HUT67138A - Attenvated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof - Google Patents
Attenvated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- HUT67138A HUT67138A HU9302369A HU9302369A HUT67138A HU T67138 A HUT67138 A HU T67138A HU 9302369 A HU9302369 A HU 9302369A HU 9302369 A HU9302369 A HU 9302369A HU T67138 A HUT67138 A HU T67138A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- prv
- virus
- vaccine
- animal
- gpx
- Prior art date
Links
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 title abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 87
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 72
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 72
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 167
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 58
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 20
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 12
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 claims description 7
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 claims description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 3
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 claims 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 72
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 71
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 49
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 49
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 37
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 21
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 21
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 19
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 16
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 16
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 10
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710181600 Glycoprotein gp2 Proteins 0.000 description 5
- 101150087500 Gpl gene Proteins 0.000 description 5
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 244000309466 calf Species 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(5-bromo-1h-indol-3-yl)oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C=C12 LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 4
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 101150015940 gL gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101000942694 Bos taurus Clusterin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical class C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 206010022524 Intentional self-injury Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000220304 Prunus dulcis Species 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 208000005560 Self Mutilation Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002809 confirmatory assay Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/815—Viral vaccine for porcine species, e.g. swine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
A találmány tárgyát élő vírus-vakcinában alkalmazható, sertésekben álveszettség megbetegedés ellen védettséget létrehozó legyengített álveszettség vírus képezi. A találmány kiterjed az említett vírus olyan alkalmazására, amely lehetővé teszi a vírussal vakcinázott és a vad-típusú álveszettség vírussal fertőzött állatok megkülönböztetését.
Vírus DNS izolálására és ennek az izolált DNS-nek bakteriális plazmidokba való klónozására szolgáló eljárások nagymértékben kibővítették a vírus vakcinák készítésének rendelkezésre álló lehetőségeit. A találmány szerinti megoldás klónozott vírus DNS szekvenciák inszertálásokkal, deléciókkal és egyszeri vagy többszörös báziscserékkel való módosítását foglalja magába. A módosított DNS ezután újból a vírusgenomba inszertálható abból a célból, hogy a vírus kórokozó képességét elveszítse. Az így kapott élő vírust ezután vakcinában alkalmazhatjuk a gazdaállatban immunválasz kiváltására, valamint az állatban az adott megbetegedés ellen védettség létrehozására.
A találmány szerinti megoldásnál alkalmazhatók például az állati vírusok egy csoportját alkotó Herpetoviridae vagy herpeszvírusok. Ezek a vírusok genetikai anyagként 100 000-200 000 bázispárból álló DNS-t tartalmaznak. Lényeges, hogy genomjukban néhány olyan régiót azonosítottak, amelyek in vitro sejttenyészetben nélkülözhetőek a vírus replikációjához. Az ezekben a régiókban található DNS módosítása csökkentheti a vírus kórokozó képességét, vagyis legyengítheti a vírust. A timidin-kináz gén inaktiválása következtében például a humán Herpes simplex vírus (13) és a sertés álveszettség vírus. (14) elveszti kórokozó képességét.
Az ismétlődő régió eltávolítása következtében a humán Herpes simplex vírus elveszti kórokozó képességét (16, 17). A Marék-féle betegség vírusában izoláltak egy ismétlődő régiöt, amely vírus okozta daganatképzéssel kapcsolatos (18). A saimiri herpeszvírus egy szakasza hasonlóképpen kapcsolatba hozható daganatképzéssel (19). Az ismétlődő régió egy részének eltávolítása az álveszettség vírus kórokozó tulajdonságának elvesztéséhez vezet (4 877 737 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, bejelentés: 1989 október 31.). Egyes természetben előforduló vakcina törzsekben kimutatták, hogy az álveszettség vírus egy szakasza a deletálódott (7, 15), és azt találták, hogy ezek a deléciók legalább részben felelőssé tehetők ezen törzsek kórokozó képességének elvesztéséért.
Általában elfogadott az a nézet, hogy a herpeszvírusok a genom különböző részein tartalmaznak nem létfontosságú (nonessential) DNS régiókat és ezen régiók módosítása legyengített vírust eredményezhet, ily módon vakcina készítésére alkalmas, kórokozó képességüket elvesztett törzseket kaphatunk. A vírus legyengítettségének mértéke lényeges a vírus vakcinaként való alkalmazhatóságának szempontjából. Túlságosan legyengített vírust eredményező deléciók olyan vakcinához vezetnek, amely nem vált ki megfelelő immunválaszt. Ismeretes ugyan néhány olyan deléció, amely legyengített vírust hoz létre, a deléciók célravezető kombinációja azonban nem könnyen tekinthető át.
Az álveszettség vírus természetes gazdaszervezete a sertés, amelyben a fertőzés rendszerint nem szembetűnő, de láz, görcsök és bénulás is jellemezheti. Az álveszettség vírus megfertőzi a szarvasmarhát, birkát kutyát, macskát, rókát, valamint a nyércet is, amelyekben a fertőzés rendszerint a gazdaállat pusztulásához vezet. Az álveszettség vírus fertőzés fő látható tünete a heves viszketés, amely általában a gazdaállat érintett részének öncsonkítását eredményezi. Az agyvelőgyulladás tünetei, heves izgatottság, görcsrohamok és bénulás előzik meg a pusztulást, amely a klinikai tünetek felléptét követő néhány napon belül bekövetkezik.
A sertés álveszettség vírus által okozott betegség a közigazgatási hatóságok komoly gondját képezi világszerte. Az Amerikai Egyesült Államokban fertőzött állományból származó sertés csak vágóhidaknak adható el. Az amerikai egyesült államokbeli Mezőgazdasági Minisztérium az álveszettség felszámolására egy mentesítési programot dolgozott ki. A fajlagos megkülönböztető vakcinák és azokat kísérő diagnosztikai vizsgáló módszerek kifejlesztését megelőzően minden álveszettség ellen vakcinázott állatot fertőzöttként kezeltek, és azokkal azonos szabályozó korlátozásoknak vetettek alá. A megkülönböztető vakcinák megjelenésével a rendelkezéseket úgy módosították, hogy lehetővé vált a vakcinázott, nem fertőzött sertések államok közötti szállítása, feltéve, hogy a megkülönböztető vakcina és a diagnosztikai vizsgáló módszer kombinációját a Szövetségi Álveszettség Mentesítési Együttműködési Program [Cooperative State-Federal Pseudorabies Eradication Program, Federal Register, 55. kötet, No. 90, 19245-19253 (1990, május 9.)] alkalmazhatónak ítélte.
• « ·
- 5 A megkülönböztető vakcinák előállítására tett próbálkozások az álveszettség vírus (PRV) valamelyik glükoprötéinjenek deléciójára összpontosítottak. Elméletileg a diagnosztikai markerként kiválasztott glükoproteinnek a következő sajátságokkal kell rendelkeznie: (1) a glükoprotein és az azt kódoló gén ne legyen létfontosságú a fertőző vírus termelődéséhez; (2) a glükoprotein erős és hosszantartó választ váltson ki az állatban; (3) a glükoprotein ne járuljon hozzá a védettséget létrehozó immunválasz kialakulásához. Három glükoprotein, a gD, a gH és a gB(II) (25) nem felelnek meg az első szempontnak. Mindegyiknek van egy olyan megfelelője a Herpes simplex vírusban (HSV), amely létfontosságúnak bizonyult (20). A g63 egy kis mennyiségben jelenlevő glükoprotein, amelytől nem várható erős szerológiai válasz kiváltása (8) . A glll glükoproteinről kimutatták, hogy a neutralizáló ellenanyagok (10) és a sejt közvetítette immunválasz (21) célpontjaként jelentősen hozzájárul a védettséget létrehozó immunitás kialakulásához. A gl ugyancsak neutralizáló ellenanyagok célpontja (22), és valószínűleg szerepet játszik a védettséget létrehozó immunitás kialakulásában. Csupán a gpX felel meg mindhárom elméleti szempontnak (25) .
Jelenleg öt USDA által engedélyezett, módosított élő megkülönböztető PRV vakcina áll rendelkezésre. Ezek a PRV/Marker (SyntroVet Incorporated), a Tolvid (Upjohn), a PRV vakcina (Boehringer Ingelheim), a PRVac (SmithKline Beecham Animál Health) és az OmniMark (Fermenta Animál Health) vakcinák. A fenti vakcinák mindegyikét kísérő diagnosztikai vizsgáló módszer három PRV glükoprotein (gpX, gl vagy glll) egyikére irányul. Mindegyik esetben a diagnosztikus glükoproteint kódoló gént géntechnikai úton módosították, vagy kimutatták róla, hogy természetben előforduló vírusban deletálódott. A PRV/Marker és a Tolvid vakcinákban a gpX a deletált diagnosztikai marker, melyet géntechnikai eljárásokkal módosítottak. A PRV vakcina és a PRVac vakcinák esetében egy természetben előforduló vírusból spontán deletálódott a gl. Az OmniMark vakcinában a glll géntechnikai módosítás következtében deletálódott.
Az álveszettség mentesítési program előrehaladtával nagy értéke lenne egy megerősítő diagnosztikai vizsgáló eljárásnak. Az egyes diagnosztikus antigének eltérő antigenitásának, valamint az egyes állatok immunválasza természetének köszönhetően a diagnosztikus antigén hatására termelődött ellenanyagszint széles határok között változhat. Egy második diagnosztikai markert tartalmazó megerősítő vizsgálatban alkalmazható vakcina nagyon értékes lenne. Két olyan vírus törzset írtak le, amelyekben szerológiai megkülönböztetés céljából két glükoprotein tartalmaz deléciót. Ezek közül az egyiket Kit és munkatársai írták le (4 711 850 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) és tartalmaz egy géntecnikai úton létrehozott deléciót a glll génben, valamint egy természetes úton létrejött deléciót a gl génben. Amint azt fent ismertettük, mindkét glükoprotein neutralizáló ellenanyagok célpontját képezi, a glll ezenkívül a sejt közvetítette immunitás célpontja is. Mindkét fontos antigén deléciójától az várható, hogy a vakcina hatékonyságát veszélyezteti. A második, Post és munkatársai által ismertetett vírust (25) géntechnikai eljárással állították elő, és a gpX, valamint a gl génekben hordoz deléciót. A szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy a vírus hatékonysága lényegesen csökkent a csak gpX glükoproteinben deletált vírussal összehasonlítva. Összefoglalva, a gyakorlat jelenlegi állása szerint egy olyan vírus, amely mind a gpX, mind a gl génekben deléciót tartalmaz, nem lenne vakcinaként hatékony.
A jelenleg rendelkezésre álló termékeket felülmúló vakcinának a következő sajátosságokkal kell rendelkeznie: (1) ne okozzon klinikai tüneteket 3-4 napos malacokban; (2) 95 %-os védettséget hozzon létre bármely életkorú sertésben; (3) tegye lehetővé a szerológiai megkülönböztetést a vadtípusú vírussal fertőzött állatoktól; és (4) tegye lehetővé egy megerősítő diagnosztikai vizsgáló eljárás kidolgozását. A találmány tárgyát ilyen, az eddigieket felülmúló vakcina képezi, amelyet nem várt módon a gpX, valamint a gl gének meghatározott régióinak deletálásával hoztunk létre.
A találmány tárgyát tehát legyengített, genetikai módosítással létrehozott S-PRV-155 elnevezésű álveszettség vírus (ATCC nyilvántartási szám: VR 2311) képezi. A találmány kiterjed a legyengített, genetikai módosítással létrehozott
S-PRV-155 elnevezésű álveszettség vírus hatásos immunizáló mennyiségét és egy megfelelő hordozóanyagot tartalmazó vakcinára. A találmány tárgyát képezi továbbá egy az álveszettség vírus által okozott betegség ellen állatok immunizálására szolgáló eljárás, amely abban áll, hogy a találmány szerinti vakcina hatásos immunizáló mennyiségét adagoljuk az állatnak. Végül, a találmány kiterjed egy a találmány szerinti vakcinával vakcinázott, valamint a természetben előforduló vad-típusú álveszettség vírussal fertőződött állat megkülönböztetésére szolgáló eljárásra.
A mellékelt 1. ábra az ISU S62/26 PRV törzs jellemzőit mutatja. A PRV genomiális DNS-ének ábrája a különösen hoszszú, a belső ismétlődő, a különösen rövid és a terminális ismétlődő régióit mutatja. Jelöltük a BamHI, az Xbal és a Hindin enzimek restrikciós térképét. A fragmenseket számozással vagy betűkkel jelöltük csökkenő sorrendben. A különösen rövid régiót további részletek bemutatása céljából kinagyítottuk. Néhány gén lokalizációját ugyancsak jelöltük; ezek a glükoprotein II (gll) (24), a glükoprotein III (glll) (23), a timidin-kináz (TK), a közvetlen korai gén (IE), a protein kináz (PK) (3), a glükoprotein X (gpX) (4), a glükoprotein 50 (g50) (5), a glükoprotein 63 (g63) (6) és a glükoprotein I (gl) (6) .
