WO2023229013A1 - ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞の製造方法 - Google Patents

Abstract

（１）ミエロイド細胞にｃ－ＭＹＣをコードする核酸を導入するステップと、（２）前記ステップ（１）により得られた細胞をＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの存在下で培養するステップと、（３）前記ステップ（２）により得られた細胞に、ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットをコードする核酸およびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットをコードする核酸を導入するステップとを含む、ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞を製造する方法を提供する。

Description

ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞の製造方法

　本発明は、ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞の製造方法、およびそれにより得られた増殖性ミエロイド細胞、およびそれを用いた医薬に関する。

　インターロイキン－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ７０）は、感染やがんに応答してマクロファージや樹状細胞（ＤＣ）などのミエロイド細胞によって産生される炎症性サイトカインであり、Ｔ細胞やＮＫ細胞を活性化し、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の産生を促進する。ＩＦＮ－γ産生が促進されると、抗原提示が増加し、細胞性免疫応答が誘導され、血管新生などの腫瘍促進プロセスが阻止される。そのため、ＩＬ－１２ｐ７０は、がん治療薬として以前から期待されているが、ＩＬ－１２ｐ７０の全身投与に関連する用量制限毒性のために、がん治療への応用が妨げられている（非特許文献１）。

　ＤＣによるＩＬ－１２ｐ７０産生を誘導することにより、能動的にがん反応性Ｔ細胞応答を惹起する戦略は、がん治療において優れた臨床効果が期待できる１つのアプローチである。現在、自家性のＤＣにがん抗原を負荷して患者の体内に戻すことにより抗腫瘍免疫応答を活性化する、いわゆるＤＣワクチン療法には、単球由来のＤＣが一般的に使用されている。しかし、単球は末梢血中に極めて少量しか存在せず、培養により増殖させることもできないため、治療に有効な量のＤＣを調製することには困難が存在する。さらに、単球由来ＤＣのＩＬ－１２ｐ７０産生量は患者間で異なり、十分な抗腫瘍効果を得るには至っていない。

　上記諸問題を解決するべく、本発明者らは、ｉＰＳ細胞から増殖性ミエロイド細胞を作製する方法の改良を重ねている（特許文献１および２、非特許文献２）。しかし、これまでに報告された増殖性ミエロイド細胞は、単球由来のＤＣよりも抗腫瘍効果に劣るものであった。

国際公開第２０１２／０４３６５１ 国際公開第２０２１／２３０３０４

Clin. Cancer Res. 3: 409-417, 1997 J. Immunol. Regen. Med. 12: 100042, 2021

　本発明は、ＩＬ－１２ｐ７０を安定的に産生でき、優れた抗腫瘍効果を発揮する増殖性ミエロイド細胞およびその製造方法を提供することを目的としてなされたものである。

　本発明者らは、鋭意研究の結果、ＣＤ４０－ＣＤ４０リガンド相互作用またはトール様受容体刺激などによる誘導の有無によらず、ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的かつ大量に産生する増殖性ミエロイド細胞を作出することに成功した。

　すなわち、本発明は、一実施形態によれば、（１）ミエロイド細胞にｃ－ＭＹＣをコードする核酸を導入するステップと、（２）前記ステップ（１）により得られた細胞をＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの存在下で培養するステップと、（３）前記ステップ（２）により得られた細胞に、ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットをコードする核酸およびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットをコードする核酸を導入するステップとを含む、ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞を製造する方法を提供するものである。

　前記方法は、前記ステップ（１）において、ＢＭＩ１をコードする核酸、およびＭＤＭ２、ＬＹＬ１またはＢＣＬ２アイソフォームアルファをコードする核酸をさらに導入することが好ましい。

　前記ミエロイド細胞は、多能性幹細胞から分化されたものであることが好ましい。

　また、本発明は、一実施形態によれば、上記方法により製造された、ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞を提供するものである。

　また、本発明は、一実施形態によれば、ｃ－ＭＹＣをコードする外因性核酸、ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットをコードする外因性核酸およびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットをコードする外因性核酸を含んでなる、ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞を提供するものである。

　好ましくは、前記細胞は、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦ依存的に増殖する。

　好ましくは、前記細胞は、ＣＤ４０－ＣＤ４０リガンド相互作用またはトール様受容体刺激がない状態で、少なくとも３００ｐｇ／１×１０^４細胞／２４時間のＩＬ－１２ｐ７０を産生する。

　好ましくは、前記細胞は、トール様受容体刺激がある状態の単球由来樹状細胞と比較して、少なくとも５倍のＩＬ－１２ｐ７０を産生する。

　前記細胞は、ＣＤ８６、ＣＤ８０およびＣＤ８３からなる群から選択される少なくとも１つの共刺激分子を発現していることが好ましい。

　前記細胞は、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子を発現していなくてもよい。

　前記細胞は、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ遺伝子ならびに／またはそれらの発現に関与する因子をコードする遺伝子を欠損していることが好ましい。

　前記細胞は、キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸をさらに含むことが好ましい。

　前記細胞は、ＳＩＲＰα遺伝子をさらに欠損していることが好ましい。

　前記細胞は、内因性の主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ遺伝子ならびに／またはそれらの発現に関与する因子をコードする遺伝子を欠損し、かつ、所望の主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよび／またはクラスＩＩをコードする外因性核酸をさらに含むことが好ましい。

　また、本発明は、一実施形態によれば、上記細胞を含んでなる、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化するための組成物を提供するものである。

　前記組成物は、前記Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞によるインターフェロンγの産生を誘導するものであることが好ましい。

　また、本発明は、一実施形態によれば、上記細胞を含んでなる、対象におけるがんを予防または治療するための医薬組成物を提供するものである。

　また、本発明は、一実施形態によれば、上記細胞を前記対象に投与するステップを含む、対象におけるがんを予防または治療するための方法を提供するものである。

　前記方法は、免疫チェックポイント阻害薬を前記対象に投与するステップをさらに含むことが好ましい。

　本発明に係る増殖性ミエロイド細胞は、単球由来のＤＣとは異なり、特別の刺激や誘導を要することなくＩＬ－１２ｐ７０を恒常的かつ大量に産生できるものであり、かつ、免疫チェックポイント阻害薬と併用することにより相乗的な抗腫瘍効果を示す。そのため、本発明に係る増殖性ミエロイド細胞は、単球由来のＤＣよりも高いがん治療効果を発揮することができる。さらに、本発明に係る増殖性ミエロイド細胞は、抗原提示しない場合でもＴ細胞やＮＫ細胞を活性化できるために、ＨＬＡを除去されてよい。そのため、本発明に係る増殖性ミエロイド細胞は、がん治療のためのユニバーサル細胞製剤の開発のために有用である。

図１は、マウスＩＬ－１２ｐ７０産生増殖性ミエロイド細胞の作製スケジュール（フィーダー細胞使用）を示す概略図である。 図２は、マウスＩＬ－１２ｐ７０の発現ベクターの構成を示す概略図である。 図３は、ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣにおける細胞表面マーカー（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＤＥＣ２０５、Ｇｒ－１およびＣＤ３３）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すサイトグラムである。 図４は、ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣにおける細胞表面マーカー（ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すヒストグラムである。 図５は、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦ存在下でのｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣの増殖を評価したＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。 図６は、ＯＫ４３２刺激した、またはしていないｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣのＩＬ－１２ｐ７０産生量を示すグラフである。 図７は、ＯＶＡペプチドを負荷された、またはされていないｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣにより誘導されたＯＶＡペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ産生量を示すグラフである。 図８は、ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣ、ＢＭ－ＤＣおよびＯＫ４３２で刺激されたＢＭ－ＤＣ（ＯＫ４３２－ＤＣ）（いずれもＯＶＡペプチド負荷なし）により誘導されたＮＫ細胞からのＩＦＮ－γ産生量を示すグラフである。 図９は、ＯＶＡペプチドを負荷された、またはされていないｐＭＣ、ＧＭ－ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣにより誘導されたＯＶＡペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。 図１０は、ＯＶＡペプチドを負荷された、またはされていないｐＭＣ、ＧＭ－ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣにより誘導されたＯＶＡペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ産生量を示すグラフである。 図１１は、治療用細胞（ＯＶＡペプチドを負荷されたｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣ）を投与されたマウス脾臓中の標的細胞（ＯＶＡペプチド負荷あり（高ｅＦｌｕｏｒ６７０）または負荷なし（低ｅＦｌｕｏｒ６７０））をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すヒストグラムである。 図１２は、ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣにより誘導されたインビボにおける抗原特異的細胞障害（％　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｙｓｉｓ）を示す箱ひげ図である。 図１３は、ＯＶＡペプチドを負荷されたＩＬ１２－ｐＭＣまたはＢＭ－ＤＣを投与されたマウスおよび未処置マウスにおける、皮下移植されたＯＶＡ発現がん細胞の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。 図１４は、図１３における各マウスの生存率を示すカプラン・マイヤープロットである。 図１５は、ＯＶＡペプチドもしくはＳＩＹペプチドを負荷されたＩＬ１２－ｐＭＣまたはＢＭ－ＤＣを投与されたマウスおよびナイーブマウスから採取されたＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ産生細胞の頻度を調べたＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す写真である。 図１６は、図１５のスポット数のグラフである。 図１７は、ＯＶＡペプチドを負荷されたＩＬ１２－ｐＭＣに加えて、アイソタイプ・コントロール抗体、抗ＣＤ８α抗体または抗ＮＫ１．１抗体を投与されたマウスにおける、皮下移植されたＯＶＡ発現がん細胞の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。 図１８は、図１７における各マウスの生存率を示すカプラン・マイヤープロットである。 図１９は、ＩＣＩｓおよび／またはＯＶＡペプチドを負荷されたＩＬ１２－ｐＭＣを投与されたマウスおよび未処置マウスにおける、皮下移植されたＯＶＡ発現がん細胞の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。 図２０は、図１９における各マウスの生存率を示すカプラン・マイヤープロットである。 図２１は、ＩＣＩｓおよび／またはＡＨ１ペプチドを負荷されたＩＬ１２－ｐＭＣを投与されたマウスおよび未処置マウスにおける、皮下移植されたＡＨ１発現がん細胞の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。 図２２は、図２１における各マウスの生存率を示すカプラン・マイヤープロットである。 図２３は、ＡＨ１ペプチドまたはβ－ｇａｌペプチドを負荷されたＩＬ１２－ｐＭＣ／ＩＣＩｓ併用マウスを投与されたマウスおよびナイーブマウスから採取されたＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ産生細胞の頻度を調べたＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより検出されたスポット数のグラフである。 図２４は、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウス、ＩＣＩｓ投与マウス、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウス、および未処置マウスのがん組織中のＣＤ４５^＋細胞におけるＣＤ８およびＮＫ１．１の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すサイトグラムである。 図２５は、図２４における各マウスのがん組織中のＣＤ４５^＋細胞に対するＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の割合を示す箱ひげ図である。 図２６は、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウス、ＩＣＩｓ投与マウス、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウス、および未処置マウスのがん組織中のＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるパーフォリンおよびグランザイムＢの発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すサイトグラムである。 図２７は、図２６における各マウスのがん組織中のＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するパーフォリン陽性かつグランザイムＢ陽性細胞の割合を示す箱ひげ図である。 図２８は、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウス、ＩＣＩｓ投与マウス、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウス、および未処置マウスのがん組織中のＮＫ１．１^＋細胞におけるパーフォリンおよびグランザイムＢの発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すサイトグラムである。 図２９は、図２８における各マウスのがん組織中のＮＫ１．１^＋細胞に対するパーフォリン陽性かつグランザイムＢ陽性細胞の割合を示す箱ひげ図である。 図３０は、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣを投与されたマウスの血中ＩＬ－１２ｐ７０濃度の経時変化を示すグラフである。 図３１は、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣを投与されたマウスの血中ＩＦＮ－γ濃度の経時変化を示すグラフである。 図３２は、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウス、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用／抗ＩＦＮγＲ抗体マウスおよび未処置マウスにおける、皮下移植されたＯＶＡ発現がん細胞の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。 図３３は、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスおよびＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用／抗ＩＦＮγＲ抗体マウスにおける、ＯＶＡ発現がん細胞の皮下移植から２１日目の腫瘍体積を示すグラフである。 図３４は、図３２における各マウスの生存率を示すカプラン・マイヤープロットである。 図３５は、ヒトＩＬ－１２ｐ７０産生増殖性ミエロイド細胞の作製スケジュール（フィーダー細胞不使用）を示す概略図である。 図３６は、ヒトＩＬ－１２ｐ７０の発現ベクターの構成を示す概略図である。 図３７は、ヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣにおけるＣＤ１９の発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示すヒストグラムである。 図３８は、ヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣにおける細胞表面マーカー（ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すヒストグラムである。 図３９は、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦ存在下でのヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣの増殖を評価したＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。 図４０は、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激した、またはしていないヒトＤＣ、ヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣのＩＬ－１２ｐ７０産生量を示すグラフである。 図４１は、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激した、またはしていないヒトＤＣ、ヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣのＩＬ－１０産生量を示すグラフである。 図４２は、ｈＴＥＲＴペプチドを負荷された、またはされていないヒトｐＭＣ、ヒトＧＭＭ－ｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣにより誘導されたｈＴＥＲＴペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ産生量を示すグラフである。 図４３は、ヒトｐＭＣ、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣ、ヒトＤＣまたはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激したヒトＤＣと種々の比率で混合されたアロ反応性Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ産生量を示すグラフである。 図４４は、ヒトｐＭＣ、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣ、ヒトＤＣまたはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激したヒトＤＣにより誘導されたＮＫ細胞からのＩＦＮ－γ産生量を示すグラフである。 図４５は、放射線照射された、またはされていないヒトＩＬ１２－ｐＭＣおよびヒトｐＭＣの、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの存在下または非存在下における細胞増殖を示すグラフである。 図４６は、放射線照射されていないヒトＩＬ１２－ｐＭＣの重症免疫不全マウス体内における造腫瘍性をルシフェラーゼ生物発光に基づいて評価した結果を示す図である。 図４７は、放射線照射されたヒトＩＬ１２－ｐＭＣの重症免疫不全マウス体内における造腫瘍性をルシフェラーゼ生物発光に基づいて評価した結果を示す図である。 図４８は、ＩＬ１２－ｐＭＣ（ペプチド負荷なし）を右脚に投与されたマウスおよび未処置マウスにおける、左脚および右脚に皮下移植されたＭＯ４細胞の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。 図４９は、図４８の各マウス群における腫瘍径の中央値の経時変化を示すグラフである。 図５０は、図４８における各マウスの生存率を示すカプラン・マイヤープロットである。 図５１は、ＩＬ１２－ｐＭＣ（ペプチド負荷なし）および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与されたマウスおよび未処置マウスにおける、左脚および右脚に皮下移植されたＭＯ４細胞の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。 図５２は、図５１の各マウス群における腫瘍径の中央値の経時変化を示すグラフである。 図５３は、図５１における各マウスの生存率を示すカプラン・マイヤープロットである。 図５４は、ＩＦＮ－γ刺激した、またはしていないｐＭＣおよびｐＭＣ－ＵｎｉｖにおけるＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２ＤｂおよびＩ－Ａｂの発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すサイトグラムである。 図５５は、膜結合型マウスＩＬ－１２の発現ベクターの構成を示す概略図である。 図５６は、ｐＭＣ、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ、およびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖの細胞表面におけるＩＬ－１２の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すサイトグラムである。 図５７は、ＧＣ３３ベースのキメラ抗原受容体（マウス）の発現ベクターの構成を示す概略図である。 図５８は、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＧＣ３３－Ｚ、およびｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚの細胞表面における、ＣＤ１９、ＳＩＲＰαおよびＩＬ－１２の発現、ならびにＧＰＣ３結合をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すサイトグラムである。 図５９は、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＧＣ３３－Ｚ、およびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚの細胞表面における、ＣＤ１９、ＳＩＲＰαおよびＩＬ－１２の発現、ならびにＧＰＣ３結合をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すサイトグラムである。 図６０は、ＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３の細胞表面におけるＧＰＣ３の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すサイトグラムである。 図６１は、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＧＣ３３－Ｚ、およびｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚの、がん細胞モデルに対する傷害活性を比較したグラフである。 図６２は、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＧＣ３３－Ｚ、およびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚの、がん細胞モデルに対する傷害活性を比較したグラフである。 図６３は、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚの、ＮＫ細胞またはＴ細胞に対するＩＦＮ－γ産生誘導能を比較したグラフである。 図６４は、ＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３－Ｈ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ－ＫＯにおけるＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂの欠損をフローサイトメトリーにより確認した結果を示すサイトグラムである。 図６５は、未処置または治療用細胞（ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖもしくはｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ）を投与されたＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３－Ｈ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ－ＫＯ細胞移植マウス（１４日目）のインビボイメージングの結果を示す図である。 図６６は、図６５における各マウスのルシフェラーゼ発光の全フラックスを示す図である。 図６７は、図６５における各マウスの生存率を示すカプラン・マイヤープロットである。 図６８は、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖまたはｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚを種々の濃度で投与されたＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３－Ｈ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ－ＫＯ細胞移植マウス（１８日目）のインビボイメージングの結果を示す図である。 図６９は、図６８における各マウスのルシフェラーゼ発光の全フラックスを示す図である。 図７０は、図６９の結果をマウス群ごとにまとめたグラフである。 図７１は、ヒトｐＭＣ、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４、ＩＬ１２－ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２およびＩＬ１２－ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４における細胞表面マーカー（ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ１９）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すヒストグラムである。 図７２は、ヒトｐＭＣ、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２およびｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４に対するｐＭＣドナーＴ細胞の増殖応答を比較したグラフである。 図７３は、ヒトｐＭＣ、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２およびｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４に対するドナーＡ　Ｔ細胞の増殖応答を比較したグラフである。 図７４は、ヒトｐＭＣ、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２およびｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４に対するドナーＢ　Ｔ細胞の増殖応答を比較したグラフである。 図７５は、膜結合型ヒトＩＬ－１２の発現ベクターの構成を示す概略図である。 図７６は、ヒトｐＭＣおよびヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣの細胞表面におけるＩＬ－１２の発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示すヒストグラムである。 図７７は、ヒトｐＭＣ、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣおよびヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣのＩＬ１２分泌能を比較したグラフである。 図７８は、ヒトｐＭＣ、ヒトＩＬ－１２－ｐＭＣ、ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣおよびヒトＤＣにおける細胞表面マーカー（ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＦｃεＲＩα、ＳＩＲＰαおよびＣＤ３）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すヒストグラムである。 図７９は、ＧＣ３３ベースのキメラ抗原受容体（ヒト）の発現ベクターの構成を示す概略図である。 図８０は、ヒトｐＭＣ、ヒトｐＭＣ－ＧＣ３３－Ｚ、ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣおよびヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＧＣ３３－Ｚの細胞表面における、ＣＤ１９およびＩＬ－１２の発現、ならびにＧＰＣ３結合をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すサイトグラムである。 図８１は、ヒトｐＭＣ、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣ、ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ、ヒトｐＭＣ－ＧＣ３３－ＺおよびヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＧＣ３３－Ｚの、ＮＫ細胞に対するＩＦＮ－γ産生誘導能を比較したグラフである。 図８２は、ヒトｐＭＣ、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣ、ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ、ヒトｐＭＣ－ＧＣ３３－ＺおよびヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＧＣ３３－Ｚの、Ｔ細胞に対するＩＦＮ－γ産生誘導能を比較したグラフである。

　以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。

　本発明は、第一の実施形態によれば、（１）ミエロイド細胞にｃ－ＭＹＣをコードする核酸を導入するステップと、（２）前記ステップ（１）により得られた細胞をＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの存在下で培養するステップと、（３）前記ステップ（２）により得られた細胞に、ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットをコードする核酸およびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットをコードする核酸を導入するステップとを含む、ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞を製造する方法である。

　「ミエロイド細胞」とは、白血球のうち、単球、マクロファージ、樹状細胞およびそれらの前駆細胞の総称である。ミエロイド細胞特異的マーカーは周知であり、それらの任意の組み合わせによりミエロイド細胞を定義することができる。本実施形態の方法において出発細胞として用いられるミエロイド細胞は、例えば、ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ３３^＋として定義されてよく、好ましくは、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ２０５またはＣＤ２０６をさらに発現してよい。

　本実施形態におけるミエロイド細胞は、任意の脊椎動物由来のものであってよく、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。

