１２株ＲＲＩを前述のように
得られるプラスミドで形質転換し、そして生産されたプ
ラスミド　ＤＮＡを前述のように分離した。次いで、候
補の欠失プラスミドのＤＮＡを前述のように７ガロース
ゲルの電気泳動により分析した。ｐＢＢ−１１の５ａｃ
Ｉ断片の欠失を含有する、すなわち、ＰＲＶ　（ＢＵＫ
）ＢａｍＨＩ−１１５ａｃＩ−Ａおよび５ａｃＩ−Ｃ断
片を含有するｐＢＢ−１１ｄｉ　５ａｃＡ２６と表示す
るプラスミドを分離した（第４図参照）、ｐ１３１３−
１１　ｄｉ　５ａｃＡ２６の制限地図は第４図に示され
ている。５ａｃＩ−Ｃ断片はｔｋ遺伝子の解読区域の部
分を含有し、一方５ａｃＩ−Ｂ断片から下流の５ａｃＩ
−Ａ断片はＰＲＶ　ｔｋ遺伝子のいずれをも含有しない
ことに注意すべきである。５ａｃＩ−Ａ断片はｔｋ遺伝
子に以外のＰＲＶ遺伝子を符合化する可能性が最もある
（第４図参照）。
Ｆ、　ＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）の組み換えｔｋ
−ノ　の ＰＲＶ　ｔｋ−１すなわち、ＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ）
（７）無傷のＤＮＡとＰＲＶ　ｔｋ遺伝子の解読区域を
含有する交雑プラスミド、すなわち、ｐＢＢ−１１との
間の相同組み換えは、ＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）
−表示する復帰変異体ウィルス中の機能的ｔｋ＋遺伝子
を救済することを上に示した。
相同組み換えにより、ｔｋ遺伝子中のＰＲＹ欠失突然変
異体を得るために、ＰＲＶ　ｔｋ＋の無傷のＤＮＡおよ
びｔｋ遺伝子の解読区域中に欠失を含有する交雑プラス
ミドを用いて出発することが必要である。この型の交雑
に従い得られた子孫のウィルスは、親ＰＲＶ　ｔｋ＋か
ら主としてなる。こうして、収穫物中でＰＲＶ　ｔｋ−
について強化するためには、ａｒａＴを含有する選択的
培地を使用する。なぜなら、ａｒａＴはＰＲＶｔｋ＋の
反復を阻害し、そしてｔｋ−ウィルスの発芽後生育（ｏ
ｕｔｇｒｏｗｔｈ）を助けるからである。
ＰＲＹのｔｋ−欠失突然変異体のこの構成について選択
した交雑プラスミドはｐＢＢ−１１ｄＩ　５ａｃＡ２６
であった。組み換え工程について選択したＰＲＹ　ｔｋ
”はＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）であった。
下表６中のデータが明らかに示すように、ＰＲＶ　（Ｂ
ＵＫ−５Ａ）は親ＰＲＶ　（ＢＵＫ−５）よりもかなり
有毒ではなく、そして復帰変異体のＰＲＶ　（ＢＵＫ−
５Ａ−Ｒ１）は中間の毒性を有し、これは前述の突然変
異誘発および選択工程の結果であり、ＰＲＹ　（ＢＵＫ
−５Ａ−Ｒ１）ＤＮＡはＰＲＶ　（ＢＵＫ−５）ＤＮＡ
Ｊ：りも好１１゜く、あるいは欠失突然変異体の構成に
ＰＲＹのｔｋ十場の株（ｆ　ｉ　ｅ　ｌｄ　ｓｔ　ｒａ
ｔ　ｎｓ）　（７）ＤＮＡよりも好ましい。
ＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）の組み換えｔｋ−欠失
突然変異体の構成は、次の方法で特別に実施した：Ｒａ
ｂ−９細胞を６０ｍｍのペトリ皿（０、５Ｘ　１０’細
細胞器）中に接種し、そして３７℃において３６時間イ
ンキュベーションした。培養物を前述のようにＰＲＹ　
（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）とｐＢＢ−１１ｄｉ　５ａｃＡ
２６ＤＮＡとの混合物で同時トランスフェクションした
。収−したウィルスを生長培地中で一７０℃において凍
結し′て貯蔵した。次いで、同時トランスフェクション
　（ｃｏ−ｔ　ｒａｎｓｆｅｃｔ　ｉ　。
ｎ）から収穫したウィルスを融解し、超音波処理し、そ
しテ１００　ｇｇ／ｍ　１ｃ７）ａ　ｒ　ａＴを補充し
た生長培地で希釈した。
ＰＲＹ　ｔｋ−欠失ウィルスについて強化するために、
８オンスのびん内の１００ｇｇ／ｍｌのａｒａＴを含有
する生長培地中のＲａｂ（ＢＵ）細胞の全面単分子層培
養物中で前記の希釈したウィルスを継代培養した。
３７℃において１時間吸収した後、感染させた細胞の単
分子層を、１立の水につき８．０ｇのＮａｃｌ、０．４
ｇ（７）ＫＣｌ、０．１ｇのグルコースおよび０．０２
ｇのフェノールレッドからなる溶液（以後「ＧＫＮ」）
で３回洗浄し、次いで１００　ＪＬ　ｇ　／　ｍ　ｌの
ａｒａＴを含有する生長培地を添加した。３４．５℃に
おいてさらに４８時間インキユベーシゴンした後、ウィ
ルスを収穫した。
第１選択的継代培養の収穫物の滴定による第２選択的工
程およびプラーク精製を、前述のように、１１００７ｔ
／ｍｌのａｒａＴの存在下にＲａｂ（ＢＵ）細胞中で実
施した。
欠失プラスミドｐＢＢ−１１ｄｉ　５ａｃＡ２６に欠け
る対照トランスフェクションにおいて、ａｒａＴに対し
て抵抗性の自然突然変異体を分離したが、その頻度はｐ
ＢＢ−１１ｄｉ　５ａｃＡ２６で同時トランスフェクシ
ョンするときのわずかに１／４であった。
次いで、ｔ　ｋ−ＤＫを有する候補の組み換えＰＲＶを
個々のａｒａＴ抵抗性プラークから不規則に採取し、そ
してウィルスのプールを調製した。
４つの候補、すなわち、ＰＲＹ　（ＢＵＫ−ｄ　１１）
、ＰＲＶ（ＢＵＫ−ｄｉ　２）、ＰＲＶ（ＢＵＫ−ｄｉ
　３）およびＰＲＹ　（ＢＵＫ−ｄｌ　４）と表示する
候補を得た。ＰＲＹ　（ＢＵＫ−ｄｉ　３）はアメリカ
ン・タイプ・カルチャーコレクシ、ン（ｔｈｅ　Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ）にｔ−Ｊｌ、’てＡＴｃｃ　Ｎｏ　、ＶＲ−
２０７４で受託された。
Ｇ、　分子の交雑化のためのプローブを調製するた　の
　ＢＢ−１１ＤＮＡの二−り　−欠失が上で得られる候
補の欠失突然変異体のｔｋ遺伝子中に存在することを立
証するために、分゛子の交雑化の研究をプローブとして
ｐＢＢ−１１ＤＮＡを使用して実施した。ｐＢＢ−１１
プローブは次の方法で得た。
精製したプラスミドｐＢＢ−１１ＤＮＡを次の方法でニ
ック翻訳（ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ）するこ
とにより放射標識した。６．０ｐモルのＰＢＳ、ｐＨ７
，４；　１．８ナノモルのｄＡＴＰ；１．８ナノモルの
ｄＧＴＰ；　Ｏ，１ｍＣ１の［α−３２Ｐ］　−ｄＴＴ
Ｐ（４００Ｃｉ／ミリモル）；０．１ｍＣ１の［（Ｘ−
”　２Ｐｌ　−ｄＣＴＰ　（４００Ｃｉ／ミリモル）　
（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈａｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
を含有する反応混合物の２５ｐ文に、約１．０ｇｇのＰ
ＢＢ−１１を添加した。次いで、約ｉ、ｏ、ｔｕのＤＮ
ａｓｅ　Ｉ　（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中（７）１゜３
３ｎｇを添加し、そして反応混合物を１分間室温におい
て静置した。次に、反応混合物を１．０終文の旦ユ　ｃ
ｏｌｔ、ＤＮＡ　ポリメラーゼＩ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ−ＭａｎｎｈｅｉｍＢｉ　ｃｈｅｍｆ　ｃａｌｓ）
中の５．０単位と一緒にインキュベーションした。特定
の活性が２×１０”　ｃ　ｐｍ／＃ｉ、ｇｃ７）ＤＮＡ
になったとき、すなわち、約３時間において、反応を１
０ｇＭの０゜２５ＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ７，４）の添加
および６８℃の１０分間の加熱により停止させた。次い
で、キャリアーとして、ＴＥ緩衝液中の５．０ｍｇ／ｍ
ｌの超音波処理したサケの精子のＤＮＡからなる溶液の
５０ｐ、ｌを前記混合物へ添加し、モしチー−−／　り
翻訳したＤＮＡを５ｅｐｈａｄｅｘＧ５０（微細）カラ
ムクロマトグラフィーにかけ、１０　ｍＭ（７）Ｎ　ａ
Ｃｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩんｐＨ７，５，２，
０ｍＭのＥＤＴＡ−ｔ’溶離することにより精製した。
得られる［３２ｐｌ標識ニツク翻訳ＤＮＡを水浴中で２
０分間沸騰させた後ＤＮＡ−ＤＮＡ交雑化実験において
プローブとして使用し、そして氷上で急冷して１木鎖Ｄ
ＮＡを形成した（Ｒｉ　ｇ　ｂｙ、Ｐ、Ｗ、Ｊ、、Ｄｉ
ｅｃｋｍａｎｎ。
Ｍ、、Ｒｈｏｄｅｓ、Ｇ、、およびＢｅｒｇ。
Ｐ、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１１３：２３７−２５１
　（１９７７）参照）、。
Ｈ，ｐＢＢ−１１ＤＮＡを使用するＰＲＶＤＮＡの　ヒ 菌株ＩＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）、ＰＲＶ（ＢＵ
Ｋ−ｄｉ　１）、ＰＲＹ（ＢＵＫ−ｄｉ２）、ＰＲＶ（
ＢＵＫ−ｄｉ　３）８よびＰＲＹ（ＢＵＫ−ｄｉ　４）
の各々からのＤＮＡの０゜６終ｇを、制限ヌクレアーゼ
、ＳａｍＩ　（Ｎ’ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａ
ｂｓ、Ｉｎｃ、）、５ｓｔＩ　［５ａｃＩのインシゾマ
−（ｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒ）］　（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎ
ｃ、）およびＢａｍＨＩで酵素供給者により特定された
条件下で切り離し、そして断片を０．６％（Ｗ／Ｖ）の
アガロース上で３５ボルト（一定電圧）および４°Ｃに
おいて１６時間電気泳動することにより分離した。電気
泳動緩衝液は、０　、０４Ｍ（７）Ｔ　ｒ　ｉ　ｚｍａ
塩基、０．０３Ｍ（７）ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８，１お
よび０．００１ＭのＥＤＴＡからなっていた。Ｃ１ａＩ
切り離しプラスミド、ｐＭＡＲ４（１３、６ｋ　ｂ）　
、ｐＭＨ１１０（４，４ｋｂ）およびｐＡＧｏ　（６，
４ｋｂ）、ファージ　ｌａｍｂｄａ　ＤＮＡのＨｉｎｄ
ＩＩＩ断片、およびファージ　＄Ｘ１７４　ＲＦ　ＤＮ
ＡのＨａｅＩＩＩ断片をまた遺伝標識として電気泳動し
た。結果を第６Ａ図および第６Ｂ図に示す。レーン（ｌ
ａｎｅ）１．６および１１＋ＰＲＶ（ＢＵＫ−ｄｉ　４
）；レーン２．７および１２：ＰＲＶ（ＢＵＫ−ｄｉ　
３）；レーン３．８および１３：ＰＲＶ（ＢＵＫ−ｄｉ
　２）；Ｌ／−７４，９および１４　：　ＰＲＶ　（Ｂ
ＵＫ−ｄｌ　１）；Ｌ／−ｙ５．１０おＪ：びｌ　５　
：　ＰＲＶ（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）；レーン１６：Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ　入およびＨａｅＩＩＩ　φｘ１７４断片（
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ、）
；レーア１７：Ｃ１ａＩ切り離しプラスミドｐＭＡＲ４
（１３，６ｋｂ）、ｐＡＧ。
（６，４ｋｂ）、およびｐＭＨｌｌｏ（４，４ｋｂ）遺
伝標識ＤＮＡ　（Ｋｉ　ｄ　、Ｓ、、Ｑａｖ　ｉ　。
Ｈ，、Ｄｕｂｂｓ、Ｄ、Ｒ，および　０ｔｓｕｋａ、Ｈ
，Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ。
１２　：　２５−３６　（１９８３）参照）。
第６Ａ図　に示すように、４つの候補のうちから３つは
ｔｋ遺伝子を含有するＰＲＹ　（ＢＵＫ−７）ＢａｍＨ
工断片、すなわち、レーン１１．１２および１３に対し
て特異性の変更’（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）を有する
ことがわかった。詳しくは、３．５ｋｂのＢａｍＨＩ断
片は消失し、そして約３．３ｋｂの新しい断片が現われ
た。この結果はＰＲＹ　ｔｋ遺伝子からのほぼ２００　
ｂ　ｐの５ａｃＩ−Ｃ断片の欠失と一致する。
電気泳動後、アガロースゲル中の分離したＤＮＡ　制限
断片を次の方法でニトロセルロースのフィルター（Ｓｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）へ移した
：　１　、ＯＭ（７）ＫＯＨを含有するガラス支持トレ
ー中にアガロースゲルを室温において３０分間入れ、次
いで、１．０ＭのＴｒｉｓ−ＭＣ１，ｐＨ７，０および
０．６Ｍｃ７）ＮａＣ１を含有するガラス支持トレー中
に室温において６０分間入れた。次いで処理したゲルを
プロット装置（ｂｌｏｔ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）へ移した。
ニトロセルロースのフィルターヲ水中で１０分間、次い
で２０　Ｘ　ＳＳＣ中で５分間予備湿潤化した。次に、
フィルターをゲル上に配置した。
２０’　Ｘ　ＳＳＣを移送流体として使用して、プロッ
ティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を約２４時間道行させた
。付着性のゲルをニトロセルロースのフィルターから除
去し、フィルターを６ＸＳＳＣで洗浄し、室温において
数時間乾燥させ、次いで真空デシケータ−内で６０℃に
おいて一夜乾燥させた。次いで、８０”Ｏにおいて２時
間ベーキング（ｂａｋｉｎｇ）した。ニトロセルロース
のフィルターをデシケータ−から取り出し、ディジー（
Ｄａｚｅｙ）のシール・ア・ミール（ｓｅａｌ−ａ−ｍ
ｅａｌ）料理袋に入れた（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、
、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、９８：５０３−５１３　（
１９７５）参照）。
フィルターをまず６０°Ｃにおいて一夜５０　ｍ　ｌの
変性デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）の溶液で処理した
。前記溶液は３　Ｘ　ＳＳＣ，０，０２％（Ｗ／Ｖ）の
ポリビニルピロリドン、０．０２％（Ｗ／Ｖ）のフィコ
ール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．０２％（ｗ　／　ｖ　）の
ＢＳＡ、５０　ｐ−ｇ　／　ｍ　ｌのアルカリ性サケ精
子ＤＮＡおよび１０　ｇ　ｇ　／　ｍｌのポリ（Ａ）か
らなっていた。１０ｍ１の０゜２　Ｎ　（１’）　Ｎ　
ａ　ＯＨ中に５０ｍｇのサケ精子ＤＮＡを溶解し、１０
０°Ｃに２０分間加熱してＤＮＡを変性しかつ約０．４
ｋｂのセグメントに剪断し、次いで０　、２　ｍ　ｌの
ＩＯＮのＨＣｌで中和することにより調製した約５．０
ｍｇ／ｍｌの原料溶液から、゛アルカリ性サケ精子ＤＮ
Ａを添加した。
次いで、変性デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）の溶液を
、５０％（Ｖ／Ｖ）のホルムアルデヒド、０．６ＭのＮ
ａＣ１，０、２ＭノＴｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｌ、ｐＨ８，
０，０，Ｑ２ＭのＥＤＴＡ、０．１％（Ｗ／Ｖ）のドデ
シル硫酸ナトリウム、５０　ｐ−ｇ　／　ｍ　Ｉのアル
カリ性サケ精子ＤＮＡ、および１０１ｂ　ｇ　／　ｍ　
ｌのポリ（Ａ）からなる交雑化緩衝液の５０　ｍ　ｌで
置換した。次に、気泡を袋から絞り出し、次いでそれを
