JP2941804B2 - 変性された生きている偽狂犬病ウイルスを含有する偽狂犬病ワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、変性された生きている偽狂犬病ウイルス、
それを含有する偽狂犬病ワクチン、それを生産する方法
およびそれを使用する方法に関する。 偽狂犬病（Pseudradies Disease） 偽狂犬病、ブタおよび他の家畜類、例えば、ウイル
ス、ヒツジおよびヤギの高度に伝染性の病気、はヘルペ
スウイルス・スイス（Herpesvirus suis）（以後「偽
狂犬病ウイルス」または「PRV」と呼ぶ）により引き起
こされる。ブタにおいて、この病気は死へ進行しうる呼
吸の病および脳炎を引き起こす。ブタにおける感染の他
の共通の結果は、流産、新生児の死、同産群のサイズの
減少、および成長速度の遅延である。他の家畜類におい
て、最も顕著には畜牛において、PRVの感染は致死の脳
炎に進行することをほとんど避けることができない。 偽狂犬病は主要な脅威となり、そして世界を通じてブ
タの産業への経済的損失を引き起こした。また、畜牛お
よび他の飼育場の動物に対する偽狂犬病の広がりについ
てかなりの驚きが存在する。最近10年似内に、より悪性
のPRVの株の出現および前記病気の広がった散在のた
め、経済的損失が増大した。今日、10年前の0.8％より
小に比較して、米国において飼育場の８×10⁷匹の食用
豚の8.0％が感染していると推定される。 PRV感染の臨床的徴候および結果は、PRVの殺した株ま
たは弱毒した株からなるワクチンの使用により減じある
いは防止することができるであろう。しかしながら現存
するワクチンは、PRVおよび他のアルファヘルペスウイ
ルス、例えば、ヘルペス単純ウイルスＩ型および２型
（以後、それぞれ「HSV−１」および「HSV−Ｓ］と呼
ぶ）、水痘帯状疱疹、ウシの感染性リノトラデイチス
（rhinotracheitis）ウイルス（以後、「IBRV」と呼
ぶ）、マーモセットのヘルペスウイルス（以後、「MarH
V」と呼ぶ）、およびウマのヘルペスウイルム１型の独
特の特徴のため、偽狂犬病の広がりを抑制することはで
きなかった。 より詳しくは、アルファヘルペスウイルムは潜伏状態
へ入ることができる特別の能力を有する。この潜伏状態
は他の族のウイルスでは起こらない。すなわち、動物が
初期の分化していない（generalized）感染から回復す
るとき、アルファヘルペスウイルスは体の免疫防御に対
して静止性および不浸透性となる神経系の部分へ後退す
る。この潜伏の感染、すなわち、潜伏期は予期せざるこ
とには再活性化され、病気の再発または保菌状態として
知られる伝染状態を生ずることがあり、ここで感染され
た動物は病気の外部の徴候を示さないが、感染性アルフ
ァヘルペスウイルスを不連続的に伝搬しあるいは「発し
（shed）」て、感染を広がらせる。 既知の変性された生きているウイルスPRVのワクチン 従来の変性された生きているウイルスPRVのワクチン
は、ニワトリおよび／またはサルの組織培養細胞中のウ
イルスの多数の継代により生産されてきた〔スコダ・ア
ール、ブラウナー・アイ、サデツキー・イーおよびメイ
ヤー・ヴイ、「アクタ・ビロロジカ」（Skoda,R.,Braun
er,I.,Sadecky,E.,and Mayer V.Acta Virol．）８:1−
９（1964）並びにバーサ・エイ「マギー・オーラトルブ
・ラプジヤ」（Bartha,A.Magy．Allatorv．Lapja）16:4
2−45（1961）参照〕。組織培養の継代の間、突然変異
はウイルスがその新しい環境に適合するとき蓄積する。
これらの特定されない突然変異は自然宿主中のウイルス
の増殖に悪影響を及ぼし、ウイルスの減衰を生ずる。 現在市販されている変性された生きているウイルスPR
Vのワクチンを使用するときの問題は、動物が潜伏する
ワクチンのウイルスの保菌体となることである。結局、
これらのワクチンはそれらの安全性および有効性を妨害
する２つの望ましくない場合を生ずる。第１に、新生児
の流産、死産および胎児の感染は、ウイルスがワクチン
接種された保菌体により発せられるとき、あるワクチン
のウイルスにより引き起こされうる。第２に、ある群内
のワクチンのウイルスの反復循環は、ワクチンのウイル
スが病原性親株に復帰するように、減衰の過程の逆転を
生じうる。このような環境下に、広がったワクチン接種
は病気を散在を望ましくないように促進する。 前述の不適当性に加えて、既知のPRVワクチンは、病
気の症候を実質的に最小とするが、病原性の場の菌株
（field strain）で潜伏感染を動物が獲得することを
防止しない。こうして、ワクチン接種にかかわらず、動
物は病気の保菌体となり、ウイルスを感受性の動物へ伝
搬することがある。病気のこれらの保菌体は、飼育場と
市場との間を動くが、前述のような潜伏のワクチンのウ
イルスばかりでなく、また病気のウイルスを発する。こ
れは地理学的障壁および国境を横切って病気の望ましく
ない伝搬を生ずる。 アルファヘルペスウイルスの作用モード 許容細胞が感染すると、アルファヘルペスウイルスは
ウイルスのライフサイクルに対して重要なウイルス符号
化酵素（virus−encodad enzymes）の合成を誘発する
〔キット．エス.:薬理学及び治療学、編者、エー・シー
・サトレリイ；編者に従う専門家、デイ・シユガー（ペ
ルガモンプレス，リミテツド：オツクスホード）第４
巻、501−585（1979）（Kit,S.In:Pharmacology and
Therapeutics.Ed.A.C.Satorelli;Specialist Subject E
d.D.Shugar（Pergamon Press,Ltd.:Oxford）Vol.４:501
−585（1979））参照〕。チミジンキナーゼ（以後「T
K」はアルファヘルペスウイルスのゲノムにより符号化
された酵素、例えば、HSV、IBRV、MarHVおよびPRV〔ダ
ブス．デイー．アール及びキツト．エス．「ビロロジ
ー」22:493−502（1964）；キツト．エス.,ロイング，
ダブリユ．−シー.,ジヨルゲンセン，ジー，エヌ.,トラ
クラ，デイー.,及びダブス，デイー，アール．「プログ
レス イン メデイカル ヒロロジ」21:13−34（197
5）；ギツド，エス.,及びクアビ．エイチ.,「ビロロジ
ー」130:381−389（1983）及びキツド．エス.,クアビ，
エイチ.,ダブス，デイー，アール.,及びオオツカ．エイ
チ．「ジヤーナル オブ メデイカル ビロロジー」2
1:25−36（1983）（Dubbs,D.R.and Kit,S.Virology 2
2:493−502（1964）;Kit,S.,Leung,W.−C.,Jorgensen,
G.N.,Trkula,D.,and Dubbs,D.R.Progr．Med．Virol．2
1:13−34（1973）;Kid,S.,and Qavi,H.,Virology 130:
381−389（1983）;and Kid.S.,Qavi,H.,Dubbs,D.R.,and
Otsuka,H.Ｊ．Hed．Virol．12:25−36（1983））参
照〕。正常の組織培養条件下に、TKはウイルスの増殖に
必須ではない。しかしながら、TKは動物における感染の
病理学において重要な役割を演ずる。 TKの機能はデオキシチミジンをデオキシチミジンモノ
ホスヘート（以後「dTMP」）へのホスホリル化を接触す
る。デオキシチミジンモノホスフェートは、順次に、さ
らにdTTP、すなわち、DNAの必須のビルディングブロッ
クにホスホリル化される。TKはまたDNAの他の必須のビ
ルディングブロック、すなわち、dCTP、dGTPおよびdATP
の合成を間接的に促進する。アルファヘルペスウイルス
は、これらのビルディングブロックの不存在下にそれら
自体増殖することはできない〔キツト．エス．ロイン
グ，ダブリユ．−シー.,ジヨンゲンセン，ジー．エヌ.,
トルクラ．デイー.,及びダブス，デイー．アール．「プ
ログレス イン メデイカルビロロジー」（Kit,S.,Leu
ng,W.−C.,Jorgensen,G.N.,Trkula,D.,and Dubbs.D.R.P
rogr．Med．Virol．），21:13−34（1975）〕参照。 宿主のほとんどの組織は、十分な量の内生細胞TK、す
なわち、宿主のゲノムによりコード（本明細書では「符
号化」という場合あり）されたTKを生成しでデオキシチ
ミジンからdTMPおよびdTTPの合成を可能とし、こうして
ウイルスの増殖を可能とする。しかしながら、非分割組
織、例えば、神経組織はほんの低いレベルの内生細胞TK
を生成し、こうして十分なウイルスのDNAの合成を支持
するだけであり、こうしてTKが感染性ウイルスにより提
供されるとき、ウイルスの増殖を支持するだけである。
神経組織の感染の支持および神経節における潜伏の感染
の確立におけるウイルス符号化TKの重要な役割は、この
酵素の誘発に欠ける（以後「tk^-」）HSV、MarHVおよびP
RV突然変異体の研究において立証された。 より詳しくは、HSV tk^-突然変異体は、神経節におい
て複製する能力あるいは潜伏の感染を確立する能力が減
少している〔フイールド．エイチ．ジエイ．及びウイル
デイ．ピー「ジャーナル オブ ハイジーン ケンブリ
ッジ」（Field H.J.and Wildy,P.Ｊ．Hyg.,Camb．），8
1:267−277（1978）；フイールド．エイチ.,ジエイ．ア
ンダーソン，ジエイ．アール及びウイルデイー，ピー，
「ジヤーナル オブ ジエネラル ビロロジー」59（Fi
eld,H.,J.Anderson,J.R.and Wildy.P.Ｊ．Gen．Viro
l．）59:91−99（1982）；クライン，アール，ジエイ.,
デステフアノ，イー.,ブラツデイ，イー.,ブラツシイ，
イー.,及びフリードマン−キイーン，エイ．イー．「ア
ーキブス オブ ビロロジー」（Klein,R.J.,Destefan
o,E.,Brady,E.,Brasy,E.,and Friedman−Kien,A.E.Arc
h．Virol．），65,237−246（1980）；プライス，アー
ル．ダブリユ及びカーン，エイ．「インフエクシヨン
アンド イムニテイ」（Price,R.W.and Khan,A.Infec
t．Immun．），34:571−580（1981）；及びテンサー，
アール，ビー，レツセル，エス及びダンスタン，エム．
イー．「ビロロジー」（Tenser,R.B.,Ressel,S.,and Du
nstan,M.E.Virolgy），112:328−341（1981）参照〕。
潜在の感染の時折の場合において、HSV tk−突然変異
体はウイルスの再現および発散（shedding）により検出
されるように、再活性化することが困難であった。さら
に、動物が非常に大きい投与量のウイルスにより感染さ
れた後ウイルスが潜伏を確立しかつウイルスが再活性化
さるた場合にいて、発散されたウイルスは非発病性、す
なわち、無毒性にとどまった。また、HSV tk−突然変
異体が抹消神経を上昇して脳の中へ入って脳炎を引き起
こす能力は削減される。さらに、脳内に注入されたHSV
tk^-突然変異体は比較的有害ではない。 さらに、マウスはtk⁺ウイルスについての致死投与量
よりも数ログ（log）多い投与量の突然変異体PRV tk^-
または突然変異体MarHV tk^-を安全に接種することがで
きる〔キツト，エス.,クアビ，エム．ダブス，デイー．
アール．及びオオツカ，エイチ，「ジヤーナル オブ
メデイカル ビロロジー」（Kit.S.,Qavi,M.Dubbs,D.R.
and Otsuka,H.Ｊ．Med．Virol．），12:25−36（198
3）；及びテンサー，アール．ビー.,レツセル，エス．
ジエイ.,フラリツシユ，エフ．エイ及びジヨーンズ，ジ
エイ．シー．「ジヤーナル オブ ジエネラル ビロロ
ジー」（Tenser,R.B.,Ressel,S.J.,Fralish,F.A.and Jo
nes.J.C.Ｊ．Gen．Virol．），64:1369−1373（1983）
参照〕。 薬物誘発tk^-ウイルス突然変異体 多くのヌクレオシド類似体はアルファヘルペスウイル
スの複製を阻害することが示された。抗ウイルスヌクレ
オシドは、次のものを包含する：チミジンの類似体、例
えば、５−ブロモデオキシウリジン、５−ヨードデオキ
シウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、トリフル
オロデオキシチミジン、５−ブロモビニルデオキシウリ
ジンおよび５′−アミノ−５−ヨードデオキシウリジン
（以後、それぞれ「BrdUrd］、「IdUrd］、「FdUrd］、
「F₃dThd］、「BVDU」および「AIdUrd］）；デオキシシ
チジンの類似体、例えば、ヨードデオキシシチジンおよ
びブロモデオキシシチジン（以後、それぞれ「IcCyd」
および「BrdCyd」）；チミジンおよびデオキシシチジン
のアラビノシル類似体、例えば、アルビノシルチミジ
ン、２′−フルオロ−５−ヨードアラビノシルシトシン
および２′−フルオロ−５−メチル−アルビノシルウラ
シル（以後、それぞれ「araT」、「FIAC」および「FMA
U」）；およびグアニンのアシクロ誘導体、例えば、ア
シクログアノシンおよび９−1,3−ジヒドロキシ−２−
プロポキシメチルグアノシン（以後、それぞれ「ACG」
および「DHPG」）〔シエン，ワイ．−シー.,ダツチマ
ン，ジー.,フオツクス，ジエイ．ジエイ.,ワタナベ，ケ
イ．エイ．及びマクヒダ，エイチ．「アンチマイクロバ
イアル エージエント アンド ヘモセラピー」（Chen
g,Y.−C.,Dutschman,G.,Fox,J.J.,Watanabe,K.A.and Ma
chida,H.Antimicrob．Agents Chemother．），20:420
−423（1981）；エリオン ジー．ビー.,フルマン，ピ
ー．エイ.,フアイフエ，ジエイ．エイ.,デミランダ，ピ
ー.,ボーシヤンプ，エル.,及びシエツフアー，エイチ．
ジエイ．「プロシーデイングス オブ ザ ナシヨナル
アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユーエス
エイ」（Elion G.B.,Furman,P.A.,Fufe,J.A.,Demirand
a,P.,Beauchamp,L.,and Schaeffer,H.J.Proc．Nat．Aca
d．Sci．USA），74:5715−5720（1977）；プルゾツフ，
ダブリユ．イー.,ヘン，エム．エス.,リン，テイー．−
エス.,及びフイツシヤー，ピー．エイチ：「アンチバイ
ラル ヘモセラピー」：ウイルス機能の抑制剤のデザイ
ン．編者ケイ．ケイ．ガウリ（アカデミツク プレス
インコーポレイテツド：ニユーヨーク）197−206（198
1）（Prusoff,W.E.,Chen,M.S.,Lin,T.−S.,and Fische
r,P.H.In:Antiviral Chemotherapy：Design of Inhi
bitors of Viral Functions.Ed.K.K.Gauri.（Academ
ic Press,Inc.New York）,pp.197−206（1981））：及
びベエリセツテイ，ブイ．及びジエントリー，ジー．エ
イ．「ジャーナル オブ ビロロジー」．（Veerisett
y,V.and Gentry,G.A.Ｊ．Virol．），46:901−908（198
3）参照〕。 前述のヌクレオシド類似体はそれらの活性において異
る。例えば、HSV−１の複製を阻害するために必要なBVD
UおよびACGの濃度はHSV−２の複製を阻害するために必
要な濃度よりも有意に低い。さらに、FIAC、ACGおよびD
HPGはHSV−１およびHSV−２の両者に対して有用な薬物
であるが、PRVおよびIBRVに対して無効である。 これらの薬物がアルフアヘルペスウイルスの複製を阻
害する機構は変る。しかしながら、ヌクレオシド類似体
のすべては、それらが抗ウイルス作用を及ぼすことがで
きる前に、ヌクレオシドトリホスフェートに活性化しな
くてはならない。この活性化における第１工程は、再利
用経路（salvage pathway）酵素、TKの触媒作用を必要
とする。TK活性の不存在において、これらの抗ウイルス
薬物のほとんどは阻害性ではない。 前述のように、内生細胞TKはデオキシチミジンのdTMP
へのホスホリル化を触媒する。内生細胞TKは、また、デ
オキシウリジンのデオキシウリジンモノホスフェート
（以後、「dUMP」）、すなわち、dTMPの前駆物質、への
ホスホリル化を触媒する。さらに、内生細胞TKはいくつ
かのヌクレオシド、すなわち、BrdUrd、IdUrd、FdUrd、
F₃dThdのホスホリル化を触媒する。こうして、これらの
類似体は細胞毒性ならびに抗ウイルス活性を有する。他
方において、araT、BVDU、FIAC、ACGおよびDHPGは内生
細胞TKのための劣った基質である。すなわち、これらの
類似体はウイルスの複製を阻害するが、細胞の複製を阻
害しない。 HSV符号化（encoded）TKはその広い基質特異生につい
て類似する。すなわち、HSV符号化TKは、デオキシチミ
ジンおよびデオキシシチジンおよびそれらの類似体；デ
オキシチミジンおよびデオキシシチジンのアラビノシル
誘導体、例えば、FMAUそしてFIAC;ACGおよびDHPGのホス
ホリル化を効率よく触媒する。 PRV符号化TKはHSV符号化TKと多くの生化学的性質にお
いて類似するが、HSV符号化TKと抗原決定基および基質
特異性において異る〔キツト，エス.,ルング，ダブリ
ユ．−シー.,ジヨルゲンセン，ジー．エヌ.,トルクラ，
デイー及びダブス，デイー．アール．「プログレス イ
ン メデイカル ビロロジー」（Kit.S.,Lung,W.−C.,J
orgensen,G.N.,Trkula,D.,and Dubbs,D.R.Progr．Med．
Virol．），21:13−32（1975）；及びキツト，エス：
「フアーマコロジー アンド セラピユーテイツクス」
編者、エイ．シー．サルトレリー：編者に従う専門家．
シユガー（ペルガモン プレス リミテツド.:オツクス
フオード）第４巻:501−585（1979）（Kit,S.In:Phamac
ology and Therapeutics.Ed.A.C.Sartorelli;Special
ist Subject Ed.Shugar.（Pergamon Press.Ltd.:Oxfor
d）.vol.４:501−585（1979））参照〕。すなわち、PRV
符号化TKは、デオキシチミジン類似体、例えば、BraUr
d、F₃dThd;およびardTのホスホリル化を触媒するが、デ
オキシシチジンおよびその類似体；またはACGおよびDHP
Gを効率よくホスホリル化しない。 抗ウイルス薬物がデオキシリボヌクレオシドトリホス
フェートに活性化された後、各々はアルファヘルペスウ
イルス感染細胞内で異るように代謝される。BrdUrd、Id
UrdおよびBVdUはウイルスのDNA中のデオキシチミジンの
代わりに広範に組み込まれる〔アローデイーン，エイ
チ．エス.,ヘン，エム．エス.,リー，ジエイ．ジエイ.,
デ クラーク，イー.,及びプルゾツフ，ダブリユ．エイ
チ．「ジヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー」（Allaudeen,H.S.,Chen,M.S.,Lee,J.J.,De Clercq,
E.,and Prusoff,W.H.Ｊ．Biol．Chem．），257:603−60
6（1982）；デ クラーク，イー．「アーシベ インタ
ーナシヨナーレ デ フイジオロジー エ デ バイオ
ヒミー」（De Clercq,E.Arch．Int．Physiol．Biochi
m．），87:353−395（1979）；ライスソン．エイ．及び
オバーグ，ビー．「アンチマイクロバイアル エージエ
ント アンド ヘモセラピー」（Larsson,A.and Obera,
B.Antimicrob．Agents Chemother．），19:927−929
（1981）；プルゾツフ，ダブリユ．イー.,ヘン，エム．
エス．リン，テイ．−エス.,及びフイツシヤー，ピー．
エイチ：「アンチバイラルヘモセラピー」：ウイルス機
能の抑制剤のデザイン．編者．ケイ．ケイ．ガウリ（ア
カデミツク プレス インコーポレーテツド：ニユーヨ
ーク）,197−206（1981）（Prusoff,W.E.,Chen,M.S.Li
n,T.−S.,and Fischer,P.H.In:Antiviaral Chemothera
py：Design of Inhibitors of Viral Functions.E
d.K.K.Gauri.（Academic Press,Inc.:New York）,pp.19
7−206（1981））；及びシム，アイ．エス.,グツドチヤ
イルド，ジエイ.,メレデイス，デイ．エム．ポーター，
アール．エイ.,ルペール，アール．エイチ.,ビネイ．ジ
エイ.,及びワツズワース，エイチ．ジエイ．「アンチマ
イクロバイアル エージエント アンド ヘモセラピ
ー」（Sim,I.S.,Goodchild,J.,Meredith,D.M.Porter,R.