　本実施形態におけるミエロイド細胞は、末梢血から単離されたものであってもよいし、幹細胞から分化されたものであってもよいが、幹細胞から分化されたものであることが好ましい。「幹細胞」とは、自己複製能および分化能を有する細胞であり、その分化能に応じて、全能性幹細胞、多能性幹細胞、単能性幹細胞などに分類される。本実施形態におけるミエロイド細胞は、いずれの幹細胞から分化されたものであってもよいが、多能性幹細胞から分化されることが好ましい。「多能性幹細胞」には、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、多能性生殖幹（ｍＧＳ）細胞などが挙げられる。本実施形態におけるミエロイド細胞は、いずれの多能性幹細胞から分化されたものであってもよいが、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化されたものであることが好ましく、ｉＰＳ細胞から分化されたものであることがより好ましい。

　多能性幹細胞の調製方法は十分に確立されており（例えば、ｉＰＳ細胞については、Ｃｅｌｌ，２００７；１３１（５）：８６１－８７２およびＳｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１６；６：２１３－２２７）、当分野において公知の方法にしたがって多能性幹細胞を調製することができる。あるいは、すでに樹立されたｉＰＳ細胞株やＥＳ細胞株を、例えば、京都大学ｉＰＳ細胞研究財団（ＣｉＲＡ＿Ｆ）、理化学研究所バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などから入手してもよい。

　多能性幹細胞をミエロイド細胞へと誘導する方法はすでに確立されており（例えば、国際公開第２０２１／２３０３０４）、当分野において公知の方法にしたがってミエロイド細胞を調製することができる。例えば、多能性幹細胞を血液細胞に分化させる作用を有するＯＰ９細胞のようなフィーダー細胞上で多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞を中胚葉細胞へと誘導する。あるいは、フィーダー細胞を用いずに、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４などを含有する培地中で多能性幹細胞を浮遊培養することにより、中胚葉細胞を多く含む胚様体を形成させる。その後、中胚葉細胞をＧＭ－ＣＳＦの存在下で培養することにより、中胚葉細胞からミエロイド細胞に誘導することができる。

　本実施形態の方法では、ミエロイド細胞にｃ－ＭＹＣをコードする核酸を導入する。この際、任意選択的に、ＢＭＩ１コードする核酸、ＭＤＭ２コードする核酸、ＬＹＬ１コードする核酸またはＢＣＬ２アイソフォームアルファをコードする核酸をさらに導入してもよい。「ｃ－ＭＹＣ」（ヒトの場合には「ＭＹＣ」または「ヒトＭＹＣ」とも表記される）、「ＢＭＩ１」および「ＭＤＭ２」は、いずれも細胞増殖を制御する因子として周知である。「ＬＹＬ１」は、白血病関連転写因子として周知である。「ＢＣＬ２アイソフォームアルファ」は、アポトーシス制御因子として周知である。本実施形態におけるｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２、ＬＹＬ１およびＢＣＬ２アイソフォームアルファは、任意の脊椎動物由来のものであってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。

　ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２、ＬＹＬ１およびＢＣＬ２アイソフォームアルファをコードする遺伝子はすでにクローニングされており、それらの核酸配列情報は、所定のデータベースから入手することができる。例えば、ヒトＭＹＣ遺伝子であればＮＭ＿００２４６７、マウスｃ－ＭＹＣ遺伝子であればＮＭ＿０１０８４９．４、ヒトＢＭＩ１遺伝子であればＮＭ＿００５１８０、ヒトＭＤＭ２遺伝子であればＮＭ＿００２３９２、ヒトＬＹＬ１遺伝子であればＮＭ＿００５５８３．５、ヒトＢＣＬ２アイソフォームアルファ遺伝子であればＮＭ＿０００６３３（いずれもＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ）が利用可能である。

　本実施形態におけるｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２、ＬＹＬ１およびＢＣＬ２アイソフォームアルファには、同等の活性を有するそれらのバリアントやホモログなども含まれてよい。言い換えれば、本実施形態におけるｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２、ＬＹＬ１およびＢＣＬ２アイソフォームアルファには、その細胞増殖制御活性が維持されていることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。アミノ酸配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて、または、当分野で慣用のプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて算出することができる。また、本実施形態におけるｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２、ＬＹＬ１およびＢＣＬ２アイソフォームアルファには、その細胞増殖制御活性が維持されていることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。ここで、「１～数個」とは、例えば１～３０個であってよく、好ましくは１～１０個であってよく、特に好ましくは１～５個であってよい。

　ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２、ＬＹＬ１およびＢＣＬ２アイソフォームアルファをコードする核酸は、当分野において周知の方法によりミエロイド細胞に導入することができ、例えば、それらの核酸を発現ベクターにクローニングして、細胞に導入すればよい。発現ベクターには、例えば、以下に限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターや、ｐＣＭＶなどのプラスミドベクターなどを用いることができる。また、ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２、ＬＹＬ１およびＢＣＬ２アイソフォームアルファをコードする核酸は、それぞれ個別のベクターにより導入されてもよいし、単一のポリシストロニックベクターにより導入されてもよい。

　本実施形態の方法において、発現ベクターは、その種類に応じて当分野において周知の方法により細胞に導入され得る。非ウイルスベクターであれば、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどにより導入することができる。ウイルスベクターであれば、適切な力価または多重感染度（ＭＯＩ）において細胞に感染させることにより導入することができる。

　次いで、ｃ－ＭＹＣをコードする核酸が導入されたミエロイド細胞をＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの存在下で培養する。これにより、増殖性ミエロイド細胞を得ることができる。ここで、「増殖性」とは、細胞が長期間（例えば、少なくとも３ヶ月）にわたって培養可能であることをいう。

　「ＧＭ－ＣＳＦ」（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）および「Ｍ－ＣＳＦ」（マクロファージコロニー刺激因子）は、いずれも顆粒球・単球系前駆細胞の分化および増殖を促進する因子として周知である。本実施形態におけるＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦは、任意の脊椎動物由来のものであってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。

　ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦは市販されており、本実施形態では、それらを使用することができる。例えば、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｍ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、２１６－ＭＣ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｍｏｕｓｅ　Ｍ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、４１６－ＭＬ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、２１５－ＧＭ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｍｏｕｓｅ　ＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、４１５－ＭＬ）などが好ましい市販品として挙げられる。

　培養におけるＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの濃度は適宜決定することができる。ＧＭ－ＣＳＦの濃度は、例えば１０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬであってよく、好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ～１５０ｎｇ／ｍＬとすることができ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬとすることができ、さらに好ましくは３０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌであり、最も好ましくは５０ｎｇ／ｍｌである。Ｍ－ＣＳＦの濃度は、例えば１０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬであってよく、好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ～１５０ｎｇ／ｍＬとすることができ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬとすることができ、さらに好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌであり、最も好ましくは５０ｎｇ／ｍｌである。

　ミエロイド細胞を培養するための培地は、例えば、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭなどであってよく、これらから選択される単独または２種類以上を混合して用いることができる。ミエロイド細胞は、例えば１×１０^５／ｍＬ～５×１０^５／ｍＬの濃度範囲で播種されてよい。ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの存在下での培養期間は、例えば１４～１８０日間であってよく、好ましくは２０～６０日間であってよい。培養条件は、例えば哺乳動物由来のミエロイド細胞であれば、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養することが好ましい。

　次いで、増殖性ミエロイド細胞に、ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットをコードする核酸およびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットをコードする核酸を導入する。これにより、ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットとＩＬ－１２ｐ４０サブユニットとからなるヘテロ二量体であるＩＬ－１２ｐ７０（単に「ＩＬ－１２」とも呼ばれる）が産生されるようになる。「ＩＬ－１２ｐ７０」は、Ｔ細胞やＮＫ細胞を活性化するサイトカインであり、Ｔ細胞やＮＫ細胞のＩＦＮ－γ産生を誘導する。

　本実施形態におけるＩＬ－１２ｐ３５サブユニットおよびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットは、任意の脊椎動物由来のものであってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。

　ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットをコードする遺伝子およびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットをコードする遺伝子はすでにクローニングされており、それらの核酸配列情報は、所定のデータベースから入手することができる。例えば、ヒトＩＬ－１２ｐ３５サブユニット遺伝子であればＮＭ＿０００８８２．４、マウスＩＬ－１２ｐ３５サブユニット遺伝子であればＮＭ＿００１１５９４２４、ヒトＩＬ－１２ｐ４０サブユニット遺伝子であればＮＭ＿００２１８７．３、マウスＩＬ－１２ｐ４０サブユニット遺伝子であればＮＭ＿００１３０３２４４（いずれもＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ）が利用可能である。

　本実施形態におけるＩＬ－１２ｐ３５サブユニットおよびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットには、同等の活性を有するそれらのバリアントやホモログなども含まれてよい。言い換えれば、本実施形態におけるＩＬ－１２ｐ３５サブユニットおよびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットには、サイトカイン活性が維持されたＩＬ－１２ｐ７０を構成できることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。また、本実施形態におけるＩＬ－１２ｐ３５サブユニットおよびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットには、サイトカイン活性が維持されたＩＬ－１２ｐ７０を構成できることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。なお、「１～数個」は上で定義したものと同様である。

　ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットおよびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットをコードする核酸は、上記のｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２、ＬＹＬ１およびＢＣＬ２アイソフォームアルファをコードする核酸と同様に、当分野において周知の方法により、適切な発現ベクターを用いて細胞に導入すればよい。

　本実施形態におけるＩＬ－１２ｐ３５サブユニットおよびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットをコードする核酸は、任意選択的に、ペプチドリンカーをコードする核酸を介して単一のオープンリーディングフレームに融合されてもよい。言い換えれば、本実施形態におけるＩＬ－１２ｐ３５サブユニットおよびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットは、ペプチドリンカーにより連結されてよい。ペプチドリンカーの長さは、特に限定されず、例えば、５～２０アミノ酸であってよい。ペプチドリンカーの配列も、特に限定されず、当分野で一般的に用いられているリンカー配列であってよく、例えば、ＧＳリンカー、ＧＧリンカー、ＧＧＳリンカーなどを用いることができる。

　さらに、本実施形態におけるＩＬ－１２ｐ３５サブユニットおよびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットをコードする核酸は、任意選択的に、膜貫通ドメインをコードする核酸を付加されてもよい。言い換えれば、本実施形態において産生されるＩＬ－１２ｐ７０は、膜貫通ドメインが融合された細胞膜結合型ＩＬ－１２であってもよい。本実施形態において使用できる膜貫通ドメインには、例えば、ＣＤ８０の膜貫通ドメイン、ＣＤ８３の膜貫通ドメイン、ＣＤ８６の膜貫通ドメイン、ＣＤ４の膜貫通ドメイン、ＣＤ８αの膜貫通ドメインなどが挙げられる。

　本実施形態の方法によれば、ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞を得ることができる。

　言い換えれば、本発明は、第二の実施形態によれば、上記方法により製造されたＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞である。

　さらに言い換えれば、本発明は、第三の実施形態によれば、ｃ－ＭＹＣをコードする外因性核酸、ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットをコードする外因性核酸およびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットをコードする外因性核酸を含んでなる、ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞である。本実施形態における「ｃ－ＭＹＣ」、「ＩＬ－１２ｐ３５サブユニット」、「ＩＬ－１２ｐ４０サブユニット」、「ＩＬ－１２ｐ７０」、「増殖性」および「ミエロイド細胞」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。本実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、例えば第一の実施形態の方法により製造されてよく、したがって、本実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦ依存的に増殖するものであってよい。

　ここで、「ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する」とは、ＩＬ－１２ｐ７０産生量が細胞外からの刺激の有無によらず一定であることを意味する。通常、マクロファージや樹状細胞がＩＬ－１２ｐ７０を産生するためには、ＣＤ４０－ＣＤ４０リガンド相互作用またはトール様受容体刺激などによる誘導を必要とする。これに対し、第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、そのような誘導がなくともＩＬ－１２ｐ７０を安定して産生することができる。また、「ＩＬ－１２ｐ７０を産生する」とは、ＩＬ－１２ｐ７０が細胞外に分泌されること、または、ＩＬ－１２ｐ７０が細胞膜結合型である場合には細胞表面に発現することをいう。

　「ＣＤ４０」（ＴＮＦＲＳＦ５としても知られる）は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージなどの抗原提示細胞に発現するＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。「ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）」（ＴＮＦＳＦ５、ｇｐ３９またはＣＤ１５４としても知られる）は、主に活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞に発現するＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、ＣＤ４０と相互作用することによって抗原提示細胞のＩＬ－１２産生を誘導する。

　「トール様受容体（ＴＬＲ）」は自然免疫反応において中心的な役割を果たす受容体であり、例えばマウスでは１２種類（ＴＬＲ１～ＴＬＲ９、ＴＬＲ１１～１３）、ヒトでは１０種類（ＴＬＲ１～ＴＬＲ１０）のＴＬＲが同定されている。いずれのＴＬＲが活性化されてもＮＦ－κＢの活性化が起こり、ＩＬ－１２を含む炎症性サイトカインの産生が誘導され得る。種々のＴＬＲリガンドが同定されており、例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ１／ＴＬＲ２アゴニスト）、ＭＡＬＰ－２（ＴＬＲ２／ＴＬＲ６アゴニスト）、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））（ＴＬＲ３アゴニスト）、リポ多糖（ＬＰＳ）（ＴＬＲ４アゴニスト）、フラジェリン（ＴＬＲ５アゴニスト）、イミキモド（ＴＬＲ７アゴニスト）、レシキモド（Ｒ－８４８）（ＴＬＲ７／ＴＬＲ８アゴニスト）、ＣｐＧ－ＤＮＡ（ＴＬＲ９アゴニスト）などを挙げることができるが、これらに限定されない。

　第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、ＣＤ４０－ＣＤ４０リガンド相互作用またはＴＬＲ刺激がない状態で、少なくとも３００ｐｇ／１×１０^４細胞／２４時間、少なくとも７５０ｐｇ／１×１０^４細胞／２４時間、または少なくとも１０００ｐｇ／１×１０^４細胞／２４時間のＩＬ－１２ｐ７０を産生することができ、例えば３００～２０００ｐｇ／１×１０^４細胞／２４時間、好ましくは７５０～２０００ｐｇ／１×１０^４細胞／２４時間、より好ましくは７５０～１８００ｐｇ／１×１０^４細胞／２４時間、特に好ましくは１０００～１５００ｐｇ／１×１０^４細胞／２４時間のＩＬ－１２ｐ７０を産生することができる。

　上記のＩＬ－１２ｐ７０産生量は、ＴＬＲ刺激がある状態の単球由来樹状細胞のＩＬ－１２ｐ７０産生量と比較して、少なくとも３倍であり得、好ましくは少なくとも４倍であり得る。

　ここで、「単球由来樹状細胞」とは、末梢血より単離された単球から誘導された樹状細胞である。単球由来樹状細胞は、がん免疫療法における樹状細胞ベースのがんワクチン（いわゆるＤＣワクチン）に使用されており、その調製方法は十分に確立されている。具体的には、末梢血より単離された単球をＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４の存在下で培養することにより、樹状細胞へと誘導すればよい。単球由来樹状細胞は、マーカーの発現に基づいて定義されることもでき、例えば、ＣＤ１４陰性、ＣＤ４０陽性、ＣＤ８０陽性、ＣＤ８３陽性、ＣＤ８６陽性、ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性および／またはＨＬＡ－ＤＲ陽性として定義されてよい。

　ＩＬ－１２ｐ７０産生量を比較する対照としての単球由来樹状細胞は、任意の脊椎動物由来のものであってよいが、比較される増殖性ミエロイド細胞と同じ動物由来のものであることが好ましい。例えば、マウス増殖性ミエロイド細胞はマウス単球由来樹状細胞と比較されることが好ましく、ヒト増殖性ミエロイド細胞はヒト単球由来樹状細胞と比較されることが好ましい。

　単球由来樹状細胞のＩＬ－１２ｐ７０産生を誘導するためのＴＬＲ刺激は、上で定義した任意の単独または２種類以上のＴＬＲリガンドの組み合わせによるものであってよく、好ましくはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激であってよい。

　第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、ＣＤ４０－ＣＤ４０リガンド相互作用なしにＩＬ－１２ｐ７０を産生できるため、ＣＤ４０を発現しなくてもよい。また、第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子を発現しなくてもよい。第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞はＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生しているため、通常のマクロファージや樹状細胞とは異なり、抗原を提示せずともＴ細胞やＮＫ細胞を活性化することができるためである。なお、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子を発現しない細胞を「ユニバーサル細胞」または「ユニバーサル型細胞」ともいう。

　ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子を発現しない増殖性ミエロイド細胞は、ＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ遺伝子を欠損させ、かつ／またはＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ分子の発現に関与する因子をコードする遺伝子を欠損させることにより調製され得る。ＭＨＣクラスＩの発現に関与する因子には、例えば、β２－マイクログロブリンやＴＡＰ（ＴＡＰ１、ＴＡＰ２）が挙げられる。ＭＨＣクラスＩＩの発現に関与する因子には、例えば、ＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）が挙げられる。これらの遺伝子を欠損させることにより、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子を発現しない細胞を調製する技術はすでに十分に確立されている。例えば、ヒト増殖性ミエロイド細胞であれば、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子および／またはＣＩＩＴＡ遺伝子をゲノム編集により破壊することにより、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子を発現しない細胞を調製することができる（例えば、国際公開第２０１９／１６００７７、国際公開第２０２０／２６０５６３）。

　第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、内因性のＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ遺伝子ならびに／またはそれらの発現に関与する因子をコードする遺伝子を欠損させた上で、所望のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩをコードする外因性核酸を導入されてもよい。所望のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩは、がん抗原を提示することができるものであればよく、好ましくは、増殖性ミエロイド細胞を投与する対象の大多数におけるＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩと一致するように選択されてよい。

　ヒトについては、人種または地域によるＨＬＡ頻度の偏りがすでに分析されており（例えば、日本についてはｈｔｔｐｓ：／／ｈｌａ．ｏｒ．ｊｐ／ａｂｏｕｔ／ｈｌａ／）、人種または地域を超えて高頻度で見られるＨＬＡ型に基づいて、所望のＨＬＡ遺伝子を選択することができる。そのようなＨＬＡ型としては、例えば、ＨＬＡ－Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ２９、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３２、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１８、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ３８、Ｂ３９、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ４６、Ｂ４８、Ｂ５１、Ｂ５４、Ｂ５５、Ｂ５７、Ｂ５８、Ｂ６１、Ｂ６２、Ｂ７１、Ｂ７５、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６などを挙げることができ；好ましくはＨＬＡ－Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１３、Ｂ３５、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ４６、Ｂ５１、Ｂ５８、Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ１２およびＣ１４からなる群から選択されてよく；特に好ましくはＨＬＡ－Ａ１、Ａ２、Ａ１１およびＡ２４からなる群から選択されてよい。

　第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸をさらに含んでよい。「キメラ抗原受容体」（以下、「ＣＡＲ」とも記載する）は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む人工受容体分子である。抗原結合ドメインは、抗原特異的モノクローナル抗体由来のＶＨおよびＶＬを含み、ＶＨおよびＶＬはリンカーによって連結されたもの（すなわち、ｓｃＦｖ）であってもよい。膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８０、ＣＤ８３ＣＤ８６などの膜貫通ドメインであってよい。細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、　ＣＤ３ζ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３２、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＦＣＥＲＩＧ、ＦＣＧＲＩ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＩＴＧＡＭ、ＳＬＡＭＦ７、Ｄｅｃｔｉｎ－１、ＭＡＲＣＯ、ＤＡＰ１０、ＭＥＧＦ１０、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９などの細胞内ドメインであってよく、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有することが好ましい。

　ＣＡＲが標的とする抗原には、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＳＰＧ４、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ３０９、ＣＬＥＣ１４、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＴＲＢＣ１、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４５、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＣＩ、ＧＤ２、ＣＬＤＮ６／Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｇ２５０、ＣＡＭＰＡＴＨ－１、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ、Ｔ４、Ｂ７－Ｈ３、ＣＡ－ＩＸ、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＨＥＲ－２、Ａ３３、ＨＥＲ－３、ＭＵＣ－１、ＭＭＰ－２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＡ、ＴＡＧ７２、ＥｐＣＡＭ、ＩＬ３Ｒ、ＭＣＳＰなどを挙げることができる。第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、標的とするがんの種類に応じて、上記から選択される抗原を認識する１種類または複数種類のＣＡＲを発現してよい。

