JP3247376B2

JP3247376B2 - 弱毒化され、遺伝子的に加工されたシュードラビーウイルスｓ−ｐｒｖ−１５５およびその使用

Info

Publication number: JP3247376B2
Application number: JP50824092A
Authority: JP
Inventors: コクラン、マーク・デー
Original assignee: シントロ・コーポレーション
Priority date: 1991-03-01
Filing date: 1992-02-28
Publication date: 2002-01-15
Anticipated expiration: 2017-01-15
Also published as: DE69225471D1; ATE165978T1; JPH06505392A; US5240703A; AU1573292A; KR100245654B1; ES2118815T3; DE69225471T2; EP0573614A1; EP0573614B1; EP0573614A4; GR3027623T3; HU9302369D0; US5451499A; WO1992015328A1; DK0573614T3; US5736319A; HUT67138A

Description

【発明の詳細な説明】この出願においては、括弧内のアラビア数字によって
幾つかの刊行物が引用される。これらの参照文献の完全
な引用は、請求の範囲の直前、即ち本明細書末尾に記載
してある。本発明が属する技術の状態をより完全に記述
するために、これら引用文献の開示内容は、その全体が
参照として本出願に組み込まれる。

〔発明の分野〕

本発明はシュードラビー（Pseudorabies）から豚を守
るための生ウイルスワクチンに有用な、弱毒化されたシ
ュードラビーウイルス（pseudorabies virus）を包含す
る。本発明はまた、該ウイルスでワクチン接種された動
物と野生型シュードラビーウイルスに感染した動物とを
区別するための、このようなウイルスの使用を包含す
る。

〔発明の背景〕

ウイルスのDNAを単離し、単離されたDNAを細菌性プラ
スミドにクローン化できることによって、ウイルスワク
チンの作製に利用できる方法は大幅に拡大されてきてい
る。本発明を完成するために用いられる方法には、クロ
ーン化されたウイルスDNA配列を、挿入、欠失、およ
び、一個あるいは複数個の塩基変換によって改変するこ
とが含まれる。改変されたDNAは、次いでウイルスのゲ
ノムに再挿入され、ウイルスを非病原性にする。この得
られた生ウイルスは、ホスト動物中で免疫応答を誘発
し、病気に対して動物を保護するためにワクチンに利用
される。

動物ウイルスの一群であるヘルペスウイルスまたはヘ
ルペスビリダエ（Herpetoviridae）は、このアプローチ
が適用できるウイルス群の一例である。これらのウイル
スは、遺伝子物質として100,000ないし200,000塩基対の
DNAを含んでいる。重要なことに、ゲノムの幾つかの領
域は、細胞培養におけるin vitroでのウイルス複製に
必要不可欠では無いことが分かっている。該DNAのこれ
ら領域を改変することによって、ウイルスの病原性を低
くすること、即ちウイルスを弱毒化することができる。
例えば、チミジンキナーゼ遺伝子を不活性化すると、ヒ
ト単純ヘルペスウイルス（human herpes simplex viru
s）は非病原性になり（13）、豚のシュードラビーウイ
ルスも非病原性になる（14）。

繰り返し領域部分を除去すると、ヒト単純ヘルペスウ
イルスは非病原性になる（16,17）。繰り返し領域は、
ウイルス性発癌に関連したマレック病ウイルス（Marek
´s disease virus）で同定されている（18）。ヘルペ
スウイルスサイミリ（herpesvirus saimiri）にも同様
に、発癌性と相関する部分がある（19）。繰り返し領域
部分を除去すると、シュードラビーウイルスは非病原性
になる（米国特許4,877,737号、1989年10月31日発
行）。天然に存在するシュードラビーウイルスのワクチ
ン菌株には欠失している部分があり（7,15）、これらの
欠失は、少なくともこれら菌株の病原性の欠如に一部関
係していることがわかっている。

ヘルペスウイルスはゲノムの様々な部分にDNAの非必
須領域を含んでおり、この領域の改変によって該ウイル
スが非病原性になり、ワクチンを誘導できる非病原性株
の作製が可能であることについては一般に認められてい
る。ウイルスの弱毒化の程度は、ワクチンとしてのウイ
ルス利用性にとって重要である。欠失はウイルスの過度
の弱毒化を引き起こし、ワクチンが適度な免疫応答を誘
発できない結果となる。欠失による弱毒化の幾つかの例
が知られているが、欠失の適切な組み合わせについては
明らかでない。

シュードラビーウイルスの天然のホストは豚であり、
その感染は通常は明瞭ではないが、発熱、痙攣および麻
痺によって特徴付けられ得る。シュードラビーウイルス
は家畜、山羊、犬、猫、狐、ミンクにも感染し、これら
に感染するとホストは通常は死に至る。シュードラビー
ウイルス感染の目にみえる顕著な特徴は激しいかゆみで
あり、ホストの感染部分領域の損傷を招く。臨床的徴候
が現われてから通常は２、３日以内に、過度の興奮、発
作、麻痺、脳脊髄炎の全症状が現われ、死に至る。

豚におけるシュードラビーウイルス病は、政府機関の
世界規模での重大関心事である。合州国では、感染した
家畜の群れからの豚は畜殺場へ回す以外、売買できな
い。合州国農業省は、シュードラビーを排除するために
撲滅計画を制定した。特定の特異的ワクチン（differen
tial vaccine）や診断テスト手引が開発される以前に
は、シュードラビーウイルスについてワクチン接種され
た動物は、それが感染したものとして扱われ、同様の規
制の下に置かれた。特異的ワクチンの出現に伴って、州
−連邦共同のシュードラビーウイルス撲滅計画（Federa
l Register,Vol.55,No.90,pp.19245−19253（May9,199
0））で使用が認可されている特異的ワクチン／診断テ
ストを施したワクチン接種済の非感染豚については、州
間で出荷ができるように規制が改変されてきた。

特異的ワクチンの構築に際しては、PRVの糖蛋白質の
一つを欠失させることに関心が集められてきた。理論的
には、診断標識として選定される糖蛋白は次のような特
徴をもつべきとされる。（１）当該糖蛋白およびその遺
伝子は、伝染性のウイルスの産生に非必須のものでなけ
ればならない。（２）当該糖蛋白は、動物内で強力且つ
持続した反応を誘発しなければならない。（３）当該糖
蛋白は、防御的免疫反応に寄与してはならない。gD,gH
およびgB（II）（25）の三種の糖蛋白は、第一の基準に
当てはまらない。これらは夫々、必須であることが証明
されている、単純ヘルペスウイルス（HSV）中のカウン
ターパートを有している（20）。また、g63は希少な糖
蛋白であり。主要な血清反応を誘発するとは思わない
（８）。gIIIは中和抗体のターゲットとして（10）、ま
た細胞媒介性免疫のターゲットとして（21）防御免疫に
寄与することが分かっている。gIもまた中和抗体のター
ゲットであり（22）、防御的免疫において役割を果たす
と思われる。gpXだけが、上記三つの理論的基準全てに
適合する（25）。

現在のところ、USDA認可を受けた五つの改良型特異的
PRV生ワクチンが入手可能である。それらはPRV/マーカ
ー（SyntroVet Incorporated）、トルビド（Tolvid）
（Upjohn）、PRVワクチン（Boehringer Ingelheim）、P
RVac（SmithKline Beecham Animal Health）およびオム
ニマーク（OmniMark）（Fermenta Animal Health）であ
る。これらワクチンの夫々のための診断テスト手引は、
三つのPRV糖蛋白（gpX,gIまたはgIII）の一つに対して
向けられている。各々の場合、診断用の糖蛋白をコード
する遺伝子は、遺伝子工学によって改変されているか、
或いは天然に存在するウイルス中において欠失している
かのいずれかである。PRV/マーカー及びトルビドで欠失
している診断マーカーはgpxで、これは遺伝子工学技術
で改変されている。PRVワクチンおよびPRVacは、天然に
存在するウイルスからgIが自然に欠失したウイルスを含
んでいる。オムニマークでは、遺伝子工学の結果gIIIが
欠失している。

