EA026926B1 - Композиции, содержащие улучшенные генетические конструкции il-12, вакцины, иммунотерапевтические составы и способы их применения - Google Patents

Композиции, содержащие улучшенные генетические конструкции il-12, вакцины, иммунотерапевтические составы и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA026926B1
EA026926B1 EA201491171A EA201491171A EA026926B1 EA 026926 B1 EA026926 B1 EA 026926B1 EA 201491171 A EA201491171 A EA 201491171A EA 201491171 A EA201491171 A EA 201491171A EA 026926 B1 EA026926 B1 EA 026926B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
acid sequence
subunit
homologous
Prior art date
Application number
EA201491171A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491171A1 (ru
Inventor
Дэвид Б. Уэйнер
Мэттью П. Морроу
Цзянь Янь
Original Assignee
Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания filed Critical Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания
Publication of EA201491171A1 publication Critical patent/EA201491171A1/ru
Publication of EA026926B1 publication Critical patent/EA026926B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001136—Cytokines
    • A61K39/00114—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55538—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10171—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

В изобретении представлены молекулы нуклеиновых кислот и композиции, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую субъединицу р35 IL-12 или ее функциональный фрагмент, и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую субъединицу р40 IL-12 или ее функциональный фрагмент. Описаны также молекулы нуклеиновых кислот, дополнительно содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуноген. Предложены способ модулирования иммунного ответа и способы индуцирования иммунного ответа против иммуногена. Приведены также способы проведения вакцинации с терапевтической и профилактической целями.

Description

Данное изобретение относится к улучшенным генетическим конструкциям, кодирующим интерлейкин-12 (1Б-12) человека и молекулы нуклеиновых кислот, содержащие его последовательность. Данное изобретение также относится к улучшенным векторам экспрессии, вакцинам и иммунотерапевтическим составам, включающим нуклеотидные последовательности, кодирующие 1Б-12 человека, а также способы их применения.
Предпосылки создания изобретения
Применение иммунотерапии касается модулирования иммунного ответа пациента для получения желаемого терапевтического ответа. Иммунотерапевтические препараты относятся к таким композициям, которые при назначении пациенту обеспечивают модуляцию иммунной системы пациента в степени, достаточной для снижения в перспективе проявления симптомов, связанных с нежелательными иммунологическими реакциями или, в конечном счете, для облегчения симптомов путем увеличения благоприятных иммунологических реакций. В некоторых случаях иммунотерапия является частью протокола вакцинации, при котором пациенту назначают вакцину, передающую пациенту иммуноген, против которого организм пациента генерирует иммунный ответ. В таких случаях иммунотерапевтические средства повышают иммунный ответ и/или избирательно улучшают тип этого ответа (такой как клеточный или гуморальный тип иммунного ответа), который способствует лечению или предотвращению развития патологического состояния, инфекции или заболевания.
При разработке вакцин было установлено, что вакцины, обеспечивающие синтез антигеновмишеней в клетках вакцинированных людей, являются эффективными при индукции клеточного типа ответа иммунной системы. В частности, каждая из живых аттенуированных вакцин, рекомбинантых вакцин, в которых используются авирулентные векторы и ДНК-вакцины, приводит к продукции антигенов в клетках вакцинированных пациентов, что в результате обеспечивает индуцирование клеточного типа ответа иммунной системы. С другой стороны, убитые или инактивированные вакцины и субъединичные вакцины, которые состоят только из белков, не индуцируют надлежащих клеточных иммунологических реакций, тем не менее, они действительно индуцируют эффективный гуморальный ответ.
Получение клеточного иммунного ответа часто является необходимым для обеспечения защиты от патогенной инфекции и для обеспечения эффективной иммуно-опосредованной терапии для лечения патогенной инфекции, раковых или аутоимунных заболеваний. Следовательно, часто предпочтительным является применение вакцин, которые обеспечивают продукцию антигенов-мишеней в клетках вакцинированных пациентов, такие как живые аттенуированные вакцины, рекомбинантые вакцины, в которых используются авирулентные векторы и ДНК-вакцины.
Существует необходимость в разработке подходов для вакцинирования, которые способны создавать у людей сильный Т- и В-клеточный иммунитет. Недавние опасения, связанные с аттенуированием, сложностями производства вакцин, серологической интерференцией, которые наблюдали при проведении клинического исследования §ТЕР лечения ВИЧ (Ηΐν), среди массы других проблем приводят к недооценке этого важного вопроса. При использовании в качестве моделей нечеловекообразных приматов и при проведении клинических испытаний на людях простые плазмидные ДНК, использованные как платформа для получения вакцин, не приводили к индукции уровней иммуногенности, достаточных для того, чтобы поддержать предпринятые усилия их коммерческих разработок. При прямом сравнительном исследовании некоторые вакцины, основанные на чистых плазмидах, не обеспечили индуцирование клеточного или гуморального ответа по сравнению с ответом, который индуцировали их аналоги на основе вирусных векторов, включая обычно используемую платформу на основе аденовируса, серотипа 5 (Ά65).
Разработка технологии получения ДНК вакцин как отдельно стоящего метода вакцинации, а также их использования в действующих платформах для прайм-буст вакцин, принесет преимущество при разработке подходов для повышения их иммунной активности. Сообщалось, что манипуляции с кодонами и кодирующими РНК-последовательностями, а также изменения лидерных последовательностей усиливали экспрессию иммуногенов, которые кодировались плазмидами. В дополнение этого, предпринимаются попытки создания консенсусных иммуногенов, которые направлены на потребности расширения спектра иммунологического охвата, принимая во внимание в частности разнообразие вирусов.
Кроме того, внедряются другие стратегии, которые фокусируются на улучшении физической доставки ДНК-плазмид путем улучшения рецептуры лекарственных средств и применения аппаратноуправляемых технологий. Как сообщалось, ДНК-вакцины, доставленные с помощью электропорации (ЭП), усилили антиген-специфическую продукцию интерферона-гамма (ΐΡΝγ) после иммунизации макак резус с помощью плазмидных ДНК.
Другой важной областью этого специального исследования является тот факт, что совместная доставка молекулярных адъювантов, кодированных плазмидами, привела к увеличению индуцированных вакцинами ответов. Одним из наилучше охарактеризованных молекулярных адъювантов у нечеловекообразных приматов является 1Ь-12 - ТН1-поляризующий цитокин, который стимулирует реакции цитотоксических Т-лимфоцитов (СТЬ), обеспечивая передачу третьего сигнала, необходимого для эффективной активации и антиген-специфического развития первичных СИ8+ Т-клеток. Молекула 1Ь-12 представляет собой гомодимер, который содержит две субъединицы: р35 и р40. Было показано, что он явля- 1 026926 ется цитокином с наиболее впечатляющим спектром повышения активности иммунной системы, особенно для стимулирования СЭ8 Т-клеток при его использовании как ДНК-вакцины. В исследовании на макаках было показано, что 1Ь-12 был адъювантом, проявившим высокую активность для расширения интенсивности клеточного иммунного ответа ДНК-вакцин, направленного против многих антигенов. Как в случае применения для макак, так и для людей такой адъювант ДНК-вакцин может значительно улучшить иммунные реакции, индуцированные ДНК-вакцинами.
Патент США № 5723127, содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки, раскрывает информацию об Ш-12 как об адъюванте вакцин. Заявка на РСТ (Договор о патентной кооперации) № РСТ/и81997/019502 и соответствующая заявка США серийный № 08/956865, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки, раскрывает информацию о ДНК-вакцинах и ДНК-конструкциях, содержащих кодирующие Ш-12 последовательности.
Сохраняется необходимость улучшения вакцин и иммунотерапевтических препаратов. Существует потребность в композициях и способах, обеспечивающих усиление иммунных реакций. Аналогично, если некоторые иммунотерапевтические средства полезны для модулирования иммунного ответа у пациентов, сохраняется необходимость улучшения иммунотерапевтических композиций и способов их использования. Сохраняется необходимость улучшения конструкций, которые кодируют Ш-12 и могут использоваться как часть подходов при применении ДНК-вакцин. Сохраняется необходимость улучшения конструкций, которые кодируют Ш-12 и могут использоваться как иммунотерапевтические препараты. Сохраняется необходимость улучшения конструкций, которые кодируют Ш-12 и могут использоваться для достижения высоких уровней экспрессии Ш-12.
Краткое описание изобретения
Предложены композиции, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р35 Ш-12 или ее функциональный фрагмент, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р40 Ш-12 или ее функциональный фрагмент. Последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют субъединицу р35 Ш-12, могут быть по меньшей мере на 98% гомологичны последовательности 8ЕЦ ГО № 1 и кодировать белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности 8ЕЦ ГО № 2. Последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют функциональный фрагмент субъединицы р35 ГО-12, могут быть фрагментами последовательности нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 98% гомологичны последовательности 8ЕЦ ГО № 1 и кодируют белок, по меньшей мере на 98% гомологичный функциональному фрагменту последовательности 8ЕЦ ГО № 2. Последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют субъединицу р40 ГО12, могут быть по меньшей мере на 98% гомологичны последовательности 8ЕЦ ГО № 3 и кодировать белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности 8ЕЦ ГО № 4. Последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют функциональный фрагмент субъединицы р40 ГО-12, могут быть фрагментами последовательности нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 98% гомологичны последовательности 8ЕЦ ГО № 3 и кодируют белок, по меньшей мере на 98% гомологичный функциональному фрагменту последовательности 8ЕЦ ГО № 4. Вещества могут дополнительно содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуноген.
Предложен также способ модулирования иммунного ответа. Этот способ включает стадию назначения пациенту состава, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р35 ГО-12 или ее функциональный фрагмент, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р40 ГО-12 или ее функциональный фрагмент.
Предложен также способ индуцирования иммунного ответа против иммуногена. Этот способ включает стадию назначения пациенту состава, который кодирует субъединицу р35 ГО-12 или ее функциональный фрагмент, и последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р40 ГО12 или ее функциональный фрагмент, в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуноген в достаточном количестве. Эти способы индуцирования иммунного ответа против иммуногена могут быть частью способов индуцирования терапевтического иммунного ответа или способов индуцирования профилактического иммунного ответа.
Краткое описание графического материала
Фиг. 1А и 1В иллюстрируют графики сравнения уровней экспрессии в клетках ГО-12 человека (НиГО12) после трансфекции с помощью генетических конструкций в количестве 2 мкг НиГО12-ор1 (оптимальной) или НиГО-12-ηοηορΙ (неоптимальной) (фиг. 1А) или в количестве 4 мкг НиГО12-ор1 или НиГО12-поиор1 (фиг. 1В).
Фиг. 2 иллюстрирует увеличение специфических клеточных иммунных реакций на антигены Р8А (специфический антиген простаты) и Р8МА (простатический специфический мембранный антиген) у макак резусов.
Фиг. 3 иллюстрирует увеличение специфических клеточных иммунных реакций на коровый и поверхностный антигены вируса гепатита В (ВГВ) у макак резусов.
Подробное описание предпочтительного осуществления изобретения
В одном из аспектов изобретения желательно, чтобы улучшенные конструкции ГО-12 обеспечивались средствами для улучшенной транскрипции и трансляции, включая наличие одного или большего
- 2 026926 количества следующих элементов: низкое содержание нуклеотидов ОС в лидерной последовательности для усиления транскрипции, стабилизация мРНК и оптимизация кодонов, удаление, насколько возможно, цис-активных фрагментов последовательности (например, внутренних ТАТА-боксов).
В некоторых аспектах изобретения в схему вакцинации желательно включить улучшенные конструкции 1Ь-12 или как часть состава вакцины или как отдельный состав, вводимый согласованно с вакциной для того, чтобы создать расширенный иммунный ответ против антигенов вакцины. В некоторых аспектах изобретения желательно использование улучшенных конструкций 1Ь-12 как иммунотерапевтических средств, которые могут быть использованы для модулирования у пациентов иммунных реакций. В некоторых аспектах изобретения желательно обеспечить использование улучшенных конструкций 1Ь-12 для того, чтобы обеспечить экспрессию векторов, которые могут быть использованы для получения высоких уровней экспрессии 1Ь-12.
В данной заявке приводятся высокоактивные генные адъюванты 1Ь-12. Эти новые адъюванты обладают несколькими преимуществами перед предыдущими молекулами 1Ь-12. Улучшенная лидерная последовательность способствует секреции молекул, а также обеспечивает улучшение загрузки рибосом, таким образом, расширяется влияние этих адъювантов и усиливается экспрессия. Значительные изменения последовательностей РНК впоследствии удаляют гомологию синтезированных белков к природным последовательностям 1Ь-12, таким образом, предотвращая интерференцию между вводимым адъювантом и иммунной системой хозяина, а также снижая возможные разрушительные взаимодействия между последовательностями 1Ь-12 хозяина и доставляющими гены молекулами. Более того, высокая активность новых конструкций снижает требуемые дозы, что, таким образом, благоприятно сказывается на вопросах производства и обеспечения введения, связанных с такими адъювантами. Наконец, так как такие молекулы имеют более высокую биологическую активность, то они улучшают показатели эффективности вакцины при применении ίη νίνο. В общей сложности эти конструкции являются важными новыми инструментами, как для вакцинации, так и для применения для иммунотерапии.
Определения.
Терминология, использованная в этой заявке, применяется только с целью описания особых вариантов осуществления изобретения и не претендует на исчерпывающее описание. Как принято в описании и приложенных пунктах формулы изобретения, единственные формы слов включают множество определяемых объектов, если только в контексте четко не указано иное.
При перечислении в настоящей заявке числовых диапазонов каждое промежуточное число, находящееся в них имеет такую степень точности как явно предусмотрено. Например, для диапазона 6-9, числа 7 и 8 подразумеваются как дополняющие 6 и 9. И для диапазона 6.0-7.0, числа 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; 6,5; 6,6; 6,7; 6,8; 6,9 и 7,0 являются явно предусмотренными.
Адъювант.
Адъювант, как используется в этой заявке, может означать молекулу, включая молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, обладающий иммуномодулирующей активностью, добавляемый к ДНК-плазмидным или другим вакцинам для усиления иммуногенных свойств одного или более антигенов, кодируемых ДНК-плазмидами или вакцинами и последовательностями нуклеиновых кислот, которые кодируют адъюванты белок, описанный в дальнейшем в этой заявке.
Антитело.
Антитело может обозначать антитела классов 1дО, 1дМ, 1дА, ί§Ό или ί§Ε или их фрагменты, фрагменты или их производные, включая РаЪ, Р(аЪ')2, Рй и одноцепочечные антитела, димеры антител, биспецифические антитела, бифункциональные антитела и их производные. Это антитело может быть антителом, изолированным из образца сыворотки млекопитающего, поликлональным антителом, аффинно-очищенным антителом или их смесью, которые проявляют достаточную специфичность связывания необходимого эпитопа, или последовательностью, из которой оно походит.
Кодирующая последовательность.
Кодирующая последовательность или кодирующая нуклеиновая кислота при использовании в этой заявке подразумевают нуклеиновую кислоту (молекула РНК или ДНК), которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок. Эта кодирующая последовательность может дополнительно содержать сигналы инициации и терминации, функционально присоединенные к регуляторным элементам, включающим промотор и сигнал полиаденирования, отвечающие за направление экспрессии в клетках человека или млекопитающих, которым назначается эта нуклеиновая кислота.
Комплементарность.
Комплементарность или комплементарный, используемые в этой заявке, обозначают правила образования пар оснований между нуклеотидами или нуклеотидными аналогами молекул нуклеиновых кислот как предложено Уотсоном-Криком (например, А-Т/и и С-О) и Хугстином.
Постоянный ток.
Постоянный ток используется в этой заявке для обозначения тока, который получают или которому подвергаются ткани или клетки, обозначающие указанные ткани, в течение длительности электрического импульса, передаваемого такой ткани. Электрический импульс поступает из устройств для электропорации, описанных в настоящей заявке. В течение продолжительности электрического импульса
- 3 026926 этот ток сохраняет постоянную силу для указанных тканей, потому что предложенное в данной заявке устройство для электропорации обладает элементом обратной связи, преимущественно обеспечивающем постоянную обратную связь. Элемент обратной связи может измерять сопротивление тканей (или клеток) на протяжении длительности импульса и обуславливает изменение выходной электрической мощности устройства для электропорации (например, увеличением напряжения). Таким образом, сила электрического тока в этой ткани остается постоянной в продолжение электрического импульса (порядка микросекунд) или от импульса к импульсу. В некоторых вариантах осуществления изобретения элемент обратной связи включает контроллер.
Ток обратной связи или обратная связь.
Ток обратной связи или обратная связь, как используется в настоящей заявке, применяются взаимозаменяемо и обозначают активный отклик предложенных устройств для электропорации, который включает измерение силы тока между электродами в ткани и изменение выходной мощности, подаваемой устройством для ЭП соответственно для того, чтобы поддерживать силу тока на постоянном уровне. Перед началом подачи последовательности импульсов или лечения с помощью электричества этот постоянный уровень силы тока устанавливается пользователем. Обратная связь осуществляется компонентом для электропорации, например, контроллером, устройства для электропорации, так как электрический контур в нем способен постоянно проводить мониторинг электрического тока между электродами в ткани и сравнивать наблюдаемую силу тока (или ток в ткани) с предустановленной силой тока и постоянно проводить регулирование выходной мощности для поддержания наблюдаемой силы тока на предустановленных уровнях. Петля обратной связи может реагировать немедленно, так как является аналоговой обратной связью с закрытым контуром.
Децентрализованный ток.
Децентрализованный ток используется в настоящей заявке для обозначения набора электрических токов подаваемых из различных решеток игольчатых электродов устройств для электропорации, описанных в настоящей заявке, в отношении которых эти наборы минимизируют, или предпочтительнее ликвидируют, появления при электропорации соответствующего теплового стресса на каком-либо участке ткани, подвергаемого электропорации.
Электропорация.
Электропорация (ЭП), электропермеабилизация или электрокинетическое усиление используются в настоящей заявке взаимозаменяемо и касаются использования трансмебранного импульса электрического поля для индуцирования микроскопических проходов (пор) в биомембране. Их присутствие позволяет таким биомолекулам как плазмиды, олигонуклеотиды, миРНК (δίΚΝΆ), лекарственным препаратам, ионам и воде проходить с одной стороны клеточной мембраны на другую.
Механизм обратной связи.
Механизм обратной связи, используемый в настоящей заявке, относится к процессу, выполняемому или программным обеспечением, или аппаратными средствами (или программно-аппаратными средствами), которые обрабатывают процессы получения и сравнения значений импеданса интересующих тканей (перед, во время и/или после получения импульса энергии) с данным значением, преимущественно силы тока, и регулируют импульс энергии, подаваемый для получения предустановленного значения. Механизм обратной связи может быть выполнен петлей с аналоговым закрытым контуром.
Фрагмент.
Фрагмент, как используется в настоящей заявке, обозначает часть нуклеиновой кислоты или нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, обладающий свойством вызывать иммунный ответ у млекопитающих в основном подобный тому, что вызывает нефрагментированная молекула. Фрагментами могут быть ДНК-фрагменты, выбранные из фрагментов последовательности §Е0 ГО № 1, фрагментов последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности §Е0 ГО № 1 и кодирует функциональные фрагменты белка, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности §Е0 ГО № 2; фрагментов последовательности §Е0 ГО № 3 и фрагментов последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности §Е0 ГО № 3 и кодирует функциональные фрагменты белка, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности §Е0 ГО № 4.