A 2. ábra a 263-58.18 Homológia Vektorba inszertált DNS részletes ismertetése. Az ábra a 263-58.18 plazmidba iktatott DNS fragmensek irányultságát mutatja. Az egyes fragmensek eredetét a táblázatban jelöltük. Szintén jelöltük az egyes fragmensek közötti kapcsolódásnál található szekvenciákat. Mindegyik kapcsolódás esetében ismertettük a fragmensek előállításánál felhasznált restrikciós helyeket, valamint a fragmensek összekapcsolásához felhasznált szintetikus linker szekvenciákat. A mesterséges linker szekvenciákat vastag aláhúzással jelöltük. Ugyancsak megadtuk néhány
- 9 gén kódoló szakaszának, valamint szabályozó elemnek a helyzetét. A kővetkező» jelöléseket alkalmaztuk: a zárójelben levő számok () az 1. ábrán megadott hivatkozáshoz viszonyított aminosavakra vonatkoznak, a szögletes zárójelben [] levő restrikciós helyek pedig az előállítás során megszüntetett hasítási helyek maradékait jelölik. A következő rövidítéseket alkalmaztuk: protein kináz (PK), glükoprotein X (gpX)ι glükoprotein 50 (g50), glükoprotein 63 (g63), álveszettség vírus (PRV), és poliadenilációs jel (pA).
A 3. ábra a 416-09.2H homológia vektorba inszertált DNS részletes ismertetése. A diagram a 416-09.2H plazmidba iktatott DNS fragmensek irányultságát mutatja. Az egyes fragmensek eredetét a táblázatban jelöltük. Szintén jelöltük az egyes fragmensek közötti kapcsolódásnál található szekvenciákat. Mindegyik kapcsolódás esetében ismertettük a fragmensek előállításánál felhasznált restrikciós helyeket, valamint a fragmensek összekapcsolásához felhasznált szintetikus linker szekvenciákat. A mesterséges linker szekvenciákat vastag aláhúzással jelöltük. Ugyancsak megadtuk néhány gén kódoló szakaszának, valamint szabályozó elemnek a helyzetét. A következő jelöléseket alkalmaztuk: a zárójelben levő számok () az 1. ábrán megadott hivatkozáshoz viszonyított aminosavakra vonatkoznak, a szögletes zárójelben [] levő restrikciós helyek pedig az előállítás során megszüntetett hasítási helyek maradékait jelölik. A következő rövidítéseket alkalmaztuk: protein kináz (PK), glükoprotein X (gpX), glükoprotein 50 (g50), glükoprotein 63 (g63) , álveszettség vírus (PRV), és poliadenilációs jel (pA) .
• · · · • · ♦ ·*·· · · ···· ···· ·· ·· ·· ♦· · · ·
- 10 A 4. ábra a 436-86.32K homológra vektorba inszertált DNS részletes ismertetése. Az ábra a 436-86.32K plazmidba iktatott DNS fragmensek irányultságát mutatja. Az egyes fragmensek eredetét a táblázatban jelöltük. Szintén jelöltük az egyes fragmensek közötti kapcsolódásnál található szekvenciákat. Mindegyik kapcsolódás esetében ismertettük a fragmensek előállításánál felhasznált restrikciós helyeket, valamint a fragmensek összekapcsolásához felhasznált szintetikus linker szekvenciákat. A mesterséges linker szekvenciákat vastag aláhúzással jelöltük. Ugyancsak megadtuk néhány gén kódoló szakaszának, valamint szabályozó elemnek a helyzetét. A következő jelöléseket alkalmaztuk: a zárójelben levő számok () az 1. ábrán megadott hivatkozáshoz viszonyított aminosavakra vonatkoznak, a szögletes zárójelben [] levő restrikciós helyek pedig az előállítás során megszüntetett hasítási helyek maradékait jelölik. A következő rövidítéseket alkalmaztuk: protein kináz (PK), glükoprotein X (gpX), glükoprotein 50 (g50), glükoprotein I (gl), álveszettség vírus (PRV) , humán cytomegalovírus (HCMV) és poliadenilációs jel (pA) .
A találmány tárgyát legyengített, géntechnikai úton előállított, S-PRV-155 elnevezésű álveszettség vírus képezi (ATCC nyilvántartási szám: VR 2311). Az S-PRV-155 álveszettség vírust a Mikroorganizmusok Szabadalmi Célból Történő Kölcsönös Letétbe Helyezéséről szóló Budapesti Egyezmény szerint 1991 február 12-én letétbe helyeztük az American Type Culture Collection (ATCC) Szabadalmi Lerakatában (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 U.S.A.) ATCC VR • · • · ·
- 11 2311 nyilvántartási szám alatt. A találmány kiterjed a legyengített, genetikai módosítással létrehozott S-PRV-155 elnevezésű álveszettség vírus hatásos immunizáló mennyiségét, valamint egy megfelelő hordozóanyagot tartalmazó vakcinára. A vakcina inaktivált vagy élő S-PRV-155 álveszettség vírust tartalmazhat.
Az álveszettség vírusa számára (vakcina készítés céljából) ismeretesek megfelelő hordozóanyagok a gyakorlatban, melyek magukba foglalnak proteineket, cukrokat, stb. Megfelelő hordozóanyag például az egy vagy több stabilizáló anyagot, mint például stabilizált, hidrolizált proteint vagy laktózt tartalmazó fiziológiásán pufferolt tápfolyadék.
A találmány szerinti vakcinában általában, az S-PRV-155 vírus hatásos immunizáló mennyisége adagonként körülbelül 103-109 plakképző egység. A hatásos immunizáló mennyiség élő vakcinák esetében előnyösen adagonként körülbelül 104-106 plakképző egység, inaktivált vakcinák esetében 107-109 plakképző egység. Az élő vakcinát előnyösen úgy állítjuk elő, hogy szövettenyésztő folyadékhoz stabilizáló anyagot, például stabilizált, hidrolizált proteint adunk. Az inaktivált vakcina esetében előnyösen a szövettenyésztő folyadékot közvetlenül a vírus inaktiválását követően használjuk.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy álveszettség vírus által okozott megbetegedés ellen állatok, különösen sertések immunizálását szolgáló eljárás, amely abban áll, hogy a találmány szerinti vakcina hatásos immunizáló mennyiségét adagoljuk az állatnak. A vakcina bármely, a gyakorlatban járatos személy számára ismert módszerrel adagolható, például izomba, bőr alá, hasüregbe, vagy intravénás injektálással. Más eljárás szerint a vakcina adagolható orron vagy szájon át.
A találmány kiterjed egy a találmány szerinti vakcinával vakcinázott, valamint a természetben előforduló vad-típusú álveszettség vírussal fertőződött állat megkülönböztetésére szolgáló eljárásra. Ez az eljárás magában foglalja az állattól nyert testfolyadék minta vizsgálatát gpX, valamint legalább egy másik, a természetben előforduló, vad-típusú álveszettség vírussal fertőzött állatban kifejeződő antigén jelenlétére nézve, és annak meghatározását, hogy a testfolyadék mintában az antigén és a gpX megtalálható-e. A testfolyadékban az antigén jelenléte és a gpX hiánya vakcinával vakcinázott és a természetben előforduló, vad-típusú álveszettség vírussal nem fertőzött állatra utal. A testfolyadékban az antigén és a gpX jelenléte különböző eljárásokkal állapítható meg, például a testfolyadékban az antigénre és a gpX-re fajlagos ellenanyagok meghatározásával. A találmány szerinti vakcinával vakcinázott, valamint a természetben előforduló vad-típusú álveszettség vírussal fertőződött állat megkülönböztetésére szolgáló eljárás magában foglalhatja továbbá a minta vizsgálatát gl jelenlétére nézve. A testfolyadékban az antigén jelenléte és a gl hiánya a vakcinával vakcinázott és a természetben előforduló vad-típusú álveszettség vírussal nem fertőződött állatra utal. A találmány leírásában a természetben előforduló álveszettség vírus alatt olyan álveszettség vírust értünk, amelyet nem módosítottak géntechnikai módszerekkel, ide tartoznak, de azokra • · • ·· ···· · · • · · · ···· • · ·· ·· · · ····
- 13 nem korlátozódnak, vad-típusú álveszettség vírusok, valamint olyan álveszettség vírusok, amelyek a természetben előforduló és spontán deléciót tartalmazó álveszettség vírusok közé tartoznak. A találmány szerint nem létfontosságú gén alatt a vírus replikációban nélkülözhető gént értünk.
A találmány kiterjed továbbá egy a találmány szerinti vakcinával vakcinázott, valamint a természetben előforduló vad-típusú álveszettség vírussal fertőzött állat megkülönböztetésére szolgáló eljárásra. Ez az eljárás magában foglalja az állattól nyert testfolyadék minta vizsgálatát gl, valamint legalább egy másik, a természetben előforduló, vad-típusú álveszettség vírussal fertőzött állatban kifejeződő antigén jelenlétére nézve, és annak meghatározását, hogy a testfolyadék mintában az antigén és a gl jelen van-e. A testfolyadékban az antigén jelenléte és a gl hiánya vakcinával vakcinázott és a természetben előforduló, vad-típusú álveszettség vírussal nem fertőzött állatra utal.
Álveszettség vírusok, köztük az S-PRV-155 vírus előállítására, kiválasztására és tisztítására szolgáló eljárásokat a következő, Anyagok és módszerek című fejezetben ismertetjük.
ÁLVESZETTSÉG VÍRUS (PRV) TÖRZSTENYÉSZETEK ELŐÁLLÍTÁSA
Álveszettség vírus (PRV) törzstenyészeteket úgy állítottunk elő, hogy 1 % borjú szérummal kiegészített, 2 mmol/1 glutamint, 100 egység/ml penicillint, és 100 egység/ml streptomycint tartalmazó Dulbecco féle módosított Eagle tápfolyadékban (DME) tenyésztett Verő sejteket (a fenti össze• · · · • ·· · · · · · · ···* * ♦ · · ·· ·· ·· ·· ···♦
- 14 tevőket az Irvin Scientific cégtől vagy annak megfelelő szállítótól szereztük be, és ezután teljes DME tápfolyadéknak nevezzük), sejtenként 0,01 plakképző egységet (PFU) tartalmazó fertőzési hányados értékkel fertőztünk. Miután a citopatogén hatás teljesen kialakult, a tápfolyadékot és a sejteket összegyűjtöttük, és a sejteket klinikai centrifugában ülepítettük (3000 rpm, 5 perc) . A sejteket az eredeti térfogat 1/10 mennyiségének megfelelő tápfolyadékban szuszpendáltuk, és egyenlő mennyiségű kétszer autoklávozott fölözött tejet (9 tömeg/térfogat % fölözött tejpor vízben) adtunk hozzá. A vírus mintákat kétszer fagyasztottuk és olvasztottuk, egyenlő térfogatokra szétosztottuk és fagyasztva -70 °C-on tároltuk. A titer rendszerint körülbelül 108 PFU/ml volt.
A PRV TITRÁLÁSA
A PRV titrálásához Verő sejteket oltottunk 60 mm átmérőjű Petri-csészékbe 5 x 105 sejt/ml mennyiségben. A következő napon a növekedést serkentő tápfolyadékot (10 % borjúszérummal kiegészített teljes DME) csészénként 3,0 ml fenntartó tápfolyadékra (1 % borjúszérummal kiegészített teljes DME) cseréltük. A vírus tenyészetekből l:104, ΙΟ5, ΙΟ6, 107 és 108 hígításokat késztettünk fenntartó tápfolyadékban. Ezekből a hígításokból 1,0 ml-t adtunk mindegyik csészéhez. A csészéket 4 óra hosszat 37 ’C-on tartottuk 5 % CO2-t tartalmazó nedves inkubátorban. A tápfolyadékot ezután leszívtuk, és mindegyik csészét 2 mmol/1 glutamint, 100 egység/ml penicillint, 100 egység/ml streptomycint, és 2 % borjúszéru• ·
- 15 mot tartalmazó 2 x Minimál Essential tápfolyadékban (MÉM) oldott, 0,75 %-os végkoncentrációjú, 5 ml térfogatú alacsony olvadáspontú agarózzal rétegeztünk felül. A csészéket 30 percre szobahőmérsékletre helyeztük, hogy az agaróz megdermedjen, ezután 3 napra 5 % CO2-t tartalmazó nedves inkubátorba raktuk 37 °C-ra. A plakkokat megszámoltuk és kiszámítottuk a PFU/ml értékeket.