シュードラビーの撲滅計画が進むに従い、確認診断テ
ストが重要となろう。各々の診断抗原の抗原性が異なる
ため、また個々の動物の免疫応答の性質に起因して、診
断抗原に対する抗体の量は広範囲に亘って変化し得る。
確認テストに用いられ得る第二の診断マーカーを含むワ
クチンが、重要な価値を有するであろう。血清学的差別
化をはかるために、二つの糖蛋白の欠失を伴う二つのウ
イルス株が提唱されてきた。一つはキット（Kit）らに
より記載されているもので（U.S.特許4,711,850号）、
遺伝子工学によるGIIIの欠失と、自然に発生するgIの欠
失とを有している。前述したように、これら二つの糖蛋
白は中和抗体のターゲットであり、またgIIIは細胞媒介
性免疫のターゲットでもある。これらの重要な抗原の両
方が欠失していると、ワクチンの有効性が妨げられると
予想される。ポスト（Post）らによって記載された第二
のウイルス（25）は、gpXおよびgIの両遺伝子における
欠失を含めるために、遺伝子的に加工されている。著者
等は、これらのウイルスが、gpXのみを欠失させたウイ
ルスに比較して効果が著しく劣ると結論した。要する
に、当該技術の現状は、gpXおよびgIの両者を欠失した
ウイルスはワクチンとしては有効ではないであろうこと
を示している。

現在利用されているワクチンより優れたワクチンは、
次のような特徴を持つと思われる。（１）生後３−４日
の小豚において臨床的徴候は現われない；（２）全年齢
の豚に対して、95％の防御率を与える；（３）野生型に
感染した動物との血清学的差別を可能にする；（４）確
認診断テストができる。本発明は、gpXおよびgIの両者
における特定の領域を欠失させることによって、思いが
けなくも、この様な優れたワクチンを提供するものであ
る。

〔発明の概要〕

本発明は特に、Ｓ−PRV−155と命名された、遺伝的に
加工され且つ弱毒化されたシュードラビーウイルス（AT
CC受付番号VR2311）を提供する。本発明はまた、有効な
免疫量の遺伝子的に加工され且つ弱毒化されたシュード
ラビーウイルス（Ｓ−PRV−155と命名されたもの）と、
適切なキャリアーとを含有するワクチンを提供する。本
発明は更に、シュードラビーウイルスによって惹起され
る疾患に対して動物を免疫化する方法であって、本発明
のワクチンを有効免疫量を前記動物に投与することを具
備した方法を提供する。最後に本発明は、本発明のワク
チンを接種された動物を、天然に存在する野生型シュー
ドラビーウイルスに感染した動物から区別する方法を提
供する。

〔図面の簡単な説明〕

図1: PRV株ISU S62/26の詳細。特有の長い内部繰り返し領
域、特有の短い領域、および末端リピート領域を示すPR
VゲノムDNA図。酵素BamH I,Xba I,Hind IIIの制限酵素
地図が示されている。サイズを縮小するために、断片を
番号化あるいは記号化してある。特異的な短い領域は、
詳細を示すため拡大してある。幾つかの遺伝子の位置が
示されている：これら遺伝子は、糖蛋白II（gII）（2
4），糖蛋白III（gIII）（23），チミジンキナーゼ（T
K），即時的初期遺伝子（immediate early gen;IE），
プロテインキナーゼ（PK）（３），糖蛋白Ｘ（gpX）
（４），糖蛋白50（g50）（５），糖蛋白63（g63）
（６），糖蛋白Ｉ（gI）（６）である。

図2: 相同ベクター263−58.18におけるDNAの挿入詳細。プ
ラスミド263−58.18を組み立てるDNA断片の方向性を示
す図。各々の断片の起源が表に示されている。断片間の
接合部に位置する配列も示してある。各々の断片を生成
するために使用する制限酵素切断部位、並びに該断片を
接合するために使用する合成リンカー配列が、各々の接
合部について記載されている。合成リンカー配列には太
線で下線が引いてある。また、幾つかの遺伝子コード領
域および調節要素の位置が示されている。次のような簡
略化が用いられている。（）の中の数字は、図１に示し
た参照に対応するアミノ酸を示す。［］中の制限酵素切
断部位は、構築の間に破壊される残余部位を示す。下記
の略号が用いられる：プロテインキナーゼ（PK），糖蛋
白Ｘは（gpx），糖蛋白50は（g50），糖蛋白63（g6
3），シュードラビーウイルス（PRV），ポリアデニレー
ション信号（pA）。

図3: 相同ベクター416−09.2HへのDNA挿入の詳細。プラス
ミド416−09.2Hを組み立てるDNA断片の方向性を示す
図。各々の断片の起源を表に示す。断片間の夫々の接合
部に位置する配列も示してある。各々の断片を生成する
ために使用する制限酵素切断部位、並びに診断片を接合
するために使用する合成リンカー配列が、各々の接合部
について記載されている。合成リンカー配列には太線で
下線を引いてある。幾つかの遺伝子コード領域および調
節要素の位置が示されている。次のような簡略化が用い
られている。（）の中の数字は図１に示した参照に対応
するアミノ酸を示す。［］中の制限酵素切断部位は、構
築の間に破壊される残余部位を示す。下記の略号が用い
られる：プロテインキナーゼ（PK），糖蛋白Ｘ（gp
X），糖蛋白50は（g50），糖蛋白63（g63），シュード
ラビーウイルス（PRV），ポリアデニレーション信号（p
A）。

図4: 相同ベクター436−86.32KへのDNA挿入の詳細。プラス
ミド436−86.3Kを組み立てるDNA断片の方向性を示す
図。表には各々の断片の起源が示されている。断片間の
夫々の接合部に位置する配列も示してある。各々の断片
を生成するために使用する制限酵素切断部位、並びに断
片を接合するために使用する合成リンカー配列が、各々
の接合部について記載されている。合成リンカー配列に
は太線で下線を引いてある。幾つかの遺伝子コード領域
および調節要素の位置が示されている。次の簡略化が用
いられている。（）の中の数字は、図１に示した参照に
対応するアミノ酸を示す。［］中の制限酵素切断部位
は、構築の間に破壊される残余部位を示す。下記の略号
が用いられている：プロテインキナーゼ（PK），糖蛋白
Ｘは（gpX），糖蛋白50（g50），糖蛋白Ｉ（gI），シュ
ードラビーウイルス（PRV），ヒトサイトメガロウイル
ス（HCMV），ポリアデニレーション信号（pA）。

〔発明の詳細な説明〕

本発明はＳ−PRV−155と命名された、遺伝子に加工さ
れ且つ弱毒化されたシュードラビーウイルス（ATCC受付
番号VR2311）を提供する。Ｓ−PRV−155シュードラビー
ウイルスは、特許手続上の微生物の国際的寄託に関する
ブタペスト要約に準じ、ATCC受付番号VR2311の下に、ア
メリカ合衆国メリーランド州ロックウイルパークローン
ドライブ（Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,
U.S.A.）のアメリカンタイプカルチャーコレクションに
寄託されている。本発明はまた、有効な免疫量の遺伝子
的に加工され且つ弱毒化されたシュードラビーウイルス
（Ｓ−PRV−155と命名されたもの）と、適切なキャリア
ーとを含有するワクチンを提供する。該ワクチンは、不
活性化された又は生のシュードラビーウイルスＳ−PRV
−155の何れかを含む。