オスター争タッチーア−マチック・バッグ・シーラー（
０，５ｔｅｒ　Ｔｏｕｃｈ−ａ−Ｍａｔｉｃ　Ｂａｇ　
５ｅａｌｅｒ）でシールし、振盪機上で３７°Ｃにおい
て１時間インキュベーションした。
その後、前述のようにして得られた、１本鎖［３２ｐ］
ニック翻訳ＰＢＢ−１１ＤＮＡの、約１０’ｃｐｍおよ
び５０ナノグラムを含有する約１．０’ｍｌを、袋の側
面の角に穴を開けることにより３．０ｍｌの注射器で袋
に添加した。次ぎに、袋を再シールし、振盪機上で４８
時間まで３７°Ｃにおいてインキュベーションして交雑
化を進行させた。
交雑化が完結した後、袋を切り、溶液をデカンテーショ
ンした。次いで、フィルターを注意して除去し、そして
最初の洗浄のためであるが、いずれの洗浄においてもポ
リ（Ａ）を含まない、５０ｐ−ｇ／ｍｌの変性サケ精子
ＤＮＡを含有する約１００ｍ１の交雑化緩衝ｉを含むト
レー中に入れた。フィルターを３０分間３７℃において
５回おだやかに振盪させながら洗浄した。次に、フィル
ターを３０分間３７°Ｃにおいて０．３　Ｘ　ＳＳＣで
、次いで０．１　Ｘ　ＳＳＤで洗浄し、濾紙上に置いて
室温において一夜乾燥させた。
オートラジオグラフィーのため、フィルターをサラン・
ラップで覆われた薄い片の厚紙上に再び配置し、そして
増感紙をもつコダック（Ｋ　ｏ　ｄ　ａｋ）Ｘ−Ｏｍａ
ｔ　ＲＸＲ２フィ）Ｌｚハムへ７０℃において５時間な
いし２日間露光した。
第６Ｂ図に示すように、［３２ｐ］標識ｐＢＢ−１１ブ
ローブト（ｐｒｏｂｅｄ）ゲルのオートラジオグラフィ
ーにより、ＰＲＶ　（ＢＵＫ−ｄ　ｌｌ）は親ＰＲＶ　
（ＢＵＫ−５Ａ　Ｒ１）（７）それに同一の制限パター
ンを有する自然ｔｋ−突然変異体であり、これに対して
ＰＲＶ　（ＢＵＫ−ｄ　１２）、ＰＲＶ（ＢＵＫ−ｄｉ
　３）およびＰＲＶ（ＢＵＫ−ｄｉ　４）はｔｋ−欠失
突然変異体であることが証明された。さらに、第６Ｂ図
から明らかなように、ｔｋ遺伝子の５ａｃＩ−Ｃ断片は
組み換えウィルスＰＲＶ　（ＢＵＫ−ｄ　１２）、ＰＲ
Ｖ（ＢＵＫ−ｄｉ　３）おＪ：びＰＲＶ（ＢＵＫ−ｄｉ
　４）においで欠失していた。この欠失は約１００〜２
００ｂｐであることがわカッた。詳しくは、３．５ｋｂ
のＢａｍＨＩ断片が消失し、そして約３．３ｋｂの新し
い断片が現われた（第６Ｂ図、レーン１１−１３参照）
。さらに、変更はｐＢＢ−１１の１．８ｋｂのＳｍａ工
断片中に見い出された。レーン１〜３は、３つの候補の
、上に同定した欠失突然変異体において、この１．８ｋ
ｂのＳ　ｍ　ａ　Ｉ断片は期待するように約１．６ｋｂ
に短くなったことを示す（第４図参照）。５ｓｔＩ処理
した群では第６Ｂ図において差は明らかではない。なぜ
なら、非常に小さい、すなわち、１００ｂｐより小さい
、ＤＮＡ断片はニトロセルロースのフィルターへ結合す
ることができないからである。
一実］１組良− ｔｋ＋復帰変異体についてのＰＲＶ　ｔｋ−１、’　５
ｔａｃｋ 上の実施例１および２により分離されたＰＲＶｔｋ−突
然変異体の伸長（ｐｒｏｐａｇａｔｉｎ）の間ｔｋ＋に
対する復帰変異体が自然じ生ずるかどうかを研究するた
めに、次のプラークのオートグラフィー実験（Ｔｅｎｓ
ｅｒ、Ｒ。
Ｂ、、Ｊｏｎｅｓ、Ｊ、Ｃ，、Ｒｅ５ｓｅｌ。
Ｓ、Ｊ、、および　Ｆｒａｌｔｓｈ、Ｆ。
Ａ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
よ７　：　１２２−１２７　（１９８３）参照）を実施
した。
２Ｘ１０’　（７）Ｒａｂ　（ＢＵ）細胞を１００ｍｍ
のプラスチックのペトリ皿内の１０ｍ１の生長培地中に
接種し、そして準全面単分子層が得られるまで、３７°
Ｃにおいて２〜３日間インキュベーションした。次に、
生長培地を取り出し、単分子層をＧＫＮで洗浄した。次
いで、二重反復実験の皿をＰＲＶ　（ＢＵＫ−ｄ　１　
３）、ＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ）、無ウィルス（消極的
対照として）、またはＰＲＶ　（ＢＵＫ−５）（積極的
対［して）で感染させた。各ウィルスを用いて１皿を１
０２ｐ、ｆ、ｕ、７皿、１０３ｐ、ｆ、ｕ、／皿、１０
’　ｐ’、ｆ、ｕ、７皿、または１０１ｉ　ｐ。
ｆ、ｕ、７皿を含有する０、５ｍｌで接種した。
３７℃において１時間の吸収期間後、生長培地中に溶解
した０、５％（Ｗ／Ｖ）のメチルセルロースからなる溶
液の１０ｍ１を添加し、そしてインキュベーションを３
４．５℃において３日間続けた。次いで、このメチルセ
ルロース溶液を毛管ピペットで取り出し、そして５．０
ｍｌの生長培地と置換した。その後、［１４Ｃ］−チミ
ジン（３，０ＩＬＣｉ／皿）を６時間添加してＤＮＡを
標識付けた。
次に、生長培地を取り出し、単分子層を１０ＪＬｇ　／
　ｍ　ｌの非放射性チミジン含有ＧＫＮで洗浄し、そし
て細胞を１５ｍ１のエタノールで２３°Ｃにおいて５分
間添加することにより固定した０次いで、細胞を５．０
ｍｌの０．１％（Ｗ／Ｖ）の結晶質バイオレット溶液で
室温において５分間着色し、過剰の水道水で洗浄し、−
夜空気乾燥した。次いで、固定した細胞を含有するペト
リー皿の底をフジ（Ｆｕｊｉ）ＲＸＸ線フィルムと１週
間接触させた。このフィルムを現像すると、ＰＲＶ　ｔ
ｋ＋プラークは同位元素の組み込みにｒる暗いリムをも
つ円形として現われ、これに対してｔｋ−プラークは標
識されず、すなわち、暗色のリムを持たなかった。この
結果が証明するように、ＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１
）の感染の子孫、したがって、ｔｋ”表現型の子孫、か
ら得られるプラークは高度に標識される。これと対照的
に、ＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ）　およびＰＲＹ　（ＢＵ
Ｋ−ｄｉ　３）の子孫、したがって、ｔｋ−表現型の子
孫、から得られるプラークは標識されない。コウシテ、
ＰＲＶ　ｔ　ｋ”　ヘ（７）ＰＲＹ　ｔ　ｋ−の復帰は
検出されなかった。すなわち、ＰＲＹ（ＢＵＫ−５Ａ）
およびＰＲＶ　（ＢＵＫ−ｄ　１３）についての自然復
帰（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）速
度は１Ｏ−５より小である。
種々のＰＲＶ株のＴＫ活性を次の方法でアッセイした。
０．０１ＭのＫＣＩ、０．００１５ＭのＭｇＣ１２，お
よび０　、０１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，４から
なる低張性緩衝液の５容量中に懸濁した細胞沈殿物をダ
ウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）均質化することにより、６時間
の後感染において、約１０８のモック（ｍ　ｏ　ｃ　ｋ
）感染またはＰＲＶ感染Ｒａｂ（ＢＵ）から細胞質ゾル
を調製した。次いで、１．５ＭのＫＣＩ、０．０３Ｍの
２−メルカプトエタノール、２５％（Ｖ／Ｖ）のグリセ
ロールおよび０．５Ｍのイプシロン　アミノカプロン酸
を含有する溶液の１７９容量を添加して、ＫＣＩ濃度を
等重性に調節し、かつ酵素を安定化した。このホモジネ
ートを４℃において４時間スピア：Ｉ　（Ｓｐｉｎｃｏ
）Ｎｏ、６５　ローターで４０．０００ｒｐｍにおいて
遠心し、そして上澄みをバイアルに移した。アリコート
をタンパク質濃度の決定およびＴＫ活性のアッセイのた
めに取った。
ＴＫアッセイは、３つの異る酵素レベル、例えば、７５
，１１３および１８８終ｇのタンパク質／アッセイ管に
おいて、３８℃において１０分間ゼロ次の運動力学に標
準化した条件下で実施した。反応混合物はＯ，１ｍＭの
［３Ｈ］−デオキシチミジン（２９１ｃｐｍ／ピコモル
のデオキシチミジン）、２．０ｍＭのＡＴＰ　、１．０
ｍＭのＭｇＣｌ２、ｌ　ＯｍＭ（７）ＫＦ、ｌ　ＯＯｍ
Ｍ（７）Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８，０、およびタン
パク質を合計０．１２５ｍ１の容量で含有した。反応を
０．０２５ｍ１（７）５０％（ｗ／ｖ）のトリクａａ酢
酸の添加により停止させた。１１０００Ｘの低速遠心に
より沈殿したタンパク質を除去した後、０．０２ｍ１の
部分をＤＥＡＥ−セルロースのシート（Ｗｈ　ａ　ｔ　
ｍａ　ｎ）上へスポッテイング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）し
た。反応の［”Ｈ］−ｄＴＭＰ生成物は、基質の［８１
（］−デオキシチミジンから、１７５ｍ１のギ酸および
６．３ｇのギ酸アンモニウムを合計１１の容量の水へ添
加することにより行った溶媒中のクロマトグラフィーに
より分離した。［”　Ｈ］−ｄＴＭＰのスポットなＵＶ
光により可視化し、紙から切った０次いで、各スポット
における放射能を液体シンチレーシせン分光分析により
決定した（Ｋｉｔ、Ｓ、および　。ａｖ４．Ｈ，Ｖｉｒ
ｏｌｏ　１３０：　３８１−３８９　（１９８３）参照
）。結果を下表３に示す。
六−一旦 Ｒａｂ（ＢＵ）＠胞のチミジンキナーゼ活性Ｒａｂ（Ｂ
ＬＪ）細胞の感染に使用したＰＲＶ株　ＴＫ活性モック
感染Ｒａｂ（ＢＵ）　０，０９ ＰＲＶ　（８ＵＫ−５＞　４．８ ＰＲＶ（ＢｔＪＫ−５△−Ｒ１）　３．５ＰＲＶ　（Ｂ
ＬＩＫ−５Ａ＞　０．０３ＰＲＶ　（ＢＵＫ−ｄｌ　２
　＞　０．０３ＰＲＶ　（ＢＬＩＫ−ｄｌ　３　）　０
，０２ＰＲＶ　（ＢＵＫ−ｄｌ　４　）　０．０３表３
から明らかなように、（ｉ）Ｒａｂ　（ＢＵ）細胞、す
なわち５．ｔｋ−細胞、は無視しうるＴＫ活性を有する
；（ｉｉ）ＴＫ活性はＲａｂ（Ｂ　Ｕ）細胞によりｔｋ
＋ウィルスＰＲＹ　（ＢＵＫ−５）で感染後に獲得され
るが、ＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ）、ＰＲＹ　（ＢＵＫ−
ｄｌ　２）、ＰＲＶ　（ＢＵＫ−ｄ　ｌ　３）またはＰ
ＲＹ　（ＢＵＫ−ｄｌ　４）で感染後に獲得されない；
そして（ｉｉｆ）ＴＫはまたＲａｂ（ＢＵ）細胞がｔｋ
＋ウィルスＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）　で感染す
した後獲得される。
いくつかの遺伝子はアルファヘルペスウィルス類が病気
を起こす能力に寄与すること、すなわち、両力がマルチ
ジェニック（ｍｕｌｔｉｇｅｎｉｃ）であることは一般
に認められている０例えば、アルファヘルペスウィルス
類は潜在性を確立し、神経系を上昇しそして脳炎を引き
起こす、または妊娠した動物において流産を引き起こす
能力において異ることが知られている。前述のように、
ｔｋ遺伝子は両力に寄与する遺伝子の１つであるが、両
力に寄与する唯一の遺伝子ではない。
すなわち、ＰＲＶブカレスト（Ｂｕｃｈａｒｅｓｔ）株
およびバルク（Ｂａｒｔｈａ）株はＰＲＹのアウジェス
ズキイ（Ａｕｊｅｓｚｋｙ）株または場の分離物（ｆｉ
ｅｌｄ　１ｓｏｌａｔｅｓ）に比較してブタについて砥
衰５されるが、前述のウィルスのすべてはＰＲＹ　ｔｋ
＋株である。この実施例は、ＰＲＹ　（ＢＵＫ）株がｔ
ｋ遺伝子をｔｋ−表現型に突然変異させることによりさ
らに減衰されうることを立証する。
ｔｋ−ウィルスの分離に利用する親ＰＲＹ株は、前述の
ように、ＰＲＹ　（ＢＵＫ）、すなわち、ニワトリ細胞
中で多数回継代培養することにより前もって減衰させた
ｔｋ十株、であり、そしてブタを７ウジエスズキイ（Ａ
ｕｊｅｓｚｋｙ）の病気に対して保護することにおいて
有用であることがわかった（Ｓｋｏｄａ、Ｒ，、Ｂｒａ
ｕｎｅ　ｒ　、１．．５ａｄｅｃｋｙ　、Ｅ、、および
　Ｍａｙｅｒ、Ｖ、　Ａｃｔａ　Ｖｉｒｏｌ　旦：　ｌ
−９（１９６４）参照）。ＰＲＹ　（ＢＵＫ）はまたウ
シについて部分的に減衰されることが示されたが、この
ウィルスの低い投与量はウサギおよびマウスにおいて致
死の感染を生成する。こうして、実験動物のＰＲＹに対
する感受性は、これらの動物において本発明の遺伝的に
操作したＰＲＶｔｋ−株の両力の適当な測定手段である
。
本発明のウィルスの両力を評価するために、マウスをＰ
ＲＶ　（ＢＵＫ−５）、ＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ）およ
びＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）で腹腔内に接種した
。結果を下表４に示す。
Ｌの表４の実験ｌに示す結果から明らかなように、腹腔
内接種について、親ＰＲＹ　（ＢＵＫ−５）、°すなわ
ち、ｔｋ＋ウィルス、についてのＬＤ６０値は約６８ｐ
、ｆ、ｕ、／マウスであり、そしてＰＲＶ　（ＢＵＫ−
５Ａ）、すなわち、ｔｋ−ウィルス、について、ＬＤ５
゜値はｌｏ７より大きカッタ。ＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ
）は、マタ、マウスにおける腹腔内接種後、両力がｔｋ
＋ウィルスＰ　ＲＶ　（Ｂ　Ｕ　Ｋ　−５）　（Ｌ　Ｄ
　ｓ。＝２）よりも低い（ＬＤｇ　ｏ　＝５００）こと
がわかった。さらに、表４における実験ｌの結果が示す
ように、プラスミドｐＢＢ−１１からＰＲＹ　ｔｋ遺伝
子を受け取ったＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）、すな
わち、ｔｋ＋ウィルス、は約４８００の中間のＬＤ、　
ｏを有した。この事実が証明するように、ＰＲＹ（７）
両力は機能的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ｔｋ遺伝子をＰ
ＲＹに回復させることにより有意に増加することができ
、そしてこの遺伝子は病原性に対して重要である。さら
に、ＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）は中間の両力を有
するので、結果が示すように、実施例１において例示さ
れている本発明の第１実施態様におけるＰＲＹを減衰さ
せる方法は、ｔｋ遺伝子に影響を及ぼすものを越えた変
化をウィルスに導入し、そしてこれらの変化は減衰を増
大する。さらに、ＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）を実
施例２においてｔｋ−欠失突然変異体を生成するための
基質として使用したので、追加の減衰性突然変異はＰＲ
Ｙ　ｔｋ−欠失突然変異体において保持される。
ｔｋ−欠失突然変異体、ＰＲＹ　（ＢＵＫ−ｄ　１３）
、の皮下接種を用いる追加の研究は、上の表４の実験２
に示されている。未希釈のｔｋ−欠失突然変異体、ＰＲ
Ｖ　（ＢＵＫ−ｄ　１　３）による感染、すなわち、１
０”　ｐ、ｆ、ｕ、７ｍ１ｃ７）力価を有するウィルス
の０　、１　ｍ　ｌの接種に対してマウスは生存した。
他方において、１０４のｐ、、　ｆ　、　ｕ　、　（７
）ＰＲＶ　（ＢＵＫ−５）は５匹ツマウスのうち４匹を
殺し、そしてｌｏ３のＰ、ｆ。
Ｕ、は５匹のマウスのうち２匹を殺した。
また、１〜ｌｏｐ、ｆ、ｕ、のＰＲＹ　（ＢＵＫ−５）
の皮下接種後、致死の感染はすべての感染させた５〜６
ポンドのニューシーラントのウサギにおいて４〜６日の
うちに生成する。しかしながら、１０３〜１０５ｐ、ｆ
、ｕ、のＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ）およびＰＲＹ　（Ｂ
ＵＫ−ｄｌ　３）による感染に対して３匹のウサギのう
ち１匹は生存する。生存しないウサギは死ぬまでより長
い期間、すなわち、７〜１２日を要した。
さらに、ＰＲＶ　（ＢＵＫ−ｄｉ　３）が減少した両力
を有するという指示は、ウシのパイロット試験から得ら
れる。すなわち、両力のあるＰＲＶ株で感染したウシは
、中枢神経系の信号、例えば、腫瘍、運動失調、および