A.,Ruper,R.H.,Viney,J.,and Wadsworth,H.J.Antimicro
b．Agents Chemother．），23:416−421（1983）参
照〕。この組み込みはウイルスのゲノムを不安定化し、
後にその転写および翻訳を不安定化することがある。Br
dUrd、IdUrdおよびBVDUのトリホスフェートは、また、
デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートのプールを
徹底的に変更する。トリホスフェートのプールにおいて
得られる不均衡は突然変異の頻度を増大しおよび／また
はDNAの生合成の他の鍵酵素、すなわち、リボヌクレオ
シドジホスフェートリダクダーゼを阻害することがある
〔ナカマヤ，ケイ.,ルス，ジエイ．エル及びヘング，ワ
イ．−シー．「ジヤーナル オブ ビロロジー」（Naka
yama,K.,Ruth,J.L.,and Cheng,Y.−C.Ｊ．Virol．），4
3:325−327（1982）参照〕。 多くの類似体、例えば、araT、FMAUおよびFIACのトリ
ホスフェートは、アルファヘルペスウイルスDNAポリメ
ラーゼにより優先的に結合され、そしてDNA合成におけ
る自然トリホスフェートの利用を拮抗的に阻害する〔ル
ス，ジエイ．エル及びヘング，ワイ．−シー．「モレキ
ユラー フアーマコロジー」（Ruth,J.L.and Cheng,Y.
−C.Mol．Pharmacol．）201:415−522（1981）参照〕。
それらは、また、非解離性錯体を形成するアルフアヘル
ペスウイルスDNAポリメラーゼへ結合することができ
る。 ACGのトリホスフェートはHSV感染細胞中のDNA合成に
選択的に利用されるが、薬物が３′−ヒドロキシ基を欠
くため、 DNA鎖を停止する。araT、FMAUおよびFIACはH
SVのDNA合成を選択的に阻害するが、複製するDNA鎖中に
有意に組み込まれない。 ヌクレオシド類似体の抗ウイルス効果を回避するため
に、アルファヘルペスウイルスは薬物抵抗性に突然変異
する。薬物抵抗性突然変異体は、すべての反復するアル
ファヘルペスウイルス集団中に約10^-3〜10^-5の発生率
で、DNAの反復機構の不完全性のために生ずる。 薬物抵抗性アルファヘルペスウイルス突然変異体の３
つの型、すなわち、次のものをもつアルファヘルペスウ
イルスが検出された：（１）ウイルスのtk遺伝子におけ
る突然変異；（２）ウイルスのDNAポリメラーゼ遺伝子
における突然変異；および（３）両者の遺伝子における
突然変異。 ウイルスのTKおよびウイルスのDNAポリメラーゼ遺伝
子における突然変異は、追加の部類に再分割することが
できる。すなわち、ウイルスのTKおよびウイルスのDNA
ポリメラーゼ遺伝子の突然変異のあるものは活性を完全
に損失させるが、他のものは活性を部分的にのみ損失さ
せるか、あるいはそれらの基質を認識する突然変異体酵
素の能力を選択的に減少させるだけである〔ベーリセツ
テイ．ブイ．及びジエントリー．ジー．エイ．「ジヤー
ナル オブ ビロロジー」（Veerisetty.V.and Gentry,
G.A.Ｊ．Virol．），46:901−908（1983）；ラーダー，
ビー，エイ.,ダース，デイ.,ヘング，ワイ．−シー.,及
びダーバイ，ジー・「ジヤーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー」（Larder,B.A.,Derse,D.,Cheng,Y.
−C.,and Dardy,G.Ｊ．Biol．Chem．），259:2027−203
3（1983）；ルス，ジエイ．エル．及びヘング．ワイ．
−シー．「モレキユラー フアーマコロジー」（Ruth,
J.L.and Cheng,Y.−C.Mol．Pharmacol．），20:415−52
2（1981）；及びシム，アイ．エス.,グツドチヤイル
ド，ジエイ.,メレデイス，デイー．エム.,ポーター，ア
ール．エイ．ルぺール，アール．エイチ.,ビネイ，ジエ
イ.,及びワズワース，エイチ．ジエイ．「アンチマイク
ロバイアル エージエント アンド ヘモセラピー」
（Sim,I.S.,Goodchild,J.,Meredith,D.M.,Porter,R.A.R
uper,R.H.,Viney,J.,and Wadsworth,H.J.Antimicrob．A
gents Chemother．），23:416−421（1983）参照〕。 薬物抵抗性を発現する最も有効な機構は、ウイルスの
TK活性の表現（本明細書では「表現」という場合あり）
を排除することである〔ダブス．デイ．アール及びキツ
ト，エス．「ビロロジー」（Dubbs,D.R.and Kit,S.Viro
logy），22:214−225（1964）；及びダブス，デイー．
アール．及びキツド，エス．「ビロロジー」（Dubbs,D.
R.and Kit,S.Virology），22:493−502（1964）参
照〕。すなわち、機能的TKポリペプチドを合成すること
ができないアルファヘルペスウイルス突然変異体は、ウ
イルスのDNAポリメラーゼが変更されるか否かに無関係
に、ヌクレオシド類似体を毒性の代謝物にホスホリル化
することができない。それにもかかわらず、これらの突
然変異体は正常の組織培養条件下に増殖させることがで
きない。こうして、ヌクレオシド類似体の存在下のアル
ファヘルペスウイルスの培養は、TK活性に欠ける自発的
および誘発された突然変異体の選択および強化（enrich
ment）を許容しない。 KT活性に欠けるウイルスのTK突然変異体のいくつかの
異る型は既知である。これらの突然変異体のあるもの
は、無傷であるが、非機能的なTKの合成を誘発する。こ
れらの突然変異体は、ポリペプチドの折りたたみ（fold
ing）を変異する酵素または突然変異、すなわち、温度
感受性のTK、の活性中心に変化したアミノ酸を有する。
他の突然変異体、例えば、HSV−１（B2006）は、多分ポ
リペプチドのアミノ末端付近のゴドンにナンセンス突然
変異の結果、TKの生産を誘発することができない。な
お、他の突然変異体は、tk遺伝子の中央におけるナンセ
ンス突然変異の結果、不活性の短いポリペプチドを誘発
する。この型の突然変異は、部分的TKの活性が回復され
うるので、「サプレッサーtRNAs」で「抑制（suppres
s）」されうる。最後に、TK活性をもたない突然変異体
はtk遺伝子の解読区域（coding region）内のヌクレオ
チドの欠失（deletion）から生ずる。 HSV tk^-またはワクシニアtk^-を得るために従来使用
されて第１手順は、BrdUrdを含有する生長培地における
いくつかの継代のために、tk^-マウス線維芽細胞、すな
わち、LM（TK^-）細胞中においてHSV−１またはワクシニ
アのウイルスの増殖、次いでBrdUrdを含有する培地中の
子孫のウイルスのプラーク精製を必然的に伴なった〔ダ
ブス，デイー．アール．及びキツト，エス．「ビロロジ
ー」（Dubbs,D.R.and Kit.S.Virology），22:214−225
（1964）；ダブス．デイー．アール．及びキツト．エ
ス．「ビロロジー」（Dubbs,D.R.and Kit.S.Virolog
y），22:493−502（1964）；及びキツド，エス．及びダ
ブス．デイー．アール．「バイオケミカル アンド バ
イオフイジカル リサーチ コミユニケイシヨンズ」
（Kid,S.and Dubbs,D.R.Biochem．Biophys．Res．Commu
n．），13:500−504（1963）参照〕。HSV−２（株33
3）、PRV（株Aujeszky）およびMarHV（株Falk）のtk^-突
然変異体も同様な手順により後に単離された〔キツト，
エス.,ロイング，ダブリユ．−シー.,ジヨルゲンセン，
ジー．エヌ.,トルクラ，デイー.,及びダブス，デイー．
アール．「プログレス イン メデイカル ビロロジ
ー」（Kit,S.,Leung,W.−C.,Jorgensen,G,N.,Trkula,
D.,and Dubbs,D.R.Progr．Med．Virol．），21:13−34
（1975）参照〕。 HSV−１、HSV−２、PRVおよびIBRVのtk^-突然変異体
は、また、宿主としてtk⁺組織培養細胞および、選択の
ため、非細胞毒性薬物、例えば、araT、BVDUおよびACG
を使用することにより得られた〔ベンポラツト，テイ
ー.,ビーチ，アール．エイ.,及びイハラ，エシ．「ビロ
ロジー」（BenPorat,T.,Veach,R.A.,and Ihara,S.Virol
ogy），127:194−204（1983）；フイールド，エイチ．
ジエイ.,アンダーソン，ジエイ．アール及びワイルデイ
ー，ピー，「ジヤーナル オブ ジエネラル ビロロジ
ー」（Field,H.J.,Anderson,J.R.,and Wildy,P.Ｊ．Ge
n．Virol．），49:91−99（1982）；フイールド，エイ
チ．ジエイ．及びネーデン，ジエイ．「アンチバイラル
リサーチ」（Field.H.J.and Neden,J.Antiviral Re
s．），２:243−254（1982）；ゴルドン，ワイ.,ギルデ
ン，デイー．エイチ.,シユトラム，ワイ．アスハー，テ
イー.,テーパー，イー.,ウエリツシユ，エム.,デブリ
ン，エム.,スニツパー，デイー.,ハダー，ジエイ.,及び
ベツカー，ワイ，「アーキブス オブ ビロロジー」
（Gordon,Y.,Gilden,D.H.,Shtram,Y.Asher,T.,Tabor,
E.,Wellish,M.,Devlin,M.,Snipper,D.,Hadar,J.,and Be
cker,Y.Arch．Virol．），76:39−49（1983）；カイ
ン，アール．ジエイ．「アーキブス オブ ヒロロジ
ー」（Kein,R.J.Arch．Virol．），72:143−168（198
2）；ラーダー，ビー．エイ.,デルス，デイー.,シエ
ン．ワイ．−シー.,及びダルバイ，ジー．「ジヤーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー」（Larder,B.
A.,Derse,D.,Cheng,Y.−C.,and Dardy,G.Ｊ．Biol．Che
m．），258:2027−2033（1983）；テンサー，アール．
ビー.,レツセル，エス.,及びデユンスタン，エム．イ
ー．「ビロロジー」（Tenser,R.B.,Ressel,S.,and Duns
tan,M.E.Virology），113:328−341（1981）；及びウエ
インマスター，ジー．エイ.,ミスラ，ブイ.,マクグイー
ル，アール.,バビウク，エル．エイ.,及びデ クラー
ク，イー.,「ビロロジー（Weinmaster,G.A.,Mistra,V.,
McGuire,R.,Babiuk.L.A.,and De Clercg,E.,Virolog
y），118:191−201（1982）参照〕。 高度に減衰することは別として、HSV−１、HSV−２お
よびMarHVのtk^-突然変異体の有効なワクチンとして機能
する。これらのtk^-ウイルスの突然変異体を接種した動
物は、致死量のtk⁺ウイルスを用いる抵抗（challenge）
に抵抗する〔フイールド，エイチ．ジエイ．及びワイル
デイー，ピー．「ジヤーナル オブ ハイジーン ケン
ブリッジ」（Field,H.J.and Wildy,P.Ｊ．Hyg.,Cam
b．），81:267−277（1978）：クライン，アール．ジエ
イ．「アーキブス オブ ビロロジー」（Klein,R.J.Ar
ch．Virol．），72:143−168（1982）；及びキツト，エ
ス.,クアビ，エイチ.,ダブス，デイー．アール．及びオ
オツカ，エイチ．「ジヤーナル オブ メデイカル ビ
ロロジー」（Kit,S.,Qavi,H.,Dubbs,D.R.and Otsuka,H.
Ｊ．Med．Virol），12:25−36（1983）参照〕。さら
に、HSVについて、tk^-ウイルスを接種した動物は、tk⁺
ウイルスで対抗したとき、潜伏的感染を発現する傾向が
少ないことが証明された。 これまで単離されてきたアルファヘルペスウイルスtk
^-薬物誘発突然変異体の多くは、それらをワクチンとし
て不適当とさせる２つの欠点を有する。第１に、部分的
TK活性をもつ突然変異体は有毒である〔ゴルドン，ワ
イ.,ギルデン，デイー．エイチ.,シユトラム．ワイ.,ア
スハー，ワイ.,テーパー，イー.,ウエリツシユ，エム.,
デブリン，エム.,スニツパー，デイー.,ハダー，ジエ
イ.,及びベツカー，ワイ．「アーキブス オブ ビロロ
ジー」（Gordon,Y.,Gilden,D.H.,Shtram,Y.,Asher,Y.,T
abor,E.,Wellish,M.,Devlin,M.,Snipper,D.,Hader,J.,a
nd Becker,Y.Arch．Virol．），76:39−49（1983）；ク
ライン．アール．ジエイ．「アーキブス オブ ビロロ
ジー」（Klein R.J.Arch．Virol．），72:143−168（19
82）；及びテンサー，アール．ビー.,レツセル，エス．
及びデユンスタン，エム．イー．「ビロロジー」（Tens
er,R.B.,Ressel,S.and Dunstan,M.E.Virology），112:3
28−341（1981）参照〕。第２に、tk^-突然変異体のある
ものの作業プール（working pool）は、10^-3〜10^-5の
頻度で自然tk⁺復帰異性体（revertant）を含有しうる。
次いで、これらのtk⁺復帰異性体は、tk^-突然変異体より
も生体内反復について選択的利点を有する。ほとんどの
薬物誘発tk^-ウイルスの突然変異体は復帰する潜在的能
力を有するが、復帰（reversion）の頻度は自然復帰の
頻度より低く、すなわち、約10^-5〜10^-7程度である〔キ
ヤンピオン−ピツカード，ジエイ.,ロウルス，ダブリ
ユ．イー.,及びバチエツテイ，エス．「ジヤーナル オ
ブ ビロロジー」（Campione−Piccard,J.,Rawls,W.E.,
and Bacchetti,S.Ｊ．Virol．），31:281−287（1979）
参照〕。 欠失（deletion）誘発tk^-ウイルス突然変異体 tk遺伝子中に欠失をもつtk^-ウイルスは、tk⁺に復帰す
ることができないので、ヌクレオチド変更（change）の
みを含有するtk^-突然変異体よりも優れる。 tk遺伝子の解読区域において欠失を含有する組み換え
HSV−１ tk^-またはMarHV tk^-を構成する方法は既知で
ある〔シムレイ，ジエイ．アール．「ネイチヤー」（Si
mley,J.R.Nature，385:333−335（1980）；ポスト，エ
ル．イー.,マツケム，エス.,ロイズマン，ビー．「セ
ル」（Post,L.E.,Mackem,S.,Roizman,B.Cell），24:555
−565）；及びキツト，エス.,クアビ，エイチ.,ダブ
ス，デイー．アール.,及びオオツカ，エイチ．「ジヤー
ナル オブ メデイカル ビロロジー」（Kit,S.,Qavi,
H.,Dubbs,D.R.,and Otsuka,H.Ｊ．Med．Virol．），12:
25−36（1983）参照〕。これらの欠失突然変異体は、対
応するウイルスのtk遺伝子中に欠失されたヌクレオチド
配列を含有するHSV−１ tk⁺またはMarHV tk⁺および雑
種プラスミド（本明細書では「交雑プラスミド」という
場合あり）の感染性DNAを同時トランスフェクションす
る（co−transfecting）ことにより得られる。得られる
組み換えウイルスは、tk^-ウイルスを選択する薬物、例
えば、araT、BrdUrdおよびBrdCydを含有する培地中でウ
イルスの収穫物（harvest）をプラーキング（plaquin
g）した後、単離する。tk^-欠失ウイルスは、例えば、そ
れらのDNAを制限ヌクレアーゼで分析することにより、
適当なプローブを用いる分子の交雑化の研究により、お
よび組み換えウイルス感染細胞からの抽出についてのTK
検定により、認識される。 アルファヘルペスウイルスのtk^-欠失突然変異体を構
成する前述の方法において、tk⁺ウイルスのDNAおよび交
雑プラスミドのDNAで細胞を最初に同時トラスフェクシ
ョンすることから得られた子孫は、ウイルスの混合物か
ら成る。子孫の大部分は親のtk⁺ウイルスであり、そし
て集団の非常に小部分、すなわち、約10^-3〜10^-5、は組
み換えtk^-ウイルスから成る。tk^-ウイルスを単離するた
めには、大過剰のtk⁺ウイルスにもかかわらず、tk^-ウイ
ルスの複製を可能とすると同時にtk⁺ウイルスの複製を
阻止する選択的手順が必要でいる。選択条件がきわめて
有効である場合、すなわち、tk^-ウイルスに関連する複
製の阻止またはtk⁺ウイルスの顕著な生長が存在しない
場合、tk^-ウイルスは単一の工程において選択すること
ができる。しかしながら、選択条件が部分的にのみ有効
である場合、多数の選択工程はそれらが集団の有意の分
画を表わすまでtk^-ウイルスを濃縮するために必要であ
る。 HSV−１について、HSV−１ tk⁺によるプラークの形
成を防止するためにBrdUrd、araTまたはBrCydを使用し
て効率よい選択が可能である。すなわち、HSV−１ tk⁺
およびHSV−１ tk^-の混合物のプラーク滴定（plaque t
itration）を、これらの薬物を含有する培地中で実施す
るとき、約10³〜10⁴のHSV−１ tk⁺の中から１つのHSV
−１ tk^-を同定かつ単離することができる。得られるH
SV−１ tk^-のプラークは大きく、良好に定められ、そ
してHSV−１ tk⁺ウイルスの汚染は最小である。 しかしながら、大量のPRV tk⁺を含有する混合物から
PRV tk^-突然変異体を単離するために有効ではない。な
ぜなら、BrdUrdおよびaraTPRV tk⁺プラークの大きさお
よび数を部分的にのみ減少するだけであるからである。
さらに、BrdCydはPRVでは無効である。 HSV−１の応答およびPRVの応答との間の差は、PRVお
よびHSV−１符号化酵素、すなわち、TK、DNAポリメラー
ゼおよびリボヌクレオシドジホスフェートリダクターゼ
の性質の不類似；前記２種のウイルスにより感染された
細胞のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートのプ
ールの組成の差；および多分PRVおよびHSV誘導ヌクレア
ーゼがウイルス合成のために細胞のDNAを分解（degrad
e）しかつそれを利用する能力の差に帰することができ
る。こうして、PRVの場合において、強化（enrichmen
t）工程はプラーク滴定における末端希釈（terminal di
lution）において候補のプラークを単離する前に、PRV
tk^-の集団を増加することを必要とする。このような
強化工程の使用および開発の必要性は、本発明の以前に
おいて知られていなかった。 要約すると、前述の方法は異質のDNA配列の欠失をHSV
−１組み換え体のtk遺伝子中に導入するために適切であ
るが欠失をPRV組み換え体のtk遺伝子中に導入する仕方
を、次の理由で、教示または示差していない：（１）PR
V tk遺伝子の解読領域を限界決定するヌクレオシド配
列の大体の境界は従来決定されていない；（２）適切な
欠失をクローニングされたPRV tk遺伝子中に作ること
を許すPRV tk遺伝子内の制限部位についての教示が存
在しない；および（３）前の考察したように、HSV−１
とともに使用する薬物はPRVについて不適当であるの
で、修正された強化および選択の手順を開発しなくては
ならない。結局、既知の手順をPRV tk遺伝子中の欠失
突然変異体の単離に使用するための情報は不十分である
ばかりでなく、かつまた既知の手順はPRV系に有効に働
かない。 したがって、本発明の目的は、偽狂犬病の広がりを抑
制するために有効な偽狂犬病ワクチンを提供することで
ある。 本発明の本発明の目的は、偽狂犬病ワクチンを接種さ
れた動物がワクチンのウイルスの保菌体になり難い偽狂
犬病ワクチンを提供することである。 本発明のほかの目的は、偽狂犬病ワクチンを接種され
た動物が病原性の場の菌株（field strain）の菌株に
よる潜伏の感染を獲得し難い偽狂犬病ワクチンを提供す
ることである。 本発明のなおほかの目的は、ワクチンのウイルスが機
能的（functional）TKを生成することができない偽狂犬
病ワクチンを提供することである。 本発明のさらになおほかの目的は、ワクチンのウイル
スが低い、すなわち、自然の、復帰頻度を有する偽狂犬