シュードラビーウイルスの適切なキャリアは当該技術
において周知であり、蛋白、糖等を含む。この様な適切
なキャリアの一例は、安定化され加水分解された蛋白、
ラクトース等のような一以上安定化剤を含有する生理学
的に均衡のとれた培地である。

一般に、本発明のワクチンは有効免疫量（10³〜10⁹PF
U/dose）のＳ−PRV−155ウイルスを含む。好ましくは、
生ワクチンの有効免疫量は約10⁴〜10⁶PFU/dose、不活性
化ワクチンの有効免疫量は約10⁷〜10⁹PFU/doseである。
生ワクチンは、好ましくは組織培養液を採取し、安定化
され加水分解された蛋白等の安定化剤を配合することに
よって製造される。不活性化ワクチンは、ウイルスを不
活性化した直後の組織培養液を直接使用するのが好まし
い。

本発明はまた、シュードラビーウイルスによって惹起
される病気に対して動物、特に豚を免疫化する方法であ
って、本発明のワクチンの有効免疫量を前記動物に投与
することを具備した方法を提供する。ワクチンは、当業
者に周知の方法、例えば筋肉注射、皮下注射、腹腔内注
射、静脈注射等の何れの方法によっても投与できる。或
いは、ワクチンは鼻孔内投与または経口投与され得る。

本発明はまた、本発明のワクチンを接種した動物と天
然に存在する野生型シュードラビーウイルスに感染した
動物とを区別する方法を提供する。この方法は、gpXの
存在および天然に存在する野生型シュードラビーウイル
スに感染した動物中に通常発現する少なくとも一つの他
の抗原の存在について、動物から採取した体液のサンプ
ルを分析することと、該体液中に前記抗原およびgpXが
存在するか否かを決定することとを具備する。体液中に
前記抗原が存在し且つgpXが存在しないことは、その動
物がワクチン接種されたものであり、天然に存在する野
生型シュードラビーウイルスには感染していないことを
示す。体液中における前記抗原およびgpXの存在は、例
えば、体液中において、前記抗原およびgpXに特異的な
抗体を検出することを含む様々な方法で決定され得る。
本発明のワクチンを接種した動物と、天然に存在する野
生型シュードラビーウイルスに感染した動物とを区別す
る方法は、更に、gIの存在についてサンプルを分析する
ことを具備し得る。体液中に前記抗原が存在し且つgIが
存在しないことは、その動物がワクチン接種されたもの
であり、天然に存在する野生型シュードラビーウイルス
には感染していないことを示す。この出願において、天
然に存在するシュードラビーウイルスとは、遺伝子工学
的操作のされていないシュードラビーウイルスを意味
し、その中には野生型シュードラビーウイルスと、天然
に存在し且つ自然の欠失をもったシュードラビーウイル
スから選ばれるシュードラビーウイルスが含まれるが、
これらに限定されるものではない。この出願において、
非必須の遺伝子とは、ウイルスの複製に必要でない遺伝
子を意味する。

本発明はまた、本発明のワクチンを接種した動物と天
然に存在する野生型シュードラビーウイルスに感染した
動物とを区別するもうひとつの方法を提供する。この方
法は、gIの存在および天然に存在する野生型シュードラ
ビーウイルスに感染した動物中に通常発現する少なくと
も一つの他の抗原の存在について、動物から採取した体
液のサンプルを分析することと、該体液中に前記抗原お
よびgIが存在するか否かを決定することとを具備する。
体液中に前記抗原が存在し、gIが存在しないことは、前
記動物がワクチン接種したものであり、天然に存在する
野生型シュードラビーウイルスに感染していないことを
示す。

Ｓ−PRV−155を含むシュードラビーウイルスを構築
し、選別し、精製する方法は、次に述べる「材料および
方法」の項で詳述する。

〔材料および方法〕

シュードラビーウイルス（PRV）のストックサンプルの
調製シュードラビーウイルスのストックサンプルは、2mM
のグルタミン、100単位/mlのペニシリン及び100単位/ml
のストレプトマイシン（これらの成分はIrvine Scienti
fic社または同様の供給業者から入手できる）を含有す
るダルベッコ改良イーグル（Dulbecco´s Modified Eag
le（DME））培地（以後、完全DME培地と呼ぶ）に牛胎児
の血清を１％加えた培地中において、細胞あたり0.01プ
ラーク形成単位（PFU）の感染多重度でベロ（Vero）細
胞に感染させることにより調製される。細胞変性効果が
現れた後、培地および細胞を回収し、細胞を５分間、30
00rpmの臨床遠心分離機で遠心してペレット状にした。
元の体積の1/10の培地中に細胞を再懸濁させ、二回オー
トクレーブ処理したスキムミルク（水中の９％（wgt/vo
l）スキムミルク）を等量加えた。ウイルスサンプルを
二回凍結および解凍し、小分わけし、−70℃で凍結貯蔵
した。力価は、通常10⁸PFU/mlであった。

PRVのタイター測定 PRVのタイター測定のために、ベロ細胞を60mmのペト
リ皿に5x10⁵細胞/ml濃度でプレーティングした。次の日
に、成育培地（完全培地DME＋10％牛胎児血清）を3.0ml
/皿の維持培地（完全培地DME＋１％牛胎児血清）と置換
した。ウイルスストックを維持培地で1:10⁴,10⁵,10⁶,10
⁷,10⁸に希釈した。これらの希釈液の1.0mlを各皿に添加
した。皿は37℃、二酸化炭素５％の湿式インキュベータ
ー中に４時間置かれた。次いで培地を吸引し、夫々の皿
に対して、2mMのグルタミン、100単位/mlのペニシリ
ン、100単位/mlのストレプトマイシン、および２％牛胎
児血清を含有する２×の最低必須培地（MEM）中におい
て、最終濃度0.75％の低温溶融アガロース5.0mlをオー
バーレイした。アガロースを定着させるために皿を30分
室温に放置し、次いで二酸化炭素５％の湿式インキュベ
ーター中に３日間静置した。プラークをカウントし、PF
U/mlを計算した。

PRV・DNAの調製 PRV・DNAを調製するために、25cm²フラスコまたは60m
mペトリ皿内におけるベロ細胞の集密細胞単層に対し
て、培地1ml中のウイルスサンプル100ulを感染させた。
二酸化炭素５％の湿式インキュベーター中に、37℃で１
〜２時間放置して吸着を促進させた。吸着後、4mlの完
全DME培地＋１％牛胎児血清を加えた。一晩インキュベ
ーションした後、または細胞が100％の細胞変性効果を
示したときに、細胞スクレーパー（コースター（coaste
r）プランド）を用いて細胞を培地中に擦り入れた。細
胞および培地を５分間、3000rpmの臨床遠心分離機で遠
心した。培地を捨て、細胞ペレットを0.01M Tris pH7.
5,1mM EDTA及び0.5％ Nonidet P−40（NP40）を含む0.5
ml溶液中にゆっくり再懸濁した。サンプルを室温で10分
インキュベーションした。次いで、RNase A（シグマ）
のストック溶液10ulを添加した（ストックは10mg/ml
で、DNaseを失活させるために10分煮沸した）。サンプ
ルを５分間、3000rpmの臨床遠心分離機で遠心し、核を
ペレット化した。パスツールピペットまたは木製の棒
で、DNAペレットを除去して捨てた。上澄液を、20％ド
デシル硫酸ナトリウム（シグマ社）25ul及び25ulのプロ
テナーゼ−Ｋ（10mg/ml,ベーリンガーマンハイム社）を
含む1.5mlのエペンドルフ管に注いだ。サンプルを掻き
混ぜ、37℃で30〜60分インキュベーションした。同量の
水飽和フェノールを加え、サンプルをボルテックス攪拌
機上で攪拌した。サンプルをエペンドルフ・ミニ遠沈管
に入れ、最高速度で５分間遠心した。上部の水層を新し
いエペンドルフ管に採取し、２倍量の−20℃の無水エタ
ノールを添加し、該エペンドルフ管を−20℃で30分間静
置し、核酸を沈殿させた。エペンドルフ遠心機内におい
て、サンプルを４℃で５分間遠心した。上澄液を捨て、
ペレットを80％冷エタノールで一回洗浄した。17ulの水
でペレットを再水和した。大量のDNAを調製するため
に、手順のスケールアップをはかり、850cm²のローラー
ボトルのベロ細胞から始めた。得られたDNAを、水また
は0.01M Tris pH7.5,1mM EDTA中に４℃で貯蔵した。