　第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、好ましくは、ＳＩＲＰα遺伝子をさらに欠損してよい。ここで、「ＳＩＲＰα遺伝子を欠損する」とは、ＳＩＲＰαが発現可能でないように遺伝子が改変されることのみならず、機能を喪失したＳＩＲＰαが発現されるように遺伝子が改変されることをも含む。ＳＩＲＰαの機能を喪失させる改変としては、例えば、ＳＩＲＰαの細胞内シグナル伝達ドメインを欠損する改変が挙げられる。ＳＩＲＰα遺伝子は、当分野において周知の方法により欠損させることができ、例えばゲノム編集により欠損させればよい。

　第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、ＣＤ８６（Ｂ７－２としても知られる）、ＣＤ８０（Ｂ７－１としても知られる）およびＣＤ８３（ＨＢ１５としても知られる）から選択される少なくとも１つの共刺激分子を発現することが好ましい。ＣＤ８６、ＣＤ８０およびＣＤ８３はいずれもＴ細胞やＮＫ細胞を活性化するための共刺激分子であり、これらが発現する場合には、さらに効果的にＴ細胞やＮＫ細胞を活性化し得るためである。

　さらに、第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、好ましくは、ＴＬＲ刺激によりＩＬ－１０を産生しない。ＩＬ－１０は抗炎症性サイトカインであり、通常のマクロファージや樹状細胞はＴＬＲ刺激によりＩＬ－１０を産生するため、免疫反応が抑制され得る。これに対し、第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞がＩＬ－１０を産生しない場合には、免疫反応が抑制されないため、より効率的に細胞性免疫応答が誘導され得る。

　第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、特別の刺激や誘導を要することなくＩＬ－１２ｐ７０を恒常的かつ大量に産生することができるため、がんやウイルス感染症などの治療のために有用である。さらに、第二および第三の実施形態の増殖性ミエロイド細胞は、ＭＨＣ（ＨＬＡ）分子を発現しなくてもよいことから、がんやウイルス感染症など治療のためのユニバーサル細胞製剤の開発に有用である。

　例えば以下の実施例に示すように、特定の実施形態のヒト増殖性ミエロイド細胞は、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激したヒト単球由来樹状細胞と比較して３倍以上のＩＬ－１２ｐ７０を産生できるだけでなく、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激があってもＩＬ－１０を産生しない。また、特定の実施形態のヒト増殖性ミエロイド細胞は、細胞表面にＩＬ－１２ｐ７０を発現する。このような細胞は、極めて効率的に細胞性免疫応答を誘導し得る。

　本発明は、第四の実施形態によれば、上記増殖性ミエロイド細胞を含んでなる、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化するための組成物である。

　「Ｔ細胞」は、表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を発現する細胞であり、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）と細胞傷害性Ｔ（Ｔｃ）細胞（ＣＤ８^＋Ｔ細胞）とに大別され、さらに種々の免疫表現型マーカー発現に基づいて多様なサブセットに分類される。例えば、Ｔｈ細胞は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）などに分類され、Ｔｃ細胞は、Ｔｃ１、Ｔｃ２、Ｔｃ９、Ｔｃ１７などに分類されるが、これらに限定されない。本実施形態におけるＴ細胞は、いずれのサブセットのものであってもよいが、好ましくはＴｃ細胞（ＣＤ８^＋Ｔ細胞）である。

　「ＮＫ細胞」（ナチュラルキラー細胞）は、自然リンパ球（ＩＬＣ）ファミリーに属する、細胞傷害性リンパ球の一種である。ＮＫ細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体およびＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現せず、例えば、ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋として定義され得る。

　本実施形態において、「Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化する」とは、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖、分化、成熟、サイトカイン産生などを誘導または促進することをいう。本実施形態の組成物は、例えば、Ｔ細胞および／もしくはＮＫ細胞によるインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、ＴＮＦ－α、ＣＣＬ５、ＸＣＬ１などの炎症性サイトカインの産生を誘導する、Ｔ細胞および／もしくはＮＫ細胞の増殖を誘導する、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞の細胞傷害分子（パーフォリンもしくはグランザイムＢ）の発現を促進する、もしくはＣＤ６９の発現を促進することができる。本実施形態の組成物は、好ましくはＴ細胞および／またはＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの産生を誘導することができる。

　本実施形態の組成物は、上記増殖性ミエロイド細胞を有効成分として含有する。本実施形態の組成物は、有効成分のみから構成されていてもよいが、さらに任意の成分として、薬学的に許容される公知の担体、緩衝剤、その他の成分（例えば合成ペプチドなど）を含んでもよい。例えば、本実施形態の医薬組成物は、有効成分である細胞の生存を維持できるリン酸緩衝生理食塩水などの担体を用いて、液剤として調製されてよい。この場合、増殖性ミエロイド細胞は、例えば１×１０^６～１×１０^８細胞／ｍＬの濃度で上記担体に懸濁されてよい。

　本実施形態における増殖性ミエロイド細胞は、任意選択的に、放射線照射されていてもよい。放射線照射により増殖性ミエロイド細胞の増殖を停止させることができ、インビボにおける本実施形態の組成物の安全性を向上させることができる。本実施形態における増殖性ミエロイド細胞は、例えば５～８５Ｇｙ、好ましくは１０～６５Ｇｙ、より好ましくは１０～４０ＧｙのＸ線またはγ線を照射されてよい。

　インビトロにおいて本実施形態の組成物によりＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化するためには、本実施形態の組成物とＴ細胞またはＮＫ細胞とを混合し、一定時間インキュベートすればよい。インキュベーション時間は、例えば１２～７２時間であってよい。インキュベーション温度は、用いる細胞の種類により適宜設定することができ、例えば、哺乳動物細胞であれば、３７℃であってよい。

　インビボにおいて本実施形態の組成物によりＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化するためには、本実施形態の組成物を対象に投与すればよい。本実施形態の組成物は、例えば、注射、注入、移植などの適切な方法により投与することができる。好ましくは、本実施形態の組成物は、静脈内、皮下、皮内、リンパ節内、腹腔内、がん組織内に注入されてよい。本実施形態の組成物の投与量は、対象の年齢、体重、健康状態などに応じて異なってよいが、例えば１×１０^５～１×１０^７細胞／ｋｇ（体重）であってよい。前記投与量は、１回で投与されてもよいし、複数回にわたって投与されてもよい。

　第四の実施形態の組成物は、ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞を有効成分とするため、通常のＤＣワクチンよりも調製が容易であり、かつ、通常のＤＣワクチンよりも高いＴ細胞およびＮＫ細胞活性化能を有する。そのため、がんやウイルス感染症など治療のための細胞製剤として有用である。

　例えば以下の実施例に示すように、特定の実施形態におけるヒト増殖性ミエロイド細胞は、他の既報のヒト増殖性ミエロイド細胞より３倍以上も抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＩＦＮ－γ産生誘導能が高く、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激したヒト単球由来樹状細胞より５０倍以上もＮＫ細胞に対するＩＦＮ－γ産生誘導能が高い。このような細胞は、がんやウイルス感染症など治療のための細胞製剤に極めて有用である。

　本発明は、第五の実施形態によれば、上記増殖性ミエロイド細胞を含んでなる、対象におけるがんを予防または治療するための医薬組成物である。

　本実施形態において「予防する」とは、がんを発症するおそれのある対象において、その発症を未然に防ぐことのみならず、その発症リスクを低減することや、発症する前の対象に処置することにより、対象ががんを発症した場合の症状の進行を遅延または重症度を軽減することをも含む。

　本実施形態において「治療する」とは、がんを完全に治癒することのみならず、がんの症状を寛解または緩和すること、がんの進行を遅延または停止させること、および、がん患者の生命予後を改善することをも含む。

　本実施形態における「対象」は、任意の脊椎動物であってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物であり、特に好ましくはヒトである。対象は、乳幼児、若年、青年、成人および老人対象を含めた任意の年齢であり得る。

　本実施形態における増殖性ミエロイド細胞は、対象に対して好ましくは同種または自家であってよい。また、本実施形態における増殖性ミエロイド細胞は、任意選択的に、放射線照射されていてよい。本実施形態における増殖性ミエロイド細胞は、例えば５～８５Ｇｙ、好ましくは１０～６５Ｇｙ、より好ましくは１０～４０ＧｙのＸ線またはγ線を照射されてよい。

　本実施形態における増殖性ミエロイド細胞は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩを発現する場合、がん抗原を負荷されてもよい。ミエロイド細胞にがん抗原を負荷する方法は十分に確立されており、当分野において公知の方法にしたがってがん抗原を負荷することができる。例えば、がん抗原ペプチドの全長もしくは部分断片または腫瘍ライセートを含有する培地中でミエロイド細胞を培養すればよい。または、がん抗原ペプチドの全長または部分断片をコードする核酸を、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを用いて細胞に導入してもよい。

　本実施形態において使用できるがん抗原は、特に限定されないが、例えば、ＭＰＨＯＳＰＨ１、ＣＤＣＡ１、ＤＥＰＤＣ１、ＬＹ６Ｋ、ＩＭＰ３、ＴＴＫ、ＮＹ－ＥＳＯ－１およびＫＫ－ＬＣ－１などの、ＣＴＤａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｔａ．ｌｎｃｃ．ｂｒ）にリストされるがん精巣抗原；ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ－Ａおよびチロシナーゼなどの分化抗原；ＨＥＲ２、ＣＥＡおよびグリピカン３などの過剰発現抗原；Ｋ－ＲＡＳおよびＥＧＦＲなどのドライバー遺伝子変異抗原；サバイビン－２Ｂおよびｂｃｒ／ａｂｌなどの変異抗原；ＨＰＶ由来のＥ６、Ｅ７およびＥＢＶ由来のＥＢＮＡ－２、３、４、６などのウイルス抗原；ならびにネオアンチゲン（がん患者個々に新たに発現した変異抗原）などであってよい。

　本実施形態の医薬組成物は、第四の実施形態の組成物と同様に調製されてよく、上記増殖性ミエロイド細胞を有効成分として含有し、任意の成分をさらに含有してよい。

　本実施形態の医薬組成物は、任意の成分として、第四の実施形態で定義したものに加えて、抗がん剤や免疫チェックポイント阻害薬をさらに含んでもよい。「免疫チェックポイント阻害薬」とは、免疫チェックポイント分子またはそのリガンドに結合し、免疫抑制シグナルの伝達を阻害する物質である。本実施形態において使用できる免疫チェックポイント阻害薬は、特に限定されないが、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗Ｂ７抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＫＩＲ抗体、ＩＤＯ阻害薬、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＴＩＭ３抗体などであってよい。本実施形態において使用できる「抗がん剤」は、任意の公知の抗がん剤であってよく、例えば、メトトレキサート、アクチノマイシンＤ、５－フルオロウラシル、パクリタキセル、ペメトレキセド、シスプラチンなどであってよい。

　本実施形態の医薬組成物は、例えば、注射、注入、移植などの適切な方法により投与することができる。好ましくは、本実施形態の医薬組成物は、静脈内、皮下、皮内、リンパ節内、またはがん組織内などに注入されてよい。本実施形態の医薬組成物の投与量は、対象の年齢、体重、がんの重症度などに応じて異なってよいが、例えば１×１０^５～１×１０^７細胞／ｋｇ（体重）であってよい。前記投与量は、１回で投与されてもよいし、複数回にわたって投与されてもよい。

　本発明は、第六の実施形態によれば、対象におけるがんを予防または治療するための方法であって、上記増殖性ミエロイド細胞を前記対象に投与するステップを含む方法である。本実施形態における「予防する」、「治療する」、「対象」、および「増殖性ミエロイド細胞」は、第五の実施形態で定義したものと同様である。

　本実施形態の方法において、増殖性ミエロイド細胞は、第四および第五の実施形態で定義したように製剤化され、投与されてよい。増殖性ミエロイド細胞の投与量は、第四および第五の実施形態で定義したものと同様である。

　本実施形態の方法は、免疫チェックポイント阻害薬を投与するステップをさらに含んでもよい。本実施形態における「免疫チェックポイント阻害薬」は、第五の実施形態で定義したものと同様である。

　本実施形態の方法は、抗がん剤を投与するステップをさらに含んでもよい。本実施形態における「抗がん剤」は、第五の実施形態で定義したものと同様である。

　増殖性ミエロイド細胞を投与するステップと、抗がん剤または免疫チェックポイント阻害薬を投与するステップとは、順次または同時に行うことができる。例えば、増殖性ミエロイド細胞を投与した後に抗がん剤または免疫チェックポイント阻害薬を投与してもよく；抗がん剤または免疫チェックポイント阻害薬を投与した後に増殖性ミエロイド細胞を投与してもよく；増殖性ミエロイド細胞および抗がん剤または免疫チェックポイント阻害薬を同時に投与してもよい。

　第五の実施形態の医薬組成物および第六の実施形態の方法は、単球由来のＤＣを用いた一般的ながん治療よりも抗腫瘍活性が高く、特に、免疫チェックポイント阻害薬との併用により相乗的な抗腫瘍活性を発揮する。そのため、第五の実施形態の医薬組成物および第六の実施形態の方法は、従来方法によっては治療が困難であった難治がんの治療に有用である。

　以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。

＜１．ＩＬ－１２産生マウス増殖性ミエロイド細胞の作製＞
　以下の手順によりＩＬ－１２ｐ７０産生マウス増殖性ミエロイド細胞を作製した。作製スケジュールを図１に示す。
（１－１）マウス増殖性ミエロイド細胞の作製
　Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスｉＰＳ細胞を、Ａｒａｋｉ　Ｒ．ら（Ｎａｔｕｒｅ．　２０１３　Ｆｅｂ　７；４９４（７４３５）：１００－４．　ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１８０７）に記載の方法により作製した。マウス増殖性ミエロイド細胞を、Ｚｈａｎｇ　Ｒ．ら（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｒｅｓ．　２０１５　Ｊｕｎ；３（６）：６６８－７７．　ｄｏｉ：１０．１１５８／２３２６－６０６６．ＣＩＲ－１４－０１１７）に記載の方法により作製した。具体的には、２０％ＦＣＳを含有するαＭＥＭ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を用いてｉＰＳ細胞をＯＰ９細胞（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫより購入）上で６～７日間培養し、中胚葉細胞への分化を誘導した。中胚葉細胞を回収して新たなＯＰ９細胞上に移し替え、２０ｎｇ／ｍＬのマウスＧＭ－ＣＳＦ組換え体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、４１５－ＭＬ）の存在下で６～７日間培養し、ミエロイド系細胞への分化を誘導した。ミエロイド系細胞（以下、「ＭＣ」ともいう）を回収し、ヒトｃ－ＭＹＣ遺伝子を含むレンチウイルスベクターを感染させ、３０ｎｇ／ｍＬのマウスＧＭ－ＣＳＦ組換え体および５０ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦ組換え体（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）の存在下で７～１０日間培養した。ＧＭ－ＣＳＦ／Ｍ－ＣＳＦ依存性に増殖するミエロイド系細胞が出現し、これらを「増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）」と名付けた。本実施例におけるすべての細胞培養は３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で行った。

（１－２）マウスＩＬ－１２ｐ７０を発現するレンチウイルスベクターの作製
　マウスＩｌ１２ａおよびＩｌ１２ｂのｃＤＮＡ（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿００１１５９４２４およびＮＭ＿００１３０３２４４；配列番号１および２）をＴｈｏｓｅａ　ａｓｉｇｎａ　ｖｉｒｕｓ（ＴａＶ）由来の自己切断ペプチドＴ２Ａをコードする核酸配列（配列番号３）により接続した融合ｃＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔに委託して合成した。融合ｃＤＮＡをＣＳＩＩ－ＥＦ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｕｓプラスミド（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ　ＤＮＡ　ＢＡＮＫ）のマルチクローニングサイトに挿入し、ＣＳＩＩ－ＥＦ－Ｉｌ１２ａ－Ｔ２Ａ１－Ｉｌ１２ｂ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｕｓを得た（図２）。

　ＣＳＩＩ－ＥＦ－Ｉｌ１２ａ－Ｔ２Ａ１－Ｉｌ１２ｂ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｕｓ、ｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐ（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ　ＤＮＡ　ＢＡＮＫ）およびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖ（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ　ＤＮＡ　ＢＡＮＫ）を２９３Ｔ細胞（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫより購入）へリポフェクションにより導入した。リポフェクションから３日後に培養上清を回収し、細孔径０．４５μｍのフィルターでろ過した後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーター（クロンテック）によりウイルス粒子を濃縮した。得られたウイルス粒子はＤＭＥＭに懸濁した後、クライオバイアルに分注し、－１５０℃で保管した。

（１－３）ＩＬ－１２ｐ７０産生マウス増殖性ミエロイド細胞の作製
　上記（１－１）で作製したｐＭＣを４８ウェルプレートに播種し、上記（１－２）で作製したレンチウイルスベクターを感染させた。感染後の増殖培養には、２０％ＦＣＳ、３０ｎｇ／ｍＬのマウスＧＭ－ＣＳＦ組換え体および５０ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦ組換え体を含有するαＭＥＭ（以下、「ｐＭＣ培地」と記載する）を用いた。感染から８日後、フローサイトメトリーによりＶｅｎｕｓ陽性細胞を分離した。分離されたＶｅｎｕｓ陽性細胞は、３ヶ月以上にわたり増殖し続けた。この細胞を「ＩＬ－１２ｐ７０産生増殖性ミエロイド細胞（ＩＬ１２－ｐＭＣ）」と名付けた。

＜２．ＩＬ－１２ｐ７０産生マウス増殖性ミエロイド細胞の表面マーカー解析＞
　上記１で作製したｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣにおける表面マーカーの発現を免疫染色およびフローサイトメトリーにより解析した。免疫染色には、以下の表１に記載の抗体を用いた。対照として、以下の手順により調製した骨髄由来樹状細胞（ＢＭ－ＤＣ）を用いた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスから採取された骨髄細胞（１．５×１０^６）を９０ｍｍ微生物用ペトリディッシュで培養した。培地には、１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍＬのマウスＧＭ－ＣＳＦ組換え体および５０μＭの２－メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ１６４０（シグマアルドリッチ）を用いた。培養開始から３日目と６日目に培地を半量交換した。８日目に５０μｇ／ｍＬのマウスＩＬ－４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を添加し、９日目の浮遊細胞をＢＭ－ＤＣとした。

　表１．マーカーの染色に用いた抗体

　結果を図３および４に示す。図４において、点線はラットＩｇＧ２ｂ抗体（ＲＴＫ４５３０）により染色した結果を示す（陰性対照）。ｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣは、ＢＭ－ＤＣと同様に、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＤＥＣ２０５、Ｇｒ－１、ＣＤ３３などのミエロイド系分化マーカー、マクロファージマーカーおよび樹状細胞マーカーを発現していた（図３）。また、ｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣは、ＢＭ－ＤＣと同様に、抗原提示分子であるＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ、ならびに共刺激分子であるＣＤ８０およびＣＤ８６を発現していた（図４）。このことから、ｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣは、Ｔ細胞刺激活性を有することが示唆された。一方、ｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣは、ＢＭ－ＤＣとは異なり、ＣＤ４０を発現しなかった（図４）。

＜３．ＩＬ－１２ｐ７０産生マウス増殖性ミエロイド細胞の特性解析＞
（３－１）増殖能
　上記１で作製したｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣを９６ウェルプレートに播種し（２×１０^３細胞／ウェル）、マウスＧＭ－ＣＳＦ組換え体（３０ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＭ－ＣＳＦ組換え体（５０ｎｇ／ｍＬ）、またはそれらの組み合わせを添加した２０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ中で培養した。各培地条件における増殖をＭＴＴアッセイにより経時的に評価した。培養開始から２４時間ごとに０．５ｍｇ／ｍＬの３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）試薬（メルクミリポア）を添加し、その４時間後に代謝されたホルマザンを波長５９５ｎｍの吸光度により測定した。