PRV DNS ELŐÁLLÍTÁSA
A PRV DNS készítmény előállításához 25 cm2 területű palackokban vagy 60 mm átmérőjű Petri-csészékben tenyésztett összefüggő egyrétegű Verő sejt tenyészeteket 1 ml tápfolyadékban szuszpendált 100 mikroliter vírus mintával fertőztünk. Az adszorbció 1-2 óráig tartott 37 ’C-on, 5 % CO2-t tartalmazó nedves inkubátorban. Az adszorbciót követően ehhez 4 ml, 1 % borjúszérummal kiegészített teljes DME tápfolyadékot adtunk. Egy éjszakán át tartó inkubálás után, vagy amikor a sejtek 100 %-ban citopatogén hatást mutattak, a sejteket sejt-kaparóval (Costar védjegy) a tápfolyadékba kapartuk. A sejteket és a tápfolyadékot klinikai centrifugában ülepítettük (3000 rpm, 5 perc). A tápfolyadékot elöntöttük, és a sejt üledéket 0,01 mol/1 Tris-t (pH 7,5), 1 mmol/1 EDTA-t, és 0,5 % Nonidet P-40 -t (NP40) tartalmazó 0,5 ml térfogatú oldatban óvatosan szuszpendáltuk. A mintát 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Tíz mikroliter RNase A (Sigma) törzsoldatot (törzsoldat: 10 mg/ml, 10 percig forralva a DNase inaktiválása céljából) adtunk a mintához. A mintát 5 percig 3000 rpm-n klinikai centrifugában centrifu• · ·« «· · * «* · • «· ·«·· · · «··« Λ · · · •· ·· ·« «· ···«
- 16 gáltuk a magok ülepítése céljából. A DNS üledéket pasteur pipettával, vagy fapálcikával eltávolítottuk és kidobtuk. A felülúszót 25 mikroliter 20 %-os nátrium-dodecil-szulfátot (Sigma), és 25 mikroliter proteináz-K-t (10 mg/ml;
Boehringer Mannheim) tartalmazó 1,5 ml térfogatú Eppendorf csövekbe öntöttük. A mintát megkevertük és 30-60 percig 37 °C-on inkubáltuk. Ehhez a mintával azonos térfogatú vízzel telített fenolt adtunk, és azt vortex keverőn megkevertük. A mintát Eppendorf mini centrifugában teljes sebességen 5 percig ülepítettük. A felső vizes fázist új Eppendorf csőbe vittük át, kétszeres térfogatú -20 °C-os etanolt adtunk hozzá, és a csövet 30 percre -20 °C-ra tettük a nukleinsav kicsapása céljából. A mintát Eppendorf centrifugában 4 °C-on, 5 percig ülepítettük. A felülúszót elöntöttük, és az üledéket egyszer hideg 80 %-os etanollal mostuk.
Az üledéket 17 mikroliter vízben rehidráltuk. Nagyobb mennyiségű DNS előállításához az eljárást úgy módosítottuk, hogy 850 cm2 területű gördülő palackban tenyésztett Verő sejtekből indultunk ki. A DNS-t vízben vagy 0,01 mol/1 Tris-t (pH 7,5), és 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó pufferben tároltuk 4 °C-on.
FENOLOS EXTRAKCIÓ
A fenolos extrakciót bármely alkalmas térfogatú DNS mintával, tipikusan 100 mikroliter-1 ml közötti térfogatú mintával végeztük. A DNS mintát 0,01 mol/1 Tris-t (pH 7,5), és 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó pufferrel hígítottuk, és azonos térfogatú vízzel telített fenolt adtunk hozzá. A mintát vortex keverőn röviden megkevertük, és 3 percre jégre tét··· ·
- 17 tűk. Miután a mintát 3 percig mikrocentrifugában ülepítettük, a vizes fázist új csőbe vittük át, és etanollal kicsaptuk.
ETANOLOS KICSAPÁS
A mintában található DNS-t etanolos kicsapással koncentráltuk. A DNS mintához 1/10 térfogatnyi 3 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetátot (pH 7,5), és 3 térfogatnyi hideg etanolt adtunk. A DNS-t 30 percig -70 °C-on vagy egy éjszakán át -20 °C-on hagytuk kicsapódni, majd mikrocentrifugában 15 percig, 4 °C-on ülepítettük. Az üledéket 200 mikroliter hideg 80 %-os etanollal egyszer mostuk, és 10 percig, 4 °C-on ismét ülepítettük. Levegőn való szárítást, vagy liofilezést követően az üledékeket megfelelő mennyiségű pufferben vagy vízben szuszpendáltuk.
RESTRIKCIÓS ENZIMMEL VÉGZETT EMÉSZTÉS
A DNS-t restrikciós enzimekkel hasítottuk a gyártó cég (IBI, BRL, new England Biolabs, stb) által ajánlott puffer felhasználásával. Amennyiben lehetséges volt, a DNS koncentrációját 1 mikrogramm/50 mikroliter alatt tartottuk. Az inkubálást 37 °C-on, 1-4 óráig végeztük.
A DNS AGARÓZ GÉL ELEKTROFORÉZISE
A DNS restrikciós mintájának láthatóvá tétele céljából a DNS-hez 5 mikroliter minta töltő puffért (5 x elektroforézis puffer, 0,01 % brómfenolkék festék, 50 mmol/1 EDTA, és 50 % glicerin) adtunk. A mintát 0,6 %-3,0 % agaróz gélt tartalmazó, horizontális, pufferrel elárasztott elektroforézis készülék egy mintasávjába töltöttük. Az elektroforézis puffer 40 mmol/1 Tris-t, és 10 mmol/1 EDTA-t tartalmazott, a puf««·· ·· ·* ·· ·· • · * « ·* · · · • ·· ··· · · · ···· 4»·· fért ecetsawal pH 7,8-ra állítottuk be, és ehhez szükség szerint 0,5 mikrogramm/ml etidium-bromidot adtunk. A gélt 18 órán át 40-50 Volt feszültségen futtattuk, eltávolítottuk, 0,5 mikrogramm/ml etidium-bromiddal 30 percig festettük, majd a DNS csíkokat hosszú hullámhosszú UV megvilágító készülékkel láthatóvá tettük.
LIGÁLÁS
A DNS-t T4 DNS ligáz (BRL) enzimmel kapcsoltuk össze. A ligációs reakció változó mennyiségű DNS-t (0,2-20 mikrogramm), 20 mmol/1 Tris-t (pH 7,5), 10 mmol/1 MgC12~t, 10 mmol/1 ditiotreitolt (DTT), 200 mikromol/1 ATP-t és 20 egység T4 DNS ligázt tartalmazott 10-20 mikroliter végtérfogatú reakcióelegyben. A ligálást 3-16 órán keresztül, 15 °C-on végeztük.
A DNS SOUTHERN LENYOMAT VIZSGÁLATA
A Southern lenyomat vizsgálathoz a nem radioaktív DNS jelölő és meghatározó készletet (Nonradioaktive DNA Labeling and Detection Kit, Boehringer Mannheim) használtuk. A gyártó által ajánlott eljárást követtük.
DNS TRANSZFEKTÁLÁS REKOMBINÁNS VÍRUS ELŐÁLLÍTÁSÁRA
A módszer Graham és Van dér Eb (1) kalcium-foszfát eljárásán alapszik, amelyben a következő változtatásokat hajtottuk végre. Vírus vagy plazmid eredetű DNS-t 298 mikroliterre hígítottunk 0,01 mol/1 Tris-t (pH 7,5), és 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó pufferben. Ehhez negyven mikroliter 2 mol/1 koncentrációjú CaCl2-t, majd azonos térfogatú 2 x HEPES pufférés sóoldatot (10 g Ν-2-hidroxi-etil-piperazin N'-2-etán-szulfonsav (HEPES), 16 g NaCl, 0,74 g KC1, 0,25 g *·· · ·
- 19 Na2HPO4 x 2Η2Ο, egy liter vízre számítva 2 g dextróz, NaOHval a pH 7,4-re állítva) adtunk. Az elegyet ezután 10 percig jégen inkubáltuk, majd cseppenként hozzáadtuk egy 60 mm átmérőjű Petri-csészében 5 ml tápfolyadék (2 % borjúszérummal kiegészített DME) alatt növekedő, 80 %-ban összefüggő egyrétegű Verő sejttenyészethez. A sejteket négy óra hosszat 37 °C-on, 5 % CO2-t tartalmazó nedves inkubátorban inkubáltuk. A sejteket ezután háromszor 5 ml térfogatú 1 x PBS pufferrel (1,15 g Na2HPŰ4, 0,2 g KH2PO4, 0,8 g NaCl, és 0,2 g KC1 1 liter vízre számítva) mostuk, és 5 ml tápfolyadékkal (2 % borjúszérummal kiegészített DME) fedtük. A sejteket 3-7 napig 37 °C-on inkubáltuk a fentiek szerint, amíg a vírus okozta citopatogén hatás 50-100 %-ban kialakult. A vírusokat a vírus törzstenyészetek esetében fent leírtak szerint ülepítettük. Ezt a vírustenyészetet transzfekciós tenyészetnek neveztük, és ezután rekombináns vírusok jelenlétére vizsgáltuk a Bluogal módszer rekombináns PRV válogatására című fejezetben ismertetettek szerint.
HOMOLÓG REKOMBINÁCIÓS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA
Ez az eljárás PRV DNS, valamint plazmid homológia vektor DNS között végbemenő homológ rekombináción alapszik, mely folyamat az ezekkel a DNS elemekkel kotranszfektált Verő sejtekben jön létre. Legalább 0,1-1,0 mikrogramm, megfelelő klónozott PRV szekvenciákkal határolt idegen DNS-t tartalmazó plazmid DNS-t (az úgy nevezett homológia vektort) összekevertünk körülbelül 0,3 mikrogramm intakt PRV DNS-sel. A DNS-t 0,01 mol/1 Tris-t (pH 7,5) és 1 mmol/1 EDTA-t tar• . * ·
- 20 talmazó pufferben 298 mikroliterre hígítottuk, és a DNS TRANSZFEKTÁLÁS REKOMBINÁNS VÍRUS ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben (lásd fent) ismertetettek szerint Verő sejtekbe transzferáltuk.
KÖZVETLEN LIGÁLÁSOS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA
Homológia vektorok alkalmazása helyett és ahelyett, hogy a rekombináns vírusok előállítását a homológ rekombináció folyamatára bíznánk, a közvetlen ligálásos technikát is kifejlesztettük a PRV módosításására. Ebben az esetben a klónozott idegen DNS-t nem kell ellátnunk határoló PRV DNS szekvenciákkal, annak csupán olyan restrikciós hasítási helyeket kell tartalmaznia, amelyek lehetővé teszik az idegen gén kivágását a plazmid vektorból. A PRV DNS-t egy az előzővel kompatibilis restrikciós enzimmel hasítottuk. A módszer alkalmazásának feltétele az volt, hogy a PRV DNS hasításához felhasznált restrikciós enzim korlátozott számú helyen hasítson, és legalább az egyik hely nem létfontosságú hely legyen. Használtunk Xbal enzimet, amely két helyen hasítja a PRV DNS-t. Hind III enzimet is használtunk, amely négy helyen hasítja a PRV DNS-t. Ugyancsak felhasználhatók az egyéb módszerek segítségével előzőleg beiktatott restrikciós hasítási helyek. A PRV DNS-t 30-szoros moláris feleslegben levő plazmid DNS-sel (tipikus esetben 5 Mg vírus DNS-t 10 μg plazmid DNS-sel) elegyítettünk, és a keveréket a megfelelő restrikciós enzimmel hasítottuk. A DNS elegyet a restrikciós enzimek eltávolítása céljából fenollal extraháltuk, és etanollal kicsaptuk, majd a fent ismertetett ligálási eljárás szerint ligáltuk. Az összekapcsolt DNS elegyet ezután 298 μΐ pufferben (0,01 mol/1 Tris, pH 7,5; 1 mmol/1 EDTA) szuszpendáltuk, és a DNS TRANSZFEKTÁLÁS REKOMBINÁNS VÍRUS ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett eljárás szerint Verő sejtekbe transzfektáltuk (lásd fent).
A közvetlen ligálásos eljárás PRV-ből DNS deletálására is alkalmazható. A megfelelő restrikciós enzim felismerő helyekkel határolt nem létfontosságú” DNS szakasz úgy deletálható, hogy a PRV-t az adott enzimmel hasítjuk, és újból ligáljuk. A közvetlen ligálásos eljárással előállított genetikailag módosított vírusok előfordulási gyakorisága elég magas ahhoz, hogy a válogatás a transzfekciós tenyészetből random kiválasztott plakkok restrikciós enzim emésztésével elvégezhető legyen.