フェノール抽出 DNAサンプルのフェノール抽出は任意の量で行われる
が、典型的には、100ulから1mlのDNAサンプルで行われ
る。DNAサンプルを0.01M Tris pH7.5,1mM EDTA中に希釈
し、同量の水飽和フェノールを添加した。サンプルをボ
ルテックス攪拌機上で手短に攪拌し、氷上に３分間静置
した。マイクロ遠心機で３分間遠心した後、水層を新し
い管に採取し、エタノールで沈殿させた。

エタノール沈殿サンプル中のDNAをエタノール沈殿によって濃縮し
た。該DNAサンプルに、1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH
7.5）および３倍量の冷エアノールを添加した。DNAを−
70℃で30分間、あるいは−20℃で一晩で沈殿させ、４℃
で15分間マイクロ遠沈機で遠心してペレット化した。こ
のペレットを200ulの80％冷エタノールで洗浄し、４℃
で10分間、再度ペレット化した。空気乾燥または凍結乾
燥した後、適切な緩衝液または水の中にペレットを再懸
濁させた。

制限酵素消化分解製造業者（IBI,BRL,New England Biolabs等）が推薦
する緩衝液を使用して、DNAを制限酵素で切断した。DNA
の濃度をできるだけ1ug/50ul以下に保った。インキュベ
ーションを37℃で１〜４時間行った。

DNAのアガロースゲル電気泳動 DNAの制限酵素パターンを可視化するために、5ulのロ
ーデイング緩衝液（５×電気泳動緩衝液、0.01％のブロ
ムフェノールブルー、50mM EDTA,50％グリセロール）を
添加した。サンプルを、0.6％〜3.0％のアガロースゲル
を含む水平潜水型電気泳動ユニットのレーンにかけた。
電気泳動緩衝液は、40mM Tris,10mM EDTAを酢酸でpH7.8
に調整し、且つ0.5ug/mlの臭化エチジウムを添加し又は
添加しなかったものである。ゲルを40〜50ボルトで18時
間泳動し、0.5ug/mlの臭化エチジウムで30分間染色し、
長波長UVトランスイルミネーターでDNAバンドを可視化
した。

凍結 DNAを、酵素T4・DNAリガーゼ（BRL）の作用で連結し
た。連結反応物には、0.2〜20ugの様々な量のDNAと、20
mM Tris pH7.5と、10mM MgCl₂と、10mMジチオトレイト
ール（DTT）と、200uM ATPと、20単位のT4・DNAリガー
ゼとが、10〜20ulの最終反応容積中に含まれている。凍
結は、15℃で３〜16時間行なわれた。

DNAのサザンブロテインングサザンブロテイングでは、非放射性のDNAラベリング
と検出キット（ベーリンガーマンハイム社）を用い、製
造業者が推薦する方法に従った。

遺伝子組換ウイルスを創製するためのDNAトランスフェ
クショングラハム（Graham）およびファン・デル・エプ（Van
der Eb）のリン酸カルシウム法（１）を基礎として、次
の改変が加えられた。ウイルスDNAおよび／またはプラ
スミドDNAを、0.01M Tris pH7.5,1mM EDTA中で298ulに
希釈した。2MのCaCl₂40ulを加え、続いて同量の２×HEP
ES食塩緩衝液（10gのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラ
ジンＮ′−２−エタンスルホン酸（HEPES）と、食塩16g
と、0.74gの塩化カリウムと、0.25gのリン酸水素二ナト
リウムと、2gのデキストランとを水１リットルに加え、
水酸化ナトリウムでpHを7.4に緩衝したもの）を加え
た。混合物を氷上で10分間インキュベーションし、60mm
ペトリ皿内の5mlの培地（DME＋２％牛胎児血清）下にお
いて増殖しているベロ細胞の80％集密的単層に滴下し
た。二酸化炭素５％の湿式インキュベーター中で、細胞
を37℃で４時間インキュベーションした。次いで、細胞
を１×PBS（水１リットル当り、1.15gのリン酸水素二ナ
トリウム、0.2gのリン酸二水素カリウム、0.8gの塩化ナ
トリウム、0.2gの塩化カリウム）のアリコート5mlで三
回洗浄し、5mlの培地（DMEプラス２％の牛胎児血清）を
供給した。ウイルスからの細胞変性効果が50〜100％に
なるまで、細胞を上記のように37℃で３〜７日間インキ
ュベーションした。ウイルスストックの調製のために、
上記のようにしてウイルスを回収した。このストックは
トランスフェクションストックと呼ばれ、続いて「組換
PRVのブルオガルスクリーン（BLUOGAL SCREEN」）によ
って組換ウイルスのスクリーニングを行った。

組換PRVを創製するための相同組換法この方法は、PRV・DNAとプラスミド相同ベクターDNA
とをベロ細胞に同時トランスフェクトしたときに、両者
の間に起こる相同組換に基いている。適当なPRVクロー
ン化配列が両側面に配置された外来DNAを含んだ0.1〜1.
0ugのプラスミドDNA（相同ベクター）を、約0.3ugの完
全なPRV・DNAと混合した。このDNAは0.01M Tris pH7.5,
1mM EDTAで298ulに希釈され、「遺伝子組換ウイルスを
創製するためのDNAトランスフェクション」（上記参
照）に準じてベロ細胞にトランスフェクションされる。

遺伝子組換PRVを創製するための直接連結法我々は、相同ベクターを用いて相同的組換により組換
ウイルスを創製するのではなく、直接連結によりPRVを
製造する技術を開発した。この方法では、クローンされ
た外来DNAは、その両側面にPRV・DNAが配置される必要
はなく、プラスミドベクターから外来遺伝子断片を切り
出すために用いる制限酵素消化部位を有することだけが
必要とされる。PRV・DNAを切り出すために、適合した制
限酵素が使用された。この技術で必要とされるのは、PR
V・DNAの消化分解に使用される酵素が限られた切断部位
を有し、少なくとも一箇所の非必須切断部位を有するこ
とである。我々は、PRV・DNAを二箇所で切断するXba I
を使用した。また、我々はPRV・DNAを四箇所で切断する
Hind IIIを使用した。他の方法で予めPRVに導入された
制限酵素部位も使用できる。PRV・DNAを30倍モルの過剰
プラスミドDNAと混合し（通常、プラスミドDNA10ugに対
して5ugのウイルスDNA）、混合物を適切な制限酵素で切
断した。DNA混合物は、制限酵素を除くためにフェノー
ルで抽出され、エタノールで沈殿され、上記に詳述した
連結方法で結合された。次いで、連結されたDNA混合物
は、298ulの0.01M Tris pH7.5,1mM EDTA中に再懸濁さ
れ、「遺伝子組換ウイルスを創製するためのDNAトラン
スフェクション」（上記参照）に準拠してベロ細胞にト
ランスフェクションされた。