　結果を図５に示す。ｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣの増殖はＧＭ－ＣＳＦ依存的であり、ＧＭ－ＣＳＦとＭ－ＣＳＦとを組み合わせて培地に添加することにより、増殖がさらに増強された。また、この増殖は３ヶ月以上継続した。これらの結果から、ｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣは、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦにより増殖を制御できるユニークな細胞であり、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦにより大量産生可能であることが示唆された。

（３－２）ＩＬ－１２ｐ７０産生
　１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を用いて、上記１で作製したｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣ、ならびに上記２で作製したＢＭ－ＤＣを９６ウェルプレートに播種した（１．０×１０^４細胞／１００μＬ）。５μｇ／ｍＬのＯＫ４３２（ピシバニール、中外製薬）を添加し、２４時間培養した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅ　Ｓｅｔ　Ｍｏｕｓｅ　ＩＬ－１２（ｐ７０）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によりＩＬ－１２ｐ７０を定量した。ＯＫ４３２を添加しない場合（ビヒクル）のＩＬ－１２ｐ７０産生量も同様に測定した（対照）。

　結果を図６および表２に示す。図中、アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示す（＊ｐ＜０．０５）。驚くべきことに、ＩＬ１２－ｐＭＣはＯＫ４３２の添加に関係なくＩＬ－１２ｐ７０を産生し、その産生量は、ＯＫ４３２を添加されたＢＭ－ＤＣの１００倍以上であった。ｐＭＣは、ＯＫ４３２の添加に関係なくＩＬ－１２ｐ７０を産生しなかった。

　表２．ＩＬ－１２ｐ７０の産生量

（３－３）抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＩＦＮ－γ産生誘導能
　上記１で作製したｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣ、ならびに上記２で作製したＢＭ－ＤＣに、１０μＭのニワトリオボアルブミン２５７－２６４ペプチド（ユーロフィンジェノミクス）（以下、「ＯＶＡペプチド」とも記載する）を負荷した。１６時間後、細胞を９６ウェルプレートに播種し（５．０×１０^４細胞／ウェル）、放射線を照射した（８５Ｇｙ）。ＯＴ－Ｉマウス（ＯＶＡペプチド特異的Ｔ細胞受容体トランスジェニックマウス、Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊ、ジャクソンラボラトリー）の脾細胞から、ＣＤ８α^＋　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　ｍｏｕｓｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＯＶＡペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞（以下、「ＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞」とも記載する）を分離した。ＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞（１．０×１０^４細胞／ウェル）を、上記ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣの各ウェルに添加し、１０％ＦＣＳおよび２－メルカプトエタノール（５０μＭ）を含有するＲＰＭＩ１６４０中で３日間共培養した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｅｔ　Ｍｏｕｓｅ　ＩＦＮ－γ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によりＩＦＮ－γを定量した。各細胞にＯＶＡペプチドを負荷しなかった場合（ビヒクル）のＩＦＮ－γ産生量も同様に測定した（対照）。

　結果を図７および表３に示す。図中、アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示す（＊ｐ＜０．０５）。ＯＶＡペプチドを負荷されていないｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣと共培養されたＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞はＩＦＮ－γを産生しなかった。一方、ＯＶＡペプチドを負荷されたｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣと共培養されたＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞はＩＦＮ－γを産生した。特に、ＯＶＡペプチドを負荷されたＩＬ１２－ｐＭＣと共培養されたＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞は最も多くＩＦＮ－γを産生した。驚くべきことに、ＯＶＡペプチドを負荷されたＩＬ１２－ｐＭＣと共培養されたＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生量は、ＯＶＡペプチドを負荷されたｐＭＣまたはＢＭ－ＤＣと共培養されたＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞よりも、５倍以上高かった。

　表３．抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生量

（３－４）ＮＫ細胞に対するＩＦＮ－γ産生誘導能
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの脾細胞から、ＮＫ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　ｍｏｕｓｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＮＫ細胞を分離した。上記１で作製したｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣ、上記２で作製したＢＭ－ＤＣ、ならびに上記（３－２）の手順によりＯＫ４３２で刺激されたＢＭ－ＤＣ（ＯＫ４３２－ＤＣ）（いずれもＯＶＡペプチド負荷なし）を９６ウェルプレートに播種し（５．０×１０^４細胞／ウェル）、放射線を照射した（８５Ｇｙ）。ＮＫ細胞（１．０×１０^４細胞／ウェル）を、ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣの各ウェルに添加し、１０％ＦＣＳおよび２－メルカプトエタノール（５０μＭ）を含有するＲＰＭＩ１６４０中で３日間共培養した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｅｔ　Ｍｏｕｓｅ　ＩＦＮ－γによりＩＦＮ－γを定量した。

　結果を図８および表４に示す。驚くべきことに、ＩＬ１２－ｐＭＣと共培養されたＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの産生量は、他の細胞と共培養されたＮＫ細胞と比較して６０倍以上高かった。

　表４．ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの産生量

　以上の結果から、ＩＬ１２－ｐＭＣは大量生産が可能であること、ＢＭ－ＤＣよりも高いＩＬ－１２ｐ７０産生能を有すること、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対するＩＦＮ－γ産生誘導能に優れることが明らかになった。

＜４．ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＧＭ－ｐＭＣの比較＞
　国際公開第２０２１／２３０３０４およびＭａｓｈｉｍａ　Ｈ．らによる報告（Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．　２０２０　Ｓｅｐ　６；９（１）：１８１４６２０．　ｄｏｉ：　１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０２０．１８１４６２０）には、ＧＭ－ＣＳＦ産生マウス増殖性ミエロイド細胞が開示されている（前者では「ｉｐＡＰＣ－ＧＭ」、後者では「ＧＭ－ｐＭＣ」として記載されている；本実施例では「ＧＭ－ｐＭＣ」と記載する）。Ｔ細胞に対する増殖誘導活性およびＩＦＮ－γ産生誘導能について、ＩＬ１２－ｐＭＣとＧＭ－ｐＭＣとを比較した。

（４－１）抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する増殖誘導活性
　Ｍａｓｈｉｍａ　Ｈ．らによる報告（Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．　２０２０　Ｓｅｐ　６；９（１）：１８１４６２０．　ｄｏｉ：　１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０２０．１８１４６２０）に記載の手順にしたがってＧＭ－ｐＭＣを調製した。上記１で作製したｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣ、上記２で作製したＢＭ－ＤＣ、ならびにＧＭ－ｐＭＣに、１０μＭのＯＶＡペプチドを負荷した。１６時間後、細胞を９６ウェルプレートに播種し（５．０×１０^３細胞／ウェル）、放射線を照射した（１０Ｇｙ）。ＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞（１．０×１０^４細胞／ウェル）を、上記ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣの各ウェルに添加し、１０％ＦＣＳおよび２－メルカプトエタノール（５０μＭ）を含有するＲＰＭＩ１６４０中で共培養した。４８時間後に１μＣｉの３Ｈ－チミジン（パーキンエルマー）を添加し、さらに１６時間後にＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞に取り込まれた放射線量を液体シンチレーションカウンターで測定した。各細胞にＯＶＡペプチドを負荷しなかった場合（Ｍｅｄｉｕｍ）の増殖誘導活性も同様に測定した（対照）。

　結果を図９および表５に示す。図中、アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＯＶＡペプチドを負荷されていないｐＭＣ、ＧＭ－ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣはいずれもＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞の増殖を誘導しなかった（白バー：Ｍｅｄｉｕｍ）。ＯＶＡペプチドを負荷されたｐＭＣ、ＧＭ－ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣはいずれもＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞の増殖を誘導した（黒バー：Ｐｅｐｔｉｄｅ）。驚くべきことに、ＩＬ１２－ｐＭＣの抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する増殖誘導活性は、ＧＭ－ｐＭＣと比較して約２倍高かった（表５）。

　表５．抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖

（４－２）抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＩＦＮ－γ産生誘導能
　上記（４－１）と同様の手順により、ｐＭＣ、ＧＭ－ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣにＯＶＡペプチドを負荷し、ＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞と共培養した。４８時間後に培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｅｔ　Ｍｏｕｓｅ　ＩＦＮ－γによりＩＦＮ－γを定量した。各細胞にＯＶＡペプチドを負荷しなかった場合（Ｍｅｄｉｕｍ）のＩＦＮ－γ産生量も同様に測定した（対照）。

　結果を図１０および表６に示す。図中、アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＯＶＡペプチドを負荷されていないｐＭＣ、ＧＭ－ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣはいずれもＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生を誘導しなかった（白バー：Ｍｅｄｉｕｍ）。ＯＶＡペプチドを負荷されたｐＭＣ、ＧＭ－ｐＭＣ、ＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣはいずれもＯＴ－Ｉ　Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生を誘導した（黒バー：Ｐｅｐｔｉｄｅ）。驚くべきことに、ＩＬ１２－ｐＭＣの抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＩＦＮ－γ産生誘導能は、ＧＭ－ｐＭＣと比較して約３０倍、ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣと比較して約２５倍高かった（表６）。

　表６．抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生量

　以上の結果から、ＩＬ１２－ｐＭＣは、抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する増殖誘導活性およびＩＦＮ－γ産生誘導能において、ＧＭ－ｐＭＣよりも格段に優れていることが明らかになった。

＜５．インビボにおける抗原特異的細胞障害活性の誘導＞
（５－１）治療用細胞
　上記１で作製したｐＭＣおよびＩＬ１２－ｐＭＣ、ならびに上記２で作製したＢＭ－ＤＣに、１０μＭのＯＶＡペプチドを負荷したものを治療用細胞として用いた。

（５－２）標的細胞
　Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスとＭＨＣが一致しており、かつＥＧＦＰをユビキタスに発現するマウスＣ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）Ｃ１４－Ｙ０１－ＦＭ１３１Ｏｓｂ（ジャクソンラボラトリー）（以下、「ＥＧＦＰマウス」と記載する）から脾細胞を採取し、２つに分けた。一方には、１０μＭのＯＶＡペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で１時間培養し、その後洗浄した。もう一方には、ＯＶＡペプチドを添加せずに、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で１時間培養し、その後洗浄した。培地には、１０％ＦＣＳおよび２－メルカプトエタノール（５０μＭ）を含有するＲＰＭＩ１６４０を用いた。ＯＶＡペプチドを負荷された脾細胞を高濃度（０．５μＭ）のｅＦｌｕｏｒ６７０（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）で標識し、ＯＶＡペプチドを負荷されていない脾細胞を低濃度（０．００５μＭ）のｅＦｌｕｏｒ６７０で標識した。標識はメーカーのプロトコールにしたがって行った。これらの細胞を１：１の比率で混合したものを標的細胞として用いた。

（５－３）細胞障害活性の誘導および評価
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（日本チャールズリバー）に対し、０日目および７日目に治療用細胞（１×１０^５）を腹腔内投与した（処置マウス）。１４日目に、標的細胞（５×１０^６）を静脈内投与した。治療用細胞を投与されていないマウス（未処置マウス）にも同様に標的細胞を投与した。２０時間後、マウスを安楽死させて脾臓を採取し、脾臓中の標的細胞（ＥＧＦＰ陽性）について、高ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞および低ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞の割合をフローサイトメトリーにより評価した。

　抗原特異的細胞障害（％　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｙｓｉｓ）を、以下の計算式により算出した。
１００－［１００×（％　高ｅＦｌｕｏｒ６７０処置マウス／％　低ｅＦｌｕｏｒ６７０処置マウス）／（％　高ｅＦｌｕｏｒ６７０未処置マウス／％　低ｅＦｌｕｏｒ６７０未処置マウス］

　フローサイトメトリー解析の代表的なヒストグラムを図１１に示す。ＯＶＡペプチドを負荷されたＩＬ１２－ｐＭＣを投与したマウスでは、ＯＶＡペプチドを負荷された標的細胞（高ｅＦｌｕｏｒ６７０）が高効率で排除された（図１１上段右、１．０３％）。ＯＶＡペプチドを負荷されたＢＭ－ＤＣを投与したマウスでも標的細胞が排除されたが（図１１下段左、３．９７％）、ＩＬ１２－ｐＭＣを投与した場合の方が優れていた。

　抗原特異的細胞障害（％　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｙｓｉｓ）を図１２に示す。図中、アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。ＩＬ１２－ｐＭＣ処置マウスでは、ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣ処置マウスよりも抗原特異的細胞障害が誘導された（図１２左）。

　ここで、ＩＬ１２－ｐＭＣ処置マウスに抗ＩＦＮ－γ受容体抗体（αＩＦＮγＲ　Ａｂ、クローン名ＧＲ２０、ＢｉｏＸ　ｃｅｌｌ）を投与すると、標的細胞の排除能力が低下し（図１１下段右、３２．５％）、抗原特異的細胞障害が減弱した（図１２右）。これらの結果から、ＩＬ１２－ｐＭＣによるインビボ抗原特異的細胞障害活性の誘導にはＩＦＮ－γが重要な役割を果たすと考えられた。

＜６．ＩＬ１２－ｐＭＣのがんに対する予防的効果＞
（６－１）投与スケジュール
　上記（５－１）の手順によりＯＶＡペプチドを負荷されたＩＬ１２－ｐＭＣまたはＢＭ－ＤＣ（１×１０^５個）を、０日目および７日目に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（日本チャールズリバー）に対して腹腔内投与した。最後の投与から７日後に、マウスの右脇腹の皮下に、１×１０^５個のＯＶＡタンパク質全長を発現するマウスメラノーマＢ１６細胞（Ｂ１６－ＯＶＡ　ＭＯ４、メルクミリポア）（以下「ＭＯ４細胞」と記載する）を移植した。各マウス（ｎ＝１２）について、腫瘍の増殖と生存を経時的に評価した。腫瘍の長径が１５ｍｍを超えた時点をエンドポイントとした。

（６－２）腫瘍体積
　腫瘍体積の経時変化を図１３に示す。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ両側検定によるｐ値を示し（＊＊＊ｐ＜０．００１）、「ｎ．ｓ．」は有意差なしを意味する。ＯＶＡペプチドを負荷されたＩＬ１２－ｐＭＣおよびＢＭ－ＤＣは同程度にがんを抑制した。

（６－３）マウスの生存率
　マウスの生存率を図１４に示す。図中、アスタリスク（＊）はログランク検定によるｐ値を示し（＊＊＊ｐ＜０．００１）「ｎ．ｓ．」は有意差なしを意味する。ＯＶＡペプチドを負荷されたＩＬ１２－ｐＭＣまたはＢＭ－ＤＣを投与されたマウスでは、未処置マウスと比較して生存期間が延長された。

（６－４）エクスビボでのＩＦＮ－γ産生能評価
　ＯＶＡペプチドを負荷されたＩＬ１２－ｐＭＣまたはＢＭ－ＤＣの投与により、がんの生着が完全に阻止されたマウス（ＭＯ４細胞移植後５６日生存）、およびナイーブマウス（治療用細胞もがん細胞も投与されたことのないマウス）の脾臓から、ＣＤ８α^＋　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　ｍｏｕｓｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ８^＋Ｔ細胞を採取した。標的細胞（抗原提示細胞）には、ＲＭＡ－Ｓ細胞（Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｕｐｐｌ．　１９９１；６：３８－４４．ｄｏｉ：　１０．１００２／ｉｊｃ．２９１０４７０７１１）を用いた。ＲＭＡ－Ｓ細胞は、通常ではＭＨＣクラスＩ分子を細胞表面に発現できないが、ＭＨＣクラスＩ分子にペプチドが結合して安定化されると、ＭＨＣクラスＩ分子を細胞表面に発現する。ＲＭＡ－Ｓ細胞にＯＶＡペプチドまたはＳＩＹペプチド（ユーロフィンジェノミクス）を負荷し、放射線を照射した（４５Ｇｙ）。１０％ＦＣＳおよび２－メルカプトエタノール（５０μＭ）を含有するＲＰＭＩ１６４０中、抗ＩＦＮ－γ抗体を固定したメンブレンプレート上で、ＣＤ８^＋Ｔ細胞および標的細胞を２０時間共培養した。

　ＢＤ（商標）ＥＬＩＳＰＯＴ　Ｍｏｕｓｅ　ＩＦＮ－γ　ＥＬＩＳＰＯＴ　Ｓｅｔ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。スポット数はＥＬＩＰＨＯＴＯ　Ｃｏｕｎｔｅｒ（ミネルバテック）を用いて測定した。

　スポットの写真を図１５に示す。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイでは、ＩＦＮ－γ産生があった部位がスポットとして検出され、スポットの数が多ければ、ＩＦＮ－γを産生したＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＯＶＡ特異的Ｔ細胞）の頻度が高いことを示す。ナイーブマウスのＣＤ８^＋Ｔ細胞とＲＭＡ－Ｓ細胞との共培養ではスポットが見られないのに対し、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣまたはＢＭ－ＤＣを投与されたマウスのＣＤ８^＋Ｔ細胞とＲＭＡ－Ｓ細胞との共培養では多くのスポットが見られた。

　スポットの数を図１６に示す。図中、「ｐＯＶＡ」はＯＶＡペプチドを負荷されたＲＭＡ－Ｓ細胞を用いた場合を意味し（黒バー）、「ｐＳＩＹ」はＳＩＹペプチドを負荷されたＲＭＡ－Ｓ細胞を用いた場合（陰性対照）を意味する（白バー）。アスタリスク（＊）はスチューデントｔ両側検定によるｐ値を示す（＊ｐ＜０．０５）。ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣを投与されたマウスのＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＯＶＡペプチド負荷ＢＭ－ＤＣを投与されたマウスのＣＤ８^＋Ｔ細胞と同様に、ＳＩＹペプチド負荷ＲＭＡ－Ｓ細胞と共培養された場合よりも、ＯＶＡペプチド負荷ＲＭＡ－Ｓ細胞と共培養された場合に、ＩＦＮ－γを産生する細胞の数が増加した。この結果から、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣを投与されたマウスのＣＤ８^＋Ｔ細胞において、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞が高頻度で存在することが示された。

　以上の結果から、ＩＬ１２－ｐＭＣはＢＭ－ＤＣと同程度に抗原特異的Ｔ細胞を誘導でき、予防的がんワクチンとして使用できるものであることが明らかになった。また、所望の抗原を用いることで、その抗原に対するＴ細胞を誘導できること、および、その抗原を発現する細胞に起因する疾患に対して予防的処置を行うことができることが明らかになった。

＜７．ＩＬ１２－ｐＭＣの抗腫瘍効果の機序＞
（７－１）投与スケジュール
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの脇腹皮下に、ＭＯ４細胞（１×１０^５個）を移植した（０日目）。４、１１および１８日目にＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ（１×１０^５個）を腹腔内投与した。抗ＣＤ８α抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）または抗ＮＫ１．１抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）（各２００μｇ）を腹腔内投与し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞を除去した。陰性対照としてアイソタイプ・コントロール抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を腹腔内投与した。各マウス（ｎ＝１２）について、腫瘍の増殖と生存を経時的に評価した。腫瘍の長径が１５ｍｍを超えた時点をエンドポイントとした。

（７－２）腫瘍体積
　腫瘍体積の経時変化を図１７に示す。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ両側検定によるｐ値を示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。抗ＣＤ８α抗体または抗ＮＫ１．１抗体を投与すると、抗腫瘍効果が減弱した。特に、抗ＣＤ８α抗体を投与した場合に、抗ＮＫ１．１抗体を投与した場合よりも、抗腫瘍効果が大きく減弱した。

（７－３）マウスの生存率
　マウスの生存率を図１８に示す。図中、アスタリスク（＊）はログランク検定によるｐ値を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。抗ＣＤ８α抗体または抗ＮＫ１．１抗体を投与すると、生存期間が短縮した。特に、抗ＣＤ８α抗体を投与した場合に、抗ＮＫ１．１抗体を投与した場合よりも、生存期間が著しく短縮した。

　以上の結果から、ＩＬ１２－ｐＭＣが抗腫瘍効果を示す上で、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が特に重要な役割を演じていることが明らかになった。