REKOMBINÁNS PRV BLUOGAL MÓDSZERREL VÉGZETT KIVÁLOGATÁSA
Abban az esetben, ha a rekombináns vírusba E. coli bétagalaktozidáz marker gént iktatunk be, a rekombinánsokat tartalmazó plakkokat egyszerű vizsgálattal láthatóvá tehetjük. Ha a plakk vizsgálat során a felső agaróz rétegbe Bluogal™ (Bethesda Research Labs) nevű vegyszert teszünk (200 μg/ml), akkor a béta-galaktozidázt expresszáló plakkok kék színben jelennek meg. A kék plakkokat friss Verő sejtekbe oltottuk, és további kék plakkok izolálásával tisztítottuk. Azoknál a rekombináns vírus előállítási stratégiáknál, amelyeknél az E. coli béta-galaktozidáz marker gént eltávolítottuk, a vizsgálat a hátteret képező szülői kék plakkok közül fehér plakkok tisztítását is magába foglalta. Mindkét esetben a vírusokat tipikusan három plakk tisztítási kör el22 végzésével tisztítottuk.
DELÉCIÓT TARTALMAZÓ VÍRUSOK ELŐÁLLÍTÁSA
A deléciót tartalmazó vírusok előállításának stratégiája magába foglalta mind a homológ rekombinációs, mind a közvetlen ligálásos technikák alkalmazását. Először homológ rekombinációs eljárással egy olyan vírust állítottunk elő, amelyben a deletálandó gént E. coli béta-galaktozidáz marker génnel helyettesítettük. Ezután közvetlen ligálásos technikával egy második vírust állítottunk elő, amelyben a marker gént deletáltuk. A fenti stratégia megvalósíthatóságának a feltétele az, hogy az első vírusba beiktatott marker gént a KÖZVETLEN LIGÁLÁSOS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett megfelelő restrikciós enzim felismerő helyek határolják. Ennek az eljárásnak az az előnye, hogy mindkét vírus tisztítható a REKOMBINÁNS PRV BLUOGAL MÓDSZERREL VÉGZETT VÁLOGATÁSA című fejezetben ismertetettek szerint. Az első vírust a fehér hátteret képező plakkok közül a kék plakkok, a második vírust a kék plakkok közül a fehér plakkok kiválogatásával tisztíthatjuk. Három különböző homológra vektort állítottunk elő a gpX, valamint a gpl géneket kódoló szakaszok deletálása céljából. Ezeknek a homológra vektoroknak a részletes ismertetése az alábbiakban következik.
A 263-58.18 HOMOLÓGIA VEKTOR
A 263-58.18 plazmidot a gpX gén kódoló szakaszának az álveszettség vírusból való deletálása céljából állítottuk elő. Ez a plazmid egy PRV DNS-sel határolt E. coli bétagalaktozidáz marker gént tartalmaz. A marker géntől 5’ irányban található a PRV DNS egy körülbelül 1330 bázispárból álló fragmense, amely a gpX elsődleges transzlációs termékének első hét aminosavát (4) kódoló szekvenciákkal végződik.
A marker géntől 3' irányban található a PRV DNS egy körülbelül 1800 bázispárból álló fragmense, amely a gpX elsődleges transzlációs termékének utolsó 19 aminosavát (4) kódoló szekvenciákkal kezdődik. Ennek a plazmidnak a HOMOLÓG REKOMBINÁCIÓS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetettek szerinti alkalmazása során a gpX elsődleges transzlációs termékének 8-479. aminosavait kódoló DNS a marker gént kódoló DNS-sel cserélődik ki. Megjegyzendő, hogy a béta-galaktozidáz (lacZ) marker gén az endogén gpX promoter irányítása alatt működik. A plazmidot a 2. ábrán részletesen ismertetjük. A plazmidot az említett DNS forrásokból szokásos rekombináns DNS technikák alkalmazásával állítottuk elő (2) . A plazmid konstrukcióját a következő forrásokból származó restrikciós fragmensek, valamint a 2. ábrán bemutatott szintetikus DNS fragmensek összekapcsolásával végezhetjük. A plazmid vektor a pSP65 (Promega) egy körülbelül 2792 bázispárból álló Smal-PvuII restrikciós fragmenséből származott. Az 1. fragmenst a PRV 10 számú BamHI restrikciós fragmensének (15) egy körülbelül 922 bázispárból álló EcoRV-Sall restrikciós fragmense képezte. A 2. fragmenst a PRV 10 számú BamHI restrikciós fragmensének (15) egy körülbelül 412 bázispárból álló Sall-BamHI restrikciós fragmense képezte. A 3. fragmens a pJF751 plazmid (11) egy körülbelül 3347 bázispárból álló BamHI-Ball restrikciós fragmense volt. A 4. fragmenst a PRV 7 számú BamHI restrikciós fragmensének (15) egy körülbelül 1803 bázispárból álló Ndel-Stul restrikciós fragmense képezte. Megemlítendő, hogy a B és a D kapcsolódásoknál található Xbal hasítási helyek a plazmidban található egyedüli Xbal hasítási helyek, és lehetővé teszik a marker génnek egy Xbal restrikciós fragmensként való kivágását.
A 416-09.2H HOMOLÓGIA VEKTOR
A 416-09.2H plazmidot a gpl gén kódoló szakaszának az álveszettség vírusból való deletálása céljából állítottuk elő. Ez a plazmid egy PRV DNS-sel határolt E. coli bétagalaktozidáz marker gént tartalmaz. A marker géntől 5' irányban található a PRV DNS egy körülbelül 1884 bázispárból álló fragmense, amely a gpl elsődleges transzlációs termékének első aminosavát kódoló bázispártól (6) 5' irányban, attól körülbelül 46 bázispárra található szekvenciákkal végződik. A marker géntől 3' irányban található a PRV DNS egy körülbelül 1309 bázispárból álló fragmense, amely a gpl elsődleges transzlációs termékének utolsó 105 aminosavát (6) kódoló szekvenciákkal kezdődik. Ennek a plazmidnak a HOMOLÓG REKOMBINÁCIÓS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetettek szerinti alkalmazása során a gpl elsődleges transzlációs termékének 1-472. aminosavait kódoló DNS a marker gént kódoló DNS-sel cserélődik ki. Megemlítendő, hogy a béta-galaktozidáz (lacZ) marker gén az endogén gpX promoter irányítása alatt működik. A plazmidot a 3. ábrán részletesen ismertetjük. A plazmidot az említett DNS forrásokból szokásos rekombináns DNS technikák alkalmazásával állítottuk elő (2). A plazmid konstrukcióját a következő forrásokból származó restrikciós fragmensek, valamint a 3. áb25 rán bemutatott szintetikus DNS fragmensek összekapcsolásával végezhetjük. A plazmid vektor a pSP19 (Promega) egy körülbelül 3009 bázispárból álló Smal-BamHI restrikciós fragmenséből származott. Az 1. fragmenst a PRV 7 számú BamHI restrikciós fragmensének (15) egy körülbelül 1884 bázispárból álló HincII-Dral restrikciós fragmense képezte. A 2. fragmenst a PRV 10 számú BamHI restrikciós fragmensének (15) egy körülbelül 412 bázispárból álló Sall-BamHI restrikciós fragmense képezte. A 3. fragmens a pJF751 plazmid (11) egy körülbelül 3347 bázispárból álló BamHI-Ball restrikciós fragmense volt. A 4. fragmenst a PRV 7 számú BamHI restrikciós fragmensének (15) egy körülbelül 1309 bázispárból álló Sphl-BamHI restrikciós fragmense képezte. Megemlítendő, hogy a B és a D kapcsolódásoknál található Xbal hasítási helyek a plazmidban található egyedüli Xbal hasítási helyek, és lehetővé teszik a marker génnek egy Xbal restrikciós fragmensként való kivágását.
A 436-86.32K HOMOLÓGIA VEKTOR
A 436-86.32K plazmidot a gpX gén kódoló szakaszának az álveszettség vírusból való deléciója céljából állítottuk elő. Ez a plazmid egy PRV DNS-sel határolt, HCMC közvetlen korai promoterrel rendelkező E. coli béta-galaktozidáz marker gént tartalmaz. A marker géntől 5' irányban található a PRV DNS egy körülbelül 1330 bázispárból álló fragmense, amely a gpX elsődleges transzlációs termékének első hét aminosavát (4) kódoló szekvenciával végződik. A marker géntől 3 * irányban található a PRV DNS egy körülbelül 1800 bázispárból álló fragmense, amely a gpX elsődleges transzlá• ·
- 26 ciós termékének utolsó 19 aminosavát (4) kódoló szekvenciával kezdődik. Ennek a plazmidnak a HOMOLÓG REKOMBINÁCIÓS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetettek szerinti alkalmazása során a gpX elsődleges transzlációs termékének 8-479. aminosavait kódoló DNS a marker gént kódoló DNS-sel cserélődik ki. A plazmidot a 4. ábrán részletesen ismertetjük. A plazmidot az említett DNS forrásokból szokásos rekombináns DNS technikák alkalmazásával állítottuk elő (2). A plazmid konstrukcióját a következő forrásokból származó restrikciós fragmensek, valamint a 4. ábrán bemutatott szintetikus DNS fragmensek összekapcsolásával végezhetjük. A plazmid vektor a pSP65 (Promega) egy körülbelül 2792 bázispárból álló Smal-PvuII restrikciós fragmenséből származott. Az 1. fragmenst a PRV 10 számú BamHI restrikciós fragmensének (15) egy körülbelül 1336 bázispárból álló EcoRV-BamHI restrikciós fragmense képezte. A 2. fragmenst a HCMC E Xbal restrikciós fragmensének (12) egy körülbelül 1191 bázispárból álló Pstl-Avall restrikciós fragmense képezte. A 3. fragmens a pJF751 plazmid (11) egy körülbelül 3002 bázispárból álló BamHI-PvuII restrikciós fragmense volt. Megemlítjük, hogy ez a fragmens két belső PvuII hasítási helyet tartalmaz, ami részleges PvuII emésztést tesz szükségessé.
Más eljárás szerint a fragmenst megkaphatjuk részleges emésztés nélkül két különálló fragmensként. Ezeket a fragmenseket egy körülbelül 2950 bázispárból álló BamHI-Ndel, valamint egy körülbelül 55 bázispárból álló Ndel-PvuII fragmens alkotja. A 3. fragmens az egyedi Ndel hasítási helyeknél összekapcsolt két fragmenssel helyettesíthető. A 4.
• ·
- 27 fragmenst a PRV 7 számú BamHI restrikciós fragmensének (15) egy körülbelül 1803 bázispárból álló Ndel-Stul restrikciós fragmense képezte. Megemlítendő, hogy a B és a D kapcsolódásoknál található Xbal hasítási helyek a plazmidban található egyedüli Xbal hasítási helyek, és lehetővé teszik a marker génnek egy Xbal restrikciós fragmensként való kivágását.
VAKCINÁZÁSI VIZSGÁLATOK SERTÉSEKEN
Az élő, legyengített vírus hatékonyságának vizsgálatára háromnapos korú, álveszettség vírustól mentes sertésállományból származó kocáktól született malacokat használtunk. A malacokat 1 ml, 103-105 plakképző egységet (PFU) tartalmazó vírus-szuszpenzióval oltottuk izomba adva.
A PRV—155 vírust inaktivált vakcinaként is vizsgáltuk. A vírust bináris etiléniminnel legalább 40 órán át, 37 °C-on való kezeléssel inaktiváltuk. Az inaktivált vírus-szuszpenziót egy olaj alapú adjuvánssal elegyítettük, és négyhetes korú malacokba oltottuk.
Mind az élő S-PRV-155, mind az inaktivált S-PRV-155 vírussal vakcinázott állatokat a vakcinázás után minden nap megfigyeltük a káros reakciókra (a PRV megbetegedés klinikai tüneteire) nézve. Az élő S-PRV-155 vírussal vakcinázott malacoktól orr-váladék mintákat gyűjtöttünk, és azokból tenyésztést végeztünk annak megállapítása céljából, hogy a vírusok képesek-e ürülni és más állatokra terjedni. Az immunitás fokát a szérumban a PRV ellen termelődött ellenanyagok szintjének meghatározásával, és 3-4 héttel a vakcinázást követően a vakcinázott malacoknak virulens vírussal való fe-
lülfertőzésével határoztuk meg. Az utóbbi esetben a vakcinázott malacokat, valamint nem vakcinázott malacok egy csoportját virulens, pneumotrop PRV törzzsel (VDL4892) oltottuk, a felülfertőzéshez olyan mennyiségű vírust használtunk, amely a nem vakcinázott malacok csoportjának legalább 80 %-ánál PRV megbetegedést okozott. A felülfertőzött állatokat naponta megfigyeltük a megbetegedés tüneteire, valamint az orrváladékon keresztül való vírus ürítésre nézve. A felülfertőzéskor, és a vakcinázást követően 2-3 hétig, egy hetes időközökben szérum mintákat gyűjtöttünk. A szérumot szérum neutralizáló ellenanyagok (SN), gpX ellenes ellenanyagok (HerdChekR; IDEXX Corp.), valamint gpl ellenes ellenanyagok (HerdChekR; IDEXX Corp.; és ClinEase, SmithKline Beecham) jelenlétére vizsgáltuk a gyártó utasításai szerint eljárva.