直接連結法は、PRVからDNAを欠失させるためにも使用
され得る。適当な制限酵素部位が両側に配置された非必
須DNAは、このような酵素でPRVを消化し、再連結するこ
とによって欠失され得る。直接連結法による組換ウイル
スの生成頻度が十分に高いので、スクリーニングは、ト
ランスフェクションストックからランダムに選んだプラ
ークを制限酵素分析することによって達成され得る。

組換PRVのブロガル（Bluogal）スクリーンニング大腸菌βガラクトシダーゼマーカー遺伝子が組換ウイ
ルスに取り込まれた場合、組換体を含んでいるプラーク
は簡単な分析によって可視化される。プラーク分析の間
に、化学物質Bluogal^TM（Bethesda Research labs）が
アガロースオーバーレイゲルに取り込まれ（200ug/m
l）、活性βガラクトシダーゼを発現したプラークは青
色に変わった。この青色プラークを新鮮なベロ細胞に入
れ、再び青色プラークを単離することで精製した。大腸
菌βガラクトシダーゼマーカー遺伝子を除去する組換ウ
イルス戦略において、分析には、バックグラウンド青色
親プラークから白色プラークを精製することが含まれ
る。何れの場合も、典型的には三回のプラーク精製でウ
イルスは精製される。

欠失ウイルスの構築欠失ウイルスの構築に使用される戦略には、相同組換
および直接連結技術の両方が含まれる。最初に、相同組
換（ここでは欠失されるべき遺伝子が大腸菌βガラクト
シダーゼマーカー遺伝子で置換される）を経てウイルス
が構築された。次に、マーカー遺伝子を欠失させる直接
連結によって、第二のウイルスが構築された。この戦略
においては、「組換PRVを創製するための直接連結方
法」で述べたように、最初のウイルスに導入されたマー
カー遺伝子の両側に、制限酵素部位が配置されていなけ
ればならない。この戦略の利点は、両ウイルスが「組換
PRVのためのブロガル（Bluogal）スクリーン」によって
精製され得ることである。最初のウイルスは、白色のバ
ックグラウンドから青色プラークを選別することで精製
される。第二のウイルスは、青色のバックグラウンドか
ら白色プラークを選別することで精製される。gpXおよ
びgpI遺伝子コード領域を欠失させるために、三つの異
なった相同ベクターが構築された。これら相同ベクター
の詳細を次に述べる。

相同ベクター263−58.18 プラスミド263−58.18は、シュードラビーウイルスか
らgpX遺伝子コード領域を欠失させる目的で構築され
た。それは、両側にPRV・DNAが配置された大腸菌βガラ
クトシダーゼマーカー遺伝子を含んでいる。該マーカー
遺伝子の上流は、gpX初期転写生成物の最初の７アミノ
酸（４）をコードする配列で終端する約1330塩基対のPR
V・DNA断片である。前記マーカー遺伝子の下流は、gpX
初期転写生成物の最後の19のアミノ酸（４）をコードす
る配列で始まる約1800塩基対のPRV・DNA断片である。
「組換PRVを創製するための相同組換法」に準拠してこ
のプラスミドを使用すると、gpX初期転写生成物のアミ
ノ酸８〜479をコードするDNAが、マーカー遺伝子をコー
ドするDNAに置換される。なお、βガラクトシダーゼ（l
acz）マーカー遺伝子は、内因性gpXプロモータの制御下
にくることに留意されたい。該プラスミドの詳細を図２
に示す。該プラスミドは、標準組換DNAテクニック
（２）を利用して、示されたDNA源から構築された。該
プラスミドは、図２にあげた合成DNA配列と下記供給源
からの制限酵素断片とを接合することによって構築され
得る。このプラスミドベクターは、pSP65（プロメガ
社）のSma IからPvu IIまでの制限酵素断片（約2792塩
基対）に由来する。断片１は、PRV BamH I制限酵素断片
＃10（15）のEcoR VからSal Iまでの制限酵素断片（約9
22塩基対）である。断片２は、PRV BamH I制限酵素断片
＃10（15）のSal IからBamH Iまでの制限酵素断片（約4
12塩基対）である。断片３は、プラスミドpJF751（11）
のBamH IからBal Iまでの制限酵素断片（約3347塩基
対）である。断片４は、PVR BamH I制限酵素断片＃７
（15）に由来するNde IからStu Iまでの制限酵素断片
（約1803塩基対）である。接合部Ｂおよび接合部Ｄに位
置するXba I部位は該プラスミドの唯一のXba I部位であ
り、マーカー遺伝子をXba I制限酵素断片として切り出
すことができることに注意されたい。

相同ベクター416−09.2H プラスミド416−09.2Hは、シュードラビーウイルスか
らgI遺伝子コード領域を欠失させる目的で構築された。
それは両側にPRV・DNAが配置された大腸菌βガラクトシ
ダーゼマーカー遺伝子を含んでいる。そのマーカー遺伝
子の上流は、gI初期転写生成物の最初のアミノ酸（６）
の約46塩基対上流に位置する配列で終端する、約1884塩
基対のPRV・DNA断片である。そのマーカー遺伝子の下流
は、gI初期転写生成物の最後の105のアミノ酸（６）を
コードする配列で始まる、約1309塩基対のPRV・DNA断片
である。「組換PRVを創製するための相同組換方法」に
準拠してこのプラスミドを使用すると、gI初期転写生成
物のアミノ酸１〜472をコードするDNAが、マーカー遺伝
子をコードするDNAに置換される。βガラクトシダーゼ
（lacZ）マーカー遺伝子は、gpXプロモータの制御下に
くることに注意されたい。該プラスミドの詳細を図３に
示す。該プラスミドは、標準組換DNA技術（２）を利用
して、示されたDNA源から構築された。該プラスミド
は、図３に示した合成DNA配列と下記供給源からの制限
酵素断片とを接合することによって構築され得る。この
プラスミドベクターは、pSP19（プロメガ社）のSma Iか
らBamH Iまでの制限酵素断片（約3009塩基対）に由来す
る。断片１は、PRV BamH I制限酵素断片＃７（15）のHi
nc IIからDra Iまでの制限酵素断片（約1884塩基対）で
ある。断片２は、PRV BamH I制限酵素断片＃10（15）の
Sal IからBamH Iまでの制限酵素断片（約412塩基対）で
ある。また断片３は、プラスミドpJF751（11）のBamH I
からBal Iまでの制限酵素断片（約3347塩基対）であ
る。断片４は、PVR BamH I制限酵素断片＃７（15）に由
来するSph IからBamH Iまでの制限酵素断片（約1309塩
基対）である。接合部Ｂおよび接合部Ｄに位置するXba
I部位は該プラスミドの唯一のXba I部位であり、マーカ
ー遺伝子をXba I制限酵素断片として切り出すことがで
きることに注意されたい。