＜８．ＩＬ１２－ｐＭＣのＩＣＩ非感受性がんに対する治療的効果＞
（８－１）投与スケジュール
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの脇腹皮下に、ＭＯ４細胞（１×１０^５個）を移植した（０日目）。４、１１および１８日目にＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ（１×１０^５個）を腹腔内投与した。さらに、ＩＣＩｓ（抗ＣＴＬＡ－４抗体（１００μｇ）および抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１００μｇ）の混合物）（以下、「ＩＣＩｓ」とも記載する）を、５、８、１２および１５日目に投与した。以下、このマウスを「ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウス」とも記載する。また、同様のスケジュールでＩＣＩｓのみを投与したマウス（以下、「ＩＣＩｓ投与マウス」とも記載する）、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣのみを投与したマウス（以下、「ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウス」とも記載する）、何も投与しなかったマウス（以下、「未処置マウス」とも記載する）を作製した。各マウス（ｎ＝１２）について、腫瘍の増殖と生存を経時的に評価した。腫瘍の長径が１５ｍｍを超えた時点をエンドポイントとした。

（８－２）腫瘍体積
　腫瘍体積の経時変化を図１９に示す。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ両側検定によるｐ値を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。ＩＣＩｓ投与マウス、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウス、およびＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスにおいて、腫瘍体積が抑制された。１８日目にＩＣＩｓ投与マウスから死亡マウスが出たため、１８日目で比較したところ、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウスではＩＣＩｓ投与マウスよりも腫瘍体積が抑制された。さらに、２５日目にＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウスから死亡マウスが出たため、２５日目で比較したところ、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスではＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウスよりも腫瘍体積が抑制された。

　国際公開第２０２１／２３０３０４およびＭａｓｈｉｍａ　Ｈ．らによる報告（Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．　２０２０　Ｓｅｐ　６；９（１）：１８１４６２０．　ｄｏｉ：　１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０２０．１８１４６２０）によれば、ＧＭ－ｐＭＣは、ＩＣＩｓよりも腫瘍成長を抑制した一方、ＧＭ－ｐＭＣとＩＣＩｓとを併用しても、ＧＭ－ｐＭＣ単独投与よりも優れた抗腫瘍効果を示さなかった。これに対し、驚くべきことに、ＩＬ１２－ｐＭＣは、ＩＣＩｓとの併用によりさらに強い抗腫瘍効果を示した。

（８－３）マウスの生存率
　マウスの生存率を図２０に示す。図中、アスタリスク（＊）はログランク検定によるｐ値を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＩＣＩｓ投与マウス、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウス、およびＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスの生存期間が延長された。ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウスは、ＩＣＩｓ投与マウスよりも生存期間が長かった。驚くべきことに、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスは、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウスよりも生存期間がさらに長かった。

　国際公開第２０２１／２３０３０４およびＭａｓｈｉｍａ　Ｈ．らによる報告（Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．　２０２０　Ｓｅｐ　６；９（１）：１８１４６２０．　ｄｏｉ：　１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０２０．１８１４６２０）によれば、ＧＭ－ｐＭＣは、ＩＣＩｓよりも生存期間を延長したが、ＧＭ－ｐＭＣとＩＣＩｓとを併用しても、ＧＭ－ｐＭＣ単独投与と比較して、生存期間を延長しなかった。

　以上の結果から、抗原ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣは、ＩＣＩｓ非感受性のがんに対してはＩＣＩｓよりも有効であることが判明した。また、抗原ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣとＩＣＩｓとの併用は、ＩＣＩｓ非感受性のがんに対して相乗的な治療効果を示すことが明らかになった。

＜９．ＩＬ１２－ｐＭＣのＩＣＩ感受性がんに対する治療的効果＞
（９－１）投与スケジュール
　Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスｉＰＳ細胞に代えてＢＡＬＢ／ｃマウスｉＰＳ細胞を用いて、上記１と同様の手順によりＩＬ１２－ｐＭＣを作製し、ＯＶＡペプチドに代えてＡＨ１ペプチド（ユーロフィンジェノミクス）を負荷した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスに代えてＢＡＬＢ／ｃマウス、ＭＯ４細胞に代えてＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣに代えてＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣを用いて、上記８と同様の手順により腫瘍の増殖と生存を経時的に評価した。腫瘍の長径が１５ｍｍを超えた時点をエンドポイントとした。ＣＴ２６細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の大腸がん細胞株である。ＡＨ１ペプチドは、マウス白血病ウイルスｇｐ７０由来のＣＴＬエピトープであり（ＰＮＡＳ，９３：９７３０－９７３５，１９９６）、ＣＴ２６細胞を用いた腫瘍免疫モデルに広く使用されている。

（９－２）腫瘍体積
　腫瘍体積の経時変化を図２１に示す。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ両側検定によるｐ値を示し（＊ｐ＜０．０５）、「ｎ．ｓ．」は有意差なしを意味する。ＩＣＩｓ投与マウス、ＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウス、およびＩＣＩｓ／ＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスにおいて、腫瘍体積が抑制された。ＩＣＩｓ投与による腫瘍体積の抑制効果は、ＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与と同等であった。ＩＣＩｓ／ＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与は、ＩＣＩｓまたはＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣの単独投与よりも、さらに腫瘍体積を抑制した。

（９－３）マウスの生存率
　マウスの生存率を図２２に示す。図中、アスタリスク（＊）はログランク検定によるｐ値を示し（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）、「ｎ．ｓ．」は有意差なしを意味する。ＩＣＩｓ投与マウス、ＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウス、およびＩＣＩｓ／ＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスの生存期間が延長された。ＩＣＩｓ投与マウスとＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウスの生存期間の延長は同等であった。ＩＣＩｓ／ＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスでは、ＩＣＩｓ投与マウスまたはＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウスよりも、さらに生存期間が延長された。

　以上の結果から、抗原ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣは、ＩＣＩｓ感受性のがんに対してはＩＣＩｓと同等の治療効果を有することが判明した。また、抗原ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣとＩＣＩｓとの併用は、ＩＣＩｓ感受性のがんに対して相乗的な治療効果を示すことが明らかになった。

（９－４）エクスビボでのＩＦＮ－γ産生能評価
　ＣＴ２６細胞の移植後５６日生存したＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ／ＩＣＩｓ併用マウスおよびナイーブマウスについて、ＯＶＡペプチドに代えてＡＨ１ペプチド、ＳＩＹペプチドに代えてβ－ｇａｌペプチド（ユーロフィンジェノミクス）、ＲＭＡ－Ｓ細胞に代えて脾臓抗原提示細胞を用いた以外は上記（６－４）と同様の手順によりＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行い、ＩＦＮ－γ産生能を評価した。β－ｇａｌペプチドは、β－ガラクトシダーゼ由来のペプチドであり、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた腫瘍免疫モデルにおける陰性対照ペプチドとして広く使用されている。

　結果を図２３に示す。図中、「ｐＡＨ１」はＡＨ１ペプチドを負荷された脾臓抗原提示細胞を用いた場合を意味し（黒バー）、「ｐβ－ｇａｌ」はβ－ｇａｌペプチドを負荷された脾臓抗原提示細胞を用いた場合（陰性対照）を意味する（白バー）。アスタリスク（＊）はスチューデントｔ両側検定によるｐ値を示す（＊ｐ＜０．０５）。ＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ／ＩＣＩｓ併用マウスのＣＤ８^＋Ｔ細胞は、β－ｇａｌペプチドを負荷された脾臓抗原提示細胞と共培養された場合よりも、ＡＨ１ペプチドを負荷された脾臓抗原提示細胞と共培養された場合に、ＩＦＮ－γを産生する細胞の数が増加した。この結果から、ＡＨ１ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ／ＩＣＩｓ併用マウスのＣＤ８^＋Ｔ細胞において、ＡＨ１特異的Ｔ細胞が高頻度で存在することが示された。

　以上の結果から、ＩＬ１２－ｐＭＣは、抗原特異的にＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘導できることが明らかになった。

＜１０．がん組織内の免疫細胞の変化＞
（１０－１）投与スケジュール
　上記（８－１）と同様の手順により、ＭＯ４細胞（ＩＣＩｓ非感受性）を用いて、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウス、ＩＣＩｓ投与マウス、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウス、および未処置マウスを作製した（それぞれｎ＝３）。がん組織は１７日目に採取した。

（１０－２）フローサイトメトリー
　腫瘍組織を採取する４時間前に２５０μｇのブレフェルジンＡ（ＡｄｉｐｏＧｅｎ）（１ｍｇ／ｍＬ）をマウスの腹腔内に注入した。機械的破砕および細胞外マトリックスの酵素分解により、腫瘍組織から単細胞懸濁液を得た。単離された腫瘍組織を細かく切り、１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、０．２ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（ナカライテスク）および２０ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ　Ｉ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁した。３７℃のウォーターバスにて組織懸濁液を３０分間消化した後、７０μｍフィルターに通して単細胞懸濁液を得た。単細胞懸濁液にＦｃ受容体ブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を加えてインキュベートし、製造元の指示に従って免疫蛍光標識抗体で染色した。

（１０－３）ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の割合
　がん組織におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＤ８陽性）およびＮＫ細胞（ＮＫ１．１陽性）の頻度を解析した結果を図２４に示す。各ゲート中の数値は、測定された各細胞のＣＤ４５陽性細胞に占める割合を示す。フローサイトメトリーの結果から算出されたＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の割合を図２５に示す。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ両側検定によるｐ値を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。未処置マウスおよびＩＣＩｓ投与マウスの比較では、がん組織内のＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の頻度に有意差はなかった。ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウスでは、ＩＣＩｓ投与マウスよりもがん組織内のＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の頻度が上昇した。ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスでは、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウスよりもがん組織内のＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度が上昇したが、ＮＫ細胞の頻度に有意差はなかった。

（１０－４）がん組織内ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＰｒｆ１^＋ＧｚｍＢ^＋細胞の割合
　がん組織内ＣＤ８^＋Ｔ細胞における細胞内抗原パーフォリン（Ｐｆｎ）およびグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）の発現を解析した結果を図２６に示す。各ゲート中の数値は、測定された各細胞のＣＤ８陽性細胞に占める割合を示す。フローサイトメトリーの結果から算出されたパーフォリン陽性かつグランザイムＢ陽性（Ｐｒｆ１^＋ＧｚｍＢ^＋）細胞の割合を図２７に示す。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ両側検定によるｐ値を示す（＊＊ｐ＜０．０１）。未処置マウスおよびＩＣＩｓ投与マウスの比較では、がん組織内のＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＰｒｆ１^＋ＧｚｍＢ^＋細胞の頻度に有意差はなかった。ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウスでは、ＩＣＩｓ投与マウスよりも、がん組織内のＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＰｒｆ１^＋ＧｚｍＢ^＋細胞の頻度が上昇した。ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスでは、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウスよりも、がん組織内のＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＰｒｆ１^＋ＧｚｍＢ^＋細胞の頻度が上昇した。

（１０－４）がん組織内ＮＫ細胞におけるＰｒｆ１^＋ＧｚｍＢ^＋細胞の割合
　がん組織内ＮＫ細胞（ＮＫ１．１^＋細胞）における細胞内抗原パーフォリン（Ｐｆｎ）およびグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）の発現を解析した結果を図２８に示す。各ゲート中の数値は、測定された各細胞のＮＫ細胞に占める割合を示す。フローサイトメトリーの結果から算出されたＰｒｆ１^＋ＧｚｍＢ^＋細胞の割合を図２９に示す。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ両側検定によるｐ値を示す（＊＊ｐ＜０．０１）。未処置マウスおよびＩＣＩｓ投与マウスの比較では、がん組織内のＮＫ細胞におけるＰｒｆ１^＋ＧｚｍＢ^＋細胞の頻度に有意差はなかった。ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウスでは、ＩＣＩｓ投与マウスよりも、がん組織内のＮＫ細胞におけるＰｒｆ１^＋ＧｚｍＢ^＋細胞の頻度が上昇した。ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスでは、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ投与マウスよりも、がん組織内のＮＫ細胞におけるＰｒｆ１^＋ＧｚｍＢ^＋細胞の頻度が上昇した。

　以上の結果から、ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣは、がん組織において細胞殺傷能力の高いＣＤ８^＋Ｔ細胞やＮＫ細胞を誘導することが明らかになった。また、この効果は、ＩＣＩｓとの併用により促進されることが判明した。

＜１１．臨床効果におけるＩＦＮ－γの役割＞
（１１－１）血中のＩＬ－１２ｐ７０およびＩＦＮ－γの濃度の測定
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの腹腔内に、上記１で調製したＩＬ１２－ｐＭＣ（１×１０^５個）にＯＶＡペプチドを負荷して投与した。投与から３、６、１２、２４、４８、７２時間後および７日後に採血し、血中のＩＬ－１２ｐ７０およびＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡにて定量した。

　結果を図３０および３１に示す。血中ＩＬ－１２ｐ７０は、ＩＬ１２－ｐＭＣ投与から１２時間後にピークに達し、４８時間後に検出限界以下になった（図３０）。一方、血中ＩＦＮ－γは、ＩＬ１２－ｐＭＣ投与から２４時間後にピークに達し、４８時間後および７２時間後にも２×１０^３ｐｇ／ｍＬ以上検出されたが、７日後には検出されなかった（図３１）。この結果から、ＩＬ１２－ｐＭＣ投与により血中ＩＦＮ－γが上昇し、長期間持続されることが示された。

（１１－２）投与スケジュール
　上記（８－１）と同様の手順により、ＭＯ４細胞（ＩＣＩｓ非感受性）を用いて、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスおよび未処置マウスを作製した。また、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスに、さらに抗ＩＦＮ－γ受容体抗体（αＩＦＮγＲ　Ａｂ、クローン名ＧＲ２０、ＢｉｏＸ　ｃｅｌｌ）（２００μｇ）をＭＯ４細胞移植の４、５、１１、１２、１８および１９日後に投与したマウス（以下、「ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用／抗ＩＦＮγＲ抗体マウス」とも記載する）を作製した。各マウス（ｎ＝１２）について、腫瘍の増殖と生存を経時的に評価した。腫瘍の長径が１５ｍｍを超えた時点をエンドポイントとした。

（１１－３）腫瘍体積
　腫瘍体積の経時変化を図３２に示す。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ両側検定によるｐ値を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスおよびＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用／抗ＩＦＮγＲ抗体マウスにおいて腫瘍体積が抑制されたが、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用／抗ＩＦＮγＲ抗体マウスにおける抗腫瘍効果は、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスにおける抗腫瘍効果よりも低下した。

　ＭＯ４細胞移植から２１日目のＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用マウスおよびＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用／抗ＩＦＮγＲ抗体マウスにおける腫瘍体積の平均値を図３３に示す。図中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ両側検定によるｐ値を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。抗ＩＦＮγＲ抗体の投与により腫瘍体積が増加しており、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスにおける抗腫瘍効果にはＩＦＮ－γが重要な役割を果たしていることが示された。

（１１－４）マウスの生存率
　マウスの生存率を図３４に示す。図中、アスタリスク（＊）はログランク検定によるｐ値を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスおよびＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用／抗ＩＦＮγＲ抗体マウスの生存期間が延長されたが、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用／抗ＩＦＮγＲ抗体マウスの生存期間は、ＩＣＩｓ／ＯＶＡペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣ併用投与マウスよりも短縮された。

　以上の結果から、抗原ペプチド負荷ＩＬ１２－ｐＭＣとＩＣＩｓとの併用によるＩＣＩｓ非感受性がんに対する抗腫瘍効果には、ＩＦＮ－γが重要な役割を果たしていることが明らかになった。

＜１２．ＩＬ－１２ｐ７０産生ヒト増殖性ミエロイド細胞の作製＞
　以下の手順によりＩＬ－１２ｐ７０産生ヒト増殖性ミエロイド細胞を作製した。作製スケジュールを図３５に示す。
（１２－１）ヒト増殖性ミエロイド細胞の作製
　ヒトｉＰＳ細胞を、Ｋｉｔａｙａｍａ　Ｓ．ら（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ．　２０１６　Ｆｅｂ　９；６（２）：２１３－２７．　ｄｏｉ：　１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１６．０１．００５．）に記載の方法により作製した。ヒト増殖性ミエロイド細胞を、以下の手順により作製した。ヒトｉＰＳ細胞を、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｌａｍｉｎｉｎ－５１１　Ｅ８）（ニッピ）でコーティングされた６ウェルプレートで、ヒトｉＰＳ細胞用培地ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素）中で培養した。ヒトｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）で３７℃、４分間処理して回収し、終濃度１０μＭのＹ－２７６３２（富士フイルム和光純薬）を含有するＳｔｅｍＦｉｔを用いてＣｏｓｔａｒ（商標）超低接着培養６ウェルプレート（コーニング）に播種した。播種翌日に培地を交換することによりＹ－２７６３２を除去した。３日間の浮遊培養により胚様体（ＥＢ）を形成させた後、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１×）（Ｇｉｂｃｏ）、４５０μＭのモノチオグリセロール（ナカライテスク）および５０μｇ／ｍＬのＬ－アスコルビン酸２－リン酸（シグマアルドリッチ）を添加した無血清培地Ｘ－ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ）を分化培地として以降の分化誘導を実施した。５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＢＭＰ－４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）、５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＶＥＧＦ（富士フイルム和光純薬）および５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えｂＦＧＦ（富士フイルム和光純薬）を含む分化培地中で３～４日培養することにより、中胚葉細胞への分化を誘導した。その後、細胞を、５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換え血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）（富士フイルム和光純薬）、５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（富士フイルム和光純薬）、５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換え幹細胞因子（ＳＣＦ）（富士フイルム和光純薬）、５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）（富士フイルム和光純薬）、１０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えトロンボポエチン（ＴＰＯ）（富士フイルム和光純薬）、２０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＩＬ－３（富士フイルム和光純薬）、および５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＧＭ－ＣＳＦ（富士フイルム和光純薬）を添加した分化培地中で１０日間培養することにより、造血系細胞への分化を誘導した。その後、細胞を、５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＦｌｔ３Ｌおよび５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＧＭ－ＣＳＦを添加した分化培地中で４～５日培養することにより、ミエロイド系細胞（以下、「ヒトＭＣ」ともいう）への分化を誘導した。

　ヒトＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２遺伝子を含むレンチウイルスベクターを、以下の手順により調製した。ヒトＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２の各ｃＤＮＡ配列（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿００１３５４８７０．１、ＮＭ＿００５１８０．９およびＮＭ＿００２３９２；配列番号４～６）をｐＳＬ（配列番号７）のマルチクローニングサイト（ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ）へ挿入し、ｐＳＬ－ＭＹＣ、ｐＳＬ－ＢＭＩ１およびｐＳＬ－ＭＤＭ２を得た。ｐＳＬは、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）のＥｃｏＲＩ－ＳｔｕＩ部位に、ＥＦ１αプロモーターを含むＣＳＩＩ－ＥＦ－ＭＣＳ（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ　ＤＮＡ　ＢＡＮＫ）の部分配列を挿入して作製した。

　ｐＳＬ－ＭＹＣ、ｐＳＬ－ＢＭＩ１またはｐＳＬ－ＭＤＭ２を、ｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐおよびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖとともに２９３Ｔ細胞へリポフェクションにより導入した。リポフェクションから３日後に培養上清を回収し、細孔径０．４５μｍのフィルターでろ過した後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーターによりウイルス粒子を濃縮した。得られたウイルス粒子はＤＭＥＭに懸濁した後、クライオバイアルに分注し、－１５０℃で保管した。

　上で作製したヒトＭＣに、ヒトＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２遺伝子を含むレンチウイルスを同時に感染させた。感染の際には、５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＧＭ－ＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＭ－ＣＳＦ（富士フイルム和光純薬）および５％のＡｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｒｕｍ（細胞科学研究所）を添加した無血清培地ＡＬｙＳ７０５（細胞科学研究所）を用いた。感染から７～１４日後に、ＧＭ－ＣＳＦ／Ｍ－ＣＳＦ依存性に増殖するミエロイド系細胞が出現し、これらを「ヒト増殖ミエロイド細胞（ヒトｐＭＣ）」と名付けた。ヒトｐＭＣを、２０％ＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＧＭ－ＣＳＦ組換え体および５０ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦ組換え体を含有するαＭＥＭ（以下、この培地を「ｈｐＭＣ培地」と記載する）で培養した。