A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük.
1. példa
S-PRV-150
Az S-PRV-150 egy olyan álveszettség vírus, amely a TK génen belül egy deléciót tartalmaz a különösen hosszú régióban, deléciót hordoz az ismétlődő régióban, egy 1460 bázispár nagyságú deléciót tartalmaz a gl kódoló szakaszán belül, és egy 1825 bázispárból álló deléciót hordoz a gpX kódoló szakaszában. Az E. coli béta-galaktozidáz (lacZ gén) gént a gpl gén helyére inszertáltuk, és az a HCMV közvetlen korai promotere irányítása alatt áll.
Az S-PRV-150 vírust az S-PRV-002 vírusból (4 877 737 sz.
- 29 amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, 1989. október 31.) állítottuk elő három közbülső vírus létrehozásán keresztül. Az első közbülső vírus az S-PRV-070 volt. Ebben a vírusban az ismétlődő régión belül található Xbal hasítási helyeket (lásd 1. ábra) EcoRI hasítási helyekké alakítottuk, hogy lehetővé tegyük a következő lépésekben az egyéb helyeken található Xbal restrikciós helyek felhasználását. Ezt a KÖZVETLEN LIGÁLÁSOS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA fejezetben ismertetett eljárás segítségével, a CTAGGAATTCC szintetikus oligonukleotidnak az S-PRV-002 vírus Xbal hasítási helyeire való inszertálásával hajtottuk végre. A második, S-PRV-089 nevezetű közbülső vírusban a béta-galaktozidáz marker génnel a gpX deléciót iktattuk be. Ezt a 263-58.18 homológia vektor (lásd anyagok és módszerek), valamint az S-PRV-070 vírus felhasználásával végeztük a HOMOLÓG REKOMBINÁCIÓS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett eljárás szerint. A harmadik közbülső vírus esetében (S-PRV-112) a béta-galaktozidáz marker gént (lacZ), Xbal enzimmel végzett emésztéssel eltávolítottuk a KÖZVETLEN LIGÁLÁSOS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett eljárás szerint. Végül az S-PRV-150 vírust a 416-09.2H homológia vektor (lásd anyagok és módszerek), valamint az S-PRV-153 vírus felhasználásával állítottuk elő HOMOLÓG REKOMBINÁCIÓS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett eljárás szerint.
Az S-PRV-150 vírus szerkezetét BamHI, valamint Xbal enzimekkel végzett restrikciós enzim vizsgálatokkal igazoltuk.
• ·· ···· · · • · · · · · · • · · ·· ·· ····
2. példa
S-PRV-151
Az S-PRV-151 egy olyan álveszettség vírus, amely egy deléciót tartalmaz a TK génen belül a különösen hosszú régióban, deléciót hordoz az ismétlődő régióban, egy 1460 bázispár nagyságú deléciót tartalmaz a gl kódoló szakaszán belül, és egy 1825 bázispárból álló deléciót hordoz a gpX kódoló szakaszában.
Az S-PRV-151 vírust az S-PRV-150 vírusból kaptuk a marker gén (lásd fent) eltávolításával. Ezt az S-PRV-150 Xbal enzimmel való emésztésével értük el a KÖZVETLEN LIGÁLÁSOS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett eljárás szerint. Az S-PRV-151 vírus szerkezetét BamHI, valamint Xbal enzimekkel végzett restrikciós enzim vizsgálatokkal igazoltuk.
A következő kísérletet végeztük el annak megállapítása céljából, hogy az S-PRV-151 alkalmazható-e vakcinaként álveszettség megbetegedés ellen sertésekben védettség létrehozására. Ebben a kísérletben háromnapos korú malacokat vakcináztunk az S-PRV-151 vírussal izomba adva, a következőkben ismertetettek szerint jártunk el: 4 malacot 104 plakképző egységet (PFU), 4 malacot 106 plakképző egységet tartalmazó vírussal oltottunk. A kísérlet egy öt malacból álló kontroll csoportot is tartalmazott. Az állatokat megfigyeltük, majd a VAKCINÁZÁSI VIZSGÁLATOK SERTÉSBEN című fejezetben ismertetettek szerint azokat felülfertőztük. (Az eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze.
• · • · • ·· · ·· · · *· · · · • ·· ««· · · · ···· · · · · ·· ·· ·· · ····
- 31 1. táblázat napos korú malacok vakcinázása S-PRV-151 vírussal, és felülfertőzésük virulens PRV-vel.
Vírus Malacok SN ellenanyag3 Felülfertőzést koncentráció száma Vakcina utáni felülfer követó megfigyelések
| adagonként | tózés után | Vírus ürítés*3 | klinikai tünetek0 | pusztulás | ||
| 21 nap | 14 nap | |||||
| adagonként 104 PFU | 4 | <=2 | 45 | 41% | 100% | 20% |
| adagonként 106 PFU | 4 | <=2 | 96 | 33% | 100% | 0% |
| kontroll | 5 | < 2 | 10 | 55% | 100% | 20% |
a = mértani átlag titer (a hígítás reciproka) b = a vírusra nézve pozitív orrváladék minták százalékos aránya c = CNS-t és/vagy légúti tüneteket mutató malacok százalékos aránya.
Ebben a kísérletben mindegyik vakcinázott állat a vakcinázást követően egészséges maradt, és nem ürített vakcina vírust a mandula váladékban; azonban neutralizáló ellenanyagok jelenlétét nem sikerült kimutatni. A virulens vírussal való felülfertőzést követően mindkét csoporthoz tartozó mindegyik vakcinázott állat a PRV betegség klinikai tüneteit mutatta. Az S-PRV-151 vírus három napos malacokban ártalmatlannak bizonyult ugyan, de ez a vírus nem hozott létre védettséget az állatokban.
• ·
3. példa
S-PRV-154
Az S-PRV-154 egy olyan álveszettség vírus, amely egy deléciót tartalmaz a TK génen belül a különösen hosszú régióban, deléciót hordoz az ismétlődő régióban, egy 1460 bázispár nagyságú deléciót tartalmaz a gl kódoló szakaszán belül, és egy 1414 bázispárból álló deléciót hordoz a gpX kódoló szakaszában. Az E. coli béta-galaktozidáz (lacZ gén) gént a gpX gén helyére inszertáltuk, és az a HCMV közvetlen korai promotere irányítása alatt áll.
Az S-PRV-154 vírust az S-PRV-002 vírusból (4 877 737 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, 1989. október 31.) állítottuk elő három közbülső vírus konstrukcióján ke.resztül. Az első közbülső vírus az S-PRV-070 volt. Ebben a ví.rusban az ismétlődő régión belül található Xbal hasítási helyeket (lásd 1. ábra) EcoRI hasítási helyekké alakítottuk, hogy lehetővé tegyük a következő lépésekben az egyéb helyeken található Xbal restrikciós helyek felhasználását. Ezt a KÖZVETLEN LIGÁLÁSOS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA fejezetben ismertetett eljárás segítségével a CTAGGAATTCC szintetikus oligonukleotidnak az S-PRV-002 vírus Xbal hasítási helyeire való inszertálásával hajtottuk végre. A második, S-PRV-146 nevezetű közbülső vírusban a béta-galaktozidáz marker génnel a gl deléciót iktattuk be. Ezt a 416-09.2H homológia vektor (lásd anyagok és módszerek), valamint az S-PRV-070 vírus felhasználásával végeztük a HOMOLÓG REKOMBINÁCIÓS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett eljárás szerint. A harmadik közbülső • · • ·« ··· 4 · · ·*·« ···· ·· ·· ·· W · ·♦·
- 33 vírus esetében (S-PRV-153) a béta-galaktozidáz marker gént (lacZ), Xbal enzimmel végzett emésztéssel eltávolítottuk a KÖZVETLEN LIGÁLÁSOS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett eljárás szerint. Végül az S-PRV-154 vírust a 436-86.32K homológia vektor (lásd anyagok és módszerek), valamint az S-PRV-153 vírus felhasználásával állítottuk elő HOMOLÓG REKOMBINÁCIÓS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett eljárás szerint. Az S-PRV-154 vírus szerkezetét BamHI, valamint Xbal enzimekkel végzett restrikciós enzim vizsgálatokkal igazoltuk.
4. példa
S-PRV-155
Az S-PRV-155 egy olyan álveszettség vírus, amely egy deléciót tartalmaz a TK génen belül a különösen hosszú régióban, deléciót hordoz az ismétlődő régióban, egy 1460 bázispár nagyságú deléciót tartalmaz a gl kódoló szakaszán belül, és egy 1414 bázispárból álló deléciót hordoz a gpX kódoló szakaszában. Az S-PRV-155 álveszettség vírust letétbe helyeztük a Mikroorganizmusok Szabadalmi Célból Történő Kölcsönös Letétbe Helyezéséről szóló Budapesti Eyezmény szerint az American Type Culture Collection Szabadalmi Lerakatában (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 U.S.A.) 1991 február 12.-én ATCC VR 2311 nyilvántartási szám alatt.
Az S-PRV-155 vírust az S-PRV-154 vírusból (lásd fent) a marker gén eltávolításával kaptuk. Ezt az S-PRV-154 vírus Xbal enzimmel való emésztésével értük el a KÖZVETLEN LIGÁLÁ« · a ·«· ♦ · « • · · · ··«« ·· · · ·· *· · * * ·
- 34 SOS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett eljárás szerint. Az S-PRV-155 vírus szerkezetét BamHI, valamint Xbal enzimekkel végzett restrikciós enzim vizsgálatokkal igazoltuk. A gpX, valamint a gl deléciók meglétét Southern lenyomat módszerrel igazoltuk az illető gének kódoló szakaszának megfelelő próbák segítségével.
A következő kísérletek arra utalnak, hogy az S-PRV-155 vírus alkalmazható vakcinaként álveszettség betegség ellen sertésekben védettség létrehozására, és a vad-típusú fertőzéstől megkülönböztethető immunválaszt vált ki.
Ebben a kísérletben háromnapos korú malacokat vakcináztunk az S-PRV-155 vírussal izomba adva, a következőkben ismertetettek szerint jártunk el: 6 malacot 103 plakképző egységet (PFU), 8 malacot 105 plakképző egységet, és 20 malacot 103'5 plakképző egységet tartalmazó vírussal oltottunk. A kísérletbe két, egyenként öt malacból álló kontroll csoportot is bevontunk. Az állatokat megfigyeltük, majd a VAKCINÁZÁSI VIZSGÁLATOK SERTÉSBEN című fejezetben ismertetettek szerint felülfertőztük őket (lásd 2. táblázat, lent).
«·« ·
C χφ μ i
N <0 fa a χΦ r-H
P
θ' cd Λί •d a •«M
Λ!