興奮を包含する感染の臨床的信号を発現する。これらの
信号は、接種の６〜７日の期間後に生じ、そしてウシは
数時間以内に、すなわち、病気の信号が現われた後１２
時間以内に死亡する。ＰＲＹ抗体についてゼロ陰性の（
ｚ　６　ｒ□−ｎｅｇａｔ　ｉ　ｖｅ）ウシにおいて、
ＬＤＩｌｏ値は鼻内に投与した両力のあるウィルスにつ
いて約ｌＯ４〜１０ＩｓのＴＣＩＤ、。であり、そして
筋肉内または皮膚内に投与した両力のあるウィルスにつ
いてよりわずかに低い（Ｓｋｏｄａ、Ｒ，、Ｂｒａｕｎ
ｅｒ、１．．５ａｄｅｃｋｙ、Ｅ、、および　Ｍａｙｅ
ｒ、Ｖ、Ａｃｔａ　Ｖｉｒｏｌ　８：１−１９（１９６
９）および　Ｂｉｒｏｎ、Ｐ、、Ｖａｎｄｅｑｕｅｔｔ
ｅ　、Ｊ　、、Ｐｅｎ５ａｅｒｔ　、Ｍ、Ｂ、およびＬ
ｅｕｎａｎ、Ｊ、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅｔ。
Ｒｅｓ、４３ニア６Ｏ−７６３（１９８２）参照）、Ｉ
ＴＣＩＤｓ　ｏは０．７ｐ、ｆ、ｕ、に等しい。
他方において、２ＸｌＯ’　ｐ、ｆ　、ｕ、（７）ＰＲ
Ｖ　（ＢＵＫ−ｄ　１　３）で筋肉内に接種したウシお
よび２Ｘ　１０８ｐ　、　ｆ　、　ｕ　、ｃ７）ＰＲＹ
　（ＢＵＫ−ｄｉ　３）で鼻内に接種した第２のウシの
両者は、感染に対して生存し、そしていずれのウシも、
腫瘍、運動失調または興奮のような臨床的作用を示さな
かった。この結果が立証するように、ＰＲＶ　（ＢＵＫ
−ｄｉ　３）はまたウシにおけるワクチンとしえ安全に
使用することができる。
−実］１賎Ｊ− ＰＲＶ　ｔｋ＋を用いる対抗（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に
対するワクチン接種した動物の抵ＰＲＹ　ｔｋ−株をワ
クチン接種したマウスがＰＲＶ　ｔｋ＋株の病原性作用
から保護されるかどうかを知るために、ｔｋ＋ウィルス
の致死の投与量を用いる対抗実験を後述するように実施
した。
それぞれＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ）　およびＰＲＹ（Ｂ
ＵＫ−ｄ　ｌ　３）で腹腔内または仙腰椎の感染により
実施例５におけるマウスをワクチン接種してから約３週
間後に、マウスをＰＲＹ　（ＢＵＫ−５）またはＰＲＹ
　（Ａｕ　ｊ）　で感染させた（表５参照）。ワクチン
接種したマウスはｔｋ＋ウィルスのＬ　Ｄ　５ｏの１０
０倍よ２りも多い対抗に対して明らかに抵抗性であった
。ワクチン接種しない対照マウスについて、７匹のうち
で５匹は１０４ｐ　、　ｆ　、　ｕ　、　（７）ＰＲＶ
　（ＢＵＫ　−５）　ニよる腹腔的感染に倒れ、そして
４匹のうち３匹は２Ｘ１０’　ＰＲＹ　（ＢＵＫ−５）
　による皮下感染に倒れた。しかしながら、１０’　〜
１０’　ｐ、ｆ、ｕ。
のＰＲＹ　（ＢｔＪＫ−５Ａ）で前もって腹腔内にワク
チン接種したマウスはいずれも１０４Ｐ、ｆ。
ｕ　、　のＰＲＶ　（ＢＵＫ−５）の感染から死亡せず
、そして１０４または１０’ｐ、ｆ、ｕ、のＰＲＶ　（
ＢＵＫ−５Ａ）でワクチン接種した５匹のマウスのうち
わずかに２匹はＩＯ’ｐ、ｆ、ｕ。
のＰＲＹ　（ＢＵＫ−５）の感染後に死亡した。
１０’ｐ、ｆ、ｕ−のＰＲＶ　（ＢＵＫ−ｄ　１３）で
皮下にワクチン接種したマウスについて、５匹のうち１
匹のみが２Ｘ１０’　ｐ、ｆ、ｕ、のＰＲＶ（ＢＵＫ−
ｉ）により死に、そして５匹のうち１匹のみが２Ｘ１０
’　ｐ、ｆ、ｕ、（７）ＰＲＹ（Ａｕｊ）により死んだ
。
上の結果が明らかに示すように、本発明のＰＲＶ　ｔｋ
−株はＰＲＶ　ｔｋ＋の感染の病原性作用に対してマウ
スを高度に保護する。
マウスはＰＲＶに対してきわめて感受性であり、そして
この実施例において使用した対抗ウィルス投与量は非常
に高く、すなわち、１０４〜１０”ｐ、ｆ、ｕ、であっ
たことに注意すべきである。現場（ｆｉｅｌｄ）の感染
において、ブタまたはウシは１０３〜１０４ｐ、ｆ、ｕ
、より大きいＰＲＶに暴露されることはありえないであ
ろう。こうして、上の結果から、本発明のワクチンのウ
ィルスは現場の条件のもとで有効であろうと信じられる
。
【図面の簡単な説明】
第１図は、例えば、本発明の偽狂犬病ウィルスの株の誘
導を概略的に示す。 第２図は、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩについてのＰＲＹ
　（ＢＵＫ−５）およびＰ（ＢＵＫ−７）のＤＮＡ制限
ヌクレアーゼ地図を示す。ゲノムの独特の短い（Ｕ　ｓ
）領域を限定する逆反復（ｉｎ、ｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐ
ｅａｔ）（ＩＲ）および末端反復（ＴＲ）が示されてい
る。ＵＬはゲノムの独特の長い領域を意味する。 第３図は、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ消化ＰＲＶ（Ａｕ
ｊ）、レーン３および８　；　ＰＲＹ　（ＢＵＫ−５）
　、レーア２および７　；　ＰＲＹ　（ＢＵＫ−ｄｌ　
３）、レーンｌおよび６の臭化エチジウム着色アガロー
スゲルを示す。レーン４および５は、Ｈｉｎｄｍ　入お
よびＨａｅｍ　φｘ１７４櫟１１１ｉ　（ｍａ　ｒ　ｋ
ｅ　ｒ）断片を含有する。 第４図は、例えば、本発明において使用するプ４マ々Ｖ
小詠薯を鉦威酷澹デ；小　、口Ｄ９００山にＰＲＹ　（
ＢＵＫ−７）　のＢａｍＨＩ−１１断片を挿入すると、
交雑プラスミドｐＢＢ−１１が生成する。プラスミドｐ
ＢＢ−１１ｄｌ　５ａｃＡ２６は、ｐＢＢ−１１から１
．ｏｋｂの５ａｃＩ−Ａ断片およびＯ，ｌｋｂの５ａｃ
−Ｃ断片を欠失することにより得られる。 第５図は、ＰＲＹ　ｔｋ遺伝子の解読領域を含有するＰ
ＲＶ　（ＢＵＫ−７）断片のヌクレオチド配列およびそ
の側面に位置する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列を示す。こ
の配列はＰＲＹ　ＴＫ　ｍＲＮＡを生成するために転写
されたＤＮＡ鎖の補体である。 第６図は、ＰＲＶ　ＤＮＡｃ７）ＳｍａＩ、５ｓｔＩお
よびＢａｍＨＩ断片の７ガロースゲルを示す。（Ａ）臭
化エチジウム着色されている。 （Ｂ）特異的ＤＮＡ断片に対する［”　２Ｐ］　４ＩＷ
識ＰＢＢ−１１プローブの交雑化を示すオートラジオグ
ラフ。 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ　、４識別記号 ／／（Ｃ１２Ｎ　１５１００ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ｏ発明者　ソール・キット 庁内整理番号 アメリカ合衆国テキサス用７７０２４ヒユーストン・ウ
インクドライブ　１１９３５ 手続補正書（方式） 昭和６０年５　月３Ｄ　日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第２７４９８０号 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４代　理　人〒１０７ ５、補正命令の日付　昭和６０　年　４　月３０日（発
送日）（１）明細嘗第５４頁第１５行〜第３５頁第１行
に「（５ｋｏｄａ・・・・・・・・・参照）。ｊとおる
を以下のとおり訂正する。 「〔スコダ・アール、プラウナー・アイ、サブツキ−・
イーおよびメイヤー・グイ、［アクタ・ピロロツカＪ（
Ｓｋｏｄα、Ｒｏ。 Ｂｒａｗｎｅｒ、　１．、５ａｄｅｃｋｙ、　Ｅ、、　
ａｎｄｌａｙｅｒ　Ｖ、　Ａｃｔａ　Ｖｉｒｏｌ、）　
８　：　１−９（１９６４）並びにパーサ・エイ［マギ
ー・オーラトルプ・ラゾジャ」（Ｂａｒｔｈα、Ａ。 Ｍａｇｙ、　Ａｔ１ａｔｏｒｖ、　Ｌａｐｊａ）　１６
　：　４２−４５（１９６１）参照〕。」 （２）同第６６頁１６竹〜第３７頁４行に１（Ｋｉｔ・
・・・・・・・・参照）。」とあるを以下の通り訂正す
る。 「〔キット、ニス、：薬理学及び治療学、編者、ニー・
シー・サトレリイ；編者に従う専門家、ティー・シュガ
ー（ペルガモンプレス、リミテッド：オツクスホード）
第４巻、５０１−５８５（１９７９）＜Ｋｉｔ。 ｔｉｃｓ、Ｅｄ、Ａ、Ｃ，５ａｔｏｒｅｌｌｊ　；　５
ｐｅｃｉａ−１ｉｓｔ　５ｕｂｊｅｃｔ　Ｅｄ、、Ｄ、
Ｓｈ、ｗｇａｒ　（Ｐｅｒｇａ−ｒｎ、ｏｎ　ｐｒｅｓ
ｓ、Ｌｔｄ、：　Ｏｘｊ’ｏｒｄ）Ｖｏｌ、４　：５０
１−５８５（１９７９））参照〕。」（３）同６７頁第
７行−３８頁第１行Ｋ［（Ｄｕｂｂｓ・・・・・・・・
・参照）。」とあるを以下の通り訂正する。 「〔ダプス、ディー、アール及びキット、ニス、［ピロ
ロジー４２２：４９３−５０２（１９６４）；キット、
ニス１．ロイング。 ダプリュ、−シー０．ソヨルグンセン、ソー、エヌ、、
ドルクラ、ティー１．及びダブス、ディー、アール、［
プログレス　イン　メディカル　ピロロソーｊ２１：１
３−３４（１９７５）ｉキッド、ニス１．及びクアビ、
エイチ、、「ピロロジー−１１３０：３８１−３８９（
１９８３）及びキッド、ニス０．クアビ、エイチ、、ダ
ブス、ディー、アール１．及びオオツカ、エイチ、［ジ
ャーナル　オグ　メディカルピロロソーＪ　１２：２５
−３６（１９８３）（Ｄｕ、ｂｂｓ、　Ｄ、　Ｒ，ａｎ
ｄ　Ｋｉｔ、　Ｓ、　Ｖｉｒｏｌｏ−ｇ１／　２２：４
９３−５０２（１９６４）。 Ｋｉｔ、Ｓ、、Ｌｅｕｎｇ、Ｗ、−Ｃ，、Ｊｏｒｇｅｎ
ｓｅｎ。 Ｇ、Ｎ、、Ｔｒｋｕｌａ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｄｕｂｂｓ、
、Ｄ。 Ｒ，ｐｒｏｇｒ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、２１　：　１３
−３４　（１９７５）ＨＫｉｄ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｑａ、
ｖｉ。 （１９８５）；　ａｎｄ　Ｋｉｄ、　Ｓ、、　Ｑａ、ｖ
ｉ。 Ｈ，、Ｄｕｂｂｇ、Ｄ、　Ｒ，、ａｎｄ　０ｔｓｕｋａ
、、　Ｈ。 Ｊ、Ｍｉｄ、Ｖｉｒｏｌ、１　２　：　２５−３６（１
９８３Ｎ参照〕。」 （４）同３８頁１５行−５９頁１行に［（Ｋｉｔ・・・
・・・参県）。」とあるを以下の迫り訂正する。 「〔キット、ニス、ロイング、ダブリュ、−シー０．ソ
ヨルグニ／セン、ソー、エヌ、。 ドルクラ、ディー０．及びダブス、ティー。 ７−ル、［プログレス　イン　メディカルピロロジーＪ
　（Ｋｉｔ、　Ｓ、、　Ｌｅｒｂｎｇ、　Ｖ／。 −Ｃ，、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、　Ｇ、　Ｎ、、　Ｔｒｋ
ｕｌａ。 Ｄ、＋　ａｎｄ　ＩＪＭｂｂｂｓ、　Ｄ、　Ｒ，Ｐｒｏ
ｇｒ、　Ａｆｅｄ。 Ｖｉｒｏｌ、）、２１：　１３−３４（１９７５）１参
照。」 （５）同３９’ｊｆｆ１１９行−４０頁１６行に［（Ｆ
ｉｅｌｄ・・・・・・・・・参照）。」とあるを以下の
通り訂正する。 「〔フィールド、エイチ、ジエイ、及びウィルディ、ビ
ー［ジャーナル　オン　）゛イソーン　ケンブリッジＪ
　（Ｆｉｅｌｄ　Ｅ、　Ｊ。 ａｒｒ、ｄ　Ｗｉｌｄｙ、　Ｐ、　Ｊ、　Ｈ’ｙｇ、、
　Ｃａ、ｒｎｂ、　）。 ８１：２６７−２７７（１９７８）ｉフィールド、エイ
テ、、ソエイ、アンダーソン。 ジエイ、アール及びウィルディー、ビー。 ［ジャーナル　オン　ジェネラル　ピロロジーＪ　５９
　（Ｆｉｅｌｄ、　Ｈ，、Ｊ、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ。 ／、　Ｒ，ａｎｄ　Ｗｉｌｄｙ、　ｐ、　Ｊ、　Ｇｅｎ
、　ＶｉｒｏＬ、）。 ５９：９ｌ−９９（１９８２）；クライン。 アール、ソエイ、、デステファノ、イー、。 プラッデイ、イー０．プラツシイ、イー、。 及びフリードマンーキイーン、エイ、イー。 「アーキプス　オン　ピロロジー」（Ｋｌｅ−ｉｎ、　
Ｒ，Ｊ、、　ＤｅＳｔｅｆａｎｏ、　Ａ、、　Ｂｒａｄ
ｙ。 Ｅ、、Ｂｒａｓｙ、Ｅ、、ａｎｄ　Ｆｒｉｅｄｍａｒｒ
、−Ｋｉｅｎ。 Ａ、Ｅ’、Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、）、６５．２３７−
２４６　（１９８０）；プライス、アール。 ダブリュ及びカーン、エイ、［インフエクション　アン
ド　イムニティーＪ　（Ｐｒ１ｃｅ。 Ｒ，Ｗ、　ａｎｄ　Ｋｈａｎ、　Ａ、　Ｉｎｆｅｃｔ、
　Ｉｗｎｕｎ、）。 ３４：５７１−５８０（１９８１）ｉ及びテンサー、ア
ール、ビー６．レッセル、ニス及Ｕｆンスタン、エム、
イー、［ピロロジーＪ　（Ｔｅｎ５ｅｒ、　Ｒ，Ｂ、、
　Ｒｅ５ｓｅｌ、　Ｓ、。 ａｎｄ　Ｉ）ｕｎｓｔａ？Ｉ、　Ｍ、　Ｅ、　Ｖｉｒｏ
ｌｇｙ　）　。 １１２：３２８−３４１　（１９８１）参照〕。」（６
）同４１頁１３行−４２頁２行に「（Ｋｉｔ・出・・参
照）。」とあるを以下の通シ訂正する。 「〔キット、ニス１．クアビ、エム、ダブス。 ディー、アール、及びオオッカ、エイチ。 ［ジャーナル　オン　メディカル　ピロロジーＪ　（Ｋ
ｉｔ、　Ｓ、、　Ｑａｖｉ、　Ｍ、　Ｄｕｂｂｓ、　Ｄ
。 Ｒ，ａｎｄ　０ｔｓ１ｔｋａ、　Ｈ，Ｊ、　Ｒｅｄ、　
Ｖｉｒｏｌ、）。 １２：２５−３６（１９８３）；及びテンザー、アール
、ビー０．レッセル、ニス。 ソエイ、、フラリツシュ、エフ、エイ及びソヨーンズ、
ソエイ、シー、「ソヤーナルオン　ジェネラル　ピロロ
ジー」（Ｔｅｎｓ−ｅｒ、　Ｒ，Ｂ、、　Ｒｅ５ｓｅｌ
、　Ｓ、　Ｊ、、　Ｆｒａｌｉｓｈ。 Ｆ、　Ａ、　ａｎｔｉ　Ｊｏｎｅ８．　Ｊ、　Ｃ，Ｊ、
　Ｇｅｎ。 Ｖｉｒｏｌ、）　、　６４　：　１３６９−１３７３（
１９８３）参肪〕。」 （７）同４３頁ｅ行−４４頁１２行に：　［（Ｃｈ、ｅ
ｎｇ・・・・・・・・・参照）。」とあるを以下の通り
訂正する。 「〔ジエン、ワイ、−シー０．ダツチマン。 ソー０．フォックス、ジエイ、ソエイ、。 ワタナベ、ケイ、エイ、及びマクヒダ、エイサ、［アン
チマイクロバイアル　エーゾェント　アンド　−＼モセ
ラビーＪ　（Ｃｈ、ｅｎｇ。 Ｙ、　−Ｃ，、、Ｄｕｔｓｃｈ、ｒｎａｎ、、　Ｇ、、
　Ｆａｘ、　Ｊ。 Ｊ、、　ｉＶａ、ｔａｎａｂｅ、　Ｋ、　Ａ、　ａｎｄ
　Ｍａｃｈｉｄａ。 Ｈ，ＡｎｔｉｍｉＣｒｏｂ、　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈ、ｅ
ｔｎｏｔｈ、ｅｒ、）。 ２０：４２０−４２３（１９Ｅ’１）；エリオン　ソー
、ビー０．フルマン、ビー、エイ０．ファイフエ、ソエ
イ、エイ、ｌデミランダ、ビー０．ボージャンプ、エル
、。 及びシエツファー、エイチ、ソエイ、［ゾロシーデイン
ダス　オン　ザ　ナショナルアカデミ−オン　サイエン
ス　オン　ザユーエスエイＪ　（Ｅｌｉｏｎ　Ｇ、　Ｂ
、、　Ｆｕｒｒｎａｎ。 Ｐ、　Ａ、、　Ｆｙｆｅ、　Ｊ、　Ａ、、　Ｄｅｍｉｒ
ａｎｄａ、　７’、＋Ｂｅｃｔｒｔｃｌｔ、ａｍｐ、　
Ｌ、、　ａｎｔｉ　５ｃｈａｅｆｆｅｒ、　Ｈ。 、１．　ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ　）　。 ７４：５７１５−５７２０（１９７７）？プルシッフ、
ダブリュ、イー０．ヘン、エム、ニス０．リン、ティー
、−ニス１．及びフィッシャー、ビー、エイチ：「アン
チバイアｋ　へモセラビー」：ウイルス機能の抑制剤の
デザイン、編者ケイ、ケイ、ガラリ（アカデミツク　プ
レス　インコーホレイテッド：ニューヨーク）１９７−
２０６（１９８１）　（Ｐｒｖｔ、５ｏｆｆ、　Ｆ、　
Ｅ、、　Ｃｈｅｎ。 Ｍ、　Ｓ、、　Ｌｉｎ、　Ｔ、　−５，、ａｎｄ　Ｆｉ
ｓｃｈｅｒ。 ｐ、　Ｈ，Ｉｎ　：　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｃｈｅｍｏ
ｔｈｅｒａｐｙ：、Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　Ｉｎｈｉｂｉ
ｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｖｉｒａｌ　Ｆｕｎ−ｃｔｉｏｎｓ、
Ｆ、ｄ、に、に、Ｇａｕｒｉ、（Ａｃａｄｅｔｎ、１ｃ
ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）、ｐｐ
、１９７−２０６（１９８１））：及びベエリセツテイ
、ブイ、及びツエントリー、ソー、エイ、「ツヤ−ナル
　オプ　ピロロジー」。 （Ｖｅｅｒｉｓｅｔｔｙ、　Ｖ、　ａｎｄ　Ｇｅｎｔｒ
ｙ、　Ｇ、　Ａ。 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、４６：９０１−９０８（１９８３
）参採〕。」 （８）同４７頁４行−１５行に［（Ｋｉｔ・・・・・・
・・・・・・参照）。」とあるを以下の通り訂正する。 「〔キット、ニス０．ルング、ダブリュ、−シー０．ヅ
ヨルグンセン、ジー、エヌ、。 ドルクラ、ディー及びダブス、ディー、アール、「プロ
グレス　イン　メゾイカルビｏｏジーｊ　（Ｋｉｔ、　
Ｓ、、　Ｌｒｂｎｇ、　Ｆ、　−Ｃ，。 Ｊｏｒｇｔｔ？１．ｓｅｎ、　Ｇ、　Ｎ、、　Ｔｒｋｕ
ｌａ、　Ｄ、、　ａｎｄＤｕｂｂｓ、　Ｄ、　Ｒ，Ｐｒ
ｏｇｒ、　Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、）。 ２１　：　１３−３２　（１９７５）；及びキット、ニ
ス：［ファーマコロソー　アンドセラビューティックス
」編者、エイ、シー。 サルトレリー二編者に従う専門家、シュガー（ベルがモ
ン　プレス　リミテッド、ニオツクスフオード）第４巻
：　５０１−５８５（１９７９）　（Ｋｉｔ、　Ｓ、　
Ｉｎ　：　ｐｈａｔｎｔｔｃｏ−１ｏｇｙ　ａｎｄ　Ｔ
ｈｅｒａｐｅｗｔｉｃｓ、　Ｅｔｉ、　Ａ、　Ｃ。 ５ａｒｔｏｒｅｌｌｉ　；　５ｐｅｃｉａｌｉｓｔ　Ｓ
ｖ、ｂｊｅｃｔＥｄ、　Ｓｈｕｇａｒ、　（ｐｅｒｇａ
ｍｏｎ　ｐｒｅｓｓ、　Ｌｔｄ、：０ｘｆｏｒｄ）、　
ｖｏｌ、　４：　５０１−５Ｒ５（１９７９Ｎ参照〕。 」 （９）同４８頁７行−４９頁１４行に「（Ａ１１ｃｔｒ
ｂｄｅｅｎ・・・・・・・・・参照）。」とあるを以下
の通り引止する。 Ｆ［７０−ティーン、エイチ、ニス１．ヘン。 エム、ニス１．リー、ソエイ、ソエイ、。 デ　クラーク、イー１．及びプルシッフ。 ダブリュ、エイチ、「ジャーナル　オプバイオロジカＡ
　ケミストリー」、（ＡｌｌαＵ−ｄｅｅｎ、　Ｈ，Ｓ
、、　Ｃｈｅｎ、　Ｊ／、　Ｓ、、　Ｌｅｅ、’　Ｊ。 Ｊ、、　Ｄｅ　Ｃ１ｅｒｃｑ、　Ｅ、、　ａｎｄ　ｐｒ
ｒｔ、５ｏｆｆ。 ６０’３−５Ｏ６（１９８２）ｉデ　クラーク、イー、
ｒアーシベ　インターナショナーレ　デ　フイソオロソ
ー　エ　デ　バイオヒミーＪ　（Ｄｅ　Ｃ１ｅｒｃｑ、
　Ｅ、　Ａｒｃｈ、。 Ｉｎｔ、　ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｂｉｏｃｈ、ｉｔｎ、、
　）＋　８７　：３５３−３９５　（１９７９）ｉラル
スソン。 エイ、及びオバーダ、ビー、「アンチマイクロバイアル
　エージェント　アンド　へモセラビーＪ　（Ｌａｒｓ
ｓｏｎ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｏｂｅｒｇ。 Ｂ、　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅ
ｍｏｔｈｅｒ、）　。 １９：９２７−９２９　（１９８１）；プルシッフ、ダ
ブリュ、イー０．ヘン、エム。 ニス、リン、ティ、−ニス、、及ヒフィッシャー、ピー
、エイチ：「アンチバイラルへモセラビー」：ウイルス
機能の抑制剤のデザイン、編者、ケイ、ケイ、ガラリ（
アカデミツク　プレス　インコーホレーテッド：ニュー
ヨーク）、１９７−２０６　（１９８１）　（Ｐｒｕｓ
ｏｆｆ、　Ｗ、　Ｅ、　＋　Ｃ１ｂｅｎ、　Ｍ。 Ｓ、　Ｌｉｎ、　Ｔ、　−５，、ａｎｄ　Ｆｉｓｃｈｅ
ｒ、　ｐ。 Ｈ，Ｉｎ　：　Ａｎｔｉｖｉａｒａｌ　Ｃｈｅｒｎ、ｏ
ｔｈ、ｅｒａｐｙ　：Ｆｑｂｎｃ　ｔ　４°ｏｎｓ、Ｅ
ｄ、に、に、Ｇａｕｒｉ、（Ａｃａ−ｄｅｍｉｃ　ｐｒ
ｅｓｓ、Ｉｎｃ、：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）。 ７）７１．１９７−２０６（１９８１Ｎ　；及びシム、
アイ、ニス０．グッドナヤイルド。 ジエイ１．メレデイス、ティ、エム、ポーター、アール
、エイ０．ルペール、アール。 エイチ、、ピネイ、ジエイ、、及びワツズワース、エイ
ナ、ソエイ、「アンチマイクロバイアル　エージェント
　アンド　へモセラビーＪ　（Ｓｉｍ、１．　Ｓ、、　
にｏｏｄｃｈｉｌｄ。 ／、、　Ａｆｅｒｅｃｌｉｔ＃、　Ｄ、　Ｍ、　ｐｏｒ
ｔｅｒ、　Ｒ，Ａ、。 Ｈｖ、ｐｅｒ、　Ｒ，Ｈ，、Ｖｉｎｅｙ、　Ｊ、、　ａ
ｎｄ　Ｗａｄｓ−（１９８３）参照〕。」 Ｃ１同５０頁５−８行に「（Ｎａｋｙａ、ｔｎ、ａ　・
・−−−−・−お照）。」とあるを以下の通ね訂正する
。 ［−１−カヤマ、ケイ０．ルス、シェイ、エル及び、ヘ
ング、ワイ、−シー、［ソヤーナルオプ　ピロロジーＪ
　（Ｎａｋａｙａｍａ、　Ｋ、　。 Ｒｒｂｔｈ、　Ｊ、　Ｌ、、　ａｎｔｉ　Ｃｈｅｎｇ、
　Ｙ、　−Ｃ。 Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）、　４３　：３２５−３２７　（
１９８２）参照〕。」 （１１）同５０頁１３−１６行Ｋ　［（Ｒｓｔｈ、　・
ｍ１・・参照）。」とあるを以下の通り削正する。 「〔ルス、ソエイ、エル及ヒヘング、ワイ。 −シー、「モレキュラー　ファーマコロジ−Ｊ　（’Ｒ
ｕｔｈ、、　／、　Ｌ、　ａｎｄ　Ｃｈｅｎｇ、　Ｙ。 −Ｃ，Ｍｏ１．　ｐｈ、ａｒｒｒｒ、ａ、ｃｏｌ、　）
、　２　Ｑ　：　４１５喝−一−−−−−畷−■−一―
−■――−１−−５２２（１９８１）参照〕。」 （１２）同５２頁８行−５６頁５行に「（Ｖｅｅｒｉｓ
ｅ−１ｔｙ・・・・・・・・・参照）。」　とあるを以
下の通り訂正する。 「〔ベーリセッティ、ブイ、及びジエントリー。ソー、
エイ、［ジャーナル　オプ　ピｏｏジーＪ　（Ｖｅｅｒ
ｉｓｅｔｔｙ、Ｖ、　ａ７Ｔ、ｄＧｅｎｔｒｙ、　Ｇ、
　Ａ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　）、　４６　：９０１−
９０８　（１９８３）；ラーダー。 ピー、エイ８．ダーヌ、ディ０．ヘング。 ワイ、−シー１．及びダーバイ、ソー。 ［ジャーナル　オン　バイオロジカル　ケミストリーＪ
　（Ｌａｒｄｅｒ、　Ｂ、　Ａ、、　１）ｅｒｓｅ。 Ｄ、、　Ｃｈ、ｅｎｇ、　Ｙ、　−Ｃ，、ａｎｄ　Ｄａ
、ｒｂｙ、　Ｇ。 １、１ｉｉｏ１．　Ｃｈ、ｅｍ、）、　２５９：　２０
２７−２０３３　（１９８３）；ルス、ジエイ、エル、
及ヒヘング、ワイ、−シー、［モレキュラー　ファーマ
コロソ−１（Ｒπｔｈ、、　Ｊ。 Ｌ、　ａ、ｎｃｊ、　Ｃｈｅｎｇ、　Ｙ、　−Ｃ，Ｍｏ
１．　、ｐｈａｒｔｎａ−ｃｏｌ、）、２［］：４１５
−５２２（１９８１）；及びシム、アイ、ニス１．グツ
ドチャイルド、ソエイ、、メレデイス、ディー、エム、
。 ポーター、゛アール、エイ、ルペール、アール、エイチ
、、ビネ１”、ジエイ、、及びワズワース、エイチ、ジ
エイ、「アンチマイクロバイアル　エージェント　アン
ド　へモ七うビーｊ　（Ｓｉｍ、　１．．５．、　Ｇｏ
ｏｃｊｃｈ信ｄ。 Ｊ、、　Ｍｅｒｅｄｉｔｈ、　Ｄ、　Ｍ、、　ｐｏｒｔ
ｅｒ、　Ｒ，Ａ。 Ｒｕｐｅｒ、　Ｒ，Ｈ，、Ｖｉｎｅｙ、　Ｊ、、　ａｎ
ｄ　Ｗａｄｓ−ｗａｒｔｈ、　Ｈ，Ｊ、　Ａｎｔｉｔ＋
ｒ、１ｃｒｏｂ、　Ａｇｅｎｔｓ（１９８３）参ＪｆＣ
ｉｌ。」 （１３）同５３頁７−１２行に「（１）ｕｂｂｓ　・、
、、旧、。 参照）、」とあるを川下の通り訂正する。 「〔タフス、ディ、アール及びキット、ニス。 ［ピＴ、ｆｆ　ＯソーＪ　（／）ｕｂｂｓ、　Ｉ）、　
Ｒ，ａｆＬａＫｉｔ、　Ｓ、　Ｖｉｒｏｔｏｇｖ　Ｌ　
２２　：　２１４−２２５（１９６４）；及びダブス、
ディー。 アール、及びキット、ニス、「ピロロノー」（Ｉｈｉ、
ｂｂｓ、ｊ九　Ｒ，ａ、ｎｄ　Ｋｉｔ、Ｓ、Ｖｉｒｏｌ
ｏ−ｇｙ）、２２：４９３−５０２　（１９６４）参照
］。」 （１４）　ｌｎｌ　５５頁１３行−５６頁２行にｌ−（
１）ｕｂｂ８・・・・・・・・・参照）。」とあるを以
下の通りＮ、ｌ’　、７Ｔ’する。 「〔ダプス、ティー、アール、及びキット。 ニス、［ビＯＯソーｊ　（Ｄｕｂｂｓ、　Ｄ、　Ｒ。 ａｎ、ｄ　Ｋｉｔ、、　Ｓ、　Ｔ’ｉｒｏｌｏｇｉ／）
、　２２　：　２１４−２７５　（１９６４’）、ダブ
ス、ディー。 アール、及びキット、ニス、「ピロロジー」（Ｄｕｂｂ
ｓ、Ｉ）、Ｒ，ａｎｄ　Ｋｉｔ、Ｓ、Ｖｉｒｏｌｏ−ｇ
ｙ）、２２：４９６−５ｏ２（１９６４）；及びキッド
、ニス、及びダブス、ディー。 アール、［バイオケミカル　アンド　バイオフィジカル
　リサーチ　コミュニケイショ７ズＪ　（、Ｋｉｒｉ、
　Ｓ、　ａｎａ　ｉ）ｖ、ｂｂｓ、　ｌ）、　、Ｒ。 Ｂｉｏｃｈｅｒｎ、　Ｂｉｏｐｈ、ｙｓ、　Ｒｅｓ、　
Ｃｏｍｙｔｕｂｎ、）。 １３：５００−５０４（１９６３）参照〕。」（１５）
同５３頁７−１２行婬「（人ｉｔ・・・・・・・・・・
−・参照）。」とめるをＶ下の通り訂正する。 「〔キット、ニス１．ロイング、ダブリュ。 −シー０．ジョルケ８ンセン、ジー、エヌ、。 ドルクラ、ディー０．及びダプス、ティー。 アール、［ｆログレス　イン　メゾイカルビｏｏジーｊ
　（Ｋｉｔ、　Ｓ、　、　Ｌｅｒｔｎｇ、　ｕｌ、　−
Ｃ，、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、　Ｇ、　Ｎ、、　Ｔｒｋｕ
ｌａ、、　ｒ）、。 ａｎｄ　Ｄｕｂｂｓ、　Ｄ、　Ｒ，ｐｒｏｇｒ、　Ａ（
ｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、）。 ２１：１５−３４（１９７５）参戸〕。」（１６）巨１
５６頁１５行−５８頁５行に１（Ｒｅｎｐｏｒａｔ・・
・・・・・・・参照）。−１とをるを以下の通り訂正す
る。 「〔ペンポラット、ティー０．ビーチ、アール、　エイ
、　＋　及’Ｏ：イハラ、ニス、［ピロロソーＪ　（１
３ｅｎｐｏｒａｔ、　Ｔ、、　Ｖｅａｃｈ、　Ｒ，Ａ、
。 ａｎｄ　Ｉｈ、ａｒａ、　Ｓ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　Ｌ
　１２７　：１９４−２０４　（１９８））？フィール
ド。 エイチ、ジエイ、、アンダーソン、ジェイ。 アール及びワイルディー、ビー、「ジャーナル　オン　
ジェネラル　ピロロジー」（Ｆｉｅｌｄ、　７７；　Ｊ
、、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｊ、　Ｒ，。 ａｎｄ　Ｗｉｌｄｙ、　ｐ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒ
ｏｌ、）。 １叉：９ｌ−９９（１９８２）ｉフィールド、エイチ、
ジエイ、及びネーデン、ジェイ、「アンチバイラル　リ
サーチ」（Ｆｉｅ−１ｄ、　Ｅ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｎｅ
ｄｅｎ、　Ｊ、　ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓ、）、２：
２４３−２５４　（１９８２）；ゴルドン、ワイ、、ギ
ルデン、ディー、エイチ、、シュトラム、ワイ、アスハ
ー、ティー０．テーパー、イー０．ウェリッシュ。 エム０．テプリン、エム０．スニッノクー。 ディー０．ハダー、ソエイ、、及びベッカ一、ワイ、［
アーキプス　オプ　ピロロジーＪ　（Ｇｏｒｄｏｎ、　
Ｙ、、　Ｇ１１ｄｅｎ、　Ｄ、　Ｈ，。 Ｓｈｔｒａｍ、　Ｙ、　Ａｓｈ、ｅｒ、　Ｔ、、　Ｔａ
ｂｏｒ、　、Ｅ、。 Ｗｅｌｌｉｓｈ、　Ｍ、、　Ｄｔｔｖｌｉｎ、　Ｍ、、
　５ｎｉｐｐｅｒ。 Ｄ、、　Ｈａｄａｒ、　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｂｅｃｋｅｒ
、　Ｙ。 ９８３）；カイン、アール、ヅエイ、「アーキブス　オ
プ　ピロロジー」（Ｋｅ休。 Ｒ，Ｊ、　Ａｒｃｈ、、　Ｖｉｒｏｌ、）　、　７２：
　１４３−１６８（１９Ｂ２）ｉラーダー、ビー、エイ
、＋ｆルス、ティー０．ジエン、ワイ。 −シー、、及びダルバイ、ソー、［ジャーナル　オプ　
バイオロジカル　ケミストリーＪ　（Ｌａｒｄｅｒ、　
Ｂ、　Ａ、、　Ｄａｒｓｅ、　Ｄ、。 Ｃｈｅｎｇ、　Ｙ、　−Ｃ，、ａｎｄ　Ｄａｒｂｙ、　
Ｇ、　／。 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、　２５８：２０２７−２０
３３（１９８３）；テンサー、アール、ビー０．レツセ
ル、ニス１．及びデュンスタン、エム、イー、［ビｏｏ
ジーＪ　（Ｔｅｎ５ｅｒ。 Ｒ，１３，、Ｒｔｔｓｓｅｌ、　Ｓ、、　ａｎｄ　Ｉｈ
ｔｎｓｔａｎ。 Ａり、　Ｅ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１１３　：　３２８
−３４ｊ（１９８１）ｉ及びウニインマスター、ソー、
エイ０．ミスラ、ブイ１．マクグイール、アール１．バ
ビウク、エル、エイ０．及びデ　クラーク、イー０．「
ピロロジーＪ　（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ、　Ｇ、　Ａ、
、　Ｍｉｓｔｒａ。 Ｖ、、　ＭｃＧｗｉｒｅ、　Ｒ，、Ｂａｂｉｕｋ、　Ｌ
、　Ａ、。 ａｎｄ　Ｄｅ　Ｃｌｅｒｃｇ、　Ｅ、、　Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ）。 １１８：１９１−２０１（１９８２）参照〕。」（１７
）同５８頁１１−１９行に［（Ｆｉｅｌｄ　・・・−・
・・・・・参照）。」とあるを以下の通シ訂正する。 「〔フィールド、エイチ、ジエイ、及びワイルディー、
ビー、［ジャーナル　オン　ハイソーン　ケンブリッジ
Ｊ　（Ｆｉｅｌｄ、　Ｈ。 Ｊ、　ａ、ｎｄ　Ｗｉｌｄｙ、　Ｐ−Ｊ、　Ｈｙｇ、、
　Ｃａｍｂ、）。 Ｅ’、１　：２６７−２７７（１９７８）：クライン、
アール、ソエイ、［アーキゾス　オプ　ピロロソーＪ　
（Ｋｌｅｉｎ、　Ｒ，Ｊ、　Ａｒｃｈ、。 Ｖｉｒｏｌ、）、７２：１４３−１６８（１９８２）；
及びキット、ニス１．クアピ、エイチ、、ダブス、ディ
ー、アール、及びオオツカ、エイチ、［ジャーナル　オ
ン　メディカル　ピロロジーＪ　（Ｋｉｔ、　Ｓ、、　
Ｑａｖｉ。 Ｈ，、Ｄｕｂｂｓ、　Ｄ、　Ｒ，ａｎｄ　０ｔｓｕｋａ
、　Ｈ。 Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ）、　１２：２５−３６（１９
８３）参照〕。」 （１８）同５９頁８−１９行にｌ”’　（Ｇｎｒｄｎｎ
−、、、、。 参照）。」とあるを以１の通り訂正する。 「〔ゴルドン、ワイ、、ギルデン、ディー。 エイチ、、シュトラム、ワイ、、アスハー。 ワイ、、テーパー、イー０．ウエリツシュ。 ゴム１．テフリン、エム６．スニツ）％　＋ｆイー＋ｌ
ハダー、ソエイ、、及びベツカー、ワイ、「アーキブス
　オン　ピロロジー　」（Ｇｏｒｄｏｎ、　Ｙ、、　Ｇ
１１ｄｅｎ、　Ｄ、　Ｉｆ、。 Ｓｈ、ｔｒａｍ、　Ｙ、、　Ａｓｈ、ｅｒ、　Ｙ、、　
Ｔａｂｏｒ、　Ｅ、。 Ｗｅｌｌｉｓｈ、　Ａ１．、　Ｉ）ｅｖｌｉｎ、　Ｍ、
、　５ｎｉｐｐｅｒ。 Ｄ、、　Ｈａｄａｒ、　Ｊ、、　ａｓｄ　Ｂｅｃｋｅｒ
、　Ｙ、　Ａｒｃｈ。 Ｖｉｒｏｌ、）、７６：３９−４９（１９８３）；クラ
イン、アール、ソエイ６　「アーキプスオプ　ビｏｏジ