ДНК-фрагменты последовательности §Е0 ГО № 1, фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 98% гомологичны последовательности §Е0 ГО № 1 и кодируют функциональные фрагменты белка, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности §Е0 ГО № 2, способной кодировать полипептиды длиной 50 или более, 55 или более, 60 или более, 65 или более, 70 или более, 75 или более, 80 или более, 85 или более, 90 или более, 95 или более, 100 или более, 105 или более, 110 или более, 115 или более, 120 или более, 125 или более, 130 или более, 135 или более, 140 или более, 145 или более, 150 или более, 155 или более, 160 или более, 165 или более, 170 или более, 175 или более, 180 или более, 185 или более, 190 или более, 195 или более, 200 или более, 205 или более, 210 или более, 215 или более аминокислот последовательности §Е0 ГО № 2 или белок, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности §Е0 ГО № 2. ДНК-фрагменты последовательности §Е0 ГО № 1, фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на
- 4 026926
98% гомологичны последовательности 8ЕЦ ΙΌ № 1 и кодируют функциональные фрагменты белка, который содержит менее 53, менее 58, менее 63, менее 68, менее 73, менее 78, менее 83, менее 88, менее 93, менее 98, менее 103, менее 108, менее 113, менее 118, менее 123, менее 128, менее 133, менее 138, менее 143, менее 148, менее 153, менее 158, менее 163, менее 168, менее 173, менее 178, менее 183, менее 188, менее 193, менее 198, менее 203, менее 208, менее 213 или менее 218 аминокислот в длину последовательности 8ЕЦ ГО № 2 или белок, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности 8ЕЦ ГО № 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности 8ЕЦ ГО № 1 и кодирует функциональные фрагменты белка, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности 8ЕЦ ГО № 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности 8ЕЦ ГО № 1 и кодирует функциональные фрагменты белка, который по меньшей мере на 99% гомологичен последовательности 8ЕЦ ГО № 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности 8ЕЦ ГО № 1 и кодирует функциональные фрагменты последовательности 8ЕЦ ГО № 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 99% гомологична последовательности 8ЕЦ ГО № 1 и кодирует функциональные фрагменты белка, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности 8ЕЦ ГО № 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 99% гомологична последовательности 8ЕЦ ГО № 1 и кодирует функциональные фрагменты белка, который по меньшей мере на 99% гомологичен последовательности 8ЕЦ ГО № 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 99% гомологична последовательности 8ЕЦ ГО № 1 и кодирует функциональные фрагменты последовательности 8ЕЦ ГО № 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагменты являются фрагментами последовательности 8ЕЦ ГО № 1, которые кодируют функциональные фрагменты последовательности 8ЕЦ ГО № 2.
ДНК-фрагменты последовательности 8ЕЦ ГО № 3, фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 98% гомологичны последовательности 8ЕЦ ГО № 3 и кодируют функциональные фрагменты белка, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности 8ЕЦ ГО № 4, способной кодировать полипептиды длиной 50 или более, 55 или более, 60 или более, 65 или более, 70 или более, 75 или более, 80 или более, 85 или более, 90 или более, 95 или более, 100 или более, 105 или более, 110 или более, 115 или более, 120 или более, 125 или более, 130 или более, 135 или более, 140 или более, 145 или более, 150 или более, 155 или более, 160 или более, 165 или более, 170 или более, 175 или более, 180 или более, 185 или более, 190 или более, 195 или более, 200 или более, 205 или более, 210 или более, 215 или более, 220 или более, 225 или более, 230 или более, 235 или более, 240 или более, 245 или более, 250 или более, 255 или более, 260 или более, 265 или более, 270 или более, 275 или более, 280 или более, 285 или более, 290 или более, 295 или более, 300 или более, 310 или более, 315 или более, 320 или более, 325 или более аминокислот последовательности 8ЕЦ ГО № 4 или белок, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности 8ЕЦ ГО № 4. ДНК-фрагменты последовательности 8ЕЦ ГО № 3 и фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 98% гомологичны последовательности 8ЕЦ ГО № 3 и способны кодировать функциональные фрагменты, которые содержат менее 53, менее 58, менее 63, менее 68, менее 73, менее 78, менее 83, менее 88, менее 93, менее 98, менее 103, менее 108, менее 113, менее 118, менее 123, менее 128, менее 133, менее 138, менее 143, менее 148, менее 153, менее 158, менее 163, менее 168, менее 173, менее 178, менее 183, менее 188, менее 193, менее 203, менее 208, менее 213, менее 218, менее 223, менее 228, менее 233, менее 238, менее 243, менее 248, менее 253, менее 258, менее 263, менее 268, менее 273, менее 278, менее 283, менее 288, менее 293, менее 298, менее 303, менее 308, менее 313, менее 318, менее 323 или менее 328 аминокислот последовательности 8ЕЦ ГО № 4 или белок, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности 8ЕЦ ГО № 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности 8ЕЦ ГО № 3 и кодирует функциональные фрагменты белка, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности 8ЕЦ ГО № 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности 8ЕЦ ГО № 3 и кодирует функциональные фрагменты белка, который по меньшей мере на 99% гомологичен последовательности 8ЕЦ ГО № 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности 8ЕЦ ГО № 3 и кодирует функциональные фрагменты последовательности 8ЕЦ ГО № 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 99% гомологична последовательности 8ЕЦ ГО № 3 и кодирует функциональные фрагменты белка, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности 8ЕЦ ГО № 4. В некоторых вариантах осуществления
- 5 026926 изобретения предлагаются фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 99% гомологична последовательности 8ЕО ГО № 3 и кодирует функциональные фрагменты белка, который по меньшей мере на 99% гомологичен последовательности 8ЕО ГО № 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 99% гомологична последовательности 8ЕО ГО № 3 и кодирует функциональные фрагменты последовательности 8ЕО ГО № 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагменты являются фрагментами последовательности 8ЕО ГО № 3, которые кодируют функциональные фрагменты последовательности 8ЕО ГО № 4.
ДНК-фрагменты могут не содержать кодирующих последовательностей для сигнального пептида ГО-12. ДНК-фрагменты могут включать кодирующие последовательности сигнальных пептидов иммуноглобулинов таких как последовательности сигнальных пептидов 1дЕ или 1дС. Так, например ДНКфрагменты, которые кодируют субъединицу р35 ГО-12 не кодируют аминокислоты 1-22 последовательности 8ЕО ГО № 2, и в некоторых таких вариантах осуществления изобретения могут включать последовательности, кодирующие сигнальные пептиды иммуноглобулинов, такие как последовательность сигнальных пептидов 1дЕ (8ЕО ГО № 5) или 1дС.
Фрагмент также может относиться к полипептидным фрагментам, способным в основном функционировать подобно полноразмерным полипептидам. Фрагмент р35 ГО-12 может быть фрагментом последовательности 8ЕО ГО № 2 или фрагментом полипептида, который по меньшей мере на 98% гомологичен фрагменту последовательности 8ЕО ГО № 2. Фрагмент р35 ГО-12 может быть фрагментом полипептида, который по меньшей мере на 99% гомологичен фрагменту последовательности 8ЕО ГО № 2. Фрагмент р35 ГО-12 может быть фрагментом описанных выше пептидов. Фрагмент р40 ГО-12 может быть фрагментом последовательности 8ЕО ГО № 4 или фрагментом полипептида, который по меньшей мере на 98% гомологичен фрагменту последовательности 8ЕО ГО № 4. Фрагмент р40 ГО-12 может быть фрагментом полипептида, который по меньшей мере на 99% гомологичен фрагменту последовательности 8ЕО ГО № 4. Фрагмент р40 ГО-12 может быть фрагментом описанных выше полипептидов.
Функциональный фрагмент по значению относится к фрагменту субъединицы ГО-12, который меньше полной последовательности р35 и/или меньше полной последовательности р40, которые в основном могут функционировать подобно полноразмерным субъединицам р35 или р40. Такие в основном схожие функции включают взаимодействие с другими белками, субъединицами или рецепторами в значительной степени таким же образом, как и полноразмерные субъединицы р35 или р40 при доставке таким способом, что позволяет образовывать гетеродимеры, которые в результате приводят к в основном таким же эффектам, как и гетеродимер р35/р40 ГО-12.
Г енетическая конструкция.
Термин генетическая конструкция используется в настоящей заявке касательно ДНК- или РНКмолекул, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую одну или обе субъединицы ГО-12 или белок-мишень или другой (не ГО-12) иммуномодулирующий белок. Эта кодирующая последовательность содержит сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включающими промотор и сигнал полиаденирования, отвечающие за направление экспрессии в клетках пациентов, которым назначается эта молекула нуклеиновой кислоты.
Гиперпролиферативный.
Как используется в настоящей заявке, термин гиперпролиферативные заболевания означает отношение к тем заболеваниям и расстройствам, которые характеризуются гиперпролиферацией клеток, а термин связанный с гиперпролиферативностью белок означает отношение к белкам, связанным с гиперпролиферативными заболеваниями.
Идентичный.
Идентичный или идентичность в настоящей заявке используются в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей и обозначают то, что последовательности имеют определенное процентное содержание остатков, которые совпадают на определенном участке. Процентное содержание может рассчитываться путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнивая две производительности на определенном участке, определяя количество положений, в которых встречаются идентичные остатки в обоих последовательностях для получения количества совпавших положений, разделяя количество совпавших положений на общее количество положений на определенном участке и умножая результат на 100, получают процентное значение идентичности последовательности. В случаях, когда две последовательности являются различными по длине или при выравнивании получается один или более смещенных концов, а определенный участок для сравнения включает только одну последовательность, то остатки одной последовательности вносятся в знаменатель, но не в числитель этого уравнения. При сравнении ДНК и РНК основания тимин (Т) и урацил (У) могут считаться эквивалентными. Проверка на идентичность может выполняться вручную или с использованием компьютерного алгоритма сравнения последовательностей, такого как ВЬЛ§Т или ВЬЛ§Т 2.0.
Импеданс.
Импеданс, как используется в настоящей заявке, может применяться при обсуждении механизма обратной связи и может быть переведен в значение силы тока согласно закону Ома, таким образом, по- 6 026926 лучают сравнение с предустановленным значением силы тока.
Иммунный ответ (иммунная реакция).
Иммунный ответ, как используется в настоящей заявке, обозначает активацию иммунной системы организма-хозяина, например млекопитающего, в ответ на введение одного или более консенсусного антигена вируса саркомы Рауса (Р8У) путем использования ДНК-плазмидных вакцин. Иммунный ответ может быть в виде клеточного или гуморального ответа или их обоих.
Внутриклеточный патоген.
Внутриклеточный патоген, как используется в настоящей заявке, обозначает отношение к вирусу или патогенному организму, которые по меньшей мере в части своей репродукции или жизненного цикла обитают в клетке хозяина и там продуцируют или обуславливают продукцию патогенных белков.
Нуклеиновая кислота.
Нуклеиновая кислота, или олигонуклеотид, или полинуклеотид, как используется в настоящей заявке, обозначает по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанные вместе. Описание одной цепи также определяет последовательность комплементарной цепи. Поэтому нуклеиновая кислота также включает комплементарную цепь описанной одной цепи. Много вариантов нуклеиновой кислоты могут использоваться с такой же целью, как и данная нуклеиновая кислота. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает в основном идентичные нуклеиновые кислоты и их комплементарные последовательности. Одноцепочечные кислоты могут быть зондами для гибридизации с последовательностьюмишенью в строгих условиях гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает зонд, который участвует в гибридизации в строгих условиях.
Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечеными или могут содержать участки двухцепочечных и одноцепочечных последовательностей. Нуклеиновые кислоты могут быть в виде ДНК, геномной и комплементарной (кДНК), РНК или гибридными, когда нуклеиновые кислоты содержат комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов и комбинации оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин и изогуанин. Нуклеиновые кислоты могут быть получены методами химического синтеза или рекомбинантными методами.
Функционально связанный.
Функционально связанный, как используется в настоящей заявке относительно гена, функционально присоединенного к промотору, и касается связывания двух компонентов так, чтобы происходила экспрессия этого гена под контролем промотора, с которым он пространственно соединен. Промотор может быть расположен на 5' (восходящем) или 3' (нисходящем) конце гена, находящегося под его контролем. Расстояние между промотором и геном приблизительно может быть таким же, как расстояние между тем промотором и подконтрольным ему геном в гене, из которого получен этот промотор. Как известно в данной области знаний, варьирование этого расстояния может происходить без потери функционирования промотора. Касательно сигнального пептида, функционально связанного с белком, этот термин относится к белку, несущему сигнальный пептид, составляющий часть этого белка таким образом, чтобы он мог функционировать как сигнальный пептид. В отношении кодирующей последовательности, которая кодирует сигнальный пептид, функционально связанный с кодирующей белок последовательностью, этот термин относится к кодирующей последовательности составленной так, что трансляция кодирующей последовательности приводит к синтезу белка, несущего сигнальный пептид, составляющий часть этого белка таким образом, чтобы он мог функционировать как сигнальный пептид.
Промотор.
Промотор, как используется в настоящей заявке, обозначает синтетическую молекулу или молекулу природного происхождения, которая обладает свойствами передавать, активировать или усиливать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор может включать один или более специфических транскрипционных регуляторных последовательностей для дополнительного усиления экспрессии и/или для изменения пространственного характера экспрессии и/или временного характера экспрессии той же последовательности. Промотор также может включать дистальные энхансерные (усилительные) или репрессорные элементы, которые могут быть расположены на расстоянии нескольких тысяч пар оснований от сайта инициации транскрипции. Промотор может быть получен из разных источников, включая вирусы, бактерии, грибы, растения, насекомые и животные. Промотор может регулировать экспрессию генных компонентов конституитивно или дифференциально в отношении клетки, ткани или органа, в которых происходит экспрессия, относительно стадии развития, в которой происходит экспрессия или в ответ на внешние воздействия, такие как физиологические стрессы, патогены, ионы металлов или индуцирующие агенты. Репрезентативные примеры промоторов включают промотор бактериофага Т7, промотор бактериофага Т3, промотор 8Р6, лактозный (1ас) оператор-промотор, составной (1ас) промотор, поздний промотор 8У40, ранний промотор 8У40, промотор К.8У-ЬТК, промотор СМУ ΙΕ, ранний или поздний промотор 8У40 и промотор СМУ ΙΕ.
Строгие условия гибридизации.
Строгие условия гибридизации, как используется в настоящей заявке, обозначают условия, в которых первая последовательность нуклеиновой кислоты (например, зонд) будет гибридизироваться со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, мишенью), такие условия как сложная
- 7 026926 смесь нуклеиновых кислот. Строгие условия зависимы от типа последовательности и будут отличаться в разных обстоятельствах. Строгие условия могут быть выбраны такими, когда температура примерно на 5-10°С ниже температуры точки плавления (Тт) специфической последовательности при определенной ионной силе и рН раствора. Тт может быть температурой (при определенной ионной силе раствора, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% оснований комплементарны мишени гибридизируемой с последовательностью-мишенью в условиях равновесия (так как последовательности-мишени присутствуют в избытке, при Тт 50% зондов связаны в условиях равновесия). Строгие условия могут быть такими, при которых концентрация солей является менее чем примерно 1,0М раствор ионов натрия, такой как примерно 0,01-1,0М концентрация раствора ионов натрия (или других солей) при рН 7,0-8,3 и при температуре по меньшей мере около 30°С для коротких зондов (например, примерно 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере около 60°С для длинных зондов (например, более чем примерно 50 нуклеотидов). Строгих условий также можно достичь добавлением дестабилизирующего агента, такого как формальдегид. Для избирательной или специфической гибридизации положительный сигнал может по меньшей мере превосходить в 2-10 раз фоновый сигнал при гибридизации. Примерные строгие условия гибридизации могут быть следующими: 50% формамид, 5-кратный (5х) раствор цитрата-хлорида натрия (88С) и 1%-ный раствор додецилсульфата натрия (8Ό8), инкубирование при 42°С или, 5х88С, 1% 8Ό8, инкубирование при 65°С, с промывкой в 0,2храстворе 88С и 0,1% 8Ό8 при 65°С.
В основном комплементарный.
В основном комплементарный используется в настоящей заявке для обозначения того, что первая последовательность по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична по комплементарности второй последовательности на участке 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более нуклеотидов или аминокислот или того, что две последовательности гибридизируют в строгих условиях гибридизации.
В основном идентичный.
В основном идентичный используется в настоящей заявке для обозначения того, что первая и вторая последовательности по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичны на участке 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более нуклеотидов или аминокислот или в отношении нуклеиновых кислот, если первая последовательность в основном дополняет по комплементарности вторую последовательность.
Белок-мишень.
Белок-мишень используется в настоящей заявке в значении, относящемуся к пептидам или белку, которые являются частью вакцин или которые кодируются генными конструкциями ДНК-вакцин, действующие как белки-мишени для иммунного ответа. Термины белок-мишень и иммуноген используются взаимозаменяемо и касаются белка, против которого может быть получен иммунный ответ. Белокмишень является иммуногенным белком, который несет по меньшей мере эпитоп белка патогена или нежелательного типа клеток, таких как раковая клетка или клетка, вовлеченная в аутоиммунное заболевание, против которых требуется получить иммунный ответ. Иммунный ответ, направленный против белка-мишени, будет защищать пациента и/или лечить пациента от специфической инфекции или болезни, с которыми связан белок-мишень.
Вариант.
Вариант, как используется в настоящей заявке в отношении нуклеиновой кислоты, может обозначать: (ί) часть или фрагмент референсной нуклеотидной последовательности; (ίί) комплементарную последовательность референсной нуклеотидной последовательности или ее части; (ίίί) нуклеиновою кислоту, которая в основном идентична референсной нуклеотидной последовательности или в основном комплементарна ей; или (ίν) нуклеиновую кислоту, которая гибридизируется в строгих условиях с референсной нуклеиновой кислотой, комплементарной ей, или с последовательностями, в основном идентичными ей.