Φ μ φ a :3 μ
Háromnapos malacok vakcinázása S-PRV-155 vírussal és felülfertőzés virulens PRV-vel :3 fa φ
μ χΗ >
η χφ μ χΗ μ :3
| •d | |||
| 3 | |||
| χφ | Ό | ||
| μ | Ό | Γ-1 | |
| 3 | r-1 | Ρχ | |
| úti | σ> | ||
| <0 | Ν | μ | |
| χφ | Ρ | m | |
| Ρ | Φ | υ | |
| to | Ν | μ | χΗ |
| μ | η | -Η | Λ |
| Μ | 0 | μ | 0» |
| Φ | C | C | |
| <μ | φ | ||
| γΗ | <d | ||
| :3 | •Η | υ | |
| rH | Ό | χ | |
| Φ | λ | ||
| fa | 5 |
| C | Ό | Ό |
| Χφ | r-4 | Γ~Χ |
| μ | úti | a |
| 3 | Ν | θ' |
•ΗΛ
| η | μ | μ o | ||
| vd | N | φ | γΗ | |
| rH | Φ | φ | fa | |
| Úti | 0 | μ | θ' | |
| C | c | -H | ||
| •d | θ' | μ | ||
| υ | Φ | c | ο | |
| X | •H | Φ | X | |
| cd | Ό | Λ | ||
| > | θ' | |||
| 1 | C | |||
| μ | χφ | |||
| φ | μ | |||
| <H | 5 | |||
| r*4 | ||||
| :3 | Φ | |||
| <ti | «-4 | χφ | ||
| P | Φ | ,Ν | ||
| OD | fa | tö | ||
| Φ | μ | |||
| P | ||||
| •r| | ||||
| μ | CD | |||
| C | vd | |||
| Φ | N | |||
| Md | α | |||
| 8 | a | χφ | ||
| w | •*4 | μ | ||
| υ | 3 | |||
| Λ! | ||||
| Φ | ||||
| > |
Ο Φ
3χ§ rV Ν Φ φ
| Ο | Ο | Ο | ο | dP Ο αο |
| dP | dP | |||
| ο | ο | Ο | ο | Ο |
| Ο | Ο | |||
| rH | rH | |||
| dP | dP | dP | dP | dP |
| γΗ | CN | Ο | σ> | |
| CN | rH | ιη | <η | Γ* |
| dP | dP | dP | dP | dP |
| ω | Γ-* | Ο | Ο | Ο |
| «—< | ΓΊ | Ο | Ο | Ο |
| rH | γΗ | γ-1 | ||
| dP | dP | |||
| Η | Η | Ο | Ο | |
| 2 | 2 | 2 | ο | ο |
| r4 | Μ | |||
| Φ | Ρ | |||
| dP | dP | dP | dP | dP |
| r* | CN | Ο | Ο | Ο |
| Φ | Ο | σ\ | Ο | |
| «Η | γΗ | |||
| ο | Ο | Ο | ο | ο |
| ο | Ο | Ο | ο | ο |
| ο | Ο | ο | ο | ο |
| ο | Ο | ω | ω | |
| ω | ω | CN | Γ-< | CN |
| ω | ||||
| Γ- | ιη | CN | ’d* | CN |
| V | V | |||
| KD | 00 | ιη | ο | in |
| CN | ||||
| 3 | ||||
| Ρ | ||||
| 3 | 3 | Οι | ||
| Ρ | Ρ | |||
| Οι | Λ | (0 | ιη | CD |
| υ | o | |||
| ΓΟ | ιη | C | ω | C |
| ο | ο | ρ | ο | •*4 |
| 1—< | Η | C | Η | C |
Μ
Λ -Η
Ο Φ Μ (0 χφ Ρ χΗ θ' Ή Λ «5
Φ
| Ö> | φ | ||
| Φ rH +> | ·γ~ι & Φ | •Ρ | •Ρ |
| C | Φ | φ | |
| •H | ω | rH 'Φ | rH *Φ |
| a | χφ | θ' | 0> |
| «3 | Ν | ω | ω |
| -P | <Ο | Ν | Ν |
| P | •Ρ | •Η | •Η |
| χφ | Μ | > | > |
| ε | Φ Ή | * | φ |
| γ—1 | Φ | ω | |
| Φ | Λ | φ | |
| k | <—I | υ | W |
| Φ | Φ | Ό | C |
| +> | Μ-Ι | Ρ | •Η |
| •Η | Φ | Γ—1 | |
| Ρ | Φ | U | |
| <0 | Λ | 0 | Ό |
felülfertőzést követő 14. nap felülfertőzést követő 21. nap vírusra nézve pozitív orrváladék minták százalékos aránya.
• ·* «·· · · · ««·* ·«·· 4 < ·4 ·· ·· ····
Ennél a kísérletnél mindegyik vakcinázott állat egészséges maradt a vakcinázást követően, PRV ellenes szérum-neutralizáló ellenanyagokat termelt, és a mandula váladékban nem ürített vakcina vírust. Virulens vírussal való felülfertőzés után a három vakcinázott csoportba tartozó állatok egyike sem mutatta a PRV betegség tüneteit, míg a kontroll csoportba tartozó állatokban kifejlődtek a PRV betegség klinikai tünetei, és az egyik csoportnál 80 %-t ért el apusztulás.
A vakcinázott és felülfertőzött állatoktól vett szérum mintákat gX HerdChek, valamint a gl HerdChek és ClinEase vizsgálatokkal vizsgáltuk. A várakozásnak mefelelően az S-PRV-155 vírussal vakcinázott állatok a felülfertőzés napjáig szeronegatívok maradtak gpX-re és gl-re nézve. A vakcinázott állatok a vad-típusú vírussal való felülfertőzéskor a vakcinázás révén védettek voltak az álveszettség betegséggel szemben. A felülfertőző törzs azonban tünetmentesen felülfertőzte a vakcinázott állatokat, és ezért azt vártuk, hogy azok a fertőzést követően gpX, valamint gl ellenes ellenanyagokat termeljenek.
Amint azt a 2. táblázat mutatja, az S-PRV-155 vírussal vakcinázott állatok a vad-típusú vírussal való felülfertőzést követő ideig gpX-re és gl-re nézve negatívok maradtak. A felülfertőzést követő 14. nap körül megkezdődött a vakcinázott állatok szerokonvertálódása gpX-re és gl-re nézve. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az S-PRV-155 hatékony vakcina törzs, amely egy egyszerű szérum diagnosztikai eljárás segítségével lehetővé teszi a vakcinázott, valamint a vad-típusú vírussal fertőződött állatok megkülönböztetését.
• ••· ·· ·>♦ ·* ·· • · «· · · · * * • ·· *·· · · · « ν » · · · · «· ·· ·· ·· ····
5. példa
A következő kísérlet azt mutatja, hogy az inaktivált SPRV-155 vírus alkalmazható vakcinaként álveszettség betegség ellen sertésekben védettség létrehozására, és a vad-típusú fertőzéstől megkülönböztethető immunválaszt hoz létre. Öt fiatal szeronegatív malacot vakcináztunk egy alkalommal inaktivált S-PRV-155 vakcinával, és a VAKCINÁZÁSI VIZSGÁLATOK SERTÉSBEN című fejezetben ismertetettek szerint azokat felülfertőztük. Az inaktivált S-PRV-155 vakcina vírus koncentrációja adagonként 107'3 PFU volt (lásd 3. táblázat, alább).
- 38 O CM
in r* táblázat in in rd
O +> rd MO > •H •P 44 <0 G •H
Φ Ui M0
N Μβ c •H
O
Φ >
X o υ <o rH ti ε
Φ > I
(Λ C Φ rH
P •H >
ti +J <0 Φ 4J •«d •P c ti
Λί
O ti i—< ti X φ P Φ Ή fcl
4J U
Φ fa n *ti
N \ti c •r4
O Λ ti >
ti
N <0
ED 'ti
4J
β MŰ 4J
O rσ>
P P o N UÚ c -d υ Λ ni >
CM n
CM
V in
Φ
| >1 β Mtí Ρ Φ | ||
| Φ | ω | |
| > | 0 | |
| N | 44 | |
| Φ | Ό) | |
| •r-i | rd | |
| Φ | Φ | |
| Md | Ν | |
| •H | νο | |
| 44 | Ν ω | |
| C | Φ | |
| <0 | > | 44 |
| Λ | Ν | Μθ |
| M0 | Φ | Ρ |
| 44 | •ο | C |
| O | Φ | •Η |
| P | <Η | ε |
| a | •Η | |
| •H | 44 | 44 |
Φ C Ό >
| Ρ | φ Λ | Φ rd | Ν Φ |
| ω | 44 | Μβ | ·ΓΙ |
| νθ | ιφ | > | φ |
| Ρ | rd | Ρ | Md |
| Ή | Φ | Ρ | •Η |
| θ' | Ν | ο | 44 |
| Md | Μβ | ||
| Λ | Ν | > | C |
| ω | vd | Φ | |
| φ | Ρ | XI | |
| (0 | Η | Μβ | |
| Ρ | «0 | Ν | 44 |
| φ | Ό | 0 | 'Φ |
| Ρ | Ό | Οι | rd |
| •Η | rd | Φ | |
| -Ρ | «0 | Φ | Ν |
| Ρ | > | VC | |
| Λ | Ρ | Ν | Ν |
| 'Φ | φ | 'Φ | (/] |
| Ν | > | C | |
| :θ | C | 44 | |
| 44 | 0 | Φ | Ο |
| 44 | Ρ | -Ρ | |
| •Η | 0 | (Λ | Φ |
| C | Ρ | 3 | rd |
| φ | Φ | Ρ | rd |
| Ρ | Ν | Ή | 'Φ |
| Ρ | 10 | > | |
| 'φ | Ν | ||
| β | φ | Φ | Φ |
| φ | Λ | 0 | Ό |
A vakcinázott állatokban a vakcinázást követően PRV ellenes neutralizáló ellenanyagok termelődtek, azonban gpX, valamint gl ellenes ellenanyagok nem. A virulens vírussal való felülfertőzés után egy vakcinázott állat mutatott csupán egy napig tartó tájékozódási zavart. Mind az öt nem vakcinázott kontroliban kifejlődtek az álveszettség betegségre jellemző súlyos központi idegrendszeri tünetek. A felülfertőzést követően legalább a 21. napra a vakcinázott állatok szerokonverziót mutattak az egyik vagy mindkét diagnosztikus antigénre nézve. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az S-PRV-155 vírus inaktivált vakcinában alkalmazva védettséget hoz létre sertésekben az álveszettség megbetegedéssel szemben, és a fertőzött állatokétól megkülönböztethető immunválaszt vált ki.
6. példa
S-PRV-158
Az S-PRV-158 egy olyan álveszettség vírus, amely egy 1460 bázispár nagyságú deléciót tartalmaz a gl kódoló szakaszán belül, és egy 1414 bázispárból álló deléciót hordoz a gpX kódoló szakaszában. Az E. coli béta-galaktozidáz (lacZ gén) gént a gl gén helyére inszertáltuk, és az a HCMV közvetlen korai promoter irányítása alatt áll.
Az S-PRV-158 vírust az S-PRV-000 vírusból (ISU S62/26 PRV törzsből) állítottuk elő két közbülső vírus konstrukcióján keresztül. Az első közbülső vírus az S-PRV-156 volt. Ebben a az első S-PRV-156 nevezetű közbülső vírusban a béta-galaktozidáz marker génnel a gpX deléciót iktattuk be. Ezt a 436-86.32K homológia vektor (lásd anyagok és módszerek), valamint az S-PRV-000 vírus felhasználásával végeztük a HOMOLÓG REKOMBINÁCIÓS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett eljárás szerint. A második közbülső vírus esetében (S-PRV-157) a béta-galaktozidáz marker gént (lacZ) Xbal enzimmel végzett emésztéssel eltávolítottuk a KÖZVETLEN LIGÁLÁSOS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett eljárás szerint. Végül az S-PRV-158 vírust a 416-09.2H homológia vektor (lásd anyagok és módszerek), valamint az S-PRV-157 vírus felhasználásával állítottuk elő HOMOLÓG REKOMBINÁCIÓS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett eljárás szerint.
Az S-PRV-158 vírus szerkezetét BamHI, valamint Xbal enzimekkel végzett restrikciós enzim vizsgálatokkal igazoltuk.
7. példa
S-PRV-159
Az S-PRV-159 egy olyan álveszettség vírus, amely egy 1460 bázispár nagyságú deléciót tartalmaz a gl kódoló szakaszán belül, és egy 1414 bázispárból álló deléciót hordoz a gpX kódoló szakaszában.
Az S-PRV-159 vírust az S-PRV-158 vírusból (lásd fent) a marker gén eltávolításával kaptuk. Ezt az S-PRV-158 vírus Xbal enzimmel való emésztésével értük el a KÖZVETLEN LIGÁLÁSOS ELJÁRÁS REKOMBINÁNS PRV ELŐÁLLÍTÁSÁRA című fejezetben ismertetett eljárás szerint. Az S-PRV-159 vírus szerkezetét BamHI, valamint Xbal enzimekkel végzett restrikciós enzim vizsgálatokkal igazoltuk.
A találmány szerinti megoldást szemléltető példák összefoglalása
A találmány tárgyát genetikailag módosított herpesz vírusok alkalmazása képezi állatokban betegség elleni védettség létrehozására. Ezek a vírusok két glükoprotein, a gpX, valamint a gl glükoproteinek delécióját tartalmazzák. A
4. táblázat a fent ismertetett hat deléciót hordozó vírus jellemzőit foglalja össze. A vírus titereket a PRV TITRÁLÁSA című fejezetben ismertetettek szerint határoztuk meg. Az ártalmatlansági, valamint hatékonysági adatokat a VAKCINÁZÁSI KÍSÉRLETEK SERTÉSBEN című fejezetben leírtak szerint állapítottuk meg.