病ウイルスの高度に弱毒化（本明細書では「減衰」とい
う場合あり）した（attenuated）突然変異原誘発tk^-突
然変異体である偽狂犬病ワクチンを提供することであ
る。 本発明の追加の目的は、ワクチンのウイルスがtk⁺に
復帰することができない偽狂犬病ウイルスのtk^-欠失突
然変異体でありかつtk⁺ウイルスから容易に単離される
偽狂犬病ワクチンを提供することである。 本発明の他の目的は、低い、すなわち、自然の、復帰
頻度を有する高度に減衰した突然変異原誘発tk^-偽狂犬
病ウイルスを生産しかつ使用する方法を提供することで
ある。 本発明のほかの目的は、tk⁺に復帰しない偽狂犬病ウ
イルスのtk^-欠失突然変異体を生産しかつ使用する方法
を提供することである。 本発明の１つの実施態様において、前述の目的は、突
然変異原誘発突然変異（mutogen−induced mutation）
の結果として機能的TKを生産することができない温度抵
抗性偽狂犬病ウイルス、および（１）製薬学的に有効量
の前記ウイルス、および（２）製薬学的に許容されうる
担体または希釈剤からなる偽狂犬病のための変性された
生きているウイルスのワクチンにより達成された。 本発明のほかの実施態様において、前述の目的は、
（１）温度感受性ウイルスのための許容温度においてtk
^-宿主細胞中でPRV tk⁺株をプラーク精製（plaque−pur
ifying）し；（２）工程（１）の得られるウイルスをtk
^-宿主細胞中で突然変異原の存在下に温度感受性ウイル
スのための許容温度において２〜５回増殖させ；（３）
工程（２）の得られるウイルスをtk⁺宿主細胞中で突然
変異原の存在下に温度感受性ウイルスのための非許容温
度において増殖させ；（４）工程（３）の得られるウイ
ルスをtk⁺宿主細胞中で突然変異原の存在下に温度感受
性ウイルスのための許容温度において増殖させ；（５）
工程（４）の得られるウイルスをtk⁺宿主細胞中で選択
剤（selective agent）の存在下の温度感受性ウイルス
のための許容温度において増殖させ；そして（６）工程
（５）の得られるウイルスをtk⁺宿主細胞中で突然変異
原の存在下に温度感受性ウイルスのための許容温度にお
いて増殖させ、温度抵抗性PRV tk^-突然変異原誘発突然
変異体を生産する、ことからなる、突然変異原誘発突然
変異の結果として機能的TKを生産することができない温
度抵抗性偽狂犬病ウイルスを生産する方法によって、達
成された。 本発明のほかの実施態様において、前述の目的は、tk
遺伝子の欠失の結果として機能的TKを生産することがで
きない温度抵抗性偽狂犬病ウイルス、および（１）製薬
学的に有効量の前記ウイルス、および（２）の製薬学的
に許容されうる担体または希釈剤からなる偽狂犬病のた
めの変性された生きているウイルスのワクチンによっ
て、達成された。 本発明のなおほかの実施態様において、前述の目的
は、（１）クローニングベクターとPRV tk遺伝子の実
質的にすべてを含有するPRVのDNA断片とからなる交雑プ
ラスミドを構成し；（２）工程（１）の交雑プラスミド
を、tk⁺宿主細胞中において、温度抵抗性PRV tk^-突然
変異原誘発突然変異体からのDNAで同時トラスフェクシ
ョンし（co−transfecting）；（３）tk^-宿主細胞中に
おいて、工程（２）において生産されたウイルスからの
PRV tk⁺について選択し；（４）PRV tk遺伝子の実質
的にすべてより少ないものが存在し、同時に欠失（dele
tion）の各側に隣接してPRV DNA配列を保持するよう
に、工程（１）の交雑プラスミドからDNA配列を欠失さ
せ；（５）tk⁺宿主細胞中において、工程（３）におい
て得られたPRV tk⁺から誘導されたPRV tk⁺DNAを工程
（４）の得られる交雑プラスミドで同時トランスフェク
ションし；そして（６）tk^-宿主細胞中において、工程
（５）において生産されたウイルスからのPRV tk^-につ
いて選択して、温度抵抗性PRV tk^-欠失突然変異体を生
産する；ことからなるtk遺伝子の欠失の結果として機能
的TKを生産することができない温度抵抗性偽狂犬病ウイ
ルスを生産する方法によって達成された。 １つの実施態様において、本発明な自然復帰割合が10
^-5より小であるようにtk遺伝子中に１または２以上の突
然変異を含有しかつ突然変異体体ウイルスが機能的TKを
生産しない、高度に減衰した温度抵抗性PRVtk^-突然変異
原誘発突然変異体、およびその生産方法に関する。 本発明のこの実施態様はtk^-突然変異体を単に単離す
る方法を越えるが、ウイルスの病気を引き起こす能力が
減少するように、多数の遺伝的変更を蓄積する方法に関
する。 本発明のこの実施態様の方法は、次の工程からなる：
（１）温度感受性ウイルスのための許容温度においてtk
^-宿主細胞中でPRV tk⁺株をプラーク精製（plaque−pur
ifying）し；（２）工程（１）の得られるウイルスをtk
^-宿主細胞中で突然変異原の存在下に温度感受性ウイル
スのための許容温度において２〜５回増殖（propagatin
g）させ；（３）工程（２）の得られるウイルスをtk⁺宿
主細胞中で突然変異原の存在下に温度感受性ウイルスの
ための非許容温度において増殖させ；（４）工程（３）
の得られるウイルスをtk⁺宿主細胞中で突然変異原の存
在下に温度感受性ウイルスのための許容温度において増
殖させ；（５）工程（４）の得られるウイルスをtk⁺宿
主細胞中で選択剤の存在下に温度感受性ウイルスのため
の許容温度において増殖させ；そして（６）工程（５）
の得られるウイルスをtk⁺宿主細胞中で突然変異原の存
在下に温度感受性ウイルスのための許容温度において増
殖させ、温度抵抗性PRV tk^-突然変異原誘発突然変異体
を生産する、からなる。 プラーク精製は、場の分離物（field isolates）お
よび既知の減衰した菌株は異るウイルスの混合物からし
ばしばなるので、ワクチンのウイルスの形成に使用すべ
き出発物質を精製する手段を提供する。 本発明において出発物質として使用する特定のPRV t
k^-菌株は臨界的ではない。このようなPRV tk^-の例は、
次のものを包含する：より知られた減衰した菌株、例え
ば、ブカレスト（Bucharest）菌株（以後、「PRV（BU
K）」）、SUCH−１菌株〔スコダ，アール.,ブラウナ
ー，アイ.,サデツキー，イー.,及びメイヤー，ブイ．
「アクタ ビロロジカ」（Skoda,R.,Brauner,I.,Sadeck
y,E.,and Mayer.V.Acta Virol．），８:1−９（1964）
参照〕。Barthaとして知られているＫ菌株〔パーサ，エ
イ．「マギー アラトルブラプジヤ」（Bartha,A.Mag
y．Allatorv．Lapja），16:42−45（1961）参照〕，お
よびノルデン（Norden）菌株〔パウル，ピー．エス.,メ
ンゲリング，ダブリユ．エル．及びピルトル，イー．シ
ー．「アーキブス オブ ビロロジー」（Paul,P.S.,Me
ngeling,W.L.and Pirtle,E.C.Arch．Virol．），73:193
−198（1982）参照〕；動物から直接分離されあるいは
実験室においてしばしば継代接種（passage）される有
毒の菌株、例えば、ATCC No.VR−135を有するAujeszky
菌株（以後、「PRV（Auj）株」、Ｐ−2208菌株、KC−15
2D菌株〔マエス，アール．ケイ．カニツツ，シー．エ
ル．及びグスタフソン，デイー．ピー．「アメリカン
ジヤーナル オブ ベテリナリー リサーチ」（Mass,
R.K.Kanitz,C.L.and Gustafson,D.P.Am．Ｊ．Vet．Re
s．）44:2083−2086（1983）参照〕、S62/26 Iowa菌
株、Ind−FH菌株、Ind−Ｓ菌株、Ind−Ｒ菌株およびシ
ョウプ（Shope）菌株〔パウル，ピー．エス.,メンゲリ
ング，ダブリユ．エル．及びピルトル，イー．シー．
「アーキブス オブ ビロロジー」（Paul,P.S.,Mengel
ing,W.L.and Pirtle,E.C.Arch．Virol．），73:193−19
8（1982）参照〕。PRV（BUK）は本発明において使用す
る好ましい菌株である。 本発明の文脈において、温度抵抗性ウイルスは非温度
感受性であるウイルスである。こうして、温度抵抗性ウ
イルスは、非許容温度（non−permissive temperatur
e）、すなわち、約38.5℃〜40℃、好ましくは39.1℃に
おいて、PRVの親ウイルスまたは場の単離物が許容温度
において複製するのとほぼ同様によく複製することがで
きる。これと対照的に、温度感受性PRV菌株は複製に必
須なウイルスの遺伝子中に突然変異を含有し、これによ
り機能的遺伝子生産物は許容温度、すなち、約33℃〜3
7.5℃、好ましくは34.5℃において生産されるが、非許
容温度においては生産されない。したがって、温度感受
性ウイルスにおいて、感染性ウイルスの粒子の生産は、
許容温度における生産に比較して、非許容温度において
４〜７ログ（log）低い。温度抵抗性ウイルスの菌株を
用いると、感染性ウイルスの粒子の生産は非許容温度に
おいて許容温度におけるのとほぼ同一である。 ある温度感受性の呼吸ウイルス菌株、例えば、IBRVの
温度感受性突然変異体、は従来変性された生きているウ
イルスPRVのワクチンとして使用されてきた〔パストレ
ツト，ピー．ピー.,チリー，イー.,ブロキエル，ビー.,
及びデルボーベン，ジー.,「アンナーレ デ リシエル
シエ ベテリネール」（Pastoret,P.P.,Thiry,E.,Broch
ier,b.,and Derboven,G.,Ann．Rech．Vet．）,13:221−
235（1981）及びシヤノツク，アール．エム.,「ジヤー
ナル オブ インフエクシヤス デイシージズ」（Chan
ock,R.M.,Ｊ．Infect．Dis．），143:364−374（1981）
参照〕。このような使用の原理的説明は、温度感受性ウ
イルスが特別に許可された部位において限定された複製
を行ない、そして局所的な免疫学的応答を引き出すこと
ができるということである。しかしながら、温度感受性
ウイルスは宿主動物のより深い、温度がウイルスの複製
に非許容性である組織中における複製を害される。 温度抵抗性ウイルスは、変性された生きているウイル
スPRVのワクチンとして温度感受性のウイルスよりも次
の理由で優れる：（１）減衰（attenuation）は、複製
（replication）に必要な有害ウイルスの遺伝子からよ
りもむしろ特定の病原性ウイルスの遺伝子における変更
（alteration）から生ずる；および（２）の温度抵抗性
ウイルス菌株は、接種部位においてより広範に複製し、
そしてより完全な延長した免疫学的応答を引き出すこと
ができる。 本発明において用いる特定のtk^-宿主細胞は、それか
らがPRVの許容生長を許すかぎり、臨界的ではない。こ
のようなtk^-宿主細胞の例は、次のものを包含する：ウ
サギRab（BU）、マウスLM（TK^-）、ヒトHeLa（BU25）
〔キツト，エス.,クアビ，エイチ.,ダブス，デイー．ア
ール．及びオオツカ，エイチ．「ジヤーナル オブ メ
デイカル ビロロジー」（kit,S.,Qavi,H.,Dubbs,D.R.a
nd Otsuka,H.Ｊ．Med．Virol．），12:25−36（1983）
参照〕、シリアン（syrian）ハムスターBHK 21（TK^-）
〔サンドウス，ピー．ジー.,ウイルキー，エヌ．エム．
及びダビツドソン，エイ．ジエイ．「ジヤーナル オブ
ジエネラル ビロロジー」（Sandus,P.G.,Wilkie,N.
M.and Davidson,A.J.Ｊ．Gen．Virol．），63:277−295
（1982）参照〕、およびヒト系列（line）143〔キヤン
ピオネ−ピカルド，ラウルス，ダブリユ．イー．及びバ
クチエツテイ，エス．「ジヤーナル オブ ビロロジ
ー」（Campione−Picardo,Rawls,W.E.and Bacchetti,S.
Ｊ．Virol．），31:281−287（1979）参照〕。Rab（B
U）は本発明において使用する好ましいtk^-宿主細胞であ
る。 本発明において使用する特定のtk⁺宿主細胞は、それ
らがPRVの許容生長を許すかぎり、臨界的ではない。こ
のようなtk⁺宿主細胞の例は、次のものを包含する:ATCC
No.1414を有するRab−9;1次ウサギ腎細胞;2次ウサギ
腎細胞；サル細胞、例えば、CV−１およびOMK;ヒト細
胞、例えば、HeLa（S3）およびヒト胚腎細胞；およびニ
ワトリ胚線維芽細胞。Rab−９は本発明において使用す
る好ましいtk⁺宿主細胞である。しかしながら、野（fie
ld）における動物のワクチン接種に使用すべくウイルス
の生産のために、米国の農務省が認証した、好ましくは
ワクチン接種すべき動物と同一種でありかつ他の感染性
物質（agent）を含まない、PRVに許容される細胞系統を
使用すべきである。例えば、適当なブタ細胞系統はマイ
コプラズマおよび他のウイルスを含まない認証された二
倍体非腫瘍発生ブタ腎細胞系列であろう。 本発明において使用する特定の突然変異原は臨界的で
はない。このような突然変異原の例は次の通りである:B
rdUrd、NH₂OH、HONO、ニトロソグアニジンおよび紫外線
〔スシヤツフエル，ピー．エイ.,アロン，ジー．エム.,
ビスワル，エヌ．及びベニイツシユ−メルニツク，「ビ
ロロジー」（Schaffer,P.A.,Aron,G.M.,Biswal,N.and B
enyesh−Melnick,Virology），52:52−71（1973）及び
サンドリーゴルデイン，アール．エム.,レビン，エム．
及びグロオン，ジエイ．シー．「ジヤーナル オブ ビ
ロロジー」（Sandri−Goldin,R.M.,Levine,M.and Glori
oso,J.C.Ｊ．Virol．），38:41−49（1981）参照〕。Br
dUrdは、その組み合わせられた突然変異原性および選択
の活性のために、好ましい突然変異原である。すなわ
ち、BrdUrdはよく知られた効力のある突然変異原である
ばかりでなく、またtk^-ウイルスの選択に有用である。
低濃度のBrdUrdにおけるPRVの順次の継代培養（serial
passage）はウイルスを生長させると同時にその中に突
然変異体を蓄積させる。これらの突然変異体は毒性を減
少させ、こうしてワクチンの安全性を高める。より高い
BrdUrdの濃度におけるaraTの存在下の引き続く継代培養
は、tk^-の表現型の選択を可能とする。本発明はPRV tk^-
突然変異体を得るための最近用いられている方法と異
る。なぜなら、araTは薬物抵抗性のPRVを得るためにの
みその方法において使用されたからである〔ベン−ポラ
ツト，テイー.,ビーチ，アール．エイ.,及びイハラ，エ
ス．「ビロロジー」（Ben−Porat,T.,Veach,R.A.,and I
hara,S.Virology），127:194−204（1983）参照〕。す
なわち、araTは突然変異原ではなく、こうして自然PRV
tk^-突然変異体の選択のみがこの方法により起こる。
さらに、araTの選択により分離された多くのヘルペスウ
イルスはTKの生産において部分的に欠けるだけであり、
それゆえ有毒である。 BrdUrdは突然変異原としてかつ選択剤として使用する
ことにより、多数の突然変異をウイルスのtk遺伝子中に
のみならず、かつまたウイルスのゲノム全体に導入する
ことが可能であり、こうしてTK活性に欠けかつ低い復帰
速度、すなわち、約10^-5〜10^-7の復帰速度を示す減衰さ
れたPRV突然変異体を得ることが可能である。 本発明において使用する特定の選択剤は、選択剤がtk
^-をtk⁺偽狂犬病ウイルスから選択することができるかぎ
り、臨界的ではない。このような選択剤の例は次の通り
である:BrdUrd、araT、BVDU、FMAUおよびAIdUrd。araT
はtk⁺宿主細胞に対して毒性ではないので、それらの細
胞のための好ましい選択剤である。BrdUrdはtk^-宿主細
胞のための好ましい選択剤である。 同様な手順がまた異るtk^-アルファヘルペスウイル
ス、すなわち、IBRVの分離に適用された〔キツト，エ
ス．及びクアビ，エイチ．「ビロロジー」（Kit,S.and
Qavi,H.Virology），130:381−389（1983）〕および米
国特許出願第516,179号、1983年７月21日出願参照）。
しかしながら、これらの手順において、tk^-宿主細胞は
使用されず、そして出発物質はPRVではなかった。 他の実施態様において、本発明はtk遺伝子の欠失の結
果として機能的TKを生産することができないPRVの温度
抵抗性tk^-欠失突然変異体およびその生産方法に関す
る。突然変異体はTKを解読するDNA配列の部分に欠ける
ので、tk⁺への復帰は起こらない。 本発明はこの実施態様の方法は、（１）クローニング
ベクター（cloning vector）とPRV tk遺伝子の実質的
にすべてを含有するPRVのDNA断片とからなる交雑プラス
ミドを構成し、（２）工程（１）の交雑プラスミドを、
tk⁺宿主細胞中において、温度抵抗性PRV tk^-突然変異
原誘発突然変異体からのDNAで同時トランスフェクショ
ンし（co−transfecting）、（３）tk^-宿主細胞中にお
いて、工程（２）において生産されたウイルスからのPR
V tk⁺について選択し、（４）PRV tk遺伝子の実質的
にすべてより少ないものが存在し、同時に欠失の各側に
隣接してPRV DNA配列を保持するように、工程（１）の
交雑プラスミド（hydrid plasmid）からDNA配列を欠失
させ（５）tk⁺宿主細胞中において、工程（３）におい
て得られたPRV tk⁺から誘導されたPRV tk⁺DNAを工程
（ｄ）の得られる交雑プラスミドで同時トランスフェク
ションし、そして（６）tk^-宿主細胞中において、工程
（５）において生産されたウイルスからのPRV tk⁺につ
いて選択して、温度抵抗性PRV tk^-欠失突然変異体を生
産する、工程からなる。 tk遺伝子はほぼ1500bpの大きさである。欠失突然変異
体は、57〜1500bpのDNA断片をtk遺伝子の適当な解読区
域（coding region）から排除し、こうしてTKの適切な
折りたたみ（folding）または基質の結合を防止するこ
とによって生成することができる。あるいは、欠失突然
変異体は、遺伝子の適切なリーディングフレーム（read
ing frame）が転位（shift）されるように、10〜100bp
のDNA断片を排除することによって生成することができ
る。後者の場合において、ナンセンスポリペプチドが生
成されうるか、あるいはポリペプチドの合成はフレーム
−シフト誘発停止コドンのため停止（abort）されう
る。欠失の好ましい大きさは約75え570bpである。 ここで使用するとき、「フランキング配列（flanking
sequence）」は、tk遺伝子の解読配列から上流、下
流、または上流および下流の両者の配列を意味する。上
流の配列は転写制御信号、すなわち、プロモーターおよ
びエンハンサー（enhancer）を含有する。下流の配列
は、tk遺伝子の転写のためのポリアデニル化信号を含有
する。 工程（１）の交雑プラスミド中に存在しなくてはなら
ない精確なtk遺伝子の配列は、欠失のために選択した配
列および欠失突然変異体の工作（engeneering）におい
て使用すべき制限ヌクレアーゼに依存するであろう。 この実施態様において使用するPRV tk^-突然変異体
は、tk遺伝子の解読区域中に１または２以上の点の突然
変異を含有する。したがって、工程（１）において使用
する交雑プラスミドは、PRV tk^-突然変異体において突
然変異する特定の配列と置換するPRV tk⁺遺伝子配列を
含有しなくてはならない。PRV tk^-DNAと工程（１）の
交雑プラスミドとの間の組み換え事象（event）は、PRV
tk^-遺伝子における１または２以上の突然変異原誘発
突然変異から上流および下流の両者において起こらなく
てはならない。工程（１）の交雑プラスミドが突然変異
したPRV tk^-DNAとそれにより置換する交差（または乗
り替え）事象、すなわち、マーカーレスキユー（本明細
書では「遺伝標識救済」という場合あり）（marker re
scue）は、救済PRV DNA断片が小さい、例えば、50〜10
0bpであるときでさえ理論的には起こりうるが、実際に
は、このような小さいDNA断片により遺伝標識救済は起
こりそうもない。これと対照的に、遺伝標識救済の確率