相同ベクター436−86.32K プラスミド436−86.32Kは、シュードラビーウイルス
からgpX遺伝子コード領域を欠失させる目的で構築され
た。それは、RPV・DNAが両側に配置された、HCMCで即時
的初期促進された大腸菌βガラクトシダーゼマーカー遺
伝子を含んでいる。そのマーカー遺伝子の上流は、gpX
初期転写生成物の最初の７アミノ酸（４）をコードする
配列で終わる約1330塩基対のPRV・DNA断片である。その
マーカー遺伝子の下流は、gpX初期転写物の最後の19ア
ミノ酸（４）をコードする配列で始ま約1800塩基対のPR
V・DNA断片である。「組換PRVを創製するための相同組
換法」に準拠してこのプラスミドを使用用すると、gpX
初期転写生成物のアミノ酸８〜479をコードするDNAが、
マーカー遺伝子をコードすDNAで置換される。該プラス
ミドの詳細を図４に示す。該プラスミドは、標準組換DN
A技術（２）を利用して、示されたDNA源から構築され
た。該プラスミドは、図４に示した合成DNA配列と下記
供給源からの制限酵素断片とを接合することによって構
築され得る。プラスミドベクターは、pSP65（プロメガ
社）のSma IからPvu IIまでの制限酵素断片（約2792塩
基対）に由来する。断片１は、PRV BamH I制限酵素断片
＃10（15）のEcoR VからBamH Iまでの制限酵素断片（約
1336塩基対）である。断片２は、HCMV Xba I制限酵素断
片Ｅ（12）のPst IからAva IIまでの制限酵素断片（約1
191塩基対）である。断片３は、プラスミドpJF751（1
1）のBamH IからPvu IIまでの制限酵素断片（約3002塩
基対）である。なお、該断片は二つの内部Pvu II部位を
含み、部分的なPvu II消化を必要とする。或いは、この
断片は部分的な消化を必要とせずに、二つの断片として
得てもよい。これらの二つの断片は、BamH IからNde I
までの断片（約2950塩基対）と、Nde IからPvu IIまで
の断片（約55塩基対）である。特有のNde I部位で接合
されたこれら二つの断片は、断片３と置換可能である。
断片４は、PVR BamH I制限酵素断片＃７（15）から得た
Nde IからStu Iまでの制限酵素断片（約1803塩基対）で
ある。接合部Ｂおよび接合部位Ｄに位置するXba I部位
は該プラスミドの唯一のXba I部位であり、マーカー遺
伝子をXba I制限酵素断片として切り出すことができる
ことに注意されたい。

豚におけるワクチン接種の研究シュードラビーウイルスに感染していない豚群の雌に
生まれた日齢３日の豚を使用して、弱毒化された生ウイ
ルスの有効性をテストした。10³〜10⁵プラーク形成ユニ
ット（PFU）を含むウイルス液1mlを子豚に筋肉内注射し
た。

PRV−155ウイルスもまた、不活性化ワクチンとしてテ
ストした。該ウイルスは、二成分系エチレンイミンに37
℃で少なくとも40時間さらして不活性化された。不活性
化ウイルス液をオイルベースアジュバントと混合して、
週齢４週間の豚に接種した。

生Ｓ−PRV−155または不活性化Ｓ−PRV−155の何れか
を接種した動物は、不利な反応（PRVの臨床的徴候）が
でないかどうかについて、接種後毎日観察された。生Ｓ
−PRV−155を接種した豚の鼻孔からの分泌を採取し、ワ
クチンウイルスが他の動物に感染したり広がったりする
能力があるか否かを確認するために培養された。PRV血
清抗体量を測定することによって、また接種後３〜４週
間のワクチン接種した豚に感染力を持つウイルスを抗原
投与することによって免疫性を決定した。後者の場合に
は、ワクチン接種した動物とワクチン接種していない動
物群とに、感染性PRVの肺炎性菌株（pneumotropic stra
in;VDL4892）を、ワクチン接種していない豚の群の少な
くとも80％にPRV疾患を惹起させる抗原投与量で接種し
た。抗原投与された動物は、病気の徴候および鼻孔ウイ
ルスの脱粒性について毎日観察された。血清サンプルは
抗原投与時、並びに接種後２〜３週間の間は一週毎に採
取した。血清は、血清中和（SN）抗体について試験さ
れ、またgpX（HerdChek^R,IDEXX Corp.）およびgpIに対
する抗体（HerdChek^R,IDEXX Corp.ClinEase,SmithKline
Beecham）についても製造業者の推薦に従って試験され
た。

〔実施例〕

例１Ｓ−PRV−150 Ｓ−PRV−150は、特有の長配列領域のTK遺伝子におけ
る欠失と、繰り返し領域における欠失と、gIコード領域
における1460塩基対の欠失と、gpXコード領域における1
825塩基対の欠失とを有するシュードラビーウイルスで
ある。大腸菌βガラクトシダーゼの遺伝子（lacZ遺伝
子）がgpI遺伝子の代わりに挿入され、HCMVの即時的初
期プロモータの制御下に置かれている。

Ｓ−PRV−150は、Ｓ−PRV−002から三つの中間ウイル
スの構築を経て誘導された（米国特許4,877,737号、198
9年10月31日発行）。最初の中間ウイルスはＳ−PRV−07
0である。このウイルスにおいては、次工程で他の位置
あるXba I制限酵素部位を使用できるように、繰り返し
領域（図１参照）にあるXba I部位がEcoR I部位に変換
された。これは、「組換PRVを創製するための直接連結
法」を利用して、合成オリゴヌクレオチドCTAGGAATTCC
をＳ−PRV−002のXba I部位に挿入することによって達
成された。第二の中間ウイルスＳ−PRV−089において
は、gpX欠失が、βガラクトシダーゼマーカー遺伝子に
沿って導入された。これは、相同ベクター263−58.18
（「材料および方法」参照）と、「組換PRVを創製する
ための相同組換法」におけるＳ−PRV−070を利用して達
成された。第三の中間ウイルス（Ｓ−PRV−112）におい
ては、βガラクトシダーゼマーカー遺伝子（lacZ）が、
「組換PRVを創製するための直接連結法」に記載されて
いるようにしてXba Iで消化することにより除去され
た。最後に、相同ベクター416−09.2H（「材料および方
法」参照）と、「組換PRVを創製するための相同組換
法」におけるウイルスＳ−PRV−153を使用して、Ｓ−PR
V−150が創製される。Ｓ−PRV−150の構造はBamH Iおよ
びXba Iによる制限酵素分析によって確認された。

例２Ｓ−PRV−151 Ｓ−PRV−151は、特有の長配列領域のTK遺伝子におけ
る欠失と、繰り返し領域における欠失と、gIコード領域
における1460塩基対の欠失と、gpXコード領域における1
825塩基対の欠失とを有するシュードラビーウイルスで
ある。

Ｓ−PRV−151は、Ｓ−PRV−150（上記参照）からマー
カー遺伝子を除去したものである。これは、「組換PRV
を創製するための直接連結方法」に記載されているよう
に、Xba IによるＳ−PRV−150の消化によって達成され
る。Ｓ−PRV−151の構造は、BamH IおよびXba Iによる
制限酵素分析で確認された。

Ｓ−PRV−151がシュードラビーウイルス病から豚を守
るワクチンとして使用可能か否かを決定するために、次
の実験が行われた。この研究においては、次のような筋
肉注射により、日齢３日の子豚にＳ−PRV−151を接種し
た:4匹を10⁴PFUで、また４匹を10⁶で接種した。この研
究では５匹の対照グループも含めた。これら動物は、
「豚におけるワクチン接種の研究」に記載したようにし
て観察され、次いで抗原投与が行なわれた（下表Ｉ参
照）。

本実験において、ワクチン接種動物はすべて接種後も
健康であった。また、扁桃腺分泌物中へのワクチンウイ
ルスの放出はなかった。しかし、中和抗体は検出されな
かった。感染性ウイルスに抗原投与した後、両グループ
のワクチン接種動物はすべてPRV病の臨床的徴候を現し
た。Ｓ−PRV−151は日齢３日の子豚では安全であった
が、このウイルスはこれら動物における防御性を立証で
きなかった。

例３Ｓ−PRV−154 Ｓ−PRV−154は、特有の長配列領域のTK遺伝子におけ
る欠失と、繰り返し領域における欠失と、gIコード領域
における1460塩基対の欠失と、gpXコード領域における1
414塩基対の欠失とを有するシュードラビーウイルスで
ある。大腸菌βガラクトシダーゼの遺伝子（lacZ遺伝
子）がgpX遺伝子の代わりに挿入され、HCMVの即時的初
期プロモータの制御下に置かれている。