4. táblázat
| A gpX. valamint a al deléciót hordozó PRV vírusok | ||||
| jellemzői | ||||
| vírus; | titer; | vakcinázást követő | a felülfertőzést követő | |
| PFU/ml; | klinikai tünetek; | megfigyelések | ||
| klinikai | pusztulás | |||
| tünetek | ||||
| S-PRV-150 | 2,30x10® | NT | NT | NT |
| S-PRV-151 | 3,80x10® | nincs | 100 % | 20 % |
| S-PRV-154 | 1,53x10® | NT | NT | NT |
| S-PRV-155 | 1,48x10® | nincs | 0 % | 0 % |
| S-PRV-158 | 1,47x10® | NT | NT | NT |
| S-PRV-159 | 5,61x10® | NT | NT | NT |
- 42 Mind a hat vírus gpX, valamint gl deléciót tartalmaz. Az S-PRV-150 és az S—PRV-151 vírusokban található gpX deléciós régió nagyobb, mint az egyéb vírusokban található gpX deléciók nagysága. Az S-PRV-150, az S-PRV-151, az S-PRV-154, valamint az S-PRV-155 vírusok ugyancsak deléciót hordoznak a TK, valamint az ismétlődő régióban. Az S-PRV-150, az S-PRV154, valamint az S-PRV-158 vírusokban az E. coli béta-galaktozidáz (lacZ) marker gén is megtalálható.
Vizsgálatainkból kitűnik, hogy a deléciók pontos mérete és kombinációja lényeges a gpX, valamint a gl markereket tartalmazó megkülönböztető vakcinák hatékonysága szempontjából. Az S-PRV-150 és az S-PRV-151 vírusok lényegesen csökkent vírus titerrel rendelkeznek. A sejttenyészetekben előállítható vírus titer kritikus kérdés a vakcina előállítása szempontjából. Az S-PRV-150 és az S-PRV-151 vírusok alacsony titere vakcinaként való előállításukat, annak drágasága következtében akadályozza. Az S-PRV-155 és az S-PRV-151 vírusok a sertésekben PRV betegséggel szemben védettséget létrehozó képességük tekintetében is drámaian különböznek. Az S-PRV-151 elégtelen szintű védettséget, míg az S-PRV-155 vírus teljes védettséget hoz létre. Az S-PRV-155 vírusban található deléciók kombinációja felelős azért, hogy ez a vírus törzs kiváló vakcina termék. Ez a termék három napos korú malacokba adva ártalmatlan, védettséget hoz létre minden sertés korosztálynál, és egy, vagy két diagnosztikai marker felhasználásával szerológiai megkülönböztetést tesz lehetővé. A gyakorlat jelenlegi állása szerint váratlan volt a deléciók ilyen kombinációjának kiváló alkalmazhatósága. Az t
- 43 eredmények újak, előre nem láthatóak voltak, és segítséget nyújtanak egy kiváló álveszettség vakcina termék kiválasztásában.
• · «
Irodalomjegyzék
1. F. L. Graham and A. Van dér Eb., Virology 52, 556567, 1973.
2. T. Mániát is, et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1982.
3. M. van Zijl, et al., J. of Virology 71, 1747-1755,
1990.
4. T. J. Reá, et al., J. of Virology 54, 21-29, 1985.
5. E. A. Petrovskis, et al., J. of Virology 59, 216223, 1986.
6. E. A. Petrovskis, et al., J. of Virology 60, 185193, 1986.
7. Ε. A. Petrovskis, et al., J. of Virology 60, 11661169, 1986.
8. T. Ben-Porat and A. S. Káplán, Virology 41, 265-273, 1970.
9. T. Ben-Porat, et al., J. of Virology 49, 970-979, 1984.
10. T. Ben-Porat, et al., Virology 154, 325-334, 1986.
11. F. A. Ferrari, et al., J. of Bacteriology 161, 556- ' 562, 1985.
12. D. R. Thonsen, et al., Gene 16, 207-216, 1981.
13. R. W. Price and A. Kahn, Infection and Inununity 34, í 571-580, 1981.
• ·
I
14. Ρ. Β. Tenser, et al./ J. of Generál Virology 64, 1369-1373, 1983.
15. B. Lomniczi, et al., J. of Virology 49, 970-979, 1984.
16. B. Roizaan, et al., Cold Spring Harbor Conference on New Approaches to Viral Vaccines, September, 1983.
17. R. L. Thompson, et al., Virology 131, 180-192, 1983.
18. K. Fukuchi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 751-754, 1985.
19. J. M. Koomey, et al., J. of Virology 50, 662-665, 1984.
20. M. W. Ligás and D. C. Johnson, J. of Virology 62, 1486-1494, 1988.
21. F. Zuckerman, et al., Vaccination and Control of Adjeszky's Disease, pp. 107-117, Ed. J. van Oirschot. Kluwer, London, 1989.
22. T. C. Mettenleiter, et al., Virology 158, 141-146, 1987.
23. A. K. Robbins, et al., J. of Virology 58, 339-347,
1986.
24. A. K. Robbins, et al., J. of Virology 61, 2691-2701,
1987.
25. L. E. Post, et al., J. Repród. Fért. Suppl. 41, 97104, 1990.
Claims (17)
- Szabadalmi igénypontok1. Legyengített, S-PRV-155 jelű (ATCC nyilvántartási szám: VR 2311) genetikailag módosított álveszettség vírus.
- 2. Vakcina, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti legyengített vírus hatékony immunizáló mennyiségét és egy szokásos hordozóanyagot tartalmaz.
- 3. A 2. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a legyengített vírus inaktivált.
- 4. A 2. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a legyengített vírus élő.
- 5. A 2. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a hordozóanyag egy stabilizáló anyagot tartalmazó, fiziológiásán pufferolt tápfolyadék.
- 6. A 2. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a hatékony immunizáló mennyiség adagonként körülbelül103- 109 PFU.
- 7. A 6. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a hatékony immunizáló mennyiség adagonként körülbelül104- 106 PFU.
- 8. A 6. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a hatékony immunizáló mennyiség adagonként körülbelül 107-109 PFU.
- 9. Eljárás állatok immunizálására álveszettség vírus okozta megbetegedés ellen, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerinti vakcina hatékony immunizáló mennyiségét adagoljuk állatoknak.
- 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve.• · · · « « t> · · • ·« ·««· · · ·«·« ··»«- 47 hogy a vakcinát sertéseknek adagoljuk.
- 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vakcinát izomba, bőr alá, hasüregbe vagy vénába adott injekcióval adagoljuk.
- 12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vakcinát az orron át adagoljuk.
- 13. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vakcinát szájon át adagoljuk.
- 14. Eljárás a 2. igénypont szerinti vakcinával vakcinázott, valamint a természetben előforduló, vad-típusú álveszettség vírussal fertőzött állatok megkülönböztetésére, azzal jellemezve, hogy egy az állattól nyert testfolyadék mintát gpX-re, valamint legalább egy másik, a természetben előforduló, vad-típusú álveszettség vírussal fertőzött állatban normálisan expresszálódó antigénre nézve megvizsgálunk, és az antigén jelenléte és a gpX hiánya alapján megállapítjuk, hogy vakcinával vakcinázott és a természetben előforduló, vad-típusú álveszettség vírussal nem fertőzött állatról van-e szó.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antigén és a gpX jelenlétét a testfolyadékban az antigénre, valamint a gpX-re fajlagos ellenanyagok meghatározásával állapítjuk meg.
- 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintát gl-re nézve is vizsgáljuk, az antigén jelenléte és a gl hiánya alapján megállapítjuk, hogy vakcinával vakcinázott és a természetben előforduló, vad-típusú álveszettség vírussal nem fertőzött állatról van-e szó.··· · * · • ·
- 17. Eljárás a 2. igénypont szerinti vakcinával vakcinázott, valamint a természetben előforduló, vad-típusú álveszettség vírussal fertőzött állatok megkülönböztetésére, azzal jellemezve, hogy egy az állattól nyert testfolyadék mintát gl-re, valamint legalább egy másik, a természetben előforduló, vad-típusú álveszettség vírussal fertőzött állatban normálisan expresszálódó antigénre nézve megvizsgálunk, és az antigén jelenléte és a gpX hiánya alapján megállapítjuk, hogy vakcinával vakcinázott és a természetben előforduló, vad-típusú álveszettség vírussal nem fertőzött állatról van-e szó.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/663,413 US5240703A (en) | 1991-03-01 | 1991-03-01 | Attenuated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9302369D0 HU9302369D0 (en) | 1994-01-28 |
| HUT67138A true HUT67138A (en) | 1995-02-28 |
Family
ID=24661700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9302369A HUT67138A (en) | 1991-03-01 | 1992-02-28 | Attenvated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5240703A (hu) |
| EP (1) | EP0573614B1 (hu) |
| JP (1) | JP3247376B2 (hu) |
| KR (1) | KR100245654B1 (hu) |
| AT (1) | ATE165978T1 (hu) |
| AU (1) | AU1573292A (hu) |
| DE (1) | DE69225471T2 (hu) |
| DK (1) | DK0573614T3 (hu) |
| ES (1) | ES2118815T3 (hu) |
| GR (1) | GR3027623T3 (hu) |
| HU (1) | HUT67138A (hu) |
| WO (1) | WO1992015328A1 (hu) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5961982A (en) * | 1985-09-06 | 1999-10-05 | Syntro Corporation | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof |
| US5965138A (en) * | 1985-09-06 | 1999-10-12 | Syntro Corporation | Recombinant chimeric virus and uses thereof |
| US5928648A (en) * | 1985-09-06 | 1999-07-27 | Syntro Corporation | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof |
| US5240703A (en) * | 1991-03-01 | 1993-08-31 | Syntro Corporation | Attenuated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof |
| US5853733A (en) * | 1993-02-26 | 1998-12-29 | Syntro Corporation | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof |
| ATE288483T1 (de) * | 1992-07-30 | 2005-02-15 | Akzo Nobel Nv | Nicht-verbreitendes lebendes herpesvirusvakzin |
| EP0619840A1 (en) * | 1992-10-06 | 1994-10-19 | Akzo Nobel N.V. | Pseudorabies virus vaccine |
| US5738854A (en) * | 1992-10-06 | 1998-04-14 | Akzo Nobel N.V. | Pseudorabies virus vaccine |
| US6875856B2 (en) * | 1993-09-24 | 2005-04-05 | Syntro Corporation | Recombinant infectious laryngotracheitis virus and uses thereof |
| EP0659885A1 (en) * | 1993-12-21 | 1995-06-28 | Akzo Nobel N.V. | Vaccine against viruses associated with antibody-dependent-enhancement of viral infectivity |
| US7153510B1 (en) * | 1995-05-04 | 2006-12-26 | Yale University | Recombinant vesiculoviruses and their uses |
| ATE181112T1 (de) | 1995-08-09 | 1999-06-15 | Schweiz Serum & Impfinst | Dem genom von minussträngigen rna-viren entsprechende cdna und verfahren zur herstellung von infektiösen minussträngigen rna-viren |
| ATE512231T1 (de) | 1998-02-27 | 2011-06-15 | Univ Pennsylvania | Impfstoffe, immuntherapeutika und verfahren zur anwendung derselben |
| KR20010103788A (ko) * | 1999-03-03 | 2001-11-23 | 멕코나시 에블린 에이치. | 백신 및 유전자요법 조성물 및 이들의 제조 및 사용방법 |
| WO2000066162A1 (en) * | 1999-04-30 | 2000-11-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mutant human cd80 and compositions for and methods of making and using the same |
| WO2002006303A2 (en) * | 2000-07-14 | 2002-01-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Dna vaccines encoding hiv accessory proteins |
| AU2002211524B2 (en) * | 2000-10-04 | 2007-03-22 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Highly expressible genes |
| EP1390802A1 (en) * | 2001-04-27 | 2004-02-25 | Novartis AG | Automatic lens design and manufacturing system |
| WO2002100317A2 (en) | 2001-05-25 | 2002-12-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Targeted particles and methods of using the same |
| US7205398B2 (en) * | 2002-05-24 | 2007-04-17 | Schering-Plough Animal Health Corporation | Eta-1 gene and methods for use |
| NZ570709A (en) * | 2003-06-13 | 2010-04-30 | Univ Pennsylvania | Nucleic acid sequences encoding and compositions comprising IgE signal peptide and/or IL-15 and methods for using the same |
| EP1633372B1 (en) | 2003-06-13 | 2011-11-30 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Vaccines, immunotherapeutics and methods for using the same |
| WO2005024427A2 (en) * | 2003-09-09 | 2005-03-17 | Idexx Laboratories, Inc. | Detection of west nile virus infection and vaccination |
| US20080274140A1 (en) * | 2004-11-19 | 2008-11-06 | David B Weiner | Vaccines and Methods for Using the Same |
| CA2636867C (en) * | 2006-01-13 | 2015-12-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Vaccines and immunotherapeutics using codon optimized il-15 and methods for using the same |
| US9259463B2 (en) | 2006-01-16 | 2016-02-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Chlamydia vaccine |