は、救済DNA断片が約１〜4kbであるとき、大きく増大す
る。注、後述するpBB−11中のPRV DNAの挿入は3.5kbで
ある。 工程（４）において要求されるプラスミド中の欠失に
隣接する特定のPRV DNA配列は、交雑プラスミド中の欠
失の特異性に依存する。一般に、欠失の３′および５′
の両者の側に隣接するPRV DNA配列の大きさは少なくと
も約400bpであろう。例えば、後述するプラスミドpBB−
11 dl SacA26が工程（５）におけるPRV tk⁺ DNAに
よるトランスフェクションに使用される場合、PRV tk
遺伝子の欠失された0.1kbのヌクレオチド配列は図単位
2.8におけるBamH I開裂（cleavage）部位から約800bpで
ある（第４図参照）。これはSac I−Ｃ欠失の５′の上
流側において交差事象を許すために十分４である。同様
に、Sac I開裂部位（0.9図単位）からpBB−12 dl Sac
A26のSac I部位（2.0図単位）へ延びるヌクレオチド断
片中に1100bpが存在する。これはSac I欠失の３′下流
における交差よりも適切である。 PRV tk遺伝子およびそのフランキング配列を含有する
PRVのDNA断片からなる交雑プラスミドを構成するために
本発明のこの実施態様において使用する特定のクローニ
ングベクターは、クローニングベクターが選択的特性
（trait）、すなわち、薬物抵抗性を解読する遺伝子を
含有するかぎり、臨界的ではない。このようなクローニ
ングベクターは、次のものを包含する:pBR322およびpBR
322に基づくベクター〔セキグチ，テイ.,ニシモト，テ
イ.,カイ，アール及びセキグチ，エム．「ジエネ」（Se
kiguchi,T.,Nishimoto,T.,Kai,R.and Sekiguchi,M.Gen
e），21:267−272（1983）参照〕、pMB9、pBR325、pKH3
7〔ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ（Bethesda Re
search Laboratories）〕、pBR328、pHC79〔ベーリンガ
ー マンハイム バイオケミカルズ（Boeheringer Mann
eheim Biochemicals）〕、ファージCharon 28〔ベセス
ダ リサーチ ラボラトリーズ（Bethesda Research La
boratories）〕、pKB11、pKSV−10〔ピー−エル バイ
オケミカルズ（Ｐ−L Biochemicals）〕、pMAR420〔Ots
uka,エイチ.,ヘイゼン，エム.,キツト，エム.,クアビ，
エイチ．及びキツト，エス．「ビロロジー」（Otsuka,
H.,Hazen,M.,Kit,M.,Qavi,H.and Kit,S.Virology），11
3:196−213（1981）参照〕およびオリゴ（dG）−テイル
ド（tailed）pBR322〔ニユー イングランド ヌークリ
アー（New England Nuclear）参照〕。 PRV（BUK）BamH I−11断片がPRV tk遺伝子を含有す
ることを発見され、下を参照、そしてpBR322はただ１つ
のBamH Iクローニング部位を有するので、pBR322は本発
明において使用する好ましいクローニングベクターであ
る。この部位におけるDNA断片の挿入はクローニングベ
クターテトラサイクリン遺伝子を不活性化するが、アン
ピシリン遺伝子を不活性化しないので、挿入によりpBR3
22より大きいテトラサイクリン感受性、アンピシリン抵
抗性交雑プラスミドは容易に分離されうる。 BamH I断片は別として、PRVのBal II、Bcl IおよびMb
o I断片は、それらの断片がBamH I断片と同じ結合端（c
ohesive ends）を有するので、pBR322のBamH I部位に
おいてクローニングされうる。pMB9、pBR325、pKH47、p
BR328、pHC79およびファージCharon28DNAも単一のクロ
ーニング部位を有する。しかしながら、Mbo I断片は小
さくかつtk遺伝子の一部分のみを含有し、一方Bgl II断
片は大きすぎてファージCharon 28を除外してクローニ
ングベクターのいずれにおいても便利にクローニングさ
れない。 PRV（BUK） kpn Ｉ−J_L断片はPRV tk遺伝子を含有
することがまた発見された（下を参照）。こうして、pk
B11、pKSV−10およびpMAR420は、ただ１つのKpnIクロー
ニング部位を含有するので、この断片をクローニングす
るための有用なクローニングベクターである。同様にオ
リゴ（dG）−テイルドpBR322はPRVのオリゴ（dC）−テ
イルドKpn I−J_L断片と一緒にクローニングベクターと
して使用することができる。 本発明において有用な独特のクローニング部位を含有
する他のクローニングベクターは、PRV tk遺伝子を含
有する断片を生産するBamH IおよびKpn I以外の制限ヌ
クレアーゼの評価のときに決定することができる。PRV
tk遺伝子を含有する断片を生産するために使用するこ
とができる他の制限ヌクレアーゼ、こうして本発明にお
いて有用でありうる他のクローニングベクターは、下に
より詳しく考察する第５図に示すPRV tk遺伝子配列か
ら容易に明らかである。 本発明のプラスミドを生長させるために用いる特定の
宿主は必須ではない。このような宿主の例は、次のもの
を包含する：E. coli K12 RR1〔ボリバー，エフ.,ロド
リゲツ，アール．エル.,グリーン，ピー．ジエイ.,ベト
ラツハ，エム．シー．ハイネツカー，エイチ．エル.,ボ
イヤー，エイチ．ダブリユ.,クローザ，ジエイ．エイ
チ.,及びフアルコウ，エス．「ジエネ」（Bolivar,F.,R
odriguez,R.L.,Greene,P.J.,Betlach,M.C.Heyneker,H.
L.,Boyer,H.W.,Crosa,J.H.,and Falkow,S.Gene），２:9
5−113（1977）参照〕；E. coli K12 HB101（ATCC N
o.33694）；E. coli MM21（ATCC No.33678）；および
E. coli DH1（ATCC No.33849）。E. coli K12 RR1は
好ましい宿主であり、そしてF^-hsd Ｒ hsd Ｍ遺伝子
型を有する。 同様に、別のベクター／クローニング系、例えば、次
のものを使用することができる：E. coliまたはSaccharo
myces cerevisiae、または両者の中で生長するプラス
ミドベクター、あるいはさらには、B. subtilusの中で生
長するプラスミドベクトル、あるいは動物の細胞、マウ
スの細胞（ATCC RL1616）の中で生長するウシ乳糖腫ウ
イルス（ATCC No.37112）のようなベクター〔エルダ
ー，ジエイ．テイー.,スプリツツ，アール．エイ．及び
ウエイスマン，エス．エム．「アニユアル レビユー
インジエネテイツク（Elder,J.T.,Spritz,R.A.and Weis
sman,S.m.Ann. Rev. Gen.），15:295−340（1981）及びウ
ーレ，アール.,グロスマン，エル．及びモルダベ，ケ
イ．メソツド イン エンザイモロジー“組換えDNA",1
01巻，パートC,アカデミツクプレス，ニユーヨーク．
（1983）（Ure,R.,Grossman,L.and Moldave,K.Methods
in Enzymology“Recombinant DNA",vol.101,Part C,
Academic Press,N.Y.（1983））参照〕。 本発明の前述の変性された生きているウイルスの製薬
学的に有効な量は、製薬学的に許容されうる担体または
希釈剤と一緒に、動物、例えば、ブタ、ウシ、ヒツジお
よびヤギにおける偽狂犬病に対するワクチンとして使用
することができる。 本発明において有用な製薬学的に許容されうる担体ま
たは希釈剤の例は、次のものを包含する:PRVに対する抗
体を含有しない、すなわち、PRvに対して血清陰性であ
る約2.5〜15％の血清を含有する生理学的な緩衝され
た、すなわち、約pH7.0〜7.4の媒質。無ガンマグロブリ
ン血清は、ガンマグロブリンを含有する血清よりも好ま
しい。本発明において使用すべき血清の例は、次のもの
を包含する：ブタ血清、ウシ血清、ウシ胎児血清、ウマ
血清および子羊血清。PRVについて血清陰性であるブタ
からの無ガンマグロブリンブタ血清はブタのワクチン接
種に好ましく、そしてウシ胎児血清または無ガンマグロ
ブリンウシ血清はウシのワクチン接種に好ましいであろ
う。血清タンパク質、例えば、ブタアルブミンまたはウ
シ血清アルブミンを約0.5〜3.0％の量で血清の代わりに
使用することができる。しかしながら、ワクチン接種さ
れる動物においてアレルギー性応答を誘発する異質のタ
ンパク質を担体または希釈剤中に使用することを避ける
ことが望ましい。 本発明の変性された生きているウイルスは少なくとも
10⁶〜５×10⁸p.f.u./mlの力価で−70℃〜−90℃におい
て、あるいは凍結乾燥された状態で４℃〜−20℃におい
て貯蔵することが好ましい。凍結乾燥されたウイルスは
無菌の蒸留水で再構成することができる。 投与すべき有用な適量は、ワクチン接種する動物の年
令、体重および種、および投与方法に依存して変化する
であろう。適当な適量は、例えば、約10⁵〜５×10⁸p.f.
u.、好ましくは約10⁶〜５×10⁷p.f.u.であることができ
る。 本発明のワクチンは、鼻内に、筋肉内におよび皮下に
投与することができる。筋肉内投与は好ましい投与方法
である。 次の実施例は例示を目的として提供され、そして本発
明の範囲をいかなる方法においても限定するものではな
い。下の実施例１および２は第１図に概略的に示されて
いる。 以下の実施例において、すべての媒質および緩衝溶液
は、特記しないかぎり、ガラス蒸留水中で構成した。 実施例１ PRVの温度抵抗性tk^-突然変異原誘発突然変異の生産 PRV（BUK）はよく知られたPRV tk⁺株であり〔スコ
ダ，アール.,ブラウナー，アイ.,サデツキー，イー.,及
びメイヤー，ブイ．「アクタ ビロロジカ」（Skoda,
R.,Brauner,I.,Sadecky,E.,and Mayer,V.Acta Viro
l．），８:1−９（1964）参照〕そしてこの実施例にお
いて出発物質として使用した。PRV（BUK）は、ドナルド
博士〔ドナルド ピー．グスタフソン博士，インデイア
ナ州，ラフアイエツト．パーデユー大学，獣医学部（D
r.Donald P.Gustafson,Department of Veterinary Medi
cine,Purdus University,Lafayette,Indiana）〕により
提供された。このウイルスは本来ニワトリ胚細胞培養物
中で800以上継代培養（passage）することにより減衰さ
れており、そしてヨーロッパにおいてワクチンとして使
用されていた。このウイルスは場の分離物（field iso
late）よりもウシおよびブタについて有毒ではない。パ
ーデュー（Purdue）において、このウイルスはまたブタ
腎（PK−15）細胞中で数回継代培養されていた。受け取
った後、PRV（BUK）をRab−９細胞中で１回継代培養
し、後述するようにプラーク精製してPRV（BUK−５）お
よびPRV（BUK−７）を得た。 プラーク精製は次の方法で実施した:6つのくぼみ（we
ll）のプラスチックのコスター（Costar）トレー、直径
3.5mm、の各くぼみに、イーグル（Eagle）の最小必須培
地（AutoPow,APMEN,Flow Laboratories,Inc.）プラス1
0％（v/v）ウシ胎児血清、50μg/mlのネオマイシンおよ
び2mMのグルタミンおよび10mMのヘペス（Hepes）緩衝
液、pH7.3（以後「生長培地」）の2.5ml中の250,000Rab
（BU）細胞を接種（seed）した。次いでトレーを37℃に
おいて３日間湿潤CO₂のインキュベーター内でインキュ
ベーションし、その時細胞は集密的細胞単層（本明細書
では「全面単分子層」という場合あり）を形成した。 次いで−70℃において貯蔵したウイルスを融解し、４
℃において１分間超音波処理してウイルスの凝集体を細
胞破片から開放した。各ウイルスの希釈物について重複
の試料を使用して、10^-4、10^-5および10^-6において希釈
した10倍の連続的希釈を生長培地で行った。 連続的に希釈したPRV（BUK）でRab（BU）細胞を感染
させる前に、コスターのくぼみからの生長培地を吸引す
る。次いで、連続的に希釈した試料の各々の0.1mlを細
胞の単分子層に添加した。34.5℃における１水素の吸収
期間後、2.5mlの寒天の上層（overlay）溶液を各くぼみ
に添加した。 寒天の上層溶液は、次のように調製した:100mlの2.5
％（w/v）BactoAgar（DIFCO）を沸騰水の浴中で溶融し
た。次に、等体積（100ml）の２倍強度のMcCoyの5A溶液
（Flow Laboratories,Inc.）を溶融した寒天に添加し
た。２倍強度のMcCoyの5A溶液は、280mMのNaClおよび0.
67mMのNa₂HPO₄、0.88mMのKH₂PO₄、11mMのKCl、1.6mMのM
gSO₄（7H₂O）、2.5mMのCaCl₂、11mMのグルコース、pH7.
12およびフェノールレッド（4mg/ml）（以後「BS
S」）、アミノ酸およびビタミンの強化混合物、0.2％
（w/v）の重炭酸ナトリウム、および0.4％（w/v）のグ
ルコースからなる2X−ハンク（Hank）の均衡塩溶液を含
有する。次いで、上の200mlの溶液を2.0mlの200mMのグ
ルタミン、1.0mlの10mg/mlのネオマイシンの溶液、1.0m
lのマイコスタチン（10,000単位/ml）、2.4mlの1.0MのH
epes緩衝液、pH7.3、8.0mlの1.0％（w/v）プロタミン硫
酸塩溶液および20mlのウシ胎児血清で補充して寒天上層
を生成した。 寒天上層を固化させた後、コスター・トレーをCO₂イ
ンキュベーター内に34.5℃において３日間配置した。次
いで、第２上層を添加した。 第２寒天層は第１寒天上層と同一の組成を有したが、
ただしそれは10mlの0.1％（w/v）の中性レッド指示薬色
素を補充されていた。次いで、トレーをインキュベータ
ーに戻し、34.5℃にさらに12〜24時間保持した。 ウイルスのプラーク、すなわち、ピンクのバックグラ
ウンドに対して純粋な白色の区域、が検出された。プラ
ークは細胞の集団の破壊を伴う単一のウイルス粒子の複
製の連続の連続の円から生じた。これと対象的に、無傷
の非感染細胞はピンクに着色され、そして顕微鏡検査に
より明瞭に見ることができた。次いで、プラークに計数
し、プラークの上の寒天の中に毛管ピペットを挿入する
ことにより、特定のプラークにおけるウイルスを「採取
（pick）」し、そしてその物質を吸引し、0.5mlの生長
培地中に分散させた。「採取」したプラークは約10⁴〜1
0⁵p.f.u./mlの量でウイルスを含有し、そして−70℃に
おいて貯蔵した。このようにして、ウイルスのクローン
PRV（BUKP5）およびPRV（BUK−７）が得られた。 PRV（BUK−５）およびPRV（BUK−７）は、遺伝的に同
一であり、同一の制限ヌクレアーゼ地図を有することが
わかった。さらに、酵素のアッセイにより、PRV（BUK−
５）およびPRV（BUK−７）はそれで感染された細胞中に
ウイルスのTK活性を３〜5p.f.u./細胞の感染の多重度
（multiplisity of infection）（以後「m.o.i.］）
で37℃において６時間で誘発することが立証された。下
に記載する手順において、PRV（BUK−５）およびPRV（B
UK−７）は互換的に使用することができた。 「採取された」プラークからのウイルスの作業原料
（working stock）は、約10⁷Rab−９細胞を採取した各
プラークからの0.5mlのウイルスで感染させ、そして34.
5℃において３〜５日間、広範な細胞変性効果が観察さ
れるまで、インキュベーションすることにより調製し
た。 次に、生長培地中のRab（BU）細胞の全面単分子層の
培養物〔キツト，エス．及びクアビ，エイチ．「ビロロ
ジー」（Kit,S.and Qavi,H.Virology），130:381−389
（1983）参照〕をPRV（BUK−５）で2.0p.f.u./細胞のm.
o.i.において接種した。 37℃において１時間の吸収期間後、培地を5.0μg/ml
のBrdUrd（Clabiochem−Behring Cop.）で補充し、そ
してウイルスを２日間34.5℃で増殖させ、感染した培養
物を−40℃において水平位置で凍結させ、次いで融解
し、浸透して感染した細胞をガラスから分離し、細胞の
破片を含有する生長培地のアリコートをピペットで上下
させ、そして無菌の２オンスの処方びん内に入れること
によって、ウイルスを収穫した。 後述する第２の継代培養の直前に、１つのびんのウイ
ルスを融解し、ソニケイター・セル・ディスラプター
（Sonicator Cell Disrupter）W220F型（Heat Syste
ms Ultrasonics Ｉ nc.）を使用して４℃において１
分間超音波処理した。 次に、上で収穫したウイルスの1:100希釈物の第２継
代培養をRab（BU）細胞中で34.5℃において実施した
が、ただし生長培地を10μg/mlのBrdUrdで補充した。 次いで、第２継第培養後収穫したウイルスの1:100希
釈物の第３継代培養をRab（BU）細胞中で34.5℃におい
て実施したが、ただし生長培地を25μg/mlのBrdUrdで補
充した。 その後、第３継代培養後収穫したウイルスの1:100希
釈物の第４継第培養をRad（BU）細胞中で34.5℃におい
て実施したが、ただし生長培地を25μg/mlのBrdUrdで補
充した。得られるウイルスを生長培地中で−70℃におい
て貯蔵し、そして前述のようのプラーク精製した。 次いで、得られるプラーク精製したウイルスを10μg/
mlのBrdUrdを含有する生長培地中で39.1℃および34.5度
の両者においてRab−９細胞中で増殖させた。この工程
は、生長培地中にBrdUrd、すなわち、温度抵抗性のBrdU
rd抵抗tk^-ウイルスの存在にかかわらず、PRVゲノム中に
追加の不規則の突然変異を誘発させかつ39.1℃において
tk⁺細胞中で生長することができるウイルスを選択する
ために用いた。 Rab−９細胞はBrdUrdをホスホリル化するTKを有す
る。こうして、細胞のTK活性をもつ生産物はウイルスの
複製を阻害することもできるのでウイルスはtk^-でなく
てはならず、また、ウイルスの薬物抵抗性、すなわち、
BrdUrd抵抗性でなくてはならない。両者の温度において
等しくよく生長したウイルス、すなわち、非温度感受性
ウイルスまたは「温度抵抗性」ウイルスのみをさらに処
理した。 次いで、araT選択工程を用いて、PRVがBrdUrd以外の
ヌクレオシド類似体の非常に高濃度に対して交差抵抗性
であることを確保した。また、BrdUrdと異り、araTはRa
b−９ TKではなくRV TKにより選択的にホスホリル化
されるので、araTをまた使用した。 araT選択工程において、温度抵抗性ウイルスの1:200
希釈物の1.0mlを使用して生長培地中のRab−９細胞の全
面単分子層の培養物を37℃における１時間の吸収により
感染させた。次いで、100μg/mlのaraTを含有する生長
培地（Yamasa Shoyu Co.）を添加し、そして34.5℃に
おけるインキュベーションを広範な細胞変性の効果が観
察されるまで進行させた。 他の選択工程を上のようにRab−９細胞中で34.5℃に
おいて実施したが、ただし生長培地を200μg/mlのaraT
で補充した。 次に、選択工程を上のようにRab−９細胞中で34.5℃
において実施したが、ただし生長培地を25μg/mlのBrdU
rdで補充して、得られるウイルスがtk⁺宿主細胞中にお
いてさえBrdUrdに対して高度に抵抗性があることを確保
した。 上の最後の工程から収穫したウイルスを前述のように
Rab−９細胞についてプラーク精製し、そして個々のプ
ラークを採取し、Rab−９細胞中で39.1℃および34.5℃
の両者における生長について試験して、温度抵抗性およ
びtk^-ウイルスのクローンを選択した。１つのこのよう
なクローン［これはPRV（BUK−5A）と表示した］は、ア
メリカン・タイプ・カルチャーコレクション（the Am4
erican Type Culture Collection）にいてATCC No.