Вариант в отношении пептида или полипептида, которые отличаются аминокислотной последовательностью по инсерциям, делециям или заменам консервативных аминокислот, но, по крайней мере, сохраняют биологическую активность. Вариант может также обозначать белок с аминокислотной последовательностью, которая в основном идентична референсному белку с аминокислотной последовательностью, который, по крайней мере, сохраняет свою биологическую активность. Замена консервативной аминокислоты, например замещение аминокислоты другой аминокислотой со схожими свойствами (например, гидрофильностью, значением и распределением заряженных участков) в этой области знания, считается типичным получением минорного изменения. Эти минорные изменения могут быть идентифицированы, в частности, учитывая гидропатический индекс аминокислот, как это понимается в этой области знаний: Ку1е е1 а1., I. ΜοΙ. ΒίοΙ. 157:105-132 (1982). Гидропатический индекс аминокислот основан на анализе их гидрофобности и заряда. В этой области знаний известно, что аминокислоты с подобными гидропатическими индексами могут заменяться, и при этом сохраняется функционирование белка. В одном аспекте могут замещаться аминокислоты, обладающие гидропатическими индексами со значениями
- 8 026926 ±2. Гидрофильность аминокислот также может использоваться для выявления заместителей, которые в результате приведут к сохранению белками биологических функций. Рассмотрение гидрофильности аминокислот в контексте пептида допускает расчет наибольшей локальной средней гидрофильности этого пептида, это полезный показатель, о котором сообщалось, что он хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью (патент США № 4554101, содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки). Замены аминокислот, обладающие подобными значениями гидрофильности, могут приводить к получению пептидов, сохраняющих биологическую активность, например иммуногенность, как это понимается в этой области знаний. Замены могут создаваться из аминокислот, обладающих значениями гидрофильности в пределах отличия значений друг от друга ±2. Особенность боковой цепи таких аминокислот влияет и на индекс гидрофобности и на значение гидрофильности. В соответствии с этим наблюдением замены аминокислот, которые совместимы по биологическим функциям, как полагается, зависят от относительного подобия аминокислот и особенно боковых заместителей этих аминокислот, для которых определяются гидрофобность, гидрофильность, заряд, размер и другие свойства.
Вектор.
Вектор, как используется в настоящей заявке, обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую точку начала репликации. Вектором может быть плазмида, бактериофаг, искусственная бактериальная хромосома или искусственная дрожжевая хромосома. Вектор может быть ДНКили РНК-вектором. Вектор может быть самореплицирующимся внехромосомным вектором или вектором, который интегрируется в геном хозяина.
Интеолейкин-12 (Ш-12).
Приводимый в настоящей заявке является синтетической конструкцией, которая кодирует р35 (αсубъединица) и р40 (β-субъединица) Ш-12 человека. Субъединица р35 Ш-12 человека (последовательность §ЕЦ ГО № 2) представляет собой белок из 219 аминокислот, который включает сигнальный пептид из аминокислот 1-22 и зрелую белковую последовательность в положениях аминокислот 23-219. Субъединица р40 ГО-12 человека (последовательность §ЕЦ ГО № 4) представляет собой белок из 328 аминокислот, который включает сигнальный пептид из аминокислот 1-22 и зрелую белковую последовательность в положениях аминокислот 23-328. Аминокислоты 40-90 субъединицы р40 ГО-12 человека относятся к домену иммуноглобулинов, аминокислоты 125-217 субъединицы р40 ГО-12 человека относятся к Стерминальному домену р40 цитокина интерлейкина-12.
В некоторых вариантах осуществления изобретения субъединица р35 ГО-12 кодируется конструкцией, содержащей кодирующую последовательность на одной плазмиде, а субъединица р40 ГО-12 кодируется конструкцией, содержащей кодирующую последовательность на разных плазмидах. В некоторых вариантах осуществления изобретения конструкция, содержащая кодирующую субъединицу р35 ГО-12 последовательность, и конструкция, содержащая кодирующую субъединицу р40 ГО-12 последовательность, находятся в одной и той же плазмиде, но каждая конструкция обладает своим собственным промотором. В некоторых вариантах осуществления изобретения конструкция, содержащая кодирующую субъединицу р35 ГО-12 последовательность, и конструкция, содержащая кодирующую субъединицу р40 ГО-12 последовательность, находятся в одной и той же плазмиде под контролем одного промотора и разделены последовательностью 1КЕ§. В некоторых вариантах осуществления изобретения конструкция, содержащая кодирующую субъединицу р35 ГО-12 последовательность, и конструкция, содержащая кодирующую субъединицу р40 ГО-12 последовательность, находятся в одной и той же плазмиде под контролем одного промотора и разделены кодирующей последовательностью сайта протеолитического расщепления. В некоторых вариантах осуществления изобретения конструкция, содержащая кодирующую субъединицу р35 ГО-12 последовательность, и конструкция, содержащая кодирующую субъединицу р40 ГО-12 последовательность, находятся в одной и той же плазмиде под контролем одного промотора и субъединицы разделены линкером, который позволяет им быть активными в виде одной белковой цепи.
Последовательности НиГО12-ор1 - это оптимизированные последовательности, кодирующие субъединицы ГО-12 человека. Такие последовательности обладают пониженной гомологичностью с геномом хозяина для того, чтобы изменить структуру РНК и избежать регуляции последовательностей при раскодировании. Эти последовательности обеспечивают улучшенную стабильность и экспрессию мРНК.
Последовательность НиГО12-ор1 является кодирующей последовательностью, которая кодирует субъединицу р35 ГО-12, и описана как последовательность §ЕЦ ГО № 1. Последовательность НиГО12-ор1 является кодирующей последовательностью субъединицы р35 ГО-12 из 219 аминокислот, тем самым описанной как последовательность §ЕЦ ГО № 2. Аминокислоты 1-22 соответствуют сигнальному пептиду. Аминокислоты 23-219 соответствуют участку зрелого белка.
Последовательность НиГО12-ор1 является кодирующей последовательностью, которая кодирует субъединицу р40 ГО-12, описанную как последовательность §ЕЦ ГО № 3. Последовательность НиГО12-ор1 является кодирующей последовательностью субъединицы р40 ГО-12 из 328 аминокислот, тем самым описанной как последовательность §ЕЦ ГО № 4. Аминокислоты 1-22 соответствуют сигнальному пептиду ГО-12, а аминокислоты 23-328 составляют зрелый белок. Аналогичные последовательности ГО-12 макаки
- 9 026926 резус и являются последовательностями КЬТО12-орЕ которые представляют собой оптимизированные последовательности, кодирующие субъединицы ГО-12 макаки резус.
В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальный пептид 1Ь-12 субъединиц р35 или р40 1Ь-12 или их обоих может быть замещен отличающимся сигнальным пептидом, таким как другой сигнальный пептид иммуноглобулинов, например 1§О или 1дЕ (8ЕО ГО № 5). Кодирующие последовательности, которые кодируют сигнальный пептид ГО-12 субъединиц р35 или р40 ГО-12 или их обоих может быть замещен кодирующими последовательностями, которые кодируют отличающийся сигнальный пептид, такой как другой сигнальный пептид иммуноглобулинов, например 1§О или 1дЕ (являются кодирующими последовательностями, которые кодируют последовательность 8ЕО ГО № 5). В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальный пептид субъединицы р35 ГО-12 может быть замещен отличающимся сигнальным пептидом, таким как другой сигнальный пептид иммуноглобулинов, например 1§О или 1дЕ (8ЕО ГО № 5). Функциональные фрагменты последовательности 8ЕО ГО № 2 могут не содержать сигнальных пептидных последовательностей ГО-12 р35. В некоторых вариантах осуществления изобретения кодирующая последовательность, которая кодирует сигнальный пептид р35 ГО-12, может быть замещена кодирующей последовательностью отличающегося сигнального пептида, такой как кодирующая последовательность другого сигнального пептида иммуноглобулинов, например кодирующая последовательностью сигнального пептида 1§О или 1дЕ (т.е. кодирующей последовательностью, которая кодирует 8ЕО ГО № 5). Последовательности нуклеиновых кислот, являющиеся фрагментами 8ЕО ГО № 1, могут не содержать кодирующих последовательностей сигнального пептида р35 ГО-12.
Функциональные фрагменты последовательности 8ЕО ГО № 4 могут не содержать сигнальных пептидных последовательностей ГО-12 р40. В некоторых вариантах осуществления изобретения кодирующая последовательность, которая кодирует сигнальный пептид р40 ГО-12, может быть замещена кодирующей последовательностью отличающегося сигнального пептида, такого как кодирующая последовательность другого сигнального пептида иммуноглобулинов, например кодирующая последовательность сигнального пептида 1§О или 1дЕ (т.е. кодирующей последовательностью, которая кодирует 8ЕО ГО № 5). Последовательности нуклеиновых кислот, являющиеся фрагментами последовательности 8ЕО ГО № 3, могут не содержать кодирующих последовательностей сигнального пептида р40 ГО-12. При расчете гомологии по отношению к последовательности 8ЕО ГО № 1 или 8ЕО ГО № 3 кодирующих последовательностей, которые не кодируют соответственно сигнальный пептид р35 ГО-12 или сигнальный пептид р40 ГО-12, расчет основывается на сравнении с последовательностью 8ЕО ГО № 1 или 8ЕО ГО № 3, за исключением части 8ЕО ГО № 1, которая кодирует сигнальный пептид р35 ГО-12, или части 8ЕО ГО № 3, которая кодирует сигнальный пептид р40 ГО-12.
Плазмида.
Приводимая в настоящей заявке является вектором, который способен экспрессировать конструкции ГО-12 в клетках млекопитающих в количестве эффективном для модулирования иммунного ответа у млекопитающих. Каждый вектор может включать гетерологическую нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или обе субъединицы. Этот вектор может быть плазмидой. Эта плазмида может быть использована для трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей ГО-12, которая трансформирует клетки хозяина в условиях культивирования и поддержания культуры, при которых происходит экспрессия ГО-12.
Эта плазмида может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую один или более антигенов. Эта плазмида может дополнительно содержать иницирующий кодон, который может находиться на восходящей кодирующей последовательности и стоп-кодон, который может находиться на нисходящей кодирующей последовательности. Кодон инициации и терминации могут находиться в рамках кодирующей последовательности.
Эта плазмида может также содержать промотор, который функционально связан с кодирующей последовательностью. Этот промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью, может быть промотором обезьяньего вируса 40 (§У40), промотором вируса опухоли молочной железы мышей (ММТУ), промотором вируса иммунодефицита человека (Ηΐν), а также вируса бычьего иммунодефицита (Βΐν), промотором с длинным концевым повтором ГО-ТВ), промотором вируса Молони, промотором вируса лейкоза птиц (ЛЕУ), промотором цитомегаловируса (ΟΜν), таким как непосредственный ранний промотор СМУ, промотором вируса Эпштейн-Барр (ЕВУ) или промотором вируса саркомы Рауса (Κδν). Этот промотор также может быть промотором человеческого гена, такого как кодирующий человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин или человеческий металотионенин. Этот промотор также может быть тканеспецифическим промотором, таким как специфический промотор мышц или кожи, природным или синтетическим. Примерами таких промоторов описаны в публикации патентной заявки США № υδ 20040175727, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Эта плазмида также может дополнительно содержать сигнал полиаденилирования, который может находиться на нисходящей кодирующей последовательности. Сигнал полиаденилирования может быть сигналом полиаденилирования δν40, сигналом полиаденилирования ЬТК, сигналом полиаденилирования бычьего гормона роста (БОН), сигналом полиаденилирования человеческого гормона роста (ЬСН)
- 10 026926 или сигналом полиаденилирования человеческого β-глобина. Сигнал полиаденилирования ЗУ40 может быть сигналом плазмиды рСЕР4 (1иуйтодеи, Заи Όίοβο. СА).
Эта плазмида может дополнительно содержать энхансер в восходящем направлении кодирующей последовательности. Энхансер может быть энхансером человеческого актина, человеческого миозина, человеческого гемоглобина, человеческого мышечного креатина или вирусным энхансером - одним из СМУ, РМЭУ, РЗУ или ЕВУ. Полинуклеотидные функционирующие энхансеры описаны в патентах США №№ 5593972, 5962428 и \УО 94/016737, содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылок.
Эта плазмида также может содержать точку начала репликации для того, чтобы поддерживать плазмиду внехромосомно и синтезировать множество копий плазмиды в клетке. Эта плазмида может быть плазмидой рУАХ1, рСЕР4 или рКЕР4 компании 1иуйтодеи (8аи Э1едо, СА), которые могут содержать точку начала репликации вируса Эпштейна-Барр или кодирующий участок ядерного антигена ΕΒΝΑ-1, которые могут обеспечивать эписомальную репликацию многих копий без интеграции плазмиды. Основной последовательностью этой плазмиды может быть рАУ0242. Эта плазмида может быть плазмидой аденовируса типа 5 (А65), дефектной к репликации.
Эта плазмида также может включать регуляторную последовательность, которая может хорошо подходить для генной экспрессии в клетке, в которую вводится плазмида. Кодирующая последовательность может содержать кодон, который позволит обеспечить более эффективную транскрипцию кодирующей последовательности в клетке хозяина.
Эта кодирующая последовательность также может содержать лидерную последовательность 1д Лидерная последовательность может находиться на 5'-конце кодирующей последовательности. Консенсусные антигены, кодируемые этой последовательностью, могут содержать Ν-терминальную лидерную последовательность 1§ перед белком консенсусного антигена. Эта Ν-терминальная лидерная последовательность 1§ может быть последовательностью 1дЕ или 1§С.
Эта плазмида может быть плазмидой р8Е420 Диуйтодеи, 8аи Э1едо, СаНГ.), которая используется для получения белков в бактериях ЕксНетюЫа сой (Е.соН). Эта плазмида также может быть плазмидой рУЕ32 Диуйтодеи, 8аи Э1едо, СаНГ.), которая используется для получения белков в штаммах дрожжей ЗассНатотусек сетеу181ае. Эта плазмида также может быть полной системой экспрессии бакуловируса МАХВАС™ Диуйтодеи, 8аи Э1едо, СаНГ.), которая используется для получения белков в клетках насекомых. Эта плазмида также может быть ДНК на основе промотора цитомегаловируса (рс^NΑ) рс^NΑ I или рс^NΑ3 Диуйтодеи, 8аи Э1едо, СаНГ.), которые используются для получения белков в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО).
Вакцина.
Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения доставка последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует ГБ-12 или ее функциональные фрагменты, может происходить в комбинации с последовательностями нуклеиновой кислоты, которые кодируют иммуноген для усиления иммунного ответа против этого иммуногена. Когда молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногены и 1Б-12, поглощаются клетками пациента, то иммуноген и 1Б-12 экспресиируются в клетках, и белки, благодаря этому, поступают в организм пациента. Аспекты изобретения предоставляют способы доставки кодирующих последовательностей иммуногена и 1Б-12 на одной молекуле нуклеиновой кислоты, способы доставки кодирующих последовательностей иммуногена и 1Б-12 на разных молекулах нуклеиновых кислот и способы доставки кодирующих последовательностей иммуногена и 1Б-12 как часть рекомбинантных вакцин и как часть аттенуированных вакцин.
Согласно некоторым аспектам данного изобретения предлагаются составы и способы, иммунизирующие организм пациента с профилактической и/или терапевтической целью против аномальных или связанных с заболеваниями клеток. Эта вакцина может быть любым типом вакцины, таким как живая аттенуированная вакцина, рекомбинантная вакцина, вакцина с нуклеиновой кислотой или ДНК-вакцина. Иммунный ответ, индуцированный вакциной, может модулироваться путем доставки молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют иммуноген и 1Б-12, или их функциональные фрагменты. Конструкции 1Б-12 особенно эффективны при их введении в комбинации с молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуноген, такой как, например, часть плазмиды или геном рекомбинантного вектора или аттенуированный патоген или клетка. Конструкции 1Б-12 могут использоваться в вакцинах для профилактики для того, чтобы индуцировать защитный иммунный ответ у инфицированных пациентов или свободных от заболеваний людей. Конструкции 1Б-12 особенно эффективны, когда вводятся для индуцирования защитного иммунного ответа у людей. Конструкции ГБ-12 могут использоваться в вакцинах с терапевтической целью для того, чтобы индуцировать иммунный ответ у инфицированных или заболевших пациентов. Конструкции 1Б-12 особенно эффективны, когда вводятся для индуцирования терапевтического иммунного ответа у людей. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, содержащие конструкции 1Б-12, вводятся в виде композиции, не содержащей клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, содержащие конструкции 1Б-12, вводятся в виде композиции, не содержащей раковых клеток. В некоторых вариантах осу- 11 026926 ществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, содержащие конструкции 1Ь-12, назначаются в виде композиции, не содержащей какого-либо другого цитокина.
Предложенная в настоящей заявке вакцина способна генерировать у млекопитающих иммунный ответ против патогенов, иммуногенов, которые экспрессируются в клетках, связанных с заболеванием, или других иммуногенов, против которых требуется получить иммунный ответ. Эта вакцина может включать каждую из плазмид, описанных выше. Эта вакцина может включать множество плазмид или их комбинацию. Эта вакцина может обеспечивать индукцирование терапевтического или профилактического иммунного ответа.
Генетические конструкции могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-мишень или иммуномодулирующий белок, функционально связанный с регуляторными элементами, необходимыми для экспрессии генов. Согласно этому изобретению комбинация генных конструкций включает одну конструкцию, которая содержит экспрессируемую форму нуклеотидной последовательности, кодирующей белок-мишень, и одну конструкцию, которая содержит экспрессируемую форму нуклеотидной последовательности, кодирующей представленный иммуномодулирующий белок. Доставка в живую клетку молекул(ы) ДНК или РНК, которые включают комбинацию генных конструкций, в результате обеспечивает экспрессию ДНК или РНК и продукцию белка-мишени и одного или более иммуномодулирующих белков. В результате усиливается иммунный ответ против этого белка-мишень.
Данное изобретение может использоваться для иммунизации людей против таких патогенов, как вирусы, прокариоты, и таких патогенных эукариотических организмов, как одноклеточные патогенные организмы и многоклеточные паразиты. Данное изобретение особенно эффективно для иммунизации людей против тех патогенов, которые инфицируют клетки и которые не инкапсулированы, такие как вирусы и прокариоты, такие как бактерии гонореи, листерии и шигеллы. Кроме того, данное изобретение также эффективно для иммунизации людей против протозойных патогенов, включающих стадию жизненного цикла, в которой они существуют в виде внутриклеточных патогенов. В табл. 1 представлен перечень некоторых семейств и видов вирусов, для которых согласно данному изобретению могут быть созданы вакцины. Для вакцин могут быть эффективны ДНК-конструкции, которые содержат последовательности ДНК, кодирующие пептиды, которые включают, по меньшей мере, эпитоп, идентичный или в основном сходный с эпитопом, представленным на патогенном антигене, таких как антигены, перечисленные в таблицах. Более того, данное изобретение также эффективно для иммунизации человека против других патогенов, включая прокариотические и эукариотические протозойные патогены, а также многоклеточных паразитов, таких как перечислены в табл. 2.
Таблица 1
Вирусы
Семейство пикорнавирусы (Р1согпау1ги8).
Виды.
Риновирусы (медицина): отвечают за 50% случаев простуд.
Энтеровирусы (медицина): включают полиовирусы, коксакивирусы, есйо-вирусы и энтеровирусы человека, такие как вирус гепатита А.
Афтовирусы (ветеринария): это вирусы, вызывающие заболевания ящуром.
Антигены-мишени: УР1, УР2, УР3, УР4, УРО.
Семейство калицивирусов (СайсМгик).
Виды.
Группа норовирусов (медицина): эти вирусы являются важным агентом среди причин эпидемических заболеваний гастроэнтеритами.
Семейство тогавирусов (Тодауьгик).
Виды.
Альфавирусы (медицина и ветеринария): примеры включают синдбис-вирус, вирус реки Росс и вирусы венесуэльского, восточного и западного энцефалита лошадей.
Реовирус (медицина): вирус краснухи.
Семейство флавивирусов (Иауьушйае).