ーＪ　（Ｋｌｅｉｎ　Ｒ，Ｊ、　Ａｒｃｈ、。 Ｖｉｒｏｌ、）、７２：１４３−１６８（１９８２）；
及びテンサー、アール、ビー９．レツセル、ニス、及び
デュンスタン、エム。 イー、［ピロｏソーＪ　（Ｔｅｎ５ｅｒ、　Ｒ，Ｂ、＋
Ｒｅ５ｓｅｌ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｄｕｔｒ、５ｔａｔＬ
、　Ｍ、　Ｅ。 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１１２：３２８−３４１（１９８
１）８敗〕。」 （１９）　同６０頁１０−１４行に「（Ｃａ、ｍｐｉｏ
ｎｅ・・・・・・・・・参照）。」とあるを以下の通り
訂正する。 「〔キャンピオン−ピッカード、ジエイ、。 ロウルス、ダブリュ、イー０．及びパチェツテイ、ニス
、［ジャーナル　オン　ピロロソーＪ　（Ｃａｍｐｉｏ
ｎｅ−ｐｉｃｃａｒｄ、　Ｊ、。 Ｒａｗｉｓ、　Ｆ、　Ｅ、、　ａｎｄ　Ｂａｃｃｈｅｔ
ｔｉ、　、５゜Ｊ、Ｖｉτｏｆ）、３１　：２８１−２
８７（１９７９）参照〕。」 （２０）　１ｍ１６１頁４−１２行に［（５ｉｒｎ、ｌ
ｅｙ　＝参照）。」とあみを以下の迫り訂正する。 「〔シムレイ゛、−／ユイ、アール、「ネイチャーｊ　
（５ｉｒｎ、ｌｅｙ、　Ｊ、　Ｒ，Ｎａｔｕｒｅ　）　
。 ３８５：３３３−３３５（１９ＦｔＯ）ｉポスト、エル
、イー、、マツケム、ニス、。 ロイズ々ン、ビー、［セルｊ　（ｐｏｓｔ、　Ｌ。 Ｅ、、　Ｍａｃｋｅｍ、　Ｓ、、　Ｒｏｉｚｍａｎ、　
Ｂ、　Ｃｅ１ｌ）。 ２４：５５５−５６５）ｉ及びキット、ニス６．クアビ
、エイチ、、ダプス、ディー。 アール１．及びオオツ力、エイチ、［ジャーナル　オツ
　メディカル　ピロロジー」（Ｋｉｔ、　Ｓ、、　Ｑα
υｉ、　Ｈ，、ＩＪ、）ｕｂｂｓ、　Ｊ）、　Ｆ、。 ａｎｄ　０１ｓｕｋａ、　Ｈ，／、　Ｍｅｄ、　Ｖｉｒ
ｏｌ、）　。 １２：２５−３６（１９８３）参照〕。」（２１）同７
４頁５−９行に［（５ｋｏｄ、α・・・・・・・・・参
照）、」とあるを以下の通り訂正する。 「〔スコダ、アール０．ブラウナー、アイ、。 サデツキー、イー９．及びメイヤー、ブイ。 「アクタ　ピロロシカ」（Ｓｋｏｄα、Ｒｏ。 Ｂｒａｕｎｅｒ、　１．、５ａｄｅｃｋｙ、　Ｅ、、　
ａｎｄＭａｙｅｒ、　Ｖ、　Ａｃｔａ　Ｖｉｒｏｌ、）
　、　８：　１−９（１９６４）参照〕。」 （２２）−同７４負１０−１２行に１（、Ｂｏ、ｒｔｈ
ａ　・−・・参照）」とあるを以下の通り訂正する。 「〔ハーサ、エイ、「マギー　アラトルブラ６１）参照
〕」 （２６）同７４頁１３−１６行にｒ　（Ｐａ、ｕｌ　、
、、、、、・、。 参照）；」とあるを以下の通り訂正する。 「〔パウル、ビー、ニス０．メンケ゛リング。 ダプリュ、エル、及びピルトル、イー、シー、［アーキ
ブス　オプ　ピロロジー］（Ｐａｕｌ、　Ｐ、　Ｓ、、
　Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ、　ＩＦ、　Ｌ。 ａｎｄ　ｐｉｒｔｌｅ、　Ｅ、　Ｃ，Ａｒｃｈ、　Ｖｉ
ｒｏｌ、）。 Ｌ上：１９３−１９８（１９８２）参照〕；」（２４）
同７５頁３−６行に「（Ｍａｅｓ・・・・・・・・・・
・・参Ｍ）、」とあるを以下の通り訂正する。 「〔マエス、アール、ケイ、カニツツ、シー。 エル、及びグスタフンン、ティー、ビー。 「アメリカン　ツヤ−ナル　オツ　ベテリナリー　リサ
ーチｊ　（Ｍａｔｓ、　Ｒ，Ｋ、　Ｋａｎｉ−ｔｚ、Ｃ
，Ｌ、ａｎｄ　（Ｊｙｒｂｓｔａｆｓｏｎ、Ｄ、Ｐ。 Ａｍ、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、）、４４：２０８３−２０
８６　（１９８３’ｌ参照〕、」 （２５）同７５頁９−１２行に「ＰｃＬｌＬｌ・・・・
・・・・・・・・参照）。」とあるを以下の通り引止す
る。 「〔ノクウル、ピー、ニス、メンｒリング、タプリュ、
エル０．及びぎルトル、イー、シー、「アーキブス　オ
プ　ピロロソー」（Ｐａｕｌ、　Ｐ、　Ｓ、　Ｍｅｎｇ
ｅｌｉｎｇ、　Ｆ、　Ｌ、。 ａｎｄ　ｐｉｒｔｌｅ、　Ｅ、　Ｃ，Ａｒｃｈ、、　Ｖ
ｉｒｏｔ、）。 ７３：１９３−１９８（１９８２）参照〕。」（２６）
同７６頁１９行−７７頁６行に［（、ｐａｓｔｏ−γｅ
ｔ・・・・・・・・・参照）。」とあるを以下の通り訂
正する。 「〔ツクストレット、ビー＊　ｅ　−、チリ−。 イー１．ブロキエル、ビー０．及びデルボーペン、−、
Ｆ−、、「アンナーレ　デ　リシエルシエ　ベテリネー
ル」（Ｐａ８ｔＯτｅｔ。 ｐ、　ｐ、、　Ｔｈ１ｒｙ、　Ｅ、、　Ｂｒｏｃｈｉｅ
ｒ、　ｂ、。 １３：２２１−２３５（１９８１）及びシャノック、ア
ール、エム、、「Ｎヤ−ｆｋオオンインフエクシャス　
デイシージズ」（Ｃ’ｈａｎｏｃｋ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｊ
、　Ｉｎｆｅｃｔ、、Ｄｉｓ、）。 １４３：３６４−３７４’（１９８１）参照〕。」（２
７）同７８Ｔｈ、１１−１．４行に［（Ｋｉ、ｔ・・・
・・・・・・参照）、」とあるを以下の辿υＭｌＩＦす
る。 「〔キット、ニス、ｔクアビνエイチ・！ダブス、ディ
ー、アール、及びオオツカ、エイチ、［ジャーナル　オ
プ　メディカルピロロジーＪ　（Ｋｉｔ、　Ｓ、、　Ｑ
ａｖｉｒ　Ｉｉ、。 Ｄｖ、ｂｂｓ、　Ｄ、　Ｒ，ａｎｄ　０ｔｓｕｋα、Ｈ
ｌ−ムＭｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、）、上２：２５−３６（
１９８３）参照〕、」 （２Ｂ）芭、１７８頁１５−１９行に［’　（５ａｎｄ
ｒｔ、ｓ　・・−参照）、」とあるを以下の通り訂正す
る。 「〔ザンドウス、ピー、ジー０．ウィルキー。 エフ。エム、及びダビツドソン、エイ、ジエイ、［ジャ
ーナル　オン　ジェネラルピロロジーｌ（，５ａｎｄｕ
ｓ、　ｐ、　Ｇ、、　Ｗｉｌｋｉｅ。 Ｎ、Ｍ、ａｎｄ　Ｉ）ａｖｉｄｓｏ？１．、Ａ、Ｌ　Ｊ
、Ｇｅｎ。 Ｖｉｒｏｌ、）、６５：２７７−７９５　（１９８２）
参照〕、」 （９９）同７９頁１−４行に［（Ｃａｍｐｉｏ？ｌｃ−
・−・・参照）。」とあるを以Ｆの通り訂正する。 「〔キャンピオネーピカルド、ラウルス、ダプリュ、イ
ー、及びバクテエツテイ、ニス。 ［ジャーナル　オン　ピロロジー−１（００ｍ−ｐｉｏ
ｎｅ−Ｐｉｃａｒｄｏ、　Ｒａｗｌｓ、　Ｗ、　Ｅ、　
ａ、ｎｄＢａｃｃｈｅｔｔｉ、　Ｓ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏ
ｌ、）＋　３１　：２８１−２８７（１９７９）８刑〕
。」（３０）同８０頁１０−１８行に［（５ｃｈａｆｆ
ｅｒ・・・・・・・・・参Ｐ）。］とあるを以下の通り
訂正する。 「〔スシャツフエル、ビー、エイ１．アロン。 ソー、エム６．ビスワル、ゴヌ、及ヒベニイツシューメ
ルニツク、「ピロロジー」（，５ｃｈａｆｆｅｒ’、　
Ｐ、Ａ、、Ａｒｏｎ、、　Ｇ、Ｍ、。 Ｂｉｓｗａｌ、　Ｎ、　ｃｔｎｄ　Ｂｅｎｙｅｓｈ、−
Ｍｅｌｎ、ｉｃｋ。 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、　５２：　５７−７１　（１９７
３）及びサン′ドリーゴルデイン、アール・。 エム１．レビン、エム、及びダロオン、ジエイ、シー、
［ジャーナル　オン　ピロロジーＪ　（５ａｎｄｒｉ−
Ｇｏｔｄ、ｉｎ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｌｅｖｉ−ｎｅ、　Ｍ
、　ａｎｄ　Ｇｌｏｒｉｏｓｏ、　Ｊ、　Ｃ，Ｊ、　Ｖ
ｉ−ｒｏｌ、）、３８：４ｌ−４９（１９８１）参照〕
。」 （３１）同８１頁１５−１８行ＶＣ［（、Ｂｅｎ−・−
−−参照）。」とあるを以１の通り訂正する。 「〔ベンーポラット、ティー１．ビーチ、アール、エイ
０．及びイノ・う、ゴス、「ピロロノー」（Ｂｅ、ｎ−
ｐｏｒａ、ｔ、　Ｔ、、　Ｖ’ｅａＣ１ｙ　Ｒ。 Ａ、、　ａｎｄ　Ｉｈａｒａ、　Ｓ、　Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙＪ。 １２７：１９４−２０４（１９８３）８押〕。 （３２）巨１８６頁４−６行１／’「（Ｋｉｔ・・・・
・・・・・　１９８６）」とを・るを以下の通りＷｒ正
する。 「〔キット、ニス、及びクアビ、エイチ。 ［ピｏｏジーＪ　（Ｋｉｔ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｑａｖｉ
。 Ｈ，ＶｉｒｏｌｏｇＶ）、　１３０　：　３８１−３８
９（１９１３３）’：ＩＪ （己３）ｔｉ＋［９頁１０−１３行Ｋ［（Ｓｅｋ匂ｕｃ
ｈｉ・・・・・・・・参照）、」とおるを以下の通り訂
正する。 ［セキダナ、ティ０．ニシモ上、ティ、。 カイ、アール及びセキグチ、エム、「ジエネｊ　（Ｓｅ
ｋｉｇｖ、ｃｈｉ、　Ｔ、、　Ｎ１５ｈ、ｉｍ、ｏｔｏ
。 Ｔ、、Ｋｏ、ｉ、、Ｒ，ａｎｃｔ　Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ
、Ｊ／。 Ｇｅｎｅ）、２１　：　２６７−２７２　（１９８６）
参照〕、」− （６４）同８９頁１４−１５行に［（Ｂｅｔｈｅｓｃｉ
ａ−＝−−−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　、Ｊと凍
するを「〔ヘセスダ　リザーテ　ラボラトリーズ（Ｂｅ
ｔｈｅｓｃｔａ、　Ｒｅ５ｅａ、ｒｃ’ｈ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ’）３．、Ｐ）と訂正する。 （３５）　＋ロコ８９ｊ’ｊｌ　６−１７　行ｅζ　「
　（Ｂｏｅｈｅｒｉｎ’ｇｅｒ・・・・・・・・・１４
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）　、　ＪとあるをＩｒ（べ
−！Ｊンガー　マンハイム　バイオケミカルズ（Ｂｏｅ
ｈｅｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｅｈｅｉｒｎ　Ｂｉｏ−ｃ
ｈｅｒｎｉｃａｌｓ　）　］、」 と引正する。 （３６）　ＩｎＩ３９Ｍ　１８行−９０頁１行Ｉｇ［Ｂ
ｅｔｈ、ｅｓｄａ・−・＝・−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ　）、］とあるを、「〔ベセスダ　リサーチ　ラボラ
トリーズ（Ｂｅ　ｔｈ、ｅｓｄａ、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
、　Ｌａ、ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　］、　Ｊと訂正す
る。 （３７）同９０頁１−２行Ｋ　「（Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏｃ
ｈｅ−ｍｉｃａ１８ｒ）、」トアルヲ 「〔ビー−エル　バイオケミカルズ（Ｐ−ＬＦ３ｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ　）　〕、ｊと訂正する。 （５日）同９０頁２−６行に「（Ｏｔｓｗｋａ　−・−
−−−−−参照）」とあるを以下のａｂ訂正する。 Ｗ〔０ｔｓｖ、ｋａ、　：ｒ−イテ、　、ヘイセン、　
ｘム、　。 キット、エム８．クアビ、エイチ、及びキット、ニス、
「ピロロソー」（Ｏｔｓｗｋａ。 Ｈ，、Ｅａｚｅｎ、　Ｍ、、　Ｋｉｔ、　Ｍ、、　Ｑａ
ｖｉ、　Ｈ。 ａｎｄ　Ｋｉｔ、　Ｓ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｌｌ　）＋　
１１３　：１９６−２１３　（１９Ｆ、　ｊ　）参照１
ｊ（５９）　ｉ廿１９　［１頁７−８行Ｋ［八ｒｅｖ）
・・・・・・・・・参照）６゜」とあるを 「〔ニュー　イングランド　ヌークリアー（Ｎｅｗ　Ｅ
ｎｇ　ｌａ、ｎｄ　）ｈｂｃ　ｒｅａｒ　）　参９　）
。」と訂正する。 （４０）同９３頁２−８行に「（Ｂｏｌｉｖａｒ−山−
・−参照）；」とあるを以下の通り訂正する。 ｒ〔ポｌｊバーｌエフ８．ロドリｒツ、アール。 エル１．グリーン、ビー、ジェイ、、ベトラッハ、エム
、シー、ハイネッヵー、エイチ、エル０．ボイヤー、エ
イチ、ダブリュ、。 クローザ、ソエイ、エイチ、、及び７アルコウ、ｃｉ、
［ヅエネＪ　（Ｂｏｌｉｖａｒ、　Ｆ、。 Ｒｏｄｒｉｇｕｅ２　Ｒ，Ｌ、、　Ｇｒｇｅｎｅ、　ｐ
、　／、。 Ｂｅｔｌａｃｈ、、　Ｍ、　Ｃ，Ｈｅｙｎｅｋｅｒ、　
Ｈ，Ｌ、ｒＢｏｙｅｒ、　Ｈ，Ｆ、、　Ｃｒｏｓａ、　
Ｊ、　Ｅ、、　ａｎｄＦａｌｋｏｗ、　Ｓ、　Ｇｇｓ＋
ｅＬ　２　：　９５−１１３（１９７７）参照〕；」 （４１）９４頁５−１４行に１（Ｅｌｄｔｔｒ　−・団
−・−参照）。」とあるを以下の通り訂正する。 「〔エルダー、ジエイ、ティー１．スプリッツ、アール
、エイ、及びウェイスマン、ニス、エム、［アニュアル
　レビュー　インソエネテイツク（Ｅｌｄｅｒ、　１．
　Ｔ、、　５ｐｒｉｔｅ。 Ｒ，Ａ、ａｎｄ　Ｗｅｉｓｓｍｎｎ、　Ｓ、　Ｊｆ、　
Ａｎｎ。 Ｒｅｖ、　Ｇｅｎ、）、１５：　２９５−３４０　（１
９８１）及びウーレ、アール０．グロスマン、エル、及
びモルダベ、ケイ、メソッド１０１巻、パートＣ，アカ
デミツクプレス。 ニューヨーク、　（１９８３）　（Ｕｒｎ、　Ｒ，。 Ｇｒｏｓｓｍａｎ、Ｌ、ａｎｄ　Ｍｏ１ｄａｖｅ、に、
Ｍｅｔん−ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｒｎｏｌｏｇｙ　”
　ＲｅｃｏｒｎｂｉｎａｎｔＤＮＡ’　、　ｖｏｌ、　
１０１　、　Ｐａｒｔ　Ｃ，Ａｃａｄｅ−ｍｌｃ　ｐｒ
ｅｓｓ、　Ｎ、　Ｙ、　（１９８３）　）参照〕。」（
４２）同９７頁１０−１３行に「（５ｋｏｄα・・・・
・・参照）］とおるを以下の通９訂正する。 「〔スコダ、アール０．ブラウナー、アイ、。 サデツキー、イー８．及びメイヤー、ｆイ。 ［アクタ　ｉロロジカＪ　（５ｋｏｄａ、−Ｒ＝Ｂｒａ
ｕｒＬｅｒ、　１．、５ａｄｅｃｋｙ、　Ｅ、、　ａｎ
ｄ　Ｍａｙ−ｅｒ、　Ｖ、　Ａｃｔａ　ＶｉγＯｆ）、
８：１−９（１９６４）参照〕」 （４３）同９７頁１５−１９行に［（Ｄｒ、Ｄｏｎａｌ
ｄ・・・・・・Ｉｎｄ　ｉα荊）」とあるを以下の通シ
訂正する。 「〔ドナルド　ビー、ゲスタフノン博士、インディアナ
州、ラフアイエツト、パーデユー大学、獣医学部（Ｄｒ
、　Ｄｏｒｒ、ａｌｄ　Ｐ、　Ｃ５ｂｓ−ｔａｆｓｏｎ
、　ｌ）ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａ
ｒｙＭｇｔｉｉｃｉｎｅ、　Ｐｗｒｄｗｅ　Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ＋　Ｌａｆａ−ｙｔｔｔｔｅ、　Ｉｎｄｉａ
ｎａ　）　’］　ｊ（４４）同１００頁１２行に「Ｃａ
Ｃｌ」とあるを「　ＣαＣ１，Ｊｌ と訂正する。 （４５）同１０５頁１４−１６行に「（Ｋｉｔ・・・・
・・・・・参照）」とあるを以下の通シ訂正する。 「〔キット、ニス、及びクアピ、エイグ。 「ピロロソーＪ　（Ｋｉｔ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｑａｖｉ
、Ｅ。 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、　１３０　：　３８１−３８９
（１９８３）参照〕」 （４６）同１０９頁６行に「ｐｉｇｎａｔｔｉ　ｅｔ　
ａｌＪとあるを 「ピグナラティ等（Ｐｉｇｎａｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ　）
　Ｊと訂正する。 （４Ｚ）同１０９頁７−１１行に［Ｐｉｇ？１．ａｔｔ
ｊ　・・−・・−参Ｍ）。」とあるを以下の通り訂正す