VR−2078で受託された。 実施例２ PRVの温度抵抗性tk^-欠失突然変異体の生産 Ａ、 PRV DNAの精製 PRV DNAはHSV DNAの調製についてピグナツテイ等
（Pignatti et al）が記載するようにして本質的調製し
た〔ピクナツテイ，ピー．エフ.,カツサイ，イー.,メネ
グツチイ，ジー.,ヘムシナー，エヌ．及びミラネシ，ジ
ー．「ビロロジー」（Pignatti P.F.Cassai,E.,Meneguz
zi,G.,Chemciner,N.and Milanesi,G.Virology），93:26
0−264（1979）参照〕。 さらに詳しくは、20mlの生長培地を含有するRab−９
細胞（約５×10⁶細胞／培養）の20個の８オンスの処方
ガラスびんの単分子層培養物を、上の実施例１における
ようにして生産したPRV（BUK−７）の5.0p.f.u./細胞の
m.o.i.で感染させ、そして34.5℃において３時間インキ
ュベーションし、その時細胞のDNA合成はウイルスの感
染により阻害された。次いで、1.0μCi/mlおよび0.25μ
g/mlの［³H］−チミジンを添加してウイルスのDNAを放
射線標識し、そしてインキュベーションを34.5℃におい
て17時間さらに続けた。細胞をゴムのポリスマンにより
ガラスからこすり取ることにより分離し、600×ｇで遠
心分離し、10μg/mlの非放射性チミジンを含有する0.14
MのNaCl、0.003MのKC1、0.001MのCaCl₂、0.0005MのMgCl
₂、および0.01Mのリン酸塩、pH7.5からなる氷冷リン酸
塩緩衝食塩溶液（以後「PBS」）で洗浄した。次に、細
胞600×ｇで遠心分離し、次いでエタノール−ドライア
イス浴中で凍結させた。 融解後、0.25％（w/v）のトリトン（Triton）Ｘ−10
0、10mMのEDTA、10mMのトリス（Tris）−HCl、pH7.9か
らなる溶解溶液（lysing solution）の９容積中に細胞
沈殿物を再懸濁させた。次に、細胞懸濁液をダウンス
（Dounce）ホモジナイザーへ移し、そして室温において
20〜30分間おだやかに撹拌しながらインキュベーション
した。 次いで、細胞懸濁液をガラスの遠心分離管へ移し、Na
Clを0.2Mの最終濃度に添加した。次に、管を数回倒立さ
せ、そして溶液を1000×ｇで４℃において10分間直ちに
遠心分離した。 得られる上澄みをガラス管中にデカンテーションし、
そして10mMのTris−HCl、pH7.5、1.0mMのEDTAからなる
緩衝液（以後「TE緩衝液」）中で100μg/mlのプロテア
ーゼＫ（E.M.Science）と一緒に37℃において１時間イ
ンキュベーションすることにより脱タンパク質した。次
いで、１容量の90％（v/v）の再蒸留フェノールを添加
し、この溶液を反転により混合し、20,000×ｇで遠心分
離し、そして水相、すなわち、上相をポリアロマー（po
lyallomer）遠心分離管へ移した。次いで、固体の酢酸
ナトリウムを４％（w/v）の濃度に添加し、拡散を２容
量の氷冷エタノールで沈殿させ、そして−20℃において
一夜インキュベーションした。その後、沈殿を16,000rp
mにおける遠心により４℃においてスピンコ（Spinco）S
W25ローター内で集め、2.0mlのTE緩衝液中に溶解し、そ
して４℃においてTE緩衝液に対して透析した。 次いで、得られるDNA溶液をポリアロマー遠心分離管
へ移し、TE緩衝液中のCsClを57％（w/w）（ρ＝1.715g/
cm2）に添加した。次いで、DNAを46時間22.5℃および4
4,000rpmにおいてスピンコ No.50 Ti ローター内で
遠心した。次いで、12滴の分画をポリアロマー管の底か
ら集め、4.0μｌのアリコートを液体シンチレーション
分光光度計内で計数してPRV DNA含有分画（ρ＝約1.71
5g/cm²）を探した。合計25分画が集められたとき、一般
に分画13〜15はPRV DNAを含有した。 次いで、PRV DNA含有分画をプールし、そしてTE緩衝
液に対して前記緩衝液を数回交換して４℃において24時
間透析した。DNAの濃度を蛍光光度計により決定した。P
RV（BUK−７）DNAの収量は、10⁸細胞からは約50μｇで
あった。 PRV（BUK−７）DNAの同一性は、後述するようにサブ
マリンゲル（submarinegel）装置により４℃における電
気泳動後に得られた制限ヌクレアーゼ消化PRV（BUK−
７）DNA断片のパターンにより評価した。 さらに詳しくは、DNAをBamH IおよびKpn I制限ヌクレ
アーゼで、製造業者（New England BiLabs,Inc.）が
推奨する反応条件下で切り離した。次に、0.4％（v/v）
のブロモフェノール・ブルー、125mMのEDTAおよび50％
（v/v）のグリセロールからなる溶液の1/10容量を添加
して反応を停止させ、次いで65℃に10分間加熱した。各
試料の20μｌのアリコートをアガロースゲルの試料くぼ
みへ適用し、電気泳動を後述するように実施した。 制限ヌクレアーゼ断片の電気泳動は、0.6％（w/v）の
アガロースのスラブゲル〔キツト，エス.,クアビ，エイ
チ.,ダブス，デイー．アール．及びオーツカ，エイチ．
「ジヤーナル オブ メデイカル ビロロジー」（Kit,
S.,Qavi,H.,Dubbs,D.R.and Otsuka,H.Ｊ．Med．Viro
l．），12:25−36（1983）参照〕上において、30mMのNa
H₂PO₄、1.0mMのEDTA、40mMのTris−HCl、pH8.1からなる
電気泳動緩衝液（以後「電気泳動緩衝液」）中で45ボル
トおよび４℃において16時間実施した。電気泳動後、ゲ
ルを0.5μg/mlの臭化エチジウムを含有する電気泳動緩
衝液中でソーキングすることによりDNA断片を着色し、
長波UV照明器の上で可視化させ、そして写真撮影した。
PRV（BUK−５）およびPRV（BUK−７）の制限ヌクレアー
ゼのパターンを第２図および第３図に示し、そして断片
の大きさを下表１に記載する。 この方法で調製したPRV（BUK−７）DNAは、標準トラ
ンスフェクションアッセイにおいて約1000p.f.u./μgDN
Aの感染性を有した〔グラハム，エフ．エル．及びフア
ン デル エブ，エイ．ジエイ．「ビロロジー」（Grah
am,F.L.and Van der Eb,A.J.Virology）,52:456−467
（1973）参照〕。Ｂ、 PRV（BUK−７）DNAのクローニング PRV（BUK−７）から分離したDNAのBamH I断片を、次
の手順によりpBR322のBamH I切り離し部位においてクロ
ーニングした。 15mMのNaCl、6.0mMのTris−HCl、pH7.9および6.0mMの
MgCl₂からなる培養緩衝液（以後「切断緩衝液」）およ
び100μg/mlのウシ血清アルブミン（以後「BSA」）中
に、PRV（BUK−７）からの4.0μｇのDNAを溶解した。次
いでDNAを37℃において１時間40単位のBamH Iで消化し
た。反応を等容量の90％（v/v）の再蒸留フェノールの
添加により停止させ、混合し、そして相分離のため遠心
した。水相を0.1×TE緩衝液に対して透析した後、酢酸
ナトリウムを0.1Mに添加し、次いで２容量のエタノール
を添加し、そしてDNAの沈殿を−20℃において一夜貯蔵
した。DNAの沈殿を遠心をより集め、そして0.1×TE緩衝
液中に溶解した。 次いで、制限ヌクレアーゼ断片をBamH Iで切り離して
pBR322と組み合わせ、次の方法で脱ホスホリル化（deph
osphorylate）した： 50mMのTris−HCl、pH7.8、10mMのMgCl₂、20mMのジチ
オスレイトール、1.0mMのATPおよび50μg/mlのBSAから
なり1000単位のファージT4DNAリガーゼ（New England B
ioLabs,Inc.）を含有する結合緩衝液中において、4.0μ
ｇのBamH I切り離しPRV（BUK−７）DNAを0.2μｇのBamH
I消化脱ホスホリル化pBR322DNA（New England BioLab
s）と混合し、そして４℃において一夜インキュベーシ
ョンした。反応をEDTAの20mMまでの添加および65℃の30
分間の加熱により停止した。 組み換えプラスミドDNAをTE緩衝液中で希釈し、後述
するように、E. coli.K12 RR1 バクテリアを形質転換
するために使用した〔ボリバー，エフ.,ロドリゲツツ，
アール．エル．グルーネ，ピー．ジエイ.,ベトラツハ，
エム．シー.,ハイネツカー，エイチ．エル.,ボイヤー，
エイチ．ダブリユ.,クローザ，ジエイ．エイチ及びフア
ルコウ，エス．「ジエネ」（Bolivar,F.,Rodriguez,R.
L.Greene,P.J.,Betlach,M.C.,Heyneker,H.L.,Boyer.H.
W.,Crosa,J.H.and Falkow,S.Gene），２:95−113（197
7）参照〕。 バクテリアはCaCl₂を使用して形質転換のために調製
した〔マンデル，エム．及びハイガ，エイ．「ジヤーナ
ル オブ モレキユラー バイオロジー」（Mandel,M.a
nd High,A.Ｊ．Mol．Biol．），53:159−162（1970）参
照〕。詳しくは、2.0（A₆₀₀）の密度E.coli.K12 RR1の
一夜の培養物を使用して、1.0％（w/v）のバクトトリプ
トン、0.5％（w/v）の酵母エキス、および0.5％（w/v）
のNaClからなる肉汁（以後「ML肉汁」）の200mlを0.02
（A₆₀₀）のバクテリア密度において接種した。バクテリ
アを、約0.5（A₆₀₀）の密度が達成されるまで、約２時
間インキュベーションした。次いで、バクテリアを遠心
により沈殿させ、そして1/4容量の冷50mMのCaCl₂中に再
懸濁させた。氷上で５分間インキュベーションした後、
バクテリアを再び沈殿させ、そして1/40容量の氷冷50mM
のCaCl₂中に再懸濁させた。 次に、TE緩衝液中の1/10mlの組み換えプラスミドDN
A、約10〜100ng、を0.2mlのCaCl₂処理バクテリアへ添加
した。この混合物を４℃に30分間保持した。次いで、温
度を37℃に５分間上げ、0.3mlのML緩衝液を添加した。
その後、インキュベーションを37℃においておだやかに
振盪しながら45分間続けた。試料を30μg/mlのアンピシ
リンを補充したトリプチカーゼ大豆寒天（soy agar）ペ
トリ皿（BBL Microbiology Systems）上、で平板培養
した。 得られたクローンを、次のようにして、望の組み換え
プラスミドDNAについて急速にスクリーニングした： 組み換えプラスミドDNAを含有するバクテリアの一夜
の培養物を、30μg/mlのアンピシリンを含有する5.0ml
のML肉汁中に接種し、37℃において約1.5（A₆₀₀）の密
度にインキュベーションした。次いで、このバクテリア
培養物を1.5mlのエッペンドルフ（Eppendorf）ポリプロ
ピレン管へ移し、エッペンドルフ遠心機で約１分間室温
において遠心してバクテリアを沈殿させた。次に、バク
テリアを2mg/mlの卵リソチーム;50mMのグルコース;10mM
のチクロヘキサジアミンテトラアセテート；および25mM
のTris−HCl緩衝液、pH8.0からなるリソチーム溶液No.1
（以後「リソチーム溶液No.1）の0.1ml中に再懸濁さ
せ、次いで４℃において30分間インキュベーションし
た。次に、0.2mlの0.2NのNaOHプラス1.0％（w/v）のド
デシル硫酸ナトリウムをバクテリア溶液へ添加し、管内
に渦を形成させ、４℃に５分間保持した。その後、0.15
mlの3.0Mの酢酸ナトリウム、pH4.8を添加し、この間を
おだやかに倒立させ、その間に「凝塊（clot）」が形成
した。このDNAを４℃に１時間保持して染色体のDNA、タ
ンパク質、および高分子量RNAを沈殿させた。次に、沈
殿をエッペンドルフ遠心機内で５分間室温において遠心
し、そして組み換えプラスミドDNAを含有する透明な上
澄み流体、ほぼ0.4ml、を第２エッペンドルフ遠心管へ
移した。次いで、2.5容量のエタノール（ほぼ1.0ml）を
第２管へ添加し、この管を−20℃において30分間配置し
た。沈殿した組み換えプラツミドDNAを、エッペンドル
フ遠心機内で室温において２分間遠心により集めた。次
いで、組み換えプラスミドを0.1mlの0.1Mの酢酸ナトリ
ウム、0.0MのTris−HCl、pH8.0中に溶解し、エタノール
で再沈殿させ、再び遠心により集め、最後に50μｌの水
中に溶解した。 次いで、プラスミドDNAを切断緩衝液中で希釈し、そ
して2.0単位のBamH Iを添加した。37℃において60分の
消化期間後、試料を1/10容量の0.4％（w/v）のブロモフ
ェノール・ブルー、125mMのEDTAおよび50％（v/v）のグ
リコールからなる溶液と混合し、約20μｌを前述のよう
に電気泳動分析のために0.6％（w/v）のアガロースのス
ラグゲルへ適用した。この分析により、組み換えプラス
ミドがBamH I挿入体を含有するかどうか、そして、含有
した場合、挿入体の大きさ（kb）が明らかになった〔ビ
ルンボイム，エイチ．シー．及びドリー，「ジヤーナル
オブ ヌークレイツク アシツド リサーチ」（Birn
boim,H.C.and Doly,Ｊ．Nucl．Acids Res．），７:151
3−1523（1973）参照〕。 組み換えプラスミドDNAを大規模に調製するため、前
述の急速スクリーニング手順のために組み換えプラスミ
ドDNAの生産に使用したバクテリアに比較して200倍の量
のプラスミド形質転換バクテリアを処理したが、ただし
第１回のエタノール沈殿後、100℃に10分間加熱した5.0
mMのTris−HCl、pH8.0中の1.0mg/mlのRNaseからなる原
料溶液からの0.5mgの膵臓RNase Ａ（Worthington Bio
chemicals）で試料を37において30分間処理した。この
処理後、37℃においてTE緩衝液中の500μｇのプロテイ
ナーゼ Ｋ（E.M.Science）を添加した。引き続いて、
等容量のフェノールを添加し、試料を渦の形成により撹
拌し、前内のように遠心して相を分離した。次いで、水
相を取り出し、エタノールで沈殿させ、前述のように遠
心により集めた。沈殿を次いで0.2mlのTE緩衝液中に溶
解し、そして50mMのNaCl、10mMのTris−HCl、pH7.5、1.
0mMのEDTA中の10.4mlの直線の10−40％（w/v）スクロー
ス勾配で層状化させ、次いでスピンコ（Spinco）SW41ロ
ーター内で４℃および24,000rpmにおいて20時間遠心し
た。15滴の分画をポリアロマー遠心管の底から集めてプ
ラスチックトレーのくぼみに入れた。合計35の分画が得
られた。次いで、５μｌのアリコートを前述したように
アガロースゲルの電気泳動によりスクリーニングした。
組み換えプラスミドDNAを含有する分画をプールし、0.1
×TE緩衝液に対して透析し、さらに研究するために４℃
において貯蔵した。 Ｃ、 tk遺伝子を符号化するPRV（BUK−７）DNAの遺伝
標識転移による同定 精製されたウイルスのDNA断片間、あるいはプラスミ
ドベクター中のクローニングにより増幅されたウイルス
のDNA断片による、動物細胞における相同組み換え、お
よびゲノムのウイルスのDNAを使用して、DNA断片または
ウイルスのゲノムの中の突然変異体配列を救済した。
「遺伝標識救済（marker rescue）」または「遺伝標識
転移（marker transfer）」として知られる手順を用い
て自然突然変異および全体のウイルスDNA中の突然変異
原により誘発された突然変異をマッピングし（map）、
ならびに突然変異を交雑プラスミドからゲノムのウイル
スDNA中に転移させた〔マツツ，ビー.,スバクー シヤ
ープ，ジエイ．エイチ.,「ジヤーナル オブ ジエネラ
ル ビロロジー」（Matz,B.,Subak−Sharpe,J.J.,Gen．
Virol．），64:2261−2270（1983）参照〕。 遺伝標識転移手順を使用して、tk遺伝子を符号化（en
code）するPRV（BUK−７）BamH I断片を同定した。すな
わち、感染性PRV（BUK−5A）DNAとPRV（BUK−７）BamH
I断片の異る挿入体を含有する候補の組み換えプラスミ
ドとの混合物を、リン酸カルシウム沈殿法によりRab−
９細胞へ同時トランスフェクションした〔グラハム，エ
フ．エル．及びフアン デル エブ，エイ．ジエイ．
「ビロロジー」（Graham,F.L.and Van der Eb,A.J.Viro
lgy）,52:456−467（1973）参照〕。詳しくは、次の無
菌溶液を順番に試験管へ添加した： （１）TE緩衝液中のPRV（BUK−5A）DNAの100μg/mlの溶
液の0.4ml; （２）0.1×TE緩衝液中のPRV（BUK−７）BamH I断片を
含有する組み換えプラスミドの10μg/mlの溶液の0.4ml; （３）0.25mlの水； （４）TE緩衝液中のキャリヤー（carrier）マウス線維
芽（LM（TK^-））細胞DNAの100μg/mlの溶液の0.2ml; （５）2.0MのCaCl₂の0.125ml;および （６）２×BSSの1ml。 得られた溶液を反転により混合し、室温に30分間保持
し、その間DNA−リン酸カルシウム沈殿が形成した。次
いで、沈殿したDNA−リン酸カルシウムを含有する懸濁
液の0.5mlを5.0mlの生長培地へ直接添加し、そして60mm
のプラスチックペトリ皿中で36時間早く接種してあるRa
b−９細胞上で平板培養した。細胞を37℃において５時
間インキュベーションした。次いで、新鮮な生長培地を
添加し、そして培養物を34.5℃において２〜３日間、広
範な細胞変性の効果が起こるまでインキュベーションし
た。ウイルスの収穫物を前述のようにしてつくった。 得られるウイルスは小さい数の組み換えPRV tk⁺を含
有した。組み換えtk⁺ウイルスを強化するため、10^-4の
ハイポキサンチン、10^-6Mのアミノプテリン、4.0×10^-5
Mのチミジンおよび10^-5Mのグリシンを含有する生長培地
（以後「HATG」）〔キツト，エス．及びクアビ，エイ
チ．「ビロロジー」（Kit,S.and Qavi,H.Virolgy）,13
0:381−389（1983）参照〕継代培養した〔リトルフイー
ルド，ジエイ．ダブリユ．「サイエンス」（Littlefiel
d,J.W.Science），145:709−710（1964）；リトルフイ
ールド，ジエイ．ダブリユ．「バイオヒミカ エ バイ
オフイジカ アクタ」（Littlefield,J.W.Biochim．Bio
phys．Acta），95:14−22（1965）；及びスチルバルス
カ，イー．エイチ．及びスチルバルスキー，ダブリユ．
「ブロシーデイングス オブ ザ ナシヨナル アカデ
ミー オブ サイエンス オブ ザ ユーエスエー」
（Szybalska,E.H.and Szydalski,W.Proc．Nat．Acad．S
ci．USA），48:2026−2034（1962）参照〕中で収穫物を
Rab（BU）細胞、すなわち、tk^-細胞中で、次のように継
代培養した。 Rab−９細胞におけるトランスフェクションのウイル
ス収穫物を超音波処理し、およびHATGを含有する生長培
地中で1:500に希釈し、およびRab（BU）の全面単分子層
をウイルスで約0.01のm.o.i.において接種した。37℃に
おいて１時間吸収した後、HATGを含有する新しい生長培
地を添加し、感染を48時間34.5℃において進行させ、そ
の時ウイルスを再び収穫した。第２の選択工程を同一の
方法で実施し、ただしウイルスを1:500に希釈した。第
２選択継代培養から収穫したウイルスを前述のようにRa
b−９細胞中でプラーク精製した〔キツト，エス.,クア
ビ，エイチ「ビロロジー」（Kit,S.,Qavi,H.Virolg
y），130:381−389（1983）：およびキツト，エス.,ク
アビ，エイチ.,ダブス，デイー．アール.,及びオオツ
カ，エイチ．「ジヤーナル オブ メデイカル ビロロ
ジー」（Kit,S.,Qavi,H.,Dubbs,D.R.,and Otsuka,H.