Примеры включают (медицина): вирусы денге, желтой лихорадки, японского энцефалита, энцефалита Сент-Луис и клещевого энцефалита. Вирус Западного Нила (ОепЬапк ЫС001563, АР533540, АЕ404757, АР404756, АР404755, АР404754, АР404753, АР481864, М12294, АР317203, АР196835, АЕ260969, АР260968, АР260967, АР206518 и АР202541).
Представители антигенов-мишеней: Е N85 С.
Вирус гепатита С (медицина): эти вирусы еще не определены в семейство, но считаются относящимися к тога- или флавивирусам. Больше сходства с семейством тогавирусов.
Семейство коронавирусов (Согопауйш) (Медицина и ветеринария).
Вирус инфекционного бронхита (домашние птицы).
Вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (свиньи).
Вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней (свиньи).
Вирус инфекционного перитонита кошек (кошки).
- 12 026926
Брюшной коронавирус кошек (кошки).
Коронавирус собак (собаки).
Коранавирус, ассоциированный с тяжелым острым респираторным синдромом (8АР8). Респираторные коронавирусы человека вызывают около 40% случаев простуд. ЕХ. 224Е, ОС43.
Примечание - коронавирусы могут вызывать не-А, В или С гепатиты.
Антигены-мишени: Е1 - также называемый М или матричный белок Е2, также называемый 8, или белок шипа Е3, также называемый ВЕ, или гемагглютинин-эльтерозный гликопротеин (не представлен во всех коронавирусах), N - нуклеокапсид.
Семейство рабдовирусов (КЬаЬбоу1ги8).
Виды.
Везикуловирус, лиссавирус (медицина и ветеринария): бешенство.
Антиген-мишень: О-белок, Ν-белок.
Семейство филовирусов (РПоушбае) (медицина): вирусы геморрагической лихорадки, такие как вирус Марбурга и Эбола.
Семейство парамиксовирусов (Рагашухоуплк).
Виды.
Парамиксовирусы (медицина и ветеринария): вирус эпидемического паротита, вирус болезни НьюКасла (важный патоген кур).
Морбиливирус (медицина и ветеринария): корь, чума собачьих.
Пневмовирус (медицина и ветеринария): респираторно-синцитиальный вирус.
Семейство ортомиксовирусов (медицина): вирус гриппа.
Семейство буньявирусов (Випуауйпк).
Виды.
Буньявирус (медицина): калифорнийского энцефалита, энцефалита Ла-Кросс.
Флебовирус (медицина): лихорадка рифтовой долины.
Хантавирус: возбудителем заболевания пуремала (ригета1а) является вирус лихорадки хемахагин. Неирвирус (Уе1егшату): заболевание овец Найроби.
А также много неопределенных бунгавирусов.
Семейство аренавирусов (Агепа\аги5) (медицина): вирус лимфоцитарного менингита (ЬСМ), вирус лихорадки Ласса.
Семейство реовирусов (Реоу1ги5).
Виды.
Реовирус: вероятный патоген человека.
Ротавирус: острый гастроэнтерит детей.
Орбивирусы (медицина и ветеринария): клещевая лихорадка Колорадо, энцефалоз лошадей Лебомбо, катаральная лихорадка овец (синего языка).
Семейство ретровирусов (Ре1го\аги5).
Подсемейство.
Онковирусы (ветеринария) (медицина): вирус лейкемии кошек, человеческий лимфотропный вирус Т-клеток I типа (НТЬУ1), человеческий лимфотропный вирус Т-клеток II типа (НТЬУИ).
Лентивирусы (медицина и ветеринария): ВИЧ, вирус иммунодефицита кошек, инфекции лошадей, вирус анемии.
Семейство спумавирусов-паповавирусов (8ритаушпа1 Рароуа\аги5).
Подсемейство:
Полиомавирусы (медицина): вирусы БиКей и ДжейСи (ВКи и 1СИ).
Подсемейство.
Папилломавирусы (медицина): много видов вирусов, связанных с раковыми заболеваниями или развитием злокачественных папиллом.
Аденовирус (медицина) ЕХ АЭ7. ОРЗ (АРЭ.). О.В. - вызывают респираторные заболевания - некоторые аденовирусы, такие как 275, вызывают энтерит.
Семейство парвовирусов (Рагуоуплк) (ветеринария).
Кошачий парвовирус: вызывает энтерит кошек.
Панлейкопениявирус кошек.
Парвовирус собак.
Парвовирус свиней.
Семейство герпесвирусов (Негре5У1ги5).
Подсемейство.
Альфагерпесвирусы.
Виды.
Простой вирус герпеса (Н8У) (медицина).
Н8У1 (ОепЬапк Х14112, N001806), Н8У11 (N001798).
Вирус ветряной оспы (медицина и ветеринария).
- 13 026926
Псевдобешенство.
Ветряная оспа.
Подсемейство.
Бетагерпесвирусы.
Виды.
Цитомегаловирус (медицина).
Цитомегаловирус человека (НСМУ).
Муромегаловирус.
Подсемейство.
Г аммагерпесвирусы.
Виды.
Лимфокриптовирус (медицина).
Вирус Эпштейна-Барр (ЕВУ) - лимфома Беркитта.
Семейство поксвирусов (Роху1ги8).
Подсемейство.
Хордопоксвирусы (медицина и ветеринария).
Виды.
Оспа (натуральная оспа).
Вирус осповакцины (коровья оспа).
Парапоксвирус (ветеринария).
Авипоксвирус (ветеринария).
Каприпоксвирус.
Лепорипоксвирус.
Свипоксвирус.
Подсемейство.
Энтемопоксвирусы.
Семейство гепаднавирусов (Нерайпау1ги8).
Вирус гепатита В.
Неклассифицированный вирус гепатита дельта.
Таблица 2
Бактериальные патогены
Патогенные грамположительные кокки, включая пневмококки, стафилококки и стрептококки.
Патогенные грамотрицательные кокки, включая менингококки и гонококки.
Патогенные кишечные грамотрицательные бациллы, включая энтеробактерии; псевдомонады, ацинебактерии и эйкенеллы, возбудители мелиоидоза; сальмонеллы; возбудители шигеллоза; гемофилии, венерической язвы, бруцеллеза, туляремии; иерсинии (пастереллы); 31гер1оЬасШи8 МогШй'огш18 и спириллы; ЫЦепа Мопосу1одепе§; Егу81ре1осЬг1х РНимораПйае; возбудители дифтерии, холеры, сибирской язвы; возбудители донованоза (венерическая гранулема) и бартонеллеза.
Патогенные анаэробные бактерии, включая возбудителей столбняка, ботулизма; другие клсстридии; возбудители туберкулеза, проказы и другие микобактерии.
Патогенные заболевания, вызванные спирохетами, включая сифилис, трепонематозы: тропическая фрамбезия, болезнь пинта, эндемический сифилис; лептоспироз.
Другие инфекции, вызванные высокопатогенными бактериями и патогенными грибами, включая возбудителей актиномикозов; нокардиозов; криптококкозов; бластомикозов, гистоплазмозов и кокцидиодомикозов; кандидиазов, аспергиллезов и мукормикозов; споротрихозов; паракокцидиодомикозов, петриеллидиозов, торулопсозов, мицетом, хромомикозов и дерматофитозов.
Риккетсиозные инфекции, включая риккетсиозные заболевания и риккетсиозы.
Примеры заболеваний, вызванных микоплазмами, и хламидийных инфекций включают Мусор1а§ша Рпеитотае, венерическая лимфогранулема, пситтакоз и перинатальные хламидийные инфекции.
Патогенные эукариоты.
Патогенные простейшие и гельминты и вызванные ими заболевания включают амебиаз, малярию, лейшманиоз, трипаносомиаз, токсоплазмоз, пневмоцистис карнии, бабезиоз, гиардиоз, трихиноз, филяриаз, шизостосомиаз, заболевания, вызванные нематодами, трематодами и цестодами (ленточными червями).
Для того чтобы получить генетическую вакцину для защиты от патогенной инфекции, генетический материал, который кодирует иммуногенные белки, против которых может быть создан защитный иммунный ответ, должен быть включен в генетическую конструкцию как кодирующая последовательность для такой мишени. Из-за того, что обе молекулы ДНК и РНК относительно малы и могут быть получены относительно легко, настоящее изобретение обеспечивает дополнительное преимущество, позволяющее проводить вакцинацию множеством патогенных антигенов. Генетическая конструкция, используемая в этой генетической вакцине, может содержать генетический материал, который кодирует множество патогенных антигенов. Например, несколько вирусных генов могут быть включены в одну конструкцию,
- 14 026926 тем самым обеспечивая наличие множества мишеней.
Табл. 1 и 2 содержат перечень некоторых из патогенных агентов и организмов, для защиты от вызываемых которыми инфекций могут быть приготовлены генетические вакцины.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцины содержат оптимизированную последовательность 1Ь-12 в комбинации с одной или более конструкций ДНК-вакцин, изложенных в следующих патентных документах, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцины содержат оптимизированную последовательность 1Ь-12 в комбинации с вакциной против ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), вакциной против ВГС (вирус гепатита С), вакциной против ВПЧ (вирус папилломы человека), вакциной против вируса гриппа или противораковых вакцин, направленных на подавление НТЕКТ (теломераза-обратная транскриптаза человека), описанными в заявке согласно РСТ (Договор о патентной кооперации) № РСТ/и§07/74769 и соответствующей патентной заявке США серийный номер 12/375518. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцины содержат оптимизированную последовательность Ш-12 в комбинации с вакцинами против вируса гриппа, описанными в заявке согласно РСТ № РСТ/И808/83281, соответствующей патентной заявке США серийный номер 12/269824 или в заявке согласно РСТ № РСТ/и§11/22642 и соответствующей патентной заявке США серийный номер 12/694238. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцины содержат оптимизированную последовательность Ш-12 в комбинации с вакцинами против ВГС, описанными в заявке согласно РСТ № РСТ/И808/081627 и соответствующей патентной заявке США серийный номер 13/127008. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцины содержат оптимизированную последовательность Ш-12 в комбинации с вакцинами против ВПЧ, описанными в заявке согласно РСТ № РСТ/И810/21869 и соответствующей патентной заявке США серийный номер 12/691588 или в предварительной заявке США серийный номер 61/442162. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцины содержат оптимизированную последовательность Ш-12 в комбинации с вакцинами против натуральной оспы, описанными в заявке согласно РСТ № РСТ/И809/045420 и соответствующей патентной заявке США серийный номер 12/473634. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцины содержат оптимизированную последовательность Ш-12 в комбинации с вакцинами против лихорадки Чикунгунья, описанными в заявке согласно РСТ № РСТ/И809/039656 и соответствующей патентной заявке США серийный номер 12/936186. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцины содержат оптимизированную последовательность Ш-12 в комбинации с вакцинами против вирусных заболеваний ящуром (ΡΜΌν), описанными в заявке согласно РСТ № РСТ/И810/55187. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцины содержат оптимизированную последовательность 1Ь-12 в комбинации с вакцинами против малярии, описанными в предварительной заявке США серийный номер 61/386973. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцины содержат оптимизированную последовательность 1Ь-12 в комбинации с вакцинами против раковых заболеваний простаты, описанными в предварительной заявке США серийный номер 61/413176 или в предварительной заявке США серийный номер 61/417817. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцины содержат оптимизированную последовательность 1Ь-12 в комбинации с вакцинами против цитомегаловируса человека (ί'.'Μν). описанными в предварительной заявке США серийный номер 61/438089. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцины содержат оптимизированную последовательность 1Ь-12 в комбинации с вакцинами против устойчивого к метициллину штамма 81арЬу1ососси5 аигеиз (ΜΚδΑ), описанными в предварительной заявке США серийный номер 61/569727, поданной 12 декабря 2011 года, озаглавленной РКОТЕ1Ж СОΜРКΐδΐNΟ ΜΚδΑ РВР2А ΑΝΏ ΡΚΑΟΜΕΝΓδ ТНЕКЕОР, М'С1,Е1С ЛС11Ж ЕNСО^ΐNΟδ ТНЕ δΑΜΕ, ΑΝΌ СОΜРОδΐТΐОNδ ΑΝΏ ТНЕ1К ЖЕ ТО РКЕВЕЭТ ΑΝΏ ТКЕАТ ΜΚδΑ ПХРЕСТЮЖ и назначенным номером патентного реестра 133172.04000 (Х5709) с соответствующей заявкой согласно РСТ на утверждение приоритета в США. Предварительная заявка США серийный номер 61/569727, поданная в тот же день, что и настоящая заявка, содержание каждой из которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылок. Все патенты и патентные заявки, приведенные в этой заявке, полностью включены их содержанием посредством ссылок.
Другой аспект данного изобретения обеспечивает способ получения защитного иммунного ответа к гиперпролиферирующим клеткам, которые являются характерными при гиперпролиферативных заболеваниях, и способ лечения пациентов, страдающих от гиперпролиферативных заболеваний. Примеры гиперпролиферативных заболеваний включают все формы рака и псориаз.
Обнаружено, что введение генетической конструкции, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуногенный связанный с гиперпролиферирующими клетками белок, в клетки пациента приводит к синтезу таких белков в вакцинированных клетках пациента. Для иммунизации против гиперпролиферативных заболеваний пациенту назначают генетическую конструкцию, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую связанный с гиперпролиферативными заболеваниями белок.
Для того чтобы связанный с гиперпролиферативными заболеваниями белок был эффективной иммуногенной мишенью, он должен быть белком, который синтезируется исключительно или синтезируется в больших количествах в гиперпролиферирующих клетках по сравнению с нормальными клетками.
- 15 026926
Антигены-мишени включают такие белки, их фрагменты и пептиды, которые содержат, по меньшей мере, эпитоп, найденный в таких белках. В некоторых случаях связанный с гиперпролиферативными заболеваниями белок является продуктом мутации гена, кодирующего белок. Мутировавшие гены кодируют белок, который практически идентичный нормальному белку, за исключением того, что он немного отличается по аминокислотной последовательности, что приводит к получению другого эпитопа, не найденного в нормальном белке. Такие белки-мишени включают те белки, которые кодируются онкогенами, такими как туЬ, туе, Гун и генами транслокаций г/аЫ, так, кгс, Р53, пей, 1гк и ЕСКР. В дополнение к продуктам онкогенов, таким как антигены-мишени, белки-мишени для схем лечения и защиты от раковых заболеваний, существуют вариабельные участки антител, синтезированных В-клеточными лимфомами, и вариабельные участки Т-клеточных рецепторов Т-клеточных лимфом, которые в некоторых вариантах осуществления изобретения также используются как антигены-мишени при аутоиммунных заболеваниях. Как белки-мишени могут использоваться другие белки, ассоциированные с опухолями, такие как белки, найденные в высоких концентрациях в клетках новообразований, включая белок, распознаваемый моноклональным антителом 17-ΙΑ и фолат-связывающими белками или специфический антиген простаты (Р8Л).
В то же время данное изобретение может использоваться для иммунизации пациентов против одной или более форм рака, настоящее изобретение особенно эффективно для профилактической иммунизации индивида, который предрасположен к развитию особых видов раковых заболеваний или у которого есть раковое заболевание и, следовательно, он чувствительный к рецидиву заболевания. Развитие генетики и технологии, а также эпидемиологии, позволяют определить вероятность и оценку риска развития рака у пациента. Используя генетический скрининг и/или истории болезней членов семьи, становится возможным предсказать вероятность развития какого-либо одного или нескольких видов рака у отдельного пациента.
Аналогично, у тех пациентов, у которых уже развилась онкология и которые проходят лечение для удаления опухолей или иным образом проходят ремиссию, особенно чувствительны к рецидивам и повторному заболеванию. Такие пациенты могут быть иммунизированы против раковых заболеваний, которые были у них диагностированы, применяя иммунизацию как часть схемы лечения и получая лечение для борьбы с повторным развитием заболеваний. Таким образом, как только становится известным, что у пациента появился определенный вид онкозаболевания и есть риск его рецидива, то такие пациенты могут быть иммунизированы для подготовки их иммунной системы к противодействию будущему появлению рака.
Данное изобретение обеспечивает способ лечения пациентов, страдающих от гиперпролиферативных заболеваний. При таких способах лечения введение генетических конструкций служит в качестве иммунотерапевтического средства, направленного и стимулирующего иммунную систему индивида на подавление гиперпролиферирующих клеток, производящих белки-мишени. При лечении или предотвращении возникновения рака, особенно эффективными являются воплощения изобретения, которые не содержат клеток.
Данное изобретение обеспечивает способ лечения пациентов, страдающих от аутоиммунных заболеваний и расстройств, предоставляя иммунный ответ широкого спектра против мишеней, которые связаны с рецепторами клеток, индуцирующих аутоиммунные сбои, и с клетками, продуцирующими само-направленные антитела.
Аутоиммунные заболевания, опосредованные Т-клетками, включают ревматоидный артрит (РА), множественный склероз (МС), синдром Шегрена, саркоидоз, инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД), аутоиммунный тиреоидит, реактивный артрит, анкилозный спондилит, склеродерму, полимиозит, дерматомиозит, псориаз, вазкулит, грануломатоз Вегнера, болезнь Крона и язвенный колит. Для каждого из этих заболеваний существуют характерные рецепторы Т-клеток, связывающиеся с эндогенными антигенами и инициирующие воспалительные каскады, ассоциированные с аутоиммунными заболеваниями. Вакцинация против вариабельного участка Т-клеток будет вызывать иммунный ответ, включая цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) для удаления таких Т-клеток.
В случае РА охарактеризовано несколько специфических вариабельных участков Т-клеточных рецепторов (ТСК), вовлеченных в развитие этой болезни. Эти ТСК включают νβ-3, νβ-14, 20νβ-17 и να17. Следовательно, вакцинация ДНК-конструкцией, кодирующей, по крайней мере, один из таких белков будет вызывать иммунный ответ, который направлен на Т-клетки, вовлеченные в развитии РА. Смотрите статьи: Но\\е11 М. Ό. е1 а1., 1991 Ргос. №й. Асай. 8с1. И8А 88:10921-10925; РФатб X. е1 а1, 1991 §с1епсе 253:325-329; ХУППапъ V. е1 а1., 1992 1 СНп. 1^е8Р 90:326-333. Каждая из которых приведена в этой заявке посредством ссылки. В случае МС охарактеризовано несколько специфических вариабельных участков ТСК, вовлеченных в развитие этой болезни. Эти ТСК включают νβ-7 и να-10. Следовательно, вакцинация ДНК-конструкцией, кодирующей, по крайней мере, один из таких белков будет вызывать иммунный ответ, который направлен на Т-клетки, вовлеченные в развитие МС. Смотрите статьи: \УисйетрГептд К. е1 а1., 1990 §тепсе 248:1016-1019; ОккепЬетд 1. К. е1 а1, 1990 ИаШте 345:344-346. Каждая из которых включена в эту заявку посредством ссылки.
- 16 026926
В случае заболевания склеродермой охарактеризовано несколько специфических вариабельных участков ТСК, вовлеченных в развитие этой болезни. Эти ТСК включают νβ-6, νβ-8, νβ-14 и να-16, να-ЗС, να-7, να-14, να-15, να-16, να-28, να-12. Следовательно, вакцинация ДНК-конструкцией, кодирующей по крайней мере один из таких белков будет вызывать иммунный ответ, который направлен на Т-клетки, вовлеченные в развитие склеродермы.