（１２－２）ヒトＩＬ－１２ｐ７０を発現するレンチウイルスベクターの作製
　ヒトＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２ＢのｃＤＮＡ（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿０００８８２．４およびＮＭ＿００２１８７．３；配列番号８および９）をＰｏｒｃｉｎｅ　ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ－１（ＰＴＶ－１）由来の自己切断ペプチドＰ２Ａをコードする核酸配列（配列番号１０）により接続した融合ｃＤＮＡの３’末端に、ＩＲＥＳ配列（配列番号１１）およびヒトＣＤ１９断片（アミノ酸１－３３３）をコードする核酸配列（配列番号１２）をさらに接続したｃＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔに委託して合成した。このｃＤＮＡ（ＩＬ１２Ａ－Ｐ２Ａ－ＩＬ１２Ｂ－ＩＲＥＳ－Δ１９）をｐＳＬプラスミドのマルチクローニングサイト（ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ）へ挿入し、ｐＳＬ－ＩＬ１２Δ１９を得た（図３６）。

　ｐＳＬ－ＩＬ１２Δ１９を、ｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐおよびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖとともに２９３Ｔ細胞へリポフェクションにより導入した。リポフェクションから３日後に培養上清を回収し、細孔径０．４５μｍのフィルターでろ過した後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーターによりウイルス粒子を濃縮した。得られたウイルス粒子はＤＭＥＭに懸濁した後、クライオバイアルに分注し、－１５０℃で保管した。

（１２－３）ＩＬ－１２産生ヒト増殖性ミエロイド細胞の作製
　上記（１２－１）で作製したヒトｐＭＣを４８ウェルプレートに播種し、上記（１２－２）で作製したレンチウイルスベクターを感染させた。感染後の増殖培養には、ｈｐＭＣ培地を用いた。感染から８日後、蛍光標識抗ＣＤ１９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン４Ｇ７）を用いて細胞を染色し、Δ１９の発現を指標として細胞を分離した。分離されたΔ１９発現細胞（ＣＤ１９陽性細胞）は、ｈｐＭＣ培地中で３ヶ月以上にわたり増殖し続けた。この細胞を「ＩＬ－１２ｐ７０産生ヒト増殖性ミエロイド細胞（ヒトＩＬ１２－ｐＭＣ）」と名付けた。

　ヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣをフローサイトメトリーで評価した結果を図３７に示す。ＩＬ１２Ａ－Ｐ２Ａ－ＩＬ１２Ｂ－ＩＲＥＳ－Δ１９が導入されていないヒトｐＭＣはＣＤ１９陰性であったのに対し、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣはＣＤ１９陽性であった。この結果から、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣがＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂ遺伝子を発現していることが確認された。

＜１３．ＩＬ－１２ｐ７０産生ヒト増殖性ミエロイド細胞の表面マーカー解析＞
　上記１２で作製したヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣにおける表面マーカーの発現を免疫染色およびフローサイトメトリーにより解析した。免疫染色には、以下の表７に記載の抗体を用いた。

　表７．マーカーの染色に用いた抗体

　結果を図３８に示す。未染色細胞のヒストグラムを点線、染色細胞のヒストグラムを実線で示す。ヒトＩＬ１２－ｐＭＣは、ヒトｐＭＣと同様に、Ｔ細胞刺激に重要な分子であるＨＬＡクラスＩ分子、ＨＬＡクラスＩＩ分子、ＣＤ４０およびＣＤ８６を発現していた。このことから、ヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣは、Ｔ細胞刺激活性を有することが示唆された。

＜１４．ＩＬ－１２ｐ７０産生ヒト増殖性ミエロイド細胞の特性解析＞
（１４－１）増殖能
　上記１２で作製したヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣを９６ウェルプレートに播種し（３．０×１０^３細胞／ウェル）、ヒトＧＭ－ＣＳＦ組換え体（５０ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＭ－ＣＳＦ組換え体（５０ｎｇ／ｍＬ）、またはその組み合わせを添加した２０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ中で培養した。上記（３－１）と同様の手順により、各培地条件における増殖をＭＴＴアッセイにより経時的に評価した。

　結果を図３９に示す。ヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣの増殖はＭ－ＣＳＦ依存的であり、ＧＭ－ＣＳＦとＭ－ＣＳＦとを組み合わせて培地に添加することにより、増殖がさらに増強された。また、この増殖は３ヶ月以上継続した。これらの結果から、ヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣは、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦにより増殖を制御できるユニークな細胞であり、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦにより大量産生可能であることが示唆された。

（１４－２）サイトカイン産生
　１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を用いて、上記１２で作製したヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣ、ならびにヒトＤＣ（下記参照）を、９６ウェルプレートに播種した（１．０×１０^４細胞／ウェル）。２０μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を添加し、２４時間培養した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｅｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－１２　（ｐ７０）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によりＩＬ－１２ｐ７０を定量し、ＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｅｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によりＩＬ－１０を定量した。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を添加しない場合（培地のみ添加）のＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１０産生量も同様に測定した（対照）。

　ヒトＤＣは、以下の手順により調製した。ＣＤ１４　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてヒト末梢血単核球からＣＤ１４陽性単球を分離した。ＣＤ１４陽性単球を、ヒトＩＬ－４組換え体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）（５０ｎｇ／ｍＬ）およびヒトＧＭ－ＣＳＦ組換え体（５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で６日間培養することにより、樹状細胞へと誘導した。得られた細胞を「ヒトＤＣ」として使用した。

　ＩＬ－１２ｐ７０についての結果を図４０および表８に、ＩＬ－１０についての結果を図４１および表９に示す。図中、ヒトＤＣ、ヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣを、単に「ＤＣ」、「ｐＭＣ」および「ＩＬ１２－ｐＭＣ」と記載する。アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。

　ヒトＩＬ１２－ｐＭＣは、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激がない場合でも大量のＩＬ－１２ｐ７０を産生し（白バー）、その産生量は、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激によって増加しなかった（黒バー）。驚くべきことに、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣのＩＬ－１２ｐ７０産生量は、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激したヒトＤＣよりも４．８倍、ヒトｐＭＣよりも８６倍高かった。

　表８．ＩＬ－１２ｐ７０の産生量

　ヒトＤＣは、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激によりＩＬ－１０を産生した。一方、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣは、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激の有無によらずＩＬ－１０を産生しなかった。ヒトＩＬ１２－ｐＭＣは、免疫抑制性サイトカインであるＩＬ－１０を産生しないことから、ヒトＤＣよりも免疫抑制活性が低いと考えられた。したがって、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣは、細胞性免疫応答を誘導する上で、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激したヒトＤＣよりも優れていることが示唆された。

　表９．ＩＬ－１０の産生量

＜１５．ＩＬ－１２ｐ７０産生ヒト増殖性ミエロイド細胞のＴ細胞およびＮＫ細胞に対する刺激活性＞
　抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞、アロ反応性Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対するＩＬ－１２ｐ７０産生ヒト増殖性ミエロイド細胞の刺激活性を評価した。

（１５－１）抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞刺激活性
　上記１２で作製したヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣ、ならびに国際公開第２０２１／２３０３０４に記載されたＧＭ－ＣＳＦ／Ｍ－ＣＳＦ産生ヒト増殖性ミエロイド細胞（ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭ、本実施例では「ヒトＧＭＭ－ｐＭＣ」と記載する）に、１０μＭのヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）４６１－４６９ペプチド（以下、「ｈＴＥＲＴペプチド」とも記載する）を負荷した。１６時間後、細胞を９６ウェル丸底プレートに播種し（５×１０^４細胞／ウェル）、放射線を照射した（２０Ｇｙ）。Ａｒａｉ　Ｊ．らによる論文（Ｂｌｏｏｄ．　２００１　Ｍａｙ　１；９７（９）：２９０３－７）に記載された方法により、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２陽性ドナーの末梢血単核球から調製されたｈＴＥＲＴペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞（３×１０^４細胞／ウェル）を、上記ヒトｐＭＣ、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣおよびＧＭＭ－ｐＭＣの各ウェルに添加し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で４８時間共培養した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｅｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によりＩＦＮ－γを定量した。各細胞にｈＴＥＲＴペプチドを負荷しなかった場合（ビヒクル）のＩＦＮ－γ産生量も同様に測定した（対照）。

　結果を図４２および表１０に示す。図中、ヒトｐＭＣ、ヒトＧＭＭ－ｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣを、単に「ｐＭＣ」、「ＧＭＭ－ｐＭＣ」および「ＩＬ１２－ｐＭＣ」と記載する。アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ヒトＩＬ１２－ｐＭＣは、ヒトｐＭＣまたはヒトＧＭＭ－ｐＭＣよりも、抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＩＦＮ－γ産生誘導能が高かった。驚くべきことに、ｈＴＥＲＴペプチドを負荷されていないヒトＩＬ１２－ｐＭＣと共培養されたｈＴＥＲＴペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生量は、ｈＴＥＲＴペプチドを負荷されていないヒトｐＭＣまたはヒトＧＭＭ－ｐＭＣと共培養されたｈＴＥＲＴペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の９００倍以上であった（表１０）。また、驚くべきことに、ｈＴＥＲＴペプチドを負荷されたヒトＩＬ１２－ｐＭＣと共培養されたｈＴＥＲＴペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生量は、ｈＴＥＲＴペプチドを負荷されたヒトｐＭＣまたはヒトＧＭＭ－ｐＭＣと共培養されたｈＴＥＲＴペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の３．８倍であった（表１０）。

　表１０．抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生量

（１５－２）アロ反応性Ｔ細胞刺激活性
　上記１２で作製したヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣとはＨＬＡ型が一致しないドナーの末梢血単核球から、Ｐａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ，　ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＴ細胞を分離した。Ｔ細胞（５×１０^４細胞／ウェル）と、放射線を照射した（２０Ｇｙ）ヒトｐＭＣ、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣ、上記（１４－２）で作製したヒトＤＣもしくはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激したヒトＤＣとの混合物（１５：１、４５：１、１３５：１、４０５：１、１２１５：１または３６４５：１の混合比率）、またはＴ細胞のみを、９６ウェル丸底プレートに播種し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で５日間共培養した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｅｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γによりＩＦＮ－γを定量した。

　結果を図４３に示す。ヒトＩＬ１２－ｐＭＣは、ヒトｐＭＣ、ヒトＤＣまたはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激したヒトＤＣよりも、アロ反応性Ｔ細胞に対するＩＦＮ－γ産生誘導能が高かった。

（１５－３）ＮＫ細胞刺激活性
　上記１２で作製したヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣとＨＬＡ型が一致するドナーの末梢血単核球から、ＮＫ　ｃｅｌｌ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ，　ｈｕｍａｎ，　（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＮＫ細胞を分離した。ＮＫ細胞（３×１０^４細胞／ウェル）と、放射線を照射した（２０Ｇｙ）上記１２で作製したヒトｐＭＣ、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣ、上記（１４－２）で作製したヒトＤＣもしくはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激したヒトＤＣ（１×１０^４細胞／ウェル）とを混合し、９６ウェル丸底プレートに播種し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で４８時間共培養した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｅｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γによりＩＦＮ－γを定量した。

　結果を図４４および表１１に示す。図中、「ＤＣ」はヒトＤＣを、「ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）－ＤＣ」はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激したヒトＤＣを、「ｐＭＣ」はヒトｐＭＣを、「ＩＬ１２－ｐＭＣ」はヒトＩＬ１２－ｐＭＣを意味する。ヒトＩＬ１２－ｐＭＣは、ヒトｐＭＣ、ヒトＤＣまたはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激したヒトＤＣよりも、ＮＫ細胞に対するＩＦＮ－γ産生誘導能が高かった。驚くべきことに、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣと共培養されたＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの産生量は、ヒトｐＭＣ、ヒトＤＣまたはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激したヒトＤＣと共培養されたＮＫ細胞よりも少なくとも２００倍高かった。

　表１１．ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの産生量

　以上の結果から、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対して強力なＩＦＮ－γ産生誘導能を有することが示された。

＜１６．ヒトＩＬ１２－ｐＭＣの増殖を停止させるための放射線照射＞
　上記１２で作製したヒトＩＬ１２－ｐＭＣは、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦ依存的に増殖するため、がん化が懸念される。そのため、ヒトに投与する前には放射線照射することが想定される。ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの存在下または非存在下でヒトＩＬ１２－ｐＭＣの増殖が停止される放射線量を検討した。

　ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦ（各５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した、または添加しない２０％ＦＣＳ含有αＭＥＭを用いて、上記１２で作製したヒトｐＭＣおよびヒトＩＬ１２－ｐＭＣを９６ウェル丸底プレートに播種した（３×１０^３細胞／ウェル）。０、２．５、５、１０、２０、４０または８０Ｇｙの放射線を照射した。６日後に１μＣｉの３Ｈ－チミジンを添加し、さらに１６時間後にヒトｐＭＣまたはヒトＩＬ１２－ｐＭＣに取り込まれた放射線量を液体シンチレーションカウンターで測定した。

　結果を図４５に示す。図中、「ＩＬ１２－ｐＭＣ」はヒトＩＬ１２－ｐＭＣを、「ｐＭＣ」はヒトｐＭＣを、「ｃｙｔｏｋｉｎｅ」はＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを意味する。ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの非存在下では、放射線を照射しなかった場合でも（０Ｇｙ）増殖しなかった。ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの存在下では、０、２．５または５Ｇｙの放射線を照射しても増殖し、１０Ｇｙの放射線照射により増殖が停止された。

＜１７．ヒトＩＬ１２－ｐＭＣの造腫瘍性＞
　ヒトＩＬ１２－ｐＭＣをヒトがん治療に応用するためのリスク評価として、重症免疫不全マウス（ＮＳＧマウス、ジャクソンラボラトリージャパン）を用いてヒトＩＬ１２－ｐＭＣの造腫瘍性をの造腫瘍性を試験した。ルシフェラーゼ遺伝子（ＣＳＩＩ－ＥＦ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＩＲＥＳ－ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅ　ｐｈｏｓｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：熊本大学、千住覚博士より分与）を導入したヒトＩＬ１２－ｐＭＣに、１０Ｇｙの放射線を照射し、または照射せずに、ＮＳＧマウス（ｎ＝６）の腹腔内に投与した（５×１０^６細胞：治療時の推定投与量の５０倍）。マウス体内のヒトＩＬ１２－ｐＭＣの増殖または消失は、インビボイメージングで経時的に評価した。評価の際には、２％イソフルラン吸入麻酔下でＶｉｖｏＧｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ，　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｇｒａｄｅ（プロメガ）を投与し（３ｍｇ／マウス）、生物発光をＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　Ｓ５（パーキンエルマー）により測定した。

　結果を図４６および４７に示す。放射線照射なしのヒトＩＬ１２－ｐＭＣを腹腔内投与したマウスでは、４日後に生物発光が検出されなくなり、腫瘍性増殖は観察されなかった（図４６）。同様に、放射線照射したヒトＩＬ１２－ｐＭＣを腹腔内投与したマウスでも、４日後に生物発光が検出されなくなり、腫瘍性増殖は観察されなかった（図４７）。ヒトＩＬ１２－ｐＭＣは、放射線照射に関係なく免疫不全マウス体内で腫瘍性増殖しなかったことから、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣは腫瘍性に関して高い安全性を有し、医薬品への応用に適していることが示唆された。

＜１８．マウスＩＬ１２－ｐＭＣ（ペプチド負荷なし）の抗腫瘍効果＞
（１８－１）投与スケジュール
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの両脚皮下に、ＭＯ４細胞（１×１０^５個）を移植した（０日目）。５、１２、１９および２６日目に、右脚の移植部位周囲にＩＬ１２－ｐＭＣを投与した（１．２５×１０^５個投与（ｎ＝１４）、２．５×１０^５個投与（ｎ＝１２）、５×１０^５個（ｎ＝１２）または１×１０^６個（ｎ＝１２））。陰性対照には、治療用細胞を投与しなかった（ｎ＝１１）。各マウスについて、右脚および左脚における腫瘍の増殖と生存を経時的に評価した。腫瘍の長径が１５ｍｍを超えた時点をエンドポイントとした。

（１８－２）腫瘍体積
　各マウスにおける腫瘍体積の経時変化を図４８に、各マウス群における腫瘍径の中央値の経時変化を図４９に示す。１９日目の各マウスにおける腫瘍体積についての統計的有意差検定の結果を表１２に示す。表中、アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示し（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、「ｎｓ」は有意差なしを示す。ＩＬ１２－ｐＭＣの投与により、右脚（投与部位）における腫瘍の成長が強く抑制された。さらに、驚くべきことに、左脚（遠隔部位）においても腫瘍の成長が有意に抑制された。これらの結果から、ＩＬ１２－ｐＭＣの投与部位におけるがんのみならず、遠隔部位のがんの成長をも抑制できることが示された。

　表１２．腫瘍体積についての統計的有意差

（１８－２）マウスの生存率
　マウスの生存率を図５０に、統計的有意差検定の結果を表１３示す。表中、アスタリスク（＊）はログランク検定によるｐ値を示し、（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、「ｎｓ」は有意差なしを示す。ＩＬ１２－ｐＭＣの投与量依存的に、両脚担がんマウスの生存が延長された。

　表１３．生存率についての統計的有意差

＜１９．マウスＩＬ１２－ｐＭＣ（ペプチド負荷なし）の抗腫瘍効果（２）＞
（１９－１）投与スケジュール
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの両脚皮下に、ＭＯ４細胞（１×１０^５個）を移植した（０日目）。以下の４つの治療群を作製した（各群につきｎ＝１２）。陰性対照群には、治療のための細胞および抗体のいずれも投与しなかった（ｎ＝１２）。各マウスについて、右脚および左脚における腫瘍の増殖と生存を経時的に評価した。腫瘍の長径が１５ｍｍを超えた時点をエンドポイントとした。
　治療群１：　５、７、１２、１４、１９および２１日目に、ｐＭＣ（１×１０^６個）を右脚に投与
　治療群２：　５、１２および１９日目に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（２００μｇ）を腹腔内投与
　治療群３：　５、７、１２、１４、１９および２１日目に、ＩＬ１２－ｐＭＣ（１×１０^６個）を右脚に投与
　治療群４：　５、７、１２、１４、１９および２１日目に、ＩＬ１２－ｐＭＣ（１×１０^６個）を右脚に投与、かつ、５、１２および１９日目に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（２００μｇ）を腹腔内投与

（１９－２）腫瘍体積
　各マウスにおける腫瘍体積の経時変化を図５１に、各マウス群における腫瘍径の中央値の経時変化を図５２に示す。図中、「ｐＭＣ」は治療群１、「αＰＤ－Ｌ１Ａｂ」は治療群２、「ＩＬ１２－ｐＭＣ」は治療群３、「ＩＬ１２－ｐＭＣ＋αＰＤ－Ｌ１Ａｂ」は治療群４を示す。１８日目の各マウスにおける腫瘍体積についての統計的有意差検定の結果を表１４に示す。表中、アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示し（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、「ｎｓ」は有意差なしを示す。ＩＬ１２－ｐＭＣを投与した治療群３および４は、ＩＬ１２－ｐＭＣを投与しなかった各群（未治療群、治療群１または２）と比較して、右脚（投与部位）におけるがん抑制効果が優れていた。ＩＬ１２－ｐＭＣのみを投与された治療群３と、ＩＬ１２－ｐＭＣおよび抗ＰＤ－Ｌ１抗体の両方を投与された治療群４との間では、有意差は認められなかったが、治療群４におけるがん抑制効果の方がより優れていた。

　表１４．腫瘍体積についての統計的有意差

（１８－３）マウスの生存率
　マウスの生存率を図５３に、統計的有意差検定の結果を表１５に示す。表中、アスタリスク（＊）はログランク検定によるｐ値を示し（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、「ｎｓ」は有意差なしを示す。治療群３（ＩＬ１２－ｐＭＣ投与）では、陰性対照群、治療群１（ｐＭＣ投与）および治療群２（抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与）よりもマウスの生存が延長された。治療群３（ＩＬ１２－ｐＭＣ投与）と治療群４（ＩＬ１２－ｐＭＣ＋抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与）との間では、生存期間に有意差は認められなかった。一方、治療群４（ＩＬ１２－ｐＭＣ＋抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与）では、治療群２（抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与）よりもマウスの生存が延長された。

　表１５．生存率についての統計的有意差

　以上の結果から、ＩＬ１２－ｐＭＣは、がん抗原を負荷せずとも抗腫瘍効果を発揮できることが示された。

＜２０．ＭＨＣ欠損マウス増殖性ミエロイド細胞（ユニバーサル型ｐＭＣ）の作製＞
　上記１で作製したｐＭＣにおけるＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２ＤｂおよびＩ－Ａｂ遺伝子をゲノム編集によりノックアウトし、ユニバーサル型ｐＭＣ（ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ）を作製した。マウスＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ遺伝子中の共通配列（Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ．，２０１９，１１０（１０）：３０２７－３０３７；配列番号１３）を標的とするｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質（Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ^ＴＭＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｃａｓ９、タカラバイオ）との複合体、および、マウスＩ－Ａｂ遺伝子中の配列（Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ．，２０１９，１１０（１０）：３０２７－３０３７；配列番号１４）を標的とするｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質との複合体を、Ｎｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を用いてｐＭＣに導入した。ｓｇＲＮＡには、ＴｒｕｅＧｕｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇＲＮＡを用いた。導入後の細胞をｐＭＣ培地中で７日間培養した。以下の抗体を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーによりＨ－２Ｋｂ／Ｄｂ陰性Ｉ－Ａ／Ｅ陰性細胞を分離した。この細胞を「ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ」とした。

　表１６．染色に用いた抗体

　ｐＭＣ－Ｕｎｉｖを、５０ｎｇ／ｍＬのマウスＩＦＮ－γ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有するまたは含有しないｐＭＣ培地中で２４時間培養した後、表１６の抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーにより解析した。対照としてｐＭＣを用いた。

　結果を図５４に示す。ＩＦＮ－γはＭＨＣの発現を上昇させる作用を有することが知られており、ＩＦＮ－γ存在下で培養したｐＭＣでは、Ｈ－２Ｋｂ／Ｈ－２ＤｂおよびＩ－Ａｂの発現が上昇した。これに対し、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖでは、ＩＦＮ－γ存在下で培養しても、Ｈ－２Ｋｂ／Ｈ－２ＤｂおよびＩ－Ａｂのいずれの発現も見られなかった。これらの結果から、ｐＭＣ－ＵｎｉｖがＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２ＤｂおよびＩ－Ａｂを欠損していることが確認された。

＜２１．膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ欠損マウス増殖性ミエロイド細胞の作製＞
（２１－１）膜結合型マウスＩＬ－１２を発現するレンチウイルスベクターの作製
　５’→３’方向に、マウスＩｌ１２ａのｃＤＮＡ（配列番号１）、（Ｇ_４Ｓ）_３リンカーをコードする核酸配列（配列番号１５）、Ｉｌ１２ｂのｃＤＮＡ（配列番号２）、およびマウスＣＤ８０の膜貫通ドメインをコードする核酸配列（配列番号１６）を接続したｃＤＮＡ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ，２０２０，８：ｅ０００２１０）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔに委託して合成した。融合ｃＤＮＡをｐＳＬ（配列番号７）のマルチクローニングサイトへ挿入し、ｐＳＬ－ｍｂＩＬ１２を得た（図５５）。

　ｐＳＬ－ｍｂＩＬ１２、ｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐおよびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖを２９３Ｔ細胞へリポフェクションにより導入した。リポフェクションから３日後に培養上清を回収し、細孔径０．４５μｍのフィルターでろ過した後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーターによりウイルス粒子を濃縮した。得られたウイルス粒子はＤＭＥＭに懸濁した後、クライオバイアルに分注し、－１５０℃で保管した。

（２１－２）膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ欠損ｐＭＣの作製
　上記２０で作製したｐＭＣ－Ｕｎｉｖを４８ウェルプレートに播種し、上記（２１－１）で作製したレンチウイルスベクターを感染させた。感染後の増殖培養には、ｐＭＣ培地を用いた。感染から８日後、抗ＩＬ１２／２３抗体（表１７）を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーによりＩＬ１２／２３陽性細胞を分離した。分離されたＩＬ１２／２３陽性細胞は、ｐＭＣ培地中で３ヶ月以上にわたり増殖し続けた。この細胞を「ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ」と名付けた。

　表１７．染色に用いた抗体

　対照として、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖに代えてｐＭＣを用いた以外は同様の手順により、膜結合型ＩＬ－１２発現ｐＭＣを作製し、「ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ」と名付けた。

（２１－３）細胞表面マーカー解析
　ｐＭＣ、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ、およびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖを抗ＩＬ１２／２３抗体（表１７）により染色し、フローサイトメトリーにより解析した。

　結果を図５６に示す。ｐＭＣおよびｐＭＣ－Ｕｎｉｖは抗ＩＬ１２／２３抗体により染色されず、細胞表面にＩＬ－１２を発現していないことが確認された。これに対し、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖは抗ＩＬ１２／２３抗体により染色され、細胞表面にＩＬ－１２を発現していることが確認された。

＜２２．キメラ抗原受容体マクロファージ（ＣＡＲ－Ｍ）様膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ欠損マウス増殖性ミエロイド細胞の作製＞
　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させたマクロファージ（ＣＡＲ－Ｍ）の固形腫瘍に対する治療有効性が報告されている（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０２０，３８（８）９４７－９５３）。また、マクロファージにおけるＣＤ４７－ＳＩＲＰシグナルを阻害することによりマクロファージの貪食が活性化されることが知られており、ＳＩＲＰα欠損マクロファージは強いがん細胞殺傷能力を有する（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０２１，１２（１）：３２２９）。本実施例では、抗ヒトグリピカン３（ＧＰＣ３）抗体クローンＧＣ３３（米国特許第７９１９０８６）（以下、単に「ＧＣ３３」と記載する）由来のｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来の膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが融合されてなるＣＡＲを発現させた膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ欠損マウス増殖性ミエロイド細胞ならびに膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ／ＳＩＲＰα欠損マウス増殖性ミエロイド細胞を作製した。

（２２－１）ＭＨＣおよびＳＩＲＰαを欠損するマウス増殖性ミエロイド細胞の作製
　マウスＳＩＲＰα遺伝子中の配列（配列番号１７）を標的とするｓｇＲＮＡ（ＴｒｕｅＧｕｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇＲＮＡ）とＣａｓ９タンパク質との複合体を、Ｎｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を用いてｐＭＣ－ＵｎｉｖおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖに導入した。導入後の細胞をｐＭＣ培地中で７日間培養した。以下の抗体を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーによりＳＩＲＰα陰性細胞を分離した。得られた細胞を「ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ」および「ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ」とした。

　表１８．染色に用いた抗体

（２２－２）ＧＣ３３ベースのＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターの作製
　５’→３’方向に、マウスＣＤ８αのシグナル配列をコードするｃＤＮＡ（ＣＤＳ１－８１）（配列番号１８）、ＧＣ３３のＶＨをコードする核酸配列（配列番号１９）、２０５ｃリンカー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，３０（４２）：１０１１７－１０１２５）をコードする核酸配列（配列番号２０）、ＧＣ３３のＶＬをコードする核酸配列（配列番号２１）、マウスＣＤ８αの膜貫通領域をコードするｃＤＮＡ（ＣＤＳ４２４－６９９）（配列番号２２）、マウスＣＤ３ζの細胞内領域をコードするｃＤＮＡ（ＣＤＳ１５４－４９５）（配列番号２３）、ＩＲＥＳ配列（配列番号１１）およびマウスＣＤ１９の細胞外領域をコードするｃＤＮＡ（ＣＤＳ１－９９３）（配列番号２４）を接続したｃＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔに委託して合成した。融合ｃＤＮＡをｐＳＬ（配列番号７）のマルチクローニングサイトへ挿入し、ｐＳＬ－ＧＣ３３ｓｃＦｖ－Ｚ－ＩＲＥＳ－ｍΔ１９を得た（図５７）。

　ｐＳＬ－ＧＣ３３ｓｃＦｖ－Ｚ－ＩＲＥＳ－ｍΔ１９、ｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐおよびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖを２９３Ｔ細胞へリポフェクションにより導入した。リポフェクションから３日後に培養上清を回収し、細孔径０．４５μｍのフィルターでろ過した後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーターによりウイルス粒子を濃縮した。得られたウイルス粒子はＤＭＥＭに懸濁した後、クライオバイアルに分注し、－１５０℃で保管した。

（２２－３）ＣＡＲ－Ｍ様ＭＨＣ欠損マウス増殖性ミエロイド細胞の作製
　ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ、およびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯをそれぞれ４８ウェルプレートに播種し、上記（２２－２）で作製したレンチウイルスベクターを感染させた。感染後の増殖培養には、ｐＭＣ培地を用いた。感染から８日後、以下の抗体を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーによりＣＤ１９陽性細胞を分離した。得られた細胞を「ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＧＣ３３－Ｚ」、「ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＧＣ３３－Ｚ」、「ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ」および「ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ」と名付けた。

　表１９．染色に用いた抗体

（２２－４）細胞表面マーカー解析
　ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ならびに上記（２２－１）および（２２－３）で作製した細胞を、表１７～１９の抗体およびＦＩＴＣ標識ヒトＧＰＣ３（ＡＣＲＯ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により染色し、フローサイトメトリーにより解析した。

　結果を図５８および５９に示す。ｐＭＣ－Ｕｎｉｖは、ＳＩＲＰα陽性、ＣＤ１９陰性、ＧＰＣ３結合陰性、ＩＬ１２／２３陰性であった。ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯは、ＳＩＲＰα陰性、ＣＤ１９陰性、ＧＰＣ３結合陰性、ＩＬ１２／２３陰性であった　。ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＧＣ３３－Ｚは、ＳＩＲＰα陽性、ＣＤ１９陽性、ＧＰＣ３結合陽性、ＩＬ１２／２３陰性であった。ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚは、ＳＩＲＰα陰性、ＣＤ１９陽性、ＧＰＣ３結合陽性、ＩＬ１２／２３陰性であった。ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖは、ＳＩＲＰα陽性、ＣＤ１９陰性、ＧＰＣ３結合陰性、かつＩＬ１２／２３陽性であった。ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯは、ＳＩＲＰα陰性、ＣＤ１９陰性、ＧＰＣ３結合陰性、かつＩＬ１２／２３陽性であった。ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＧＣ３３－Ｚは、ＳＩＲＰα陽性、ＣＤ１９陽性、ＧＰＣ３結合陽性、かつＩＬ１２／２３陽性であった。ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚは、ＳＩＲＰα陰性、ＣＤ１９陽性、ＧＰＣ３結合陽性、かつＩＬ１２／２３陽性であった。

＜２３．ＣＡＲ－Ｍ様膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ欠損マウス増殖性ミエロイド細胞のがん傷害活性＞
（２３－１）がん抗原ＧＰＣ３を発現するがん細胞モデルの作製
（ｉ）ルシフェラーゼを発現するＭＣ３８の作製
　マウス大腸がん細胞株ＭＣ３８（アメリカ国立がん研究所、Ｊｅｆｆｅｒｅｙ　Ｓｃｈｌｏｍ博士より分与）に、ルシフェラーゼ遺伝子（ＣＳＩＩ－ＥＦ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＩＲＥＳ－ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅ　ｐｈｏｓｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；熊本大学、千住覚博士より分与）を導入し、ルシフェラーゼ発現ＭＣ３８（ＭＣ３８－Ｌｕｃ）を作製した。

（ｉｉ）ＧＰＣ３を発現するレンチウイルスベクターの作製
　ヒトＧＰＣ３のｃＤＮＡ（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿００４４８４、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔに委託して合成）をＣＳＩＩ－ＥＦプラスミド（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ　ＤＮＡ　ＢＡＮＫ）のマルチクローニングサイトに挿入し、ＣＳＩＩ－ＥＦ－ＧＰＣ３を作製した。ＣＳＩＩ－ＥＦ－ＧＰＣ３、ｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐおよびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖを２９３Ｔ細胞へリポフェクションにより導入した。リポフェクションから３日後に培養上清を回収し、細孔径０．４５μｍのフィルターでろ過した後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーターによりウイルス粒子を濃縮した。得られたウイルス粒子はＤＭＥＭに懸濁した後、クライオバイアルに分注し、－１５０℃で保管した。

（ｉｉｉ）ＧＰＣ３およびルシフェラーゼを発現するＭＣ３８の作製
　上記（ｉ）で作製したＭＣ３８－Ｌｕｃを４８ウェルプレートに播種し、上記（ｉｉ）で作製したレンチウイルスベクターを感染させた。感染後の増殖培養には、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭを用いた。感染から８日後、以下の抗体を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーによりＧＰＣ３陽性細胞を分離した。この細胞を「ＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３」と名付けた。

　表２０．染色に用いた抗体

　ＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３を抗ＧＰＣ３抗体（表２０）により染色し、フローサイトメトリーにより解析した。結果を図６０に示す。ＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３は、ＧＰＣ３を細胞表面に発現していることが確認された。

（２３－２）がん傷害活性の評価
　ターゲット細胞として、ＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３またはＭＣ３８－Ｌｕｃを用い、エフェクター細胞として、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ならびに上記（２２－１）および（２２－３）で作製した細胞を用いた。ターゲット細胞（３×１０^３細胞／ウェル）およびエフェクター細胞（３×１０^４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ中で４８時間共培養した。ルシフェラーゼの基質（Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ^ＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ、プロメガ）を添加して５分間インキュベートした後、生物発光をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ^ＴＭｉ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。生物発光の減少率（％　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を、以下の計算式により算出した。
［（最大発光－バックグラウンド発光）－（サンプル発光－バックグラウンド発光）］／（最大発光－バックグラウンド発光）×１００

　結果を図６１および６２に示す。図中、アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示し（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、「ｎｓ」は有意差なしを示す。ＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３およびｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚの共培養、ならびにＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３およびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚの共培養では、生物発光が６０％以上減少した（図６１Ｄ、図６２Ｈ）。これらの結果から、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－ＺおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚの強いがん傷害活性が確認された。

＜２４．膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ欠損マウス増殖性ミエロイド細胞のＩＦＮ－γ産生誘導能＞
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの脾細胞から、ＮＫ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　ｍｏｕｓｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＮＫ細胞を分離した。ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚを９６ウェルプレートに播種し（各１．０×１０^４細胞／ウェル）、放射線を照射した（２０Ｇｙ）。その後、ＮＫ細胞（５×１０^４細胞／ウェル）を添加し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で４８時間共培養した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｅｔ　Ｍｏｕｓｅ　ＩＦＮ－γによりＩＦＮ－γを定量した。

　また、ＮＫ細胞に代えてＴ細胞を用いた以外は上記と同様の手順により、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚとの共培養を実施し、ＩＦＮ－γを定量した。Ｔ細胞は、Ｐａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ，　ｍｏｕｓｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの脾細胞から分離したものを用いた。

　結果を図６３に示す。図中、アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示し（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、「ｎｓ」は有意差なしを示す。ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚは、ＮＫ細胞およびＴ細胞のＩＦＮ－γ産生を強く誘導した。これらの結果から、膜結合型ＩＬ－１２を発現するＭＨＣ欠損マウス増殖性ミエロイド細胞が、ＣＡＲの発現の有無によらず、Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対して強力なＩＦＮ－γ産生誘導能を有することが示された。

＜２５．膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ欠損マウス増殖性ミエロイド細胞のインビボにおける抗腫瘍効果＞
（２５－１）Ｈ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂを欠損するＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３の作製
　ＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３をマウスに投与すると、ＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３自身がＭＨＣ上に提示したＧＰＣ３によりＴ細胞応答が惹起され得る。そこで、膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ欠損マウス増殖性ミエロイド細胞のみのインビボ抗腫瘍効果を正確に評価するために、自らはＴ細胞応答を惹起できないがん細胞モデルとして、Ｈ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂを欠損したＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３を作製した。上記２０と同様の手順により、上記（２３－１）で作製したＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３におけるＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ遺伝子をノックアウトした。ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９タンパク質複合体の導入後の増殖培養には、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭを用いた。７日間の培養後、フローサイトメトリーによりＨ－２Ｋｂ／Ｄｂ陰性Ｉ－Ａ／Ｅ陰性細胞を分離し、「ＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３－Ｈ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ－ＫＯ」と名付けた（図６４）。

（２５－２）抗腫瘍効果
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの腹腔内に、ＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３－Ｈ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ－ＫＯ細胞（５×１０^５個／３００μＬ）を移植した（０日目）。１、３、７、１０、１４、１７、２１、２５、２８、および３１日目に、３×１０^６個／３００μＬの治療用細胞（ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖまたはｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ；１０Ｇｙ放射線照射）を腹腔内に投与した（それぞれｎ＝７）。陰性対照群には、治療用細胞を投与しなかった（ｎ＝７）。健康対照群には、がん細胞の移植も治療用細胞の投与も行わなかった（ｎ＝７）。１、３、７、１０、１４、１７、２２、２５、２９、および３２日目に、ＶｉｖｏＧｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを腹腔内に投与し、生物発光をＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　Ｓ５により測定した。健康対照群と比較して２０％以上の体重減少、低体温（３２℃以下）または腹水貯留が観察された時点をエンドポイントとした。

　１４日目の各マウスのインビボイメージングの結果を図６５に示し、ルシフェラーゼ発光の全フラックス（フォトン／秒）を図６６に示す。図中、「Ａ」は陰性対照群、「Ｂ」はｐＭＣ－Ｕｎｉｖ投与群、「Ｃ」はｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ投与群、「Ｄ」はｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ投与群、「Ｅ」はｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ投与群を示す。さらに、図６６に示されたルシフェラーゼ発光の全フラックスについての統計的有意差検定の結果を表２１に示す。表中、アスタリスク（＊）はスチューデントｔ両側検定によるｐ値を示し（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、「ｎｓ」は有意差なしを意味する。ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚは陰性対照群、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖよりも強いがん増殖抑制効果を示した。さらに、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚが最も強いがん増殖抑制効果を示し、その効果は、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚよりも有意に強かった。ｐＭＣ－Ｕｎｉｖは、がん増殖抑制効果を示さなかった。

　表２１．ルシフェラーゼ発光強度についての統計的有意差

（２５－３）マウスの生存率
　マウスの生存率を図６７に示し、図６７に示された生存率についての統計的有意差検定の結果を表２２に示す。表中、アスタリスク（＊）はログランク検定によるｐ値を示し（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、「ｎｓ」は有意差なしを意味する。ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚが最も生存期間を延長し、その効果は、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚよりも有意に強かった。ｐＭＣ－Ｕｎｉｖは、生存期間を延長しなかった。

　表２２．生存率についての統計的有意差

　以上の結果から、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚの抗腫瘍効果が示された。ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚは、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖよりも抗腫瘍効果が高かった。ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚが最も高い抗腫瘍効果を示した。

＜２６．膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ欠損マウス増殖性ミエロイド細胞のインビボにおける抗腫瘍効果（２）＞
　上記２５において高い抗腫瘍効果が確認されたｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚについて、さらに詳細な比較を行った。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの腹腔内に、ＭＣ３８－Ｌｕｃ－ＧＰＣ３－Ｈ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ－ＫＯ細胞（５×１０^５個／５００μＬ）を移植した（０日目）。２、４、８、１１、１４および１７日目に、３×１０^６個／３００μＬ、１×１０^６個／３００μＬ、３×１０^５個／３００μＬまたは１×１０^５個／３００μＬのｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖもしくはｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ（１０Ｇｙ放射線照射）を腹腔内に投与した（それぞれｎ＝１０）。対照群には、ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚ（３×１０^６個／３００μＬ）を投与した（ｎ＝１０）。陰性対照群には、治療用細胞を投与しなかった（ｎ＝１０）。４、８、１１、１５および１８日目に、ＶｉｖｏＧｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを腹腔内に投与し、生物発光をＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　Ｓ５により測定した。

　１８日目の各マウスのインビボイメージングの結果を図６８に示し、ルシフェラーゼ発光の全フラックス（フォトン／秒）を図６９に示し、それらについて群ごとにまとめたグラフを図７０に示す。図中、アスタリスク（＊）はマン・ホイットニーのＵ検定によるｐ値を示す（＊ｐ＜０．０５）。３×１０^６個／３００μＬ、１×１０^６個／３００μＬまたは３×１０^５個／３００μＬの投与量で比較した場合には、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＵｎｉｖおよびｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚの間で有意差は見られなかった。しかし、１×１０^５個／３００μＬの投与量で比較した場合には、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－ＺはｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖよりも有意にがん増殖を抑制した。これらの結果から、ｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－Ｕｎｉｖ－ＳＩＲＰα－ＫＯ－ＧＣ３３－Ｚは特に優れた抗腫瘍効果を発揮し、がん治療のためのユニバーサル細胞製剤の開発のために極めて有用であることが示された。