Ｊ．Med．Virol．），12:25−36（1983）参照〕。下の
表に示すように、遺伝標識転移方法により試験した組み
換えプラスミド、すなわち、プラスミドpBB−11、はPRV
（BUK−5A）のtk^-突然変異を救済し、すなわち、PRV（B
UK−5A）で組み換えしてPRV（BUK−5A R1）と表示する
tk⁺ウイルスを生成した。これと対象的に、下表２に示
すように、PRV DNA断片BamH I−４およびBamH I−９を
含有するプラスミド［これはBamH I−11の両側（第２図
参照）、すなわち、それぞれプラスミドpBB−４およびp
BB−９でマッピングされている］はPRV（BUK−5A）のtk
^-突然変異を救済しなかった。これらの結果により、Bam
H I−４およびBamH I−９の断片はPRV（BUK−5A）tk遺
伝子中に突然変異部位に関する配列を含有しないことが
立証される。 pBR322のBamH I切り離し部位に挿入されたPRV（BUK−
７）の3.5kbのBamH I断片、すなわち、BamH I−11を含
有するプラスミドpBB−11の制限ヌクレアーゼ地図は第
４図に示されている。この断片は、前述の遺伝標識転移
アッセイにより立証されるように、PRV tk遺伝子を含
有する。PRV tk遺伝子の近似の境界を定めるために、
3.5kbのBamH I断片の部分を利用する遺伝標識転移アッ
セイを前述のように実施した。これらの実験により、Sa
c I−Ｂ断片の配列は野生型tk⁺配列のPRV（BUK−5A）へ
の遺伝標識転移に必須であるが、pBB−11のSac I−Ａ断
片の配列は野生型tk⁺配列のPRV（BUK−5A）への遺伝標
識転移に必要ではないことが立証された。また、PRV（B
UK−７）の6.3kbのKpn I−J_L断片（表１および第２図参
照）はPRV（BUK−5A）のtk^-突然変異を救済することが
発見された。この事実は、RV（BUK−5A）における突然
変異、すなわち、tk遺伝子の解読区域がpBB−11のKpn I
制限部位（2.1図単位）とBamH I制限部位（3.9図単位）
との間に位置することを証明する。 Ｄ、 PRV tk遺伝子のヌクレオチド配列 pBB−11の3.5kbのBamH I断片の部分を、後述するよう
にファージM13mp8〜mp11中でサブクローニングし（subc
lone）してPRV tk遺伝子を順番に配列（sequence）し
た〔フ，エヌ．−テイー．及びメシング，ジエイ「ジエ
ネ」（Hu,N.−T.and Messing,J.Gene），17:271−277
（1982）；及びメシング，ジエイ及びビエイラ，ジエ
イ．「ジエネ」（Messing,J.and Vieira,J.Gene），19:
269−276（1982）参照〕。 半合成lac配列および適当なクローニング部位を含有
するファージ M13誘導体の系列が設計された〔メイシ
ング，ジエイ．「ジエネテイツク エンジニアリング」
編者、アール．セトロウ及びエイ．ホランダー（プレナ
ム パブリツシング コーポレイシヨン：ニユーヨーク
州，ニユーヨーク市）（Messing,J.Genetic Engineeri
ng Eds.R.Setlow and A.Hollander（Plenum Publising
Corporation:New York,N.Y.））,Vol.４:19−35（198
2）参照〕。これらの誘導体はファージM13の非必須区域
における小さいDNA断片のクローニングおよび簡単なカ
ラー試験による挿入体の検出を可能とする。この系はDN
A配列化反応（sequncing reaction）およびDNAプローブ
の調製において広い用途を見い出した。 PRV tk遺伝子の断片をファージM13誘導体、例えば、
M13 mp8、M13 mp9、M13 mp10、およびM13 mp11の複
製型（以後「RF」）（New England BioLabs,Inc.）中
でサブクローニングするとき、同一の断片を両方の可能
な配向（orientation）でクローニングすることができ
る。組み換えファージM13誘導体の複製は、１本鎖のフ
ァージDNAの合成に導く。M13のペンタデカマー（pentad
ecamer）を使用して１本鎖DNAの配列を開始した（New
England BioLabs,Inc.またはP.L.Biochemcals）。 RF M13誘導体を調製するために、E. coli.K12 JM103
バクテリアの一夜培養物（New England BioLabs,Inc.
またはP.L.Biochemcals）からの1.0mlを10⁷p.f.u.のM13
mp10で感染させた。9.0mlのML肉汁と混合した後、感
染させた培養物を37℃において３時間インキュベーショ
ンした。次いで、1mlの感染させた培養物および9.0mlの
非感染バクテリアを0.1のML肉汁に添加し、そして培
養物を37℃において７時間さらにインキュベーションし
た。培養物を遠心により収穫し、リソチーム溶液No.1中
に懸濁させ、そしてRF M13 mp10 DNAを抽出し、前述
のように10−40％（w/v）スクロース勾配およびTE緩衝
液中の57％（w/v）CsCl勾配の遠心により精製した。 PRV tk遺伝子のSac I断片Ａ、ＢおよびＣ、すなわ
ち、PRV（BUK）BamH I−11のSac I断片（第４図参照）
を次の方法でM13中においてサブクローニングした。約
1.0μｇのpBB−11 DNAを100ngのRF M13 DNAと混合
し、そしてこの混合物を6.0mMのTris−HCl、pH7.4、6.0
mMのMgCl₂、6.0mMの２−メルカプトエタノールおよび10
0μｇのBSA中において10単位のSac I（New England B
ioLabs,Inc.）で37℃において１時間切り離した。この
反応をEDTAの20mMまでの添加および65℃の20分間の加熱
により停止させた。次いで、この反応生成物をエタノー
ルで沈殿させ、結合緩衝液中に溶解し、1000単位のファ
ージ T4 DNA リガーゼ（New England BioLabs,In
c.）と結合した。次に、この反応混合物を16℃において
４時間インキュベーションし、そして反応を４容量のTE
緩衝液の添加および65℃の10分間の加熱により停止させ
た。 組み換えM13をPRV Sca I断片DNA挿入体で選択するた
めに、前述のように調製した0.2mlのCaCl処理E. coli.K1
2 JM103バクテリアを10〜50μの結合したM13 mp10
DNAと混合し、そして氷浴中に40分間保持した。次い
で、この混合物を37℃において５分間10μの100mMの
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドおよび
50μの2.0（w/v）の、ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドと一緒に50％（v/
v）のジメチルホルムアミド中でインキュベーションし
た。次に、0.2mlの新しく生長するバクテリアおよび１
中の5.0gの酵母エキス;5.0gのNaCl;および6.0gのバク
トアガー（bactoagar）からなる3.0mlの軟質寒天を添加
した。この混合物を69mmのペトリ皿上へ注ぎ、37℃にお
いて一夜インキュベーションした。 その後、ファージ感染バクテリアから成る無色のプラ
ークを採取し、微小力価（microtiter）のペトリ皿へ接
種し、37℃において３時間インキュベーションした。次
いで、0.2mlの新しく生長するE. coli.K12 JM103をファ
ージ感染バクテリアへ添加した；この混合物を5.0mlのM
Lを含有する試験管へ移し、37℃において一夜インキュ
ベーションした。 次に、1.0mlの感染したバクテリアを遠心し、上澄み
を他の試験管へ移し、0.5mlの12％（w/v）のポッリエチ
レングリコール（6000）および1.5mMのNaClを含有する
溶液を添加し、この懸濁液を４℃に10分間保持し、次い
で遠心した。上澄みを廃棄し沈殿したファージを0.1ml
の0.2％（w/v）のドデシル硫酸ナトリウム、0.25mMのED
TA中に溶解した。次いで、ファージDNAを前述のように
アガロースゲルの電気泳動により分析した。組み換えフ
ァージを、挿入体をもたない１本鎖ファージDNAに比較
して遅い移動度の、すなわち、大きい大きさの挿入体含
有１本鎖ファージDNAにより認識させた。 ファージM13 mp10中に２つの挿入体が相補的である
かどうかを知るために、相補試験（complementary tes
t）を後述するように用いた。 より詳しくは、２つの候補の組み換え１本鎖M13 mp1
0ファージを0.15MのNaCl、0.015Mのクエン酸ナトリウ
ム、pH7.0（以後「SSC」）からなる６×緩衝液中で65℃
において１時間混合した。次いで、反応混合物の部分を
前述のようにアガロースゲルの電気泳動により分析し
た。２つの挿入配列が相補的であるとき、それらは互い
に交雑化し、電気泳動においてもとの１本鎖ファージDN
Aよりも遅く動く帯を誘導体とした。 前述のようにM13 mp10組み換えDNAのRF型から分離し
たクローニングしたSec I断片を、Msp IまたはTaq I（N
ew England BioLabs,Inc.）により切り離し、そして
本質的にSac I断片のサブクローニングについて前述し
たようにM13 mp9のAcc I部位においてクローニングし
た。PRV（BUK）BamH I 11−Sac I−Ｂ断片を含有するM
13 mp10のRF DNAを、Kpn Iにより、すなわち、PRV（B
UK）BamH I 11−Sac I−Ｂ断片内の切り離し部位によ
り；およびSma Iにより、すなわち、M13 mp10中のクロ
ーニング部位に対して切り離し部位３′により切り離し
た。Kpn Iの結合端を、後述するように、ファージT4 D
NAポリメラーゼ（Bethesda Reseach Laboratories）
の３′ヌクレアーゼ活性を使用してブラント（blunt）
端に転化した。 すべての４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフ
ェートの存在下に、T4 DNAポリメラーゼは、制限断片
から対でない３′テイルを除去し、そして相補的dNTPが
存在する場合、それが第１対の塩基に到達するとき、停
止するであろう。Kpn I結合端をブラント端に転化する
ために、10μのDNA断片からなる反応混合物は1.0μｇ
のDNA、2.0μの10倍のT4 DNAポリメラーゼ緩衝液、
すべての４種のデオキシヌクレオシドトリホスフェート
の2.0mMの誘導体の1.0μ、1.0μのT4 DNAポリメラ
ーゼ、約2.5単位、および19μの水を含有する。10倍
のT4 DNAポリメラーゼ緩衝液は、0.33MのTris−アセテ
ート（pH7.9）、0.66Mの酢酸カリウム、0.10Mの酢酸マ
グネシウム、5.0mMのジチオスレイトール、および1.0mg
/mlのBSA（Pentax Fraction Ｖ）からなっていた。こ
の反応混合物を37℃において５分間インキュベーション
した。次いで、1.0μの0.5MのEDTAを添加して反応を
停止させた。この溶液をフェノール／クロロホルム（1:
1）（v/v）溶液で１回抽出し、そしてDNAを２容量のエ
タノールで沈殿させた。DNAを遠心により集め、70％（w
/v）のエタノールで洗浄し、再遠心し、真空乾燥した。
DNAを20μのTE緩衝液（pH7.6）中に溶解し、ブラント
端のDNA断片をM13 mp10断片のSma I切り離し部位へ再
結合し、配向に依存して、0.8kbまたは0.2kbのKpn I/Sm
a I配列を排除した（第４図参照）。 PRV tk遺伝子のSac I断片に加えて、３つのSma I断片
を、前述のSac I断片のサブクローニングに用いたのと
同一の方法でファージM13 mp8中でサブクローニングし
た（第４図）。 配列のために１本鎖ファージDNAを調製するために、
1.0mlのファージ感染E. coli.K12 JM103および1.0mlの
新しく生長する非感染バクテリアを100mlのMl肉汁中に
接種し、37℃において７時間インキュベーションした。
ファージを上澄みから12％（w/v）のポリエチレングリ
コール（6000）および1.5mMのNaClで沈殿させ、遠心に
より集め、5.0mlのTE緩衝液プラス0.1mlの10％（v/v）
ドデシル硫酸ナトリウムおよび5.0mlの90％（v/v）水性
フェノール中に懸濁させた。この混合物を遠心し、水相
を5.0mlのフェノール：クロロホルム（1:1）で１回抽出
した。次に、DNAを２容量のエタノールで沈殿させ、沈
殿を70％（v/v）で、次いで100％のエタノールで洗浄
し、真空乾燥し、そして0.2mlのTE緩衝液中に溶解し
た。 DNAの配列化（sequencing）は、ジデオキシヌクレオ
シド鎖の停止法により、鋳型としてPRV（BUK）BamH I−
11 DNAの１本鎖M13サブクローン、ペンタデカマー合成
プライマー（New England BioLabs,Inc.）、標識基質
として［α−³²P］−dTTP、Mg⁺、適当な非標識デオキシ
リボヌクレオシドトリホスフェートおよびジデオキシリ
ボヌクレオシドトリホスフェート、およびE. coli.DNAポ
リメラーゼ（Klenow断片、Bethesda Reseach Laborat
ories）を使用して実施した。この反応混合物を38℃に
おいて15分間インキュベーションした後、デオキシリボ
ヌクレオシドトリホスフェートを含有するチェース溶液
を添加した。反応を38℃において10分後酵母tRNA（Sigm
a Chemical Co.）を含有するEDTA溶液の添加により停
止させ、反応生成物をエタノールで沈殿させ、90％（v/
v）のホルムアミド、30mMのNaOH、10mMのEDTA、0.3％
（w/v）のブロモフェノール・ブルー、および0.3％（w/
v）のキシレンシアノールからなる溶液の10μ中に溶
解し、90℃に１分間加熱し、そして7.6％（w/v）のアク
リルアミド、0.4％（w/v）のビスアクリルアミド、0.00
7％（w/v）の過硫酸アンモニウムおよび17％（v/v）の
ホルムアミドからなる8.0％（w/v）の配列化ゲル中に挿
入した〔サンガー，エフ.,クールソン，エイ．アール.,
バレル，ビー．ジー.,スミス，エイ，ジエイ，エイチ及
びロエ，ビー，エイ．「ジヤーナル オブ モレキユラ
ー バイオロジー」（Sanger,F.,Coulson,A.R.,Barrel
l,B.G.,Smith,A.J.H.and Roe,B.A.Ｊ．Mol．Biol．143:
161−178（980）及びサンガー，エフ.,ニツクレン，エ
ス．及びクールソン，エイ．アール．「プロシーデイン
グス オブ ザ ナシヨナル アカデミー オブ サイ
エンス オブ ザ ユーエスエイ」（Sanger,F.,Nickle
n,S.and Coulson,A.R.Rroc．Nat．Acad．Sci．USA），7
4:5436−5476（1977）参照〕。 PRV tk遺伝子の解読区域を含有する1686bpのDNA断片
のヌクレオシド配列は、実質的に第５図中に示す通りで
ある。第５図に示すヌクレオシド配列はPRV（BUK−７）
により得られるが、tk遺伝子の高度に進化的な保存性
（highly evolutionary conservatism）のために、上
に例示した他のPRV tk⁺株は実質的に同様なヌクレオシ
ド配列をもつtk遺伝子を有することが期待され、こうし
て、下に考察するように、第５図におけるヌクレオチド
配列を使用して、出発物質としてPRV（BUK）以外のPRV
tk⁺株を用いて、追加のPRV tk^-欠失突然変異体を構成
することができる。 第５図において、pBB−11の3.9図単位におけるBamH I
部位に相当するBamH I部位（CGATCC）（第４図参照）は
ヌクレオチド318において開始する。BamH I部位に対す
るヌクレオチド５′は、PRV DNA BamH I−11断片に隣
接するBamH I−９断片中に存在する（第２図参照）。次
いで、1368ヌクレオチドにおいて、この配列はpBB−11
のBamH I部位から反時計回りに延びる（3.9図単位；第
４図）。PRV TKのための推定上の翻訳開始信号、すな
わち、ATGはヌクレオチソ122に存在する。PRV TKのた
めの推定上の翻訳停止信号、すなわち、TGAはヌクレオ
チソ1229に存在する。PRV TKのための推定上の転写の
ポリアデニル化信号、すなわち、AATAAAはヌクレオチソ
1411に存在する。こうして、第５図における配列から予
測されるPRV TKの分子量は40,610ダルドンである。こ
れは他のアルファヘルペスウイルスTKに類似する。 50を超える異る制限ヌクレアーゼについての制限ヌク
レアーゼ部位が、第４図に示されるヌクレオチド配列か
ら予測される。例えば、Sac I部位はヌクレオチド115、
925、1007、1034および1073における配列から予測され
るので、pBB−11 dl SacA26において欠失したSac I−
Ｃ断片（下を参照）は、長さが148bp、すなわち、ヌク
レオチド925から1073までであろう。この欠失はまた翻
訳リーディングフレームを変化させる。なぜなら、欠失
は３つに分画不可能である、すなわち、コドンは３つの
ヌクレオチドを含有するからである。さらに、Sma I部
位はヌクレオチド４、402および763において予測され、
そしてXho IおよびMlu I部位はそれぞれヌクレオチド11
00および1110において予測される。これらの予測はpBB
−11の制限ヌクレオチド地図と一致し（第４図参照）そ
して他の欠失突然変異体を作るための一緒に密接する部
位について精確なデータを提供する。さらに、２つの部
位がXma IIIについて予測され、３つの部位がBgl Iおよ
びHinc IIについて予測され、そして５つの部位がSac I
Iについて予測される。これらの制限部位を使用して、
本発明の代わりに交雑プラスミド、こうして他のtk^-欠
失突然変異隊を構成することができる。 Ｅ、 pBB−11の欠失プラスミドの構成 前述のように、PRVの組み換えtk^-欠失突然変異体の特
異的なかつ高い効率の工学（engineering）について、t
k遺伝子の解読区域中に欠失をもち、しかも欠失に隣接
する５′および３′部位の両者に少なくとも400bpのPRV
ヌクレオチド配列を含有してPRV tk⁺DNAのtk遺伝子と
の相同組み換えを促進するプラスミドを必要とする。こ
れらの性質をもつプラスミドを構成するために、プラス
ミドpBB−11を制限ヌクレアーゼSac Iで消化し、次いで
前述のようにファージT4 DNAリガーゼで再結合した
（第４図参照）。 次いで、E. coli.K12株RR1を前述のように得られるプ
ラスミドで形質転換し、そして生産されたプラスミドDN
Aを前述のように分離した。次いで、候補の欠失プラス
ミドのDNAを前述のようにアガロースゲルの電気泳動に
より分析した。pBB−11のSac I断片の欠失を含有する、
すなわち、PRV（BUK）BamH I−11 Sac I−ＡおよびSac
I−Ｃ断片を含有するpBB−11 dl SacA26と表示するプ
ラスミドを分離した（第４図参照）。pBB−11 dl Sac
A26の制限地図は第４図に示されている。Sac I−Ｃ断片
はtk遺伝子の解読区域の部分を含有し、一方Sac I−Ｂ
断片から下流のSac I−Ａ断片はPRV tk遺伝子のいずれ
をも含有しないことに注意すべきである。Sac I−Ａ断
片はtk遺伝子に以外のPRV遺伝子を符号化する可能性が
最もある（第４図参照）。 Ｆ、 PRV（BUK−5A−R1）の組み換えtk^-欠失突然変異
体の構成 PRV tk^-、すなわち、PRV（BUK−5A）の無傷のDNAとP
RV tk遺伝子の解読区域を含有する交雑プラスミド、す
なわち、pBB−11との間の相同組み換えは、PRV（BUK−5
A−R1）と表示する復帰変異体ウイルス中の機能的tk⁺遺
伝子を救済することを上に示した。 相同組み換えにより、tk遺伝子中のPRV欠失突然変異
体を得るために、PRV tk⁺の無傷のDNAおよびtk遺伝
子の解読区域中に欠失を含有する交雑プラスミドを用い
て出発することが必要である。この型の交雑に従い得ら
れた子孫のウイルスは、親PRV tk⁺から主としてなる。
こうして、収穫物中でPRV tk^-について強化するために
は、araTを含有する選択的培地を使用する。なぜなら、
araTはPRV tk⁺の反復を阻害し、そしてtk^-ウイルスの
発芽後生育（outgrowth）を助けるからである。 PRVのtk^-欠失突然変異体のこの構成について選択した
交雑プラスミドはpBB−11 dl SacA26であった。組み
換え工程について選択したPRV tk⁺はPRV（BUK−5A−R
1）であった。 下表６中のデータが明らかに示すように、PRV（BUK−
5A）は親PRV（BUK−５）よりもかなり有毒ではなく、そ
して復帰変異体のPRV（BUK−5A−R1）は中間の毒性を有
し、これは前述の突然変異誘発および選択工程の結果で
あり、PRV（BUK−5A−R1）DNAはPRV（BUK−５）DNAより
も好ましく、あるいは欠失突然変異体の構成にPRVのtk⁺
場の株（field strains）のDNAよりも好ましい。 PRV（BUK−5A−R1）の組み換えtk^-欠失突然変異体の
構成は、次の方法で特別に実施した:Red−９細胞を60mm
のペトリ皿（0.5×10⁶細胞／皿）中に接種し、そして37
℃において36時間インキュベーションした。培養物を前
述のようにPRV（BUK−5A−R1）とpBB−11 dl SacA26D
NAとの混合物で同時トランスフェクションした。収穫し
たウイルスを生長培地中で−70℃において凍結して貯蔵
した。次いで、同時トランスフェクション（co−transt
ection）から収穫したウイルスを融解し、超音波処理
し、そして100μg/mlのaraTを補充した生長培地で希釈
した。 PRV tk^-欠失ウイルスについて強化するために、８オ
ンスのびん内の100μg/mlのaraTを含有する生長培地中
のRab（BU）細胞の全面単分子層培養物中で前記の希釈
したウイルスを継代培養した。 37℃において１時間吸収した後、感染させた細胞の単
分子層を、１の水につき8.0gのNaCl、0.4gのKCl、0.1
gのグルコースおよび0.02gのフェノールレッドからなる
溶液（以後「GKN」）で３回洗浄し、次いで100μg/mlの
araTを含有する生長培地を添加した。34.5℃においてさ
らに48時間インキュベーションした後、ウイルスを収穫
した。 第１選択的継代培養の収穫物の滴定による第２選択的
工程およびプラーク精製を、前述のように、100μg/ml
のaraTの存在下にRab（BU）細胞中で実施した。 欠失プラスミドpBB−11 dl SacA26に欠ける対照ト
ランスフェクションにおいて、araTに対して抵抗性の自
然突然変異体を分離したが、その頻度はpBB−11 dl S
acA26で同時トランスフェクションするときのわずかに1
/4であった。 次いで、tk^-DKを有する候補の組み換えPRVを個々のar
aT抵抗プラークから不規則に採取し、そしてウイルスの
プールを調製した。 ４つの候補、すなわち、PRV（BUK−dl １）、PRV（B
UK−dl ２）、PRV（BUK−dl ３）およびPRV（BUK−d1
４）と表示する候補を得た。PRV（BUK−dl ３）はア
メリカン・タイプ・カルチャーコレクション（the Ame
rican Type Culture Collection）においてATCC N
o.VR−2074で受託された。 Ｇ、 分子の交雑化のためのプローブを調製するための
pBB−11 DNAのニック翻訳 欠失が上で得られる候補の欠失突然変異体のtk遺伝子
中に存在することを立証するために、分子の交雑化の研
究をプローブとしてpBB−11 DNAを使用して実施した。
pBB−11プローブは次の方法で得た。 精製したプラスミドpBB−11 DNAを次の方法でニック
翻訳（nick−translating）することにより放射標識し
た。6.0μモルのPBS、pH7.4;1.8ナノモルのdATP;1.8ナ
ノモルのdGTP;0.1mCiの［α−³²P］−dTTP（400Ci/ミリ
モル）;0.1mCiの［α−³²P］−dCTP（400Ci/ミリモル）
（Amersham Corporation）を含有する反応混合物の25
μに、約1.0μｇのpBB−11を添加した。次いで、約1.