Для того чтобы лечить пациентов, страдающих от аутоиммунного заболевания, опосредованного Тклетками, особенно тех, для которых вариабельные участки ТСК еще не были охарактеризованы, выполняется синовиальная биопсия. Могут быть отобраны образцы присутствующих Т-клеток и с помощью использования стандартных методик идентифицировать вариабельные участки таких ТСК. Генетические вакцины могут создаваться на основании этой информации.
Аутоиммунные заболевания, опосредованные В-клетками, включают волчанку (СКВ - системную красную волчанку), базедову болезнь (болезнь Грейвса), тяжелую миастению, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунную тробоцитопению, астму, криоглобулемию, первичный склероз желчных путей и пернициозную анемию. Для каждого из этих заболеваний существуют характерные антитела, связывающиеся с эндогенными антигенами и инициирующие воспалительные каскады, ассоциированные с аутоиммунными заболеваниями. Вакцинация против вариабельного участка антител будет вызывать иммунный ответ, вовлекая цитотоксические Т-лимфоциты (СТЬ) для удаления тех В-клеток, которые продуцируют эти антитела.
Для того чтобы лечить пациентов, страдающих от аутоиммунного заболевания, опосредованного Вклетками, должны быть идентифицированы вариабельные участки антител, задействованных в аутоиммунную активность. Может проводиться биопсия, и могут отбираться образцы антител, присутствующие в зоне воспаления. Вариабельные участки таких антител могут быть идентифицированы с помощью стандартных методик. Генетические вакцины могут создаваться на основании этой информации.
В случае заболевания СКВ, один антиген, полагают, является ДНК. Следовательно, у пациентов, которых необходимо иммунизировать от СКВ, образцы их сыворотки крови могут быть проверены на присутствие антител против ДНК, и может быть приготовлена вакцина, которая содержит ДНКконструкции, кодирующие вариабельный участок таких найденных в сыворотке антител против ДНК.
Общие структурные характеристики между вариабельными участками и ТСК и антител хорошо известны. ДНК последовательность, кодирующая особый ТСК или антитело, обычно может быть найдена следующими хорошо известными методами, такими как описано в издании КаЪа1 с1 а1. 1987. Последовательность важных для иммунологии белков. Министерство здравоохранения и социального обеспечения США, г. Бетесда, штат Мэриленд, которая включена в эту заявку посредством ссылки. Кроме того, общий метод клонирования функциональных вариабельных участков антител может быть найден в публикации СЬаиййагу ν. К. е1 а1. Ргос. Май. Асай 8с1. И8А, 1990, 87:1066, которая включена в эту заявку посредством ссылки.
В дополнение к использованию способных к экспрессии форм последовательностей, кодирующих иммуномодулирующие белки, для улучшения генетических вакцин настоящее изобретение относится к улучшенным аттенуированным живым вакцинам и улучшенным вакцинам, которые используют рекомбинантные векторы для доставки чужеродных генов, кодирующих антигены. Примеры аттенуированных живых вакцин и вакцин с рекомбинантными векторами для доставки чужеродных генов описаны в патентах США №№: 4722848; 5017487; 5077044; 5110587; 5112749; 5174993; 5223424; 5225336; 5240703; 5242829; 5294441; 5294548; 5310668; 5387744; 5389368; 5424065; 5451499; 5453364; 5462734; 5470734 и 5482713, которые включены в эту заявку посредством ссылки. Приведенные генные конструкции включают нуклеотидную последовательность конструкции 1Ь-12 или ее функциональные фрагменты, в которых нуклеотидная последовательность функционально связана с регуляторными последовательностями, способными функционировать в вакцине для управления экспрессией. Эти генные конструкции вводятся в аттенуированные живые вакцины и рекомбинантные вакцины для получения улучшенных вакцин согласно этому изобретению.
Эти вакцины могут дополнительно содержать фармацевтическиприемлемые вспомогательные вещества. Фармацевтическиприемлемые вспомогательные вещества могут быть фунциональными молекулами, такими как транспортирующие молекулы, адъюванты, носители или растворители. Фармацевтическиприемлемое вспомогательное вещество может быть облегчающим трансфекцию агентом, который может содержать поверхностно-активные вещества, такие как иммуностимулирующие комплексы (ИСКОМ), неполный адъювант Фрейнда, аналог липополисахарида (ЛПС), включая монофосфорил-липид А, мураминовые пептиды, аналоги хинонов, транспортирующие молекулы, такие как сквален, гиалуроновую кислоту, липиды, липосомы, кальциевые ионы, вирусные белки, полианионы, поликатионы, наночастицы или другие известные агенты, облегчающие трансфекцию.
Облегчающими трансфекцию агентами являются полианионы, поликатионы, включая поли-Ь- глютамат (ЬО8), или липиды. Облегчающий трансфекцию агент - поли-Ь-глютамат предпочтительнее полиЬ-глютамат вводится в вакцины в концентрации менее 6 мг/мл. Облегчающий трансфекцию агент также может содержать поверхностно-активные вещества, такие как иммуностимулирующие комплексы (ИС- 17 026926
КОМ), неполный адъювант Фрейнда, аналог ЛПС, включая монофосфорил-липид А, мураминовые пептиды, аналоги хинонов и транспортирующие молекулы, такие как сквален и гиалуроновую кислоту, которые также могут назначаться в сочетании с генетической конструкцией. В некоторых вариантах осуществления изобретения ДНК-плазмидные вакцины также могут включать такие облегчающие трансфекцию агенты как липиды, липосомы, включая лецитиновые липосомы или другие липосомы, известные в этой области знания как ДНК-липосомные смеси (см. например УО 9324640), кальциевые ионы, вирусные белки, полианионы, поликатионы, наночастицы или другие известные агенты, облегчающие трансфекцию. Предпочтительными облегчающими трансфекцию агентами являются полианионы, поликатионы, включая поли-Ь- глютамат (ЬО8), или липиды. Концентрация агента для трансфекции в составе вакцины может быть менее 4, менее 2, менее 1, менее 0,750, менее 0,500, менее 0,250, менее 0,100, менее 0,050 или менее 0,010 мг/мл.
Фармацевтическиприемлемым вспомогательным веществом может быть один или более дополнительных адъювантов. Адъюванты могут обеспечиваться другими генами, которые экспрессируются на этой же или на другой плазмиде, или вводятся в виде белков в комбинации с вышеупомянутой плазмидой в вакцине. Одним или большим количеством адъювантов могут быть белки и/или молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, выбранные из групп состоящих из α-интерферона (ΙΡΝ-α), βинтерферона (ΙΡΝ-β), γ-интерферона, тромбоцитарного фактора роста (ΡΌΟΡ), факторов некроза опухолей (ΤΝΡα, ΤΝΡβ), гранулоцито-макрофаго-колониестимулирующего фактора (ОМ-С8Р), эпидермального фактора роста (ЕОР), хемокина кожи, привлекающего Т-клетки (СТАСК), экспрессируемого тимусом эпителиального хемокина (ТЕСК), эпителиального хемокина, связанного со слизистыми (МЕС), интерлейкина-15 (ГЬ-15), включая ГЬ-15, обладающий сигнальной или кодирующей последовательностью, которые кодируют последовательность с изъятой сигнальной последовательностью или дополнительно включающую разные сигнальные пептиды, такие как из 1дЕ, или кодирующие последовательности разных сигнальных пептидов, таких как 1дЕ, 1Ь-28, МНС, СО80, СО86, 1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-10, 1Ь18, МСР-1, ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β, 1Ь-8, Ь-селектина, Р-селектина, Е-селектина, СЭ34. О1уСАМ-1, МабСАМ-1, ЬРА-1, УЬА-1, Мас-1, р150.95, РЕСАМ, 1САМ-1, 1САМ-2, 1САМ-3, СО2, ЬРА-3, М-С8Р, О-С8Р, мутантных форм 1Ь-18, СЭ40, СО40Ь, фактора роста сосудов, фактора роста фибробластов, 1Ь-7, фактора роста нервов, фактора роста эндотелия сосудов, Рак, рецептора ΤΝΡ, Ρ1ΐ, Аро-1, р55, У§Ь-1, ΌΚ3, ТКАМР, Аро-3, А1К, ΙΑΡΙλ ΝΟΚΡ, ΌΚ4, ΌΚ5, КШЬЕК, ТКА1Ь-К2, ТК1СК2, ΌΚ6, каспазы 1СЕ, Рок, суии, 8р-1, Ар-1, Ар-2, р38, р65Ке1, МуЭ88, 1КАК, ТКАР6, 1кВ, инактивированного ΝΙΚ, §АР К, 8АР-1, ΊΝΚ, генов, отвечающих на интерфероны, ΝΡ1<Β, Вах, ТКАТЬ, ТКАТЬгес, ТКАТЕгесОКС5, ΤΚΛΙΕ-Κ3, ТКАТЬ-КГ, КАИК, КАИК ЬЮАТХЭ, Ох40, Ох40 ЬЮАТХЭ, ΝΚΟ2Ό, МГСА, МГСВ, ИКО2А, ΝΚΟ2Β, ИКО2С, ИКО2Е, МКО2Р, ТАР1, ТАР2 и их функциональных фрагментов или их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительным адъювантом может быть один или более белков и/или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих выбранные из групп, состоящих из: Ю-15, ΙΕ-28, СТАСК, ТЕСК, МЕС или хемокина, выделяемого Т-клетками при активации (КАЭТЕЗ). Примеры конструкций и последовательностей Ш-15 приведены в заявке согласно РСТ № РСТ/и804/18962 и соответствующей заявке на патент США серийный № 10/560650 и в заявке согласно РСТ № РСТ/и807/00886 и соответствующей заявке на патент США. серийный №12/160766 и в заявке согласно РСТ № РСТ/И810/048827. Примеры конструкций и последовательностей Ш-28 приведены в заявке согласно РСТ № РСТ/И809/039648 и соответствующей заявке на патент США серийный № 12/936192. Примеры конструкций и последовательностей ΚАNΤЕδ и других хемокинов приведены в заявке согласно РСТ № РСТ/И81999/004332 и соответствующей заявке на патент США серийный № 09/622452. Другие примеры конструкций и последовательностей КАЭТЕ8 приведены в заявке на РСТ № РСТ/И811/024098. Примеры конструкций и последовательностей ΚАNΤЕδ и других хемокинов приведены в заявке согласно РСТ № РСТ/И81999/004332 и соответствующей заявке на патент США серийный № 09/622452. Другие примеры конструкций и последовательностей КАЭТЕ8 приведены в заявке на РСТ № РСТ/И811/024098. Примеры конструкций и последовательностей хемокинов СТАСК, ТЕСК и МЕС приведены в заявке согласно РСТ № РСТ/и§2005/042231 и соответствующей заявке на патент США серийный № 11/719646. Примеры ОХ40 и других иммуномодуляторов приведены в заявке на патент США серийный № 10/560653. Примеры ЭК5 и других иммуномодуляторов приведены в заявке на патент США серийный № 09/622452.
Вакцина может дополнительно содержать агент содействия генетической вакцине, как описано в заявке на патент США серийный № 021579, поданной 1 апреля 1994 года, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки.
Эта вакцина может включать консенсусные антигены и плазмиды в количествах от около 1 до 100 мг, от около 1 мкг и до около 10 мг или предпочтительно от около 0,1 мкг и до около 10 мг или более предпочтительно от около 1 и до около 2 мг. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фармацевтические составы согласно данному изобретению включают от около 5 нг до около 1000 мкг ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фармацевтические составы содержат от около 10 нг до около 800 мкг ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фармацевтические составы содержат от около 0,1 до около 500 мкг ДНК. В
- 18 026926 некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фармацевтические составы содержат от около 1 до около 350 мкг ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фармацевтические составы содержат от около 25 до около 250 мкг, от около 100 до около 200 мкг, от около 1 нг до около 100 мг, от около 1 мкг до около 10 мг, от около 0,1 мкг до около 10 мг, от около 1 и до около 2 мг, от около 5 нг до около 1000 мкг, от около 10 нг до около 800 мкг, от около 0,1 до около 500 мкг, от около 1 до около 350 мкг, от около 25 до около 250 мкг, от около 100 до около 200 мкг консенсусного атигена или кодирующей его плазмиды.
Вакцина может быть составлена согласно способу ее применения. Инъекционные фармацевтические составы вакцин должны быть стерильными, не содержать пирогенов и механических частиц. Следует использовать изотоническую рецептуру или раствор. Добавки для обеспечения изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, манит, сорбит или лактозу. Эта вакцина может включать агент, отвечающий за сужение сосудов. Такие изотонические растворы могут содержать фосфатно-солевой буферный раствор. Состав вакцины дополнительно может содержать стабилизаторы, включая желатин и альбумин. Стабилизаторы, такие как ЬОЗ, поликатионы или полианионы, введенные в состав вакцины, должны обеспечивать стабильность рецептуры при комнатной температуре или температуре окружающей среды в течение длительных периодов времени.
Способы доставки вакцины.
Приводимый в настоящей заявке способ доставки вакцины, содержащей конструкции с 1Ь-12, необходим для создания иммунных ответов, эффективных против иммуногенов вакцины. Этот способ доставки вакцины или проведения вакцинации может обеспечивать индуцирование терапевтического или профилактического иммунного ответа. Процесс вакцинации может генерировать у млекопитающих иммунный ответ против иммуногенов. Вакцина может вводиться реципиентам для модулирования активности иммунной системы млекопитающих и усиливать иммунный ответ. Введение вакцин может выполняться трансфекцией последовательностей, кодирующих иммуноген и конструкции 1Ь-12, расположенных на одной или более молекул нуклеиновый кислот. Кодирующие последовательности, экспрессирующиеся в клетках, доставляются до поверхности клеток, с помощью которых иммунная система распознает и индуцирует клеточный, гуморальный или клеточный и гуморальный ответы. Доставка вакцин может применяться для индуцирования и получения иммунного ответа у млекопитающих против иммуногена путем введения им описанной выше вакцины. Включение в состав вакцин конструкций 1Ь-12 ведет к более эффективному иммунному ответу.
После доставки вакцин и плазмид в клетки млекопитающих трансфицированные клетки будут экспрессировать и секретировать иммуногены и 1Ь-12, которые кодируются плазмидами, введенными с вакциной. Эти иммуногены будут распознаваться иммунной системой как чужеродные белки, и против них будут вырабатываться антитела. Эти антитела будут распознаваться иммунной системой, что обеспечит эффективный ответ при последующих инфицированиях. Присутствие 1Ь-12, кодируемого конструкциями 1Ь-12, приведет к более выраженному иммунному ответу.
Эта вакцина может назначаться млекопитающим для обеспечения формирования у них иммунного ответа. Млекопитающими могут быть люди, приматы, нечеловекообразные обезьяны, коровы, рогатый скот, овцы, козы, антилопы, бизоны, азиатские буйволы, жвачные животные, олени, ежи, слоны, ламы, альпаки, мыши, крысы и куры.
Комбинированные схемы лечения.
Конструкции 1Ь-12 могут назначаться в комбинации с другими белками или генами, которые кодируют один или более продуктов:
α-интерферон (ΙΡΝ-α), β-интерферон (ΙΡΝ-β), γ-интерферон, тромбоцитарный фактор роста (ΡΌΟΡ), факторы некроза опухолей (ΤΝΡα, ΤΝΡβ), гранулоцито-макрофаго-колониестимулирующий фактор (СМ-С8Р), эпидермальный фактор роста (ЕСР), хемокин кожи, привлекающий Т-клетки (СТАСК), экспрессируемый тимусом эпителиальный хемокин (ТЕСК), эпителиальный хемокин, связанный со слизистыми (МЕС), 1Ь-15, включая 1Ь-15, с изъятой сигнальной последовательностью или обладающий дополнительной последовательностью, включающей сигнальный пептид 1дЕ, МНС, СЭ80. СЭ86. 1Ь-1, 1Ь-2, ГО-4, ГО-5, 1Ь-6, 1Ь-10, ГО-18, ГО-28, МСР-1, ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β, ГО-8, КАЫТЕЗ, Ь-селектина, Р-селектина, Еселектина, СО34, О1уСАМ-1, МаДСАМ-1, ЬРА-1, УЬА-1, Мас-1, р150.95, РЕСАМ, 1САМ-1, 1САМ-2, 1САМ-3, СИ2, ЬРА-3, М-СЗР, С-СЗР, ГО-14, мутантных форм ГО-18, СИ40, ί'.Ό40Ε фактора роста сосудов, фактора роста фибробластов, ГО-7, фактора роста нервов, фактора роста эндотелия сосудов, Рак, рецептора ΤΝΡ, РН, Аро-1, р55, АЗЬ-1, ΌΚ3, ТКАМР, Аро-3, А1К, Ι.ΆΚΙλ ΝΟΚΡ, ΌΚ4, ΌΚ5, КГОЬЕК, ТКАГО-К2, ТК1СК2, ΌΚ6, каспазы 1СЕ, Рок, с-]ии, Зр-1, Ар-1, Ар-2, р38, р65Ке1, МуО88, 1КАК, ТКАР6, 1кВ, инактивированного ΝΙΚ, ЗАР К, ЗАР-1, ΙΝΚ, генов, отвечающих на интерфероны, ΝΡΚΒ, Вах, ТКАГО, ТКАГОгес, ТКАП.гесОКСл ТКАГО-К3, ТКАГО-К4, ΕΛΝ^ КАИК Ι.ΙΟΆΝΙλ 0x40, 0x40 Ι.ΙΟΆΝΙλ НКС2Э, МБСА, МБСВ, NΚΟ2А, NΚΟ2Β, NΚΟ2С, NΚΟ2Е, NΚΟ2Ρ, ТАР1, ТАР2 и их функциональных фрагментов или их комбинаций.
Вакцина может вводиться разными путями, включая оральный, парентеральный, сублингвальный, трансдерамальный, ректальный, трансмукозальный, местный, через ингаляции, путем буккального вве- 19 026926 дения, интраплевральный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, назальный, интратекальный и внутрисуставный или их сочетаниями. При ветеринарном применении этот состав может вводиться с помощью подходящей приемлемой рецептуры в соответствии с нормальной ветеринарной практикой. Ветеринары без труда могут определить режим дозирования и путь введения, которые являются наиболее подходящими для данного вида животных. Вакцина может вводиться обычными шприцами, устройствами для проведения безыгольных инъекций, пушками для микропроецированной бомбардировки генами или другими физическими методами, такими как электропорация (ЭП), гидродинамическим методом или с помощью ультразвука.
Плазмида вакцины может быть доставлена в организм млекопитающего несколькими хорошо известными техниками, включающими инъекцию ДНК (также именуемая как ДНК-вакцинация) с или без применения электропорации ίη νίνο, с помощью липосом, с участием наночастиц, рекомбинантными векторами, такими как рекомбинантные аденовирусы, рекомбинантными вирусами, связанными с аденовирусом и рекомбинантной осповакциной. Консенсусный антиген может доставляться через ДНКинъекцию равно как и электропорацией ίη νίνο.
Электропорация.