| CA3184778A1 (en) | 2006-07-28 | 2008-01-31 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hiv consensus envelope sequences and methods for using same |
| CN105535961A (zh) * | 2008-04-04 | 2016-05-04 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 使用il-28和组合物的疫苗和免疫治疗及其使用方法 |
| JP5744719B2 (ja) * | 2008-04-04 | 2015-07-08 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | チクングニヤウィルスタンパク質の共通配列、これをコードする核酸分子、並びにこれを使用する組成物および方法 |
| US8921536B2 (en) | 2008-10-29 | 2014-12-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | HCV vaccines and methods for using the same |
| AU2008363596B2 (en) | 2008-10-29 | 2015-04-30 | Inovio Pharmaceuticals, Inc | Improved HCV vaccines and methods for using the same |
| US9050287B2 (en) | 2009-01-23 | 2015-06-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Vaccines for human papilloma virus and methods for using the same |
| CA2653478A1 (en) * | 2009-01-23 | 2010-07-23 | Gregg Martin | Automated wash system for industrial vehicles |
| CN102821790A (zh) | 2009-09-14 | 2012-12-12 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 包含IL-15受体α和/或编码IL-15受体α的核酸分子的疫苗和免疫治疗剂,以及其使用方法 |
| KR101851699B1 (ko) | 2009-11-02 | 2018-04-24 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 구제역 바이러스(ｆｍｄｖ) 공통 단백질, 이를 위한 코딩 서열 및 이로부터 만들어진 백신 |
| US8298820B2 (en) | 2010-01-26 | 2012-10-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom |
| CN102781952B (zh) | 2010-02-08 | 2015-09-02 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 编码rantes的核酸分子、包含其的组合物以及其使用方法 |
| ES2718846T3 (es) | 2010-11-12 | 2019-07-04 | Univ Pennsylvania | Antígenos de próstata consenso, molécula de ácido nucleico que los codifica y la vacuna y usos que los comprenden |
| CA2826199A1 (en) | 2011-01-31 | 2012-08-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleic acid molecules encoding novel herpes antigens, vaccine comprising the same, and methods of use thereof |
| US9238679B2 (en) | 2011-02-11 | 2016-01-19 | The Trustees Of The University Of Pennslyvania | Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same |
| EA037377B1 (ru) | 2011-02-11 | 2021-03-22 | Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания | Вакцина для индукции иммунного ответа на hbv |
| JP6117781B2 (ja) | 2011-07-11 | 2017-04-19 | イノビオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド | 交差防御性アレナウイルスワクチンおよびそれらの使用方法 |
| CA2848658C (en) | 2011-10-12 | 2022-08-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Vaccines for human papilloma virus and methods for using the same |
| WO2013062507A1 (en) | 2011-10-24 | 2013-05-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Improved hcv vaccines and methods for using the same |
| KR102277469B1 (ko) | 2011-12-12 | 2021-07-15 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 개선된 il-12 유전적 컨스트럭트 및 백신을 포함하는 조성물, 면역치료제 및 이를 이용하는 방법 |
| KR20140116095A (ko) | 2011-12-12 | 2014-10-01 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | Mrsa pbp2a 및 이의 단편들을 포함하는 단백질, 이를 인코딩한 핵산, 및 mrsa 감염을 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 그의 용도 |
| EP2836505B1 (en) | 2012-04-10 | 2019-01-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Human respiratory syncytial virus concensus antigens, nucleic acid constructs and vaccines made thereform, and methods of using same |
| WO2014165291A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Improved vaccines for human papilloma virus and methods for using the same |
| CN114045295A (zh) | 2013-03-15 | 2022-02-15 | 宾夕法尼亚大学理事会 | 口蹄疫病毒(fmdv)共有蛋白、其编码序列以及由其制造的疫苗 |
| AU2014228405B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-05-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Cancer vaccines and methods of treatment using the same |
| JP6236144B2 (ja) * | 2013-05-31 | 2017-11-22 | 普莱柯生物工程股▲ふん▼有限公司 | 豚ヘルペスウイルス、ワクチン組成物及びその製造方法と応用 |
| CN111560355A (zh) * | 2015-03-20 | 2020-08-21 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用 |
| CN106834236A (zh) * | 2016-02-23 | 2017-06-13 | 南京农业大学 | 猪伪狂犬病毒变异株TK、gE和gI基因缺失毒株及其应用 |
| CN107815441B (zh) * | 2017-08-31 | 2020-05-12 | 浙江大学 | 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用 |
| US11338029B2 (en) | 2017-12-13 | 2022-05-24 | Inovio Pharmaceuticals, Inc. | Cancer vaccines targeting PRAME and uses thereof |
| US11235044B2 (en) | 2017-12-13 | 2022-02-01 | Inovio Pharmaceuticals, Inc. | Cancer vaccines targeting MUC16 and uses thereof |
| EP3723810A4 (en) | 2017-12-13 | 2022-02-23 | Inovio Pharmaceuticals, Inc. | ANTI-MESOTHELIN CANCER VACCINES AND THEIR USES |
| MX2021005257A (es) | 2018-11-06 | 2021-06-18 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Composicion inmunogenica contra el subtipo h5 del virus de la influenza aviar. |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4769331A (en) * | 1981-09-16 | 1988-09-06 | University Patents, Inc. | Recombinant methods and materials |
| NL8303501A (nl) * | 1983-10-12 | 1985-05-01 | Centraal Diergeneeskundig Inst | Deletiemutant van een herpesvirus en vaccin, dat dit virus bevat. |
| US4514497B1 (en) * | 1983-12-30 | 1998-02-24 | Novagene Inc | Modified live pseudorabies viruses |
| EP0162738A1 (en) * | 1984-04-09 | 1985-11-27 | MOLECULAR GENETICS RESEARCH & DEVELOPMENT LIMITED PARTNERSHIP | Production of pseudorabies virus subunit vaccines |
| US5041370A (en) * | 1984-05-02 | 1991-08-20 | The Upjohn Company | Pseudorabies virus (PRV) gene, host cell, method for detecting animals infected with pseudorabies virus, and kit therefor |
| US5041536A (en) * | 1984-05-02 | 1991-08-20 | The Upjohn Company | Pseudorabies virus (PRV) gene |
| JP2559384B2 (ja) * | 1985-07-29 | 1996-12-04 | ジ・アップジョン・カンパニ− | ウイルスワクチン |
| US5068192A (en) * | 1986-01-27 | 1991-11-26 | Prutech Research And Development Partnership | Attenuated pseudorabies virus which includes foreign DNA encoding an amino acid sequence |
| US5047237A (en) * | 1985-09-06 | 1991-09-10 | Prutech Research And Development Partnership | Attenuated pseudorabies virus having a deletion of at least a portion of a gene encoding an antigenic, nonessential protein, vaccine containing same and methods of identifying animals vaccinated with the vaccine |
| US4877737A (en) * | 1985-09-06 | 1989-10-31 | Prutech Research And Development Partnership | Attenuated pseudorabies virus which has a deletion in at least a portion of a repeat sequence and vaccine containing same |
| AU623333B2 (en) * | 1986-01-27 | 1992-05-14 | Syntro Corporation | Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same |
| US4753884A (en) * | 1986-01-28 | 1988-06-28 | Novagene, Inc. | Pseudorabies virus mutants, vaccines containing same, methods for the production of same and methods for the use of same |
| US4711850A (en) * | 1986-01-28 | 1987-12-08 | Novagene, Inc. | Pseudorabies virus mutants, vaccines containing same, methods for the production of same and methods for the use of same |
| US4999296A (en) * | 1986-04-29 | 1991-03-12 | Novagene, Inc. | Thymidine kinase negative insertion mutants of pseudorabies virus and methods for the production of same |
| US5037742A (en) * | 1986-07-18 | 1991-08-06 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Pseudorabies virus recombinants and their use in the production of proteins |
| DE3854190T2 (de) * | 1987-07-27 | 1996-03-28 | Syntro Corp | Attenuierte herpesviren, herpesviren, die für eine aminosäuresequenz kodierende fremde dns beeinhalten und sie enthaltende impfstoffe. |
| US5004593A (en) * | 1989-04-17 | 1991-04-02 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Hexamethylmelamine formulation exhibiting reduced neurotoxicity |
| US5240703A (en) * | 1991-03-01 | 1993-08-31 | Syntro Corporation | Attenuated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof |
-
1991
- 1991-03-01 US US07/663,413 patent/US5240703A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-02-28 DE DE69225471T patent/DE69225471T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-28 DK DK92909287T patent/DK0573614T3/da active
- 1992-02-28 AT AT92909287T patent/ATE165978T1/de active
- 1992-02-28 AU AU15732/92A patent/AU1573292A/en not_active Abandoned
- 1992-02-28 ES ES92909287T patent/ES2118815T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-28 HU HU9302369A patent/HUT67138A/hu unknown
- 1992-02-28 JP JP50824092A patent/JP3247376B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-28 WO PCT/US1992/001634 patent/WO1992015328A1/en active IP Right Grant
- 1992-02-28 EP EP19920909287 patent/EP0573614B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-04-30 US US08/055,530 patent/US5451499A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-01 KR KR1019930702619A patent/KR100245654B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-01 US US08/456,509 patent/US5736319A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-08-11 GR GR980401801T patent/GR3027623T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100245654B1 (en) | 2000-03-02 |
| JP3247376B2 (ja) | 2002-01-15 |
| WO1992015328A1 (en) | 1992-09-17 |
| EP0573614A4 (en) | 1994-09-14 |
| US5451499A (en) | 1995-09-19 |
| HU9302369D0 (en) | 1994-01-28 |
| JPH06505392A (ja) | 1994-06-23 |
| DK0573614T3 (da) | 1999-01-25 |
| DE69225471T2 (de) | 1999-01-14 |
| EP0573614A1 (en) | 1993-12-15 |
| ATE165978T1 (de) | 1998-05-15 |
| DE69225471D1 (de) | 1998-06-18 |
| US5736319A (en) | 1998-04-07 |
| EP0573614B1 (en) | 1998-05-13 |
| GR3027623T3 (en) | 1998-11-30 |
| ES2118815T3 (es) | 1998-10-01 |
| US5240703A (en) | 1993-08-31 |
| AU1573292A (en) | 1992-10-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT67138A (en) | Attenvated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof | |
| US5187087A (en) | Recominbant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof | |
| US5223424A (en) | Attenuated herpesviruses and herpesviruses which include foreign DNA encoding an amino acid sequence | |
| EP0332677B1 (en) | Attenuated herpes viruses, herpes viruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccines containing same | |
| JPH10506782A (ja) | 組換え型シチメンチョウヘルペスウイルス、及びその使用 | |
| JP2000512844A (ja) | ベクターとして鳥類の感染性喉頭気管炎ウイルスを用いた鳥類用組換え生ワクチン | |
| US5741696A (en) | Recombinant equine herpesviruses | |
| JP2010187679A (ja) | 新規な組換えヘルペスウイルスおよび変異体ヘルペスウイルス | |
| JPH08500969A (ja) | 七面鳥の組換えヘルペスウイルス及びそれらの使用 | |
| HUT55243A (en) | Process for producing recombinant subunite vaccine against pseudolyssa | |
| CA2166371A1 (en) | Avian herpesvirus-based live recombinant avian vaccine, in particular against gumboro disease | |
| US5593873A (en) | Recombinant infectious bovine rhinotracheitis virus | |
| US5047237A (en) | Attenuated pseudorabies virus having a deletion of at least a portion of a gene encoding an antigenic, nonessential protein, vaccine containing same and methods of identifying animals vaccinated with the vaccine | |
| US5874279A (en) | Recombinant infectious bovine rhinotracheitis virus | |
| US5731188A (en) | Recombinant equine herpesviruses | |
| ZA200210354B (en) | BVDV virus-like particles. | |
| JP3964458B2 (ja) | 組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスおよびその使用 | |
| EP0654089B1 (en) | Recombinant equine herpesviruses | |
| JP3529134B2 (ja) | 組換えネコヘルペスウイルスのベクターワクチン | |
| US5068192A (en) | Attenuated pseudorabies virus which includes foreign DNA encoding an amino acid sequence | |
| CA2113641A1 (en) | Recombinant infectious bovine rhinotracheitis virus | |
| US5783195A (en) | Recombinant infectious bovine rhinotracheitis virus S-IBR-052 and uses thereof | |
| US6225111B1 (en) | Recombinant equine herpesviruses | |
| JPH03228680A (ja) | 感染性気管支炎ウイルスワクチン | |
| JPH09505726A (ja) | 組換え感染性喉頭気管炎ウイルス及びそれらの使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC4 | Cancellation of temporary protection due to refusal |