0μのDNase Ｉ（Worthington Biochemical Corpor
ation）中の1.33ngを添加し、そして反応混合物を１分
間室温において静置した。次に、反応混合物を1.0μ
のE. Coli.DNAポリメラーゼＩ（Boehringer−Mannheim
Bichemicals）中の5.0単位と一緒にインキュベーション
した。特定の活性が２×10⁸cpm/μｇのDNAになったと
き、すなわち、約３時間において、反応を10μの0.25
MのEDTA（pH7.4）の添加および68℃の10分間の加熱によ
り停止させた。次いで、キャリアーとして、TE緩衝液中
の5.0mg/mlの超音波処理したサケの精子のDNAからなる
溶液の50μを前記混合物へ添加し、そしてニック翻訳
したDNAをSephadex G50（微細）カラムクロマトグラフ
ィーにかけ、10mMのNaCl、10mMのTris−HC1んpH7.5、2.
0mMのEDTAで溶離することにより精製した。 得られる［³²P］標識ニック翻訳DNAを水浴中で20分間
沸騰させた後DNA−DNA交雑化実験においてプローブとし
て使用し、そして氷上で急冷して１本鎖DNAを形成した
〔リグビー，ピー．ダビリユ．ジエイ.,デイツクマン，
エム.,ローデス，ジー.,及びバーグ，ピー．「ジヤーナ
ル オブ モレキユラー バイオロジー」（Rigby,P.W.
J.,Dieckmann,M.,Rhodes,G.,and Berg,P.Ｊ．Mol．Bio
l．），113:237−251（1977）参照〕。 Ｈ、 pBB−11 DNAを使用するPRV DNAの交雑化 菌株PRV（BUK−5A−R1）、PRV（BUK−dl １）、PRV
（BUK−dl ２）、PRV（BUK−dl ３）およびPRV（BUK
−dl ４）の各々からのDNAの0.6μｇを、制限ヌクレア
ーゼ、Sam I（New England BioLabs,Inc.）Sst I［Sac
Iのイソシゾマー（isoschizomer）］（Bethesda Rese
arch Laboratories,Inc.）およびBamH Iで酵素供給者
により特定された条件下で切り離し、そして断片を0.6
％（w/v）のアガロース上で35ボルト（一定電圧）およ
び４℃において16時間電気泳動することにより分離し
た。電気泳動緩衝液は、0.04MのTrizma塩基、0.03MのNa
H₂PO₄、pH8.1および0.001MのEDTAからなっていた。Cla
I切り離しプラスミド、pMAR4（13.6kb）、pMH110（4.4k
b）およびpAGO（6.4kb）、ファージlambda DNAのHind
III断片、およびファージ φX174 RF DNAのHae III
断片をまた遺伝標識として電気泳動した。結果を第6A図
および第6B図に示す。レーン（lane）１、６および11:P
RV（BUK−dl ４）；レーン２、７および12:PRV（BUK−
dl ３）；レーン３、８および13:PRV（BUK−dl
２）；レーン４、９および14:PRV（BUK−dl １）；レ
ーン５、10および15:PRV（BUK−5A−R1）；レーン16:Hi
nd IIIλおよびHae III φx174断片（New England Bi
oLabs,Inc.）；レーン17:Cla I切り離しプラスミドpMAR
4（13.6kb）、pAGO（6.4kb）、およびpMH110（4.4kb）
遺伝標識DNA〔キツド，エス.,クアビ，エイチ.,ダブ
ス，デイー．アール．及びオーツカ，エイチ．「ジヤー
ナル オブ メデイカル ビロロジー」（Kid,S.,Qavi,
H.,Dubbs,D.R.and Otsuka,H.Ｊ．Med．Virol．）,12:25
−36（1983）参照〕。 第6A図に示すように、４つの候補のうちから３つはtk
遺伝子を含有するPRV（BUK−７）BamH I断片、すなわ
ち、レーン11、12および13に対して特異性の変更（alte
rations）を有することがわかった。詳しくは、3.5kbの
BamH I断片は消失し、そして約3.3kbの新しい断片が現
われた。この結果はPRV tk遺伝子からのほぼ200bpのSa
c I−Ｃ断片の欠失と一致する。 電気泳動後、アガロースゲル中の分離したDNA制限断
片を次の方法でニトロセルロースのフィルター（Schlei
cher and Schuell）へ移した:1.0MのKOHを含有するガラ
ス支持トレー中にアガロースゲルを室温において30分間
入れ、次いで、1.0MのTris−HCl、pH7.0および0.6MのNa
Clを含有するガラス支持トレー中に室温において60分間
入れた。次いで処理したゲルをブロット装置（blot ap
paratus）（Bethesda Research Laboratories）へ移し
た。 ニトロセルロースのフィルターを水中で10分間、次い
で20 Ｘ SSC中で５分間予備湿潤化した。次に、フィ
ルターをゲル上に配置した。20 Ｘ SSCを移送流体と
して使用して、ブロッティング（blotting）を約24時間
進行させた。付着性のゲルをニトロセルロースのフィル
ターから除去し、フィルターを６ Ｘ SSCで洗浄し、
室温において数時間乾燥させ、次いで真空デシケーター
内で60℃において一夜乾燥させた。次いで、80℃におい
て２時間ベーキング（baking）した。ニトロセルロース
のフィルターをデシケーターから取り出し、デイジー
（Dazey）のシール・ア・ミール（seal−ａ−meal）料
理袋に入れた〔スーザーン，イー．エム.,「ジヤーナル
オブ モレキユラー バイオロジー」（Southern,E.
M.,Ｊ．Med．Biol．），98:503−513（1975）参照〕。 フィルターをまず60℃において一夜50mlの変性デンハ
ルト（Denhardt）の溶液で処理した。前記溶液は３ Ｘ
SSC、0.02％（w/v）のポリビニルピロリドン、0.02％
（w/v）のフィコール（Ficoll）、0.02％（w/v）のBS
A、50μg/mlのアルカリ性サケ精子DNAおよび10μg/mlの
ポリ（Ａ）からなっていた。10mlの0.2NのNaOH中に50mg
のサケ精子DNAを溶解し、100℃に20分間加熱してDNAを
変性しかつ約0.4kbのセグメントに剪断し、次いで0.2ml
の10NのHClで中和することにより調製した約5.0mg/mlの
原料溶液から、アルカリ性サケ精子DNAを添加した。 次いで、変性デンハルト（Denhardt）の溶液を、50％
（v/v）のホルムアルデヒド、0.6MのNaCl、0.2MのTris
−HCl、pH8.0、0.02MのEDTA、0.1％（w/v）のドデシル
硫酸ナトリウム、50μg/mlのアルカリ性サケ精子DNA、
および10μg/mlのポリ（Ａ）からなる交雑化緩衝液の50
mlで置換した。次に、気泡を袋から絞り出し、次いでそ
れをオスター・タッチ−アーマチック・バック・シーラ
ー（Oster Touch−ａ−Matic Bag Sealer）でシール
し、振盪機上で37℃において１時間インキュベーション
した。 その後、前述のようにして得られた、１本鎖［³²P］
ニック翻訳pBB−11 DNAの、約10⁷cpmおよび50ナノグラ
ムを含有する約1.0mlを、袋の側面の角に穴を開けるこ
とにより3.0mlの注射器で袋に添加した。次ぎに、袋を
再シールし、振盪機上で48時間まで37℃においてインキ
ュベーションして交雑化を進行させた。 交雑化が完結した後、袋を切り、溶液をデカンテーシ
ョンした。次いで、フィルターを注意して除去し、そし
て最初の洗浄のためであるが、いずれの洗浄においてポ
リ（Ａ）を含まない、50μg/mlの変性サケ精子DNAを含
有する約100mlの交雑化緩衝液を含むトレー中に入れ
た。フィルターを30分間37℃において５回おだやかに振
盪させながら洗浄した。次に、フィルターを30分間37℃
において0.3 Ｘ SSCで、次いで0.1 Ｘ SSDで洗浄
し、濾紙上に置いて室温において一夜乾燥させた。 オートラジヲグラフィーのため、フィルターをサラン
・ラップで覆われた薄い片の厚紙上に再び配置し、そし
て増感紙をもつコダック（Kodak）Ｘ−Omat Ｒ XR2フ
ィルムへ−70℃において５時間ないし２日間露光した。 第6B図に示すように、［³²P］標識pBB−11プローブド
（probed）ゲルのオートラジオグラフィーにより、PRV
（BUK−dl １）は親PRV（BUK−5A R1）のそれに同一
の制限パターンを有する自然tk^-突然変異体であり、こ
れに対してPRV（BUK−dl ３）およびPRV（BUK−dl
４）はtk^-欠失突然変異体であることが証明された。さ
らに、第6B図から明らかなように、tk遺伝子のSac I−
Ｃ断片は組み換えウイルスPRV（BUK−dl ２）、PRV（B
UK−dl ３）およびPRV（BUK−dl ４）において欠失し
ていた。この欠失は約100〜200bpであることがわかっ
た。詳しくは、3.5kbのBamH I断片が消失し、そして約
3.3kbの新しい断片が現われた（第6B図、レーン11〜13
参照）。さらに、変更はpBB−11の1.8kbのSma I断片中
に見い出された。レーン１〜３は、３つの候補の、上に
同定した欠失突然変異体において、この1.8kbのSma I断
片は期待するように約1.6kbに短くなったことを示す
（第４図参照）。Sst I処理した群では第6B図において
は差は明らかではない。なぜなら、非常に小さい、すな
わち、100bpより小さい、DNA断片はニトロセルロースの
フィルターへ結合することができないからである。 実施例３ tk⁺復帰変異体についてのPRV tk^-原料（stock）の分
析 上の実施例１および２により分離されたPRV tk^-突然
変異体の伸長（propagatin）の間tk⁺に対する復帰変異
体が自然じ生ずるかどうかを研究するために、次のプラ
ークのオートグラフィー実験〔テンサー，アール．ビ
ー.,ジヨーンズ．ジエイ．シー.,レツセル，エス．ジエ
イ及びフラリツシユ，エフ，エイ．「ジヤーナル オブ
クリニカル マイクロバイオロジー」（Tenser,R.B.,
Jones,J.C.,Ressel,S.J.,and Fralish,F.A.J. Clin，Mic
robiol．），17:122−127（1983）参照〕を実施した。 ２×10⁶のRab（BU）細胞を100mmのプラスチックのペ
トリ皿内の10mlの生長培地中に接種し、そして準全面単
分子層が得られるまで、37℃において２〜３日間インキ
ュベーションした。次に、生長培地を取り出し、単分子
層をGKNで洗浄した。次いで、二重反復実験の皿をPRV
（BUK−dl ３）、PRV（BUK−5A）、無ウイルス（消極
的対照として）、またはPRV（BUK−５）（積極的対照と
して）で感染させた。各ウイルスを用いて、皿を10²p.
f.u./皿、10³p.f.u./皿、10⁴p.f.u./皿、または10⁵p.f.