Введение вакцины с помощью электропорации плазмид вакцины может выполняться с использованием устройств для электропорации, которые могут быть настроены для доставки в требуемые ткани животных под действием импульса энергии, эффективного для образования двусторонних пор, формируемых в клеточных мембранах. Предпочтительным является импульс энергии постоянного тока сходного с предустановленной пользователем исходной силой тока. Устройство для электропорации может состоять из компонента для электропорации и набора электродов или ручного устройства. Компонент для электропорации может включать и состоять из одного или более элементов устройства для электропорации, включая контроллер, генератор формы кривой тока, измеритель импеданса, регистратор формы кривой тока, входной элемент, элемент фиксирующий состояние прибора, коммуникационный порт, элемент памяти, источник питания и выключатель питания. Электропорация может проводиться в условиях ίη νίνο с использованием устройства для электропорации, например системы для ЭП СЕЬЬЕСТКА (Ιηονίο РЬагтасеиИсаН, В1ие Ве11, РА) или электропоратор Е1деп (СспсЦошсу 8ап Οίοβο, СА) для облегчения проведения трансфекции клеток плазмидами.
Компонент для электропорации может функционировать как единственный элемент устройств для электропорации, а другие элементы являться отдельными элементами (или компонентами), соединенными с компонентом для электропорации. Компонент для электропорации может функционировать в виде более чем одного элемента устройств для электропорации, которые могут соединяться с оставшимися другими элементами устройств для электропорации, отделенных от компонента для электропорации. Элементы устройств для электропорации, существующие как составляющие части электромеханического или механического устройства не следует функционально ограничивать, так как элементы могут функционировать как одно устройство или как отдельные элементы, связанные один с другим. Компонент для электропорации может обеспечивать подачу импульса энергии, который создается при постоянной силе тока в требуемой ткани и с участием механизма обратной связи. Набор электродов может включать решетку электродов, несущую множество электродов, расположенных в пространстве упорядочено, в котором набор электродов получает импульс энергии из компонента для электропорации и передает его в неизменном виде через электроды до требуемых тканей. По крайней мере один из множества электродов является нейтральным и в момент передачи импульса энергии измеряет импеданс нужной ткани и передает значение импеданса компоненту для электропорации. Механизм обратной связи может получить измеренный импеданс и скорректировать импульс энергии, полученный от компонента для электропорации для поддержания постоянного тока.
Множество электродов может передавать импульс энергии в виде децентрализованного набора. Множество электродов могут передавать импульс энергии в виде децентрализованного набора благодаря контролю электродов в запрограмированной последовательности. Запрограмированная последовательность вводится пользователем посредством компонента для электропорации. Запрограмированная последовательность может состоять из множества импульсов, подаваемых последовательно, причем каждый импульс из этого множества импульсов подается через по меньшей мере два активных электрода с использованием одного нейтрального электрода, измеряющего импеданс. При этом последующий импульс из множества импульсов подается другим из по крайней мере двух активных электродов с использованием одного нейтрального электрода, измеряющего импеданс.
Механизм обратной связи может быть выполнен в виде аппаратного или программного обеспечения. Механизм обратной связи может быть выполнен в виде петли с аналоговым закрытым контуром. Обратная связь срабатывает каждые 50, 20, 10 или 1 мкс, но предпочтительно работает в режиме реального времени или незамедлительно (т.е. практически мгновенно, как определяет доступная техника по определению времени отклика). Нейтральный электрод может измерять импеданс в требуемой ткани и передавать значение импеданса механизму обратной связи. И механизм обратной связи отвечает на значение импеданса и регулирует импульс энергии для поддержания постоянного тока в значении, аналогичном предустановленной силе тока. Механизм обратной связи может постоянно и немедленно под- 20 026926 держивать постоянный ток во время подачи импульса энергии.
Примеры устройств для электропорации и методов проведения электропорации, которые могут способствовать доставке ДНК-вакцин настоящего изобретения, включают те устройства и способы, описанные в патенте США № 7245963 авторов ЭгадЫа-АкН е1 а1., публикации патента США 2005/0052630, поданного авторами διηίΐΐι е1 а1., содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Другие устройства для электропорации и методы проведения электропорации, которые могут быть использованы для облегчения доставки ДНК-вакцин, включают те устройства и способы, приведенные в рассматриваемой совместно и в соавторстве заявке на патент США серийный № 11/874072, поданной 17 октября 2007 года, которая заявляет приоритет согласно ст. 119(е) 35 Свода законов США (И8С) по отношению к предварительным заявкам сер. № 60/852149, поданной 17 октября 2006 г, и № 60/978982, поданной 10 октября 2007 г., содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылок.
Патент США № 7245963 авторов ЭгадЫа-АкП е1 а1. описывает модульные электродные системы и их использование для облегчения введения биомолекул в клетки требуемой ткани организма человека, животных или растений. Модульные электродные системы могут включать множество игольчатых электродов, подкожную иглу, электрический соединитель, обеспечивающий проводное соединение с программируемым контроллером импульсов постоянного тока для множества игольчатых электродов, и источник питания. Оператор может использовать множество игольчатых электродов, собранных в поддерживающую конструкцию, и прочно вставлять их в выбранную ткань организма или растения. Потом через подкожную иглу необходимые биомолекулы вводятся в выбранную ткань. Активируется программируемый контроллер импульсов постоянного тока, и на множество игольчатых электродов подается электрический импульс постоянного тока. Поданный электрический импульс постоянного тока способствует введению биомолекул в клетки, расположенные между множеством игольчатых электродов. Полное содержание патента США № 7245963 включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Публикация патента США 2005/0052630, поданного авторами διηίΐΐι е1 а1., описывает устройство для электропорации, которое может использоваться для эффективного облегчения введения биомолекул в клетки выбранной ткани организма или растения. Устройство для электропорации включает электрокинетическое устройство (ЭКУ), режим работы которого определяется программным или аппаратным обеспечением. ЭКУ под контролем пользователя и на основе введенных параметров импульса создает серии наборов программируемых импульсов постоянного тока между электродами решетки и позволяет хранить и накапливать данные о форме кривой тока. Устройство для электропорации также содержит заменяемый диск с электродами, несущий решетку игольчатых электродов, центральный канал для введения для инъекционной иглы и съемную установочную шайбу. Полное содержание публикации патента США 2005/0052630 включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Решетки электродов и способы их использования, описанные в патенте США № 7245963 и публикации патента США 2005/0052630, могут быть приспособлены к глубокому проникновению не только в ткани, такие как мышцы, но также и в другие ткани или органы. Благодаря конфигурации электродной решетки инъекционная игла (для доставки выбранного типа биомолекул) также целиком вводится в орган-мишень, а инъекция проводится перпендикулярно органу-мишени в область, которая предварительно разграничена электродами. Электроды, описанные в патенте США № 7245963 и публикации патента США 2005/005263, преимущественно имеют размеры 20 мм длиной и диаметром калибра 21.
Дополнительно в некоторых вариантах осуществления изобретения, которые включают устройства для электропорации и их использование, предусмотрены такие устройства для электропорации, которые описаны в следующих патентах: патент США 5273525 выдан 28 декабря 1993 г., патенты США 6110161 выдан 29 августа 2000 г., 6261281 выдан 17 июля 2001 г., 6958060 выдан 25 октября 2005 г. и 6939862 выдан 6 сентября 2005 г. Помимо этого патенты, охватывающие объект изобретения, представлены в патенте США 6697669, выданном 24 февраля 2004 года, который касается доставки ДНК с использованием какого-либо из множества устройств, и в патенте США 7328064, выданном 5 февраля 2008 года, который описывает способ введения ДНК как предусмотрено в данной заявке. Все вышеуказанные патенты в их полном содержании включены в настоящую заявку посредством ссылок.
Способ приготовления ДНК-плазмид.
Представленные в настоящей заявке методы приготовления ДНК-плазмид, которые содержат ДНКконструкции и вакцины, обсуждаются в этой заявке. ДНК-плазмиды, после стадии последнего субклонирования в системе экспресии плазмид млекопитающих, могут быть использованы для инокуляции клеточной культуры в реакторе для крупномасштабной ферментации, применяя известные в этой области знания способы.
ДНК-плазмиды для использования в устройствах для ЭП настоящего изобретения могут быть созданы или получены с применением комбинации известных устройств и технологий, но преимущественно их получают, применяя оптимизированную технологию получения плазмид, которая описана в совместно-рассматриваемой предварительной заявке патента США, составляющего предмет лицензии, серийный № 60/939792, поданной 23 мая 2007 г. В некоторых примерах ДНК-плазмиды, применяемые в этих исследованиях, могут быть составлены в концентрациях более или равных 10 мг/мл. Такие технологии по- 21 026926 лучения также содержат или включают различные устройства и протоколы, широко известные тем лицам, которые обладают обычными знаниями в этой области техники. Дополнительно технологии описаны в патенте США серийный № 60/939792, включая описанные в патенте, составляющем предмет лицензии, патенте США № 7238522, выданном 3 июля 2007 г. Указанные выше заявка и патент США серийный № 60/939792 и 7238522 соответственно в их полном содержании включены в настоящую заявку посредством ссылок.
Иммуномодулирующие составы и способы их применения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих субъединицы ГО-12, доставляются без добавления последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих иммуноген. В таких способах применения последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих субъединицы ГО-12, используются как иммунотерапевтические препараты, которые при экспрессии синтезируют функциональный ГО-12, вызывающий у пациента желаемый иммуномодулирующий эффект. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих субъединицы ГО-12, применяются и доставляются, как описано выше, за исключением последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих иммуноген. В таких способах применения последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих субъединицы ГО-12, могут использоваться сами как иммунотерапевтические препараты по себе или в сочетании с другими иммуномодулирующими белками, такими как описаны выше в разделе озаглавленном комбинированные схемы лечения.
Примеры
Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими примерами. Следует понимать, что эти примеры при указании предпочтительных вариантов осуществления изобретения даются таким образом, чтобы служить только иллюстрацией. Из вышеприведенного описания и этих примеров опытный в этой сфере техники человек может установить значимые характеристики этого изобретения и, не отходя от сущности и сферы этого изобретения, может создать разные изменения и модификации этого изобретения для того, чтобы приспособить его к различным видам применения и условий использования. Поэтому разные модификации этого изобретения, дополнительно показанным и описанным в настоящей заявке, будут очевидны из вышеизложенного описания тем лицам, которые обладают опытом в этой сфере знаний. Такие модификации также подразумеваются как такие, которые попадают под прилагаемую формулу изобретения.
Пример 1. Сравнение уровней экспрессии последовательностей р1шГО-12-ор1 и рНиГО12-попорН
Сравнение уровней экспрессии последовательностей р1шГО-12-ор1 и рНиГО12-попор1 было выполнено для того, чтобы показать, что важные подходы оптимизации кодонов/РНК способны усилить уровни экспрессии/адъювантное действие созданного синтетического ГО-12.
Клетки 293Т (7,5х 105), которые подвергли трансфекции с помощью 2 или 4 мкг последовательностей соответственно 1шГО-12-ор1 и НиГО12-попор1 в 6-луночных планшетах, используя реагент для трансфекции РиСеиеб (КосНе АррНеб §аепсе, ГОЛапароНк, ΙΝ) согласно инструкции производителя. ДНК и реагент для трансфекции РиСепе6 добавляли последовательно к среде без сыворотки в соотношении ДНК:РиСепе6 1 мг ДНК на 3 мкг реагента РиСепе6. Объем среды без сыворотки определяли по количеству, необходимому для получения общего объема всей смеси, равного 200 мкл. Эту смесь добавляли к каждой лунке с клетками и инкубировали планшет в течение 48 ч при температуре 37°С и атмосфере СО2 5%. После завершения инкубации были отобраны образцы супернатанта для анализа с помощью иммуноферментного анализа (ЕЫ§Л).
Планшеты с высокой способностью связывания белков (Νιιικ. КосНейег. ΝΥ) были покрыты моноклональными антителами МТ86/221 по 100 мкл/лунка из набора для определения ГО-12 человека методом ЕЬГОЛ (МаЫесН, МапешопЬ ОН) и инкубировались в течение ночи при температуре 4°С. После такой инкубации планшеты промывали дважды фосфатно-солевым буфером с Твином (Тгееп) - РВ8Т (фосфатно-солевой буфер Дюльбекко - ЭРВ§ с 0,1% Твин 20) и заблокированы выдержкой в течение 1 ч после добавления по 200 мкл/лунка раствора ЭРВ§ с 0,05% Твин 20 и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (В8Л). В дальнейшем планшеты промывали раствором РВ8Т. С использованием белка НГО-12 р70 был приготовлен положительный стандарт согласно инструкциям производителя (МаЫесН, Мапешоп1, ОН). Образцы положительного стандарта и супернатанта были добавлены в объеме 100 мкл/лунка в лунки в двух повторностях при разведениях 1:50, 1:150, 1:450, 1:1350 и 1:4050. Эти образцы и положительные стандарты были разбавлены с использованием вышеупомянутого блокирующего раствора. Далее планшеты инкубировали в течение ночи при температуре 4°С. Затем планшеты промывали раствором РВ8Т и инкубировали в течение 1 ч с 100 мкл/лунка моноклональных антител МТ618, меченных биотином (тАВ МТ618-ЫоНп) (МаЫесН, МапетоШ, ОН). После инкубации планшеты снова промывали и инкубировали в течение 1 ч с 100 мкл/лунка с пероксидазой хрена, меченной стрептавидином (§1гер!ауИш-НКР), разбавленной до концентрации 1:1000 блокирующим буферным раствором. Потом планшеты снова промывали раствором РВ8Т и определяли связывание с помощью тетраметилбензидина (ТМВ) и 2Ν раствора Н2§40. Планшеты считывали на спектрофотометре при длине волны 450 нм.
Как показано на фиг. 1А и 1В, плазмида с последовательностью НиГО12-ор1 проявила более высокие уровни экспрессии ГО-12 по сравнению с плазмидой с последовательностью НиГО12-попорН Очевидно,
- 22 026926 что стратегия по оптимизации кодонов/ РНК повышает экспрессию Ш-12.
Пример 2. Усиление специфических клеточных иммунных ответов на антигены Р8А (специфический антиген простаты) и Р8МА (простатический специфический мембранный антиген), вызванных вакцинацией плазмидой рМасШ12-ор1.
Макак резусов иммунизировали 1 мг Р8А и Р8МА в комбинации с 0,04 мг плазмиды рМас1Ь-12-ор! внутримышечно с последующей электропорацией с помощью устройства Се11ес1га компании 1поую РРагшасеиЧсаЬ. Через две недели после каждой иммунизации у макак резусов отбирали кровь и изолировали мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) для количественного определения Р8Аи Р8МА методом иммуноферментных пятен (ЕЫ8ро1) со специфическим ΙΡΝ-γ. Для группы животных, получивших плазмиду рМас1Ь12-ор1, показано 3-кратное увеличение пикового ответа по сравнению с группой животных, не получивших плазмиду рМас1Ь12-ор! (фиг. 2).
Пример 3. Усиление специфических клеточных иммунных ответов на коровый и поверхностный антигены вируса гепатита В (ВГВ), вызванных вакцинацией плазмидой рМас1Ь12-ор1.
Макак резусов иммунизировали 1 мг корового и поверхностного антигена в комбинации с 0,04 мг плазмиды рМас1Ь-12-ор! внутримышечно с последующей электропорацией с помощью устройства Се11ес1га компании 1поую РРагшасеиЧсаЬ. Через две недели после каждой иммунизации у макак резусов отбирали кровь и изолировали РВМС для количественного определения корового и поверхностного антигена методом ЕЬ18ро1 со специфическим ΙΡΝ-γ. Для группы животных, получивших плазмиду рМасГЬ12орр показано увеличение размера и охвата клеточного ответа по сравнению с группой животных, не получивших плазмиду рМас1Ь12-ор! (фиг. 3).
Перечень последовательностей.
<110> тКе тгизтеез οί тНе иптуегзтту οί РеппзуКапта
Уап, этап мет пег, оаутс! в.
моггои, маттНеи р.
<120> КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ УЛУЧШЕННЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КОНСТРУКЦИИ 1Ь-12,
ВАКЦИНЫ, ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ <130> 133172.4102 <150> и5 61/569,600 <151> 2011-12-12 <160> 5 <170> Патент версии 3.5 <210> 1 <211> 660 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Оптим.нуклеиновая кислота субъединицы р35 11_—12 <400> 1
атдтдссссд стсддтссст дстдстддтс дстассстдд тсстдстдда тсасстдтса 60
стддстсдаа атстдсстдт сдстассссс датсстддса тдттсссстд сстдсассат 120
адссадаасс тдстдсдддс сдтдтссаат атдстдсада аадссадаса дасассддад 180
ттассстт дтасттстда ддааатсдас сасдаддата ттастаадда саааасстсс 240
асадссдаад сстдсстдсс астддадстд ассаадаасд аатсатдтст даасадсадд 300
дадасттсст ТсаТсассаа сдддтсттдс стддстадтс дсаадассад сттсатдатд 360
дсастдтдсс тдадстссат стасдаддат стдаадатдт атсаддсдда аттсаааасс 420
атдаасдста адстдстдат ддассстааа сдасадатст ттстддатса даататдстд 480
дсадтдаттд асдадстдат дсаддссстд аасттсааса дсдааассдт сссасадаад 540
тстадтстдд аддаасссда сттттатаад асааааатса адстдтдсат тстдстдсат 600
дсстттсдда ттсдддстдт састаттдат сдддтсатдт сатасстдаа сдсттсстаа 660
<210> 2 <211> 219 <212> ПРОТЕИН <213> искусственная последовательность <220>
<223> Оптим.нуклеиновая кислота субъединицы р35 11_—12 <400> 2 мет Суз Рго А1а Агд Вег ьеи ьеи ьеи Уа1 А1а тНг ьеи Уа1 ьеи ьеи 15 10 15
Азр нтз ьеи Вег ьеи А1а Агд Азп ьеи Рго Уа1 А1а тНг Рго Азр Рго 20 25 30
С!у мет РНе рго Суз ьеи НТЗ НТЗ 40 зег α! η АЗП ьеи ьеи Агд 45 а! а Уа1
35
Зег АЗП мет Ьеи С1п Ьу5 А1а Агд С1п тНг |_еи С1и РНе туг РГО Суз
50 55 60
тНг Зег С1и С1 и 11е Азр НТ5 С! и Азр 11е тНг ьуз АЗр ьуз ТНг зег
65 70 75 80
тНг Уа1 С1и А1а Су 5 |_еи РГО ьеи С! и ьеи тНг ьуз АЗП С1и зег Суз
85 90 95
ьеи АЗП Зег Агд С! и тНг Зег РНе 11е тНг АЗП С1у зег Суз ьеи а! а
100 105 110
Зег Агд ьуз ТНг зег РНе мет мет А1а ьеи Суз ьеи зег зег 11е туг
115 120 125
С1и АВр ьеи 1_у5 мет туг С1п Уа! С1и РНе |_уз тНг мет АЗП А1а ьуз
130 135 140
ьеи ьеи мет А5р РГО Ту 5 Агд С1п 11е РНе ьеи АЗр С1п АЗП мет ьеи
145 150 155 160
а! а Уа1 11е А5р с! и |_еи мет С1п А1а |_еи АЗП РНе АЗП Зег С!и тНг
165 170 175
Уа1 РГО С!п 1_у5 Зег Зег |_еи С1и С1и РГО АЗр РНе туг ьуз тНг ьуз
180 185 190
11е ьуз ьеи Суз 11е |_еи ьеи НТ5 А1а РНе Агд 11е Агд А1а уа! тНг
195 200 205
11е А5р Агд Уа! мет Зег туг |_еи АЗП А1а зег
210 215
<210> 3 <211> 987 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> Оптим.нуклеиновая кислота субъединицы р40 1Ь-12
<400> 3
ахдхдссахс ; адсадсхддх сахсхсххдд хххадхсхдд хдхххсхддс ххсхссасхд 60
дтсдстатст : дддаассдаа аааддатдтд тасдтддтсд адстддастд дтатссадат 120
дсасссддас 1 ааахддхддх ссхдассхдс дасасасссд аддаадахдд сахсасххдд 180
ассстддасс ; ададстссда ддтдстддда тстддсаада састдастат тсаддтсааа 240
дааххсдддс 1 атдссддаса дтасасатдт сасаадддсд дддаддхдсх дадхсасхса 300
схдсхдсхдс хдсахаадаа адаадасддс ахсхддхсха схдасаххсх дааддахсад 360
ааададсста адаасаааас сттсстдада тдсдаадста адааттатад тдддаддттт 420
ассхдххддх ддстдассас аахсхсаасх дассхдассх ххадсдхдаа ахсхадхадд 480
дддтсаадсд атссасаддд адтдасстдс ддадсадста састдадсдс сдадсдддТд 540
ададдадаса асааддадха сдаахахадх дхсдадхдсс аддаадаххс адссхдхссс 600
дсадссдадд аатссстдсс татсдаадтд атддтддасд стдтдсасаа дстдааатас 660
даааасхаса сахссхсххх схххаххсдс дасахсахха адссадахсс сссхааааас 720
стдсадстда адсссстдаа аааттсссда саддтддадд тстсттддда атассстдат 780
асатддадса схссасаххс ххахххсадх схдасххххх дсдхдсаддх ссадддсаад 840
адсааааддд адаадааада ссдсдтдттс ассдатаада сатссдстас тдтсатстдт 900
сдаааааасд саадсахххс сдтдсдддса саддахаддх аххаххссад садххддхсх 960
дадсдддстт ссдтсссттд тадттда 987
<210> 4 <211> 328 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Оптим.нуклеиновая кислота субъединицы р40 1Ь-12 <400> 4
мет 1 Су5 ΗΊ 5 С! η С!п 5 ьеи Уа! 1!е зег тгр 10 РНе Зег ьеи уа! РНе 15 ьеи
А1а зег РГО Ьеи Уа1 А! а 11е тгр С!и Ьеи Ьуз Ьуз Азр Уа! туг Уа!