る。 「〔ビグナツテイ、−−、エフ０．カッサイ。 イー０．メネグツチイ、ソー１．ヘムシブ−、エフ、及
びミラネジ、ソー、［ピロロソーＪ　（Ｐｉｇｎａｔｔ
ｉ、　ｐ、　Ｆ、、　Ｃａ、ｇｓａｔ。 Ｅ、、　Ｍｅｘｅｇｕｚｚｉ、　Ｇ、、　Ｃｈｅｍｃｉ
ｔｚｅｒ、　Ｎ。 ａｎｄ　ＭｉＬａｎｅｓｉ、　Ｇ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
　）、９３　：２６０−２６４　（１９７９）参照〕。 」（４８）同１１４頁８−１２行に［（Ｋｉｔ・・・・
・・・・・参照）」とあるを以下の通り訂正する。 「〔キット、ニス０．クアビ、エイチ、、ダプス、ティ
ー、アール、及びオーツカ、エイチ、［ツヤ−ナル　オ
ン　メゾイカルビｏロソーＪ　（Ｋｉｔ、　Ｓ、、　Ｑ
ａｖｉ、　Ｈ，。 Ｄｖ、ｂｂｓ、　、Ｄ、　Ｒ，（１％（／　０ｔｓ１Ｌ
ｋａ、　−Ｈ，Ｊ。 Ｍａｄ、　ＶｉｒｏＬ、）、　１２：　２５−３６　（
１９８３）参照〕」 （４９）同１１５頁８−１１行に［（Ｇｒａｈａｍ　−
−−−・−参照）。」とあるを以下の通シ訂正する。 「〔グラハム、エフ、エル、及びファン　デル　ニブ、
エイ、ツエイ、「ピロロソー」（Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、
　Ｌ、　ａｙｔ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ。 Ａ、　Ｊ、　ＶｉｒｏＬｏｇｖ）、　５２　：　４５６
−４６７（１９７３）参照〕。」 （５０）　Ｆ４１１９頁５−１１行に１（Ｂｏｌｉｖｅ
ｒ　・・−・・・・・・参照）。」とあるを以下の通シ
訂正する。 「〔ポリバー、エフ１．ロドリケ゛ツッ、アール、エル
、グリーネ、ビー、ソエイ、、ベトラツハ、エム、シー
０．ハイネッカー。 エイチ、エル０．ボイヤー、エイチ、ダブリュ、、クロ
ーザ、ジエイ、エイチ及びファルコウ、ニス、［ジエネ
］（Ｂｏｌｉｖｅｒ。 Ｆ、、　Ｒｏｄｒｉ（Ｂｔｅｚ、　Ｒ，Ｌ、　Ｇｒｅｅ
ｎｅ、　ｐ。 Ｊ、、　Ｂｅｔｌａｃｈ、　ｋｆ、　Ｃ，、Ｅｅｙｎｅ
ｋｅｒ、　Ｈ。 Ｌ、、　Ｂｏｙｅｒ、　Ｈ，Ｆ、、　Ｃｒｏｓａ、　／
、　Ｈ。 ａｎｄ　Ｆａｌｋｏｗ、　Ｓ、　Ｇｇ＊ｇ　）、　２　
：　９５−１１３（１９７７１き照〕。」 （５１）同１１９頁１３−１５行に「（Ｍａｎｄｅ　ｌ
・・・・・・・・・参照）。」とあるを以下の辿り訂正
する。 「〔マユ／チル、エム、及ヒノ・イガ、エイ。 ［ツヤ−ナル　オン　モレキュラー　バイオ、ロソーｊ
　（Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ、ａｎｄ　Ｈｉｇａ、Ａ。 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、　５３：１５９−１６２（
１９７０）参照〕。」 （５２）同１２４頁２−５行に「（Ｂｉｒｎｂｏｉｒｐ
、　・−・−・−参照）。」とあるを岬、下の通り訂正
する。 「〔ビルンポイム、エイテ、シー及びトリー。 ［ジャーナル　オン　ヌークレイツク　アシッド　リサ
ーチ、Ｊ　（Ｂｉｒ？１ｂｏｉｔｙＬ、　、Ｈ，Ｃ。 ａｎｄ　ＤｏＬｙ、　Ｊ、　Ｍｕｃｈ、　Ａｃ１ｄｓ　
Ｅ、ｅｓ、）。 ７：１５１３−１５２’３（１９７３）参照〕。」（５
３）同１２６頁１４−１７行に「（Ｍａｔｚ・・・・・
・参照）。」とあるを以下の通り訂正する。 「〔マツツウビー１．スバクー　シャープ。 ソエイ、エイチ、、「ジャーナル　オプジエネラル　ピ
ロロソーＪ　（Ｍａｔｚ、　Ｂ、。 Ｓｗｂａｋ−５ｈａｒｐｅ、　／、　１１．、　Ｊ、　
Ｇｇｔｒ、、　Ｖｉ−−ｒｏｌ、）、６４：２２６１−
２２７０（１９゛８５）参照〕。ｊ （５４）同１２７頁６−９行に「（Ｇｒａｈ、ａｒｎ、
　−＝−・−、−・参照）。」とあるを以下の通り匍正
する。 「〔グ−ラハム、エフ、エル、及ヒフアン　デル　ゴブ
、エイ、ジエイ、「ピロロソー」（Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ
、　Ｌ、　ｏ、ｎｄ　Ｖａ、ｎ　ｄ、ｅｒ　Ｅｂ。 Ａ、　Ｊ、　Ｉｌｉｒｏｌｏｇｙ）　、　５　’ｌ　：
　４５６−４６７（１９７３）参照〕。」 （５５）同１２９頁６−８行に［（Ｋｉｔ・・・・・・
・・・参照）」とを・るを以下の通り訂正する。 「〔キット、ニス、及びクアビｔエイチ。 「ヒロロジ一」（人ｉｔ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｑａｖｉ。 Ｈ，ＶｉｒｏｌｏＱＶ）　、１３１：ｌ：　３８１−３
８９（１９８３）参照ゝ〕」 （５６）　１ｉｉｌ　１２９頁９−１７行に［（Ｌｉｔ
ｔｌｅｆｉｅｌｄ。 ・・・・・・・・・参照）１とあるを以下の通り酌正す
る。 ｒ〔リトルフィールド、ソエイ６、ダプリュ。 ［サイエンスＪ　（ＬｉｔＬｌｅｆｉｅｌｄ、　Ｊ、　
Ｆ。 ５ｃｉｅｎｃｅ）　、　１４５　ニア　０’９−７１０
（１９６４）；リトルフィールド、ソゴ、イ。 ダブリュ、「バイオヒミカ　エ　バイオフイヅカ　アク
タＪ　（Ｌｉｔｔｌｅｊ’１ｅｌｄ、　Ｊ。 Ｗ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、９
５　：１４−２２（１９６５）ｉ及びスチバルスカ、イ
ー、エイチ、及びスチパルスキー。 ダプリュ、「プロシーデインダス　オプザ　ナショナル
　アカデミ−オプ　サイエンス　オプ　ザ　ニーニスニ
ー」（Ｓｚｙ−ｂａｌｓｋａ、、　Ｅ、　Ｈ，ａｎｄ　
５ｚｙｂａｌｓｋｉ、　Ｗ。 ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　
）　、　４８：２０２６−２０３４　（１９６２）参照
〕」（５７）　ＩｍＪ　１３０頁１２−１８行にＪ（Ｋ
ｉｔ・・・・・・参照）。」とあるを以下の通り訂正す
る。 「〔キット、ニス８．クアビ、エイチ、［ピｏｏソーＪ
　（Ｋ’ｉｔ、　Ｓ、、　Ｑａｖｉ、　Ｈ，Ｖｉｒｏ−
８３）；およびキット、ニス９．クアピ。 エイチ、、ダプス、ディー、アール０．及びオオツカ、
エイチ、［ジャーナル　オンメディカル　ピロロジーｊ
　（Ｋｉｔ、　Ｓ、。 Ｑａｖｉ、　１１．、　Ｉ）ｕｂｂｓ、　Ｄ、　Ｒ，、
ａｎｄ　０ｔｓｕｋａ。 Ｈ，Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、）、１２　：　２５−３
６（１９８３１参照〕。」 （５８）同１３４頁１２−１７行に［（、ｆｈｂ　・−
・−旧・・参照）。」とあるを以下の通り訂正する。 「〔）、エヌ、−ティー、及びメリック、・レエイ［ソ
エネＪ　（Ｉｈｂ、　Ｎ、　−Ｔ、　ａｎｄＭｅｓｓｉ
ｎｇ、　Ｊ、　Ｇｏｎｅ）　＋　１７　：　２７１−２
７７　（１９８２）；及びメシンダ、ヅエイ及びビエイ
ラ、ソエイ、「ソエネ」 （Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ、　
／、　Ｇｅｎｅ）。 −Ｌヱ：２６９−２７６（１９８２）参照〕。」（５９
）同１３５頁１−７行に［（Ｍｅｓｓｉｎｇ　＝−−参
照）。−１とあるを以下の通り訂正する。 「〔メリック、ジェイ、「ヅエネティックエンジニアリ
ング」編者、アール、セトロウ及びエイ、ホランダ−（
ゾレナム　〕母ブリッジング　コーポレイション：ニュ
ーヨーク州、ニューヨーク市）　（Ａｉｅｓｓｉｎｇ。 Ｊ、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｅｄ
ｓ、　Ｒ。 Ｓｅｔｌｏｗ　ａｎｄ　Ａ、　ＥｏｌｌａＭＡ、ｅｒ　
（ｐｌｅｎｕｒｎｐｕｂｌｉｓｉｎｇ　Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔ’ｉｏｎ　：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。 Ｎ、Ｙ、））、Ｖｏｌ、４：１９−３５　（１９８２）
参照〕。」 （６０）同１４６頁１５行−１４７頁４行に「（Ｓａｎ
ｇｅｒ・・・・・・・・・冬期）。」とあるを以下の通
り訂正する。 「〔サンガー、エフ１．クールソン、エイ。 アール１．バレル、ビー、ソー１．スミス。 エイ、ジエイ、エイチ及びロエ、ピー　、エイ、［ツヤ
−ナル　オプ　モレキュラーバイオロジーＪ　（Ｓａｎ
ｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｃｏｕｌｓｏｎ。 Ａ、　Ｒ，、Ｂａｒｒｅｌｔ、　Ｂ、　Ｇ、、　、Ｓｒ
ｎ、ｉｔｈ、　Ａ。 Ｊ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｒｏｅ、　Ｂ、　Ａ、　Ｊ、　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏｌ。 １４３：１６１−１７８（９８０）及びサンガー、エフ
０．ニックレンツニス、及ヒクールンン、エイ、アール
、１７６０シーデインダス　オン　ザ　ナショナル　ア
カデミ−オン　サイエンス　オプ　ザ　ニーニスエイＪ
　（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ。 Ｓｃｉ、１Ｉ５Ａ）、７４　：　５４３６−５４７６（
１９７７）参照〕。」 （６１）同１５９頁８−１２行Ｋ　ｒ　（Ｒｉｇｂｙ・
・・・・・・・・参照）。」とあるを頃下の通υ訂正す
る。 「〔リグビー、ビー、ダブリュ、ジエイ、。 ティックマン、エム０．ローアス、ソ、。 及びバーブ、＆−，１”’ヅヤーナル　オンモレキュラ
ー　バイオロジーＪ　（Ｒｉｇｂｙ。 ｐ、　Ｗ、　Ｊ、、　Ｄｉｅｃｋｔｑａ７Ｉｎ、　Ｍ、
、　Ｒｈｏｄｅｓ。 Ｇ、、　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、　Ｐ、　Ｊ、　Ｎｏｔ、　
Ｂｉｏｌ、）。 １１３：１５７−２５１　（１９７７）参殿〕。」（６
２）同１６１頁１２−１５行に［（Ｋマ°ｄ・・・・・
・・・・参艶）。」とあろを以下の通り訂正する。 「〔キッド、ニス０．クアビ、エイチ、、ダプス、ディ
ー、アール、及びオーツカ、エイチ、［ジャーナル　オ
プ　メゾイカルビ・ｏｏソーｊ　（Ｋｉｄ、Ｓ、、Ｑａ
ｖｉ、Ｈ，。 Ｄｕ、ｔｒｂｓ、−Ｄ、　Ｒ，ａｎｄ　０１ｓｕｋａ、
　、Ｈ，Ｊ、　Ｍｅｄ。 Ｖ什ｏ１．）、１２：２５−３６（１９８３）冬用１〕
。」 （６３）同１６６頁１２−１５行に「（５ｏｕｔｈｅｒ
′ｎ・・・・・・・・・参照）。」とあるを以下の通り
訂正する。 「〔スーザーン、イー、エム３．「ジャーナル　オプ　
モレキュラー　バ（、ｔ−ｔｆｆ　ソーＪ（，５ｏｕｔ
ｈ、ｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、、／、］Ｗｏ１．　Ｂｉｏｌ、）
。 ９８：５０３−５１３（１９７５１参照〕。」（６４）
　ＰＪ　１６８頁６−１０行Ｋ　［（Ｔｅｎ５ｅｒ　・
−・・・・・・・・・・参照）」とあるを以下の通９訂
正する。 「〔テンサー、アール、ビー０．ソヨーンズ。 ソエイ、シー９．レツセル、ニス、ジエイ及ヒフラリツ
シュ、エフ、エイ、［ツヤ−ナル　オン　クリニカル　
マイクロバイオロソーＪ　（Ｔｅｎ５ｅｒ、　Ｒ，Ｂ、
、　Ｊｏｎｅｓ、　／。 Ｃ，、Ｒｅ５ｓｅｔ、　Ｓ、　！、、　ａｎｄ　Ｆｒａ
ｌｉｓｈ。 Ｆ、　Ａ、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
）、　１７　：１２２−１２７　（１９８３）参照〕ｊ
（６５）同１７６頁９−１１行にｌ’−（Ｋｉｔ・・・
・・・・・・参照）。」とを・るを、り下の通り訂正す
る。 「〔キット、ニス、及びクアビ、エイチ。 ［ピｏｏソーＪ　（Ｋｉｔ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｑａｖｉ
、　Ｈ。 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）＋　１５０：　３８１−３８９（１
９８３）参照〕。」 （６６）同１７７頁１−４行に「（５ｌｃｏｄａ−・−
・−参照）。」とおるを以］の通り訂正する。 「〔スコダ、アール１．ブラウサー、アイ、。 サデツキー、イー０．及びメイヤー、ブイ。 「ア多タヒロロジカ」（５ｋｏｄ、ａ、　、Ｒ，。 Ｂｒａｖ、ｎｅｒ、　１．、５ａｃｔｅｃｋｙ、　Ｅ、
、　ａｎｄ　Ｍａｙ−ｅｒ、　Ｖ、　Ａｃｔａ　Ｖｉｒ
ｏｌ）＋　８　：　１−９　（１９６４）参肥〕。」 （６７）同１８１頁５−１３行Ｋｒ　（５ｋｏｄａ・、
、、、、、、。 参Ｐ）。」とあるを以下の通り訂正する。。 「〔スコダ、アール０．ブラウナー、アイ、。 サデツキー、イー０．及びメイヤー、ブイ。 「アクタ　ピロづシカ］（Ｓｋｏｄα、Ｒ１゜Ｂｒａｖ
、ｎｅｒ、　１．、５ａｄｅｃｋｙ、　Ｅ、、　ａｎｄ
、　Ｍａｙ−ｅｒ、　Ｖ、　Ａｃｔａ　Ｖｉｒｏｌ　）
＋　８　：　１−１９（１９６９））及びピロン、ビー
６．ノ（ンデグツテ、ソエイ、、インサート、エム。 ビー及びロイナン、［ジャーナル　オプアメリカン　ベ
テリナリー　リサーチ］（Ｂｉｒｏｎ、　ｐ、、　Ｖａ
、ｎｄｅｑｌＬｅｔｔｅ、　Ｊ、。 ｐｅｎｓａｅｒｔ、　Ｍ、　１３．　ａｆＬｄ　Ｌｅｖ
、ｎａｎ、　Ｊ。 Ａジ／、Ｖａ、　Ｒｅｓ、）・±上ニア６０−７６３　
（１９８２）＃照Ｊ。、ｌｌ （６８）同第１８５頁第１５行及び第１８６頁第１４行
に１アガロースゲル」とめる後に「　による電気泳動図
　」 を加入する。 （６９）添付図面の第６図、第５Ｍ及び第６図を別紙の
とおり訂正する。 以上

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ■、突然変異原誘発突然変異の結果として機能的ＴＫを
    生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス６ ２、前記ウィルスがＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ）（ＡＴＣ
    ＣＮｏ　、ＶＲ−２０７８）（７）同定特性を有する、
    特許請求の範囲第１項記載の機能的ＴＫを生産すること
    ができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ３、前記ウィルスが凍結乾燥されている、特許請求の範
    囲第１項記載の機能的ＴＫを生産することができない温
    度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ４、　７程 （１）温度感受性ウィルスのための許容温度においてｔ
    ｋ−宿主細胞中でＰＲＹ　ｔｋ十株をプラーク精製し、 （２）工程（１）の得られるウィルスをｔｋ−宿主細胞
    中で突然変異原の存在下に温度感受性ウィルスのための
    許容温度において２〜５回増殖させ、 （３）工程（２）の得られるウィルスをｔｋ”宿主細胞
    中で突然変異原の存在下に温度感受性ウィルスのための
    非許容温度において増殖させ、（４）工程（３）の得ら
    れるウィルスをｔｋ”宿主細胞中で突然変異原の存在下
    に温度感受性ウィルスのための許容温度において増殖さ
    せ、（５）工程（４）の得られるウィルスをｔｋ”宿主
    細胞中で選択剤の存在下に温度感受性ウィルスのための
    許容温度において増殖させ、そして（６）工程（５）の
    得られるウィルスをｔｋ”宿主細胞中で突然変異原の存
    在下に温度感受性つ・イルスのための許容温度において
    増ｍさせて、温度抵抗性ＰＲＹ　ｔｋ−突然変異原誘発
    突然変異体を生産すること、 からなる方法により生産されたことを特徴とする突然変