Ｓ−PRV−154は、Ｓ−PRV−002から三つの中間ウイル
スの構築を経て誘導された（米国特許4,877,737号、198
9年10月31日発行）。最初の中間ウイルスはＳ−PRV−07
0である。このウイルスにおいては、次工程で他の位置
にあるXba I制限酵素部位を使用できるように、繰り返
し領域（図１参照）にあるXba I部位がEcoR I部位に変
換され。これは、「組換PRVを創製するための直接連結
法」を利用して、合成オリゴヌクレオチドCTAGGAATTCC
をＳ−PRV−002のXba I部位に挿入することによって達
成された。第二の中間ウイルスＳ−PRV−146では、gI欠
失が、βガラクトシダーゼマーカー遺伝子に沿って導入
された。これは、相同ベクター416−09.2H（「材料およ
び方法」参照）と、「組換PRVを創製するための相同組
換法」におけるＳ−PRV−070を利用して達成された。第
三の中間ウイルス（Ｓ−PRV−153）では、βガラクトシ
ダーゼマーカー遺伝子（lacZ）が、「組換PRVを創製す
るための直接連結法」に記載されているようにしてXba
Iで消化することにより除去された。最後に、相同ベク
ター436−86.32K（「材料および方法」参照）と、「組
換PRVを創製するための相同組換法」におけるウイルス
Ｓ−PRV−153を使用して、Ｓ−PRV−154が生成された。
Ｓ−PRV−154の構造はBamH IとXba Iによる制限酵素分
析で確認された。

例４Ｓ−PRV−155 Ｓ−PRV−155は、特有の長配列領域のTK遺伝子におけ
る欠失と、繰り返し領域における欠失と、gIコード領域
における1460塩基対の欠失と、gpXコード領域における1
414塩基対の欠失とを有すうシュードラビーウイルスで
ある。

Ｓ−PRV−155シュードラビーウイルスは、特許手続き
のため微生物の国際的寄託に関するブタペスト条約に準
じて、ATCC受付番号VR2311の下に、Parklawn Drive,Roc
kville,Maryland 20852,U.S.A.のアメリアンタイプカル
チャーコレクションの特許カルチャー寄託部に寄託され
ている。

Ｓ−PRV−155は、Ｓ−PRV−154（上記参照）からマー
カー遺伝子を除去したものである。これは、「組換PRV
を創製するための直接連結法」に記載されているように
して、Xba IによるＳ−PRV−155の消化によって達成さ
れる。Ｓ−PRV−154の構造はBamH I及びXba Iによる制
限酵素分析で確認された。gpXおよびgIの欠失は、各々
の遺伝子のコード領域に対するプローブを用いたサザン
ブロット分析によって確認された。

下記の実験は、Ｓ−PRV−155がシュードラビーウイル
ス病から豚を防御するためのワクチンとして有用である
こと、並びに野生型感染から区別され得る免疫反応を生
じることを示している。

この研究においては、次のような筋肉注射により、日
齢３日の子豚をにＳ−PRV−155を接種した。６匹に10³P
FU、８匹に10⁵PFU、20匹に10^3.5PFUのウイルスを夫々接
種した。夫々が５匹からなる二つの対照グループを含め
た。これら動物は、「豚におけるワクチン接種の研究」
に記載したようにして観察され、次いで抗原投与が行な
われた（下表II参照）。

本実験において、ワクチン接種動物はすべて接種後も
健康であった。PRVに対する血清中和抗体を生成し、ま
た扁桃腺の分泌物中へワクチンウイルスを放出しなかっ
た。感染性ウイルスを抗原投与した後は、三つのグルー
プのワクチン接種動物はすべてPRV病に罹患しなかった
が、対照グループでは、一つのグループで80％の死亡率
であったことを含め、対照グループの全動物がPRV病の
臨床的徴候を示した。

ワクチン接種および病原投与された動物から採取した
血清サンプルを、gX HerdChekテスト、gI HerdChekテス
トおよびClinEaseテストで分析した。予想したように、
Ｓ−PRV−155を接種した豚は、抗原投与試験まではpgX
およびgIについて血清的に陰性（sero−negative）であ
った。野生型ウイルスを抗原投与したとき、ワクチン接
種動物はシュードラビーウイルス病からワクチン接種に
より防御された。しかし、ワクチン接種動物は抗原株に
より無症状的に重感染しており、従って、誘発時にgpX
およびgIに対する抗体を産生したと考えられる。

表IIに示すように、Ｓ−PRV−155を接種した豚は、野
生型ウイルスによる抗原投与後までは、gpXおよびgIに
ついて血清的に陰性であった。抗原投与の14日後まで
に、接種動物ではgpXおよびgIについて血清的反転（ser
oconversion）が始まった。これらの結果は、Ｓ−PRV−
155が有効なワクチン株であり、これによって、野生型
ウイルスに感染した動物から簡単な血清診断試験により
区別できるワクチン接種が可能となることを示してい
る。

例５下記の実験は、不活性化Ｓ−PRV−155がシュードラビ
ーウイルスから豚を防御するワクチンとして使用でき、
野生型感染から区別できる免疫反応を生じることを示し
ている。５匹の若い血清的に陰性の豚を、「豚における
ワクチン接種の研究」に記載したようにして、不活性化
Ｓ−PRV−155ワクチンで一回接種を行った。不活性化Ｓ
−PRV−155ワクチンは10^7.3PFU/投与のウイルス濃度で
あった（下表III参照）。

ワクチン接種された動物は、接種に引き続いてPRV対
する血清中和抗体を産生したが、pgXおよびgIに対する
中和抗体は産生しなかった。感染性ウイルスを抗原投与
した後、一匹のワクチン接種動物が一日だけ共調運動不
能を示した。ワクチン接種していない５匹の対照は全
て、重度の中枢神経系徴候またはシュードラビーウイル
ス病を発現した。抗原投与の少なくとも21日後に、ワク
チン接種動物は片方あるいは両方の診断抗原に関して血
清的に反転された。これらの結果は、Ｓ−PRV−155が不
活性化ワクチンとしてシュードラビーウイルス病から豚
を防御し、感染動物の免疫反応とは区別できる免疫反応
を生じることが分かる。

例６Ｓ−PRV−158 Ｓ−PRV−158は、特有の長配列領域のTK遺伝子におけ
る欠失と、繰り返し領域における欠失と、gIコード領域
における1460塩基対の欠失と、gpXコード領域における1
414塩基対の欠失とを有するシュードラビーウイルスで
ある。大腸菌βガラクトシダーゼの遺伝子（lacZ遺伝
子）がgpI遺伝子の代わりに挿入され、HCMVの即時的初
期プロモータの制御下に置かれている。

Ｓ−PRV−158は、Ｓ−PRV−000（PRV株ISU S62/26）
から二つの中間ウイルスを経て誘導された。最初の中間
ウイルスはＳ−PRV−156である。この最初の中間ウイル
スＳ−PRV−156においては、gI欠失が、βガラクトシダ
ーゼマーカー遺伝子（lacZ）に沿って導入された。これ
は、相同ベクター436−86.3K（「材料および方法」参
照）と、「組換PRVを創製するための相同組換法」にお
けるＳ−PRV−070を利用して達成された。第二の中間ウ
イルス（Ｓ−PRV−157）においては、βガラクトシダー
ゼマーカー遺伝子（lacZ）を、「組換PRVを創製するた
めの直接連結方法」に記載されているようにして、Xba
Iで消化することにより除去した。最後に、相同ベクタ
ー416−09.2H（「材料および方法」参照）と、「組換PR
Vを創製するための相同組換法」におけるウイルスＳ−P
RV−153とを使用してＳ−PRV−158が創製された。Ｓ−P
RV−158の構造は、BamH IおよびXba Iによる制限酵素分
析で確認された。