20 25 30
уа! С1и ьеи АЗр тгр туг РГО АЗр а! а РГО С1у С1и мет Уа! уа! ьеи
35 40 45
тНг Су 5 Азр тНг РГО С!и С!и АЗр С!у 1!е тНг тгр тНг ьеи Азр С1п
50 55 60
зег зег С1 и Уа1 ьеи 0!у Зег 0!у ьуз ТНг ьеи ТНг 11е С1п Уа! ьуз
65 70 75 80
С! и РНе С1у Азр а! а С!у С!п туг тНг Суз НТ5 Ьу5 с! у с! у С! и уа!
85 90 95
Ьеи зег Нт 5 Зег Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи НТ 5 ьуз Ьуз С1и АЗр С1у 11е тгр
100 105 110
зег тНг Азр 11е ьеи ьуз Азр С!п ьуз С!и РГО Ьу5 АЗП ьуз тНг рНе
115 120 12 5
ьеи Агд Суз с! и а! а ьуз азп туг зег С!у Агд РНе тНг Суз тгр тгр
130 135 140
ьей ТНг тНг ιί е зег тНг Азр ьей тНг РНе зег Уа1 ьуз зег зег Агд
145 150 155 160
с!у Зег зег А5р РГО с1п с! у Уа1 тНг суз С1у А1а А1а ТНг ьей зег
165 170 175
А1а с1ы Агд Уа1 180 Агд с1у Азр АЗП ьуз 185 е1 и туг о!и туг зег 190 Уа1 с!и
Суз с!п с!и 195 А5р зег А1а суз Рго 200 А1а А1а с!и о!и зег 205 ьей РГО 11е
с!и Уа1 210 мег Уа1 Азр д1а Уа1 215 НТ 5 ьуз ьей ьуз туг 220 О1и А5П туг тНг
зег зег РНе РНе ιί е Агд Азр 11 е ιί е ьуз рго Азр РГО РГО ьуз АЗП
225 230 235 240
ьей с!п ьей ьуз РГО 245 ьей ьуз АЗП зег Агд 250 с!п Уа1 с!и Уа1 зег 255 тгр
с!и туг РГО А5р 260 тНг тгр зег тНг РГО 265 НТЗ зег туг РНе зег 270 ьей ТНг
РНе СУ5 Уа1 275 с!п Уа1 С1п с!у ьуз 280 зег ьуз Агд С1и ьуз 285 Ьуз Азр Агд
Уа1 РНе 290 ТНг Азр ьуз ТНг зег 295 А1а ТНг Уа1 Не суз 300 Агд Ьуз Азп А1а
Зег 11е Зег Уа1 Агд А1а С1п Азр Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег
305 310 315 320
С1и Тгр А1а Зег Уа1 Рго Суз Зег
<210> 5 <211> 18 <212> ПРОТЕИН <213> искусственная последовательность <220>
<223> Лидерная последовательность 1дЕ <400> 5
Μβΐ Азр Тгр ТНг Тгр 11е Ьей РНе Ьей Уа1 А1а А1а А1а ТНг Агд Уа1 15 10 15 плз 5ег

Claims (66)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Композиция, содержащая а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую субъединицу р35 1Ь-12 или ее функциональный фрагмент, и Ь) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую субъединицу р40 1Ь-12 или ее функциональный фрагмент, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 1Ь-12 или ее функциональный фрагмент, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности 8ЕО ГО № 1 и кодирующий белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности 5>ЕО ГО № 2, или кодирующая функциональный фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности 8ЕО ГО № 1 и кодирующей белок, по меньшей мере на 98% гомологичный функциональному фрагменту с последовательностью 5>ЕО ГО № 2, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р40 ГО-12 или ее функциональный фрагмент, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности 8ЕО ГО № 3 и кодирующий белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности 5>ЕО ГО № 4, или кодирующая функциональный фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности 8ЕО ГО № 3 и кодирующей белок, по меньшей мере на 98% гомологичный функциональному фрагменту с последовательностью 5>ЕО ГО № 4.
  2. 2. Композиция по п.1, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р35 ГО-12, по меньшей мере на 98% гомологичную последовательности 5>ЕО ГО № 1, и которая кодирует белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности 5>ЕО ГО № 2, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р40 ГО-12, по меньшей мере на 98% гомологичную последовательности 5>ЕО ГО № 3, и которая кодирует белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности 8ЕО ГО № 4.
  3. 3. Композиция по п.2, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р35 ГО-12, по меньшей мере на 98% гомологичную последовательности 5>ЕО ГО № 1, и которая кодирует белок, по меньшей ме- 25 026926 ре на 99% гомологичный последовательности 8ЕЦ ГО № 2, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р40 ГО-12, по меньшей мере на 98% гомологичную последовательности 8ЕЦ ГО № 3, и которая кодирует белок, по меньшей мере на 99% гомологичный последовательности 8ЕЦ ГО № 4.
  4. 4. Композиция по п.3, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р35 ГО-12, по меньшей мере на 98% гомологичную последовательности 8ЕЦ ГО № 1, и кодирует последовательность 8ЕЦ ГО № 2, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р40 ГО-12, по меньшей мере на 98% гомологичную последовательности 8ЕЦ ГО № 3, и кодирует последовательность 8ЕЦ ГО № 4.
  5. 5. Композиция по п.2, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р35 ГО-12, по меньшей мере на 99% гомологичную последовательности 8ЕЦ ГО № 1, и кодирует белок, по меньшей мере на 99% гомологичный последовательности 8ЕЦ ГО № 2, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р40 ГО-12, по меньшей мере на 99% гомологичную последовательности 8ЕЦ ГО № 3, и кодирует белок, по меньшей мере на 99% гомологичный последовательности 8ЕЦ ГО № 4.
  6. 6. Композиция по п.2, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р35 ГО-12, по меньшей мере на 99% гомологичную последовательности 8ЕЦ ГО № 1, и кодирует последовательность 8ЕЦ ГО № 2, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р40 ГО-12, по меньшей мере на 99% гомологичную последовательности 8ЕЦ ГО № 3, и кодирует последовательность 8ЕЦ ГО № 4.
  7. 7. Композиция по п.2, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р35 ГО-12 и является последовательностью 8ЕЦ ГО № 1, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует субъединицу р40 ГО-12 и является последовательностью 8ЕЦ ГО № 3.
  8. 8. Композиция по п.2, пригодная для доставки пациентам с применением электропорации.
  9. 9. Композиция по любому из пп.2-8, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 ГО-12, находится в разных молекулах нуклеиновой кислоты в отличие от последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей субъединицу р40 ГО-12.
  10. 10. Композиция по любому из пп.2-8, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 ГО-12, находится в одной плазмиде, а последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р40 ГО-12, находится в другой плазмиде.
  11. 11. Композиция по любому из пп.2-8, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 ГО-12, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р40 ГО-12, находятся в одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты.
  12. 12. Композиция по любому из пп.2-8, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 ГО-12, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р40 ГО-12, находятся в одной и той же плазмиде.
  13. 13. Композиция по любому из пп.2-8, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 ГО-12, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р40 ГО-12, находятся в одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты и функционально связаны с разными промоторами.
  14. 14. Композиция по любому из пп.2-8, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 ГО-12, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р40 ГО-12, находятся в одной и той же плазмиде и функционально связаны с разными промоторами.
  15. 15. Композиция по любому из пп.2-8, дополнительно содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуноген.
  16. 16. Композиция по любому из пп.2-8, дополнительно содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуноген патогена, выбранного из группы, состоящей из ВИЧ, ВПЧ, ВГС, вирусов гриппа, натуральной оспы, лихорадки Чикунгунья, ящура, возбудителя малярии, вируса цитомегаловируса человека, респираторно-синцитиального вируса человека и МГО8А.
  17. 17. Композиция по любому из пп.2-8, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 ГО-12, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р40 ГО-12, включены в вирусную частицу.
  18. 18. Композиция по любому из пп.2-8, дополнительно содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из интерлейкинов ГО-15
    - 26 026926 и ГО-28.
  19. 19. Композиция по п.1, содержащая а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный фрагмент р35 1Ь-12, который является последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности 8Е0 ГО № 1 и кодирующей белок, по меньшей мере на 98% гомологичный функциональному фрагменту последовательности 8ЕО ГО № 2, и/или Ь) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный фрагмент р40 ГО-12, который является последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности 8Е0 ГО № 3 и кодирующей белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности функционального фрагмента 8ЕО ГО № 4.
  20. 20. Композиция по п.19, содержащая а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный фрагмент р35 ГО-12, являющийся последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности 8ЕО ГО № 1 и кодирующей белок, по меньшей мере на 99% гомологичный функциональному фрагменту последовательности 8ЕЦ ГО № 2, и/или Ь) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный фрагмент р40 ГО-12, являющийся последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности 8ЕО ГО № 3 и кодирующей белок, по меньшей мере на 99% гомологичный последовательности функционального фрагмента 8ЕО ГО № 4.
  21. 21. Композиция по п.19, содержащая а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный фрагмент р35 ГО-12, являющийся последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности 8ЕО ГО № 1 и кодирующей функциональный фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 2, и/или Ь) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный фрагмент р40 ГО-12, являющийся последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности 8ЕО ГО № 3 и кодирующей функциональный фрагмент последовательности 8ЕЦ ГО № 4.
  22. 22. Композиция по п.19, содержащая а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный фрагмент р35 ГО-12, который является последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 99% гомологичной последовательности 8ЕО ГО № 1 и кодирующей функциональный фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 2, и/или Ь) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный фрагмент р40 ГО-12, который является последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 99% гомологичной последовательности 8ЕО ГО № 3 и кодирующей функциональный фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 4.
  23. 23. Композиция по п.19, содержащая а) фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 1, кодирующий функциональный фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 2, и/или Ь) фрагмент последовательности 8ЕЦ ГО № 3, кодирующий функциональный фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 4.
  24. 24. Композиция по п.19, содержащая а) фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 1, который не несет кодирующую последовательность сигнального пептида субъединицы р35 ГО-12, и/или Ь) фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 3, который не несет кодирующую последовательность сигнального пептида субъединицы р40 ГО-12.
  25. 25. Композиция по п.24, содержащая а) фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 1, который не несет кодирующую последовательность сигнального пептида субъединицы р35 ГО-12 и связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальный пептид, и/или Ь) фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 3, который не несет кодирующую последовательность сигнального пептида субъединицы р40 ГО-12 и связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальный пептид.
  26. 26. Композиция по п.19, содержащая а) фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 1, который не несет кодирующую последовательность сигнального пептида субъединицы р35 ГО-12 и связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность 8ЕО ГО № 5, и/или Ь) фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 3, который не несет кодирующую последовательность сигнального пептида субъединицы р40 ГО-12 и связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность 8ЕО ГО № 5.
  27. 27. Композиция по п.19, содержащая а) фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 1, кодирующий аминокислоты 23-219 последовательности 8ЕО ГО № 2, и/или Ь) фрагмент последовательности 8ЕЦ ГО № 3, кодирующий аминокислоты 23-328 последовательности 8ЕО ГО № 4.
  28. 28. Композиция по п.27, содержащая а) фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 1, кодирующий аминокислоты 23-219 последовательности 8ЕО ГО № 2, связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует сигнальный пептид, и/или Ь) фрагмент последовательности 8ЕЦ ГО № 3, кодирующий аминокислоты 23-328 последовательности 8ЕО ГО № 4, связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует сигнальный пептид.
  29. 29. Композиция по п.27, содержащая а) фрагмент последовательности 8ЕО ГО № 1, кодирующий аминокислоты 23-219 последовательности 8ЕО ГО № 2, связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность 8ЕО ГО № 5, и/или Ь) фрагмент последовательности 8ЕЦ ГО № 3, кодирующий аминокислоты 23-328 последовательности 880 Ш № 4, связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность 8Е0 ГО № 5.
    - 27 026926
  30. 30. Композиция по п.19, содержащая а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный фрагмент р35 1Ь-12, который является последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности δΞρ ГО № 1 и кодирующей белок, по меньшей мере на 98% гомологичный функциональному фрагменту последовательности δΞρ ГО № 2, не несущей кодирующую последовательность сигнального пептида субъединицы р35 ГО-12; и/или Б) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный фрагмент р40 ГО-12, который является последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности δΞρ ГО № 3 и кодирующей белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности функционального фрагмента последовательности δΞρ ГО № 4, не несущей кодирующую последовательность сигнального пептида субъединицы р40 ГО-12.
  31. 31. Композиция по п.30, содержащая а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный фрагмент р35 ГО-12, который является последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности δΞρ ГО № 1 и кодирующей белок, по меньшей мере на 98% гомологичный функциональному фрагменту последовательности δΞρ ГО № 2, функционально связанной с кодирующей последовательностью, которая кодирует сигнальный пептид, и/или Б) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент р40 ГО-12, который является последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности δΞρ ГО № 3 и кодирующей белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности функционального фрагмента δΞρ ГО № 4, функционально связанной с кодирующей последовательностью, которая кодирует сигнальный пептид.
  32. 32. Композиция по п.30, содержащая а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент р35 ГО-12, который является последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности δΞρ ГО № 1 и кодирующей белок, по меньшей мере на 98% гомологичный функциональному фрагменту последовательности δΞρ ГО № 2, функционально связанной с кодирующей последовательностью, которая кодирует последовательность δΞρ ГО № 5, и/или Б) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный фрагмент р40 ГО12, который является последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности δΞρ ГО № 3 и кодирующей белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности функционального фрагмента δΞρ ГО № 4, функционально связанной с кодирующей последовательностью, которая кодирует последовательность δΞρ ГО № 5.
  33. 33. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 ГО-12 или ее функциональный фрагмент, находится в разных молекулах нуклеиновой кислоты в отличие от последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей субъединицу р40 ГО-12 или ее функциональный фрагмент.
  34. 34. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 ГО-12 или ее функциональный фрагмент, находится в разных плазмидах в отличие от последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей субъединицу р40 ГО-12 или ее функциональный фрагмент.
  35. 35. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 ГО-12 или ее функциональный фрагмент, находится в одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты, как и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р40 ГО-12 или ее функциональный фрагмент.
  36. 36. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 ГО-12 или ее функциональный фрагмент, находится в одной и той же плазмиде, как и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р40 ГО-12 или ее функциональный фрагмент.
  37. 37. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 ГО-12 или ее функциональный фрагмент, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р40 ГО-12 или ее функциональный фрагмент, находятся в одной и той же плазмиде и функционально связаны с разными промоторами.
  38. 38. Композиция по п.1, дополнительно содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуноген.
  39. 39. Композиция по п.1, дополнительно содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуноген патогена, выбранного из группы, состоящей из ВИЧ, ВПЧ, ВГС, вирусов гриппа, натуральной оспы, лихорадки Чикунгунья, ящура, возбудителя малярии, вируса цитомегаловируса человека, респираторно-синцитиального вируса человека и ΜΚδΑ.
  40. 40. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 ГО-12 или ее функциональный фрагмент, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р40 ГО-12 или ее функциональный фрагмент, включены в вирусную частицу.
  41. 41. Композиция по п.1, дополнительно содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из интерлейкинов ГО-15 и ГО-28.
    - 28 026926
  42. 42. Способ индуцирования иммунного ответа против иммуногена, включающий назначение пациенту композиции по п.1 в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноген в количестве, достаточном для эффективной индукции иммунного ответа у данного пациента.
  43. 43. Способ по п.42, отличающийся тем, что композиция по п.1 дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноген.
  44. 44. Способ по п.42 или 43, отличающийся тем, что включает получение терапевтического иммунного ответа.
  45. 45. Способ по п.42 или 43, отличающийся тем, что включает получение профилактического иммунного ответа.
  46. 46. Молекула нуклеиновой кислоты, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей субъединицу р35 1Ь-12 или ее функциональный фрагмент, отличающейся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р35 1Ь-12, является по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности 8ЕЦ ίΌ № 1 и кодирующей белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности 8ЕЦ ίΌ № 2, и отличающейся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р35 ίΌ-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, которая представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности 8ЕЦ ίΌ № 1 и кодирует белок, по меньшей мере на 98% гомологичный функциональному фрагменту последовательности 8ЕЦ ίΌ № 2; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей субъединицу р40 ίΌ-12 или ее функциональный фрагмент, отличающейся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу р40 ίΌ-12, является по меньшей мере на 98% гомологичной последовательности 8ЕЦ ίΌ № 3 и кодирует белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности 8ЕЦ ίΌ № 4, и отличающейся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р40 ίΌ-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, которая представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности 8ЕЦ ίΌ № 3 и кодирует белок, по меньшей мере на 98% гомологичный функциональному фрагменту последовательности 8ЕЦ ίΌ № 4.