    異原誘発突然変異の結果として機能的ＴＫを生産するこ
    とができない温度抵抗性偽狂犬病ウイルスウ ５、前記ウィルスがＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ）（ＡＴＣ
    ＣＮｏ　、ＶＲ−２０７８）の同定特性紮有する、特許
    請求の範囲第４項記載の機能的ＴＫを生産することがで
    きない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ６、前記ウィルスが凍結乾燥されている、特許請求の範
    囲第４項記載の機能的ＴＫを生産することができない温
    度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ７、前記ＰＲＶ　ｔｋ＋株が、ＰＲＹ　（ＢＵＫ）株、
    ５ＵＣＨ−１株、Ｋ株、Ｎｏ　ｒｄｅｎ株、ＰＲＹ（Ａ
    ｕｊ）株、Ｐ−２２０８株、ＫＣ−１５２０株、５６２
    ７２Ｂ　Ｉｏｗａ株、ＩＮＤ−ＦＨ株、ＩＮＤ−３株、
    ＩＮＤ−Ｒ株およびＳｈｏ　ｐｅ株から成る群より選択
    される、特許請求の範囲第４項記載の機能的ＴＫを生産
    することができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ８、前記ＰＲＹ　ｔｋ十株がＰＲＹ　（ＢＵＫ）株であ
    る、特許請求の範囲第７項記載の機能的ＴＫを生産する
    ことができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ９、前記温度感受性ウィルスのための許容温度が約３３
    〜３７．５℃である。特許請求の範囲第４項記載の機能
    的ＴＫを生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウ
    ィルス。 １０、前記前記温度感受性ウィルスのための許容温度が
    ３４．５℃である、特許請求の範囲第９項記載の機能的
    ＴＫを生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウィ
    ルス。 １１、前記温度感受性ウィルスのための非許容温度が約
    ３８．５〜４０℃である、特許請求の範囲第４項記載の
    機能的ＴＫを生産することができない温度抵抗性偽狂犬
    病ウィルス。 １２、前記温度感受性ウィルスのための非許容温度が３
    ９．１’Ｏである、特許請求の範囲第１１項記載の機能
    的ＴＫを生産することができなｌ、％温度抵抗性偽狂犬
    病ウィルス。 １３、ｔｋ”’宿主細胞が、つ゛サキＲａｂ（ＢＵ’）
    、マウスＬＭ　（ＴＫ−）、ヒトＨｅＬａ（ＢＵ２５）
    、ゴールデンハムスターＢＨＫ　２１（ＴＫ−）および
    ヒト系列１４３から成る群より選択される、特許請求の
    範囲第４項記載の機能的ＴＫを生産することができない
    温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 １４、前記ｔｋ−宿主細胞がウサギＲａｂ（ＢＵ）であ
    る、特許請求の範囲第１３項記載の機能的ＴＫを生産す
    ることができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 １５、前記ｔｋ＋宿主細胞が、Ｒａｂ−９，１次ウサギ
    腎細胞、２次ウサギ腎細胞、サル細胞、ヒト細胞、ヒト
    胚腎細胞およびニワトリ胚線維芽細胞から成る群より選
    択される。特許請求の範囲第４項記載の機能的ＴＫを生
    産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 １６、ｔｋ”宿主細胞がＲａｂ−９である、特許請求の
    範囲第１５項記載の機能的ＴＫを生産することができな
    い温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 １７、前記突然変異原が、ＢｒｄＵｒｄ、ＮＨ２ＯＨ，
    ＨＯＮＯ、ニトロソグアニジンおよびＵＶ光から成る群
    より選択される、特許請求の範囲第４項記載の機能的Ｔ
    Ｋを生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウィル
    ス。 １８、前記突然変異原がＢｒｄＵｒｄである、特許請求
    の範囲第１７項記載の機能的ＴＫを生産することができ
    ない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 １９、前記選択剤が、ＢｒｄＵｒｄ、ａｒａＴ、ＢＶＤ
    Ｕ、ＦＭＡＵおよびＡＩｄＵｒｄから成る群より選択さ
    れる、特許請求の範囲第４項記載の機能的ＴＫを生産す
    ることができな１．ｓ温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ２０、前記選択剤がａｒａＴである、特許請求の範囲第
    １９項記載の機能的ＴＫを生産することができない温度
    抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ２１、（１）突然変異原誘発突然変異の結果として機能
    的ＴＫを生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウ
    ィルスの製薬学的に有効量、および （２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 からなることを特徴とする偽狂犬病のための変性された
    生きているウィルスのワクチン。 ２２．４ｉｆ記ウイルスがＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ）（
    ＡＴＣＣＮｏ　、ＶＲ−２０７８）（１）同定特性を有
    する、特許請求の範囲第２１項記載の偽狂犬病のための
    変性された生きているウィルスのワクチン。 ２３、前記ウィルスが凍結乾燥されている、特許請求の
    範囲第２１項記載の偽狂犬病のための変性された生きて
    いるウィルスのワクチン。 ２４、製薬学的に許容されうる担体または希釈剤がＰＲ
    Ｙに対する抗体を含有しない約２．５〜１５％の血清を
    含有する生理学的緩衝媒質である、特許請求の範囲第２
    １項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウィ
    ルスのワクチン。 ２５、前記血清が、ブタ血清、子牛血清、胎児子牛血清
    、ウマ血清および子羊血清から成る群より選択される、
    特許請求の範囲第２４項記載の偽狂犬病のための変性さ
    れた生きているウィルスのワクチン。 ２６、製薬学的に許容されうる担体または希釈剤が約０
    ．５〜３．０％の血清タンパク質を含有する生理学的緩
    衝媒質である、特許請求の範囲第２１項記載の偽狂犬病
    のための変性された生きているウィルスのワクチン。 ２７、前記血清がブタ血清アルブミンおよびウシ血清ア
    ルブミンから成る群より選択される、特許請求の範囲第
    ２６項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウ
    ィルスのワクチン。 ２８、前記製薬学的に有効量が約１０”〜５×１０８　
    ｐ、ｆ、ｕ、である、特許請求の範囲第２１項記載の偽
    狂犬病のための変性された生きているウィルスのワクチ
    ン。 ２９、前記製薬学的に有効量は約１０６〜１０’ｐ、ｆ
    、ｕ、である、特許請求の範囲第２８項記載の偽狂犬病
    のための変性された生きているウィルスのワクチン。 ３０、（１）突然変異原誘発突然変異の結果として機能
    的ＴＫを生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウ
    ィルスの製薬学的に有効量からなり、前記温度抵抗性偽
    狂犬病ウィルスは、工程（ａ）温度感受性ウィルスのた
    めの許容温度においてｔｋ−宿主細胞中でＰＲＹ　ｔｋ
    ＋株をブタ・−り精製し。 （ｂ）工程（ａ）の得られるウィルスをｔｋ−宿主細胞
    中で突然変異原の存在下に温度感受性ウィルスのための
    許容温度において２〜５回増殖させ、 （Ｃ）工程（ｂ）の得られるウィルスをｔｋ”宿主細胞
    中で突然変異原の存在下に温度感受性ウィルスのための
    非許容温度において増殖させ、 （ｄ）工程（Ｃ）の得られるウィルスをｔｋ＋宿主細胞
    中で突然変異原の存在下に温度感受性ウィルスのための
    許容温度において増殖させ、 （ｅ）工程（ｄ）の得られるウィルスをｔｋ＋宿主細胞
    中で選択剤の存在下に温度感受性ウィルスのための許容
    温度において増殖させ、そして （ｆ）工程（ｅ）の得られるウィルスをｔｋ＋宿主細胞
    中で突然変異原の存在下に温度感受性ウィルスのための
    許容温度において増殖させて、温度抵抗性ＰＲＹ　ｔｋ
    −突然変異原誘発突然変異体を生産すること、 からなる方法により生産され、そして （２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 を含むことを特徴とする偽狂犬病のための変性された生
    きているウィルスのワクチン。 ３１、前記ウィルスがＰＲＹ　（ＢＵＫ−５Ａ）（ＡＴ
    ＣＣＮＯ，ＶＲ−２０７８）（７）同定特性を有する、
    特許請求の範囲第３０項記載の偽狂犬病のための変性さ
    れた生きているウィルスのワクチン。 ３２、前記ウィルスが凍結乾燥されている。特許請求の
    範囲第３０項記載の偽狂犬病のための変性された生きて
    いるウィルスのワクチン。 ３３、製薬学的に許容されうる担体または希釈剤がＰＲ
    Ｙに対する抗体を含有しない約２．５〜１５％の血清を
    含有する生理学的緩衝媒質である、特許請求の範囲第３
    ０項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウィ
    ルスのワクチン′。 ３４、前記血清が、ブタ血清、子牛血清、胎児子牛血清
    、ウマ血清および子羊血清から成る群より選択される、
    特許請求の範囲第３３項記載の偽狂犬病のための変性さ
    れた生きているウィルスのワクチン。 ３５、製薬学的に許容されうる担体または希釈剤が約０
    ．５〜３．０％の血清タンパク質を含有する生理学的Ｉ
    ｓ衝媒質である、特許請求の範囲第３０項記載の偽狂犬
    病のための変性された生きているウィルスのワクチン。 ３６、前記血清がブタ崖清アルブミンおよびウシ血清ア
    ルブミンから成る群より選択される、特許請求の範囲第
    ３５項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウ
    ィルスのワクチン。 ３７、前記製薬学的に有効量が約１０’〜５ｘ１０”　
    ｐ、ｆ、、、である、特許請求の範囲第３０項記載の偽
    狂犬病のための変性された生きているウィルスのワクチ
    ン。 ３８、前記製薬学的に有効量が約１０６〜１０’　ｐ、
    ｆ、ｕ、である、特許請求の範囲第３７項記載の偽狂犬
    病のための変性された生きているウィルスのワクチン。 ３９、前記ＰＲＹ　ｔｋ◆株が、ＰＲＹ（ＢＵＫ）株、
    ５ＵＣＨ−１株、Ｋ株、Ｎｏｒｄｅｎ株、ＰＲＹ　（Ａ
    ｕｊ）株、Ｐ−２２０８株、ＫＣ−１５２Ｄ株、Ｓ６２
    ／２６　Ｉｏｗａ株、ＩＮＤ−ＦＨ株、ＩＮＤ−３株、
    ＩＮＤ−１株および５ｈｏｐｅ株から成る群より選択さ
    れる、特許請求の範囲第３０項記載の偽狂犬病のための
    変性された生きているウィルスのワクチン。 ４０、前記ＰＲＶｔｋ＋株がＰＲＹ（ＢＵＫ）株である
    、特許請求の範囲第３９項記載の偽狂犬病のための変性
    された生きているウィルスのワクチン。 ４１、前記温度感受性ウィルスのための許容温度が約３
    ３〜３７．５℃である。特許請求の範囲第３０項記載の
    偽狂犬病のための変性された生きているウィルスのワク
    チン。 ４２、前記前記温度感受性ウィルスのための許容温度が
    ３４．５℃である、特許請求の範囲第４１項記載の偽狂
    犬病のための変性された生きているウィルスのワクチン
    。 ４３、前記温境感受性ウィルスのための非許容温度が約
    ３８．５〜４０℃である、特許請求の範囲第３０項記載
    の偽狂犬病のための変性された生きているウィルスのワ
    クチン。 ４４、前記温度感受性ウィルスのための非許容温度が３
    ９．１℃である、特許請求の範囲第４３項記載の偽狂犬
    病のための変性された生きているつ・ｆルスのワクチン
    。 ４５、前記ｔｋ−宿主細胞が、ウサギＲａｂ（ＢＵ）、
    　マウスＬＭ（ＴＫ−）、ヒトＨｅＬａ（ＢＵ２５）、
    ゴールデンハムスターＢＨＫ　２１　（ＴＫ−）および
    ヒト系列１４３から成る群より選択される。特許請求の
    範囲第３０項記載の偽狂犬病のための変性された生きて
    いるウィルスのワクチン。 ４６、前記ｔｋ−宿主細胞がウサギＲａｂ（ＢＵ）であ
    る、特許請求の範囲第４５項記載の偽狂犬病のための変
    性された生きているウィルスのワクチン。 ４７、前記ｔｋ＋宿主細胞が、Ｒａｂ−９，１次ウサギ
    腎細胞、２次ウサギ腎細胞、サル細胞、ヒト細胞、ヒト
    胚腎細胞およびニワトリ胚線維芽細胞から成る群より選
    択される、特許請求の範囲第３０項記載の偽狂犬病のた
    めの変性された生きているウィルスのワクチン。 ４８、前記ｔｋ＋宿主細胞がＲａｂ−９ｔ’ある、特許
    請求の範囲第４７項記載の偽狂犬病のための変性された
    生きているウィルスのワクチン。 ４９、前記突然変異原が、Ｂ　ｒ　ｄＵ　ｒ　ｄ、Ｎ　
    Ｈ２０Ｈ、ＨＯＮ　Ｏ、ニトロソグアニジンおよびＵｖ
    光から成る群より選択される、特許請求の範囲第３０項
    記載の偽狂犬病のための変性された生きているウィルス
    のワクチン。 ５０、前記突然変異原がＢｒｄＵｒｄである、特許請求
    の範囲第４９項記載の偽狂犬病のための変性された生き
    ているウィルスのワクチン。 ５１、前記選択剤が、ＢｒｄＵｒｄ、ａｒａＴ、ＢＶＤ
    Ｕ、ＦＭＡＵおよびＡＩｄＵｒｄから成る群より選択さ
    れる。特許請求の範囲第３０項記載の偽狂犬病のための
    変性された生きているつ・イルスのワクチン。 ５２、前記選択剤がａｒａＴである、特許請求の範囲第
    ５１項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウ
    ィルスのワクチン。 ５３、ｔｋ遺伝子欠失の結果として機能的ＴＫを生産す
    ることができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ５４、前記欠失が約ｌθ〜１５００ｂｐの大きさである
    、特許請求の範囲第５３項記載の機能的ＴＫを生産する
    ことができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ５５、前記欠失が約７５〜７５０ｂｐの大きさである、
    特許請求の範囲第５４項記載の機能的ＴＫを生産するこ
    とができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ５６、前記ウィルスがＰＲｖ（ＢＵＫ−ｄ１３）（ＡＴ
    ＣＣＮｏ、ＶＲ−２０７４）（７）同定特性を有する、
    特許請求の範囲第５３項記載の機能的ＴＫを生産するこ
    とができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ５７、前記ウィルスが凍結乾燥されている、特許請求の
    範囲第５３項記載の機能的ＴＫを生産することができな
    い温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ５８、工程 （１）クローニングベクターと、ＰＲＶｔｋ遺伝子の実
    質的にすべてを含有するＰＲＹのＤＮＡ断片とからなる
    交雑プラスミドを構成し、（２）工程（１）の交雑プラ
    スミドを、ｔｋ”宿主細胞中において、温度抵抗性ＰＲ
    Ｙ　ｔｋ−突然変異原誘発突然変異体からのＤＮＡで同
    時トランスフェクションし、 （３）ｔｋ−宿主細胞中において、工程（２）において
    生産されたウィルスからのＰＲＹｔｋ＋について選択し
    、 （４）ＰＲＹ　ｔｋ遺伝子の実質的にすべてより少ない
    ものが存在し、同時に欠失の各側に隣接してＰＲＶ　Ｄ
    ＮＡ配列を保持するように、工程（１）の交雑プラスミ
    ドからＤＮＡ配列を欠失させ。 （５）ｔｋ＋宿主細胞中において、工程（３）において
    得られたＰＲＹ　ｔｋ＋から訝導されたＰＲＶ　ｔｋ”
    　ＤＮＡを工程（４）の得られる交雑プラスミドで同時
    トランスフェクションし、そして （６）ｔｋ−宿主細胞中において、工程（５）において
    生産されたウィルスからのＰＲＹｔｋ−について選択し
    て、温度抵抗性ＰＲＹｔｋ−欠失突然変異体を生産する
    こと、からなる方法により生産されたことを特徴とする
    ｔｋ遺伝子の欠失の結果として機能的ＴＫを生産するこ
    とができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ５９、前記欠失が約ｔｏ〜１５００ｂｐの大きさである
    、特許請求の範囲第５８項記載の機能的ＴＫを生産する
    ことができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ６０、前記欠失が約７５〜７５０ｂｐの大きさである、
    特許請求の範囲第５９項記載の機能的ＴＫを生産するこ
    とができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ６１、前記ウィルスがＰＲＹ　（ＢＵＫ−ｄ　１３）（
    ＡＴＣＣＮｏ−ＶＲ−２０７４）である、特許請求の範
    囲第５８項記載の機能的ＴＫを生産することができない
    温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ６２、前記ウィルスが凍結乾燥されている、特許請求の
    範囲第５８項記載の機能的ＴＫを生産することができな
    い温度抵抗性偽狂犬病ウィル６３、前記クロー二〉・グ
    ベクターが、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、
    ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８、ｐＨＣ７９，ファージＣｈ
    ａｒｏｎ２８、ｐＫＢｌｌ、ｐＫＳＶ−１０、ｐＭＡＲ
    ４２０およびオリゴ（ｄＧ）ティルトｐＢＲ３２２から
    成る群より選択される、特許請求の範囲第５８項記載の
    機能的ＴＫを生産する“ことができない温度抵抗性偽狂
    犬病ウィルス。 ６４、前記クローニングベクトルがｐＢＲ３２２である
    、特許請求の範囲第６３項記載の機能的ＴＫを生産する
    ことができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ６５、工程（１）の前記交雑プラスミドがｐＢＢ−１１
    である、特許請求の範囲第５８項記載の機能的ＴＫを生
    産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ６６、欠失の各個に隣接するＰＲＶ　ＤＮＡが少なくと
    も約４００ｂｐの大きさである、特許請求の範囲第５８
    項記載の機能的ＴＫを生産することができない温度抵抗
    性偽狂犬病ウィルス。 ６７、工程（４）の得られる交雑プラスミドがｐＢＢ−
    １１ｄｉ　５ａｃＡ２６である、特許請求の範囲第５８
    項記載の機能的ＴＫを生産することができない温度抵抗
    性偽狂犬病ウィルス。 ６８、前記温度抵抗性ＰＲＹ　ｔｋ−突然変異原誘発突
    然変異体がＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ）（ＡＴＣＣＮｏ、
    ＶＲ−２０７８）である、特許請求の範囲第５８項記載
    の機能的ＴＫを生産することができない温度抵抗性偽狂
    犬病ウィルス。 ６９、工程（５）の前記ＰＲＹ　ｔｋ”　ＤＮＡがＰＲ
    Ｙ　（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）である、特許請求の範囲第
    ５８項記載の機能的ＴＫを生産することができない温度
    抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ７０、前記ｔｋ＋宿主細胞が、Ｒａｂ−９，１次ウサギ
    腎細胞、２次ウサギ腎細胞、サル細胞、ヒト細胞、ヒト
    胚腎細胞およびニワトリ胚線維芽細胞から成る群より選
    択される、特許請求の範囲第５８項記載の機能的ＴＫを
    生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ７１、前記ｔｋ＋宿主細胞がＲａｂ−９である、特許請
    求の範囲第７０項記載の機能的ＴＫを生産することがで
    きない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ７２、（１）ｔｋ遺伝子の欠失の結果として機能的ＴＫ
    を生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス
    の製薬学的に有効量、および（２）製薬学的に許容され
    うる担体または希釈剤、 からなることを特徴とする偽狂犬病のための変性された
    生きているウィルスのワクチン。 ７３、前記欠失が約１Ｏ−１５００ｂｐの大きさである
    、特許請求の範囲第７２項記載の偽狂犬病のための変性
    された生きているウィルスのワクチン。 ７４、前記欠失が約７５〜７５０ｂｐの大きさである、
    特許請求の範囲第７３項記載の偽狂犬病のだめの変性さ
    れた生きているウィルスのワクチン。 ７５、前記ウィルスがＰＲＹ　（ＢＵＫ−ｄ　１３）（
    ＡＴＣＣＮｏ　、ＶＲ−２０７４）の同定特性を有する
    、特許請求の範囲第７２項記載の偽狂犬病のための変性
    された生きているウィルスのワクチン。 ７６、前記ウィルスが凍結乾燥されている、特許請求の
    範囲第７２項記載の偽狂犬病のための変性された生きて
    いるウィルスのワクチン。 ７７、製薬学的に許容されうる担体または希釈剤がＰＲ
    Ｖに対する抗体を含有しない約２．５〜１５％の血清を
    含有する生理学的緩衝媒質である、特許請求の範囲第７
    ２項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウィ
    ルスのワクチン。 ７８、前記血清が、ブタ血清、子牛血清、胎児子牛血清
    、ウマ血清および子羊血清から成る群より選択される、
    特許請求の範囲第７７項記載の偽狂犬病のための変性さ
    れた生きているウィルスのワクチン。 ７９、製薬学的に許容されうる担体または希釈剤が約０
    ．５〜３．０％の血清タンパク質を含有する生理学的緩
    衝媒質である、特許請求の範囲第７２項記載の偽狂犬病
    のための変性された生きているウィルスのワクチン。 ８０、前記血清が、ブタ血清アルブミンおよびウシ血清
    アルブミンから成る群より選択される、特許請求の範囲
    第７９項記載の偽狂犬病のための変性された生きている
    ウィルスのワクチン。 ８１、前記製薬学的に有効量が約ｔＯＳ〜５×１０８ｐ
    、ｆ、ｕ、である、特許請求の範囲第７２項記載の偽狂
    犬病のための変性された生きているウィルスのワクチン
    。 ８２、前記製薬学的に有効量が約１０”〜１０７ｐ、ｆ
    、ｕ、である、特許請求の範囲第８１項記載の偽狂犬病
    のための変性された生きているウィルスのワクチン。 ８３、（１）ｔｋ遺伝子の欠失の結果として機能的ＴＫ
    を生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウィルス
    の製薬学的に有効量からなり、前記温間抵抗性偽狂犬病
    ウィルスは、工程（ａ）クローニングベクターと、ＰＲ
    Ｖｔｋ遺伝子の実質的にすべてを含有するＰＲＹのＤＮ
    Ａ断片とからなる交雑プラスミドを構成し、 （ｂ）工程（ａ）の交雑プラスミドを、ｔｋ＋宿主細胞
    中において、温度抵抗性ＰＲＹｔｋ−突然変異原誘発突
    然変異体からのＤＮＡで同時トランスフェクションし、 （ｃ）ｔｋ−宿主細胞中において、工程（ｂ）において
    生産されたウィルスからのＰＲＶ　ｔｋ＋について選択
    し、 （ｄ）ＰＲＶ　ｔｋ遺伝子の実質的にすべてより少ない
    ものが存在し、同時に欠失の各個に隣接してＰＲＹ　Ｄ
    ＮＡ配列を保持するように、工程（ａ）の交雑プラスミ
    ドからＤＮＡ配列を欠失させ、 （ｅ）ｔｋ＋宿主細胞中において、工程（Ｃ）において
    得られたＰＲＹ　ｔｋ＋がら誘導されたＰＲＹ　ｔｋ”
    　ＤＮＡを工程（ｄ）の得られる交雑プラスミドで同時
    トランスフェクションし、そして （ｆ）ｔｋ−宿主細胞中において、工程（ｅ）において
    生産されたウィルスからのＰＲＶ　ｔｋ−について選択
    して、温度抵抗性ＰＲＶ　ｔｋ−欠失突然変異体を生産
    する、からなる方法によって生産され、そして（２）製
    薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 を含有することを特徴とする偽狂犬病のための変性され
    た生きているウィルスのワクチン。 ８４、前記欠失が約１０〜１５００ｂｐの大きさである
    、特許請求の範囲第８３項記載の偽狂犬病のための変性
    された生きているウィルスのワクチン。 ８５、前記欠失が約７５〜７５０ｂｐの大きさである、
    特許請求の範囲第８４項記載の偽狂犬病のための変性さ
    れた生きているウィルスのワクチン。 ８６、前記ウィルスがＰＲＹ　（ＢＵＫ−ｄ　１３）（
    ＡＴＣＣＮｏ−ＶＲ−２０７４）である、特許請求の範
    囲第８３項記載の偽狂犬病のための変性された生きてい
    るウィルスのワクチン。 ８７、前記ウィルスが凍結乾燥されている、特許請求の
    範囲第８３項記載の機能的ＴＫを生産することができな
    い温度抵抗性偽狂犬病ウィルス。 ８８、前記クローニングベクターが、ｐＢＲ３２２、Ｐ
    ＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８、ｐ
    ＨＣ７９，ファージＣｈａｒｏ　ｎ２８、ｐＫＢｌｌ、
    ｐＫｓＶ−１０，ｐＭＡＲ４２０およびオリゴ（ｄＧ）
    ティルトｐＢＲ３２２から成る群より選択される、特許
    請求の範囲第８３項記載の偽狂犬病のための変性された
    生きているウィルスのワクチン。 ８９、前記クローニングベクターがｐＢＲ３２２である
    、特許請求の範囲第８８項記載の偽狂犬病のための変性
    された生きているウィルスのワクチン。 ９０、工程（ａ）の前記交雑プラスミドがｐＢＢ−１１
    である、特許請求の範囲第８３項記載の偽狂犬病のため
    の変性された生きているウィルスのワクチン。 ９１、欠失の各側に隣接するＰＲＶ　ＤＮＡが少なくと
    も約４００ｂｐの大きさである、特許請求の範囲第８３
    項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウィル
    スのワクチン。 ９２、工程（ｄ）の得られる交雑プラスミドがｐＢＢ−
    １１ｄｌ　５ａｃＡ２６である、特許請求の範囲第８３
    項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウィル
    スのワクチン。 ９３、前記温度抵抗性ＰＲＹ　ｔｋ−突然変異原誘発突
    然変異体がＰＲＶ　（ＢＵＫ−５Ａ）（ＡＴＣＣＮｏ、
    ＶＲ−２０７８）である、特許請求の範囲第８３項記載
    の偽狂犬病のための変性された生きているウィルスのワ
    クチン。 ９４、工程（ｅ）の前記ＰＲＹ　ｔｋ”　ＤＮＡがＰＲ
    Ｙ　（ＢＵＫ−５Ａ−Ｒ１）である、特許請求の範囲第
    ８３項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウ
    ィルスのワクチン。 ９５、前記ｔｋ＋宿主細胞が、Ｒａｂ−９，１次ウサギ
    腎細胞、２次ウサギ腎細胞、サル細胞、ヒト細胞、ヒト
    胚腎細胞およびニワトリ胚線維芽細胞から成る群より選
    択される、特許請求の範囲第８３項記載の偽狂犬病のた
    めの変性された生きているウィルスのワクチン。 ９６、前記ｔｋ“宿主細胞がＲａｂ−９である、特許請
    求の範囲第９５項記載の偽狂犬病のための変性された生
    きているウィルスのワクチン。 ９７、製薬学的に許容されうる担体または希釈剤がＰＲ
    Ｙに対する抗体を含有しない約２．５〜１５％の血清を
    含有する生理学的緩衝媒質である。特許請求の範囲第８
    ３項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウィ
    ルスのワクチン。 ９８、前記血清が、ブタ血清、子牛血清、胎児子牛面清
    、ウマ血清および子羊血清から成る群より選択される、
    特許請求の範囲第９７項記載の偽狂犬病のための変性さ
    れた生きているウィルスのワクチン。 ９９、製薬学的に許容されうる担体または希釈剤が約０
    ．５〜３．０％の血清タンパク質を含有する生理学的緩
    衝媒質である、特許請求の範囲第８３項記載の偽狂犬病
    のための変性された生きているウィルスのワクチン。 １００、前記血清が、ブタ血清アルブミンおよびウシ血
    清アルブミンから成る群より選択される。特許請求の範
    囲第９９項記載の偽狂犬病のための変性された生きてい
    るウィルスのワクチ１０１、前記製薬学的に有効量が約
    １０’〜５ＸＩＯ”　ｐ、ｆ、ｕ、である、特許請求の
    範囲第８３項記載の偽狂犬病のための変性された生きて
    いるウィルスのワクチン。 １０２、前記製薬学的に有効量が約１０６〜１０’　ｐ
    、ｆ、ｕ、である、特許請求の範囲第１０１項記載の偽
    狂犬病のための変性された生きているウィルスのワクチ
    ン。
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