＜２７．ＨＬＡ適合ＩＬ－１２ｐ７０産生ヒト増殖性ミエロイド細胞の作製＞
（２７－１）内因性ＨＬＡ欠損ヒト増殖性ミエロイド細胞（ユニバーサル型ヒトｐＭＣ）の作製
　上記（１２－１）で作製したヒトｐＭＣに、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０６、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２およびＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２遺伝子中の共通配列（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２０１９，２４（４）：５６６－５７８．ｅ７；配列番号２５）を標的とするｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質との複合体、および、ヒトＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ（ＴｒｕｅＧｕｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇＲＮＡ、配列番号２６）とＣａｓ９タンパク質との複合体を、Ｎｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍを用いて導入した。導入後の細胞をｈｐＭＣ培地中で７日間培養した。以下の抗体を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーによりＨＬＡ－ＡＢＣ陰性ＨＬＡ－ＤＲ陰性細胞を分離した。得られた細胞を「ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ」と名付けた。

　同様の手順により、上記（１２－３）で作製したヒトＩＬ１２－ｐＭＣから内因性ＨＬＡ欠損細胞（ユニバーサル型ヒトＩＬ１２－ｐＭＣ）を作製し、「ＩＬ１２－ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ」と名付けた。

　表２３．染色に用いた抗体

（２７－２）ＨＬＡ－Ａ２およびＨＬＡ－Ａ２４を発現するレンチウイルスベクターの作製
　ＨＬＡ－Ａ２（ＨＬＡ＊０２：０１）のｃＤＮＡ（ＩＰＤ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＨＬＡ００００５；配列番号２７）およびＨＬＡ－Ａ２４（ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２）のｃＤＮＡ（ＩＰＤ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＨＬＡ０００５０；配列番号２８）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔに委託して合成した。ｃＤＮＡをＣＳＩＩ－ＥＦ－ＭＣＳプラスミド（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ　ＤＮＡ　ＢＡＮＫ）のマルチクローニングサイトに挿入し、ＣＳＩＩ－ＥＦ－ＨＬＡ－Ａ２およびＣＳＩＩ－ＥＦ－ＨＬＡ－Ａ２４を作製した。ＣＳＩＩ－ＥＦ－ＨＬＡ－Ａ２またはＣＳＩＩ－ＥＦ－ＨＬＡ－Ａ２４と、ｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐおよびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖを２９３Ｔ細胞へリポフェクションにより導入した。リポフェクションから３日後に培養上清を回収し、細孔径０．４５μｍのフィルターでろ過した後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーターによりウイルス粒子を濃縮した。得られたウイルス粒子はＤＭＥＭに懸濁した後、クライオバイアルに分注し、－１５０℃で保管した。

（２７－３）外因性ＨＬＡ－Ａ２およびＨＬＡ－Ａ２４を発現する内因性ＨＬＡ欠損ヒト増殖性ミエロイド細胞の作製
　上記（２７－１）で作製したｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯおよびＩＬ１２－ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯに、上記（２７－２）で作製したレンチウイルスを感染させた。感染後の増殖培養には、ｈｐＭＣ培地を用いた。感染から５日後、以下の抗体を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーによりＨＬＡ－Ａ２陽性細胞またはＨＬＡ－Ａ２４陽性細胞を分離した。分離された細胞は、ｈｐＭＣ培地中で３ヶ月以上にわたり増殖し続けた。得られた外因性ＨＬＡ－Ａ２発現ユニバーサル型ヒトｐＭＣ、外因性ＨＬＡ－Ａ２４発現ユニバーサル型ヒトｐＭＣ、外因性ＨＬＡ－Ａ２発現ユニバーサル型ヒトＩＬ１２－ｐＭＣおよび外因性ＨＬＡ－Ａ２４発現ユニバーサル型ヒトＩＬ１２－ｐＭＣを、それぞれ、「ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２」、「ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４」、「ＩＬ１２－ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２」および「ＩＬ１２－ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４」と名付けた。

　表２４．染色に用いた抗体

（２７－４）細胞表面マーカー解析
　ヒトｐＭＣ、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４、ＩＬ１２－ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２、およびＩＬ１２－ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４を、蛍光標識抗ＣＤ１９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン４Ｇ７）ならびに表２３および２４の抗体により染色し、フローサイトメトリーにより解析した。

　結果を図７１に示す。未染色細胞のヒストグラムを点線、染色細胞のヒストグラムを実線で示す。ヒトｐＭＣが由来するｉＰＳ細胞のドナー（以下、「ｐＭＣドナー」と記載する）のＨＬＡ型は、ＨＬＡ－Ａ２陰性ＨＬＡ－Ａ２４陽性であり、ヒトｐＭＣの染色結果はそれと一致した。一方、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯは、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体、抗ＨＬＡ－Ａ２４抗体および抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体のいずれによっても染色されなかった。ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２およびＩＬ１２－ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２は、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体により染色された。ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４およびＩＬ１２－ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４は、抗ＨＬＡ－Ａ２４抗体により染色された。また、ＩＬ１２－ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２およびＩＬ１２－ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４は、抗ＣＤ１９抗体により染色され、ＣＤ１９（ＩＬ１２の発現マーカー）を発現していることが確認された。

＜２８．ＨＬＡ適合ＩＬ－１２ｐ７０産生ヒト増殖性ミエロイド細胞の免疫回避能＞
　ｐＭＣドナー、ならびにｐＭＣドナーとはＨＬＡ型が一致しないドナーＡおよびドナーＢの末梢血単核球から、Ｐａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ，　ｈｕｍａｎを用いてＴ細胞を分離した。分離されたＴ細胞を、それぞれ「ｐＭＣドナーＴ細胞」、「ドナーＡ　Ｔ細胞」および「ドナーＢ　Ｔ細胞」と名付けた。

　ｐＭＣドナー、ドナーＡおよびドナーＢのＨＬＡ型を表２５に示す。ドナーＡは、ＨＬＡ－Ａ２４を有する点ではｐＭＣドナーと一致するが、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃの一部がｐＭＣドナーと異なる。ドナーＢは、ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－ＣがｐＭＣドナーと完全に異なり、ＨＬＡ－Ｂの一部がｐＭＣドナーと異なる。

　表２５．ドナーのＨＬＡ型

　ヒトｐＭＣ、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２またはｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４（２０Ｇｙ放射線照射）（１×１０^４細胞／ウェル）と、ｐＭＣドナーＴ細胞、ドナーＡ　Ｔ細胞またはドナーＢ　Ｔ細胞（５×１０^５細胞／ウェル）とを混合し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で共培養した。６日後に１μＣｉの３Ｈ－チミジンを添加し、さらに１６時間後にＴ細胞に取り込まれた放射線量を液体シンチレーションカウンターで測定した。

　結果を図７２～７４に示す。アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示し（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、「ｎ．ｓ．」は有意差なしを示す。ｐＭＣドナーＴ細胞は、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２に対して強い増殖応答を示し、免疫拒絶が起きていることが確認され（図７２）、一方、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯまたはｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４に対しては増殖応答を示さず、免疫拒絶が回避されたことが確認された（図７２）。ドナーＡ　Ｔ細胞およびドナーＢ　Ｔ細胞は、ｐＭＣに対してのみ強い増殖応答を示した（図７３および７４）。ドナーＢはＨＬＡ－Ａ２およびＨＬＡ－Ａ２４のいずれも有していないことから、ｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２およびｐＭＣ－ＨＬＡ－ＫＯ－Ａ２４に対してドナーＢ　Ｔ細胞の増殖応答が増加することが予想されたが、増加は見られなかった（図７４）。統計的有意差検定の結果を表２６～２８に示す。

　表２６．ｐＭＣドナーＴ細胞の増殖応答についての統計的有意差

　表２７．ドナーＡ　Ｔ細胞の増殖応答についての統計的有意差

　表２８．ドナーＢ　Ｔ細胞の増殖応答についての統計的有意差

　以上の結果から、内因性ＨＬＡを欠損させた後に、必要なＨＬＡを外因的に発現させることにより、アロ反応性Ｔ細胞応答を惹起せずに目的のＴ細胞応答のみを誘導する抗原提示細胞を作製できることが示された。

＜２９．膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ欠損ヒト増殖性ミエロイド細胞の作製＞
（２９－１）膜結合型ヒトＩＬ－１２を発現するレンチウイルスベクターの作製
　５’→３’方向に、ヒトＩＬ－１２ＢのｃＤＮＡ（配列番号９）、（Ｇ_４Ｓ）_３リンカーをコードする核酸配列（配列番号１５）、ヒトＩＬ－１２ＡのｃＤＮＡ（配列番号８）のＣＤＳ１６９－７６２、およびヒトＣＤ８０の膜貫通ドメイン（ＣＤＳ７２１－８６７）をコードする核酸配列（配列番号２９）を接続したｃＤＮＡ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ，２０２０，８：ｅ０００２１０）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔに委託して合成した。融合ｃＤＮＡをｐＳＬ（配列番号７）のマルチクローニングサイトへ挿入し、ｐＳＬ－ｈｍｂＩＬ１２を得た（図７５）。

　ｐＳＬ－ｈｍｂＩＬ１２、ｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐおよびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖを２９３Ｔ細胞へリポフェクションにより導入した。リポフェクションから３日後に培養上清を回収し、細孔径０．４５μｍのフィルターでろ過した後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーターによりウイルス粒子を濃縮した。得られたウイルス粒子はＤＭＥＭに懸濁した後、クライオバイアルに分注し、－１５０℃で保管した。

（２９－２）膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ欠損ヒトｐＭＣの作製
　ヒトｐＭＣを４８ウェルプレートに播種し、上記（２９－１）で作製したレンチウイルスベクターを感染させた。感染後の増殖培養には、ｈｐＭＣ培地を用いた。感染から８日後、以下の抗体を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーによりＩＬ１２ｐ７０陽性細胞を分離した。分離されたＩＬ１２ｐ７０陽性細胞は、ｐＭＣ培地中で３ヶ月以上にわたり増殖し続けた。この細胞を「ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ」と名付けた。

　表２９．染色に用いた抗体

（２９－３）細胞表面マーカー解析
　ヒトｐＭＣおよびヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣを抗ＩＬ１２ｐ７０抗体（表２９）により染色し、フローサイトメトリーにより解析した。

　結果を図７６に示す。図では、各細胞名から「ヒト」を省略して表記する。未染色細胞のヒストグラムを点線、染色細胞のヒストグラムを実線で示す。ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣが細胞表面にＩＬ１２ｐ７０を発現していることが確認された。

＜３０．膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ欠損ヒト増殖性ミエロイド細胞のＩＬ１２分泌能＞
　ヒトｐＭＣ、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣまたはヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ（各２×１０^３細胞／ウェル）を、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を用いて９６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｅｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－１２　（ｐ７０）によりＩＬ－１２ｐ７０を定量した。

　結果を図７７に示す。図では、各細胞名から「ヒト」を省略して表記する。図中、アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ヒトＩＬ１２－ｐＭＣの培養上清からはＩＬ－１２が検出されたのに対し、ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣの培養上清からはＩＬ－１２が検出されなかった。以上の結果から、ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣは細胞表面にＩＬ１２を発現するが、細胞外には分泌しないことが示された。

＜３１．膜結合型ＩＬ－１２発現ＭＨＣ欠損ヒト増殖性ミエロイド細胞の表面マーカー解析＞
　ヒトｐＭＣ、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣ、ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣおよびヒトＤＣにおける表面マーカーの発現を免疫染色およびフローサイトメトリーにより解析した。免疫染色には、以下の表３０に記載の抗体を用いた。ヒトＤＣは、上記（１４－２）に記載の手順により調製した。
　表３０．マーカーの染色に用いた抗体

　結果を図７８に示す。図では、各細胞名から「ヒト」を省略して表記する。ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣは、ヒトｐＭＣと同様に、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４およびＳＩＲＰαを発現しており、一方、ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ１６、ＦｃεＲＩαおよびＣＤ３を発現していなかった。この結果から、膜結合型ＩＬ－１２の発現は、他の細胞表面タンパク質の発現に影響しないことが確認された。ヒトＤＣは、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＦｃεＲＩαおよびＳＩＲＰαを発現し、ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ１６およびＣＤ３を発現していなかった。

＜３２．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現ヒト増殖性ミエロイド細胞の作製＞
（３２－１）ＧＣ３３ベースのＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターの作製
　５’→３’方向に、ヒトＣＤ８αのシグナル配列（アミノ酸１－２１）をコードするｃＤＮＡ（配列番号３０）、ＧＣ３３のＶＨをコードする核酸配列（配列番号１９）、２０５ｃリンカー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，３０（４２）：１０１１７－１０１２５）をコードする核酸配列（配列番号２０）、ＧＣ３３のＶＬをコードする核酸配列（配列番号２１）、ヒトＣＤ８αの膜貫通領域（アミノ酸１２８－２１２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号３１）、ヒトＣＤ３ζの細胞内領域（アミノ酸５２－１６４）をコードするｃＤＮＡ（配列番号３２）、ＩＲＥＳ配列（配列番号１１）およびヒトＣＤ１９の細胞外領域（アミノ酸１－３３３）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１２）を接続したｃＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔに委託して合成した。融合ｃＤＮＡをｐＳＬ（配列番号７）のマルチクローニングサイトへ挿入し、ｐＳＬ－ＧＣ３３ｓｃＦｖ－Ｚ－ＩＲＥＳ－ｈΔ１９を得た（図７９）。

　ｐＳＬ－ＧＣ３３ｓｃＦｖ－Ｚ－ＩＲＥＳ－ｈΔ１９、ｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐおよびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖを２９３Ｔ細胞へリポフェクションにより導入した。リポフェクションから３日後に培養上清を回収し、細孔径０．４５μｍのフィルターでろ過した後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーターによりウイルス粒子を濃縮した。得られたウイルス粒子はＤＭＥＭに懸濁した後、クライオバイアルに分注し、－１５０℃で保管した。

（３２－２）ＣＡＲ発現ヒト増殖性ミエロイド細胞の作製
　ヒトｐＭＣおよびヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣをそれぞれ４８ウェルプレートに播種し、上記（３２－１）で作製したレンチウイルスベクターを感染させた。感染後の増殖培養には、ｈｐＭＣ培地を用いた。感染から８日後、蛍光標識抗ＣＤ１９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン４Ｇ７）を用いて細胞を染色し、Δ１９の発現を指標として細胞を分離した。分離されたΔ１９発現細胞（ＣＤ１９陽性細胞）は、ｈｐＭＣ培地中で３ヶ月以上にわたり増殖し続けた。得られた細胞を「ヒトｐＭＣ－ＧＣ３３－Ｚ」および「ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＧＣ３３－Ｚ」と名付けた。

（３２－３）細胞表面マーカー解析
　ヒトｐＭＣ、ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ、ならびに上記（３２－２）で作製したヒトｐＭＣ－ＧＣ３３－ＺおよびヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＧＣ３３－Ｚを、蛍光標識抗ＣＤ１９抗体、表２９の抗ＩＬ１２抗体、およびＦＩＴＣ標識ヒトＧＰＣ３（ＡＣＲＯ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により染色し、フローサイトメトリーにより解析した。

　結果を図８０に示す。図では、各細胞名から「ヒト」を省略して表記する。ヒトｐＭＣ－ＧＣ３３－ＺおよびヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＧＣ３３－Ｚは、ＣＤ１９陽性かつＧＰＣ３結合陽性であり、ＧＣ３３ベースのＣＡＲを発現を発現していることが確認された。ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣおよびヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＧＣ３３－ＺはＩＬ１２ｐ７０陽性であり、細胞表面にＩＬ１２を発現していることが確認された。

＜３３．ＣＡＲおよび／または膜結合型ＩＬ－１２を発現するヒト増殖性ミエロイド細胞のＩＦＮ－γ産生誘導能＞
　ｐＭＣドナー（表２５）の末梢血単核球から、ＮＫ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＮＫ細胞を分離した。また、ｐＭＣドナー（表２５）の末梢血単核球から、Ｐａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ，　ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＴ細胞を分離した。ＮＫ細胞またはＴ細胞（各５×１０^４細胞／ウェル）と、放射線を照射した（２０Ｇｙ）ヒトｐＭＣ、ヒトＩＬ１２－ｐＭＣ、ヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ、ヒトｐＭＣ－ＧＣ３３－ＺおよびヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＧＣ３３－Ｚ（各１．０×１０^４細胞／ウェル）とを混合し、９６ウェル丸底プレートに播種し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で４８時間共培養した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｅｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γによりＩＦＮ－γを定量した。

　結果を図８１および８２に示す。図では、各細胞名から「ヒト」を省略して表記する。図中、アスタリスク（＊）はＴｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによるｐ値を示し（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、「ｎ．ｓ．」は有意差なしを示す。いずれのヒト増殖性ミエロイド細胞も、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞のＩＦＮ－γ産生を誘導した。とりわけ、キメラ抗原受容体および膜結合型ＩＬ－１２の両方を発現するヒトｍｂＩＬ１２－ｐＭＣ－ＧＣ３３－Ｚは、他の細胞よりも格段に強くＮＫ細胞およびＴ細胞のＩＦＮ－γ産生を誘導した。これらの結果から、キメラ抗原受容体および膜結合型ＩＬ－１２の両方を発現する増殖性ミエロイド細胞の、インビボにおける高い抗腫瘍効果が示唆された。

Claims (19)

1. 　（１）ミエロイド細胞にｃ－ＭＹＣをコードする核酸を導入するステップと、
   　（２）前記ステップ（１）により得られた細胞をＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの存在下で培養するステップと、
   　（３）前記ステップ（２）により得られた細胞に、ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットをコードする核酸およびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットをコードする核酸を導入するステップと
   を含む、ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞を製造する方法。
2. 　前記ステップ（１）において、ＢＭＩ１をコードする核酸、およびＭＤＭ２、ＬＹＬ１またはＢＣＬ２アイソフォームアルファをコードする核酸をさらに導入する、請求項１に記載の方法。
3. 　前記ミエロイド細胞が多能性幹細胞から分化されたものである、請求項１に記載の方法。
4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の方法により製造された、ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞。
5. 　ｃ－ＭＹＣをコードする外因性核酸、ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットをコードする外因性核酸およびＩＬ－１２ｐ４０サブユニットをコードする外因性核酸を含んでなる、ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞。
6. 　ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦ依存的に増殖する、請求項５に記載の細胞。
7. 　ＣＤ４０－ＣＤ４０リガンド相互作用またはトール様受容体刺激がない状態で、少なくとも３００ｐｇ／１×１０^４細胞／２４時間のＩＬ－１２ｐ７０を産生する、請求項５に記載の細胞。
8. 　トール様受容体刺激がある状態の単球由来樹状細胞と比較して、少なくとも５倍のＩＬ－１２ｐ７０を産生する、請求項５に記載の細胞。
9. 　ＣＤ８６、ＣＤ８０およびＣＤ８３からなる群から選択される少なくとも１つの共刺激分子を発現する、請求項５に記載の細胞。
10. 　主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子を発現しない、請求項５に記載の細胞。
11. 　主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ遺伝子ならびに／またはそれらの発現に関与する因子をコードする遺伝子を欠損する、請求項１０に記載の細胞。
12. 　キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項１１に記載の細胞。
13. 　ＳＩＲＰα遺伝子をさらに欠損する、請求項１１に記載の細胞。
14. 　内因性の主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ遺伝子ならびに／またはそれらの発現に関与する因子をコードする遺伝子を欠損し、かつ、所望の主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよび／またはクラスＩＩをコードする外因性核酸をさらに含む、請求項５に記載の細胞。
15. 　請求項５～１４のいずれか１項に記載の細胞を含んでなる、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化するための組成物。
16. 　前記Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞によるインターフェロンγの産生を誘導する、請求項１５に記載の組成物。
17. 　請求項５～１４のいずれか１項に記載の細胞を含んでなる、対象におけるがんを予防または治療するための医薬組成物。
18. 　対象におけるがんを予防または治療するための方法であって、請求項５～１４のいずれか１項に記載の細胞を前記対象に投与するステップを含む、方法。
19. 　免疫チェックポイント阻害薬を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
     

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