u./皿を含有する0.5mlで接種した。37℃において１時間
の吸収期間後、生長培地中に溶解した0.5％（w/v）のメ
チルセルロースからなる溶液の10mlを添加し、そしてイ
ンキュベーションを34.5℃において３日間続けた。次い
で、このメチルセルロース溶液を毛管ピペットで取り出
し、そして5.0mlの生長培地と置換した。その後、
［¹⁴C］−チミジン（3.0μCi/皿）を６時間添加してDNA
を標識付けた。 次に、生長培地を取り出し、単分子層を10μg/mlの非
放射性チミジン含有GKNで洗浄し、そして細胞を15mlの
エタノールで23℃において５分間添加することにより固
定した。次いで、細胞を5.0mlの0.1％（w/v）の結晶質
バイオレット溶液で室温において５分間着色し、過剰の
水道水で洗浄し、一夜空気乾燥した。次いで、固定した
細胞を含有するペトリ皿の底をフジ（Fuji）RX Ｘ線フ
ィルムと１週間接触させた。このフィルムを現像する
と、PRV tk⁺プラークは同位元素の組み込みによる暗い
リムをもつ円形として現われ、これに対してtk^-プラー
クは標識されず、すなわち、暗色のリムを持たなかっ
た。この結果が証明するように、PRV（BUK−5A−R1）の
感染の子孫、したがって、tk⁺表現型の子孫、から得ら
れるプラークは高度に標識される。これと対照的に、PR
V（BUK−5A）およびPRV（BUK−dl ３）の子孫、したが
って、tk^-表現型の子孫、から得られるプラークは標識
されない。こうして、PRV tk⁺へのPRV tk^-への復帰は
検出されなかった。すなわち、PRV（BUK−5A）およびPR
V（BUK−dl ３）についての自然復帰（spontaneous r
eversion）速度は10^-5より小である。 実施例４ PRV株のTK活性 種々のPRV株のTK活性を次の方法でアッセイした。0.0
1MのKCl、0.0015MのMgCl²、および0.01MのTris−HCl、p
H7.4からなる低張性緩衝液の５容量中に懸濁した細胞沈
殿物をダウンス（Dounce）均質化することにより、６時
間の後感染において、約10⁸のモック（mock）感染また
はPRV感染Rab（BU）から細胞質ゾルを調製した。次い
で、1.5MのKCl、0.03Mの２−メルカプトエタノール、25
％（v/v）のグリセロールおよび0.5Mのイプシロン ア
ミノカルロン酸を含有する溶液の1/9容量を添加して、K
Cl濃度を等張性に調節し、かつ酵素を安定化した。この
ホモジネートを４℃において４時間スピンコ（Spinco）
No.65 ローターで40,000rpmにおいて遠心し、そして上
澄みをバイアルに移した。アリコートをタンパク質濃度
の決定およびTK活性のアッセイのために取った。 TKアッセイは、３つの異る酵素レベル、例えば、75、
113および188μｇのタンパク質／アッセイ管において、
38℃において10分間ゼロ次の運動力学に標準化した条件
下で実施した。反応混合物は0.1mMの［³H］−デオキシ
チミジン（291cpm/ピコモルのデオキシチミジン）、2.0
mMのATP,1.0mMのMgCl₂、10mMのKF、100mMのTris−HCl、
pH8.0、およびタンパク質を合計0.125mlの容量で含有し
た。反応を0.025mlの50％（w/v）のトリクロロ酢酸の添
加により停止させた。1000×ｇの低速遠心により沈殿し
たタンパク質を除去した後、0.02mlの部分をDEAE−セル
ロースのシート（Whatman）上へスポッティング（spott
ing）した。反応の［³H］−dTMP生成物は、基質の
［³H］−デオキシチミジンから、175mlのギ酸および6.3
gのギ酸アンモニウムを合計１の容量の水へ添加する
ことにより行った溶媒中のクロマトグラフィーにより分
離した。［³H］−dTMPのスポットをUV光により可視化
し、紙から切った。次いで、各スポットにおける放射能
を液体シンチレーション分光分析により決定した〔キツ
ト，エス．及びクアビ，エイチ．「ビロロジー」（Kit,
S.and Qavi,H.Virology）,130:381−389（1983）参
照〕。結果を下表３に示す。 表３から明らかなように、（ｉ）Rab（BU）細胞、す
なわち、、tk^-細胞、は無視しうるTK活性を有する；（i
i）TK活性はRab（BU）細胞によりtk⁺ウイルスPRV（BUK
−５）で感染後に獲得されるが、PRV（BUK−5A）、PRV
（BUK−d1 ２）、PRV（BUK−dl ３）またはPRV（BUK
−dl ４）で感染後に獲得されない；そして（iii）TK
はまたRab（BU）細胞がtk⁺ウイルスPRV（BUK−5A−R1）
で感染された後獲得される。 実施例５ PRV株の菌力（virulence） いくつかの遺伝子はアルファヘルペスウイルス類が病
気を起こす能力に寄与すること、すなわち、菌力がマル
チジェニック（multigenic）であることは一般に認めら
れている。例えば、アルファヘルペスウィルス類は潜在
性を確立し、神経系を上昇しそして脳炎を引き起こす、
または妊娠した動物において流産を引き起こす能力にお
いて異ることが知られている。前述のように、tk遺伝子
は菌力に寄与する遺伝子の１つであるが、菌力に寄与す
る唯一の遺伝子ではない。すなわち、PRVブカレスト（B
ucharest）株およびバルタ（Bartha）株はPRVのアウジ
ェスズキイ（Aujeszky）株または場の分離物（field i
solates）に比較してブタについて減衰されるが、前述
のウイルスのすべてはPRV tk⁺株である。この実施例
は、PRV（BUK）株がtk遺伝子をtk^-表現型に突然変異さ
せることによりさらに減衰されうることを立証する。 tk^-ウイルスの分離に利用する親PRV株は、前述のよう
に、PRV（BUK）、すなわち、ニワトリ細胞中で多数回継
代培養することにより前もって減衰させたtk⁺株、であ
り、そしてブタをアウジェスズキイ（Aujeszky）の病気
に対して保護することにおいて有用であることがわかっ
た〔スコダ，アール.,ブラウナー，アイ.,サデツキー，
イー.,及びメイヤー，ブイ.,「アクタ ビロロジカ」
（Skoda,R.,Brauner,I.,Sadecky,E.,and Mayer,V.Acta
Virol），８:1−９（1964）参照〕。PRV（BUK）はま
たウシについて部分的に減衰されることが示されたが、
このウイルスの低い投与量はウサギおよびマウスにおい
て致死の感染を生成する。こうして、実験動物のPRVに
対する感受性は、これらの動物において本発明の遺伝的
に操作したPRV tk^-株の菌力の適当な測定手段である。 本発明のウイルスの菌力を評価するために、マウスを
PRV（BUK−５）、PRV（BUK−5A）およびPRV（BUK−5A−
Rl）で腹腔内に接種した。結果を下表４に示す。 上の表４の実験１に示す結果から明らかなように、腹
腔内接種について、親PRV（BUK−５）、すなわち、tk⁺
ウイルス、についてのLD₅₀値は約68p.f.u./マウスであ
り、そしてPRV（BUK−5A）、すなわち、tk^-ウイルス、
について、LD₅₀値は10⁷より大きかった。PRV（BUK−5
A）は、また、マウスにおける腹腔内接種後、菌力がtk⁺
ウイルスPRV（BUK−５）（LD₅₀＝２）よりも低い（LD₅₀
＝500）ことがわかった。さらに、表４における実験１
の結果が示すように、プラスミドpBB−11からPRV tk遺
伝子を受け取ったPRV（BUK−5A−R1）、すなわち、tk⁺
ウイルス、は約4800の中間のLD₅₀を有した。この事実が
証明するように、PRVの菌力は機能的（functional）tk
遺伝子をPRVに回復させることにより有意に増加するこ
とができ、そしてこの遺伝子は病原性に対して重要であ
る。さらに、PRV（BUK−5A−R1）は中間の菌力を有する
ので、結果が示すように、実施例１において例示されて
いる本発明の第１実施態様におけるPRVを減衰させる方
法は、tk遺伝子に影響を及ぼすものを越えた変化をウイ
ルスに導入し、そしてこれらの変化は減衰を増大する。
さらに、PRV（BUK−5A−R1）を実施例２においてtk^-欠
失突然変異体を生成するための基質として使用したの
で、追加の減衰性突然変異はPRV tk^-欠失突然変異体に
おいて保持される。 tk^-欠失突然変異体、PRV（BUK−dl ３）、の皮下接
種を用いる追加の研究は、上の表４の実験２に示されて
いる。未希釈のtk^-欠失突然変異体、PRV（BUK−dl
３）による感染、すなわち、10⁸p.f.u./mlの力価を有す
るウイルスの0.1mlの接種に対してマウスは生存した。
他方において、10⁴のp.f.u.のPRV（BUK−５）は５匹の
マウスのうち４匹を殺し、そして10³のp.f.u.は５匹の
マウスのうち２匹を殺した。 また、１〜10p.f.u.のPRV（BUK−５）の皮下接種後、
胎児の感染はすべてを感染させた５〜６ポンドのニュー
ジーランドのウサギにおいて４〜６日のうちに生成す
る。しかしながら、10³〜10⁵p.f.u.のPRV（BUK−5A）お
よびPRV（BUK−dl ３）による感染に対して３匹のウサ
ギのうち１匹は生存する。生存しないウサギは死ぬまで
より長い期間、すなわち、７〜12日を要した。 さらに、PRV（BUK−dl ３）が減少した菌力を有する
という指示は、ウシのパイロット試験から得られる。す
なわち、菌力のあるPRV株で感染したウシは、中枢神経
系の信号、例えば、腫瘍、運動失調、および興奮を包含
する感染の臨床的信号を発現する。これらの信号は、接
種の６〜７日の期間後に生じ、そしてウシは数時間以内
に、すなわち、病気の信号が現われた後12時間以内に死
亡する。PRV抗体についてゼロ陰性の（zero−negativ
e）ウシにおいて、LD₅₀値は鼻内に投与した菌力のある
ウイルスについて約10⁴〜10⁵のTCID₅₀であり、そして筋
肉内または皮膚内に投与した菌力のあるウイルスについ
てよりわずかに低い〔スコダ，アール.,ブラウナー，ア
イ.,サデツキー，イー.,及びメイヤー，ブイ．「アクタ
ビロロジカ」（Skoda,R.,Brauner,I.,Sadecky,E.,and
Mayer,V.Acta Virol），８:1−９（1964））及びビロ
ン，ピー.,バンデプツテ，ジエイ.,ペンサート，エム．
ビー及びロイナン，「ジヤーナル オブ アメリカン
ベテリナリー リサーチ」（Biron,P.,Vandequette.J.,
Pensaert,M.B.and Leunan,Ｊ．Am．Ｊ．Vet．Res．），
43:760−763（1982）参照〕。1TCID₅₀は0.7p.f.u.に等
しい。 他方において、２×10⁷p.f.u.のPRV（BUK−dl ３）
で筋肉内に接種したウシおよび２×10⁸p.f.u.のPRV（BU
K−dl ３）で鼻内に接種した第２のウシの両者は、感
染に対して生存し、そしていずれのウシも、腫瘍、運動
失調または興奮のような臨床的作用を示さなかった。こ
の結果が立証するように、PRV（BUK−dl ３）はまたウ
シにおけるワクチンとして安全に使用することができ
る。 実施例６ PRV tk⁺を用いる抗体（challenge）に対するワクチン
接種した動物の抵抗 PRV tk^-株をワクチン接種したマウスがPRV tk⁺株の
病原性作用から保護されるかどうかを知るために、tk⁺
ウイルスの致死の投与量を用いる対抗実験を後述するよ
うに実施した。 それぞれPRV（BUK−5A）およびPRV（BUK−dl ３）で
腹腔内または仙腰椎の感染により実施例５におけるマウ
スをワクチン接種してから約３週間後に、マウスをPRV
（BUK−５）またはPRV（Auj）で感染させた（表５参
照）。ワクチン接種したマウスはtk⁺ウイルスのLD₅₀の1
00倍よりも多い対抗に対して明らかに抵抗性であった。
ワクチン接種しない対照マウスについて、７匹のうちで
５匹は10⁴p.f.u.のPRV（BUK−５）による腹腔内感染に
倒れ、そして４匹のうち３匹は２×10⁵PRV（BUK−５）
による皮下感染に倒れた。しかしながら、10⁶〜10⁷p.f.
u.のPRV（BUK−5A）で前もって腹腔内にワクチン接種し
たマウスはいずれも10⁴p.f.u.のPRV（BUK−５）の感染
から死亡せず、そして10⁴または10⁵p.f.u.のPRV（BUK−
5A）でワクチン接種した５匹のマウスのうちわずかに２
匹は10⁴p.f.u.のPRV（BUK−５）の感染後に死亡した。 10⁷p.f.u.のPRV（BUK−dl ３）で皮下にワクチン接
種したマウスについて、５匹のうち１匹のみが２×10
⁶p.f.u.のPRV（BUK−５）により死に、そして５匹のう
ち１匹のみが２×10⁵p.f.u.のPRV（Auj）により死ん
だ。 上の結果が明らかに示すように、本発明のPRV tk^-株
はPRV tk⁺の感染の病原性作用に対してマウスを高度に
保護する。 マウスはPRVに対してきわめて感受性であり、そして
この実施例において使用した対抗ウイルス投与量は非常
に高く、すなわち、10⁴〜10⁶p.f.u.であったことに注意
すべきである。現場（field）の感染において、ブタま
たはウシは10³〜10⁴p.f.u.より大きいPRVに暴露される
ことはありえないであろう。こうして、上の結果から、
本発明のワクチンのウイルスは現場の条件のもとで有効
であろうと信じられる。

【図面の簡単な説明】 第１図は、例えば、本発明の偽狂犬病ウイルスの株の誘
導を概略的に示す。 第２図は、BamH IおよびKpn IについてのPRV（BUK−
５）およびＰ（BUK−７）のDNA制限ヌクレアーゼ地図を
示す。ゲノムの独特の短い（Us）領域を限定する逆反復
（inverted repeat）（IR）および末端反復（TR）が示
されている。ULはゲノムの独特の長い領域を意味する。 第３図は、BamH IおよびKpn I消化PRV（Auj）、レーン
３および8;PRV（BUK−５）、レーン２および7;PRV（BUK
−dl 3）、レーン１および６の臭化エチジウム着色アガ
ロースゲルによる電気泳動図を示す。レーン４および５
は、Hind III λおよびHae III φX174標識（marke
r）断片を含有する。 第４図は、例えば、本発明において使用するプラスミド
の誘導を概略的に示す。pBR322中にPRV（BUK−７）のBa
mH I−11断片を挿入すると、交雑プラスミドpBB−11が
生成する。プラスミドpBB−11 dl SacA26は、pBB−11か
ら1.0kbのSac I−Ａ断片および0.1kbのSac−Ｃ断片を欠
失することにより得られる。 第５図は、PRV tk遺伝子の解読領域を含有するPRV（BUK
−７）断片のヌクレオチド配列およびその側面に位置す
る（flanking）配列を示す。この配列はPRV TK mRNAを
生成するために転写されたDNA鎖の補体である。 第６図は、PRV DNAのSma I、Sst IおよびBamH I断片の
アガロースゲルによる電気泳動図を示す。（Ａ）臭化エ
チジウム着色されている。（Ｂ）特異的DNA断片に対す
る［³²P］標識pBB−11プローブの交雑化を示すオートラ
ジオグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マロン・キツト アメリカ合衆国テキサス州77025ヒユー ストン・マーワースナンバー506 3000 (72)発明者 ソール・キツト アメリカ合衆国テキサス州77024ヒユー ストン・ウインクドライブ 11935 (56)参考文献 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．76，Ｐ. 331−340（1977) Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．127，Ｐ. 194−204（1983) Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．285 Ｐ．333 −335（1980)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．（１） 偽狂犬病ウイルスから組換えDNA技法によ
   り得ることができ、かつtk遺伝子における欠失の結果と
   して機能的TKを生産することができない偽狂犬病ウイル
   ス変異体の製薬学的に有効量、および （２） 製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 を含んでなる偽狂犬病のための変性された生きているウ
   イルスのワクチン。 ２．偽狂犬病ウイルスが温度抵抗性である特許請求の範
   囲第１項記載の偽狂犬病のための変性された生きている
   ウイルスのワクチン。 ３．前記欠失が約10〜1500bpの大きさである、特許請求
   の範囲第１または２項記載の偽狂犬病のための変性され
   た生きているウイルスのワクチン。 ４．前記欠失が約75〜750bpの大きさである、特許請求
   の範囲第３項記載の偽狂犬病のための変性された生きて
   いるウイルスのワクチン。 ５．前記偽狂犬病ウイルス変異体がPRV（BUK−d13）（A
   TCC No.VR−2074）の同定特性を有する、特許請求の範
   囲第２項記載の偽狂犬病のための変性された生きている
   ウイルスのワクチン。 ６．前記偽狂犬病ウイルス変異体が凍結乾燥されてい
   る、特許請求の範囲第１または２項記載の偽狂犬病のた
   めの変性された生きているウイルスのワクチン。 ７．製薬学的に許容されうる担体または希釈剤がPRVに
   対する抗体を含有しない約2.5〜15％の血清を含有する
   生理学的緩衝媒質である、特許請求の範囲第１または２
   項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウイル
   スのワクチン。 ８．前記血清が、ブタ血清、子牛血清、胎児牛血清、ウ
   マ血清および子羊血清から成る群より選択される、特許
   請求の範囲第７項記載の偽狂犬病のための変性された生
   きているウイルスのワクチン。 ９．製薬学的に許容されうる担体または希釈剤が約0.5
   〜3.0％の血清タンパク質を含有する生理学的緩衝媒質
   である、特許請求の範囲第１または２項記載の偽狂犬病
   のための変性された生きているウイルスのワクチン。 １０．前記血清が、ブタ血清アルブミンおよびウシ血清
   アルブミンから成る群より選択される、特許請求の範囲
   第９項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウ
   イルスのワクチン。 １１．前記製薬学的に有効量が約10⁵〜５×10⁸p.f.u.で
   ある、特許請求の範囲第１または２項記載の偽狂犬病の
   ための変性された生きているウイルスのワクチン。 １２．前記製薬学的に有効量が約10⁶〜10⁷p.f.u.であ
   る、特許請求の範囲第11項記載の偽狂犬病のための変性
   された生きているウイルスのワクチン。 １３．（１） tk遺伝子の欠失の結果として機能的TKを
   生産することができない偽狂犬病ウイルス変異体の製薬
   学的に有効量からなり、前記偽狂犬病ウイルス変異体
   が、 （ａ）クローニングベクターと、PRV tk遺伝子の実質的
   にすべてを含有するPRVのDNA断片とからなる雑種プラス
   ミドを構成し、 （ｂ）tk⁺宿主細胞を、工程（ａ）で得られる雑種プラ
   スミドとPRV tk^-突然変異原誘発突然変異体からのDNAで
   同時トランスフェクションし、 （ｃ）tk^-宿主細胞中において、工程（ｂ）において生
   産されたからウイルスのPRV tk⁺について選択し、 （ｄ）工程（ａ）で得られる雑種プラスミドにおけるtk
   遺伝子中のDNA配列を除去してtk遺伝子中に欠失を有す
   る雑種プラスミドを形成し、 （ｅ）tk⁺宿主細胞中を、工程（ｃ）において得られたP
   RV tk⁺から誘導されたPRV tk⁺DNAと工程（ｄ）で得られ
   る雑種プラスミドで同時トランスフェクションし、そし
   て （ｆ）tk^-宿主細胞中において、工程（ｅ）において生
   産されたウイルスからのPRV tk^-について選択して、PRV
   tk^-欠失突然変異体を生産する、 工程を含んでなる方法によって生産され、そして （２） 製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 を含有することを特徴とする特許請求の範囲第１または
   ２項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウイ
   ルスのワクチン。 １４．前記欠失が約10〜1500bpの大きさである、特許請
   求の範囲第13項記載の偽狂犬病のための変性された生き
   ているウイルスのワクチン。 １５．前記欠失が約75〜750bpの大きさである、特許請
   求の範囲第14項記載の偽狂犬病のための変性された生き
   ているウイルスのワクチン。 １６．前記偽狂犬病ウイルスの突然変異体がPRV（BUK−
   d13）ATCC No.VR−2074）である、特許請求の範囲第13
   項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウイル
   スのワクチン。 １７．前記偽狂犬病ウイルスの突然変異体が凍結乾燥さ
   れている、特許請求の範囲第13項記載の偽狂犬病のため
   の変性された生きているウイルスのワクチン。 １８．前記クローニングベクターが、pBR322、pMB9、pB
   R325、pKH47、pBR328、pHC79、ファージCharon28、pKB1
   1、pKSV−10、pMAR420およびオリゴ（dG）テイルドpBR3
   22から成る群より選択される、特許請求の範囲第13項記
   載の偽狂犬病のための変性された生きているウイルスの
   ワクチン。 １９．前記クローニングベクターがpBR322である、特許
   請求の範囲第18項記載の偽狂犬病のための変性された生
   きているウイルスのワクチン。 ２０．工程（ａ）の前記雑種プラスミドがpBB−11であ
   る、特許請求の範囲第13項記載の偽狂犬病のための変性
   された生きているウイルスのワクチン。 ２１．欠失の各側に隣接するPRV DNAが少なくとも約400
   bpの大きさである、特許請求の範囲第13項記載の偽狂犬
   病のための変性された生きているウイルスのワクチン。 ２２．工程（ｄ）で得られる雑種プラスミドがpBB−11
   dl SacA26である、特許請求の範囲第13項記載の偽狂犬
   病のための変性された生きているウイルスのワクチン。 ２３．工程（ｂ）のPRV tk^-突然変異原誘発突然変異体
   がPRV（BUK−5A）（ATCC No.VR−2078）である、特許請
   求の範囲第13項記載の偽狂犬病のための変性された生き
   ているウイルスのワクチン。 ２４．工程（ｅ）の前記PRV tk⁺DNAがPRV（BUK−5A−R
   1）に由来する、特許請求の範囲第13項記載の偽狂犬病
   のための変性された生きているウイルスのワクチン。 ２５．前記tk⁺宿主細胞が、Rab−９、一次ウサギ腎細
   胞、二次ウサギ腎細胞、サル細胞、ヒト細胞、ヒト胚腎
   細胞およびニワトリ胚線維芽細胞から成る群より選択さ
   れる、特許請求の範囲第13項記載の偽狂犬病のための変
   性された生きているウイルスのワクチン。 ２６．前記tk⁺宿主細胞がRab−９である、特許請求の範
   囲第25項記載の偽狂犬病のための変性された生きている
   ウイルスのワクチン。 ２７．製薬学的に許容されうる担体または希釈剤がPRV
   に対する抗体を含有しない約2.5〜15％の血清を含有す
   る生理学的緩衝媒質である、特許請求の範囲第13項記載
   の偽狂犬病のための変性された生きているウイルスのワ
   クチン。 ２８．前記血清が、ブタ血清、子牛血清、胎児牛血清、
   ウマ血清および子羊血清から成る群より選択される、特
   許請求の範囲第27項記載の偽狂犬病のための変性された
   生きているウイルスのワクチン。 ２９．製薬学的に許容されうる担体または希釈剤が約0.
   5〜3.0％の血清タンパク質を含有する生理学的緩衝媒質
   である、特許請求の範囲第13項記載の偽狂犬病のための
   変性された生ているウイルスのワクチン。 ３０．前記血清が、ブタ血清アルブミンおよびウシ血清
   アルブミンから成る群より選択される、特許請求の範囲
   第29項記載の偽狂犬病のための変性された生きているウ
   イルスのワクチン。 ３１．前記製薬学的に有効量が約10⁵〜５×10⁸p.f.u.で
   ある、特許請求の範囲第13項記載の偽狂犬病のための変
   性された生きているウイルスのワクチン。 ３２．前記製薬学的に有効量が約10⁶〜10⁷p.f.u.であ
   る、特許請求の範囲第31項記載の偽狂犬病のための変性
   された生きているウイルスのワクチン。