例７Ｓ−PRV−159 Ｓ−PRV−159は、特有の長配列領域のTK遺伝子におけ
る欠失と、繰り返し領域における欠失と、gIコード領域
における1460塩基対の欠失と、gpXコード領域における1
414塩基対の欠失とを有するシュードラビーウイルスで
ある。

Ｓ−PRV−159は、Ｓ−PRV−158（上記参照）からマー
カー遺伝子を除去したものである。これは、「組換PRV
を創製するための直接連結法」に記載したように、Xba
IでＳ−PRV−158をの消化することによって達成され
た。Ｓ−PRV−159の構造は、BamH IおよびXba Iによる
制限酵素分析で確認された。

〔実施例の要約〕

本発明は、動物を病気から守るために、遺伝子的に加
工されたヘルペスウイルス類を使用することを包含す
る。これらのウイルス類は、二つの糖蛋白（gpXおよびg
I）の欠失を有している。表IVには、上記で述べた６種
類の欠失ウイルスの特徴を要約してある。ウイルスの力
価は「PRVの力価」に準拠して決定した。安全性有効性
のデータは「豚におけるワクチン接種の研究」に準拠し
て得た。

６種類の全ての欠失ウイルスは、gpXおよびgIの欠失
を有している。Ｓ−PRV−150およびＳ−PRV−151におけ
るgpX欠失領域は、他のウイルスにおけるgpX欠失領域よ
り大きい。ウイルスＳ−PRV−150、Ｓ−PRV−151、Ｓ−
PRV−154及びＳ−PRV−155もまた、TK領域および繰り返
し領域に欠失を有する。大腸菌βガラクトシダーゼ（la
cZ）マーカー遺伝子が、Ｓ−PRV−150、Ｓ−PRV−154及
びＳ−PRV−158に存在する。

これらの分析から、gpXおよびgIマーカーを含む特異
的ワクチンの有効性にとって、欠失の正確な大きさおよ
び組み合わせが重要であることは明らかである。Ｓ−PR
V−150及びＳ−PRV−151は、顕著に低下したウイルス力
価を示す。細胞培養で成育するためのウイルス力価は、
ワクチンの製造に重要である。Ｓ−PRV−150及びＳ−PR
V−151の低力価は、これらをワクチンとして製造するこ
とをコスト的に不可能にするであろう。Ｓ−PRV−155と
Ｓ−PRV−151とでは、PRV病から豚を防御する能力が著
しく異なる。Ｓ−PRV−155は完全な防御性を与えるのに
対して、Ｓ−PRV−151は満足できるレベルの防御性を与
えない。Ｓ−PRV−155に存在する欠失の組み合わせは、
この株を優れたワクチン製品とする要因である。この製
品は、日齢３日の小豚に対する安全性、全年齢の豚に対
する防御性、および一つまたは二つの診断マーカーを用
いた血清学的差別性を与える。当該技術の現状に基づい
ては、欠失のこの組み合わせの優れた有用性は予期し得
ないものであった。これらの結果は新規であり、予測不
可能であり、優れたシュードラビーウイルスワクチン製
品の選択において有用である。

参照文献 1. F.L.Graham and A.Van der Eb.,Virology 52,556−
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1986. 24. A.K.Robbins,et al.,J.of Virology 61,2691−270
1,1987. 25. L.E.Post,et al.,J.Reprod.Fert.Suppl.41,97−10
4,1990.

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 7/00 A61K 39/245 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｓ−PRV−155と命名された、特有の長配列
領域のTK遺伝子における欠失、繰り返し領域における欠
失、gIコード領域における1460塩基対の欠失、およびgp
Xコード領域における1414塩基対の欠失を有する弱毒化
されたシュードラビーウイルス（ATCC寄託番号VR231
1）。
【請求項２】有効免疫量の請求の範囲第１項に記載の弱
毒化ウイルスと、適切なキャリアーとを含有するワクチ
ン。
【請求項３】請求の範囲第２項に記載のワクチンであっ
て、前記弱毒化ウイルスが不活性化されているワクチ
ン。
【請求項４】請求の範囲第２項に記載のワクチンであっ
て、前記弱毒化ウイルスが生であるワクチン。
【請求項５】請求の範囲第２項に記載のワクチンであっ
て、前記キャリアーが、安定化剤を含有する生理学的に
均衡のとれた培地であるワクチン。
【請求項６】請求の範囲第２項に記載のワクチンであっ
て、前記有効免疫量が10³〜10⁹PFU/doseであるワクチ
ン。
【請求項７】請求の範囲第６項に記載のワクチンであっ
て、前記有効免疫量が10⁴〜10⁶PFU/doseであるワクチ
ン。
【請求項８】請求の範囲第６項に記載のワクチンであっ
て、前記有効免疫量が10⁷〜10⁹PFU/doseであるワクチ
ン。
【請求項９】シュードラビーウイルスによって惹起され
る病気に対してヒト以外の動物を免疫化する方法であっ
て、有効免疫投与量の請求の範囲第２項に記載のワクチ
ンを、前記ヒト以外の動物に投与することを具備した方
法。
【請求項１０】請求の範囲第９項に記載の方法であっ
て、前記動物が豚である方法。
【請求項１１】請求の範囲第９項に記載の方法であっ
て、前記ワクチンが筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射
または静脈内注射によって投与される方法。
【請求項１２】請求の範囲第９項に記載の方法であっ
て、前記ワクチンが鼻孔内投与される方法。
【請求項１３】請求の範囲第９項に記載の方法であっ
て、前記ワクチンが経口投与される方法。
【請求項１４】請求の範囲第２項のワクチンを接種した
ヒト以外の動物を、天然に存在する野生型シュードラビ
ーウイルスに感染したヒト以外の動物から区別する方法
であって、gpXの存在および天然の野生型シュードラビ
ーウイルスに感染した前記動物中に通常発現する少なく
とも一つの他の抗原の存在について、前記動物から採取
した体液のサンプルを分析することと、該体液中に前記
抗原およびgpXが存在するか否かを決定することとを具
備し、体液中に前記抗原が存在し且つgpXが存在しない
ことによって、その動物がワクチン接種されたものであ
り、天然の野生型シュードラビーウイルスには感染して
いないことが示される方法。
【請求項１５】請求の範囲第14項に記載の方法であっ
て、前記体液中における前記抗原およびgpXの存在が、
体液中において、前記抗原およびgpXに対して特異的な
抗体を検出することによって決定される方法。
【請求項１６】請求の範囲第14項に記載の方法であっ
て、更に、gIの存在についてサンプルを分析することを
具備し、体液中に前記抗原が存在し且つgIが存在しない
ことによって、その動物がワクチン接種されたものであ
り、天然の野生型シュードラビーウイルスには感染して
いないことが示される方法。
【請求項１７】請求の範囲第２項のワクチンを接種した
ヒト以外の動物を、天然に存在する野生型シュードラビ
ーウイルスに感染したヒト以外の動物から区別する方法
であって、gIの存在および天然の野生型シュードラビー
ウイルスに感染した動物中に通常発現する少なくとも一
つの他の抗原の存在について、前記動物から採取した体
液のサンプルを分析することと、該体液中に前記抗原お
よびgIが存在するか否かを決定することとを具備し、体
液中に前記抗原が存在し且つgIが存在しないことによっ
て、その動物がワクチン接種したものであり、天然の野
生型シュードラビーウイルスには感染していないことが
示される方法。