  47. 47. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности 8ЕЦ ίΌ № 1 и кодирует белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности 8ЕЦ ίΌ № 2; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности 8ЕЦ ίΌ № 3 и кодирует белок, по меньшей мере на 98% гомологичный последовательности 8ЕЦ ίΌ № 4.
  48. 48. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности 8ЕЦ ίΌ № 1 и кодирует белок, по меньшей мере на 99% гомологичный последовательности 8ЕЦ ίΌ № 2; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности 8ЕЦ ίΌ № 3 и кодирует белок, по меньшей мере на 99% гомологичный последовательности 8ЕЦ ίΌ № 4.
  49. 49. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности 8ЕЦ ίΌ № 1 и кодирует последовательность 8ЕЦ ίΌ № 2; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 98% гомологична последовательности 8ЕЦ ίΌ № 3 и кодирует последовательность 8ЕЦ ίΌ № 4.
  50. 50. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 99% гомологична последовательности 8ЕЦ ίΌ № 1 и кодирует белок, по меньшей мере на 99% гомологичный последовательности 8ЕЦ ίΌ № 2; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 99% гомологична последовательности 8ЕЦ ίΌ № 1 и кодирует белок, по меньшей мере на 99% гомологичный последовательности 8ЕЦ ίΌ № 2.
  51. 51. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 99% гомологична последовательности 8ЕЦ ίΌ № 1 и кодирует последовательность 8ЕЦ ίΌ № 2; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 99% гомологична последовательности 8ЕЦ ίΌ № 1 и кодирует последовательность 8ЕЦ ίΌ № 2.
  52. 52. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, включающая последовательность 8ЕЦ ίΌ № 1 и/или 8ЕО ίΌ № 3.
  53. 53. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р35 ίΌ-12, отличающейся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р35 ίΌ-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей собой фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности 8ЕЦ ίΌ № 1 и кодирует белок, по меньшей мере на 98% гомологичный функциональному фрагменту последовательности 8ЕЦ ίΌ № 2; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р40 ίΌ-12, отличающейся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р40 ίΌ-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей собой фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, который по
    - 29 026926 меньшей мере на 98% гомологичен последовательности δΕρ ГО № 3 и кодирует белок, по меньшей мере на 98% гомологичный функциональному фрагменту последовательности δΕρ ГО № 4.
  54. 54. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р35 ГО-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р35 ГО-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей собой фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности δΕρ ГО № 1 и кодирует белок, по меньшей мере на 99% гомологичный функциональному фрагменту последовательности δΕρ ГО № 2; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р40 ГО-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р40 ГО-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей собой фрагмент нуклеиновой кислоты, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности δΕρ ГО № 3 и кодирует белок, по меньшей мере на 99% гомологичный функциональному фрагменту последовательности δΕρ ГО № 4.
  55. 55. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р35 ГО-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р35 ГО-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей собой фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности δΕρ ГО № 1 и кодирует последовательность δΕρ ГО № 2; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р40 ГО-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р40 ГО-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей собой фрагмент нуклеиновой кислоты, который по меньшей мере на 98% гомологичен последовательности δΕρ ГО № 3 и кодирует последовательность δΕρ ΙΌ № 4.
  56. 56. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р35 ГО-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р35 ГО-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей собой фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, который по меньшей мере на 99% гомологичен последовательности δΕρ ГО № 1 и кодирует белок, по меньшей мере на 99% гомологичный функциональному фрагменту последовательности δΕρ ГО № 2; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р40 ГО-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р40 ГО-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей собой фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, который по меньшей мере на 99% гомологичен последовательности δΕρ ГО № 3 и кодирует белок, по меньшей мере на 99% гомологичный функциональному фрагменту последовательности δΕρ ГО № 4.
  57. 57. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р35 ГО-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р35 ГО-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей собой фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 99% гомологичный последовательности δΕρ ГО № 1, и кодирует последовательность δΕρ ГО № 2; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р40 ГО-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р40 ГО-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей собой фрагмент нуклеиновой кислоты, который по меньшей мере на 99% гомологичен последовательности δΕρ ГО № 3 и кодирует последовательность δΕρ ΙΌ № 4.
  58. 58. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р35 ГО-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р35 ГО-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей собой фрагмент последовательности δΕρ ГО № 1 и кодирующей функциональный фрагмент последовательности δΕρ ГО № 2; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р40 ГО-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р40 ГО-12, является последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей собой фрагмент последовательности δΕρ ГО № 3 и кодирующей функциональный фрагмент последовательности δΕρ ΙΌ № 4.
  59. 59. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р35 ГО-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р35 ГО-12, не несет кодирующую последовательность, которая кодирует аминокислоты 1-22 последовательности δΕρ
    - 30 026926
    ΙΌ № 2; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р40 1Ь-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р40 1Ь-12, не несет кодирующую последовательность, которая кодирует аминокислоты 1-22 последовательности 8ЕО ГО № 4.
  60. 60. Молекула нуклеиновой кислоты по п.59, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р35 ΙΕ-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р35 ГЬ-12, дополнительно содержит кодирующую последовательность, кодирующую сигнальный пептид; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р40 ГЬ12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р40 ΙΕ-12, дополнительно содержит кодирующую последовательность, кодирующую сигнальный пептид.
  61. 61. Молекула нуклеиновой кислоты по п.59, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р35 ΙΕ-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р35 ΙΕ-12, дополнительно содержит кодирующую последовательность, кодирующую последовательность 8ЕО ГО № 5; и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный фрагмент субъединицы р40 ΙΕ-12, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный фрагмент субъединицы р40 ΙΕ-12, дополнительно содержит кодирующую последовательность, кодирующую последовательность 8ЕО ГО № 5.
  62. 62. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.46-61, пригодная для доставки пациентам с применением электропорации.
  63. 63. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.46-61, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты является плазмидой.
  64. 64. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.46-61, дополнительно содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуноген.
  65. 65. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.46-61, дополнительно содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуноген патогена, выбранного из группы, состоящей из ВИЧ, ВПЧ, ВГС, вирусов гриппа, натуральной оспы, лихорадки Чикунгунья, ящура, возбудителя малярии, вируса цитомегаловируса человека, респираторно-синцитиального вируса человека и МК8А.
  66. 66. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.46-61, отличающаяся тем, что включена в вирусную частицу.
EA201491171A 2011-12-12 2012-12-11 Композиции, содержащие улучшенные генетические конструкции il-12, вакцины, иммунотерапевтические составы и способы их применения EA026926B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161569600P 2011-12-12 2011-12-12
PCT/US2012/069017 WO2013090296A1 (en) 2011-12-12 2012-12-11 Compositions, comprising improved il-12 genetic constructs and vaccines, immunotherapeutics and methods of using the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491171A1 EA201491171A1 (ru) 2014-09-30
EA026926B1 true EA026926B1 (ru) 2017-05-31

Family

ID=48613120

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491171A EA026926B1 (ru) 2011-12-12 2012-12-11 Композиции, содержащие улучшенные генетические конструкции il-12, вакцины, иммунотерапевтические составы и способы их применения

Country Status (13)

Country Link
US (4) US9272024B2 (ru)
EP (2) EP2791157A4 (ru)
JP (5) JP6333730B2 (ru)
KR (5) KR20240096837A (ru)
CN (1) CN104245719B (ru)
AU (1) AU2012352457B2 (ru)
BR (1) BR112014014078A2 (ru)
CA (1) CA2858893A1 (ru)
EA (1) EA026926B1 (ru)
HK (1) HK1205130A1 (ru)
MX (2) MX354986B (ru)
WO (1) WO2013090296A1 (ru)
ZA (1) ZA201404199B (ru)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112014014078A2 (pt) * 2011-12-12 2018-10-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania composições compreendendo constructos genéticos il-12 aperfeiçoados e vacinas, imunoterapêuticos e métodos de uso dos mesmos
AU2014235120B2 (en) 2013-03-15 2017-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines having an antigen and interleukin-23 as an adjuvant
CA2973390A1 (en) * 2015-01-09 2016-07-14 Oncosec Medical Incorporated Method for the treatment of malignancies
EP3603661A3 (en) 2015-04-22 2020-04-01 CureVac AG Rna containing composition for treatment of tumor diseases
PT3458083T (pt) 2016-05-18 2023-03-06 Modernatx Inc Polinucleotídeos que codificam interleucina-12 (il12) e seus usos
US10888594B2 (en) 2016-05-30 2021-01-12 National University Corporation Tottori University Genetically engineered vaccinia viruses
US20190336552A1 (en) 2016-05-30 2019-11-07 Astellas Pharma Inc. Genetically engineered vaccinia viruses
CN106520779A (zh) * 2016-11-09 2017-03-22 华南农业大学 一种通过密码子优化鸡il‑2基因提高鸡的il‑2蛋白表达效率的方法
JP7285220B2 (ja) 2017-05-18 2023-06-01 モデルナティエックス インコーポレイテッド 連結したインターロイキン－１２（ｉｌ１２）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子
JP7484717B2 (ja) 2018-09-26 2024-05-16 アステラス製薬株式会社 腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤との併用によるがん療法並びにこれに用いるための医薬組成物及び組合せ医薬
SG11202103192RA (en) 2018-10-03 2021-04-29 Xencor Inc Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
KR102524247B1 (ko) * 2018-12-21 2023-04-21 가톨릭대학교 산학협력단 p40-EBI3의 복합체 및 이의 용도
TW202124722A (zh) 2019-09-18 2021-07-01 美商英特佳樂帝克醫療公司 合成dna載體及其使用方法
CA3157024A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Xencor, Inc. Targeted il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
CN110777115B (zh) * 2019-11-21 2020-08-21 北京启辰生生物科技有限公司 用于促进辅助T细胞产生TNF-α细胞因子的工程化DC细胞及方法
MX2023000948A (es) 2020-07-20 2023-04-14 Deka Biosciences Inc Proteínas de fusión de citocina doble que comprenden interleucina-10 (il-10).
EP4448016A2 (en) * 2021-12-13 2024-10-23 Deka Biosciences, Inc. Dual cytokine fusion proteins comprising multi-subunit cytokines
EP4448724A1 (en) * 2021-12-17 2024-10-23 William Marsh Rice University Encapsulated cells expressing il-12 and uses thereof
WO2023229013A1 (ja) * 2022-05-27 2023-11-30 北京天一方生物科技▲発▼展有限公司 ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞の製造方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096869A (en) * 1995-03-22 2000-08-01 Cambridge University Technical Services, Ltd. Treatment of papillomavirus-associated lesions
US20030181405A1 (en) * 1999-03-12 2003-09-25 Nordstrom Jeffrey L. Interferon alpha plasmids and delivery systems, and methods of making and using the same
WO2008089144A2 (en) * 2007-01-12 2008-07-24 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Improved dna vaccination protocols
US8026223B1 (en) * 2003-05-30 2011-09-27 University Of South Florida Treating malignant tumors with high field strength electroporation of plasmids encoding IL-12

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5077044A (en) 1980-05-19 1991-12-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Novel non-reverting shigella live vaccines
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
US5223424A (en) 1985-09-06 1993-06-29 Prutech Research And Development Attenuated herpesviruses and herpesviruses which include foreign DNA encoding an amino acid sequence
US5310668A (en) 1986-06-20 1994-05-10 Merck & Co., Inc. Varicella-zoster virus as a live recombinant vaccine
US5242829A (en) 1986-09-23 1993-09-07 Therion Biologics Corporation Recombinant pseudorabies virus
US5294441A (en) 1987-06-04 1994-03-15 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: salmonella typhi
IL86583A0 (en) 1987-06-04 1988-11-15 Molecular Eng Ass Vaccine containing a derivative of a microbe and method for the production thereof
US5387744A (en) 1987-06-04 1995-02-07 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: Salmonella typhi
US5112749A (en) 1987-10-02 1992-05-12 Praxis Biologics, Inc. Vaccines for the malaria circumsporozoite protein
JP3044062B2 (ja) 1989-03-08 2000-05-22 ヘルス・リサーチ・インク 組換えポックスウイルス宿主選択系
US5225336A (en) 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
AU645489B2 (en) 1989-03-31 1994-01-20 Washington University Vaccines containing avirulent phoP-type microorganisms
EP0431668B1 (en) 1989-12-04 1995-02-15 Akzo Nobel N.V. Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof
US5294548A (en) 1990-04-02 1994-03-15 American Biogenetic Sciences, Inc Recombianant Hepatitis a virus
US5462734A (en) 1990-11-02 1995-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Bovine herpesvirus vaccine and method of using same
US5240703A (en) 1991-03-01 1993-08-31 Syntro Corporation Attenuated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
US5273525A (en) 1992-08-13 1993-12-28 Btx Inc. Injection and electroporation apparatus for drug and gene delivery
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
NZ262582A (en) 1993-01-26 1997-10-24 David B Weiner Compositions and methods for delivery of genetic material
US5571515A (en) 1994-04-18 1996-11-05 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant
US5962428A (en) 1995-03-30 1999-10-05 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
JP2001503258A (ja) * 1996-10-18 2001-03-13 バレンティス・インコーポレーテッド 遺伝子発現および搬送系および用途
US6261281B1 (en) 1997-04-03 2001-07-17 Electrofect As Method for genetic immunization and introduction of molecules into skeletal muscle and immune cells
DE69835761T2 (de) 1997-04-03 2007-09-13 Electrofect As. Verfahren zum verabreichen von pharmazeutischen präparaten und nukleinsäuren an den skelettmuskel
CZ299473B6 (cs) 1997-06-30 2008-08-06 Rhone-Poulenc Rorer S. A. Nukleová kyselina a elektrické pole jako sdruženýprodukt pro prenos nukleové kyseliny do bunek prícne pruhovaného svalstva
WO1999047678A2 (en) 1998-03-19 1999-09-23 Valentis, Inc. Interferon alpha plasmids and delivery systems, and methods of making and using the same
EP2428249B1 (en) 1998-07-13 2015-10-07 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Skin and muscle-targeted gene therapy by pulsed electrical field
JP3543326B2 (ja) 2001-08-30 2004-07-14 ソニー株式会社 情報処理装置および方法、情報処理システム、情報配信装置、記録媒体、並びにプログラム
US8209006B2 (en) 2002-03-07 2012-06-26 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Constant current electroporation device and methods of use
US7245963B2 (en) 2002-03-07 2007-07-17 Advisys, Inc. Electrode assembly for constant-current electroporation and use
US7328064B2 (en) 2002-07-04 2008-02-05 Inovio As Electroporation device and injection apparatus
US20040175727A1 (en) 2002-11-04 2004-09-09 Advisys, Inc. Synthetic muscle promoters with activities exceeding naturally occurring regulatory sequences in cardiac cells
CA2567324C (en) 2003-05-30 2012-01-03 Advisys, Inc. Devices and methods for biomaterial production
US7833754B2 (en) * 2006-01-13 2010-11-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services IL-12 for expression in mammalian cell
EP2424887B1 (en) 2009-04-30 2015-09-30 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Inducible interleukin-12
BR112014014078A2 (pt) 2011-12-12 2018-10-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania composições compreendendo constructos genéticos il-12 aperfeiçoados e vacinas, imunoterapêuticos e métodos de uso dos mesmos
GB2504774A (en) 2012-08-10 2014-02-12 Munster Simms Eng Ltd Diaphragm pump with integral motor housing and rear pump housing
TWI548337B (zh) 2015-10-16 2016-09-01 技嘉科技股份有限公司 散熱模組、顯示卡組件及電子裝置

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096869A (en) * 1995-03-22 2000-08-01 Cambridge University Technical Services, Ltd. Treatment of papillomavirus-associated lesions
US20030181405A1 (en) * 1999-03-12 2003-09-25 Nordstrom Jeffrey L. Interferon alpha plasmids and delivery systems, and methods of making and using the same
US8026223B1 (en) * 2003-05-30 2011-09-27 University Of South Florida Treating malignant tumors with high field strength electroporation of plasmids encoding IL-12
WO2008089144A2 (en) * 2007-01-12 2008-07-24 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Improved dna vaccination protocols

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200042960A (ko) 2020-04-24
US20220193230A1 (en) 2022-06-23
ZA201404199B (en) 2015-08-26
JP2022160704A (ja) 2022-10-19
US9272024B2 (en) 2016-03-01
JP2018134100A (ja) 2018-08-30
JP6333730B2 (ja) 2018-05-30
MX2020001385A (es) 2020-03-20
KR20240096837A (ko) 2024-06-26
KR20210089272A (ko) 2021-07-15
US20180333485A1 (en) 2018-11-22
BR112014014078A8 (pt) 2017-06-13
JP2015501840A (ja) 2015-01-19
US20150004188A1 (en) 2015-01-01
CN104245719A (zh) 2014-12-24
KR20220132652A (ko) 2022-09-30
US20160235840A1 (en) 2016-08-18
US9981036B2 (en) 2018-05-29
MX2014006987A (es) 2014-11-10
JP2024138373A (ja) 2024-10-08
EP2791157A4 (en) 2015-10-14
EA201491171A1 (ru) 2014-09-30
KR102445129B1 (ko) 2022-09-20
KR102277469B1 (ko) 2021-07-15
US11241496B2 (en) 2022-02-08
JP2021042245A (ja) 2021-03-18
JP6803354B2 (ja) 2020-12-23
EP2791157A1 (en) 2014-10-22
HK1205130A1 (zh) 2015-12-11
EP3336096A1 (en) 2018-06-20
BR112014014078A2 (pt) 2018-10-09
MX354986B (es) 2018-03-28
AU2012352457A1 (en) 2014-07-03
CA2858893A1 (en) 2013-06-20
KR20140110934A (ko) 2014-09-17
KR102674807B1 (ko) 2024-06-13
JP7129106B2 (ja) 2022-09-01
WO2013090296A1 (en) 2013-06-20
CN104245719B (zh) 2016-09-14
AU2012352457B2 (en) 2016-04-21
KR102101819B1 (ko) 2020-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA026926B1 (ru) Композиции, содержащие улучшенные генетические конструкции il-12, вакцины, иммунотерапевтические составы и способы их применения
JP6047610B2 (ja) インフルエンザウイルスの複数のサブタイプに対する新規ワクチン
JP2023171837A (ja) コンセンサス前立腺抗原、それをコードする核酸分子、ならびにそれを含むワクチンおよび用途
JP2021121207A (ja) 口蹄疫ウイルス（ｆｍｄｖ）コンセンサスタンパク質、そのコード配列およびそれから生成されるワクチン
JP2020169216A (ja) 抗原およびアジュバントとしてのインターロイキン−２１を有するワクチン
JP2012509067A (ja) フラビウイルスに対する免疫反応を引き起こす抗原及びその使用方法
RU2318019C2 (ru) Днк-вакцина против пролиферирующих эндотелиальных клеток и способы ее применения
JP2016514672A (ja) 抗原およびアジュバントとしてのインターロイキン−２３を有するワクチン
US20070021364A1 (en) Methods for genetic immunization
KR20100100868A (ko) 전기천공에 의해 전달되는 ｄｎａ 백신에 의해 유도되는 항체의 생산 방법
EP1646282A1 (en) Genetic vaccines for cancer therapy

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM