JP2021526838A - 幹細胞の操作によるｉｎｋｔ細胞に基づく既製の細胞療法 - Google Patents

幹細胞の操作によるｉｎｋｔ細胞に基づく既製の細胞療法 Download PDF

Info

Publication number
JP2021526838A
JP2021526838A JP2020569178A JP2020569178A JP2021526838A JP 2021526838 A JP2021526838 A JP 2021526838A JP 2020569178 A JP2020569178 A JP 2020569178A JP 2020569178 A JP2020569178 A JP 2020569178A JP 2021526838 A JP2021526838 A JP 2021526838A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cell
inkt
engineered
tcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2020569178A
Other languages
English (en)
Inventor
リリ ヤン，
ヤンニ ジュー，
クリストファー シート，
アメリ モンテル−ハーゲン，
ゲイ ミリアム クルックス，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of JP2021526838A publication Critical patent/JP2021526838A/ja
Priority to JP2023062551A priority Critical patent/JP2023076711A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1185—Thymus cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本開示の実施形態は、臨床療法のために既製使用するための操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞に関する組成物および方法を含む。特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、造血幹前駆細胞から産生され、ＨＬＡ陰性であるので同種異系細胞療法にも適する。特定の実施形態では、細胞を特定のｉｎ ｖｉｔｒｏ三次元人工胸腺オルガノイド系で培養し、また、細胞は、イメージングおよび自殺標的化能を有する。本開示の実施形態は、少なくとも免疫学、細胞生物学、分子生物学、および少なくともがん医療を含めた医療の分野に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本出願に組み込まれる２０１８年６月１２日出願の米国仮出願第６２／６８３，７５０号の利益を主張するものである。
本開示の実施形態は、少なくとも免疫学、細胞生物学、分子生物学、および少なくともがん医療を含めた医療の分野に関する。
がんは、世界的に数千万人に影響を及ぼしており、米国およびカリフォルニア州における公衆衛生に対する主要な脅威である。がんは、カリフォルニアにおける死亡の第２の主な原因であり、毎年５６，０００件を超える死亡が生じており、また、カリフォルニア州に壊滅的な経済的影響ももたらしている。既存の治療にもかかわらず、がん患者は未だにこれらの処置の無効性、処置の毒性、および再発のリスクを被っている。したがって、がんに対する新規治療が切実に必要とされている。過去１０年の間に、免疫療法は新世代のがん医療になった。特に、細胞に基づく細胞治療に大きな見込みが示されている。顕著な例は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の操作による養子Ｔ細胞治療であり、これは、印象的な有効性である特定の血液がんを標的とするものである。
しかし、現行の処置プロトコールの大部分は、患者から採取された免疫細胞をその単一の患者を処置するために製造および使用する自己養子細胞移入からなる。そのような手法は、高価であり、製造労働集約的であり、また、必要とする全ての患者に広範に送達することが難しい。したがって、多数の患者を処置するために、大規模に製造することができ、容易に分配することができる同種異系の免疫細胞製品に大きな需要がある。
既存の治療にもかかわらず、がん患者は未だこれらの処置の無効性、処置の毒性、および再発のリスクを被っている。したがって、がんおよび自己免疫疾患などの疾患に対する新規の治療が切実に必要とされている。本開示は、長年にわたる治療の必要性に対する解決法だけでなく、より広範に送達または分配することができる治療を提供する。
新しい治療の必要性、より詳細には、自己細胞を使用する個別化治療で提起される難題に妨害されない細胞治療の必要性に対処するための実施形態が提供される。治療用細胞集団または「既製の」治療用細胞集団を作り出すために使用することができる細胞集団を製造できることにより、新しい細胞治療の利用可能性および有用性が増加する。
実施形態は、操作された（engineered）インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞または操作されたｉＮＫＴ細胞の集団に関する。少なくとも一部の場合には、操作されたｉＮＫＴ細胞は、操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ；ＣＡＲ−ｉＮＫＴ細胞）および／または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ−ｉＮＫＴ細胞）を含む。細胞に関して考察されている任意の実施形態をそのような細胞の集団に適用することができる。特定の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、以下：ｉ）インバリアントアルファＴ細胞受容体コード配列の全部または一部；ｉｉ）インバリアントベータＴ細胞受容体コード配列の全部または一部、またはｉｉｉ）自殺遺伝子のうちの１つ、２つ、および／または３つを含む核酸を含む。さらなる実施形態では、ｉ）インバリアントアルファＴ細胞受容体の全部もしくは一部；ｉｉ）インバリアントベータＴ細胞受容体の全部もしくは一部、および／またはｉｉｉ）自殺遺伝子産物をコードする配列を有する核酸含む操作されたｉＮＫＴ細胞が存在する。
さらなる態様は、ＮＫ活性化受容体のレベルが増加しており、ＮＫ阻害性受容体のレベルが低下しており、かつ／または細胞傷害性分子のレベルが増加している操作されたｉＮＫＴ細胞に関する。一部の実施形態では、ＮＫ活性化受容体は、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＤＮＡＭ−１を含む。一部の実施形態では、細胞傷害性分子は、パーフォリンおよび／またはグランザイムＢを含む。一部の実施形態では、阻害性受容体は、ＫＩＲを含む。増加または低下は、健康な個体から単離された操作されていないｉＮＫＴにおける同じマーカーのレベルに対するものであり得る。さらなる態様は、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団であって、ＮＫ活性化受容体のレベルが増加しており、ＮＫ阻害性受容体のレベルが低下しており、かつ／または細胞傷害性分子のレベルが増加している細胞の集団に関する。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団の少なくとも７０％、ちょうど７０％もしくは７０％よりも多く、少なくとも７１％、ちょうど７１％もしくは７１％よりも多く、少なくとも７２％、ちょうど７２％もしくは７２％よりも多く、少なくとも７３％、ちょうど７３％もしくは７３％よりも多く、少なくとも７４％、ちょうど７４％もしくは７４％よりも多く、少なくとも７５％、ちょうど７５％もしくは７５％よりも多く、少なくとも７６％、ちょうど７６％もしくは７６％よりも多く、少なくとも７７％、ちょうど７７％もしくは７７％よりも多く、少なくとも７８％、ちょうど７８％もしくは７８％よりも多く、少なくとも７９％、ちょうど７９％もしくは７９％よりも多く、少なくとも８０％、ちょうど８０％もしくは８０％よりも多く、少なくとも８１％、ちょうど８１％もしくは８１％よりも多く、少なくとも８２％、ちょうど８２％もしくは８２％よりも多く、少なくとも８３％、ちょうど８３％もしくは８３％よりも多く、少なくとも８４％、ちょうど８４％もしくは８４％よりも多く、少なくとも８５％、ちょうど８５％もしくは８５％よりも多く、少なくとも８６％、ちょうど８６％もしくは８６％よりも多く、少なくとも８７％、ちょうど８７％もしくは８７％よりも多く、少なくとも８８％、ちょうど８８％もしくは８８％よりも多く、少なくとも８９％、ちょうど８９％もしくは８９％よりも多く、少なくとも９０％、ちょうど９０％もしくは９０％よりも多く、少なくとも９１％、ちょうど９１％もしくは９１％よりも多く、少なくとも９２％、ちょうど９２％もしくは９２％よりも多く、少なくとも９３％、ちょうど９３％もしくは９３％よりも多く、少なくとも９４％、ちょうど９４％もしくは９４％よりも多く、少なくとも９５％、ちょうど９５％もしくは９５％よりも多く、少なくとも９６％、ちょうど９６％もしくは９６％よりも多く、少なくとも９７％、ちょうど９７％もしくは９７％よりも多く、少なくとも９８％、ちょうど９８％もしくは９８％よりも多く、または少なくとも９９％、ちょうど９９％もしくは９９％よりも多くの細胞が高レベルのＮＫＧ２Ｄを発現する。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団の少なくとも８０％、ちょうど８０％もしくは８０％よりも多く、少なくとも８１％、ちょうど８１％もしくは８１％よりも多く、少なくとも８２％、ちょうど８２％もしくは８２％よりも多く、少なくとも８３％、ちょうど８３％もしくは８３％よりも多く、少なくとも８４％、ちょうど８４％もしくは８４％よりも多く、少なくとも８５％、ちょうど８５％もしくは８５％よりも多く、少なくとも８６％、ちょうど８６％もしくは８６％よりも多く、少なくとも８７％、ちょうど８７％もしくは８７％よりも多く、少なくとも８８％、ちょうど８８％もしくは８８％よりも多く、少なくとも８９％、ちょうど８９％もしくは８９％よりも多く、少なくとも９０％、ちょうど９０％もしくは９０％よりも多く、少なくとも９１％、ちょうど９１％もしくは９１％よりも多く、少なくとも９２％、ちょうど９２％もしくは９２％よりも多く、少なくとも９３％、ちょうど９３％もしくは９３％よりも多く、少なくとも９４％、ちょうど９４％もしくは９４％よりも多く、少なくとも９５％、ちょうど９５％もしくは９５％よりも多く、少なくとも９６％、ちょうど９６％もしくは９６％よりも多く、少なくとも９７％、ちょうど９７％もしくは９７％よりも多く、少なくとも９８％、ちょうど９８％もしくは９８％よりも多く、または少なくとも９９％、ちょうど９９％もしくは９９％よりも多くの細胞が高レベルのＤＮＡＭ−１を発現する。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団の最大１％、ちょうど１％もしくは１％未満、最大２％、ちょうど２％もしくは２％未満、最大３％、ちょうど３％もしくは３％未満、最大４％、ちょうど４％もしくは４％未満、最大５％、ちょうど５％もしくは５％未満、最大６％、ちょうど６％もしくは６％未満、最大７％、ちょうど７％もしくは７％未満、最大８％、ちょうど８％もしくは８％未満、最大９％、ちょうど９％もしくは９％未満、最大１０％、ちょうど１０％もしくは１０％未満、最大１１％、ちょうど１１％もしくは１１％未満、最大１２％、ちょうど１２％もしくは１２％未満、最大１３％、ちょうど１３％もしくは１３％未満、最大１４％、ちょうど１４％もしくは１４％未満、最大１５％、ちょうど１５％もしくは１５％未満、最大１６％、ちょうど１６％もしくは１６％未満、最大１７％、ちょうど１７％もしくは１７％未満、最大１８％、ちょうど１８％もしくは１８％未満、最大１９％、ちょうど１９％もしくは１９％未満、最大２０％、ちょうど２０％もしくは２０％未満、最大２１％、ちょうど２１％もしくは２１％未満、最大２２％、ちょうど２２％もしくは２２％未満、最大２３％、ちょうど２３％もしくは２３％未満、最大２４％、ちょうど２４％もしくは２４％未満、最大２５％、ちょうど２５％もしくは２５％未満、最大２６％、ちょうど２６％もしくは２６％未満、最大２７％、ちょうど２７％もしくは２７％未満、最大２８％、ちょうど２８％もしくは２８％未満、最大２９％、ちょうど２９％もしくは２９％未満、または最大３０％、ちょうど３０％もしくは３０％未満の細胞が高レベルのＫＩＲを発現する。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団の少なくとも６５％、ちょうど６５％もしくは６５％よりも多く、少なくとも６６％、ちょうど６６％もしくは６６％よりも多く、少なくとも６７％、ちょうど６７％もしくは６７％よりも多く、少なくとも６８％、ちょうど６８％もしくは６８％よりも多く、少なくとも６９％、ちょうど６９％もしくは６９％よりも多く、少なくとも７０％、ちょうど７０％もしくは７０％よりも多く、少なくとも７１％、ちょうど７１％もしくは７１％よりも多く、少なくとも７２％、ちょうど７２％もしくは７２％よりも多く、少なくとも７３％、ちょうど７３％もしくは７３％よりも多く、少なくとも７４％、ちょうど７４％もしくは７４％よりも多く、少なくとも７５％、ちょうど７５％もしくは７５％よりも多く、少なくとも７６％、ちょうど７６％もしくは７６％よりも多く、少なくとも７７％、ちょうど７７％もしくは７７％よりも多く、少なくとも７８％、ちょうど７８％もしくは７８％よりも多く、少なくとも７９％、ちょうど７９％もしくは７９％よりも多く、少なくとも８０％、ちょうど８０％もしくは８０％よりも多く、少なくとも８１％、ちょうど８１％もしくは８１％よりも多く、少なくとも８２％、ちょうど８２％もしくは８２％よりも多く、少なくとも８３％、ちょうど８３％もしくは８３％よりも多く、少なくとも８４％、ちょうど８４％もしくは８４％よりも多く、少なくとも８５％、ちょうど８５％もしくは８５％よりも多く、少なくとも８６％、ちょうど８６％もしくは８６％よりも多く、少なくとも８７％、ちょうど８７％もしくは８７％よりも多く、少なくとも８８％、ちょうど８８％もしくは８８％よりも多く、少なくとも８９％、ちょうど８９％もしくは８９％よりも多く、少なくとも９０％、ちょうど９０％もしくは９０％よりも多く、少なくとも９１％、ちょうど９１％もしくは９１％よりも多く、少なくとも９２％、ちょうど９２％もしくは９２％よりも多く、少なくとも９３％、ちょうど９３％もしくは９３％よりも多く、少なくとも９４％、ちょうど９４％もしくは９４％よりも多く、少なくとも９５％、ちょうど９５％もしくは９５％よりも多く、少なくとも９６％、ちょうど９６％もしくは９６％よりも多く、少なくとも９７％、ちょうど９７％もしくは９７％よりも多く、少なくとも９８％、ちょうど９８％もしくは９８％よりも多く、または少なくとも９９％、ちょうど９９％もしくは９９％よりも多くの細胞が高レベルのパーフォリンを発現する。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団の少なくとも５０％、ちょうど５０％もしくは５０％よりも多く、少なくとも５１％、ちょうど５１％もしくは５１％よりも多く、少なくとも５２％、ちょうど５２％もしくは５２％よりも多く、少なくとも５３％、ちょうど５３％もしくは５３％よりも多く、少なくとも５４％、ちょうど５４％もしくは５４％よりも多く、少なくとも５５％、ちょうど５５％もしくは５５％よりも多く、少なくとも５６％、ちょうど５６％もしくは５６％よりも多く、少なくとも５７％、ちょうど５７％もしくは５７％よりも多く、少なくとも５８％、ちょうど５８％もしくは５８％よりも多く、少なくとも５９％、ちょうど５９％もしくは５９％よりも多く、少なくとも６０％、ちょうど６０％もしくは６０％よりも多く、少なくとも６１％、ちょうど６１％もしくは６１％よりも多く、少なくとも６２％、ちょうど６２％もしくは６２％よりも多く、少なくとも６３％、ちょうど６３％もしくは６３％よりも多く、少なくとも６４％、ちょうど６４％もしくは６４％よりも多く、少なくとも６５％、ちょうど６５％もしくは６５％よりも多く、少なくとも６６％、ちょうど６６％もしくは６６％よりも多く、少なくとも６７％、ちょうど６７％もしくは６７％よりも多く、少なくとも６８％、ちょうど６８％もしくは６８％よりも多く、少なくとも６９％、ちょうど６９％もしくは６９％よりも多く、少なくとも７０％、ちょうど７０％もしくは７０％よりも多く、少なくとも７１％、ちょうど７１％もしくは７１％よりも多く、少なくとも７２％、ちょうど７２％もしくは７２％よりも多く、少なくとも７３％、ちょうど７３％もしくは７３％よりも多く、少なくとも７４％、ちょうど７４％もしくは７４％よりも多く、少なくとも７５％、ちょうど７５％もしくは７５％よりも多く、少なくとも７６％、ちょうど７６％もしくは７６％よりも多く、少なくとも７７％、ちょうど７７％もしくは７７％よりも多く、少なくとも７８％、ちょうど７８％もしくは７８％よりも多く、少なくとも７９％、ちょうど７９％もしくは７９％よりも多く、少なくとも８０％、ちょうど８０％もしくは８０％よりも多く、少なくとも８１％、ちょうど８１％もしくは８１％よりも多く、少なくとも８２％、ちょうど８２％もしくは８２％よりも多く、少なくとも８３％、ちょうど８３％もしくは８３％よりも多く、少なくとも８４％、ちょうど８４％もしくは８４％よりも多く、少なくとも８５％、ちょうど８５％もしくは８５％よりも多く、少なくとも８６％、ちょうど８６％もしくは８６％よりも多く、少なくとも８７％、ちょうど８７％もしくは８７％よりも多く、少なくとも８８％、ちょうど８８％もしくは８８％よりも多く、少なくとも８９％、ちょうど８９％もしくは８９％よりも多く、少なくとも９０％、ちょうど９０％もしくは９０％よりも多く、少なくとも９１％、ちょうど９１％もしくは９１％よりも多く、少なくとも９２％、ちょうど９２％もしくは９２％よりも多く、少なくとも９３％、ちょうど９３％もしくは９３％よりも多く、少なくとも９４％、ちょうど９４％もしくは９４％よりも多く、少なくとも９５％、ちょうど９５％もしくは９５％よりも多く、少なくとも９６％、ちょうど９６％もしくは９６％よりも多く、少なくとも９７％、ちょうど９７％もしくは９７％よりも多く、少なくとも９８％、ちょうど９８％もしくは９８％よりも多く、







または少なくとも９９％、ちょうど９９％もしくは９９％よりも多くの細胞が高レベルのグランザイムＢを発現する。本開示のさらなる態様は、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢを含む操作されたｉＮＫＴ細胞または細胞の集団に関する。本開示のさらなる態様は、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団であって、その９０％よりも多くが、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢを含む、集団に関する。
一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、異種プロモーターの制御下にある核酸を含み、これは、当該プロモーターが、核酸の転写を制御するゲノムプロモーターと同じものではないことを意味する。操作されたｉＮＫＴ細胞は、１つまたは複数のコード配列を含む外因性核酸を含み、その一部または全部が本明細書に記載の多くの実施形態において異種プロモーターの制御下にあることが意図されている。
特定の細胞または細胞集団の実施形態に関して考察されている任意の実施形態を任意の他の細胞または細胞集団の実施形態に関して使用することができることが特に留意される。さらに、特定の方法に関して使用される任意の実施形態を本明細書に記載の任意の他の方法に関して実行することができる。さらに、他の方法を実現するため、ならびに任意の細胞または細胞集団の使用を生み出すまたは説明するために、本明細書に記載の異なる方法の態様を組み合わせることができる。具体的には、１つまたは複数の実施形態の態様を本明細書に記載の１つまたは複数の他の実施形態の態様と組み合わせることができることが意図されている。さらに、本明細書に記載の任意の方法は、本明細書に記載の細胞または細胞集団の１つまたは複数の使用を説明するものと言い表すことができる。例えば、操作されたｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞集団の使用を本明細書に記載の任意の方法から説明することができる。
特定の実施形態では、少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラーＴ細胞受容体（ｉＮＫＴ ＴＣＲ）および外因性自殺遺伝子産物を発現する操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、少なくとも１つのｉＮＫＴ ＴＣＲが、外因性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域による転写制御下にある内因性インバリアントＴＣＲ遺伝子から発現される、操作されたｉＮＫＴ細胞が存在する。ｉＮＫＴ ＴＣＲは、「ＣＤ１ｄ分子によって提示される脂質抗原を認識するＴＣＲ」を指す。ｉＮＫＴ ＴＣＲは、アルファ−ＴＣＲ、ベータ−ＴＣＲ、またはその両方を含み得る。一部の場合では、利用されるＴＣＲは、それぞれＨＳＣの操作によるＭＡＩＴ細胞、ＧＥＭ細胞、またはガンマ／デルタＴ細胞が生じる、ＭＡＩＴ細胞ＴＣＲ、ＧＥＭ細胞ＴＣＲ、またはガンマ／デルタＴＣＲなどの、より広範な「インバリアントＴＣＲ」の群に属するものであってよい。
ある特定の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞集団が存在する。特定の実施形態では、変更されたゲノムインバリアントＴ細胞受容体配列またはインバリアントＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性核酸を含み、１つまたは複数のＨＬＡ−ＩまたはＨＬＡ−ＩＩ遺伝子の発現を欠く操作されたｉＮＫＴクローン細胞を含む、操作されたｉＮＫＴ細胞集団が存在する。「変更されたゲノムインバリアントＴ細胞受容体配列」は、組換えＤＮＡ技術によって変更された配列を意味する。「クローン」細胞という用語は、クローントランスジェニックｉＮＫＴ ＴＣＲを発現するように操作されたｉＮＫＴ細胞を指す。一部の実施形態では、クローン細胞は、同じ前駆細胞に由来する。一部の実施形態では、前駆細胞のセットに由来するクローン細胞を含む集団を意味する混合クローン細胞の集団が存在することが意図されており、当該セットは、１０個、少なくとも１０個もしくは最大１０個、２０個、少なくとも２０個もしくは最大２０個、３０個、少なくとも３０個もしくは最大３０個、４０個、少なくとも４０個もしくは最大４０個、５０個、少なくとも５０個もしくは最大５０個、６０個、少なくとも６０個もしくは最大６０個、７０個、少なくとも７０個もしくは最大７０個、８０個、少なくとも８０個もしくは最大８０個、９０個、少なくとも９０個もしくは最大９０個、１００個、少なくとも１００個もしくは最大１００個、２００個、少なくとも２００個もしくは最大２００個、３００個、少なくとも３００個もしくは最大３００個、４００個、少なくとも４００個もしくは最大４００個、５００個、少なくとも５００個もしくは最大５００個、６００個、少なくとも６００個もしくは最大６００個、７００個、少なくとも７００個もしくは最大７００個、８００個、少なくとも８００個もしくは最大８００個、９００個、少なくとも９００個もしくは最大９００個、１０００個、少なくとも１０００個もしくは最大１０００個またはそれよりも多く（またはその中で導き出せる任意の範囲）の前駆細胞であり得、これは、集団内の細胞が、最初にトランスフェクトした／感染させた前駆細胞のセットの後代であることを意味する。外因性核酸または変更されたゲノムＤＮＡ配列を含む細胞の場合では、クローン細胞は、外因性核酸が導入された祖先細胞から生じ得る。一部の実施形態は、同じ祖先細胞から生じた後代細胞を含む集団を意味するクローン細胞の集団に関する。細胞の一部の集団は、異なるクローン細胞の混合物を含有し得ることが意図され、これはこの集団が、外因性核酸を含有するが、外因性核酸の組込み部位などの識別可能な方法で異なり得る異なる祖先細胞から生じたことを意味する。核酸配列であって、細胞に導入され（単独でまたは長い核酸配列の一部として）、組み込まれるようになり、したがって、後代細胞がその組み込まれた核酸配列を含有する核酸配列は外因性核酸とみなされる。染色体外に維持される導入された核酸配列も外因性核酸とみなされる。
ｉＮＫＴアルファＴ細胞受容体の一部またはｉＮＫＴベータＴ細胞受容体の一部を利用する実施形態では、それらの両方を発現する細胞が、少なくとも、ＣＤ１ｄ分子によって提示される脂質抗原を認識する能力を評価するアッセイに基づいて機能的なｉＮＫＴ細胞になるように、実施形態は、機能的なｉＮＫＴアルファＴ細胞受容体の一部または機能的なｉＮＫＴベータＴ細胞受容体の一部を必要とすることが意図されている。
一部の実施形態では、核酸は、ｉＮＫＴ ＴＣＲ−アルファまたはｉＮＫＴ ＴＣＲ−ベータポリペプチドの５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、１２９個、１３０個、１３１個、１３２個、１３３個、１３４個、１３５個、１３６個、１３７個、１３８個、１３９個、１４０個、１４１個、１４２個、１４３個、１４４個、１４５個、１４６個、１４７個、１４８個、１４９個、１５０個、１５１個、１５２個、１５３個、１５４個、１５５個、１５６個、１５７個、１５８個、１５９個、１６０個、１６１個、１６２個、１６３個、１６４個、１６５個、１６６個、１６７個、１６８個、１６９個、１７０個、１７１個、１７２個、１７３個、１７４個、１７５個、１７６個、１７７個、１７８個、１７９個、１８０個、１８１個、１８２個、１８３個、１８４個、１８５個、１８６個、１８７個、１８８個、１８９個、１９０個、１９１個、１９２個、１９３個、１９４個、１９５個、１９６個、１９７個、１９８個、１９９個、２００個、２０１個、２０２個、２０３個、２０４個、２０５個、２０６個、２０７個、２０８個、２０９個、２１０個、２１１個、２１２個、２１３個、２１４個、２１５個、２１６個、２１７個、２１８個、２１９個、２２０個、２２１個、２２２個、２２３個、２２４個、２２５個、２２６個、２２７個、２２８個、２２９個、２３０個、２３１個、２３２個、２３３個、２３４個、２３５個、２３６個、２３７個、２３８個、２３９個、２４０個、２４１個、２４２個、２４３個、２４４個、２４５個、２４６個、２４７個、２４８個、２４９個、２５０個、２５１個、２５２個、２５３個、２５４個、２５５個、２５６個、２５７個、２５８個、２５９個、２６０個、２６１個、２６２個、２６３個、２６４個、２６５個、２６６個、２６７個、２６８個、２６９個、２７０個、２７１個、２７２個、２７３個、２７４個、２７５個、２７６個、２７７個、２７８個、２７９個、２８０個、２８１個、２８２個、２８３個、２８４個、２８５個、２８６個、２８７個、２８８個、２８９個、２９０個、２９１個、２９２個、２９３個、２９４個、２９５個、２９６個、２９７個、２９８個、２９９個、３００個、３０１個、３０２個、３０３個、３０４個、３０５個、３０６個、３０７個、３０８個、３０９個、３１０個、３１１個、３１２個、３１３個、３１４個、３１５個、３１６個、３１７個、３１８個、３１９個、３２０個、３２１個、３２２個、３２３個、３２４個、３２５個、３２６個、３２７個、３２８個、３２９個、３３０個、３３１個、３３２個、３３３個、３３４個、３３５個、３３６個、３３７個、３３８個、３３９個、３４０個、３４１個、３４２個、３４３個、３４４個、３４５個、３４６個、３４７個、３４８個、３４９個、３５０個、３５１個、３５２個、３５３個、３５４個、３５５個、３５６個、３５７個、３５８個、３５９個、３６０個、３６１個、３６２個、３６３個、３６４個、３６５個、３６６個、３６７個、３６８個、３６９個、３７０個、３７１個、３７２個、３７３個、３７４個、３７５個、３７６個、３７７個、３７８個、３７９個、３８０個、３８１個、３８２個、３８３個、３８４個、３８５個、３８６個、３８７個、３８８個、３８９個、３９０個、３９１個、３９２個、３９３個、３９４個、３９５個、３９６個、３９７個、３９８個、３９９個、４００個、４０１個、４０２個、４０３個、４０４個、４０５個、４０６個、４０７個、４０８個、４０９個、４１０個、４１１個、４１２個、４１３個、４１４個、４１５個、４１６個、４１７個、４１８個、４１９個、４２０個、４２１個、４２２個、４２３個、４２４個、４２５個、４２６個、４２７個、４２８個、４２９個、４３０個、４３１個、４３２個、４３３個、４３４個、４３５個、４３６個、４３７個、４３８個、４３９個、４４０個、４４１個、４４２個、４４３個、４４４個、４４５個、４４６個、４４７個、４４８個、４４９個、４５０個、４５１個、４５２個、４５３個、４５４個、４５５個、４５６個、４５７個、４５８個、４５９個、４６０個、４６１個、４６２個、４６３個、４６４個、４６５個、４６６個、４６７個、４６８個、４６９個、４７０個、４７１個、４７２個、４７３個、４７４個、４７５個、４７６個、４７７個、４７８個、４７９個、４８０個、４８１個、４８２個、４８３個、４８４個、４８５個、４８６個、４８７個、４８８個、４８９個、４９０個、４９１個、４９２個、４９３個、４９４個、４９５個、４９６個、４９７個、４９８個、４９９個、５００個（またはその中で導き出せる任意の範囲）のアミノ酸または連続したアミノ酸残基をコードする配列に対して、６０％、少なくとも６０％もしくは最大６０％、６１％、少なくとも６１％もしくは最大６１％、６２％、少なくとも６２％もしくは最大６２％、６３％、少なくとも６３％もしくは最大６３％、６４％、少なくとも６４％もしくは最大６４％、６５％、少なくとも６５％もしくは最大６５％、６６％、少なくとも６６％もしくは最大６６％、６７％、少なくとも６７％もしくは最大６７％、６８％、少なくとも６８％もしくは最大６８％、６９％、少なくとも６９％もしくは最大６９％、７０％、少なくとも７０％もしくは最大７０％、７１％、少なくとも７１％もしくは最大７１％、７２％、少なくとも７２％もしくは最大７２％、７３％、少なくとも７３％もしくは最大７３％、７４％、少なくとも７４％もしくは最大７４％、７５％、少なくとも７５％もしくは最大７５％、７６％、少なくとも７６％もしくは最大７６％、７７％、少なくとも７７％もしくは最大７７％、７８％、少なくとも７８％もしくは最大７８％、７９％、少なくとも７９％もしくは最大７９％、８０％、少なくとも８０％もしくは最大８０％、８１％、少なくとも８１％もしくは最大８１％、８２％、少なくとも８２％もしくは最大８２％、８３％、少なくとも８３％もしくは最大８３％、８４％、少なくとも８４％もしくは最大８４％、８５％、少なくとも８５％もしくは最大８５％、８６％、少なくとも８６％もしくは最大８６％、８７％、少なくとも８７％もしくは最大８７％、８８％、少なくとも８８％もしくは最大８８％、８９％、少なくとも８９％もしくは最大８９％、９０％、少なくとも９０％もしくは最大９０％、９１％、少なくとも９１％もしくは最大９１％、９２％、少なくとも９２％もしくは最大９２％、９３％、少なくとも９３％もしくは最大９３％、９４％、少なくとも９４％もしくは最大９４％、９５％、少なくとも９５％もしくは最大９５％、９６％、少なくとも９６％もしくは最大９６％、９７％、少なくとも９７％もしくは最大９７％、９８％、少なくとも９８％もしくは最大９８％、９９％、少なくとも９９％もしくは最大９９％、１００％、少なくとも１００％もしくは最大１００％（またはその中で導き出せる任意の範囲）同一である配列を含む。
ある特定の実施形態では、自殺遺伝子は、酵素に基づくものであり、これは、自殺遺伝子の遺伝子産物が酵素であり、自殺機能が酵素活性に依存することを意味する。１つまたは複数の自殺遺伝子を単一細胞またはクローン集団に利用することができる。一部の実施形態では、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼ（carboxypetidase）Ｇ２、シトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、または誘導性カスパーゼ９をコードする。これらの全てが、その全体が参照により組み込まれる、米国特許第８６２８７６７号、米国特許出願公開第２０１４０３６９９７９号、Ｕ．Ｓ．２０１４０２４２０３３、およびＵ．Ｓ．２００４００１４１９１におけるものなどの、自殺遺伝子を使用するための当技術分野における方法を使用することができる。さらなる実施形態では、ＴＫ遺伝子は、ウイルスＴＫ遺伝子、すなわち、ウイルス由来のＴＫ遺伝子である。特定の実施形態では、ＴＫ遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である。一部の実施形態では、自殺遺伝子産物は、基質によって活性化される。チミジンキナーゼは、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体によって活性化される自殺遺伝子産物である。ある特定の実施形態では、自殺遺伝子産物を活性化する基質を、検出のために標識する。一部の例では、イメージングのために標識することができる基質。一部の実施形態では、自殺遺伝子産物は、ＴＣＲ−アルファまたはＴＣＲ−ベータのうちの一方または両方をコードする、同じまたは異なる核酸分子によってコードされ得る。ある特定の実施形態では、自殺遺伝子は、ｓｒ３９ＴＫまたは誘導性カスパーゼ９である。代替の実施形態では、細胞は、外因性自殺遺伝子を発現しない。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）に特異的に結合する。
追加的な実施形態では、細胞は、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｉ分子またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を欠く、またはそれが低減している。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｉ分子および／またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現の欠如は、個々のＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ分子をコードする遺伝子を破壊することによって、または全てのＨＬＡ−Ｉ複合体分子に共通する成分であるＢ２Ｍ（ベータ２ミクログロブリン）をコードする遺伝子を破壊すること、または全てのＨＬＡ−ＩＩ遺伝子の発現を制御する極めて重要な転写因子であるＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ主要組織適合性遺伝子複合体トランス活性化因子）をコードする遺伝子を破壊する（discrupting）ことによって実現される。特定の実施形態では、細胞は、１つもしくは複数のＨＬＡ−Ｉ分子および／もしくはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を欠く、またはそのような分子を５０％（または少なくとも５０％）、６０％（または少なくとも６０％）、７０％（または少なくとも７０％）、８０％（または少なくとも８０％）、９０％（または少なくとも９０％）、１００％（または少なくとも１００％）（またはその中で導き出せる任意の範囲）低下したレベルで発現する。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞が遺伝子編集によって操作された（manipulated）ので、当該細胞においてＨＬＡ−ＩまたはＨＬＡ−ＩＩは発現されない。一部の実施形態では、遺伝子編集にはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が関与する。Ｃａｓ９の代わりに、ＣａｓＸまたはＣａｓＹが関与してもよい。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＴＡＬＥＮ、同様にＣｐｆ１は他の遺伝子編集技術であり、これら全てを使用することができる。他の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、ＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ分子、Ｂ２Ｍ、および／またはＣＩＩＴＡの発現を低減するためにターゲティングされた１つまたは複数の異なるｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子を含む。
一部の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、組換えベクターまたは細胞に導入された組換えベクター由来の核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、組換えベクターは、ウイルスベクターであるまたはそれであった。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスであるまたはそれであった。ある特定のウイルスベクターの核酸は宿主ゲノム配列内に組み込まれることが理解される。
一部の実施形態では、細胞は、動物血清を含む培地に曝露されなかった。さらなる実施形態では、細胞は、凍結しているまたは凍結していた。一部の実施形態では、細胞は、予め凍結したものであり、予め凍結された細胞は室温で少なくとも１時間にわたって安定である。一部の実施形態では、細胞は、予め凍結したものであり、予め凍結された細胞は、室温で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１０時間、１５時間、２０時間、２４時間、３０時間、または４８時間（またはその中で導き出せる任意の範囲）にわたって安定である。ある特定の実施形態では、溶液中に存在する細胞または細胞の集団は、デキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、および／またはＤＭＳＯを含む。さらなる実施形態では、細胞は、無菌性、非発熱性（nonpyogenic）、かつ等張性の溶液中に存在する。
ある特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、活性化されているまたは活性化される。特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）で活性化されている。
多数の細胞を伴う実施形態では、細胞集団は、約１０２個、少なくとも約１０２個もしくは最大で約１０２個、約１０３個、少なくとも約１０３個もしくは最大で約１０３個、約１０４個、少なくとも約１０４個もしくは最大で約１０４個、約１０５個、少なくとも約１０５個もしくは最大で約１０５個、約１０６個、少なくとも約１０６個もしくは最大で約１０６個、約１０７個、少なくとも約１０７個もしくは最大で約１０７個、約１０８個、少なくとも約１０８個もしくは最大で約１０８個、約１０９個、少なくとも約１０９個もしくは最大で約１０９個、約１０１０個、少なくとも約１０１０個もしくは最大で約１０１０個、約１０１１個、少なくとも約１０１１個もしくは最大で約１０１１個、約１０１２個、少なくとも約１０１２個もしくは最大で約１０１２個、約１０１３個、少なくとも約１０１３個もしくは最大で約１０１３個、約１０１４個、少なくとも約１０１４個もしくは最大で約１０１４個、約１０１５個、少なくとも約１０１５個もしくは最大で約１０１５個またはそれよりも多く（またはその中で導き出せる任意の範囲）の細胞を含み得、これらは、一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞である細胞である。一部の場合では、細胞集団は、操作されたｉＮＫＴ細胞を少なくとも約１０６〜１０１２個含む。一部の実施形態では、これらの数の細胞の集団は、単一の細胞のバッチから作製され、別々に作製された細胞のバッチをプールした結果ではないことが意図されている。
特定の実施形態では、ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および自殺チミジンキナーゼ遺伝子産物をコードする１つまたは複数の外因性核酸を含むクローンｉＮＫＴ細胞を含むｉＮＫＴ細胞集団であって、クローンｉＮＫＴ細胞が、機能的なベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、および／またはクラスＩＩ主要組織適合性遺伝子複合体もしくはトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）を発現しないように操作されており、細胞集団が、総細胞少なくとも約１０６〜１０１２個であり、操作されたｉＮＫＴ細胞を少なくとも約１０２〜１０６個含む、ｉＮＫＴ細胞集団が存在する。特定の例では、細胞を溶液中で凍結させる。
いくつかの実施形態が、ｉＮＫＴ細胞または細胞の集団、特に、細胞の一部または全部がクローンである集団を調製する方法に関する。ある特定の実施形態では、細胞集団は、細胞の少なくともまたは最大５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％（またはその中で導き出せる任意の範囲）、すなわち、集団内の別の細胞と同じ祖先細胞に由来している細胞の上記パーセンテージがクローン性である細胞を含む。他の実施形態では、細胞集団は、１種、少なくとも１種もしくは最大１種、２種、少なくとも２種もしくは最大２種、３種、少なくとも３種もしくは最大３種、４種、少なくとも４種もしくは最大４種、５種、少なくとも５種もしくは最大５種、６種、少なくとも６種もしくは最大６種、７種、少なくとも７種もしくは最大７種、８種、少なくとも８種もしくは最大８種、９種、少なくとも９種もしくは最大９種、１０種、少なくとも１０種もしくは最大１０種、１１種、少なくとも１１種もしくは最大１１種、１２種、少なくとも１２種もしくは最大１２種、１３種、少なくとも１３種もしくは最大１３種、１４種、少なくとも１４種もしくは最大１４種、１５種、少なくとも１５種もしくは最大１５種、１６種、少なくとも１６種もしくは最大１６種、１７種、少なくとも１７種もしくは最大１７種、１８種、少なくとも１８種もしくは最大１８種、１９種、少なくとも１９種もしくは最大１９種、２０種、少なくとも２０種もしくは最大２０種、２１種、少なくとも２１種もしくは最大２１種、２２種、少なくとも２２種もしくは最大２２種、２３種、少なくとも２３種もしくは最大２３種、２４種、少なくとも２４種もしくは最大２４種、２５種、少なくとも２５種もしくは最大２５種、２６種、少なくとも２６種もしくは最大２６種、７種、少なくとも７種もしくは最大７種、２８種、少なくとも２８種もしくは最大２８種、２９種、少なくとも２９種もしくは最大２９種、３０種、少なくとも３０種もしくは最大３０種、３１種、少なくとも３１種もしくは最大３１種、３２種、少なくとも３２種もしくは最大３２種、３３種、少なくとも３３種もしくは最大３３種、３４種、少なくとも３４種もしくは最大３４種、３５種、少なくとも３５種もしくは最大３５種、３６種、少なくとも３６種もしくは最大３６種、３７種、少なくとも３７種もしくは最大３７種、３８種、少なくとも３８種もしくは最大３８種、３９種、少なくとも３９種もしくは最大３９種、４０種、少なくとも４０種もしくは最大４０種、４１種、少なくとも４１種もしくは最大４１種、４２種、少なくとも４２種もしくは最大４２種、４３種、少なくとも４３種もしくは最大４３種、４４種、少なくとも４４種もしくは最大４４種、４５種、少なくとも４５種もしくは最大４５種、４６種、少なくとも４６種もしくは最大４６種、４７種、少なくとも４７種もしくは最大４７種、４８種、少なくとも４８種もしくは最大４８種、４９種、少なくとも４９種もしくは最大４９種、５０種、少なくとも５０種もしくは最大５０種、５１種、少なくとも５１種もしくは最大５１種、５２種、少なくとも５２種もしくは最大５２種、５３種、少なくとも５３種もしくは最大５３種、５４種、少なくとも５４種もしくは最大５４種、５５種、少なくとも５５種もしくは最大５５種、５６種、少なくとも５６種もしくは最大５６種、５７種、少なくとも５７種もしくは最大５７種、５８種、少なくとも５８種もしくは最大５８種、５９種、少なくとも５９種もしくは最大５９種、６０種、少なくとも６０種もしくは最大６０種、６１種、少なくとも６１種もしくは最大６１種、６２種、少なくとも６２種もしくは最大６２種、６３種、少なくとも６３種もしくは最大６３種、６４種、少なくとも６４種もしくは最大６４種、６５種、少なくとも６５種もしくは最大６５種、６６種、少なくとも６６種もしくは最大６６種、６７種、少なくとも６７種もしくは最大６７種、６８種、少なくとも６８種もしくは最大６８種、６９種、少なくとも６９種もしくは最大６９種、７０種、少なくとも７０種もしくは最大７０種、７１種、少なくとも７１種もしくは最大７１種、７２種、少なくとも７２種もしくは最大７２種、７３種、少なくとも７３種もしくは最大７３種、７４種、少なくとも７４種もしくは最大７４種、７５種、少なくとも７５種もしくは最大７５種、７６種、少なくとも７６種もしくは最大７６種、７７種、少なくとも７７種もしくは最大７７種、７８種、少なくとも７８種もしくは最大７８種、７９種、少なくとも７９種もしくは最大７９種、８０種、少なくとも８０種もしくは最大８０種、８１種、少なくとも８１種もしくは最大８１種、８２種、少なくとも８２種もしくは最大８２種、８３種、少なくとも８３種もしくは最大８３種、８４種、少なくとも８４種もしくは最大８４種、８５種、少なくとも８５種もしくは最大８５種、８６種、少なくとも８６種もしくは最大８６種、８７種、少なくとも８７種もしくは最大８７種、８８種、少なくとも８８種もしくは最大８８種、８９種、少なくとも８９種もしくは最大８９種、９０種、少なくとも９０種もしくは最大９０種、９１種、少なくとも９１種もしくは最大９１種、９２種、少なくとも９２種もしくは最大９２種、９３種、少なくとも９３種もしくは最大９３種、９４種、少なくとも９４種もしくは最大９４種、９５種、少なくとも９５種もしくは最大９５種、９６種、少なくとも９６種もしくは最大９６種、９７種、少なくとも９７種もしくは最大９７種、９８種、少なくとも９８種もしくは最大９８種、９９種、少なくとも９９種もしくは最大９９種、１００種、少なくとも１００種もしくは最大１００種（またはその中で導き出せる任意の範囲）の異なる親細胞から生じる細胞で構成される細胞集団を含む。
操作されたｉＮＫＴ細胞およびｉＮＫＴ細胞集団を調製、作出、製造、および使用するための方法が提供される。方法は、複数の実施形態では、以下のうちの１ステップ、２ステップ、３ステップ、４ステップ、５ステップ、６ステップ、７ステップ、８ステップ、９ステップ、１０ステップ、１１ステップ、１２ステップ、１３ステップ、１４ステップ、１５ステップまたはそれよりも多くを含む：造血細胞を得るステップ；造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）を得るステップ；１つまたは複数の造血細胞になることができる前駆細胞を得るステップ；ｉＮＫＴ細胞になることができる前駆細胞を得るステップ；１つまたは複数の細胞表面マーカーを使用して混合細胞集団から細胞を選択するステップ；細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を選択するステップ；細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を単離するステップ；ＣＤ３４＋細胞とＣＤ３４−細胞を互いに分離するステップ；ＣＤ３４以外のまたはそれに加えた細胞表面マーカーに基づいて細胞を選択するステップ；細胞にｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップ；細胞にｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするウイルスベクターを感染させるステップ；細胞にｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸をトランスフェクトするステップ；細胞にｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする発現構築物をトランスフェクトするステップ；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性核酸を細胞のゲノムに組み込むステップ；細胞に１つまたは複数の自殺遺伝子産物をコードする核酸を導入するステップ；細胞に自殺遺伝子産物をコードするウイルスベクターを感染させるステップ；細胞に１つまたは複数の自殺遺伝子産物をコードする核酸をトランスフェクトするステップ；細胞に自殺遺伝子産物をコードする発現構築物をトランスフェクトするステップ；自殺遺伝子産物をコードする外因性核酸を細胞のゲノムに組み込むステップ；細胞に１つもしくは複数のポリペプチドをコードする１つもしくは複数の核酸および／または遺伝子編集のための核酸分子を導入するステップ；細胞に１つまたは複数のポリペプチドおよび／または遺伝子編集のための核酸分子をコードするウイルスベクターを感染させるステップ；細胞に１つもしくは複数のポリペプチドをコードする１つもしくは複数の核酸および／または遺伝子編集のための核酸分子をトランスフェクトするステップ；細胞に１つまたは複数のポリペプチドおよび／または遺伝子編集のための核酸分子をコードする発現構築物をトランスフェクトするステップ；１つまたは複数のポリペプチドおよび／または遺伝子編集のための核酸分子をコードする外因性核酸を組み込むステップ；細胞のゲノムを編集するステップ；細胞のプロモーター領域を編集するステップ；ｉＮＫＴ ＴＣＲ遺伝子に対するプロモーターおよび／またはエンハンサー領域を編集するステップ；１つまたは複数の遺伝子の発現を排除するステップ；単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ遺伝子の発現を排除するステップ；細胞に遺伝子編集のための１つまたは複数の核酸をトランスフェクトするステップ；単離または選択された細胞を培養するステップ；単離または選択された細胞を増大させるステップ；１つまたは複数の細胞表面マーカーに関して選択された細胞を培養するステップ；ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を培養するステップ；単離されたＣＤ３４＋細胞を増大させるステップ；細胞を、ｉＮＫＴ細胞を産生させるまたは増大させる条件下で培養するステップ；細胞を人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で培養してｉＮＫＴ細胞を産生させるステップ；細胞を無血清培地中で培養するステップ；細胞をＡＴＯ系で培養するステップであって、ＡＴＯ系が、ノッチリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む３Ｄ細胞凝集体および無血清培地を含む、ステップ。ある実施形態では１つまたは複数のステップを排除することができることが特に意図されている。
一部の実施形態では、クローンｉＮＫＴ細胞の集団を調製する方法であって、ａ）ヒト末梢血液細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ３４＋細胞を選択するステップと、ｂ）ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップと、ｃ）単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ遺伝子の表面発現を排除するステップと、ｄ）ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で培養してｉＮＫＴ細胞を産生させるステップであって、ＡＴＯ系が、ノッチリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む３Ｄ細胞凝集体および無血清培地を含む、ステップとを含む方法が存在する。
操作されたｉＮＫＴ細胞を作り出すために使用することができる細胞は、造血前駆幹細胞である。細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄細胞、胎児肝臓細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、またはこれらの組合せに由来するものであり得る。
一部の実施形態では、方法は、ＣＤ３４−細胞を単離するステップまたはＣＤ３４−細胞とＣＤ３４＋細胞を分離するステップを含む。複数の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞をさらに操作することを伴う一方で、ＣＤ３４−細胞をｉＮＫＴ細胞の創製に使用することができる。したがって、一部の実施形態では、ＣＤ３４−細胞を引き続き使用し、この目的のために蓄えておくことができる。
ある特定の方法は、１つまたは複数の核酸を細胞に導入する前に、選択されたＣＤ３４＋細胞を培地中で培養するステップを伴う。細胞を培養するステップは、選択されたＣＤ３４＋細胞を、１つまたは複数の成長因子を含む培地でインキュベートすることを含み得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の成長因子は、ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ−３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む。さらなる実施形態では、培地は、ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ−３リガンド、およびＴＰＯを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の成長因子の濃度は、各成長因子それぞれに関して、またはこれらの特定の成長因子のすべての合計に関して約５ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌの間である。培地中の単一の成長因子または成長因子の組合せの濃度は、約、少なくとも約、または最大約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４１０、４２０、４２５、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４７５、４８０、４９０、５００ｎｇ／ｍｌまたはμｇ／ｍｌ（または導き出せる任意の範囲）であり得る、またはそれよりも高くてよい。
一部の実施形態では、核酸は、本明細書で考察されているα−ＴＣＲおよび／またはβ−ＴＣＲをコードする核酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、１つの核酸がα−ＴＣＲおよびβ−ＴＣＲの両方をコードする。追加的な実施形態では、核酸は、自殺遺伝子産物をコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、選択されたＣＤ３４＋細胞に導入される核酸分子は、α−ＴＣＲ、β−ＴＣＲ、および自殺遺伝子産物をコードするものである。他の実施形態では、方法は、選択されたＣＤ３４＋細胞に自殺遺伝子産物をコードする核酸を導入するステップも伴い、その場合、ＴＣＲ遺伝子の少なくとも１つをコードする核酸とは異なる核酸分子が自殺遺伝子産物をコードする。
考察されている通り、一部の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、細胞表面にＨＬＡ−Ｉ分子および／またはＨＬＡ−ＩＩ分子を発現せず、これは、ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、またはＨＬＡ−Ｉ分子およびＨＬＡ−ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することによって実現することができる。ある特定の実施形態では、方法は、単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ分子の表面発現を排除することを伴う。特定の実施形態では、発現の排除は、細胞のゲノムＤＮＡを遺伝子編集することによって実現することができる。いくつかの方法は、Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡに対応するＣＲＩＳＰＲおよび１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を細胞に導入することを含む。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲまたは１つもしくは複数のｇＲＮＡを、電気穿孔または脂質媒介性トランスフェクションによって細胞にトランスフェクトする。したがって、方法は、細胞にＣＲＩＳＰＲおよび１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする核酸をトランスフェクトすることによってＣＲＩＳＰＲおよび１つまたは複数のｇＲＮＡを細胞に導入することを伴い得る。一部の実施形態では、異なる遺伝子編集技術を使用することができる。
同様に、一部の実施形態では、ＴＣＲ受容体をコードする１つまたは複数の核酸を細胞に導入する。これは、細胞に、本明細書で考察されているウイルスベクターであってもそうでなくてもよい組換えベクターをトランスフェクトするまたは感染させることによって行うことができる。一部の実施形態では、外因性核酸を細胞のゲノムに組み入れることができる。
一部の実施形態では、細胞を無細胞培地中で培養する。ある特定の実施形態では、無血清培地は、外部から添加されたアスコルビン酸をさらに含む。特定の実施形態では、方法は、アスコルビン酸を培地に添加することを伴う。さらなる実施形態では、無血清培地は、以下の外部から添加された成分のうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、または１６種全て（またはその中で導き出せる範囲）をさらに含む：ＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インターフェロン−ラムダ、ＴＳＬＰ、チモペンチン、プレイオトロフィン（pleotrophin）、またはミッドカイン。追加的な実施形態では、無血清培地は、１種または複数種のビタミンを含む。一部の場合では、無血清培地は、以下のビタミンのうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、または１２種（またはその中で導き出せる任意の範囲）を含む：ビオチン、ＤＬアルファ酢酸トコフェロール、ＤＬアルファトコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２、またはその塩。ある特定の実施形態では、培地は、少なくともビオチン、ＤＬアルファ酢酸トコフェロール、ＤＬアルファトコフェロール、ビタミンＡ、またはこれらの組合せもしくは塩を含む。追加的な実施形態では、無血清培地は、１つまたは複数のタンパク質を含む。一部の実施形態では、無血清培地は、以下のタンパク質のうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種またはそれよりも多く（またはその中で導き出せる任意の範囲）を含む：アルブミンまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、またはこれらの組合せ。他の実施形態では、無血清培地は、以下の化合物のうちの１種、２種、３種、４種、５種、７種、８種、９種、１０種、または１１種を含む：コルチコステロン、Ｄ−ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ−カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、またはトリヨード−Ｌ−チロニン（triodo-I-thyronine）、またはこれらの組合せ。さらなる実施形態では、無血清培地は、Ｂ−２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ−２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２１（商標）サプリメント、またはこれらの組合せを含む。追加的な実施形態では、無血清培地は、アミノ酸、単糖、および／または無機イオンを含むまたはさらに含む。一部の態様では、無血清培地は、以下のアミノ酸のうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、または１３種を含む：アルギニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、またはバリン、またはこれらの組合せ。他の態様では、無血清培地は、以下の無機イオンのうちの１種、２種、３種、４種、５種、または６種を含む：ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素、またはリン、またはこれらの組合せもしくは塩。追加的な態様では、無血清培地は、以下の元素のうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種または７種を含む：モリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、またはマンガン、またはこれらの組合せ。
一部の方法では、細胞を人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で培養する。ＡＴＯ系は、細胞の凝集体である三次元（３Ｄ）細胞凝集体を伴う。ある特定の実施形態では、３Ｄ細胞凝集体は、ノッチリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む。一部の実施形態では、３Ｄ細胞凝集体は、ＣＤ３４＋形質導入細胞と間質細胞の選択された集団を物理的マトリックスまたは足場上で混合することによって作り出される。さらなる実施形態では、方法は、ＣＤ３４＋形質導入細胞および間質細胞を遠心分離して、物理的マトリックスまたは足場上に置かれる細胞ペレットを形成するステップを含む。ある特定の実施形態では、間質細胞は、インタクトな、部分的な、または改変されたＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、またはこれらの組合せであるノッチリガンドを発現する。さらなる実施形態では、ノッチリガンドは、ヒトノッチリガンドである。他の実施形態では、ノッチリガンドは、ヒトＤＬＬ１である。
さらなる態様では、間質細胞とＣＤ３４＋細胞の比は、約、少なくとも約、または最大で約５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０（またはその中で導き出せる任意の範囲）である。特定の実施形態では、間質細胞とＣＤ３４＋細胞の比は、約１：５〜１：２０である。特定の実施形態では、間質細胞は、マウス間質細胞株、ヒト間質細胞株、一次間質細胞の選択された集団、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて多能性幹細胞から分化した間質細胞の選択された集団、またはこれらの組合せである。ある特定の実施形態では、間質細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて造血幹細胞または前駆細胞から分化した間質細胞の選択された集団である。ＣＤ３４＋細胞と間質細胞の共培養は、約、少なくとも約、または最大で約１、２、３、４、５、６、７日間および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４週間、またはそれよりも長く（またはその中で導き出せる任意の範囲）行うことができる。一部の実施形態では、共培養前に間質細胞に照射を行う。
本開示の方法により、マーカーを発現し得るまたはある特定のマーカーが高レベルもしくは低レベルである細胞を少なくとも１×１０２個、１×１０３個、１×１０４個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個、１×１０１１個、１×１０１２個、１×１０１３個、１×１０１４個、１×１０１５個、１×１０１６個、１×１０１７個、１×１０１８個、１×１０１９個、１×１０２０個、または１×１０２１個（またはその中で導き出せる任意の範囲）含む細胞の集団を作製することができる。細胞集団数は、マーカー発現に基づく細胞選別を伴わずに、またはＮＫマーカー発現に基づく細胞選別を伴わずに、またはＴ細胞マーカー発現に基づく細胞選別を伴わずに実現されるものであり得る。一部の実施形態では、細胞集団サイズは、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ＢｉＴＥ、または他の異種腫瘍標的化作用物質などの異種標的化エレメントへの抗原の結合に基づく細胞選別を伴わずに実現されるものであり得る。さらに、実現される細胞の集団は、少なくとも、最大で、またはちょうど１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１日間または７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０週間（またはその中で導き出せる任意の範囲）という期間などのある特定の期間内に生じた少なくとも１×１０２個、１×１０３個、１×１０４個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個、１×１０１１個、１×１０１２個、１×１０１３個、１×１０１４個、１×１０１５個、１×１０１６個、１×１０１７個、１×１０１８個、１×１０１９個、１×１０２０個、または１×１０２１個（またはその中で導き出せる任意の範囲）の細胞を含むものであり得る。ＮＫ活性化因子、阻害因子、または細胞傷害性分子などのマーカー発現のレベルの高低は、ＦＡＣＳ分析によって決定される高発現に関し得る。一部の実施形態では、高レベルは、非ＮＫ細胞もしくは非ｉＮＫＴ細胞、またはＴ細胞ではない細胞に関係する。一部の実施形態では、レベルの高低は、ＦＡＣＳ分析で決定される。
一部の実施形態では、方法に使用されるフィーダー細胞は、ＣＤ３４−細胞を含む。これらのＣＤ３４−細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関して選択された同じ細胞の集団に由来し得る。追加的な実施形態では、細胞を活性化することができる。ある特定の実施形態では、方法は、ｉＮＫＴ細胞を活性化することを含む。特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞を、アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）で活性化し、増大させる。細胞を活性化し、増大させるために、細胞をα−ＧＣと一緒にインキュベートまたは培養することができる。一部の実施形態では、フィーダー細胞は、α−ＧＣでパルスされている。
一部の方法では、１つまたは複数のＨＬＡ−Ｉ分子またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を欠くｉＮＫＴ細胞を選択する。一部の態様では、ＨＬＡ−Ｉ分子および／またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を欠くｉＮＫＴ細胞を選択することにより、これらの細胞がレシピエント免疫細胞による枯渇から保護される。
細胞をすぐに使用することもでき、後で使用するために保管することもできる。ある特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞を作り出すために使用される細胞を凍結し、その一方、一部の実施形態では、作製されたｉＮＫＴ細胞を凍結することができる。一部の態様では、細胞は、デキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯを含む溶液中に存在する。他の実施形態では、細胞は、無菌性、非発熱性、および等張性の溶液中に存在する。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、造血幹細胞に由来する。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、Ｇ−ＣＳＦにより動員されたＣＤ３４＋細胞に由来する。一部の実施形態では、細胞は、がんを有さないヒト患者由来の細胞に由来する。一部の実施形態では、細胞は、内因性ＴＣＲを発現しない。
作製サイクルによって作製される細胞の数は、約、少なくとも約、または最大で約１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個、１０１４個、１０１５個（またはその中で導き出せる任意の範囲）の細胞またはそれよりも多くであり得、これらは、一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞である。一部の場合では、細胞集団は、操作されたｉＮＫＴ細胞を少なくとも約１０６〜１０１２個含む。一部の実施形態では、これらの数の細胞の集団は、単一の細胞のバッチから作製され、別々に作製された細胞のバッチをプールした結果ではない、すなわち、単一の作製サイクルに由来することが意図されている。
一部の実施形態では、細胞集団を凍結させ、次いで解凍する。細胞集団を使用して操作されたｉＮＫＴ細胞を作り出すことができる、または細胞集団が操作されたｉＮＫＴ細胞を含み得る。
操作されたｉＮＫＴ細胞を使用して、患者を処置することができる。一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数の追加的な核酸を、予め凍結および解凍されていてもそうでなくてもよい細胞集団に導入することを含む。この使用により、既製ｉＮＫＴ細胞を作り出すことの利点の１つがもたらされる。特定の実施形態では、１つまたは複数の追加的な核酸は、１つまたは複数の治療用遺伝子産物をコードする。治療用遺伝子産物の例としては、少なくとも以下が挙げられる：１．抗原認識分子、例えば、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）および／またはＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）；２．共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ；ならびに／または３．サイトカイン、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ；４．転写因子、例えば、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＲＯＲγｔ、ＦＯＸＰ３、およびＢｃｌ−６。治療用抗体は、キメラ抗原受容体、単鎖抗体、モノボディ、ヒト化抗体、二重特異性抗体、単鎖ＦＶ抗体またはこれらの組合せとして含められる。
一部の実施形態では、操作されたインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞を含む細胞集団を調製する方法であって、ａ）ヒト末梢血液細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ３４＋細胞を選択するステップと、ｂ）ＣＤ３４＋細胞を、ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ−３リガンド、およびヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む成長因子を含む培地中で培養するステップと、ｃ）選択されたＣＤ３４＋細胞に、α−ＴＣＲ、β−ＴＣＲ、チミジンキナーゼ、およびｓｒ３９ＴＫなどの自殺遺伝子をコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入するステップとｄ）選択されたＣＤ３４＋細胞にＣａｓ９ならびにベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）および／またはＣＴＩＩＡに対するｇＲＮＡを導入して、Ｂ２Ｍおよび／またはＣＴＩＩＡの発現を妨害するステップと、ｅ）形質導入された細胞を、外因性ノッチリガンドを発現する照射間質細胞株と一緒に２〜１２週間（例えば、２〜１０週間または６〜１２週間）にわたって培養して、３Ｄ凝集体細胞培養でｉＮＫＴ細胞を増大させるステップと、ｆ）ＨＬＡ−Ｉ分子および／またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を欠くｉＮＫＴ細胞を選択するステップと、ｇ）選択されたｉＮＫＴ細胞を、α−ＧＣが負荷された照射フィーダー細胞と一緒に培養するステップとを含む方法が存在する。
一部の実施形態では、ａ）ヒト末梢血液細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ３４＋細胞を選択するステップと、ｂ）ＣＤ３４＋細胞を、ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ−３リガンド、およびヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む成長因子を含む培地中で培養するステップと、ｃ）選択されたＣＤ３４＋細胞に、α−ＴＣＲ、β−ＴＣＲ、チミジンキナーゼ、およびレポーター遺伝子産物をコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入するステップと、ｄ）選択されたＣＤ３４＋細胞に、Ｃａｓ９ならびにベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）および／またはＣＴＩＩＡに対するｇＲＮＡを導入して、Ｂ２ＭまたはＣＴＩＩＡの発現を排除するステップと、ｅ）形質導入された細胞を、外因性ノッチリガンドを発現する照射間質細胞株と一緒に２〜１０週間にわたって培養して、ｉＮＫＴ細胞を３Ｄ凝集体細胞培養で増大させるステップと、ｆ）Ｂ２Ｍおよび／またはＣＴＩＩＡの発現を欠くｉＮＫＴ細胞を選択するステップと、ｇ）選択されたｉＮＫＴ細胞を照射フィーダー細胞と一緒に培養するステップとを含む方法によって作製された操作されたｉＮＫＴ細胞が存在する。
ｉＮＫＴ細胞または細胞集団で患者を処置する方法も提供される。ある特定の実施形態では、患者は、がんを有する。一部の実施形態では、患者は、一部の実施形態ではがんを除き、炎症を伴う疾患または状態を有する。特定の実施形態では、患者は、自己免疫疾患または状態を有する。特定の態様では、細胞または細胞集団は、患者に対して同種異系である。追加的な実施形態では、患者は、細胞または細胞集団の拒絶反応または枯渇の徴候を示さない。一部の治療方法は、患者に、ｉＮＫＴ細胞を活性化する刺激性分子（例えば、α−ＧＣ、単独でまたはＡＰＣに負荷したもの）、または自殺遺伝子産物を引き起こす（initiate）化合物を投与するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞で処置されるがんは、白血病を含む。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞で処置されるがんは、慢性骨髄性白血病細胞を含む。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞で処置されるがんは、血液がんを含む。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞で処置されるがんは、多発性骨髄腫を含む。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞で処置されるがんは、前立腺がんを含む。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞で処置されるがんは、肺がんを含む。
ｉＮＫＴ細胞によるがん患者の処置の結果、患者に細胞または細胞集団を投与した後にがん患者の腫瘍細胞の殺滅をもたらすことができる。炎症性疾患または状態に対する処置の結果、炎症の低減をもたらすことができる。他の実施形態では、自己免疫疾患または状態を有する患者は、疾患もしくは状態の症状の改善を経験し得る、またはｉＮＫＴ細胞による他の治療的利益を経験し得る。ｉＮＫＴ細胞と標準の治療レジメンまたは他の免疫療法レジメン（複数可）を組み合わせた処置を使用することができる。
前述は、続く詳細な説明をよりよく理解することができるように本開示の特色および技術的利点をいくぶん広範に概説したものである。本明細書の請求項の主題を形成する追加的な特色および利点を下に記載する。開示される概念および特定の実施形態を、本設計の同じ目的を実行するために他の構造を改変または設計するための基礎として容易に利用することができることが当業者には理解されるはずである。そのような等価の構築物は添付の特許請求の範囲に記載されている主旨および範囲から逸脱しないことも当業者には理解されるはずである。組織化および操作の方法（method of operation）の両方に関して本明細書に開示される設計の特徴であると考えられる新規の特色は、別の目的および利点と共に、以下の説明を添付の図面と併せて検討すればよりよく理解されよう。しかし、各図面は単に例示および説明のために提示され、本開示を限定する定義として意図されていないことが明白に理解されるべきである。
本開示を完全に理解するために、添付の図面と併せて以下の説明を参照する。
図１は、既製の普遍的な造血幹細胞（ＨＳＣ）の操作によるｉＮＫＴ（ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ）細胞養子治療の作製および使用の例の概略図である。
図２Ａ〜２Ｄは、ＢＬＴ（ヒト骨髄−肝臓−胸腺を生着させたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−マウス）ヒト化マウスモデルにおけるヒトＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ細胞の生成に関する図である。（２Ａ）実験設計の例。（２Ｂ）脾臓細胞のＦＡＣＳプロット。ＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ：ＢＬＴマウスにおいて生成されたヒトＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ細胞。ｈＴｃ：ヒト従来型Ｔ細胞。図２Ｃ〜２Ｄは、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系におけるヒトＨＳＣの操作によるＮＹ−ＥＳＯ−１特異的従来型Ｔ細胞の生成を示す。（２Ｃ）実験設計の例。（２Ｄ）細胞収量（ｎ＝３〜６）。＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による。
図３Ａ〜３Ｄは、頑強かつ高収量の二段階ＡＴＯ−αＧＣ ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系におけるヒトＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ細胞の生成を行った最初のＣＭＣ試験を実証する図である（ＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯ細胞を治療代用物として試験した）。ＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯ：ＡＴＯ培養下で生成されたヒトＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ細胞）。（３Ａ）２段階ＡＴＯ−αＧＣ ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系。ＡＴＯ：人工胸腺オルガノイド；αＧＣ：ｉＮＫＴ細胞を特異的に刺激する強力なアゴニストリガンドであるアルファ−ガラクトシルセラミド。（３Ｂ）ＡＴＯ培養段階でのＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯ細胞の生成。６Ｂ１１は、ｉＮＫＴ ＴＣＲに特異的に結合するモノクローナル抗体である。（３Ｃ）ＰＢＭＣ／αＧＣ培養段階でのＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯ細胞の増大。（３Ｄ）ＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯ細胞産出。 同上。
図４Ａ〜４Ｂは、ヒトＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性に関する最初の薬理学試験を提示する図である。（ＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯおよびＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞を治療代用物として試験した）。（４Ａ）表面ＦＡＣＳ染色。（４Ｂ）細胞内ＦＡＣＳ染色。ＰＢＭＣ−ｉＮＫＴ：健康なドナーＰＢＭＣ由来のｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させた内因性ｉＮＫＴ細胞；ＰＢＭＣ−Ｔｃ：健康なドナーＰＢＭＣ由来の内因性従来型Ｔ細胞。
図５Ａ〜５Ｋは、ヒトＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ細胞の腫瘍殺滅有効性に関する最初の有効性試験を提示する図である（ＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯおよびＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞を治療代用物として試験した）。（５Ａ〜５Ｆ）血液がんモデル。（５Ａ）ＭＭ．１Ｓ−ｈＣＤ１ｄ−ＦＧヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株。（５Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍殺滅アッセイ。（５Ｃ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍殺滅のルシフェラーゼ活性による分析（ｎ＝３）。（５Ｄ）ＮＳＧマウスヒトＭＭ転移モデルを使用したｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍殺滅アッセイ。（Ｅ〜Ｆ）ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍殺滅の生きている動物の生物発光イメージング（ＢＬＩ）による分析。１４日目の代表的なＢＬＩ画像（５Ｅ）および全身発光の時間経過測定値（ＴＢＬ；５Ｆ）が示されている（ｎ＝３〜４）。（５Ｇ〜５Ｋ）固形腫瘍モデル。（５Ｇ）Ａ３７５−ｈＣＤ１ｄ−ＦＧヒト黒色腫細胞株。（５Ｈ）ＮＳＧマウスヒト黒色腫固形腫瘍モデルを使用したｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍殺滅アッセイ。（５Ｉ）腫瘍重量（２５日目）。（５Ｊ）腫瘍部位へのＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞の浸潤を示すＦＡＣＳプロット（２５日目）。（５Ｋ）Ｊの定量（ｎ＝４）。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。 同上。
図６Ａ〜６Ｃは、毒性学／腫瘍形成性に関する最初の安全性試験を示す図である（ＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞を治療代用物として試験した）。（６Ａ）マウス体重（ｎ＝９〜１０）。ｎｓ、有意でない、スチューデントのｔ検定による。（６Ｂ）マウス生存率（ｎ＝９〜１０）。（６Ｃ）マウスの病理。種々の組織を採取し、ＵＣＬＡ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅによって分析した（ｎ＝９〜１０）。
図７Ａ〜７Ｄは、ＰＥＴイメージングおよび安全管理のためのｓｒ３９ＴＫ遺伝子に関する最初の安全性試験を示す図である。（ＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞を治療代用物として試験した）。（７Ａ）実験設計。（７Ｂ）ＧＣＶ処置前およびＧＣＶ処置後のＢＬＴ−ｉＮＫＴＴＫマウスのＰＥＴ／ＣＴ画像（ｎ＝４〜５）。（７Ｃ）ＧＣＶ処置後のＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞の有効かつ特異的な枯渇を示すＦＡＣＳプロット（ｎ＝４〜５）。（７Ｄ）７ＣにおけるＦＡＣＳプロットの定量（ｎ＝４〜５）。ｎｓ、有意でない；＊＊ｐ＜０．０１；スチューデントのｔ検定による。
図８Ａ〜８Ｆは、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を作製するための製造プロセスの例を示す図である。（８Ａ）実験設計。（８Ｂ）ＨＳＣにおけるレンチ／ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫベクター媒介性ｉＮＫＴ ＴＣＲ発現。（８Ｃ）ＨＳＣにおけるＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ発現のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ−ＣＩＩＴＡ−ｇＲＮＡ複合体媒介性ノックアウト。（８Ｄ）段階１培養と段階２培養の間の精製ステップを示す図。（８Ｅ）ＨＬＡ−Ｉ／ＩＩｎｅｇ細胞の２Ｍ２／Ｔｕｅ３９ ｍＡｂ媒介性ＭＡＣＳ負の選択。（８Ｆ）ＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯ細胞の６Ｂ１１ ｍＡｂ媒介性ＭＡＣＳ正の選択。 同上。
図９Ａ〜９Ｅは、作用機序（ＭＯＡ）試験の例を提示する図である。（９Ａ）ｉＮＫＴ細胞が腫瘍を標的とするために使用する可能性のある機序。（９Ｂ〜９Ｃ）腫瘍細胞のＣＤ１ｄ／ＴＣＲ媒介性直接殺滅に関する試験。（９Ｂ）実験設計；（９Ｃ）ＭＭ．１Ｓ−ｈＣＤ１ｄ−ＦＧヒト多発性骨髄腫細胞の殺滅（ｎ＝３）。（９Ｄ〜９Ｅ）ＮＫ細胞を活性化することによる腫瘍細胞のＣＤ１ｄ非依存性標的化に関する試験。（９Ｄ）実験設計；（９Ｅ）Ｋ５６２腫瘍細胞の殺滅（ｎ＝２）。αＧＣを負荷した照射ＰＢＭＣを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。ｎｓ、有意でない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＡＶＯによる。 同上。
図１０Ａ〜１０Ｇは、安全性考慮事項を実証する図である。（１０Ａ）可能性のあるＧｖＨＤおよびＨｖＧ応答および操作された安全管理戦略。（１０Ｂ）ＧｖＨＤ応答に関する試験のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ。（１０Ｃ）ＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯ細胞によりＧｖＨＤ応答が誘導されないことを示す、ＭＬＣアッセイにおけるＩＦＮ−γ産生（ｎ＝３）。３体の異なる健康なドナー由来ＰＢＭＣをレスポンダーとして含めた。（１０Ｄ）ＨｖＧ応答に関する試験のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ。（１０Ｅ）ＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯ細胞に対する軽微なＨｖＧ応答を示す、ＭＬＣアッセイにおけるＩＦＮ−γ産生（ｎ＝３）。２体の異なる健康なドナー由来ＰＢＭＣをこの実験に使用した。（１０Ｆ）ＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ混合ＮＫ／ｉＮＫＴ培養下でミスマッチドナーＮＫ細胞による殺滅に対して抵抗性であった。（１０Ｇ）ＧｖＨＤ応答およびＨｖＤ応答を試験するためのｉｎ ｖｉｖｏ混合リンパ球養子移入（ＭＬＴ）アッセイ。ｎｓ、有意でない、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＡＶＯによる。 同上。
図１１Ａ〜１１Ｇは、併用療法の例を実証する図である。（１１Ａ）ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞療法とチェックポイント遮断療法の組合せを試験するための実験設計。（１１Ｂ）ＵＨＳＣＣＡＲ−ｉＮＫＴ細胞。（１１Ｃ）Ａ３７５−ｈＣＤ１ｄ−ｈＣＤ１９−ＦＧヒト黒色腫細胞株。（１１Ｄ）ＵＨＳＣＣＡＲ−ｉＮＫＴ細胞の抗腫瘍有効性を試験するための実験設計。（１１Ｅ）ＵＨＳＣＴＣＲ−ｉＮＫＴ細胞。（１１Ｆ）Ａ３７５−ｈＣＤ１ｄ−Ａ２／ＥＳＯ−ＦＧヒト黒色腫細胞株。（１１Ｇ）ＵＨＳＣＴＣＲ−ｉＮＫＴ細胞の抗腫瘍有効性を試験するための実験設計。
図１２は、薬物動態学／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）試験の例を示す図である。
図１３は、ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫレンチウイルスベクターの一例を示す図である。
図１４は、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を作製するための細胞製造プロセスの一例を示す図である。
図１５は、ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性を示す図である。ＮＫ活性化受容体（ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１）および阻害性受容体（ＫＩＲ）の表面染色、ならびに細胞傷害性分子（パーフォリンおよびグランザイムＢ）の細胞内染色を示す代表的なＦＡＣＳプロットが提示されている。健康なヒトドナーの末梢血から単離されたネイティブなＮＫ細胞（ＰＢＭＣ−ＮＫ細胞）を対照として含めた。
図１６Ａ〜Ｇは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性およびＭＯＡ試験について示す図である。（Ａ）ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞によるＮＫ細胞様腫瘍細胞殺滅を試験するための実験設計。本試験では多数のヒト腫瘍細胞株を使用し、ルシフェラーゼ活性アッセイを使用した腫瘍殺滅の高感度測定を可能にするためにホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）および高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）二重レポーターを過剰発現するように操作した。Ａ３７５−ＦＧ、操作されたヒト黒色腫腫瘍細胞株；Ｋ５６２−ＦＧ、操作されたヒト慢性骨髄性白血病細胞株；ＭＭ．１Ｓ−ＦＧ、操作されたヒト多発性骨髄腫細胞株；Ｈ２９２−ＦＧ、操作されたヒト肺がん細胞株；ＰＣ３−ＦＧ、操作されたヒト前立腺がん細胞株。（Ｂ〜Ｆ）ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける新鮮なまたは凍結／解凍したＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞による種々のヒト腫瘍細胞の殺滅のルシフェラーゼ活性による分析。新鮮なまたは凍結／解凍したＰＢＭＣ−ＮＫ細胞を対照として含めた。（Ｇ）ＮＫＧ２Ｄまたは／およびＤＮＡＭ−１遮断抗体の存在下でのＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞による腫瘍細胞殺滅有効性のルシフェラーゼ活性による分析。２つの実験の代表。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ｎｓ、有意でない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置のＡＮＯＶＡによる。 同上。 同上。 同上。
図１７Ａ〜Ｄは、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験である。（Ａ）実験設計。（Ｂ）経時的な全身発光（ＴＢＬ）の定量（ｎ＝５）。（Ｃ）経時的な腫瘍サイズの測定値（ｎ＝５）。（Ｄ）２６日目の腫瘍重量の測定値（ｎ＝５）。２つの実験の代表。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ｎｓ、有意でない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定による。
Ｉ．定義の例
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは複数を意味し得る。請求項（複数可）で使用され、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と併せて使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語は、１つまたは１つよりも多くを意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも第２のまたはそれよりも多くを意味し得る。特定の実施形態では、本発明の態様は、例えば、本発明の１つまたは複数の配列「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」ものであり得る。本発明の一部の実施形態は、本発明の１つまたは複数の要素、方法のステップ、および／または方法からなり得るまたはそれから本質的になり得る。本明細書に記載の任意の方法または組成物を本明細書に記載の任意の他の方法または組成物と関連させて実行することができることが意図されている。
本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）（ＨＰＣ）から操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞である「ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞」、およびそれらを作出し、使用する方法を包含する。本明細書で使用される場合、「ＨＳＣ」は、ＨＳＣ、ＨＰＣ、またはＨＳＣとＨＰＣの両方を指すために使用される。
「治療有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、処置される疾患または状態の少なくとも１つの症状または徴候を緩和する、好転させる、または防止するために有効な量を指す。
「外因性ＴＣＲ」という用語は、細胞に移入された（すなわち、遺伝子移入／形質導入／トランスフェクション技法によって）ＴＣＲ遺伝子もしくはＴＣＲ遺伝子誘導体を指す、またはＴＣＲ遺伝子もしくは遺伝子誘導体の移入を受けた細胞の後代である。外因性ＴＣＲ遺伝子はレシピエント細胞のゲノムに挿入される。一部の実施形態では、挿入は、ランダムな挿入である。ＴＣＲ遺伝子のランダムな挿入は、当技術分野で公知の方法によって容易に実現される。一部の実施形態では、ＴＣＲ遺伝子は内因性遺伝子座（例えば、内因性ＴＣＲ遺伝子遺伝子座）に挿入される。一部の実施形態では、細胞は、内因性遺伝子座ではない遺伝子座に挿入された１つまたは複数のＴＣＲ遺伝子を含む。一部の実施形態では、細胞は、マーカーまたは耐性遺伝子などの異種配列をさらに含む。
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞に任意の特異性を移植する（graft）操作された受容体を指す。これらの受容体を使用して、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植する。それらのコード配列の移入はレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターによって容易になる。この受容体は、異なる供給源に由来する部分で構成されるので、キメラと称される。これらの分子の最も一般的な形態は、ＣＤ３−ゼータ膜貫通およびエンドドメイン；ＣＤ２８または４１ＢＢ細胞内ドメイン、またはこれらの組合せと融合した、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合物である。そのような分子は、ｓｃＦｖによるその標的の認識に応答してシグナルの伝達をもたらす。そのような構築物の例は、１４ｇ２ａ−ゼータであり、これは、ハイブリドーマ１４ｇ２ａに由来するｓｃＦｖの融合物である（ジシアロガングリオシドＧＤ２を認識する）。Ｔ細胞がこの分子を発現すると（例として、オンコレトロウイルスベクター形質導入により実現される）、ＧＤ２を発現する標的細胞（例えば、神経芽細胞腫細胞）を認識し、死滅させる。悪性Ｂ細胞を標的とするために、研究者らは、Ｂ系列分子であるＣＤ１９に特異的なキメラ免疫受容体を使用してＴ細胞の特異性を向け直した。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変部分を柔軟なリンカーによって融合して、ｓｃＦｖを形成する。このｓｃＦｖ前にシグナルペプチドがあり、新生タンパク質を小胞体およびその後の表面発現へと向ける（これは切断される）。柔軟なスペーサーにより、ｓｃＦｖが様々な方向に向くことができ抗原結合が可能になる。膜貫通ドメインは、通常、細胞内に突出し、所望のシグナルを伝達するシグナル伝達エンドドメインの元の分子に由来する典型的な疎水性アルファヘリックスである。
「抗原」という用語は、それに対する抗体を免疫系に産生させる、またはＴ細胞が応答する任意の物質を指す。一部の実施形態では、抗原は、５〜５０アミノ酸の長さ、または少なくとも、最大で、またはちょうど５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、または３００アミノ酸、またはその中で導き出せる任意の範囲の長さのペプチドである。
「レシピエントに対して同種異系」という用語は、レシピエントから単離されたものではない細胞を指すものとする。一部の実施形態では、細胞は、患者から単離されたものではない。一部の実施形態では、細胞は、遺伝学的にマッチする個体（例えば、遺伝子型が適合する親族など）から単離されたものではない。
「不活性な」という用語は、望ましくない臨床的毒性をもたらさないものを指す。これは、オンターゲットの毒性またはオフターゲットの毒性のいずれかであり得る。「不活性」は、既知のまたは予測される臨床的安全性データに基づく。
「ゼノフリー（ＸＦ）」または「動物成分フリー（ＡＣＦ）」または「動物フリー」という用語は、培地、細胞外マトリックス、または培養条件に関して使用される場合、異種動物由来成分を本質的に含まない培地、細胞外マトリックス、または培養条件を指す。ヒト細胞の培養に関しては、マウスなどの非ヒト動物のあらゆるタンパク質がゼノ成分になる。ある特定の態様では、ゼノフリーマトリックスは、あらゆる非ヒト動物由来成分を本質的に含まず、したがって、マウスフィーダー細胞またはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）が排除されたものであり得る。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、細胞外マトリックスタンパク質に富む腫瘍であるＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出され、ラミニン（主要な成分）、ＩＶ型コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン／ニドゲンを含む、可溶化された基底膜調製物である。
「規定の（ｄｅｆｉｎｅｄ）」という用語は、培地、細胞外マトリックス、または培養条件に関して使用される場合、ほぼ全ての成分の性質および量が分かっている培地、細胞外マトリックス、または培養条件を指す。
「既知組成培地」は、ほぼ全ての成分の化学的性質およびそれらの量が分かっている培地を指す。これらの培地は、合成培地とも称される。既知組成培地の例としては、ＴｅＳＲ（商標）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、細胞は、血清、シグナル伝達阻害因子、動物成分またはフィーダー細胞、外因性遺伝子エレメントまたはベクターエレメントなどのある特定の試薬またはエレメントを、その細胞が１０％未満のエレメント（複数可）を有する場合、「実質的に含まない」、また、ある特定の試薬またはエレメントを、その細胞が１％未満のエレメント（複数可）を有する場合、「本質的に含まない」。しかし、総細胞集団の０．５％未満または０．１％未満が外因性遺伝子エレメントまたはベクターエレメントを含む細胞集団がさらにいっそう望ましい。
培養物、マトリックスまたは培地は、血清、シグナル伝達阻害因子、動物成分またはフィーダー細胞などのある特定の試薬またはエレメントを、培養物、マトリックスもしくは培地それぞれにおけるこれらの試薬のレベルが当業者に公知の従来の検出方法を使用して検出可能なレベル未満である、またはこれらの作用物質（agent）が培養物、マトリックスまたは培地に外部から添加されていない場合に、「本質的に含まない」。無血清培地は、血清を本質的に含まないものであり得る。
「末梢血液細胞」は、血液の循環プール内に見いだされる赤血球、白血球、および血小板を含めた血液の細胞成分を指す。
「造血幹細胞・前駆細胞」または「造血前駆体細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）」は、造血系列に拘束されるが、さらに造血分化することができる細胞を指し、造血幹細胞、多分化能造血幹細胞（血球芽細胞）、骨髄系前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、およびリンパ系前駆細胞を含む。「造血幹細胞（ＨＳＣ）」は、骨髄系（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系列（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含めた全ての血液細胞型を生じさせる多分化能幹細胞である。本開示では、ＨＳＣは、「造血幹細胞・前駆細胞」および「造血前駆体細胞」の両方を指す。
造血幹細胞・前駆細胞は、ＣＤ３４を発現するものまたは発現しないものであり得る。造血幹細胞は、ＣＤ１３３を共発現し、ＣＤ３８発現については陰性である、ＣＤ９０については陽性である、ＣＤ４５ＲＡについては陰性である、系列マーカーについては陰性である、またはこれらの組合せであり得る。造血前駆細胞／前駆体細胞としては、ＣＤ３４（＋）／ＣＤ３８（＋）細胞およびＣＤ３４（＋）／ＣＤ４５ＲＡ（＋）／ｌｉｎ（−）ＣＤ１０＋（リンパ系共通前駆細胞）、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ｌｉｎ（−）ＣＤ１０（−）ＣＤ６２Ｌ（ｈｉ）（リンパ系刺激多分化能前駆細胞）、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ｌｉｎ（−）ＣＤ１０（−）ＣＤ１２３＋（顆粒球−単球前駆細胞）、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（−）ｌｉｎ（−）ＣＤ１０（−）ＣＤ１２３＋（骨髄系共通前駆細胞）、またはＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（−）ｌｉｎ（−）ＣＤ１０（−）ＣＤ１２３−（巨核球−赤血球前駆細胞）が挙げられる。
「ベクター」または「構築物」（時には遺伝子送達または遺伝子移入「ビヒクル」と称される）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子、分子の複合体、またはウイルス粒子を指す。ポリヌクレオチドは、直鎖状分子または環状分子であり得る。
「プラスミド」は、ベクターの一般的な型であり、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体ＤＮＡと分離された（separate from）染色体外ＤＮＡ分子である。ある特定の場合では、プラスミドは環状の二本鎖である。
「発現構築物」または「発現カセット」は、転写を方向付けることができる核酸分子を意味する。発現構築物は、最小で、プロモーターと機能的に等価のプロモーターまたは構造を含む。エンハンサー、および／または転写終結シグナルなどの追加的なエレメントも含めることができる。
「外因性」という用語は、細胞もしくは生物体におけるタンパク質、遺伝子、核酸、もしくはポリヌクレオチドに関して使用される場合、細胞もしくは生物体に人工的手段によって導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、もしくはポリヌクレオチドを指す、または細胞に関して使用される場合、単離され、その後、他の細胞もしくは生物体に人工的手段によって導入された細胞を指す。外因性核酸は、異なる生物体または細胞に由来するものであってもよく、生物体または細胞内に天然に存在する核酸の１つまたは複数の追加的なコピーであってもよい。外因性細胞は、異なる生物体に由来するものであってもよく、同じ生物体に由来するものであってもよい。非限定的な例として、外因性核酸は、天然の細胞の染色体内の位置とは異なる染色体内の位置に存在する、または、そうでなければ、天然に見いだされるものとは異なる核酸配列に挟まれている。
「に対応する」という用語は、本明細書では、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同である（すなわち、同一である、厳密には進化的に関連しない）こと、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するために使用される。対照的に、「と相補的」という用語は、本明細書では、相補配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同であることを意味するために使用される。例示として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。
特定のタンパク質を「コード」する「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」、または「導入遺伝子」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて転写され、必要に応じて遺伝子産物、例えばポリペプチドへの翻訳もなされる核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ形態のいずれかで存在し得る。ＤＮＡ形態で存在する場合、核酸分子は、一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であり得る。コード領域の境界は５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子は、これだけに限定されないが、原核生物または真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含み得る。転写終結配列は、通常、遺伝子配列の３’側に位置する。
「細胞」という用語は、本明細書では当技術分野におけるその最も広範な意味で使用され、多細胞生物体の組織の構造単位であり、膜構造で囲まれて外部から隔離されており、自己複製する能力を有し、発現するための遺伝情報および機序を有する、生きている本体を指す。細胞は、本明細書で使用される場合、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であり得る。
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、自己複製することができ、多能性または多分化能である細胞を指す。一般には、幹細胞は、傷害を受けた組織を再生させることができる。本明細書における幹細胞は、これだけに限定されないが、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹細胞または組織幹細胞（組織特異的幹細胞、または体性幹細胞とも称される）であり得る。
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期胚に由来する多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、１９８１年に最初に確立され、１９８９年からノックアウトマウスの作製にも適用されている。１９９８年にはヒトＥＳ細胞が確立され、これは現在再生医療に利用可能になりつつある。
ＥＳ細胞とは異なり、組織幹細胞は、限定された分化潜在性を有する。組織幹細胞は、組織内の特定の位置に存在し、未分化の細胞内構造を有する。したがって、組織幹細胞の多能性は、一般には低い。組織幹細胞の核／細胞質比は高く、細胞内細胞小器官が少ない。大多数の組織幹細胞は、低多能性、長い細胞周期、および個体の生涯を超える増殖能を有する。組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系など、細胞が由来する部位に基づいてカテゴリーに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛包幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵臓（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
「人工多能性幹細胞」は、一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと省略され、非多能性細胞、一般には成体体細胞、または最終分化細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞などから、再プログラミング因子と称されるある特定の因子を導入することによって人工的に調製された多能性幹細胞の一種を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された」は、例えば、細胞および／または核酸に関しては、天然の状態から人為的な介入によって変更されたまたは取り出されたことを意味する。
「多能性」は、１つまたは複数の組織または器官、または特に、３つの胚葉：内胚葉（胃の内層、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（表皮組織および神経系）のいずれかを構成する全ての細胞に分化する潜在性を有する幹細胞を指す。本明細書で使用される「多能性幹細胞」は、３つの胚葉のいずれかの細胞に分化することができる細胞、例えば、全能性細胞または人工多能性細胞の直接の後裔を指す。
核酸分子を参照して「作動可能に連結した」とは、２つまたはそれよりも多くの核酸分子（例えば、転写される核酸分子、プロモーター、およびエンハンサーエレメント）が、核酸分子の転写が可能になるように接続していることを意味する。ペプチドおよび／またはポリペプチド分子を参照して「作動可能に連結した」とは、２つまたはそれよりも多くのペプチドおよび／またはポリペプチド分子が、単一のポリペプチド鎖、すなわち、融合物の各ペプチドおよび／またはポリペプチド成分の少なくとも１つの特性を有する融合ポリペプチドがもたらされるように接続していることを意味する。融合ポリペプチドは、特に、キメラである、すなわち、異種分子で構成される。
本開示の実施形態は、ＮＫＴ細胞Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有し、イメージングおよび自殺標的化能も有し、宿主免疫細胞による標的化枯渇に対して抵抗性であるｉＮＫＴ細胞として機能するように操作されたＨＳＣ細胞に関する。そのような細胞は、ＴＣＲで操作されたＨＳＣからクローンＴ細胞への高効率および高収量での分化を支持する人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系において生成される。
ＩＩ．普遍的な造血幹細胞（ＨＳＣ）の操作によるインバリアントＮＫＴ細胞（ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞）
本開示の実施形態では、インバリアントＮＫＴ細胞として機能するように改変された細胞が、細胞のレシピエントにおける有害な免疫反応を伴わない普遍的使用（元の細胞を得た個体以外の個体への使用）に適するものになるような１つまたは複数の特徴を有するように操作された細胞（例えば、ＨＳＣなど）を利用する。本開示は、ｉ）ｉＮＫＴアルファＴ細胞受容体遺伝子の全部または一部；ｉｉ）ｉＮＫＴベータＴ細胞受容体遺伝子の全部または一部、およびｉｉｉ）自殺遺伝子を含む核酸を含む操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、細胞のゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｉ分子またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を排除するように変更されている、操作されたｉＮＫＴ細胞を包含する。
Ａ．ｉＮＫＴ細胞
特定の実施形態では、本開示の操作されたｉＮＫＴ細胞は、他の型の細胞から、それらのｉＮＫＴ細胞としての活性が促進されるように作製される。ｉＮＫＴ細胞は、それらを、少なくともがん治療を含め、既製の細胞療法に関して有用なものにするいくつかの独特の特色を有するαβＴリンパ球の小さな亜集団である。ｉＮＫＴ細胞には以下の利点があるので、非ｉＮＫＴ細胞をｉＮＫＴ細胞として機能するように操作する：
１）ｉＮＫＴ細胞は、腫瘍抗原による制限およびＭＨＣによる制限とは無関係に多数の型のがんを標的とする注目すべき能力を有する（Fujii et al., 2013）。ｉＮＫＴ細胞は、非多形的ＣＤ１ｄによって提示される糖脂質抗原を認識し、したがってＭＨＣによる制限の下にない。ｉＮＫＴ細胞の天然のリガンドはまだ同定されていないが、ｉＮＫＴ細胞は多くの腫瘍組織に由来するある特定の保存された糖脂質抗原を認識し得ることが示唆されている。ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ＋腫瘍細胞によって直接提示されるか、または、ＣＤ１ｄ−腫瘍の場合にはマクロファージもしくは樹状細胞（ＤＣ）などの腫瘍浸潤性抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって間接的に交差提示されるこれらの糖脂質抗原を認識することによって刺激され得る。したがって、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ＋腫瘍およびＣＤ１ｄ−腫瘍のどちらにも応答し得る。
２）ｉＮＫＴ細胞は、腫瘍細胞を攻撃するために多数の機序を使用することができる（Vivier et al., 2012；Fujii et al., 2013）。ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ＋腫瘍細胞を細胞傷害性によって直接死滅させることができるが、それらの最も強力な抗腫瘍活性は、それらの免疫アジュバント効果に由来する。ｉＮＫＴ細胞は、刺激前は静止したままであるが、刺激後には、すぐに大量のサイトカイン、主にＩＦＮ−γを産生する。ＩＦＮ−γによりＮＫ細胞が活性化されて、ＭＨＣ陰性腫瘍標的細胞を死滅させる。その間に、ｉＮＫＴ細胞はＤＣも活性化し、次いでこれがＣＴＬを刺激して、ＭＨＣ陽性腫瘍標的細胞を死滅させる。したがって、ｉＮＫＴ細胞により誘導される抗腫瘍免疫は、腫瘍抗原による制限およびＭＨＣによる制限とは無関係に多数の型のがんを有効に標的とし、それにより、腫瘍の免疫エスケープを有効に遮断し、腫瘍再燃の機会を最小化することができる。
３）ｉＮＫＴ細胞は移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさない。ｉＮＫＴ細胞はミスマッチＭＨＣ分子およびタンパク質自己抗原を認識しないので、これらの細胞によりＧｖＨＤは引き起こされないと予測される。この概念は、同種異系骨髄または末梢血幹細胞移植を受けた血液がん患者におけるドナー由来ｉＮＫＴ細胞を分析した臨床データによって強力に裏付けられる。これらの臨床データから、患者における生着した同種異系ｉＮＫＴ細胞のレベルが移植片対白血病効果と正に相関し、ＧｖＨＤと負に相関したことが示された（Haraguchi et al., 2004；de Lalla et al., 2011）。
４）ｉＮＫＴ細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）枯渇が回避されるように操作することができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系などの強力な遺伝子編集ツールの利用可能性により、ｉＮＫＴ細胞を遺伝子改変して、それらを宿主免疫細胞による標的化枯渇に対して抵抗性にすることが可能である：ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子のノックアウトにより、ｉＮＫＴ細胞におけるＨＬＡ−Ｉ分子の発現が除去されて、宿主ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性殺滅が回避される；ＣＩＩＴＡ遺伝子のノックアウトにより、ｉＮＫＴ細胞におけるＨＬＡ−ＩＩ分子の発現が除去されて、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性殺滅が回避される。Ｂ２Ｍ遺伝子およびＣＩＩＴＡ遺伝子はどちらもヒト初代細胞におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に関して定評のある良好な標的である（Ren et al., 2017；Abrahimi et al., 2015）。ｉＮＫＴ細胞におけるＨＬＡ−Ｉ発現の除去により、ｉＮＫＴ細胞が宿主ＮＫ細胞の標的となり得る。しかし、ｉＮＫＴ細胞は、同種異系ＮＫ細胞殺滅に対して天然に抵抗性を有するようである。それでもなお、必要であれば、この懸念には、ｉＮＫＴ細胞にＨＬＡ−ＥなどのＮＫ阻害性遺伝子を送達することによって対処することができる。
５）ｉＮＫＴ細胞は、がんとの強力な関連性を有する。ｉＮＫＴ細胞の欠陥によりがんにかかりやすくなり、また、ｉＮＫＴ細胞の養子移入または刺激によりがんに対する保護をもたらすことができるというマウスにおける腫瘍サーベイランスに関するｉＮＫＴ細胞の重要な役割を示唆する説得力のあるエビデンスが存在する（Vivier et al., 2012；Berzins et al., 2011）。ヒトでは、ｉＮＫＴ細胞の発生頻度は固形腫瘍（黒色腫、結腸がん、肺がん、乳がん、および頭頸部がんを含む）ならびに血液がん（白血病、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群を含む）を有する患者において減少しており、一方、ｉＮＫＴ細胞数の増加は、予後がより良好であることに関連付けられる（Berzins et al., 2011）。肺がんの患者および頭頸部がんの患者において、α−ＧａｌＣｅｒが負荷されたＤＣおよびｅｘ ｖｉｖｏで増大させた自己ｉＮＫＴ細胞の投与により、有望な臨床的有用性が導かれた例も存在するが、ｉＮＫＴ細胞の増加は一過性であり、臨床的有用性は短期のものであった。これは、移入には限られた数のｉＮＫＴ細胞が使用されたこと、およびこれらの細胞がその後枯渇したことに起因する可能性がある（Fujii et al., 2012；Yamasaki et al., 2011）。したがって、患者に十分なｉＮＫＴ細胞を複数回用量で移入することを可能にする「既製の」ｉＮＫＴ細胞製品により、患者に、疾患と闘うためにｉＮＫＴ細胞の最大限の潜在性を活用する最良の機会を提供することを提唱することが妥当である。
しかし、同種異系既製ｉＮＫＴ細胞製品の開発は、それらの利用可能性によって著しく妨げられるのであり、これらの細胞は、ヒトにおいて非常に少数であり、変動性が高く（ヒト血液中に約０．００１〜１％）、それにより、同種異系ヒトドナーの血液細胞から治療用の数のｉＮＫＴ細胞を成長させることが非常に難しい。したがって、ｉＮＫＴ細胞の均一な集団を大きな数量で確実に生成することができる新規の方法が、既製ｉＮＫＴ細胞療法の開発の鍵である。
この臨床的適用のために十分な量のｉＮＫＴ細胞が欠如していることを考慮して、本開示の実施形態は、得られた操作された細胞がｉＮＫＴ細胞として機能するように非ｉＮＫＴ細胞を操作することを包含する。特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞として機能する細胞を、１つまたは複数の所望の特徴を有するようにさらに改変する。特定の実施形態では、ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように非ｉＮＫＴ細胞に形質導入することによって非ｉＮＫＴ細胞を遺伝子改変する。
Ｂ．ＨＳＣ細胞から作製されたｉＮＫＴ細胞
本開示の複数の実施形態では、他の型の細胞から作製されたｉＮＫＴ細胞を、普遍的使用に適するものになるように、１つまたは複数の特徴を有するように操作する。特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つの外因性インバリアントナチュラルキラーＴ細胞受容体（ｉＮＫＴ ＴＣＲ）核酸分子を含有するように遺伝子改変する。一部の実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、造血前駆細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒトＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、組換え細胞である。一部の実施形態では、細胞は、培養株のものである。
一部の実施形態では、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、ヒトインバリアントナチュラルキラーＴ細胞に由来する。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、ヒトｉＮＫＴ ＴＣＲから得られた１つまたは複数の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸配列は、ＣＤ４／ＤＮ／ＣＤ８サブセットまたはＴｈ１、Ｔｈ２、またはＴｈ１７サイトカインを産生し、ダブルネガティブｉＮＫＴ細胞を含むサブセットなどのｉＮＫＴ細胞の任意のサブセットから得ることができる。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸配列を、例えば、黒色腫、腎がん（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、肺がん、前立腺がん、乳がん、リンパ腫、白血病、血液悪性腫瘍などのがんを有していたまたは有するドナー由来のｉＮＫＴ細胞から得る。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、１つのｉＮＫＴ細胞由来のＴＣＲ−アルファ配列と異なるｉＮＫＴ細胞由来のＴＣＲ−ベータ配列を有する。一部の実施形態では、ＴＣＲ−アルファ配列を得るｉＮＫＴ細胞とＴＣＲ−ベータ配列を得るｉＮＫＴ細胞は、同じドナーに由来する。一部の実施形態では、ＴＣＲ−アルファ配列を得るｉＮＫＴ細胞のドナーは、ＴＣＲ−ベータ配列を得るｉＮＫＴ細胞のドナーとは異なる。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ配列および／またはＴＣＲ−ベータ配列は、発現のためにコドン最適化されたものである。一部の実施形態では、ＴＣＲ−アルファ配列および／またはＴＣＲ−ベータ配列を、改変されていない配列によってコードされるポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または短縮化（truncation）を有するポリペプチドをコードするように改変する。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、ＣＤ１ｄ上に提示されるアルファ−ガラクトシルセラミド（アルファ−ＧａｌＣｅｒ）を認識するＴ細胞受容体をコードする。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、および配列番号６４からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４７、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６２、および配列番号６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、操作された細胞は、例えばＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ、ｃ−Ｍｙｃなどの外因性癌遺伝子を欠く。
一部の実施形態では、操作された細胞は、機能的なｉＮＫＴ細胞である。一部の実施形態では、操作された細胞は、例えばＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン、ＭＩＰ−１−アルファ、ＭＩＰ−１−ベータなどの１つまたは複数のサイトカインおよび／またはケモカインを産生することができる。
ドナーＨＳＰＣは、ドナーの骨髄、末梢血、羊水、または臍帯血から得ることができる。ドナーは、自己ドナー、すなわちＨＳＰＣ−ｉＮＫＴ細胞による処置を受ける対象、または同種異系ドナー、すなわちＨＳＰＣ−ｉＮＫＴ細胞による処置を受ける対象とは異なるドナーであり得る。ドナーが同種異系ドナーである実施形態では、同種異系ドナーの組織（ＨＬＡ）型がドナーＨＳＰＣに由来するＨＳＰＣ−ｉＮＫＴ細胞による処置を受ける対象のものとマッチすることが好ましい。
本開示に従って、ＨＳＰＣに１つまたは複数の外因性ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子を形質導入する。本明細書で使用される場合、「ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子」は、ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体のアルファ鎖（ＴＣＲ−アルファ−）、ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体のベータ鎖（ＴＣＲ−ベータ）、またはその両方をコードする核酸分子である。本明細書で使用される場合、「ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体」は、ｉＮＫＴ細胞において発現され、ＣＤ１ｄ上に提示されるアルファ−ＧａｌＣｅｒを認識するものである。当技術分野における方法を使用してｉＮＫＴ ＴＣＲのＴＣＲ−アルファおよびＴＣＲ−ベータ配列をクローニングおよび／または組換え操作することができる。例えば、ｉＮＫＴ細胞をドナーから得、ｉＮＫＴ細胞のＴＣＲアルファ遺伝子およびＴＣＲベータ遺伝子を本明細書に記載の通りクローニングすることができる。クローニングされるｉＮＫＴ ＴＣＲは、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、および他の齧歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどを含めた任意の哺乳動物から得ることができる。一部の実施形態では、クローニングされるｉＮＫＴ ＴＣＲは、ヒトｉＮＫＴ ＴＣＲである。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ ＴＣＲクローンは、ヒトｉＮＫＴ ＴＣＲ配列および非ヒトｉＮＫＴ ＴＣＲ配列を含む。
一部の実施形態では、クローニングされたＴＣＲは、１つのｉＮＫＴ細胞由来のＴＣＲ−アルファ鎖および異なるｉＮＫＴ細胞由来のＴＣＲ−ベータ鎖を有し得る。一部の実施形態では、ＴＣＲ−アルファ鎖を得るｉＮＫＴ細胞とＴＣＲ−ベータ鎖を得るｉＮＫＴ細胞は同じドナーに由来する。一部の実施形態では、ＴＣＲ−アルファ鎖を得るｉＮＫＴ細胞のドナーは、ＴＣＲ−ベータ鎖を得るｉＮＫＴ細胞のドナーとは異なる。一部の実施形態では、ＴＣＲ−アルファ鎖をコードする配列および／またはＴＣＲクローンのＴＣＲ−ベータ鎖をコードする配列を改変する。一部の実施形態では、改変された配列は、改変されていないＴＣＲクローンと同じポリペプチド配列をコードし得、例えば、配列は、発現のためにコドン最適化される。一部の実施形態では、改変された配列は、改変されていないＴＣＲクローンとは異なる配列を有するポリペプチドをコードし得、例えば、改変された配列は、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または短縮化を有するポリペプチド配列をコードする。
Ｃ．イメージングおよび枯渇特性を有するＨＬＡ陰性ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞
特定の実施形態では、ＨＳＰＣ細胞から作製されたｉＮＫＴ細胞を、細胞を同種異系使用に適するものにする、または細胞が１つもしくは複数の特徴を有するようにさらに改変されていない場合よりも同種異系使用に適するようにすることを含め、１つまたは複数の特徴を有するようにさらに改変する。本開示は、所望であれば、同種異系使用に適したＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を包含する。一部の実施形態では、ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、非アロ反応性であり、外因性ｉＮＴＫ ＴＣＲを発現する。これらの細胞は、「既製」細胞療法に有用であり、患者の独自のｉＮＫＴおよび他の細胞の使用を必要としない。したがって、本方法は、より費用効果が大きく、労働集約性がより低い細胞免疫療法を提供する。
特定の実施形態では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こすことなく、また宿主免疫細胞に拒絶されること（ＨｖＧ拒絶反応）なく安全かつ上首尾の同種異系生着を実現するために、ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を、ＨＬＡ陰性になるように操作する。特定の実施形態では、トランスジェニックｉＮＫＴ ＴＣＲ遺伝子の発現により対立遺伝子排除による内因性ＴＣＲの組換えが遮断されるので、同種異系ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、ＧｖＨＤを引き起こさない。特定の実施形態では、同種異系ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、細胞表面上にＨＬＡ−Ｉ分子および／またはＨＬＡ−ＩＩ分子を発現せず、宿主ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性同種異系移植片枯渇およびｓｒ３９ＴＫ免疫原標的化枯渇に抵抗する。
したがって、ある特定の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、表面ＨＬＡ−Ｉ分子および表面ＨＬＡ−ＩＩ分子を発現せず、これは、これだけに限定されないが、ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合性遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、またはＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ分子を含めたＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ発現に関連するタンパク質をコードする遺伝子を破壊することによって実現される。一部の場合では、ｉＮＫＴ細胞が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が関与してもしなくてもよい遺伝子編集によって操作されたことに起因して、その表面上にＨＬＡ−ＩまたはＨＬＡ−ＩＩが発現されない。
ｉＮＫＴ細胞が任意の種類の１つまたは複数の特徴を示すように改変されている場合では、ｉＮＫＴ細胞は、細胞に導入された組換えベクター由来の核酸配列を含み得る。ベクターは、プラスミドなどの非ウイルスベクター、またはレンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、もしくはアデノウイルスなどのウイルスベクターであり得る。
本開示のｉＮＫＴ細胞は、それらの作製前、作製中、または作製後に１つまたは複数のある特定の条件に曝露されたものであっても曝露されなかったものであってもよい。特定の場合では、細胞は、動物血清を含む培地に曝露されていないまたは曝露されなかった。細胞を凍結することができる。細胞は、デキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、および／またはＤＭＳＯを含む溶液中に存在し得る。細胞が存在する溶液はいずれも無菌性、非発熱性、かつ等張性の溶液であり得る。細胞は、例えばアルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）による活性化などの任意の適切な様式によって活性化および増大したものであってよい。
本開示の態様は、β２ミクログロブリン（microglobin）（Ｂ２Ｍ）、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２のうちの１つまたは複数のｉ）外因性発現もしくは活性阻害因子；またはｉｉ）ゲノム変異を含むヒト細胞に関する。一部の実施形態では、細胞は、ゲノム変異を含む。一部の実施形態では、ゲノム変異は、細胞のゲノム内の１つまたは複数の内因性遺伝子の変異を含み、１つまたは複数の内因性遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２遺伝子を含む。一部の実施形態では、変異は、機能喪失変異を含む。一部の実施形態では、阻害因子は、発現阻害因子である。一部の実施形態では、阻害因子は、阻害性核酸を含む。一部の実施形態では、阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンス分子のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、細胞は、活性阻害因子を含む。一部の実施形態では、改変後、細胞は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２タンパク質のうちの１つまたは複数のあらゆる検出可能な発現が欠損している。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍの阻害因子またはゲノム変異を含む。一部の実施形態では、細胞は、ＣＩＩＴＡの阻害因子またはゲノム変異を含む。一部の実施形態では、細胞は、ＴＲＡＣの阻害因子またはゲノム変異を含む。一部の実施形態では、細胞は、ＴＲＢＣ１の阻害因子またはゲノム変異を含む。一部の実施形態では、細胞は、ＴＲＢＣ２の阻害因子またはゲノム変異を含む。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、および／またはＴＲＢＣ２をコードするゲノムＤＮＡの少なくとも９０％が欠失している。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、および／またはＴＲＢＣ２をコードするゲノムＤＮＡの少なくともまたは最大で５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％（またはその中で導き出せる任意の範囲）が欠失している。他の実施形態では、欠失、挿入、および／または置換は、ゲノムＤＮＡ内になされる。一部の実施形態では、細胞は、ヒト幹細胞または前駆細胞の後代である。
ＨＬＡ陰性になるように改変されるＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、任意の適切な様式で遺伝子改変することができる。ＣＩＩＴＡおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子におけるものなどの本開示の遺伝子変異を当技術分野で公知の方法によって導入することができる。ある特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼを使用して、本明細書で言及される任意の細胞の遺伝子改変のための外因性核酸配列を導入することができる。ゲノム編集、または操作されたヌクレアーゼによるゲノム編集（ＧＥＥＮ）は、人工的に操作されたヌクレアーゼ、または「分子はさみ」を使用してＤＮＡをゲノムに挿入する、ゲノム内で置き換える、またはゲノムから除去する遺伝子操作の一種である。ヌクレアーゼによりゲノム内の所望の位置に特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出し、細胞の内因性機序を利用して、誘導された切断を相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然のプロセスによって修復する。非限定的な操作されたヌクレアーゼとして、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、および操作されたメガヌクレアーゼから再度操作されたホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。当技術分野で公知の操作されたヌクレアーゼのいずれも、方法および組成物のある特定の態様に使用することができる。
操作されたｉＮＫＴ細胞は、ＲＮＡ干渉を使用する方法を使用して改変することができる。これは、遺伝子の機能またはタンパク質機能を理解し、それに配列特異的に干渉し、生物体に対するその効果をモニタリングするための遺伝子解析において一般に実施される。しかし、一部の生物体では、部位特異的変異誘発を実施することが難しいかまたは不可能であり、したがって、低分子ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）による目的の遺伝子のサイレンシングなどのより間接的な方法を使用しなければならない。しかし、ｓｉＲＮＡによる遺伝子破壊は、可変かつ不完全であり得る。ＺＦＮなどのヌクレアーゼによるゲノム編集は、操作されたヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を改変することができ、したがって、原理上はゲノム内の任意の標的化位置を切断し、従来のＲＮＡｉでは特異的に標的とすることが不可能である遺伝子に対して内因性配列の改変を導入することができるという点で、ｓｉＲＮＡとは異なる。さらに、２つのＺＦＮが、それらの標的部分の認識に必要であり、その後、隣接する配列への方向付けをもたらすので、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの特異性が増強される。
メガヌクレアーゼを使用して、操作されたｉＮＫＴ細胞を改変することができる。メガヌクレアーゼは、一般に微生物種において見いだされ、非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有し、したがって、天然に非常に特異的なものになるという独特の特性を有する。これを活用して、ゲノム編集において部位特異的ＤＳＢを行うことができる。しかし、全ての可能性のある標的配列を網羅する十分なメガヌクレアーゼが公知ではない、またはいつになっても公知とならない可能性があるという難題がある。この難題を克服するために、変異誘発およびハイスループットスクリーニング方法を使用して、独特の配列を認識するメガヌクレアーゼバリアントが作り出されてきた。他者は、種々のメガヌクレアーゼを融合し、新しい配列を認識するハイブリッド酵素を作り出すことができた。さらに他者は、合理的に設計されたメガヌクレアーゼと称される方法においてＤＮＡと相互作用するメガヌクレアーゼのアミノ酸を変更して、配列特異的メガヌクレアーゼを設計しようとした（米国特許第８，０２１，８６７号、参照により本明細書に組み込まれる）。メガヌクレアーゼには、おそらくＤＮＡ配列認識がよりストリンジェントであることに起因して、細胞において引き起こされる毒性がＺＦＮなどの方法と比較して低いという利点がある。しかし、全ての可能性のある配列に対する配列特異的酵素の構築には、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮなどの方法で利用されるコンビナトリアル可能性の利益が得られないので、費用および時間がかかる。したがって、利点と不都合の両方が存在する。
メガヌクレアーゼとは対照的に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの背景にある概念は、さらにジンクフィンガーおよび転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）などの、特異的なＤＮＡ配列を認識するペプチドと連結される非特異的ＤＮＡ切断酵素に大きく基づく。１つのやり方は、制限酵素の間では一般的でない状況である、ＤＮＡ認識部位と切断部位が互いに分離されているエンドヌクレアーゼを見いだすことであった。この酵素が見いだされたら、認識能を有さないことから非常に非特異的である切断部分を分離することができる。次いで、この部分を、非常に高い特異性をもたらすことができる、配列を認識するペプチドに連結することができる。そのような特性を有する制限酵素の例は、ＦｏｋＩである。さらに、ＦｏｋＩは、ヌクレアーゼ活性を有するには二量体化を必要とするという利点を有し、これは、各ヌクレアーゼパートナーが独特のＤＮＡ配列を認識するので、特異性が劇的に増加することを意味する。この効果を増強するために、ヘテロ二量体としてのみ機能し、触媒活性が増加したＦｏｋＩヌクレアーゼが操作されている。ヘテロ二量体で機能するヌクレアーゼでは、望ましくないホモ二量体活性の可能性が回避され、したがって、ＤＳＢの特異性が増加する。
ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮのどちらのヌクレアーゼ部分も同様の特性を有するが、これらの操作されたヌクレアーゼの差異は、それらのＤＮＡ認識ペプチドである。ＺＦＮは、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーに依拠し、ＴＡＬＥＮはＴＡＬＥに依拠する。これらのＤＮＡ認識ペプチドドメインはどちらも、それらのタンパク質において組合せで天然に見いだされるという特徴を有する。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、一般には、３ｂｐ離れた反復として存在し、転写因子などの種々の核酸相互作用タンパク質において多様な組合せで見いだされる。他方でＴＡＬＥはアミノ酸と認識されるヌクレオチド対との間の認識比が１対１である反復として見いだされる。ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥはどちらも反復パターンとして存在し、多種多様な配列特異性を作り出すために異なる組合せを試みることができる。ジンクフィンガーは、これらの点ではより確立されており、他の方法としては、モジュラーアセンブリ（トリプレット配列と相関するジンクフィンガーを連続的に付着させて必要な配列を網羅する）、ＯＰＥＮ（ペプチドドメイン対トリプレットヌクレオチドの低ストリンジェンシー選択、その後、ペプチドの組合せ対細菌系における最終的な標的の高ストリンジェンシー選択）、およびジンクフィンガーライブラリーの細菌１ハイブリッドスクリーニングなどの手法が、部位特異的ヌクレアーゼを作出するために使用されてきた。
したがって、本開示の実施形態は、１つまたは複数のある特定の内因性配列の発現を低減またはノックアウトするために内因性配列を標的化することを含んでもよいし、含まなくてもよい。特定の実施形態では、以下の遺伝子の１つまたは複数を破壊することにより、内因性ＴＣＲの再編成を遮断することができる。ガイドＲＮＡまたはｉＲＮＡを作製するために、例えば下記の遺伝子を標的とするためにそれらの配列を例として以下に提示する：
Β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）（ＩＭＤ４３としても公知）は１５ｑ２１．１に位置し、以下のｍＲＮＡ配列を有する：
Figure 2021526838
Figure 2021526838
ヒトクラスＩＩ主要組織適合性遺伝子複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子は１６ｐ１３．１３に位置し、以下のｍＲＮＡ配列を有する：
Figure 2021526838
Figure 2021526838
Figure 2021526838
ヒトＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）ｍＲＮＡ配列は以下の通りである：
Figure 2021526838
ヒトＴ細胞受容体ベータ鎖（ＴＲＢＣ１）ｍＲＮＡ配列は以下の通りである：
Figure 2021526838
Figure 2021526838
ヒトＴＲＢＣ２ Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＣＲＢ２）配列は以下の通りである：
Figure 2021526838
Figure 2021526838
ある特定の実施形態では、当技術分野で公知のＣＩＩＴＡおよび／またはＢ２Ｍの遺伝子発現を阻害する阻害性核酸または任意のやり方が意図されている。阻害性核酸の例としては、これだけに限定されないが、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよびそれらをコードする核酸が挙げられる。阻害性核酸は、細胞における遺伝子の転写を阻害し得るまたは遺伝子転写物の翻訳を妨げ得る。阻害性核酸は、１６〜１０００ヌクレオチド長であり得、ある特定の実施形態では、１８〜１００ヌクレオチド長であり得る。核酸は、少なくともまたは最大で２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個またはこれらから導き出せる任意の範囲のヌクレオチドを有し得る。生きている動物において天然に存在するｓｉＲＮＡは、「単離された」ものではないが、合成ｓｉＲＮＡ、またはその天然の状態で共存する材料から部分的にもしくは完全に分離されたｓｉＲＮＡは、「単離された」ものである。単離されたｓｉＲＮＡは、実質的に精製された形態で存在し得る、または、例えば、ｓｉＲＮＡが送達されている細胞などの非ネイティブな環境下に存在し得る。
阻害性核酸は当技術分野で周知である。例えば、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５０６，５５９号および同第６，５７３，０９９号、ならびに米国特許公開第２００３／００５１２６３号、同第２００３／００５５０２０号、同第２００４／０２６５８３９号、同第２００２／０１６８７０７号、同第２００３／０１５９１６１号、および同第２００４／００６４８４２号に記載されている。
特に、阻害性核酸は、タンパク質またはｍＲＮＡの発現を少なくとも１０％、２０％、３０％、または４０％、より詳細には少なくとも５０％、６０％、または７０％、最も詳細には、少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％またはそれよりも大きくまたは前述の間の任意の範囲もしくは値だけ低減することができるものであり得る。
さらなる実施形態では、タンパク質阻害因子である合成核酸が存在する。阻害因子は、１７〜２５ヌクレオチド長であり得、成熟ｍＲＮＡの５’から３’への配列と少なくとも９０％相補的である５’から３’への配列を含む。ある特定の実施形態では、阻害因子分子は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長、またはその中で導き出せる任意の範囲の長さである。さらに、阻害因子分子は、成熟ｍＲＮＡ、特に、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２に対するｍＲＮＡなどの成熟した天然に存在するｍＲＮＡの５’から３’への配列に対して９０％もしくは少なくとも９０％、９１％もしくは少なくとも９１％、９２％もしくは少なくとも９２％、９３％もしくは少なくとも９３％、９４％もしくは少なくとも９４％、９５％もしくは少なくとも９５％、９６％もしくは少なくとも９６％、９７％もしくは少なくとも９７％、９８％もしくは少なくとも９８％、９９％もしくは少なくとも９９％、９９．１％もしくは少なくとも９９．１％、９９．２％もしくは少なくとも９９．２％、９９．３％もしくは少なくとも９９．３％、９９．４％もしくは少なくとも９９．４％、９９．５％もしくは少なくとも９９．５％、９９．６％もしくは少なくとも９９．６％、９９．７％もしくは少なくとも９９．７％、９９．８％もしくは少なくとも９９．８％、９９．９％もしくは少なくとも９９．９％または１００％もしくは少なくとも１００％相補的である、またはその中で導き出せる任意の範囲で相補的な配列（５’から３’まで）を有する。当業者は、成熟ｍＲＮＡの配列と相補的なプローブ配列の一部をｍＲＮＡ阻害因子の配列として使用することができる。さらに、プローブ配列のその部分を、それがなお成熟ｍＲＮＡの配列と９０％相補的であるように変更することができる。
操作されたｉＮＫＴ細胞が、必要の際のその後の枯渇のための１つまたは複数の自殺遺伝子を含む場合では、自殺遺伝子は、任意の適切な種類のものであってよい。本開示のｉＮＫＴ細胞は、例えば酵素に基づくものであり得る自殺遺伝子産物を発現し得る。自殺遺伝子産物の例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、または誘導性カスパーゼ９が挙げられる。したがって、特定の場合では、自殺遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードし得る。特定の場合では、ＴＫ遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子などのウイルスＴＫ遺伝子である。特定の実施形態では、自殺遺伝子産物は、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体などの基質によって活性化される。
特定の実施形態では、自殺遺伝子はｓｒ３９ＴＫであり、対応する配列の例は、以下の通りである：
ｓｒ３９ＴＫ ｃＤＮＡ配列（コドン最適化されたもの）：
Figure 2021526838
ｓｒ３９ＴＫアミノ酸配列：
Figure 2021526838
Figure 2021526838
一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞をイメージングまたは他のやり方で検出することができる。特定の場合では、細胞は、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドをコードする外因性核酸を含み、イメージングは、蛍光イメージング、放射性イメージング、比色イメージングなどであり得る。特定の場合では、細胞を陽電子放出断層撮影法によって検出する。少なくとも一部の場合では、細胞は、これらの遺伝子改変細胞をＰＥＴイメージングで追跡すること、およびｓｒ３９ＴＫ自殺遺伝子の機能によるこれらの細胞の排除を可能にする陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）レポーター／チミジンキナーゼ遺伝子であるｓｒ３９ＴＫ遺伝子を発現する。
操作されたｉＮＫＴ細胞の集団が本開示に包含される。特定の態様では、ｉＮＫＴクローン細胞は、ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（Ｔ細胞受容体）をコードする外因性核酸を含み、１つまたは複数のＨＬＡ−Ｉ分子またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を欠く。ｉＮＫＴ細胞は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）などの酵素に基づく自殺遺伝子を含めた自殺遺伝子をコードする外因性核酸を含み得る。ＴＫ遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子などのウイルスＴＫ遺伝子であり得る。集団の細胞では、自殺遺伝子は、例えば、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体などの基質によって活性化され得る。細胞は、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドをコードする外因性核酸を含み得、一部の場合では、自殺遺伝子産物は、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドである。特定の態様では、自殺遺伝子はｓｒ３９ＴＫである。
ｉＮＫＴ細胞集団のある特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、例えば、ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、および／またはＨＬＡ−Ｉ分子またはＨＬＡ−ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現の妨害に起因して、表面ＨＬＡ−Ｉ分子および表面ＨＬＡ−ＩＩ分子を発現しない。特定の場合では、ＨＬＡ−Ｉ分子またはＨＬＡ−ＩＩ分子は、ｉＮＫＴ細胞が遺伝子編集によって操作されたことに起因して、ｉＮＫＴ細胞の細胞表面上に発現されない。遺伝子編集にはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が関与してもしなくてもよい。
ｉＮＫＴ細胞集団に関する特定の場合では、ｉＮＫＴ細胞には、ウイルスベクター（少なくともレンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスを含む）などの組換えベクター由来の核酸配列が導入されている。
ある特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞集団の細胞は、１つまたは複数のある特定の条件に曝露されていても曝露されていなくてもよく、あるいは曝露されている。ある特定の場合では、例えば、集団の細胞は、動物血清を含む培地に曝露されていないまたは曝露されなかった。集団の細胞は、凍結したものであってもそうでなくてもよい。一部の場合では、集団の細胞は、デキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、および／またはＤＭＳＯを含む溶液中に存在する。溶液は、デキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯを含み得る。細胞は、無菌性、非発熱性、かつ等張性の溶液中に存在し得る。特定の場合では、ｉＮＫＴ細胞は、アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）で活性化されたなど、活性化されている。特定の態様では、細胞集団は、クローン細胞を少なくとも約１０２〜１０６個含む。一部の場合では、細胞集団は、総細胞少なくとも約１０６〜１０１２個を含み得る。
特定の実施形態では、ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（Ｔ細胞受容体）および自殺チミジンキナーゼをコードする１つまたは複数の外因性核酸を含むクローンｉＮＫＴ細胞を含むインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞集団であって、クローンｉＮＫＴ細胞が、機能的なベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、および／またはＨＬＡ−Ｉ分子およびＨＬＡ−ＩＩ分子を発現しないように操作されており、細胞集団が、総細胞少なくとも約１０６〜１０１２個であり、クローン細胞を少なくとも約１０２〜１０６個含む、ｉＮＫＴ細胞集団が存在する。一部の場合では、細胞を溶液中で凍結させる。
ＩＩＩ．細胞の製剤化および培養
特定の実施形態では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を生成するプロセスの任意の段階で、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞および／またはその前駆体を特別に製剤化し、かつ／またはそれらを特定の培地中で培養することができる（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＴＯ培養系に存在するか否かにかかわらず）。細胞は、有害作用なしでレシピエントへの送達に適した方法で製剤化することができる。
ある特定の態様では、培地は、ＡＩＭ Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ−１５、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ、ＥＧＭ２、ＴｅＳＲ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ １０６６、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、イーグルＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ−１６４０、およびフィッシャー培地のいずれか、ならびにこれらの任意の組合せなどの、動物細胞を培養するために使用される培地を基本培地として使用して調製することができるが、培地は、動物細胞の培養に使用できるものである限りは、これらに特に限定しなくてよい。特に、培地は、ゼノフリーまたは既知組成培地であり得る。
培地は、血清含有培地または無血清培地、またはゼノフリー培地であり得る。異種動物由来成分のコンタミネーション防止の観点から、血清は、幹細胞（複数可）と同じ動物に由来するものであり得る。無血清培地は、処理されていないまたは精製されていない血清が存在しない培地を指し、したがって、精製された血液由来成分または動物組織由来成分（成長因子など）を伴う培地を含み得る。
培地は、任意の血清の代替物を含有してもしなくてもよい。血清の代替物は、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン、ウシアルブミン、組換えアルブミンもしくはヒト化アルブミンなどのアルブミン置換、植物デンプン、デキストランおよびタンパク質加水分解産物）、トランスフェリン（もしくは他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール（3'-thiolgiycerol）、またはそれに対する等価物を適切に含有する材料を含み得る。血清の代替物は、例えば国際公開第９８／３０６７９号（その全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている方法によって調製することができる。あるいは、さらなる利便性のために任意の市販の材料を使用することができる。市販の材料としては、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、既知組成脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ）、およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。
さらなる実施形態では、培地は、細胞発生に適した無血清培地であり得る。例えば、培地は、Ｂ−２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ−２７（登録商標）サプリメント（ワールドワイドウェブthermofisher.com/us/en/home/technical-resources/media-formulation.250.htmlで入手可能）、ＮＳ２１サプリメント（Chen et al., J Neurosci Methods, 2008 Jun 30; 171 (2): 239-247、その全体が本明細書に組み込まれる）、ＧＳ２１（商標）サプリメント（ワールドワイドウェブamsbio.com/B-27.aspxで入手可能）、またはこれらの組合せを、３Ｄ細胞凝集体からＴ細胞を産生させるために有効な濃度で含み得る。
ある特定の実施形態では、培地は、以下のうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種またはそれよりも多くを含み得る：ビオチンなどのビタミン；ＤＬアルファ酢酸トコフェロール；ＤＬアルファトコフェロール；ビタミンＡ（酢酸エステル）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）もしくはヒトアルブミン、脂肪酸フリー画分Ｖなどのタンパク質；カタラーゼ；ヒト組換えインスリン；ヒトトランスフェリン；スーパーオキシドジスムターゼ；コルチコステロンなどの他の成分；Ｄ−ガラクトース；エタノールアミンＨＣｌ；グルタチオン（還元型）；Ｌ−カルニチンＨＣｌ；リノール酸；リノレン酸；プロゲステロン；プトレシン２ＨＣｌ；亜セレン酸ナトリウム；および／またはＴ３（トリヨード−Ｉ−チロニン）。
一部の実施形態では、培地は、ビタミンをさらに含む。一部の実施形態では、培地は、以下：ビオチン、ＤＬアルファ酢酸トコフェロール、ＤＬアルファトコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２のうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、または１３種（およびその中で導き出せる任意の範囲）を含む、または培地は、これらの組合せまたはその塩を含む。一部の実施形態では、培地は、ビオチン、ＤＬアルファ酢酸トコフェロール、ＤＬアルファトコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、およびビタミンＢ１２を含むまたはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ビタミンは、ビオチン、ＤＬアルファ酢酸トコフェロール、ＤＬアルファトコフェロール、ビタミンＡ、またはこれらの組合せもしくは塩を含むまたはそれから本質的になる。一部の実施形態では、培地は、タンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、タンパク質は、アルブミンまたはウシ血清アルブミン、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、培地は、以下：コルチコステロン、Ｄ−ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ−カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、またはトリヨード−Ｌ−チロニン、またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数をさらに含む。一部の実施形態では、培地は、以下のうちの１つまたは複数を含む：Ｂ−２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ−２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２１（商標）サプリメント、またはこれらの組合せ。一部の実施形態では、培地は、アミノ酸、単糖、無機イオンを含むまたはさらに含む。一部の実施形態では、アミノ酸は、アルギニン、シスチン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、またはバリン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、無機イオンは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素、またはリン、またはこれらの組合せもしくは塩を含む。一部の実施形態では、培地は、以下のうちの１つまたは複数をさらに含む：モリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、またはマンガン、またはこれらの組合せ。ある特定の実施形態では、培地は、本明細書で考察されている１種もしくは複数種のビタミンおよび／または本明細書で考察されている１つもしくは複数のタンパク質、および／または以下：コルチコステロン、Ｄ−ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ−カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、もしくはトリヨード−Ｉ−チロニン、Ｂ−２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ−２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２１（商標）サプリメント、アミノ酸（例えば、アルギニン、シスチン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、もしくはバリン）、単糖、無機イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素、および／もしくはリン）もしくはその塩、ならびに／またはモリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、もしくはマンガンのうちの１つまたは複数を含むまたはそれから本質的になる。
さらなる実施形態では、培地は、外部から添加されたアスコルビン酸を含み得る。培地は、１つまたは複数の外部から添加された脂肪酸または脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン（複数可）、成長因子、サイトカイン、抗酸化剤 物質、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、および／または無機塩も含み得る。
培地成分の１つまたは複数は、少なくとも、最大で、または約０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、１８０、２００、２５０ｎｇ／Ｌ、ｎｇ／ｍｌ、μｇ／ｍｌ、ｍｇ／ｍｌ、またはその中で導き出せる任意の範囲の濃度で添加することができる。
使用する培地には、少なくとも１種の外部から添加されたサイトカインを約０．１ｎｇ／ｍＬ〜 約５００ｎｇ／ｍＬ、より詳細には１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも、最大で、または約０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、１８０、２００、２５０ｎｇ／Ｌ、ｎｇ／ｍｌ、μｇ／ｍｌ、ｍｇ／ｍｌ、またはその中で導き出せる任意の範囲の濃度で補充することができる。適切なサイトカインとしては、これだけに限定されないが、ＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インターフェロン−ラムダ、ＴＳＬＰ、チモペンチン、プレイオトロフィン、および／またはミッドカインが挙げられる。特に、培養培地は、ＦＬＴ３ＬおよびＩＬ−７のうちの少なくとも１つを含み得る。より詳細には、培養は、ＦＬＴ３ＬおよびＩＬ−７の両方を含み得る。
他の培養条件を適切に定義することができる。例えば、培養温度は、約２０〜４０℃、例えば、少なくとも、最大で、または約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃（またはその中で導き出せる任意の範囲）であり得るが、温度は、これらの値を上回ってもよく下回ってもよい。ＣＯ２濃度は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％（またはその中で導き出せる任意の範囲）、例えば、約２％〜１０％、例えば、約２〜５％、またはその中で導き出せる任意の範囲であり得る。酸素分圧は、少なくともまたは約１％、５％、８％、１０％、２０％、またはその中で導き出せる任意の範囲であり得る。
特定の実施形態では、同種異系ＨＳＣの操作によるＨＬＡ陰性ｉＮＫＴ細胞を特別に製剤化する。同種異系ＨＳＣの操作によるＨＬＡ陰性ｉＮＫＴ細胞は、細胞浮遊液として製剤化することもでき、そうでなくてもよい。特定の場合では、同種異系ＨＳＣの操作によるＨＬＡ陰性ｉＮＫＴ細胞を、単回投薬形態に製剤化する。同種異系ＨＳＣの操作によるＨＬＡ陰性ｉＮＫＴ細胞を、全身投与または局所投与用に製剤化することができる。一部の場合では、細胞を、使用前の保管用に製剤化し、細胞製剤は、ＤＭＳＯ（例えば、５％ＤＭＳＯ）などの１つまたは複数の凍結保存剤を含み得る。細胞製剤は、ヒトアルブミンを含めたアルブミンを含み得、特定の製剤は２．５％ヒトアルブミンを含む。細胞を静脈内投与専用に製剤化することができる。例えば、細胞を、１時間未満にわたる静脈内投与用に製剤化する。特定の実施形態では、細胞は、解凍時から室温で１時間、２時間、３時間、または４時間またはそれよりも長く安定である製剤化された細胞浮遊液として存在する。
一部の実施形態では、方法は、Ｔ細胞を予備刺激することをさらに含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞を抗原提示細胞で予備刺激する。一部の実施形態では、抗原提示細胞は、腫瘍抗原を提示する。
特定の実施形態では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の外因性ＴＣＲは、抗原特異性が任意の定義済みのものであり得る。一部の実施形態では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の外因性ＴＣＲは、意図されたレシピエントに対するアロ反応性がないことまたは低減していることに基づいて選択することができる（例として、ある特定のウイルス特異的ＴＣＲ、ゼノ特異的ＴＣＲ、またはがん・精巣抗原特異的ＴＣＲが挙げられる）。外因性ＴＣＲが非アロ反応性である例では、Ｔ細胞の分化の間、外因性ＴＣＲにより内因性ＴＣＲ遺伝子座の再編成および／または発現が対立遺伝子排除と称される発生プロセスによって抑制され、その結果、非アロ反応性外因性ＴＣＲのみを発現し、したがって非アロ反応性であるＴ細胞が生じる。一部の実施形態では、外因性ＴＣＲの選択は、必ずしもアロ反応性がないことに基づいて定義されない場合がある。一部の実施形態では、内因性ＴＣＲ遺伝子は、タンパク質を発現しないようにゲノム編集により改変されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用する方法などの遺伝子編集の方法が当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、単離されたＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞またはその集団は、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。ＣＡＲを方向付けることができる腫瘍細胞抗原の例としては、少なくとも、例えば、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含めたＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体−ａ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、Ｈｅｒ２、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、ＫＤＲ、ＭＡＧＥ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＰ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、癌胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＡＦＰ、ＣＡ−１２５、ＥＴＡ、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ、ラミニン受容体、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化型塩素イオンチャネル２、サイクリン−Ｂ１、９Ｄ７、ＥｐｈＡ３、テロメラーゼ、ＳＡＰ−１、ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＡＭＥ、ＳＳＸ−２、メランＡ／ＭＡＲＴ−１、ＧＰ１００／ｐｍｅｌ１７、ＴＲＰ−１／−２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異的抗原、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ−２、ＴＧＦ−βＲＩＩ、またはＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ２）が挙げられる。ＣＡＲは、第１世代、第２世代、第３世代、またはさらに後の世代のＣＡＲであり得る。ＣＡＲは、任意の２つの同一でない抗原に対して二重特異性であり得る、または、ＣＡＲは、２つよりも多くの同一でない抗原に対して特異的であり得る。
ＩＶ．追加的な改変およびポリペプチド実施形態
さらに、本開示のポリペプチドは、化学修飾することができる。例えば、ポリペプチド配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を、ポリペプチドの抗原に対する親和性が増加するように改変することにより、ポリペプチドのグリコシル化を変更することができる（米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号）。
本開示のポリペプチドまたはポリペプチドをコードする本開示の核酸の領域または断片は、配列番号２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、もしくは７１のいずれかに対して、または配列番号１〜１９、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４５、４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６３、６４、６６〜７０、または７２〜７４のいずれかによってコードされるポリペプチドに対して１カ所、少なくとも１カ所もしくは最大で１カ所、２カ所、少なくとも２カ所もしくは最大で２カ所、３カ所、少なくとも３カ所もしくは最大で３カ所、４カ所、少なくとも４カ所もしくは最大で４カ所、５カ所、少なくとも５カ所もしくは最大で５カ所、６カ所、少なくとも６カ所もしくは最大で６カ所、７カ所、少なくとも７カ所もしくは最大で７カ所、８カ所、少なくとも８カ所もしくは最大で８カ所、９カ所、少なくとも９カ所もしくは最大で９カ所、１０カ所、少なくとも１０カ所もしくは最大で１０カ所、１１カ所、少なくとも１１カ所もしくは最大で１１カ所、１２カ所、少なくとも１２カ所もしくは最大で１２カ所、１３カ所、少なくとも１３カ所もしくは最大で１３カ所、１４カ所、少なくとも１４カ所もしくは最大で１４カ所、１５カ所、少なくとも１５カ所もしくは最大で１５カ所、１６カ所、少なくとも１６カ所もしくは最大で１６カ所、１７カ所、少なくとも１７カ所もしくは最大で１７カ所、１８カ所、少なくとも１８カ所もしくは最大で１８カ所、１９カ所、少なくとも１９カ所もしくは最大で１９カ所、２０カ所、少なくとも２０カ所もしくは最大で２０カ所、２１カ所、少なくとも２１カ所もしくは最大で２１カ所、２２カ所、少なくとも２２カ所もしくは最大で２２カ所、２３カ所、少なくとも２３カ所もしくは最大で２３カ所、２４カ所、少なくとも２４カ所もしくは最大で２４カ所、２５カ所、少なくとも２５カ所もしくは最大で２５カ所、２６カ所、少なくとも２６カ所もしくは最大で２６カ所、２７カ所、少なくとも２７カ所もしくは最大で２７カ所、２８カ所、少なくとも２８カ所もしくは最大で２８カ所、２９カ所、少なくとも２９カ所もしくは最大で２９カ所、３０カ所、少なくとも３０カ所もしくは最大で３０カ所、３１カ所、少なくとも３１カ所もしくは最大で３１カ所、３２カ所、少なくとも３２カ所もしくは最大で３２カ所、３３カ所、少なくとも３３カ所もしくは最大で３３カ所、３４カ所、少なくとも３４カ所もしくは最大で３４カ所、３５カ所、少なくとも３５カ所もしくは最大で３５カ所、３６カ所、少なくとも３６カ所もしくは最大で３６カ所、３７カ所、少なくとも３７カ所もしくは最大で３７カ所、３８カ所、少なくとも３８カ所もしくは最大で３８カ所、３９カ所、少なくとも３９カ所もしくは最大で３９カ所、４０カ所、少なくとも４０カ所もしくは最大で４０カ所、４１カ所、少なくとも４１カ所もしくは最大で４１カ所、４２カ所、少なくとも４２カ所もしくは最大で４２カ所、４３カ所、少なくとも４３カ所もしくは最大で４３カ所、４４カ所、少なくとも４４カ所もしくは最大で４４カ所、４５カ所、少なくとも４５カ所もしくは最大で４５カ所、４６カ所、少なくとも４６カ所もしくは最大で４６カ所、４７カ所、少なくとも４７カ所もしくは最大で４７カ所、４８カ所、少なくとも４８カ所もしくは最大で４８カ所、４９カ所、少なくとも４９カ所もしくは最大で４９カ所、５０カ所、少なくとも５０カ所もしくは最大で５０カ所、５１カ所、少なくとも５１カ所もしくは最大で５１カ所、５２カ所、少なくとも５２カ所もしくは最大で５２カ所、５３カ所、少なくとも５３カ所もしくは最大で５３カ所、５４カ所、少なくとも５４カ所もしくは最大で５４カ所、５５カ所、少なくとも５５カ所もしくは最大で５５カ所、５６カ所、少なくとも５６カ所もしくは最大で５６カ所、５７カ所、少なくとも５７カ所もしくは最大で５７カ所、５８カ所、少なくとも５８カ所もしくは最大で５８カ所、５９カ所、少なくとも５９カ所もしくは最大で５９カ所、６０カ所、少なくとも６０カ所もしくは最大で６０カ所、６１カ所、少なくとも６１カ所もしくは最大で６１カ所、６２カ所、少なくとも６２カ所もしくは最大で６２カ所、６３カ所、少なくとも６３カ所もしくは最大で６３カ所、６４カ所、少なくとも６４カ所もしくは最大で６４カ所、６５カ所、少なくとも６５カ所もしくは最大で６５カ所、６６カ所、少なくとも６６カ所もしくは最大で６６カ所、６７カ所、少なくとも６７カ所もしくは最大で６７カ所、６８カ所、少なくとも６８カ所もしくは最大で６８カ所、６９カ所、少なくとも６９カ所もしくは最大で６９カ所、７０カ所、少なくとも７０カ所もしくは最大で７０カ所、７１カ所、少なくとも７１カ所もしくは最大で７１カ所、７２カ所、少なくとも７２カ所もしくは最大で７２カ所、７３カ所、少なくとも７３カ所もしくは最大で７３カ所、７４カ所、少なくとも７４カ所もしくは最大で７４カ所、７５カ所、少なくとも７５カ所もしくは最大で７５カ所、７６カ所、少なくとも７６カ所もしくは最大で７６カ所、７７カ所、少なくとも７７カ所もしくは最大で７７カ所、７８カ所、少なくとも７８カ所もしくは最大で７８カ所、７９カ所、少なくとも７９カ所もしくは最大で７９カ所、８０カ所、少なくとも８０カ所もしくは最大で８０カ所、８１カ所、少なくとも８１カ所もしくは最大で８１カ所、８２カ所、少なくとも８２カ所もしくは最大で８２カ所、８３カ所、少なくとも８３カ所もしくは最大で８３カ所、８４カ所、少なくとも８４カ所もしくは最大で８４カ所、８５カ所、少なくとも８５カ所もしくは最大で８５カ所、８６カ所、少なくとも８６カ所もしくは最大で８６カ所、８７カ所、少なくとも８７カ所もしくは最大で８７カ所、８８カ所、少なくとも８８カ所もしくは最大で８８カ所、８９カ所、少なくとも８９カ所もしくは最大で８９カ所、９０カ所、少なくとも９０カ所もしくは最大で９０カ所、９１カ所、少なくとも９１カ所もしくは最大で９１カ所、９２カ所、少なくとも９２カ所もしくは最大で９２カ所、９３カ所、少なくとも９３カ所もしくは最大で９３カ所、９４カ所、少なくとも９４カ所もしくは最大で９４カ所、９５カ所、少なくとも９５カ所もしくは最大で９５カ所、９６カ所、少なくとも９６カ所もしくは最大で９６カ所、９７カ所、少なくとも９７カ所もしくは最大で９７カ所、９８カ所、少なくとも９８カ所もしくは最大で９８カ所、９９カ所、少なくとも９９カ所もしくは最大で９９カ所、
１００カ所、少なくとも１００カ所もしくは最大で１００カ所、１０１カ所、少なくとも１０１カ所もしくは最大で１０１カ所、１０２カ所、少なくとも１０２カ所もしくは最大で１０２カ所、１０３カ所、少なくとも１０３カ所もしくは最大で１０３カ所、１０４カ所、少なくとも１０４カ所もしくは最大で１０４カ所、１０５カ所、少なくとも１０５カ所もしくは最大で１０５カ所、１０６カ所、少なくとも１０６カ所もしくは最大で１０６カ所、１０７カ所、少なくとも１０７カ所もしくは最大で１０７カ所、１０８カ所、少なくとも１０８カ所もしくは最大で１０８カ所、１０９カ所、少なくとも１０９カ所もしくは最大で１０９カ所、１１０カ所、少なくとも１１０カ所もしくは最大で１１０カ所、１１１カ所、少なくとも１１１カ所もしくは最大で１１１カ所、１１２カ所、少なくとも１１２カ所もしくは最大で１１２カ所、１１３カ所、少なくとも１１３カ所もしくは最大で１１３カ所、１１４カ所、少なくとも１１４カ所もしくは最大で１１４カ所、１１５カ所、少なくとも１１５カ所もしくは最大で１１５カ所、１１６カ所、少なくとも１１６カ所もしくは最大で１１６カ所、１１７カ所、少なくとも１１７カ所もしくは最大で１１７カ所、１１８カ所、少なくとも１１８カ所もしくは最大で１１８カ所、１１９カ所、少なくとも１１９カ所もしくは最大で１１９カ所、１２０カ所、少なくとも１２０カ所もしくは最大で１２０カ所、１２１カ所、少なくとも１２１カ所もしくは最大で１２１カ所、１２２カ所、少なくとも１２２カ所もしくは最大で１２２カ所、１２３カ所、少なくとも１２３カ所もしくは最大で１２３カ所、１２４カ所、少なくとも１２４カ所もしくは最大で１２４カ所、１２５カ所、少なくとも１２５カ所もしくは最大で１２５カ所、１２６カ所、少なくとも１２６カ所もしくは最大で１２６カ所、１２７カ所、少なくとも１２７カ所もしくは最大で１２７カ所、１２８カ所、少なくとも１２８カ所もしくは最大で１２８カ所、１２９カ所、少なくとも１２９カ所もしくは最大で１２９カ所、１３０カ所、少なくとも１３０カ所もしくは最大で１３０カ所、１３１カ所、少なくとも１３１カ所もしくは最大で１３１カ所、１３２カ所、少なくとも１３２カ所もしくは最大で１３２カ所、１３３カ所、少なくとも１３３カ所もしくは最大で１３３カ所、１３４カ所、少なくとも１３４カ所もしくは最大で１３４カ所、１３５カ所、少なくとも１３５カ所もしくは最大で１３５カ所、１３６カ所、少なくとも１３６カ所もしくは最大で１３６カ所、１３７カ所、少なくとも１３７カ所もしくは最大で１３７カ所、１３８カ所、少なくとも１３８カ所もしくは最大で１３８カ所、１３９カ所、少なくとも１３９カ所もしくは最大で１３９カ所、１４０カ所、少なくとも１４０カ所もしくは最大で１４０カ所、１４１カ所、少なくとも１４１カ所もしくは最大で１４１カ所、１４２カ所、少なくとも１４２カ所もしくは最大で１４２カ所、１４３カ所、少なくとも１４３カ所もしくは最大で１４３カ所、１４４カ所、少なくとも１４４カ所もしくは最大で１４４カ所、１４５カ所、少なくとも１４５カ所もしくは最大で１４５カ所、１４６カ所、少なくとも１４６カ所もしくは最大で１４６カ所、１４７カ所、少なくとも１４７カ所もしくは最大で１４７カ所、１４８カ所、少なくとも１４８カ所もしくは最大で１４８カ所、１４９カ所、少なくとも１４９カ所もしくは最大で１４９カ所、１５０カ所、少なくとも１５０カ所もしくは最大で１５０カ所、１５１カ所、少なくとも１５１カ所もしくは最大で１５１カ所、１５２カ所、少なくとも１５２カ所もしくは最大で１５２カ所、１５３カ所、少なくとも１５３カ所もしくは最大で１５３カ所、１５４カ所、少なくとも１５４カ所もしくは最大で１５４カ所、１５５カ所、少なくとも１５５カ所もしくは最大で１５５カ所、１５６カ所、少なくとも１５６カ所もしくは最大で１５６カ所、１５７カ所、少なくとも１５７カ所もしくは最大で１５７カ所、１５８カ所、少なくとも１５８カ所もしくは最大で１５８カ所、１５９カ所、少なくとも１５９カ所もしくは最大で１５９カ所、１６０カ所、少なくとも１６０カ所もしくは最大で１６０カ所、１６１カ所、少なくとも１６１カ所もしくは最大で１６１カ所、１６２カ所、少なくとも１６２カ所もしくは最大で１６２カ所、１６３カ所、少なくとも１６３カ所もしくは最大で１６３カ所、１６４カ所、少なくとも１６４カ所もしくは最大で１６４カ所、１６５カ所、少なくとも１６５カ所もしくは最大で１６５カ所、１６６カ所、少なくとも１６６カ所もしくは最大で１６６カ所、１６７カ所、少なくとも１６７カ所もしくは最大で１６７カ所、１６８カ所、少なくとも１６８カ所もしくは最大で１６８カ所、１６９カ所、少なくとも１６９カ所もしくは最大で１６９カ所、１７０カ所、少なくとも１７０カ所もしくは最大で１７０カ所、１７１カ所、少なくとも１７１カ所もしくは最大で１７１カ所、１７２カ所、少なくとも１７２カ所もしくは最大で１７２カ所、１７３カ所、少なくとも１７３カ所もしくは最大で１７３カ所、１７４カ所、少なくとも１７４カ所もしくは最大で１７４カ所、１７５カ所、少なくとも１７５カ所もしくは最大で１７５カ所、１７６カ所、少なくとも１７６カ所もしくは最大で１７６カ所、１７７カ所、少なくとも１７７カ所もしくは最大で１７７カ所、１７８カ所、少なくとも１７８カ所もしくは最大で１７８カ所、１７９カ所、少なくとも１７９カ所もしくは最大で１７９カ所、１８０カ所、少なくとも１８０カ所もしくは最大で１８０カ所、１８１カ所、少なくとも１８１カ所もしくは最大で１８１カ所、１８２カ所、少なくとも１８２カ所もしくは最大で１８２カ所、１８３カ所、少なくとも１８３カ所もしくは最大で１８３カ所、１８４カ所、少なくとも１８４カ所もしくは最大で１８４カ所、１８５カ所、少なくとも１８５カ所もしくは最大で１８５カ所、１８６カ所、少なくとも１８６カ所もしくは最大で１８６カ所、１８７カ所、少なくとも１８７カ所もしくは最大で１８７カ所、１８８カ所、少なくとも１８８カ所もしくは最大で１８８カ所、１８９カ所、少なくとも１８９カ所もしくは最大で１８９カ所、１９０カ所、少なくとも１９０カ所もしくは最大で１９０カ所、１９１カ所、少なくとも１９１カ所もしくは最大で１９１カ所、１９２カ所、少なくとも１９２カ所もしくは最大で１９２カ所、１９３カ所、少なくとも１９３カ所もしくは最大で１９３カ所、１９４カ所、少なくとも１９４カ所もしくは最大で１９４カ所、１９５カ所、少なくとも１９５カ所もしくは最大で１９５カ所、１９６カ所、少なくとも１９６カ所もしくは最大で１９６カ所、１９７カ所、少なくとも１９７カ所もしくは最大で１９７カ所、１９８カ所、少なくとも１９８カ所もしくは最大で１９８カ所、１９９カ所、少なくとも１９９カ所もしくは最大で１９９カ所、２００カ所、少なくとも２００カ所もしくは最大で２００カ所またはそれよりも多くのアミノ酸置換、連続したアミノ酸付加、または連続したアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を有し得ることが意図されている。
あるいは、本開示のポリペプチドの領域または断片は、配列番号２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、もしくは７１のいずれかと、または配列番号１〜１９、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４５、４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６３、６４、６６〜７０、または７２〜７４のいずれかによってコードされるポリペプチドと５０％、少なくとも５０％もしくは最大で５０％、５１％、少なくとも５１％もしくは最大で５１％、５２％、少なくとも５２％もしくは最大で５２％、５３％、少なくとも５３％もしくは最大で５３％、５４％、少なくとも５４％もしくは最大で５４％、５５％、少なくとも５５％もしくは最大で５５％、５６％、少なくとも５６％もしくは最大で５６％、５７％、少なくとも５７％もしくは最大で５７％、５８％、少なくとも５８％もしくは最大で５８％、５９％、少なくとも５９％もしくは最大で５９％、６０％、少なくとも６０％もしくは最大で６０％、６１％、少なくとも６１％もしくは最大で６１％、６２％、少なくとも６２％もしくは最大で６２％、６３％、少なくとも６３％もしくは最大で６３％、６４％、少なくとも６４％もしくは最大で６４％、６５％、少なくとも６５％もしくは最大で６５％、６６％、少なくとも６６％もしくは最大で６６％、６７％、少なくとも６７％もしくは最大で６７％、６８％、少なくとも６８％もしくは最大で６８％、６９％、少なくとも６９％もしくは最大で６９％、７０％、少なくとも７０％もしくは最大で７０％、７１％、少なくとも７１％もしくは最大で７１％、７２％、少なくとも７２％もしくは最大で７２％、７３％、少なくとも７３％もしくは最大で７３％、７４％、少なくとも７４％もしくは最大で７４％、７５％、少なくとも７５％もしくは最大で７５％、７６％、少なくとも７６％もしくは最大で７６％、７７％、少なくとも７７％もしくは最大で７７％、７８％、少なくとも７８％もしくは最大で７８％、７９％、少なくとも７９％もしくは最大で７９％、８０％、少なくとも８０％もしくは最大で８０％、８１％、少なくとも８１％もしくは最大で８１％、８２％、少なくとも８２％もしくは最大で８２％、８３％、少なくとも８３％もしくは最大で８３％、８４％、少なくとも８４％もしくは最大で８４％、８５％、少なくとも８５％もしくは最大で８５％、８６％、少なくとも８６％もしくは最大で８６％、８７％、少なくとも８７％もしくは最大で８７％、８８％、少なくとも８８％もしくは最大で８８％、８９％、少なくとも８９％もしくは最大で８９％、９０％、少なくとも９０％もしくは最大で９０％、９１％、少なくとも９１％もしくは最大で９１％、９２％、少なくとも９２％もしくは最大で９２％、９３％、少なくとも９３％もしくは最大で９３％、９４％、少なくとも９４％もしくは最大で９４％、９５％、少なくとも９５％もしくは最大で９５％、９６％、少なくとも９６％もしくは最大で９６％、９７％、少なくとも９７％もしくは最大で９７％、９８％、少なくとも９８％もしくは最大で９８％、９９％、少なくとも９９％もしくは最大で９９％、１００％、少なくとも１００％もしくは最大で１００％（またはその中で導き出せる任意の範囲）で同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなるアミノ酸配列を有し得る。さらに、一部の実施形態では、領域または断片は、配列番号２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、もしくは７１のいずれか、または配列番号１〜１９、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４５、４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６３、６４、６６〜７０、または７２〜７４のいずれかによってコードされるポリペプチドの１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位、１８３位、１８４位、１８５位、１８６位、１８７位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２００位、２０１位、２０２位、２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、２１３位、２１４位、２１５位、２１６位、２１７位、２１８位、２１９位、２２０位、２２１位、２２２位、２２３位、２２４位、２２５位、２２６位、２２７位、２２８位、２２９位、２３０位、２３１位、２３２位、２３３位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２４０位、２４１位、２４２位、２４３位、２４４位、２４５位、２４６位、２４７位、２４８位、２４９位、２５０位、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、２５６位、２５７位、２５８位、２５９位、２６０位、２６１位、２６２位、２６３位、２６４位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２７２位、２７３位、２７４位、２７５位、２７６位、２７７位、２７８位、２７９位、２８０位、２８１位、２８２位、２８３位、２８４位、２８５位、２８６位、２８７位、２８８位、２８９位、２９０位、２９１位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３００位、３０１位、３０２位、３０３位、３０４位、３０５位、３０６位、３０７位、３０８位、３０９位、３１０位、３１１位、３１２位、３１３位、３１４位、３１５位、３１６位、３１７位、３１８位、３１９位、３２０位、３２１位、３２２位、３２３位、３２４位、３２５位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位、３３５位、３３６位、３３７位、３３８位、３３９位、３４０位、３４１位、３４２位、３４３位、３４４位、３４５位、３４６位、３４７位、３４８位、３４９位、３５０位、３５１位、３５２位、３５３位、３５４位、３５５位、３５６位、３５７位、３５８位、３５９位、３６０位、３６１位、３６２位、３６３位、３６４位、３６５位、３６６位、３６７位、３６８位、３６９位、３７０位、３７１位、３７２位、３７３位、３７４位、３７５位、３７６位、３７７位、３７８位、３７９位、３８０位、３８１位、３８２位、３８３位、３８４位、３８５位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、３９１位、３９２位、３９３位、３９４位、３９５位、３９６位、３９７位、３９８位、３９９位、４００位、４０１位、４０２位、４０３位、４０４位、４０５位、４０６位、４０７位、４０８位、４０９位、４１０位、４１１位、４１２位、４１３位、４１４位、４１５位、４１６位、４１７位、４１８位、４１９位、４２０位、４２１位、４２２位、４２３位、４２４位、４２５位、４２６位、４２７位、４２８位、４２９位、４３０位、４３１位、４３２位、４３３位、４３４位、４３５位、４３６位、４３７位、４３８位、４３９位、４４０位、４４１位、４４２位、４４３位、４４４位、４４５位、４４６位、４４７位、４４８位、４４９位、４５０位、４５１位、４５２位、４５３位、４５４位、４５５位、４５６位、４５７位、４５８位、４５９位、４６０位、４６１位、４６２位、４６３位、４６４位、４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、４８４位、４８５位、４８６位、４８７位、４８８位、４８９位、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９４位、４９５位、４９６位、４９７位、４９８位、４９９位、５００位から開始して、
４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、１２９個、１３０個、１３１個、１３２個、１３３個、１３４個、１３５個、１３６個、１３７個、１３８個、１３９個、１４０個、１４１個、１４２個、１４３個、１４４個、１４５個、１４６個、１４７個、１４８個、１４９個、１５０個、１５１個、１５２個、１５３個、１５４個、１５５個、１５６個、１５７個、１５８個、１５９個、１６０個、１６１個、１６２個、１６３個、１６４個、１６５個、１６６個、１６７個、１６８個、１６９個、１７０個、１７１個、１７２個、１７３個、１７４個、１７５個、１７６個、１７７個、１７８個、１７９個、１８０個、１８１個、１８２個、１８３個、１８４個、１８５個、１８６個、１８７個、１８８個、１８９個、１９０個、１９１個、１９２個、１９３個、１９４個、１９５個、１９６個、１９７個、１９８個、１９９個、２００個、２０１個、２０２個、２０３個、２０４個、２０５個、２０６個、２０７個、２０８個、２０９個、２１０個、２１１個、２１２個、２１３個、２１４個、２１５個、２１６個、２１７個、２１８個、２１９個、２２０個、２２１個、２２２個、２２３個、２２４個、２２５個、２２６個、２２７個、２２８個、２２９個、２３０個、２３１個、２３２個、２３３個、２３４個、２３５個、２３６個、２３７個、２３８個、２３９個、２４０個、２４１個、２４２個、２４３個、２４４個、２４５個、２４６個、２４７個、２４８個、２４９個、２５０個、２５１個、２５２個、２５３個、２５４個、２５５個、２５６個、２５７個、２５８個、２５９個、２６０個、２６１個、２６２個、２６３個、２６４個、２６５個、２６６個、２６７個、２６８個、２６９個、２７０個、２７１個、２７２個、２７３個、２７４個、２７５個、２７６個、２７７個、２７８個、２７９個、２８０個、２８１個、２８２個、２８３個、２８４個、２８５個、２８６個、２８７個、２８８個、２８９個、２９０個、２９１個、２９２個、２９３個、２９４個、２９５個、２９６個、２９７個、２９８個、２９９個、３００個、３０１個、３０２個、３０３個、３０４個、３０５個、３０６個、３０７個、３０８個、３０９個、３１０個、３１１個、３１２個、３１３個、３１４個、３１５個、３１６個、３１７個、３１８個、３１９個、３２０個、３２１個、３２２個、３２３個、３２４個、３２５個、３２６個、３２７個、３２８個、３２９個、３３０個、３３１個、３３２個、３３３個、３３４個、３３５個、３３６個、３３７個、３３８個、３３９個、３４０個、３４１個、３４２個、３４３個、３４４個、３４５個、３４６個、３４７個、３４８個、３４９個、３５０個、３５１個、３５２個、３５３個、３５４個、３５５個、３５６個、３５７個、３５８個、３５９個、３６０個、３６１個、３６２個、３６３個、３６４個、３６５個、３６６個、３６７個、３６８個、３６９個、３７０個、３７１個、３７２個、３７３個、３７４個、３７５個、３７６個、３７７個、３７８個、３７９個、３８０個、３８１個、３８２個、３８３個、３８４個、３８５個、３８６個、３８７個、３８８個、３８９個、３９０個、３９１個、３９２個、３９３個、３９４個、３９５個、３９６個、３９７個、３９８個、３９９個、４００個、４０１個、４０２個、４０３個、４０４個、４０５個、４０６個、４０７個、４０８個、４０９個、４１０個、４１１個、４１２個、４１３個、４１４個、４１５個、４１６個、４１７個、４１８個、４１９個、４２０個、４２１個、４２２個、４２３個、４２４個、４２５個、４２６個、４２７個、４２８個、４２９個、４３０個、４３１個、４３２個、４３３個、４３４個、４３５個、４３６個、４３７個、４３８個、４３９個、４４０個、４４１個、４４２個、４４３個、４４４個、４４５個、４４６個、４４７個、４４８個、４４９個、４５０個、４５１個、４５２個、４５３個、４５４個、４５５個、４５６個、４５７個、４５８個、４５９個、４６０個、４６１個、４６２個、４６３個、４６４個、４６５個、４６６個、４６７個、４６８個、４６９個、４７０個、４７１個、４７２個、４７３個、４７４個、４７５個、４７６個、４７７個、４７８個、４７９個、４８０個、４８１個、４８２個、４８３個、４８４個、４８５個、４８６個、４８７個、４８８個、４８９個、４９０個、４９１個、４９２個、４９３個、４９４個、４９５個、４９６個、４９７個、４９８個、４９９個、５００個またはそれよりも多くの連続したアミノ酸であるアミノ酸領域を含む（１位は、配列番号のＮ末端または配列番号によってコードされるポリペプチドのＮ末端である）。本開示のポリペプチドは、１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所、１１カ所、１２カ所、１３カ所、１４カ所、１５カ所、１６カ所、１７カ所、１８カ所、１９カ所、２０カ所、２１カ所、２２カ所、２３カ所、２４カ所、２５カ所、２６カ所、２７カ所、２８カ所、２９カ所、３０カ所、３１カ所、３２カ所、３３カ所、３４カ所、３５カ所、３６カ所、３７カ所、３８カ所、３９カ所、４０カ所、４１カ所、４２カ所、４３カ所、４４カ所、４５カ所、４６カ所、４７カ所、４８カ所、４９カ所、もしくは５０カ所もしくはそれよりも多くのバリアントアミノ酸または核酸置換を含み得る、または、配列番号２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、もしくは７１のいずれか、もしくは配列番号１〜１９、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４５、４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６３、６４、６６〜７０、または７２〜７４のいずれかによってコードされるポリペプチドの少なくとも、または最大で３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、１２９個、１３０個、１３１個、１３２個、１３３個、１３４個、１３５個、１３６個、１３７個、１３８個、１３９個、１４０個、１４１個、１４２個、１４３個、１４４個、１４５個、１４６個、１４７個、１４８個、１４９個、１５０個、１５１個、１５２個、１５３個、１５４個、１５５個、１５６個、１５７個、１５８個、１５９個、１６０個、１６１個、１６２個、１６３個、１６４個、１６５個、１６６個、１６７個、１６８個、１６９個、１７０個、１７１個、１７２個、１７３個、１７４個、１７５個、１７６個、１７７個、１７８個、１７９個、１８０個、１８１個、１８２個、１８３個、１８４個、１８５個、１８６個、１８７個、１８８個、１８９個、１９０個、１９１個、１９２個、１９３個、１９４個、１９５個、１９６個、１９７個、１９８個、１９９個、２００個、２０１個、２０２個、２０３個、２０４個、２０５個、２０６個、２０７個、２０８個、２０９個、２１０個、２１１個、２１２個、２１３個、２１４個、２１５個、２１６個、２１７個、２１８個、２１９個、２２０個、２２１個、２２２個、２２３個、２２４個、２２５個、２２６個、２２７個、２２８個、２２９個、２３０個、２３１個、２３２個、２３３個、２３４個、２３５個、２３６個、２３７個、２３８個、２３９個、２４０個、２４１個、２４２個、２４３個、２４４個、２４５個、２４６個、２４７個、２４８個、２４９個、２５０個、３００個、４００個、５００個、５５０個、１０００個、１５００個、もしくは２０００個もしくはそれよりも多く、もしくはその中で導き出せる任意の範囲の連続したアミノ酸または核酸と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同様、同一、もしくは相同である。
本開示のポリペプチドは、少なくとも、最大で、またはちょうど１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所、１１カ所、１２カ所、１３カ所、１４カ所、１５カ所、１６カ所、１７カ所、１８カ所、１９カ所、２０カ所、２１カ所、２２カ所、２３カ所、２４カ所、２５カ所、２６カ所、２７カ所、２８カ所、２９カ所、３０カ所、３１カ所、３２カ所、３３カ所、３４カ所、３５カ所、３６カ所、３７カ所、３８カ所、３９カ所、４０カ所、４１カ所、４２カ所、４３カ所、４４カ所、４５カ所、４６カ所、４７カ所、４８カ所、４９カ所、５０カ所、５１カ所、５２カ所、５３カ所、５４カ所、５５カ所、５６カ所、５７カ所、５８カ所、５９カ所、６０カ所、６１カ所、６２カ所、６３カ所、６４カ所、６５カ所、６６カ所、６７カ所、６８カ所、６９カ所、７０カ所、７１カ所、７２カ所、７３カ所、７４カ所、７５カ所、７６カ所、７７カ所、７８カ所、７９カ所、８０カ所、８１カ所、８２カ所、８３カ所、８４カ所、８５カ所、８６カ所、８７カ所、８８カ所、８９カ所、９０カ所、９１カ所、９２カ所、９３カ所、９４カ所、９５カ所、９６カ所、９７カ所、９８カ所、９９カ所、１００カ所、１０１カ所、１０２カ所、１０３カ所、１０４カ所、１０５カ所、１０６カ所、１０７カ所、１０８カ所、１０９カ所、１１０カ所、１１１カ所、１１２カ所、１１３カ所、１１４カ所、１１５カ所、１１６カ所、１１７カ所、１１８カ所、１１９カ所、１２０カ所、１２１カ所、１２２カ所、１２３カ所、１２４カ所、１２５カ所、１２６カ所、１２７カ所、１２８カ所、１２９カ所、１３０カ所、１３１カ所、１３２カ所、１３３カ所、１３４カ所、１３５カ所、１３６カ所、１３７カ所、１３８カ所、１３９カ所、１４０カ所、１４１カ所、１４２カ所、１４３カ所、１４４カ所、１４５カ所、１４６カ所、１４７カ所、１４８カ所、１４９カ所、１５０カ所、１５１カ所、１５２カ所、１５３カ所、１５４カ所、１５５カ所、１５６カ所、１５７カ所、１５８カ所、１５９カ所、１６０カ所、１６１カ所、１６２カ所、１６３カ所、１６４カ所、１６５カ所、１６６カ所、１６７カ所、１６８カ所、１６９カ所、１７０カ所、１７１カ所、１７２カ所、１７３カ所、１７４カ所、１７５カ所、１７６カ所、１７７カ所、１７８カ所、１７９カ所、１８０カ所、１８１カ所、１８２カ所、１８３カ所、１８４カ所、１８５カ所、１８６カ所、１８７カ所、１８８カ所、１８９カ所、１９０カ所、１９１カ所、１９２カ所、１９３カ所、１９４カ所、１９５カ所、１９６カ所、１９７カ所、１９８カ所、１９９カ所、２００カ所、２０１カ所、２０２カ所、２０３カ所、２０４カ所、２０５カ所、２０６カ所、２０７カ所、２０８カ所、２０９カ所、２１０カ所、２１１カ所、２１２カ所、２１３カ所、２１４カ所、２１５カ所、２１６カ所、２１７カ所、２１８カ所、２１９カ所、２２０カ所、２２１カ所、２２２カ所、２２３カ所、２２４カ所、２２５カ所、２２６カ所、２２７カ所、２２８カ所、２２９カ所、２３０カ所、２３１カ所、２３２カ所、２３３カ所、２３４カ所、２３５カ所、２３６カ所、２３７カ所、２３８カ所、２３９カ所、２４０カ所、２４１カ所、２４２カ所、２４３カ所、２４４カ所、２４５カ所、２４６カ所、２４７カ所、２４８カ所、２４９カ所、２５０カ所、２５１カ所、２５２カ所、２５３カ所、２５４カ所、２５５カ所、２５６カ所、２５７カ所、２５８カ所、２５９カ所、２６０カ所、２６１カ所、２６２カ所、２６３カ所、２６４カ所、２６５カ所、２６６カ所、２６７カ所、２６８カ所、２６９カ所、２７０カ所、２７１カ所、２７２カ所、２７３カ所、２７４カ所、２７５カ所、２７６カ所、２７７カ所、２７８カ所、２７９カ所、２８０カ所、２８１カ所、２８２カ所、２８３カ所、２８４カ所、２８５カ所、２８６カ所、２８７カ所、２８８カ所、２８９カ所、２９０カ所、２９１カ所、２９２カ所、２９３カ所、２９４カ所、２９５カ所、２９６カ所、２９７カ所、２９８カ所、２９９カ所、３００カ所、３０１カ所、３０２カ所、３０３カ所、３０４カ所、３０５カ所、３０６カ所、３０７カ所、３０８カ所、３０９カ所、３１０カ所、３１１カ所、３１２カ所、３１３カ所、３１４カ所、３１５カ所、３１６カ所、３１７カ所、３１８カ所、３１９カ所、３２０カ所、３２１カ所、３２２カ所、３２３カ所、３２４カ所、３２５カ所、３２６カ所、３２７カ所、３２８カ所、３２９カ所、３３０カ所、３３１カ所、３３２カ所、３３３カ所、３３４カ所、３３５カ所、３３６カ所、３３７カ所、３３８カ所、３３９カ所、３４０カ所、３４１カ所、３４２カ所、３４３カ所、３４４カ所、３４５カ所、３４６カ所、３４７カ所、３４８カ所、３４９カ所、３５０カ所、３５１カ所、３５２カ所、３５３カ所、３５４カ所、３５５カ所、３５６カ所、３５７カ所、３５８カ所、３５９カ所、３６０カ所、３６１カ所、３６２カ所、３６３カ所、３６４カ所、３６５カ所、３６６カ所、３６７カ所、３６８カ所、３６９カ所、３７０カ所、３７１カ所、３７２カ所、３７３カ所、３７４カ所、３７５カ所、３７６カ所、３７７カ所、３７８カ所、３７９カ所、３８０カ所、３８１カ所、３８２カ所、３８３カ所、３８４カ所、３８５カ所、３８６カ所、３８７カ所、３８８カ所、３８９カ所、３９０カ所、３９１カ所、３９２カ所、３９３カ所、３９４カ所、３９５カ所、３９６カ所、３９７カ所、３９８カ所、３９９カ所、４００カ所、４０１カ所、４０２カ所、４０３カ所、４０４カ所、４０５カ所、４０６カ所、４０７カ所、４０８カ所、４０９カ所、４１０カ所、４１１カ所、４１２カ所、４１３カ所、４１４カ所、４１５カ所、４１６カ所、４１７カ所、４１８カ所、４１９カ所、４２０カ所、４２１カ所、４２２カ所、４２３カ所、４２４カ所、４２５カ所、４２６カ所、４２７カ所、４２８カ所、４２９カ所、４３０カ所、４３１カ所、４３２カ所、４３３カ所、４３４カ所、４３５カ所、４３６カ所、４３７カ所、４３８カ所、４３９カ所、４４０カ所、４４１カ所、４４２カ所、４４３カ所、４４４カ所、４４５カ所、４４６カ所、４４７カ所、４４８カ所、４４９カ所、４５０カ所、４５１カ所、４５２カ所、４５３カ所、４５４カ所、４５５カ所、４５６カ所、４５７カ所、４５８カ所、４５９カ所、４６０カ所、４６１カ所、４６２カ所、４６３カ所、４６４カ所、４６５カ所、４６６カ所、４６７カ所、４６８カ所、４６９カ所、４７０カ所、４７１カ所、４７２カ所、４７３カ所、４７４カ所、４７５カ所、４７６カ所、４７７カ所、４７８カ所、４７９カ所、４８０カ所、４８１カ所、４８２カ所、４８３カ所、４８４カ所、４８５カ所、４８６カ所、４８７カ所、４８８カ所、４８９カ所、４９０カ所、４９１カ所、４９２カ所、４９３カ所、４９４カ所、４９５カ所、４９６カ所、４９７カ所、４９８カ所、４９９カ所、５００カ所、５０１カ所、５０２カ所、５０３カ所、５０４カ所、５０５カ所、５０６カ所、５０７カ所、５０８カ所、５０９カ所、５１０カ所、５１１カ所、５１２カ所、５１３カ所、５１４カ所、５１５カ所、５１６カ所、５１７カ所、５１８カ所、５１９カ所、５２０カ所、５２１カ所、５２２カ所、５２３カ所、５２４カ所、５２５カ所、５２６カ所、５２７カ所、５２８カ所、５２９カ所、５３０カ所、５３１カ所、５３２カ所、５３３カ所、５３４カ所、５３５カ所、５３６カ所、５３７カ所、５３８カ所、５３９カ所、５４０カ所、５４１カ所、５４２カ所、５４３カ所、５４４カ所、５４５カ所、５４６カ所、５４７カ所、５４８カ所、５４９カ所、５５０カ所、５５１カ所、５５２カ所、５５３カ所、５５４カ所、５５５カ所、５５６カ所、５５７カ所、５５８カ所、５５９カ所、５６０カ所、５６１カ所、５６２カ所、５６３カ所、５６４カ所、５６５カ所、５６６カ所、５６７カ所、５６８カ所、５６９カ所、５７０カ所、５７１カ所、５７２カ所、５７３カ所、５７４カ所、５７５カ所、５７６カ所、５７７カ所、５７８カ所、５７９カ所、５８０カ所、５８１カ所、５８２カ所、５８３カ所、５８４カ所、５８５カ所、５８６カ所、５８７カ所、５８８カ所、５８９カ所、５９０カ所、５９１カ所、５９２カ所、５９３カ所、５９４カ所、５９５カ所、５９６カ所、５９７カ所、５９８カ所、５９９カ所、６００カ所、６０１カ所、６０２カ所、６０３カ所、６０４カ所、６０５カ所、６０６カ所、６０７カ所、６０８カ所、６０９カ所、６１０カ所、６１１カ所、６１２カ所、６１３カ所、６１４カ所、または６１５カ所（またはその中で導き出せる任意の範囲）の置換を含み得る。
置換は、配列番号２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、もしくは７１のいずれか、または配列番号１〜１９、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４５、４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６３、６４、６６〜７０、または７２〜７４のいずれかによってコードされるポリペプチドの１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位、１８３位、１８４位、１８５位、１８６位、１８７位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２００位、２０１位、２０２位、２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、２１３位、２１４位、２１５位、２１６位、２１７位、２１８位、２１９位、２２０位、２２１位、２２２位、２２３位、２２４位、２２５位、２２６位、２２７位、２２８位、２２９位、２３０位、２３１位、２３２位、２３３位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２４０位、２４１位、２４２位、２４３位、２４４位、２４５位、２４６位、２４７位、２４８位、２４９位、２５０位、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、２５６位、２５７位、２５８位、２５９位、２６０位、２６１位、２６２位、２６３位、２６４位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２７２位、２７３位、２７４位、２７５位、２７６位、２７７位、２７８位、２７９位、２８０位、２８１位、２８２位、２８３位、２８４位、２８５位、２８６位、２８７位、２８８位、２８９位、２９０位、２９１位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３００位、３０１位、３０２位、３０３位、３０４位、３０５位、３０６位、３０７位、３０８位、３０９位、３１０位、３１１位、３１２位、３１３位、３１４位、３１５位、３１６位、３１７位、３１８位、３１９位、３２０位、３２１位、３２２位、３２３位、３２４位、３２５位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位、３３５位、３３６位、３３７位、３３８位、３３９位、３４０位、３４１位、３４２位、３４３位、３４４位、３４５位、３４６位、３４７位、３４８位、３４９位、３５０位、３５１位、３５２位、３５３位、３５４位、３５５位、３５６位、３５７位、３５８位、３５９位、３６０位、３６１位、３６２位、３６３位、３６４位、３６５位、３６６位、３６７位、３６８位、３６９位、３７０位、３７１位、３７２位、３７３位、３７４位、３７５位、３７６位、３７７位、３７８位、３７９位、３８０位、３８１位、３８２位、３８３位、３８４位、３８５位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、３９１位、３９２位、３９３位、３９４位、３９５位、３９６位、３９７位、３９８位、３９９位、４００位、４０１位、４０２位、４０３位、４０４位、４０５位、４０６位、４０７位、４０８位、４０９位、４１０位、４１１位、４１２位、４１３位、４１４位、４１５位、４１６位、４１７位、４１８位、４１９位、４２０位、４２１位、４２２位、４２３位、４２４位、４２５位、４２６位、４２７位、４２８位、４２９位、４３０位、４３１位、４３２位、４３３位、４３４位、４３５位、４３６位、４３７位、４３８位、４３９位、４４０位、４４１位、４４２位、４４３位、４４４位、４４５位、４４６位、４４７位、４４８位、４４９位、４５０位、４５１位、４５２位、４５３位、４５４位、４５５位、４５６位、４５７位、４５８位、４５９位、４６０位、４６１位、４６２位、４６３位、４６４位、４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、４８４位、４８５位、４８６位、４８７位、４８８位、４８９位、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９４位、４９５位、４９６位、４９７位、４９８位、４９９位、５００位、５０１位、５０２位、５０３位、５０４位、５０５位、５０６位、５０７位、５０８位、５０９位、５１０位、５１１位、５１２位、５１３位、５１４位、５１５位、５１６位、５１７位、５１８位、５１９位、５２０位、５２１位、５２２位、５２３位、５２４位、５２５位、５２６位、５２７位、５２８位、５２９位、５３０位、５３１位、５３２位、５３３位、５３４位、５３５位、５３６位、５３７位、５３８位、５３９位、５４０位、５４１位、５４２位、５４３位、５４４位、５４５位、５４６位、５４７位、５４８位、５４９位、５５０位、５５１位、５５２位、５５３位、５５４位、５５５位、５５６位、５５７位、５５８位、５５９位、５６０位、５６１位、５６２位、５６３位、５６４位、５６５位、５６６位、５６７位、５６８位、５６９位、５７０位、５７１位、５７２位、５７３位、５７４位、５７５位、５７６位、５７７位、５７８位、５７９位、５８０位、５８１位、５８２位、５８３位、５８４位、５８５位、５８６位、５８７位、５８８位、５８９位、５９０位、５９１位、５９２位、５９３位、５９４位、５９５位、５９６位、５９７位、５９８位、５９９位、６００位、６０１位、６０２位、６０３位、６０４位、６０５位、６０６位、６０７位、６０８位、６０９位、６１０位、６１１位、６１２位、６１３位、６１４位、６５０位、７００位、７５０位、８００位、８５０位、９００位、１０００位、１５００位、または２０００位（またはその中で導き出せる任意の範囲）のアミノ酸におけるものであり得る。
本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、もしくは７１または配列番号１〜１９、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４５、４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６３、６４、６６〜７０、もしくは７２〜７４のいずれかによってコードされるポリペプチドの少なくとも、最大で、またはちょうど５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、１２９個、１３０個、１３１個、１３２個、１３３個、１３４個、１３５個、１３６個、１３７個、１３８個、１３９個、１４０個、１４１個、１４２個、１４３個、１４４個、１４５個、１４６個、１４７個、１４８個、１４９個、１５０個、１５１個、１５２個、１５３個、１５４個、１５５個、１５６個、１５７個、１５８個、１５９個、１６０個、１６１個、１６２個、１６３個、１６４個、１６５個、１６６個、１６７個、１６８個、１６９個、１７０個、１７１個、１７２個、１７３個、１７４個、１７５個、１７６個、１７７個、１７８個、１７９個、１８０個、１８１個、１８２個、１８３個、１８４個、１８５個、１８６個、１８７個、１８８個、１８９個、１９０個、１９１個、１９２個、１９３個、１９４個、１９５個、１９６個、１９７個、１９８個、１９９個、２００個、２０１個、２０２個、２０３個、２０４個、２０５個、２０６個、２０７個、２０８個、２０９個、２１０個、２１１個、２１２個、２１３個、２１４個、２１５個、２１６個、２１７個、２１８個、２１９個、２２０個、２２１個、２２２個、２２３個、２２４個、２２５個、２２６個、２２７個、２２８個、２２９個、２３０個、２３１個、２３２個、２３３個、２３４個、２３５個、２３６個、２３７個、２３８個、２３９個、２４０個、２４１個、２４２個、２４３個、２４４個、２４５個、２４６個、２４７個、２４８個、２４９個、２５０個、３００個、４００個、５００個、５５０個、１０００個またはそれよりも多く（またはその中で導き出せる任意の範囲）のアミノ酸という固定された長さのものであり得る。
置換バリアントは、一般には、タンパク質内の１つまたは複数の部位において１つのアミノ酸を別のアミノ酸と交換することを含有し、ポリペプチドの１つまたは複数の特性が、他の機能または特性の喪失を伴ってまたは伴わずにモジュレートされるように設計することができる。置換は、保存的、すなわち、１つのアミノ酸が形状および電荷が同様であるアミノ酸で置き換えられるものであり得る。保存的置換は当技術分野で周知であり、それらとして、例えば、アラニンからセリンへの変化；アルギニンからリシンへの変化；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへの変化；アスパラギン酸からグルタミン酸への変化；システインからセリンへの変化；グルタミンからアスパラギンへの変化；グルタミン酸からアスパラギン酸への変化；グリシンからプロリンへの変化；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへの変化；イソロイシンからロイシンまたはバリンへの変化；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへの変化；リシンからアルギニンへの変化；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへの変化；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの変化；セリンからトレオニンへの変化；トレオニンからセリンへの変化；トリプトファンからチロシンへの変化；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変化；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化が挙げられる。あるいは、置換は、非保存的であり得、したがって、ポリペプチドの機能または活性が影響を受ける。非保存的な変化は、一般には、例えば、極性もしくは荷電アミノ酸を非極性もしくは非荷電アミノ酸に置換すること、または逆に、非極性もしくは非荷電アミノ酸を極性もしくは荷電アミノ酸に置換することなど、残基を化学的に異なる残基で置換することを伴う。
タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組換える、または合成することができる。あるいは、非組換えまたは組換えタンパク質を細菌から単離することができる。そのようなバリアントを含有する細菌が組成物および方法において機能することも意図されている。したがって、タンパク質を単離する必要はない。
「機能的に等価のコドン」という用語は、本明細書では、同じアミノ酸をコードするコドン、例えば、アルギニンまたはセリンに対する６つのコドンを指すために使用され、また、生物学的に等価のアミノ酸をコードするコドンも指す。
アミノ酸配列および核酸配列は、追加的なＮ末端またはＣ末端アミノ酸、またはそれぞれ５’または３’配列などの追加的な残基を含んでよく、それでも、配列が、タンパク質の発現に関する場合にはタンパク質の生物学的活性の維持を含めた上記の基準を満たす限りは、本質的に、本明細書に開示される配列の１つに記載される通りであることも理解されよう。末端配列の付加は、特に、例えば、コード領域の５’または３’部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含み得る核酸配列に適用される。
以下は、タンパク質のアミノ酸を変化させて、等価のまたはさらには改善された第２世代分子を作り出すことに基づく考察である。例えば、タンパク質構造において、相互作用的結合能の感知できる喪失なしにある特定のアミノ酸を他のアミノ酸の代わりに使用することができる。例えば、酵素的触媒ドメインまたは相互作用成分などの構造は、そのような機能が維持されるように置換されたアミノ酸を有し得る。タンパク質の相互作用能および性質によりタンパク質の生物学的機能活性が定義されるので、ある特定のアミノ酸置換は、タンパク質配列において、およびその基礎をなすＤＮＡコード配列において行うことができ、それにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質が生じる。したがって、本発明者らは、遺伝子の生物学的有用性または活性の感知できる喪失は伴わずに、それらのＤＮＡ配列に種々の変化をなすことができることを意図している。
他の実施形態では、１つまたは複数の置換を導入することによるポリペプチドの機能の変更が意図されている。例えば、相互作用成分の相互作用的結合能を改変する意図で、タンパク質構造においてある特定のアミノ酸を他のアミノ酸の代わりに使用することができる。例えば、タンパク質相互作用ドメイン、核酸相互作用ドメイン、および触媒部位などの構造が、そのような機能を変更するためのアミノ酸置換を有し得る。タンパク質の相互作用能および性質によりタンパク質の生物学的機能活性が定義されるので、ある特定のアミノ酸置換は、タンパク質配列において、およびその基礎をなすＤＮＡコード配列において行うことができ、それにもかかわらず、異なる特性を有するタンパク質が生じる。したがって、本発明者らは、遺伝子の生物学的有用性または活性に感知できる変更を伴ってそれらのＤＮＡ配列に種々の変化をなすことができることを意図している。
そのような変化をなすことにおいては、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することができる。相互作用的生物学的機能をタンパク質に付与することにおけるハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は当技術分野において一般に理解されている（Kyte and Doolittle, 1982）。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性が結果生じるタンパク質二次構造に寄与し、二次構造により今度はタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などの相互作用が規定されることが認められている。
親水性に基づいて同様のアミノ酸の置換を有効に行うことができることも当技術分野において理解される。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号には、タンパク質の最大の局所的な平均親水性が、近接するアミノ酸の親水性によって支配されるので、タンパク質の生物学的特性と相関することが記載されている。アミノ酸を同様の親水性値を有する別のアミノ酸の代わりに使用することができ、それでもなお生物学的に等価であり、かつ免疫学的に等価であるタンパク質が生じることが理解される。
上に概説されている通り、アミノ酸置換は、一般には、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。種々の前述の特徴が考慮される例示的な置換は周知であり、それらとして、アルギニンおよびリシン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のタンパク質の全部または一部は、従来の技法に従って溶液中でまたは固体支持体上で合成することもできる。種々の自動合成機が市販されており、公知のプロトコールに従って使用することができる。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれるStewart and Young,(1984)；Tam et al.,(1983)；Merrifield,(1986)；およびBarany and Merrifield(1979)を参照されたい。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、発現に適した条件下で培養する組換えＤＮＡ技術を使用することができる。
一実施形態は、タンパク質の産生および／または提示のための、微生物を含めた細胞への遺伝子移入の使用を含む。目的のタンパク質の遺伝子を適切な宿主細胞に移入し、その後、細胞を適切な条件下で培養することができる。事実上あらゆるポリペプチドをコードする核酸を使用することができる。組換え発現ベクター、およびその中に含まれるエレメントの生成は本明細書で考察している。あるいは、産生されるタンパク質は、タンパク質産生のために使用される細胞によって通常合成される内因性タンパク質であり得る。
Ｖ．ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の作製方法
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、任意の適切な方法（複数可）によって作製することができる。方法（複数可）は、細胞に対する１つもしくは複数の改変のために１つもしくは複数の連続的なステップを利用し、かつ／または、細胞に対する１つもしくは複数の改変のために１つもしくは複数の同時に行われるステップを利用し得る。特定の実施形態では、細胞の出発供給源を、ｉＮＫＴ細胞として機能的になるように改変し、その後、イメージングできること、および／または選択的に死滅させることができること、および／または同種異系に使用可能にできることなどの１つまたは複数の追加的な特徴を細胞に付加するための１つまたは複数のステップを行う。特定の実施形態では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を生成するためのプロセスの少なくとも一部を特定のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系で行う。特定のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系の例は、ある特定の細胞を高効率および高収量で分化させることを可能にするものである。特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系は人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系である。
特定の場合では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を以下によって生成することができる：１）ドナーＨＳＣを、ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現するように遺伝子改変すること（例えば、レンチウイルスベクターによって）およびＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ分子の発現を排除すること（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集によって）；２）ＡＴＯ培養によってｉｎ ｖｉｔｒｏでｉＮＫＴ細胞に分化させること、３）ｉｎ ｖｉｔｒｏでｉＮＫＴ細胞を精製し、増大させること、ならびに４）製剤化し、凍結保存し、および／または使用すること。
本開示の特定の実施形態は、クローンインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の集団を調製する方法であって、ａ）ヒト末梢血液細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ３４＋細胞を選択するステップと、ｂ）ヒトｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップと、ｃ）単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ遺伝子の発現を排除するステップと、ｄ）ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で培養してｉＮＫＴ細胞を産生させるステップであって、ＡＴＯ系が、ノッチリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む３Ｄ細胞凝集体および無血清培地を含む、ステップとを含む方法を提供する。方法は、ＣＤ３４−細胞を単離するステップをさらに含み得る。代替の実施形態では、２Ｄ培養系または他の形態の３Ｄ培養系（例えば、ＦＴＯＣ様培養、マトリゲルを利用した培養（metrigel-aided culture））などの、ＡＴＯ系とは別の培養系を使用する。
本開示の特定の態様は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞もしくは前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または幹細胞もしくは前駆細胞などの分化の程度が低い細胞からｉＮＫＴ細胞を作製するための新規の三次元細胞培養系に関する。少なくとも、例えば、胎児肝臓、臍帯血、および末梢血ＣＤ３４＋細胞（Ｇ−ＣＳＦにより動員されたものまたは非Ｇ−ＣＳＦにより動員されたもののいずれか）を含めた種々のリソースに由来する任意の型の幹細胞を利用することができる。
特定の実施形態では、系は、無血清培地の使用を伴う。ある特定の態様では、系は、三次元細胞凝集体を培養するための細胞発生に適した無血清培地を使用する。そのような系では、十分な量のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞が生じる。本開示の複数の実施形態では、３Ｄ細胞凝集体を、インスリンを含む無血清培地中、幹細胞または前駆細胞からＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞への、または前駆体からＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化に十分な期間にわたって培養する。
細胞培養組成物の実施形態は、頑強かつ高度に再現性のあるヒトＨＳＣからＴ細胞への分化を容易にするために高度に標準化された無血清成分および間質細胞株を使用するＡＴＯ ３Ｄ培養を含む。ある特定の実施形態では、ＡＴＯにおける細胞分化は、内因性胸腺リンパ球新生を密接に模倣するものであり、単層共培養とは対照的に、機能的なＵＨＳＣ−ｉＮＫＴの効率的な正の選択が支持される。３Ｄ培養組成物のある特定の態様では、無血清条件を使用し、ヒト胸腺組織または独自の足場材料の使用を回避し、供給源細胞からの十分に機能的な成熟ヒトＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の正の選択および頑強な生成を容易にする。
特定の実施形態では、このＡＴＯ ３Ｄ培養系は、ＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、Ｂ２７、およびアスコルビン酸を含有する最適化された培地の存在下、ノッチリガンドを発現する間質細胞とのヒトＨＳＣの３Ｄ構造における凝集を含み得る。空気−流体界面での培養を可能にする条件も存在し得る。可溶性因子（サイトカイン、アスコルビン酸、Ｂ２７成分、および間質細胞由来の因子）からのＡＴＯ内のコンビナトリアルシグナル伝達が、造血細胞と間質細胞の間の３Ｄ細胞間相互作用と共に、ヒトＴ系列拘束、正の選択、および機能的な成熟Ｔ細胞への効率的な分化を容易にすることが確認されている。
特定の実施形態では、３Ｄ細胞凝集体は、ＣＤ３４＋形質導入細胞と間質細胞の選択された集団を物理的マトリックスまたは足場上で混合することによって作り出される。方法は、ＣＤ３４＋形質導入細胞および間質細胞を遠心分離して、物理的マトリックスまたは足場上に置かれる細胞ペレットを形成することをさらに含み得る。間質細胞によって発現されるノッチリガンドは、インタクトな、部分的な、または改変されたＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、またはこれらの組合せであり得る。特定の場合では、ノッチリガンドは、例えば、ヒトＤＬＬ１などのヒトノッチリガンドである。
ｉＮＫＴ細胞を産生させるために利用されるＡＴＯ系は、間質細胞とＣＤ３４＋細胞のある特定の比を有し得る。特定の場合では、間質細胞とＣＤ３４＋細胞の比は、約１：５〜１：２０である。間質細胞は、マウス間質細胞株、ヒト間質細胞株、一次間質細胞の選択された集団、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて多能性幹細胞から分化した間質細胞の選択された集団、またはこれらの組合せであり得る。間質細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて造血幹細胞または前駆細胞から分化した間質細胞の選択された集団であり得る。
クローンｉＮＫＴ細胞の集団を調製する方法では、ＨＬＡ−Ｉ分子およびＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を欠くｉＮＫＴ細胞の選択は、ｉＮＫＴ細胞に結合し、それを正に選択し、ＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ陰性細胞を負に選択する磁気ビーズにｉＮＫＴ細胞を接触させることを含み得る。特定の実施形態では、磁気ビーズは、ヒトｉＮＫＴ ＴＣＲ、ＨＬＡ−Ｉ分子、またはＨＬＡ−ＩＩ分子を認識するモノクローナル抗体でコーティングされている。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、クローン６Ｂ１１（ヒトＴＣＲ Ｖα２４−Ｊα１８を認識し、したがって、ヒトｉＮＫＴインバリアントＴＣＲアルファ鎖を認識する）、クローン２Ｍ２（ヒトＢ２Ｍを認識し、したがって、細胞表面にディスプレイされたヒトＨＬＡ−Ｉ分子を認識する）、クローンＷ６／３２（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを認識し、したがって、ヒトＨＬＡ−Ｉ分子を認識する）、およびクローンＴｕ３９（ヒトＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱを認識し、したがって、ヒトＨＬＡ−ＩＩ分子を認識する）である。
調製方法によって作製された細胞を凍結させることができる。作製された細胞をデキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯを含む溶液中に入れることができる。溶液は、無菌性、非発熱性、かつ等張性であり得る。
特定の実施形態では、ＡＴＯ系では、ＣＤ３４−細胞を含み得るフィーダー細胞を利用する。
調製方法は、選択されたｉＮＫＴ細胞を活性化し、増大させることをさらに含み得る。例えば、選択されたｉＮＫＴ細胞は、アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）で活性化されたものである。フィーダー細胞は、α−ＧＣでパルスされたものであり得る。
本開示の調製方法では、クローンｉＮＫＴ細胞を少なくとも約１０２〜１０６個含む、クローンｉＮＫＴ細胞の集団を作製することができる。当該方法では、総細胞少なくとも約１０６〜１０１２個を含む細胞集団を作製することができる。作製された細胞集団を凍結させ、次いで解凍することができる。調製方法の一部の場合では、方法は、凍結させ、解凍した細胞集団に、例えば１つまたは複数の治療用遺伝子産物をコードする１つまたは複数の追加的な核酸などの、１つまたは複数の追加的な核酸を導入することをさらに含む。
特定の実施形態では、開発されている通り、ヒトＤＬＬ１（今後はＭＳ５−ｈＤＬＬ１）が形質導入されたＭＳ−５マウス間質細胞株を、ヒト臍帯血、骨髄、またはＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血から単離されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣと共に凝集させることを伴う３Ｄ培養組成物（例えば、ＡＴＯ作製）の方法が提供され得る。最大１×１０６個のＨＳＰＣをＭＳ５−ｈＤＬＬ１細胞と最適化された比（一般にはＨＳＰＣ対間質細胞１：１０）で混合する。
例えば、凝集は、混合した細胞浮遊液の遠心分離（「圧縮凝集」）、その後の無細胞上清の吸引によって実現される。特定の実施形態では、次いで、細胞ペレットを、分化培地５〜１０ｕｌ中のスラリーとして吸引し、液滴として０．４ｕｍのナイロントランスウェル培養インサートに移すことができ、これを分化培地のウェル内に浮かせ、それにより、インサートの底部が培地と接触し、上部が空気と接触することが可能になる。
例えば、分化培地は、ＲＰＭＩ−１６４０、５ｎｇ／ｍｌのヒトＦＬＴ３Ｌ、５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−７、４％無血清Ｂ２７サプリメント、および３０ｕＭのＬ−アスコルビン酸を含み得る。培地を３〜４日毎に培養インサートの周辺から完全に置き換えることができる。培養の最初の２週間、細胞凝集体はＡＴＯとして自己組織化し得、初期Ｔ系列拘束および分化が起こる。ある特定の態様では、ＡＴＯを少なくとも６週間にわたって培養して、最適なＴ細胞分化を可能にする。ＡＴＯからの造血細胞の取り出しは、ピペット操作によってＡＴＯを脱凝集させることによって実現される。
プロトコールのバリエーションにより、特に有効性に対する影響が様々な代替成分を使用することが可能になる：
基本培地ＲＰＭＩをいくつかの市販の代替物（例えば、ＩＭＤＭ）の代わりに使用することができる。
使用される間質細胞株は、以前に記載されたマウス骨髄細胞株（Itoh et al, 1989）であるＭＳ−５であるが、ＭＳ−５を同様のマウス間質細胞株（例えば、ＯＰ９、Ｓ１７）、ヒト間質細胞株（例えば、ＨＳ−５、ＨＳ−２７ａ）、一次ヒト間質細胞、またはヒト多能性幹細胞由来の間質細胞の代わりに使用することができる。
間質細胞株にヒトＤＬＬ１ ｃＤＮＡをコードするレンチウイルスで形質導入する。しかし、遺伝子送達の方法ならびにノッチリガンド遺伝子は変えることができる。代替ノッチリガンド遺伝子としては、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２などが挙げられる。ノッチリガンドとして、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７９５，４０４号および同第８，３７７，８８６号に記載されているものも挙げられる。ノッチリガンドとして、さらに、デルタ１、３、および４およびＪａｇｇｅｄ１、２も挙げられる。
ＨＳＣの型および供給源は、骨髄、臍帯血、末梢血、胸腺、もしくは他の一次供給源；またはヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＨＳＣを含んでよい。
サイトカイン条件を変えることができる：例えば、ＦＬＴ３ＬおよびＩＬ−７のレベルを変化させて、Ｔ細胞分化カイネティクスを変更することができる；幹細胞因子（ＳＣＦ／キットリガンド）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−２、ＩＬ−１５などの他の造血サイトカインを添加することができる。
抗原特異的Ｔ細胞を生成するため、ならびに正の選択および負の選択をモデル化するために、ある特定の成分に遺伝子改変を導入することもできる。これらの改変の例としては、抗原特異的な、対立遺伝子排除されたナイーブＴ細胞を生成するために、ＨＳＣに抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレンチウイルスベクターで形質導入すること；系列拘束を特殊化されたリンパ系細胞へと方向付けるためにＨＳＣに遺伝子（複数可）を形質導入することが挙げられる。例えば、ＡＴＯにおいて機能的なｉＮＫＴ細胞を生成するために、ＨＳＣにインバリアントナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ）に関連するＴＣＲを形質導入する；ＡＴＯにおけるＴＣＲで操作されたＴ細胞もしくは操作されていないＴ細胞の両方の正の選択および成熟化を増強するために、ＡＴＯ間質細胞株（例えば、ＭＳ５−ｈＤＬＬ１）にヒトＭＨＣ遺伝子（例えば、ヒトＣＤ１ｄ遺伝子）を形質導入する；かつ／または、ＡＴＯにおけるＣＡＲ Ｔ細胞の正の選択を増強するために、ＡＴＯ間質細胞株に抗原とそれに加えて共刺激分子もしくはサイトカインを形質導入する。
操作されたｉＮＫＴ細胞の作製では、ヒト末梢血液細胞（ＰＢＭＣ）由来のＣＤ３４＋細胞を、ある特定の外因性遺伝子（複数可）を導入することによって、およびある特定の内因性遺伝子（複数可）をノックアウトすることによって改変することができる。当該方法は、１つまたは複数の核酸を細胞に導入する前に、選択されたＣＤ３４＋細胞を培地中で培養するステップをさらに含み得る。培養するステップは、選択されたＣＤ３４＋細胞を、１つまたは複数の成長因子を含む培地と一緒にインキュベートすることを含み得、一部の場合では、１つまたは複数の成長因子は、例えば、ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ−３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含み得る。成長因子は、約５ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌの間などのある特定の濃度であってもそうでなくてもよい。
特定の方法では、細胞に導入される核酸（複数可）は、α−ＴＣＲおよびβ−ＴＣＲをコードする核酸配列を含む１つまたは複数の核酸である。当該方法は、選択されたＣＤ３４＋細胞に自殺遺伝子をコードする核酸を導入するステップをさらに含み得る。特定の態様では、１つの核酸がα−ＴＣＲおよびβ−ＴＣＲの両方をコードする、または１つの核酸がα−ＴＣＲ、β−ＴＣＲ、および自殺遺伝子をコードする。自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子に由来するものなどのウイルスＴＫ遺伝子を含めたチミジンキナーゼ（ＴＫ）などの、酵素に基づくものであり得る。自殺遺伝子は、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体などの基質によって活性化され得る。細胞を、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドをコードする外因性核酸を含むように操作することができる。一部の場合では、自殺遺伝子産物は、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチド、例えば、ｓｒ３９ＴＫである。
細胞を、例えば、ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、および／またはＨＬＡ−Ｉ分子およびＨＬＡ−ＩＩ分子をコードする遺伝子の機能的な発現を妨害することによって、ＨＬＡ−Ｉ分子および／またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を欠くように操作することができる。作製方法では、単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ分子の表面発現を排除するステップは、ＣＲＩＳＰＲ、およびＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、または個々のＨＬＡ−Ｉ分子もしくはＨＬＡ−ＩＩ分子に対応する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を細胞に導入することを含み得る。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲまたは１つもしくは複数のｇＲＮＡを、電気穿孔または脂質媒介性トランスフェクションによって細胞にトランスフェクトする。特定の実施形態では、ＴＣＲ受容体をコードする核酸を、例えば、少なくともレンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスを含めたウイルスベクターなどの組換えベクターを使用して細胞に導入する。
操作されたｉＮＫＴ細胞の製造では、細胞は、外部から添加されたアスコルビン酸を含むものを含めた特定の無血清培地中に存在し得る。特定の態様では、無血清培地は、外部から添加されたＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インターフェロン−ラムダ、ＴＳＬＰ、チモペンチン、プレイオトロフィン、ミッドカイン、またはこれらの組合せをさらに含む。無血清培地は、ビオチン、ＤＬアルファ酢酸トコフェロール、ＤＬアルファトコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２、またはこれらの組合せもしくはこれらの塩を含めたビタミンをさらに含み得る。無血清培地は、アルブミンまたはウシ血清アルブミン、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、またはこれらの組合せなどの、１つまたは複数の外部から添加された（または外部から添加されたものではない）タンパク質をさらに含み得る。無血清培地は、コルチコステロン、Ｄ−ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ−カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、またはトリヨード−Ｌ−チロニン、またはこれらの組合せをさらに含み得る。無血清培地は、Ｂ−２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ−２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２１（商標）サプリメント、またはこれらの組合せを含み得る。アミノ酸（アルギニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、もしくはバリン、またはこれらの組合せを含む）、単糖、および／または無機イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素、もしくはリン、またはこれらの組合せもしくは塩を含む）が無血清培地中に存在し得る。無血清培地は、モリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、もしくはマンガン、またはこれらの組合せをさらに含み得る。
本明細書に記載の３Ｄ細胞凝集体の培養のため、ならびにＴ細胞の作製および／またはそれらの正／負の選択のための細胞培養条件を提供することができる。ある特定の態様では、選択された集団の出発細胞は、少なくともまたは約１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個またはその中で導き出せる任意の範囲の細胞を含み得る。出発細胞集団の播種密度は、１ｍｌ当たり細胞少なくともまたは約１０個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、またはその中で導き出せる任意の範囲であり得る。
３Ｄ細胞凝集体またはそれらの後代細胞の培養に使用する培養容器は、特にこれらに限定されないが、その中で幹細胞を培養することができるものである限りは、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリ皿、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、管、トレー、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ、およびローラービンを含んでよい。幹細胞は、培養の必要に応じて、少なくともまたは約０．２ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、またはその中で導き出せる任意の範囲の体積で培養することができる。ある特定の実施形態では、培養容器は、バイオリアクターであってよく、これは、生物学的に活性な環境を支持する任意のデバイスまたは系を指し得る。バイオリアクターの体積は、少なくともまたは約２リットル、４リットル、５リットル、６リットル、８リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、５００リットル、１立法メートル、２立法メートル、４立法メートル、６立法メートル、８立法メートル、１０立法メートル、１５立法メートル、またはその中で導き出せる任意の範囲であり得る。
培養容器は、細胞接着性または非接着性であり得、目的に応じて選択される。細胞接着性培養容器には、細胞に対する容器表面の接着性を改善するために細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの細胞接着のための任意の基材をコーティングすることができる。細胞接着のための基材は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用する場合）を付着させることが意図された任意の材料のものであってよい。細胞接着のための基材としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ラミニン、およびフィブロネクチンおよびそれらの混合物、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、および溶解させた細胞膜調製物が挙げられる。
種々の定義されたマトリックス成分を培養方法または組成物に使用することができる。例えば、その全体が参照により組み込まれるLudwig et al. (2006a; 2006b)に記載されている通り、多能性細胞を成長させるための固体支持体をもたらす手段として、組換えＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、およびビトロネクチンの組合せを使用して、培養表面をコーティングすることができる。
マトリックス組成物を表面上に固定して、細胞の支持体をもたらすことができる。マトリックス組成物は、１つまたは複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質および水性溶媒を含み得る。「細胞外マトリックス」という用語は、当技術分野において認められている。その成分として、以下のタンパク質のうちの１つまたは複数が挙げられる：フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、アンカリン、コンドロネクチン、リンクタンパク質、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、アンジュリン（undulin）、エピリグリン、およびカリニン。他の細胞外マトリックスタンパク質は、参照により本明細書に組み込まれるKleinman et al.,(1993)に記載されている。今後発見される可能性がある、現在のところ知られていない細胞外マトリックスも、その細胞外マトリックスとしての特徴付けは当業者には容易に決定できるので、「細胞外マトリックス」という用語に包含されるものとする。
一部の態様では、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬであり得る。一部の実施形態では、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約１μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬである。より好ましい実施形態では、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約５μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬである。
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は、天然起源であり、ヒトまたは動物組織から精製されたものであってよい。あるいは、ＥＣＭタンパク質は、本質的に、遺伝子操作された組換えタンパク質または合成タンパク質であってよい。ＥＣＭタンパク質は、タンパク質全体であってもよく、ペプチド断片の形態、ネイティブな形態または操作された形態であってもよい。細胞培養のためのマトリックスとして有用であり得るＥＣＭタンパク質の例としては、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンが挙げられる。一部の実施形態では、マトリックス組成物は、フィブロネクチンの合成により生成されたペプチド断片または組換えフィブロネクチンを含む。
さらに別の実施形態では、マトリックス組成物は、少なくともフィブロネクチンとビトロネクチンの混合物を含む。一部の他の実施形態では、マトリックス組成物は、ラミニンを含むことが好ましい。
マトリックス組成物は、単一の型の細胞外マトリックスタンパク質を含むことが好ましい。一部の実施形態では、マトリックス組成物は、特に前駆細胞の培養に使用するためのフィブロネクチンを含む。例えば、適切なマトリックス組成物は、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．ｏｆ Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．（ＢＤ）により販売されているヒトフィブロネクチン（Ｃａｔ＃３５４００８）などのヒトフィブロネクチンをダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中にタンパク質濃度が５μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬになるように希釈することによって調製することができる。特定の例では、マトリックス組成物は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）などのフィブロネクチン断片を含む。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）は、ヒトフィブロネクチンの中心細胞結合性ドメイン（ＩＩＩ型反復、８、９、１０）、高親和性ヘパリン結合性ドメインＩＩ（ＩＩＩ型反復、１２、１３、１４）、および選択的スプライシングを受けたＩＩＩＣＳ領域内のＣＳ１部位を含有する約６３ｋＤａのタンパク質（５７４アミノ酸）である。
一部の他の実施形態では、マトリックス組成物は、ラミニンを含み得る。例えば、適切なマトリックス組成物は、ラミニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）；Ｃａｔ＃Ｌ６２７４およびＬ２０２０）をダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中にタンパク質濃度が５μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌになるように希釈することによって調製することができる。
一部の実施形態では、マトリックス組成物は、マトリックスまたはその成分タンパク質がヒト起源のものだけであるという点でゼノフリーである。これは、ある特定の研究への適用に関して望ましい。例えば、ヒト細胞を培養するためのゼノフリーマトリックスでは、ヒト起源のマトリックス成分を使用することができ、あらゆる非ヒト動物成分を排除することができる。ある特定の態様では、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を組成物の培養の基材として除外することができる。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、マウス腫瘍細胞によって分泌されるゼラチン質のタンパク質混合物であり、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から市販されている。この混合物は、多くの組織において見いだされる複雑な細胞外の環境と似ており、細胞生物学者に細胞培養のための基材として頻繁に使用されるが、望ましくないゼノ抗原または夾雑物が導入される可能性がある。
ある特定の実施形態では、外因性核酸を含有する細胞を、発現ベクターまたは外因性核酸にマーカーを含めることによってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで同定することができる。そのようなマーカーにより、細胞に識別可能な変化が付与され、それにより、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定が可能になる。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものであり得る。正の選択マーカーは、そのマーカーが存在することによりその選択が許容されるものであり得、一方、負の選択マーカーは、それが存在することによりその選択が妨げられるものである。正の選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
通常、薬物選択マーカーを含めることにより、形質転換体のクローニングおよび同定が補助され、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が有用な選択マーカーである。条件の実行に基づいた形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色分析を基礎とするＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含めた他の型のマーカーも意図されている。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの、負の選択マーカーとしてスクリーニング可能な酵素を利用することができる。免疫学的マーカーを場合によってＦＡＣＳ分析と併せてどのように使用するかも当業者であれば分かるはずである。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現させることができる限りは重要ではないと考えられる。選択およびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は当業者に周知である。
選択可能なマーカーは、実験微生物学、分子生物学、および遺伝子工学において、トランスフェクションまたは外来ＤＮＡを細胞に導入することが意図された他の手順の成功を示すために使用されるレポーター遺伝子の一種を含み得る。選択可能なマーカーは、多くの場合、抗生物質耐性遺伝子である。外来ＤＮＡを導入するための手順に供された細胞を、抗生物質を含有する培地で成長させ、成長することができた細胞は、導入された遺伝子材料が首尾よく取り込まれ、発現されたものである。選択可能なマーカーの例としては、ジェネテシンに対する抗生物質耐性を付与する、Ｔｎ５由来のＡｂｉｃｒ遺伝子またはＮｅｏ遺伝子が挙げられる。
スクリーニング可能なマーカーは、研究者が望ましい細胞と望ましくない細胞を識別することを可能にするレポーター遺伝子を含み得る。本発明のある特定の実施形態では、特定の細胞系列を示すためにレポーター遺伝子を利用する。例えば、レポーター遺伝子を、発現エレメント内に位置させ、通常は同時発現のために心室性または心房性の選択的遺伝子のコード領域に付随する心室性または心房性の選択的調節エレメントの制御下に置くことができる。レポーターにより、特定の系列の細胞を、薬物または他の選択圧力下に置くまたは他の方法で細胞生存能力を危うくすることなく単離することが可能になる。
そのようなレポーターの例としては、細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ４、ＨＡエピトープ）、蛍光タンパク質、抗原性決定因子および酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子が挙げられる。ベクターを含有する細胞を、例えば、細胞表面タンパク質またはベクターにコードされる酵素によって蛍光産物に変換することができる基質に対する蛍光タグ付けされた抗体を使用してＦＡＣＳによって単離することができる。
特定の実施形態では、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質である。可視光線スペクトルほぼ全体にわたる蛍光発光スペクトルプロファイルを特色とする広範囲の蛍光タンパク質遺伝子バリアントが開発されている。元のＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａクラゲ緑色蛍光タンパク質における変異誘発の試みの結果、青色から黄色までにわたり、生物学的研究において最も広く使用されているｉｎ ｖｉｖｏレポーター分子の一部である新しい蛍光プローブがもたらされた。オレンジ色および赤色のスペクトル領域を放出する、より長い波長の蛍光タンパク質がイソギンチャク（marine anemone）、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｔｒｉａｔａ、およびＡｎｔｈｏｚｏａ綱に属する造礁サンゴから開発された。青緑色、緑色、黄色、オレンジ色、および深い赤色の蛍光発光を有する同様のタンパク質を産生させるために、さらに他の種が調査されている。蛍光タンパク質の輝度および安定性を改善し、したがって、それらの全体的な有用性を改善するために、開発研究の試みが行われている。
ある特定の実施形態では、細胞を、分化の前、またはその後に細胞の遺伝子操作によって１つまたは複数の遺伝子変更を含有するようにすることができる（ＵＳ２００２／０１６８７６６）。細胞は、人工的操作の任意の適切な手段によって外因性核酸またはポリヌクレオチドが細胞に移入されている場合、または、細胞が、前記ポリヌクレオチドを受け継いだ元々変更された細胞の後代である場合、「遺伝子が変更された」、「遺伝子改変された」または「トランスジェニック」と言える。例えば、制限された発生系列細胞または最終分化細胞に進む前、またはその後に、テロメラーゼ逆転写酵素を発現するように細胞の遺伝子変更を行うことにより、細胞をそれらの複製潜在性が増加するように処理することができる（米国特許出願公開第２００３／００２２３６７号）。
ある特定の実施形態では、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーなどのマーカーを発現ベクターに含めることにより、外因性核酸構築物を含有する細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで同定することができる。そのようなマーカーにより、識別可能な変化が細胞に付与され、それにより、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定が可能になる、または、組織特異的プロモーターを使用することにより、分化した心臓細胞の富化もしくは同定が助長される。例えば、心筋細胞分化の態様では、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、サルコメアミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、Ｎ−カドヘリン、□１−アドレナリン受容体、ＡＮＦ、転写因子のＭＥＦ−２ファミリー、クレアチンキナーゼ ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン、または心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）のプロモーターなどの心臓特異的プロモーターを使用することができる。ニューロン分化の態様では、これだけに限定されないが、ＴｕＪ−１、Ｍａｐ−２、Ｄｃｘまたはシナプシンを含めた神経特異的プロモーターを使用することができる。肝細胞分化の態様では、これだけに限定されないが、ＡＴＴ、Ｃｙｐ３ａ４、ＡＳＧＰＲ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａまたはＡＦＰを含めた胚体内胚葉特異的プロモーターおよび／または肝細胞特異的プロモーターを使用することができる。
一般に、選択可能なマーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。正の選択可能なマーカーは、そのマーカーが存在することによりその選択が許容されるものであり、一方、負の選択可能なマーカーは、それが存在することによりその選択が妨げられるものである。正の選択可能なマーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
通常、薬物選択マーカーを含めることにより、形質転換体のクローニングおよび同定が補助され、例えば、ブラストサイジン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が有用な選択可能なマーカーである。条件の実行に基づく形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色分析を基礎とするＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含めた他の型のマーカーも意図されている。あるいは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのスクリーニング可能な酵素を利用することができる。免疫学的マーカーを場合によってＦＡＣＳ分析と併せてどのように使用するかも当業者であれば分かるはずである。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現させることができるものである限りは重要ではないと考えられる。選択可能なおよびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は当業者に周知である。
例えば、１つまたは複数の特色を付加するまたは低減するために細胞を遺伝子改変する実施形態では、遺伝子改変は任意の適切な方法によって行うことができる。例えば、外因性核酸を細胞に導入するため、またはゲノムＤＮＡを編集するために、遺伝子編集、相同組換えまたは非相同組換え、ＲＮＡ媒介性遺伝子送達または任意の従来の核酸送達方法などの任意の遺伝子改変組成物または方法を使用することができる。遺伝子改変方法の非限定的な例としては、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術によるものなどの遺伝子編集法を挙げることができる。
遺伝子改変は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける選択またはスクリーニングまたはイメージングを補助する選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーを導入することも含み得る。特に、ｉｎ ｖｉｖｏイメージング剤または自殺遺伝子を外因的に発現させることまたは出発細胞もしくは後代細胞に付加することができる。さらなる態様では、方法は、画像誘導養子細胞療法を伴い得る。
特定の実施形態
本開示の特定の実施形態では、クローンインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞を含む細胞集団を調製する方法であって、ａ）ヒト末梢血液細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ３４＋細胞を選択するステップと、ｂ）ＣＤ３４＋細胞を、ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ−３リガンド、およびヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む成長因子を含む培地中で培養するステップと、ｃ）選択されたＣＤ３４＋細胞に、α−ＴＣＲ、β−ＴＣＲ、およびチミジンキナーゼをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入するステップと、ｄ）選択されたＣＤ３４＋細胞に、Ｃａｓ９ならびにベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）および／またはＣＴＩＩＡに対するｇＲＮＡを導入して、Ｂ２Ｍ遺伝子またはＣＴＩＩＡ遺伝子の発現を妨害し、したがって、ＨＬＡ−Ｉ分子および／またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を排除するステップと、ｅ）形質導入された細胞を、外因性ノッチリガンドを発現する照射間質細胞株と一緒に２〜１２週間（または２〜１０週間または６〜１２週間）にわたって培養して、ｉＮＫＴ細胞を３Ｄ凝集体細胞培養で増大させるステップと、ｆ）ＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ分子の表面発現を欠くｉＮＫＴ細胞を選択するステップと、ｇ）選択されたｉＮＫＴ細胞を照射フィーダー細胞と一緒に培養するステップとを含む方法が提供される。特定の実施形態では、選択されたＣＤ３４＋細胞から１０８〜１０１３個のｉＮＫＴ細胞が調製される。
したがって、本開示は、普遍的な既製の進歩したＨＳＣに基づくｉＮＫＴ細胞療法を包含する（図１）。具体的には、Ｇ−ＣＳＦにより動員されたＣＤ３４＋ＨＳＣを健康なドナーから、または細胞レポジトリから収集することができる。単一のドナーから、約１〜５×１０８個のＨＳＣを採取することができる。特定の場合では、これらのＨＳＣをｉｎ ｖｉｔｒｏでレンチ／ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫレンチウイルスベクターおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ−ＣＩＩＴＡ−ｇＲＮＡ複合体で操作し、次いで、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養下、８週間でｉＮＫＴ細胞に分化させる。次いで、ｉＮＫＴ細胞を精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでさらに２〜４週間にわたってさらに増大させ、その後、凍結保存およびロットリリースすることができる。特定の態様では、単一のドナーのＨＳＣから約１０１２個のｉＮＫＴ細胞が生成され、これを１，０００〜１０，０００用量（例えば用量当たり細胞約１０８〜１０９個で）に製剤化することができる。次いで得られた凍結保存された細胞製品、普遍的なＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ（ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ）細胞を容易に保管し、同種異系養子細胞移入によって既製のがん患者を処置するために配布することができる。ｉＮＫＴ細胞は、腫瘍抗原による制限および主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）による制限を伴わずに多数の型のがんを標的とすることができるので、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ治療は、多数のがんおよびがん患者の大きな集団を処置するため、したがって、まだ対処されていない医学的必要性に取り組むための普遍的ながん治療として有用である（図１）（Vivier et al., 2012；Berzins et al., 2011）。特に、開示されるＨＳＣ−ｉＮＫＴ治療は、血液がん（白血病、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群）、ならびに固形腫瘍（黒色腫、結腸がん、肺がん、乳がん、および頭頸部がん）を含めた、ｉＮＫＴ細胞による調節を受けることが臨床的に暗示されている多くの型のがんを治療するために有用である（Berzins et al., 2011）。
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ治療の基礎をなす科学的実施形態は以下の通りである：１）ヒトｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子のレンチウイルスベクター媒介性発現により、ＨＳＣがｉＮＫＴ細胞に分化するようにプログラムされる；２）ｓｒ３９ＴＫ ＰＥＴイメージング／自殺遺伝子を含めることにより、ＰＥＴイメージングを使用して患者におけるＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞をモニタリングすること、ならびに、安全のために必要な場合にはガンシクロビル（ＧＣＶ）投与によってこれらの細胞を枯渇させることが可能になる；３）ＨＳＣのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ−ＣＩＩＴＡ−ｇＲＮＡに基づく遺伝子編集により、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子がノックアウトされ、その結果、同種異系注入に適したＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ陰性細胞製品がもたらされる；４）ＡＴＯ培養系により、ヒトｉＮＫＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの効率的な発達が支持される；５）製造プロセスは高収量かつ高純度のものである。本明細書の実施例の節にこれらの科学的実施形態を裏付けるデータを提示する。
特定の場合では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴの製造は、１）Ｇ−ＣＳＦにより動員されたｌｅｕｋｏｐａｋを採取すること；２）Ｇ−ＣＳＦ−ｌｅｕｋｏｐａｋを精製してＣＤ３４＋ＨＳＣにすること；３）ＨＳＣにレンチウイルスベクターレンチ／ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫで形質導入すること；４）Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって遺伝子編集すること；５）ＡＴＯによってｉｎ ｖｉｔｒｏでｉＮＫＴ細胞に分化させること；６）ｉＮＫＴ細胞を精製すること；７）ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増大させること；８）細胞を採取し、製剤化し、凍結保存することを伴う。ある特定の実施形態では、２つの原薬（レンチ／ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫベクターおよびＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞）が存在し、最終医薬品は、特定の場合では、注入用バッグに入った、製剤化され凍結保存されたＵＨＳＣ−ｉＮＫＴであり得る。
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を生成するための効率的なプロトコールの例が本明細書に提示される。Ｂ２ＭのノックアウトによってクラスＩ ＨＬＡの細胞表面発現を除去するためのＨＳＣの効率的な遺伝子編集が本明細書で実証される。マルチプレックス編集ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を活用すると、例えば、検証されたｇＲＮＡ配列を使用して（Abrahimi et al., 2015）、ＨＬＡ−ＩＩ発現の重要な調節因子であるクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）の遺伝子をノックアウトすることにより、細胞表面クラスＩＩ ＨＬＡ発現を同時に妨害することもできる（Steimle et al., 1994）。したがって、細胞表面ＨＬＡ−Ｉおよび細胞表面ＨＬＡ−ＩＩ発現を妨害するためのこの遺伝子編集ステップならびにマイクロビーズによる精製ステップを組み入れることにより、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を生成する。これらの操作されたｉＮＫＴ細胞の純度および表面表現型を測定するために、フローサイトメトリー分析を使用することができる。細胞純度は、ＴＣＲ Ｖα２４＋Ｊα１８＋ＨＬＡ−Ｉ−ＨＬＡ−ＩＩ−によって特徴付けることができる。特定の実施形態では、このｉＮＫＴ細胞集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１６１＋であり、これは、メモリーおよびＮＫ表現型を示し、ＣＤ４＋ＣＤ８−（ＣＤ４シングルポジティブ）、ＣＤ４−ＣＤ８＋（ＣＤ８シングルポジティブ）、およびＣＤ４−ＣＤ８−（ダブルネガティブ、ＤＮ）の両方を含有する（Kronenberg and Gapin, 2002）。最近の試験でＣＤ６２Ｌ発現がｉＮＫＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ持続性およびそれらの抗腫瘍活性と関連することが示されたので（Tian et al., 2016）、ＣＤ６２Ｌ発現を解析することができる。これらの表現型のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴをＰＢＭＣ由来のｉＮＫＴと比較することができる。ＲＮＡｓｅｑを使用して、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴおよびＰＢＭＣ ｉＮＫＴ細胞に対する比較遺伝子発現解析を実施することができる。
ＰＢＭＣ ｉＮＫＴをベンチマーク対照として使用し、ＩＦＮ−γ産生および細胞傷害性アッセイを使用して、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴの機能的特性を評価することができる。ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を、αＧＣをパルスした照射ＰＢＭＣでシミュレートすることができ、１日の刺激から収集された上清をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡに供することができる（Smith et al., 2015）。ｉＮＫＴ細胞に対して、６時間にわたって刺激した後にＩＦＮ−γの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）も実施することができる。エフェクターＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を、ルシフェラーゼおよびＧＦＰを発現するように操作された、αＧＣが負荷されたＡ３７５．ＣＤ１ｄ標的細胞と一緒に４時間インキュベートすることによって細胞傷害性アッセイを行うことができ、その発光強度に関してプレートリーダーによって細胞傷害性を測定することができる。ｓｒ３９ＴＫはＰＥＴ／自殺遺伝子として導入されるので、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴをガンシクロビル（ＧＣＶ）と一緒にインキュベートすることによってその機能を確証することができ、例えばＭＴＴアッセイおよびアネキシンＶに基づくフローサイトメトリーアッセイによって細胞生存率を測定することができる。
薬物動態学／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）試験を実施することができる。ＰＫ／ＰＤ試験により、動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで以下を決定することができる：１）注入されたＵＨＳＣ−ｉＮＫＴの増大カイネティクスおよび持続性；２）種々の組織／器官におけるＵＨＳＣ−ｉＮＫＴの体内分布；３）ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴの腫瘍への輸送能およびこの濾過が腫瘍成長にどのように関連するか。Ａ３７５．ＣＤ１ｄ（Ａ３７５．ＣＤ１ｄ）腫瘍を担持する免疫不全ＮＳＧマウスを固形腫瘍動物モデルとして利用することができる。試験設計を図１２に概説する。２つの細胞用量群（１×１０６個および１０×１０６個；ｎ＝８）を調査することができる。−４日目に腫瘍を接種することができ（ｓ．ｃ．）、０日目にベースラインＰＥＴイメージングおよび採血を行うことができる。その後、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を静脈内に注入し（ｉ．ｖ．）、１）７日目および２１日目の生きている動物におけるＰＥＴイメージング；２）７日目、１４日目および２１日目の定期的な採血；３）２１日目の動物屠殺後のエンドポイント組織採取によってモニタリングすることができる。種々の採血から採取された細胞をフローサイトメトリーによって分析することができる；ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ１６１＋６Ｂ１１＋であるはずである。ｉＮＫＴサブセットが経時的にどれほど変動するかを知るために、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ４などの他のマーカーの発現を調べることができる。ｓｒ３９ＴＫを介したＰＥＴイメージングにより、腫瘍および骨、肝臓、脾臓、胸腺などの他の組織／器官におけるｉＮＫＴ細胞の存在を追跡することが可能になる。試験の最後に、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の分布を調べるために、腫瘍および脾臓、肝臓、脳、心臓、腎臓、肺、胃、骨髄、卵巣、腸などを含めたマウス組織をｑＰＣＲ解析のために収集することができる。
細胞について作用機序（ＭＯＡ）を特徴付けることができる。ｉＮＫＴ細胞は、直接殺滅によって、またはＩＦＮ−γを大量放出して、ＮＫ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞を腫瘍の根絶へと方向付けることによってのいずれかで腫瘍細胞を標的とすることが公知である（Fujii et al., 2013）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬理学試験により、直接細胞傷害性のエビデンスがもたらされる。ここで、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍反応性の補助におけるＮＫ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の役割を調査することができる。腫瘍担持ＮＳＧマウス（Ａ３７５．ＣＤ１ｄまたはＭＭ．１Ｓ．Ｌｕｃ）に、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴを単独で（上記のｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて選択される用量）またはＰＢＭＣ（ミスマッチドナー、５×１０６個）と組み合わせて注入することができる；ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴはＭＨＣ陰性であるので、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴと無関係のＰＢＭＣの間で同種異系免疫応答は起こらない可能性がある。腫瘍成長をモニタリングし、ＰＢＭＣ群を伴う場合と伴わない場合を比較することができる（群当たりｎ＝８）。特定の実施形態では、組合せ群でより大きな抗腫瘍応答が観察される場合、ＰＢＭＣの成分、例えばＮＫおよび／またはＣＤ８Ｔ細胞が治療有効性を高める役割を果たすことが示され得る。それらの個々の役割をさらに決定するために、ＮＫ細胞を枯渇させたＰＢＭＣ（ＣＤ５６ビーズによって）、ＣＤ８Ｔ細胞を枯渇させたＰＢＭＣ（ＣＤ８ビーズによって）、または骨髄系細胞を枯渇させたＰＢＭＣ（ＣＤ１４ビーズによって）をＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞と一緒に腫瘍担持マウスに共注入することができる。ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４などの免疫チェックポイント阻害因子によりｉＮＫＴ細胞機能が調節されることが示唆されている（Pilones et al., 2012；Durgan et al., 2011）。抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４による処置をＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ治療に追加することにより、これらの分子によりＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ治療がどのようにモジュレートされるかを決定し、組合せがん治療の設計に関する情報を提供することができる。
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の作製および／またはそれらの使用のために特定のベクターを利用することができる。ＨＳＣを遺伝子操作してｉＮＫＴ細胞にするためのベクター、例えば、ヒトｉＮＫＴ ＴＣＲ遺伝子をコードするＨＩＶ−１由来レンチウイルスベクターレンチ／ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫをｓｒ３９ＴＫ ＰＥＴイメージング／自殺遺伝子と一緒に利用することができる（図１３）。この第３世代自己不活化型（ＳＩＮ）ベクターの成分は、１）３’自己不活化型長末端反復（3' self-inactivating long-terminal repeats）（ΔＬＴＲ）；２）ψ領域ベクターゲノムパッケージングシグナル；３）スプライシングされていないベクターＲＮＡの核外輸送を増強するためのＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）；４）ベクターゲノムの核内移行（unclear import）を容易にするための中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）；５）マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来の内部プロモーターによって駆動される、ヒトｉＮＫＴ ＴＣＲのα鎖遺伝子（ＴＣＲα）およびβ鎖遺伝子（ＴＣＲβ）、ならびにＰＥＴ／自殺遺伝子ｓｒ３９ＴＫ（Gscheng et al., 2014）の発現カセット。ｉＮＫＴ ＴＣＲαおよびＴＣＲβおよびｓｒ３９ＴＫ遺伝子は全て、それらの最適な共発現を実現するために、コドン最適化され、２Ａ自己切断性配列（Ｔ２ＡおよびＰ２Ａ）と連結したものである（Gscheng et al., 2014）。
ベクターの品質管理に関して、ベクター製品が高品質であることを確実にするために、一連のＱＣアッセイを実施することができる。ベクター同一性、ベクター物理的力価、およびベクター純度（無菌性、マイコプラズマ、ウイルス夾雑物、複製コンピテントレンチウイルス（ＲＣＬ）試験、内毒素、残留ＤＮＡおよびベンゾナーゼ）などの標準のアッセイをＩＵ ＶＰＦで行い、試験成績書（ＣＯＡ）に提示することができる。実施することができる追加的なＱＣアッセイとして、１）形質導入／生物学的力価（ＨＴ２９細胞に段階希釈物で形質導入し、ｄｄＰＣＲを実施することによるもの、≧１×１０６ＴＵ／ｍｌ）；２）ベクタープロウイルス完全性（形質導入されたＨＴ２９細胞のゲノムＤＮＡのベクターが組み込まれた部分の配列決定によるもの、元のベクタープラスミド配列と同じ）；３）ベクター機能が挙げられる。ベクター機能は、ヒトＰＢＭＣ Ｔ細胞に形質導入することによって測定することができる（Chodon et al., 2014）。ｉＮＫＴ ＴＣＲ遺伝子の発現は、ｉＮＫＴ ＴＣＲに特異的な６Ｂ１１による染色によって検出することができる（Montoya et al., 2007）。発現されたｉＮＫＴ ＴＣＲの機能性を、αＧａｌＣｅｒによる刺激に応答したＩＦＮ−γ産生によって分析する（Watarai et al., 2008）。ｓｒ３９ＴＫ遺伝子の発現および機能性を、ペンシクロビルアップデートアッセイおよびＧＣＶ殺滅アッセイによって分析することができる（Gschweng et al., 2014）。ベクターストックの安定性（−８０℃のフリーザー中で保管）を、３カ月毎にその形質導入力価を測定することによって試験することができる。
ＶＩ．特定の細胞製造および製品製剤化
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞についての概要および特定の製造プロセスが提供される。特定の実施形態では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、例えば、腫瘍細胞と闘うことを含め、哺乳動物における疾患を標的として、それと闘うための「生きた薬物（living drug）」として機能する重要な原薬である。特定の実施形態では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、遺伝子改変されたドナーＨＳＣをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化および増大させることによって生成される。データから、実験室規模で細胞を作製するための新規の効率的なプロトコールが実証され、特定の実施形態では、細胞は、ＧＭＰと同等の製造プロセスで「既製の」細胞製品として作出される。特定の場合では、作製規模は、バッチ当たり細胞１０１２個であり、これにより、１０００〜１０，０００名の患者が処置されると推定される。
細胞製造プロセスの例が提供される。１つの細胞製造プロセスを、時系列の例および少なくとも一部の場合に各工程段階についての「工程内管理（Ｉｎ−Ｐｒｏｃｅｓｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＩＰＣ）」測定と共に図１４に概説する。ステップ１は、血液採取施設においてＧ−ＣＳＦにより動員されたドナーのＰＢＳＣを収集することであり、これは、多くの病院において常套的な手順になっている（Deotare et al., 2015）。このプロジェクトのためにＨｅｍａＣａｒｅからのＬｅｕｋｏｐａｋ中に新鮮なＰＢＳＣを得ることができる；ＨｅｍａＣａｒｅは、ＩＲＢにより承認された採取プロトコールおよびドナーの同意を有し、臨床試験および商業製品製造を支持することができる。ステップ２は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ系を使用してＰＢＳＣからＣＤ３４＋ＨＳＣを富化することである；特定の態様では、ＵＣＬＡ ＧＭＰ施設にあるそのようなシステムを使用して、このステップを完了することができ、少なくとも１０８個のＣＤ３４＋細胞を得ることができる。ＣＤ３４−細胞も採取し、保管することができる（ステップ７においてＰＢＭＣフィーダーとして使用することができる）。
ステップ３は、ＨＳＣの培養およびベクターの形質導入を伴う。ＣＤ３４＋細胞を、レトロネクチンでコーティングしたフラスコ中、１％ＨＡＳ（ＵＳＰ）および成長因子カクテル（ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ−３リガンドおよびｔｐｏ；各５０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＸ−ＶＩＶＯ１５培地で１２時間にわたって培養し、その後、レンチ／ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫベクターを添加し、さらに８時間培養することができる（Gschweng et al., 2014）。形質導入された細胞についてメチルセルロースアッセイにおいて形成された約５０コロニーを試料採取することによってベクター組込みコピー（ＶＣＮ）を測定することができ、ｄｄＰＣＲを使用して細胞当たりの平均ベクターコピー数を決定することができる（Nolta et al., 1994）。特定の場合では、手順を最適化し、＞５０％の形質導入が常套的に実現され、細胞当たりＶＣＮ＝１〜３である。
ステップ４は、強力なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９マルチプレックス遺伝子編集法を利用して、ＨＳＣにおけるＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡの両方のゲノム遺伝子座を標的とし、それらの遺伝子発現を妨害することであり（Ren et al., 2017；Liu et al., 2017）、編集されたＨＳＣに由来するｉＮＫＴ細胞はＭＨＣ／ＨＬＡ発現を欠き、それにより、宿主免疫系による拒絶反応が回避される。最初のデータから、Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ−ｇＲＮＡの電気穿孔によりＣＤ３４＋ＨＳＣに対するＢ２Ｍ破壊が高効率（フロー分析により約７５％）で成功したことが実証された。Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ２重ノックアウトをＲＮＰの混合物（Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ−ｇＲＮＡおよびＣａｓ９／ＣＩＩＴＡ−ｇＲＮＡ）の電気穿孔によって実現することができる（Abrahimi et al., 2015）。このプロセスは、電気穿孔パラメータ、２つのＲＮＰの比、電気穿孔前の幹細胞培養時間（形質導入後２４時間、４８時間、または７２時間）などを変動させることによって最適化し、検証することができる（Gundry et al,. 2016）；ＩＤＴからの高忠実度Ｃａｓ９タンパク質（Slaymaker et al., 2016；Tsai and Joung, 2016）を使用して、「オフターゲットの」影響を最小限にすることができる。例示的な評価パラメータは、生存率、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡ部位を標的とするＴ７Ｅ１アッセイによって測定される欠失（インデル）頻度（オンターゲット効率）および次世代配列決定（ＮＧＳ）、フローサイトメトリーによるＭＨＣ発現、ならびにコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイによって測定される編集されたＨＳＣの造血機能であり得る。
ステップ５は、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養１により、改変されたＣＤ３４＋ＨＳＣをｉＮＫＴ細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させることである。最初の試験から、ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現するように操作されたＨＳＣから機能的なｉＮＫＴ細胞を効率的に生成することができることが示されている。このデータを元に、１０８個の改変されたＣＤ３４＋ＨＳＣから１０１０個のｉＮＫＴ細胞を作製するための８週間のＧＭＰに適合するＡＴＯ培養プロセスを試験し、検証することができる。ＡＴＯは、ＨＳＣ（５×１０４個）と照射（８０Ｇｙ）ＭＳ５−ｈＤＬＬ１間質細胞（１０６個）の混合物を含有する細胞スラリー（５μｌ）を滴下形式で０．４μｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌトランスウェルインサート上にピペッティングし、次いで、インサートをＲＢ２７培地１１ｍｌを含有する６ウェルプレートに入れることを伴う；８週間にわたり、培地を４日毎に交換してよい。インサート当たり３つのＡＴＯと考えると、各バッチ作製に対しておよそ１７０個の６ウェルプレートを利用することができる。ＡＴＯ液滴のプレーティングおよび培地交換のために、バイオセーフティキャビネット内に置かれた自動化されたプログラム可能なピペット操作／分注系（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆからのｅｐＭｏｎｔｉｏｎ ５０７０ｆ）を使用することができる；各ラウンドで１７０プレートを完了するためには２時間の操作が必要になり得る。ＡＴＯ培養の最後に、ｉＮＫＴ細胞を収集し、特徴付けることができる。特定の実施形態では、ＡＴＯの成分は、ヒトＤＬＬ１を発現させるためのレンチウイルスによる形質導入、その後の細胞選別によって構築されるＭＳ５−ｈＤＬＬ１間質細胞株である。ある特定のＧＭＰプロセスの調製では、このポリクローナル細胞集団に対して単一細胞クローン選択プロセスを実施して、いくつかのクローンＭＳ５−ｈＤＬＬ１細胞株を確立することができ、その中から効率的なものを選択し（ＡＴＯ培養によって評価する）、それを使用してマスターセルバンクを生成することができる。そのようなバンクを使用して、将来の臨床グレードのＡＴＯ培養のための照射間質細胞を供給することができる。
ステップ６は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ系を使用してＡＴＯ由来のｉＮＫＴ細胞を精製することである。この精製ステップは、ＭＨＣＩ＋細胞およびＭＨＣＩＩ＋細胞を枯渇させ、ｉＮＫＴ＋細胞を富化するためのものである。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗ビオチンビーズを市販のビオチン化抗ＭＨＣＩ（クローンＷ６／３２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）、抗Ｂ２Ｍ（クローン２Ｍ２）、および抗ＭＨＣＩＩ（クローンＴｕ３９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ）、および抗ＴＣＲ Ｖα２４−Ｊα１８（クローン６Ｂ１１）と一緒にインキュベートすることにより、抗ＭＨＣＩビーズおよび抗ＭＨＣＩＩビーズを調製することができる。６Ｂ１１を直接コーティングしたマイクロビーズはＭｉｌｔｅｎｙｉからも入手可能である；抗ｉＮＫＴビーズはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから入手可能である。収集されたｉＮＫＴ細胞を抗ＭＨＣビーズ混合物によって標識し、２回洗浄することができ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ枯渇プログラムを使用してＭＨＣＩ＋および／またはＭＨＣＩＩ＋細胞を枯渇させることができる；必要であれば、この枯渇ステップを繰り返して、残留するＭＨＣ＋細胞をさらに除去することができる。その後、ｉＮＫＴ細胞を、標準の抗ｉＮＫＴビーズおよびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ富化プログラムを使用してさらに精製することができる。細胞純度を、例えばフローサイトメトリーによって測定することができる。
ステップ７は、精製されたｉＮＫＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させることである。検証済みのＰＢＭＣフィーダーに基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ増大プロトコールを使用し、１０１０個の細胞から出発して１０１２個のｉＮＫＴ細胞まで増大させることができる（Yamasaki et al., 2011；Heczey et al., 2014）。この細胞増大に関してＧ−Ｒｅｘに基づくバイオプロセスを評価することができる。Ｇ−Ｒｅｘは、底部にガス透過性膜を有し、より効率的なガス交換が可能な細胞成長フラスコである；Ｇ−Ｒｅｘ５００Ｍフラスコは、１０日間で１００倍の細胞増大を支持する能力を有する（Vera et al., 2010；Bajgain et al., 2014；Jin et al., 2012）。ステップ１で保管しておいたＣＤ３４−細胞（フィーダー細胞として使用される）を解凍し、αＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）をパルスし、照射を行う（４０Ｇｙ）ことができる。ｉＮＫＴ細胞を、照射フィーダー細胞と混合し（１：４の比）、Ｇ−Ｒｅｘフラスコに播種し（各１．２５×１０８個のｉＮＫＴ、フラスコ８０個）、２週間にわたって増大させることができる。ＩＬ−２（２００Ｕ／ｍｌ）を２〜３日毎に添加し、培地交換を７日目に一度行う；培地操作は全て蠕動ポンプによって実現することができる。この増大プロセスは、同様のＰＢＭＣフィーダーに基づく増大手順（迅速な増大プロトコールと称される）が多くの臨床試験に関して治療用Ｔ細胞を作製するためにすでに利用されているので（Dudley et al., 2008；Rosenberg et al., 2008）、ＧＭＰに適合する。
ステップ８は、ステップ７から収集されたｉＮＫＴ細胞（活性な薬物成分）を直接注入用に細胞浮遊液として製剤化することである。少なくとも３ラウンドの広範囲にわたる洗浄後、ステップ７からの細胞を計数し、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ Ａ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（３１．２５％ｖ／ｖ）、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｎｄ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（３１．２５％ｖ／ｖ）、Ｈｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎ（２０％ｖ／ｖ）、Ｄｅｘｔｒａｎ ４０ ｉｎ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｉｎｊｅｃｔ（１０％、ｖ／ｖ）およびＣｒｙｏｓｅｒｖ ＤＭＳＯ（７．５％、ｖ／ｖ）で構成される、注入／低温保管に適合する溶液中に浮遊させることができる（１ｍｌ当たり細胞１０７〜１０８個）；この溶液は、Ｎｏｖａｒｔｉｓの承認されたＴ細胞製品であるチサゲンレクロイセルを製剤化するために使用されている（Grupp et al., 2013）。ＦＤＡに認可された凍結用バッグ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＣｒｙｏＭＡＣＳ凍結用バッグなど）に充填したら、製品を速度制御フリーザーで凍結させ、液体窒素フリーザーで保管することができる。この製剤がＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞製品として適切であることを確実にするために、生存率および回収率を測定することによって検証および／または最適化試験を実施することができる。
高品質の作製を確実にするために、提唱されたバイオプロセスに、例えば細胞計数、生存率、無菌性、マイコプラズマ、同一性、純度、ＶＣＮなどの種々のＩＰＣアッセイを組み入れることができる。試験は、以下を含み得る：１）外観（色、不透明度）；２）細胞生存率および計数；３）ｉＮＫＴ ＴＣＲについてのｑＰＣＲによる同一性およびＶＣＮ；４）ｉＮＫＴ陽性およびＢ２Ｍ陰性による純度；５）内毒素；６）無菌性；７）マイコプラズマ；８）αＧａｌＣｅｒによる刺激に応答したＩＦＮ−γ放出によって測定される効力；９）ＲＣＬ（複製コンピテントレンチウイルス）（Cornetta et al, 2011）。これらのアッセイの大部分は、標準の生物学的アッセイまたはこの製品に独特の特定のアッセイのいずれかである。ＬＮ保管バッグを定期的に解凍し、それらの細胞生存率、純度、回収率、効力（ＩＦＮ−γ放出）および無菌性を測定することによって製品安定性試験を実施することができる。特定の実施形態では、製品は少なくとも１年にわたって安定である。
Ａ．出発細胞の供給源
選択されたＴ細胞系列に沿った分化のためのある特定の組成物または方法に多能性幹細胞または造血幹細胞もしくは前駆細胞などの出発細胞を使用することができる。幹細胞または前駆細胞と共培養するために間質細胞を使用することができる。
Ｂ．間質細胞
間質細胞は、任意の器官、例えば、骨髄、胸腺、子宮粘膜（子宮内膜）、前立腺、および卵巣の結合組織細胞である。間質細胞は、その器官の実質細胞の機能を支持する細胞である。線維芽細胞（間葉系間質細胞／ＭＳＣとしても公知）および周皮細胞が間質細胞の最も一般的な型の１つである。
間質細胞と腫瘍細胞の相互作用ががんの成長および増悪において主要な役割を果たすことが公知である。さらに、骨髄間質細胞が、局所サイトカインネットワーク（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＩＦ）を調節することによってヒト造血および炎症プロセスに関与することが記載されている。
骨髄、胸腺、および他の造血器官の間質細胞は、細胞−細胞リガンド−受容体相互作用を通じて、ならびにサイトカインおよびケモカインを含めた可溶性因子の放出を通じて造血細胞および免疫細胞の発生を調節する。これらの組織内の間質細胞は、幹細胞維持、系列特異化および拘束、ならびにエフェクター細胞型への分化を調節するニッチを形成する。
間質は、非悪性宿主細胞で構成される。間質細胞は、組織特異的な細胞型、および一部の場合では、腫瘍をその上で成長させることができる細胞外マトリックスも提供する。
Ｃ．造血幹細胞・前駆細胞
造血幹細胞・前駆細胞の重要な医学的潜在性に起因して、造血前駆細胞を胚性幹細胞から分化させるための方法を改善しようとする実質的な研究が行われてきた。ヒト成体では、主に骨髄に存在する造血幹細胞は、血液系の全ての細胞に分化する造血（ＣＤ３４＋）前駆細胞の不均一な集団を産生する。ヒト成体では、造血プロジェニター（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）が増殖および分化し、その結果、毎日数千億個の成熟血液細胞が生成される。造血前駆細胞は臍帯血にも存在する。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒト胚性幹細胞を造血前駆細胞に分化させることができる。下記の通り末梢血の試料から造血前駆細胞を増大または富化させることもできる。造血細胞は、ヒト起源、マウス起源または任意の他の哺乳動物種のものであってよい。
造血前駆細胞の単離は、細胞選別機、抗体がコーティングされた磁気ビーズを使用した磁気分離、充填カラム；アフィニティークロマトグラフィー；これだけに限定されないが、補体および細胞毒を含めた、モノクローナル抗体に結合させたまたはモノクローナル抗体と併せて使用される細胞傷害性薬剤；ならびに固体マトリックス、例えば、プレートに付着させた抗体による「パニング」、または任意の他の都合のよい技法を含めた任意の選択方法を含む。
分離または単離技法の使用は、これだけに限定されないが、物理特性の差異に基づくもの（密度勾配遠心分離および向流遠心分離溶出）、細胞表面特性の差異に基づくもの（レクチンおよび抗体親和性）、ならびに生体染色特性の差異に基づくもの（ミトコンドリア結合性色素ｒｈｏ１２３およびＤＮＡ結合性色素Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）を含む。正確な分離をもたらす技法としては、これだけに限定されないが、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）またはＭＡＣＳ（磁気活性化細胞選別）が挙げられ、これらは、例えば、複数のカラーチャネル、小角および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど、精巧化の程度が様々であり得る。
先行する技法または細胞型の純度を評価するための技法（例えば、フローサイトメトリー）に利用する抗体を、これだけに限定されないが、酵素、磁気ビーズ、コロイド磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、薬物またはハプテンを含めた、識別可能な作用物質とコンジュゲートすることができる。抗体とコンジュゲートすることができる酵素としては、これだけに限定されないが、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。抗体とコンジュゲートすることができる蛍光色素としては、これだけに限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリトリン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッドが挙げられる。抗体とコンジュゲートすることができる追加的な蛍光色素に関しては、Haugland, Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992-1994)を参照されたい。抗体とコンジュゲートすることができる金属化合物としては、これだけに限定されないが、フェリチン、コロイド金、および特に、コロイドの超常磁性のビーズが挙げられる。抗体とコンジュゲートすることができるハプテンとしては、これだけに限定されないが、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサゾロン（oxazalone）、およびニトロフェノールが挙げられる。抗体とコンジュゲートすることまたは抗体に組み入れることができる放射性化合物は、当技術分野で公知であり、それらとして、これだけに限定されないが、テクネチウム９９ｍ（９９ＴＣ）、１２５Ｉならびに、これだけに限定されないが、１４Ｃ、３Ｈおよび３５Ｓを含めた任意の放射性核種を含むアミノ酸が挙げられる。
例えばアフィニティーカラムなどの、正確な分離を可能にする正の選択のための他の技法を使用することができる。当該方法は、非標的細胞集団を約２０％未満、好ましくは約５％未満の残留量までに除去することを可能にするべきである。
細胞を光散乱特性ならびにそれらによる種々の細胞表面抗原の発現に基づいて選択することができる。精製された幹細胞のＦＡＣＳ分析による側方散乱プロファイルは低く、前方散乱プロファイルは低い〜中程度である。サイトスピン調製物により、富化された幹細胞が成熟リンパ系細胞と成熟顆粒球の間のサイズを有することが示される。
例えばSutherland et al.(1992)および米国特許第４，７１４，６８０号に記載の方法を使用して接種集団を培養前にＣＤ３４＋細胞に関して富化することも可能である。例えば、細胞を負の選択に供して、系列特異的マーカーを発現する細胞を除去する。例示的な実施形態では、細胞集団を、非ＣＤ３４＋造血細胞および／または特定の造血細胞サブセットを枯渇させるために負の選択に供する。負の選択は、ＣＤ２、ＣＤ４およびＣＤ８などのＴ細胞マーカー；ＣＤ１０、ＣＤ１９およびＣＤ２０などのＢ細胞マーカー；単球マーカーＣＤ１４；ＮＫ細胞マーカーＣＤ２、ＣＤ１６、およびＣＤ５６または任意の系列特異的マーカーを含めた種々の分子の細胞表面発現に基づいて実施することができる。負の選択は、例えばＭＡＣＳまたはカラム分離による他の細胞型の分離のために使用することができる抗体のカクテル（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、およびＣＤ２３５ａ）などの種々の分子の細胞表面発現に基づいて実施することができる。
本明細書で使用される場合、系列陰性（ＬＩＮ−）は、系列拘束細胞に関連する少なくとも１つのマーカー、例えば、Ｔ細胞に関連するマーカー（例えば、ＣＤ２、３、４および８）、Ｂ細胞に関連するマーカー（例えば、ＣＤ１０、１９および２０）、骨髄細胞に関連するマーカー（例えば、ＣＤ１４、１５、１６および３３）、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞に関連するマーカー（例えば、ＣＤ２、１６および５６）、ＲＢＣに関連するマーカー（例えば、グリコホリンＡ）、巨核球に関連するマーカー（ＣＤ４１）、肥満細胞に関連するマーカー、好酸球もしくは好塩基球に関連するマーカーまたはＣＤ３８、ＣＤ７１、およびＨＬＡ−ＤＲなどの他のマーカーを欠く細胞を指す。系列特異的マーカーは、これだけに限定されないが、ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ７１のうちの少なくとも１つを含むことが好ましい。ＬＩＮ−は、少なくともＣＤ１４およびＣＤ１５を含むことがより好ましい。例えば、ｃ−ｋｉｔ＋またはＴｈｙ−１＋に対する正の選択によってさらなる精製を実現することができる。ミトコンドリア結合性色素ローダミン１２３を使用し、当技術分野で公知の方法によってローダミン＋細胞を選択することにより、さらなる富化を得ることができる。ＣＤ３４＋、好ましくはＣＤ３４＋ＬＩＮ−、最も好ましくはＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋ＬＩＮ−である細胞を選択的に単離することにより、高度に富化された組成物を得ることができる。幹細胞が高度に富化された集団およびそれらを得るための方法は当業者に周知であり、例えば、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９７６０号；同第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８５７４号および同第ＰＣＴ／ＵＳ９４／１０５０１号に記載されている方法を参照されたい。
種々の技法を使用して、専用系列（dedicated lineage）の細胞を最初に除去することによって細胞を分離することができる。モノクローナル抗体は特定の細胞系列に関連するマーカーおよび／または分化の段階の同定に特に有用である。抗体を固体支持体に付着させて、粗分離を可能にすることができる。使用される分離技法は、採取される画分の生存率の保持を最大にするものであるべきである。有効性が異なる種々の技法を使用して、「比較的粗い」分離物を得ることができる。そのような分離物は、保持される細胞集団と共に残っている望ましくない細胞が、存在する総細胞の最大１０％、通常は約５％以下、好ましくは約１％以下である。使用される特定の技法は、分離の効率、付随する細胞傷害性、実施の容易さおよびスピード、ならびに高度な設備および／または技術的熟練の必要性に依存する。
前駆細胞の選択は、細胞に特異的なマーカーだけで実現される必要はない。負の選択と正の選択の組合せを使用することにより、富化された細胞集団を得ることができる。
Ｄ．血液細胞の供給源
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、通常は骨髄中に存在するが、血液中に出させることができ、このプロセスは動員と称され、多数のＨＳＣを末梢血中に収集するために臨床的に使用される。選択される動員用作用物質の一例は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。
末梢血中を循環しているＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞を、乱されていない状態で、またはＧ−ＣＳＦなどの造血成長因子を外部から投与した後の動員後のいずれかで、アフェレーシス技法によって採取することができる。動員後に採取される幹細胞または前駆細胞の数は、乱されていない状態でアフェレーシス後に得られるものよりも多い。本発明の特定の態様では、細胞集団の供給源は、造血幹細胞または前駆細胞をｉｎ ｖｉｖｏで富化する必要がないことに起因して、外部から適用される因子によって細胞が動員されていない対象である。
本明細書に記載の方法において使用するための細胞の集団は、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、齧歯類細胞（例えば、マウスまたはラット）、ウシ細胞、ヒツジ類細胞、ブタ細胞、ウマ科の動物の細胞、ヒツジ細胞、イヌ科の動物の細胞、およびネコ科の動物の細胞またはこれらの混合物などの哺乳動物細胞であり得る。非ヒト霊長類細胞としては、アカゲザル細胞が挙げられる。細胞は、動物、例えば、ヒト患者から得たものであってもよく、細胞株に由来するものであってもよい。細胞が動物から得られたものである場合、それ自体で、例えば、分離されていない細胞（すなわち、混合集団）として使用することができる；細胞は、最初に、例えば形質転換によって培養下で樹立されたものであってもよい；または、細胞は、予備精製方法に供されたものであってもよい。例えば、細胞集団を、細胞表面マーカーの発現に基づいて正の選択もしくは負の選択によって操作することができる；ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏにおいて１つもしくは複数の抗原で刺激することができる；ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏにおいて１つもしくは複数の生物学的修飾物質で処理することができる；またはこれらのうちのいずれかもしくは全部の組合せを行うことができる。
細胞の集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、全血または混成集団を含有するその画分、脾臓細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤性リンパ球、白血球アフェレーシスによって得られた細胞、生検組織、リンパ節、例えば、腫瘍から流出しているリンパ節を含む。適切なドナーとしては、免疫されたドナー、免疫されていない（ナイーブな）ドナー、処置を受けたドナーまたは無処置のドナーが挙げられる。「処置を受けた」ドナーは、１つまたは複数の生物学的修飾物質に曝露されたドナーである。「無処置の」ドナーは、１つまたは複数の生物学的修飾物質に曝露さていないドナーである。
例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、当技術分野で公知の方法に従って記載の通りに得ることができる。そのような方法の例は、Kim et al.(1992)；Biswas et al.(1990)；Biswas et al.(1991)によって考察されている。
細胞の集団から前駆体細胞を得る方法も当技術分野で周知である。前駆体細胞を、ｈＳＣＦ、ｈＦＬＴ３、および／またはＩＬ−３などの種々のサイトカインを使用して増大させることができる（Akkina et al., 1996）、またはＭＡＣＳまたはＦＡＣＳを使用してＣＤ３４＋細胞を富化することができる。上記の通り、負の選択技法を使用してＣＤ３４＋細胞を富化することもできる。
対象から細胞試料を得、次いで、それを所望の細胞型について富化することも可能である。例えば、本明細書に記載の通り血液からＰＢＭＣおよび／またはＣＤ３４＋造血細胞を単離することができる。細胞を、所望の細胞型の細胞表面上のエピトープに結合する抗体による単離および／または活性化などの様々な技法を使用して他の細胞から単離することもできる。使用することができる別の方法として、細胞を受容体会合によって活性化することなく特定の細胞型を選択的に富化するための、細胞表面マーカーに対する抗体を使用した負の選択が挙げられる。
骨髄細胞を腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨または他の髄腔から得ることができる。骨髄を患者から取り出し、種々の分離および洗浄手順によって単離することができる。骨髄細胞を単離するための例示的な手順は、以下のステップを含む：ａ）骨髄懸濁液を３つの画分に遠心分離し、中間の画分、またはバフィーコートを採取するステップ；ｂ）ステップ（ａ）のバフィーコート画分を分離液、一般にフィコール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＡＢの商標）中でもう一度遠心分離し、骨髄細胞を含有する中間の画分を採取するステップ；およびｃ）ステップ（ｂ）で採取した画分を、再輸注可能な骨髄細胞を回収するために洗浄するステップ。
Ｅ．多能性幹細胞
本明細書に記載の組成物および方法に適した細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける多能性幹細胞の分化により調製することもできる造血幹細胞・前駆細胞であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法において使用される細胞は、ＡＴＯに直接播種された多能性幹細胞（胚性幹細胞または人工多能性幹細胞）である。さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物において使用される細胞は、これだけに限定されないが、中胚葉プロジェニター、造血内皮プロジェニター、または造血プロジェニターなどのＰＳＣの誘導体または後代である。
「多能性幹細胞」という用語は、３つの胚葉全て、すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞を産生することができる細胞を指す。理論的には、多能性幹細胞は体のあらゆる細胞に分化することができるが、多能性の実験的決定は、一般には多能性細胞から各胚葉のいくつかの細胞型への分化に基づく。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹（ＥＳ）細胞である。他の実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞の再プログラミングによって得られる人工多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞核移植によって得られる胚性幹細胞である。
胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性細胞である。ＥＳ細胞は、発生中の胚の外側の栄養外胚葉層を除去し、次いで内部細胞塊を成長していない細胞のフィーダー層上で培養することによって単離することができる。適切な条件下で、増殖している未分化ＥＳ細胞のコロニーを作製する。コロニーを取り出し、個々の細胞に解離させ、次いで、新鮮なフィーダー層に再プレーティングする。再プレーティングした細胞は増殖し続けることができ、それにより、未分化ＥＳ細胞の新しいコロニーが生じる。次いで、新しいコロニーを取り出し、解離させ、もう一度再プレーティングし、成長させる。未分化ＥＳ細胞のこの「継代培養」または「継代」プロセスを何回も繰り返して、未分化ＥＳ細胞を含有する細胞株を作製することができる（米国特許第５，８４３，７８０号；同第６，２００，８０６号；同第７，０２９，９１３号）。「初代細胞培養」は、胚盤胞の内部細胞塊などの組織から直接得た細胞の培養である。「継代培養」は、初代細胞培養に由来する任意の培養である。
マウスＥＳ細胞を得るための方法は周知である。１つの方法では、１２９系統のマウス由来の着床前胚盤胞をマウス抗血清で処理して、栄養外胚葉を除去し、内部細胞塊を、ウシ胎仔血清を含有する培地中、化学的に不活化させたマウス胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養する。発生する未分化ＥＳ細胞のコロニーを、ウシ胎仔血清の存在下、マウス胚線維芽細胞フィーダー層上で継代培養して、ＥＳ細胞の集団を作製する。一部の方法では、サイトカイン白血病抑制因子（ＬＩＦ）を血清含有培養培地に添加することにより、マウスＥＳ細胞をフィーダー層の非存在下で成長させることができる（Smith, 2000）。他の方法では、マウスＥＳ細胞を無血清培地中、骨形成タンパク質およびＬＩＦの存在下で成長させることができる（Ying et al., 2003）。
ヒトＥＳ細胞は、胚盤胞から、以前に記載されている方法を使用して得ることができる（Thomson et al., 1995；Thomson et al., 1998；Thomson and Marshall, 1998；Reubinoff et al, 2000）。１つの方法では、５日目のヒト胚盤胞をウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に曝露し、その後、モルモット補体の１：５希釈物に曝露して、栄養外胚葉細胞を溶解させる。溶解した栄養外胚葉細胞をインタクトな内部細胞塊から除去した後、内部細胞塊をガンマ不活化マウス胚線維芽細胞のフィーダー層上で、ウシ胎仔血清の存在下で培養する。９〜１５日後、内部細胞塊に由来する細胞の凝集塊を化学的に解離させる（すなわち、トリプシンに曝露する）かまたは機械的に解離させ、ウシ胎仔血清およびマウス胚線維芽細胞のフィーダー層を含有する新鮮な培地に再プレーティングすることができる。さらに増殖させたら、未分化形態を有するコロニーをマイクロピペットによって選択し、機械的に解離させて凝集塊にし、再プレーティングする（米国特許第６，８３３，２６９号を参照されたい）。ＥＳ様形態は、核の細胞質に対する比が明らかに高く、突出した核小体を有する緻密なコロニーと特徴付けられる。得られたＥＳ細胞を、簡単なトリプシン処理により、または個々のコロニーをマイクロピペットによって選択することにより、常套的に継代することができる。一部の方法では、血清を用いずに、ＥＳ細胞を線維芽細胞のフィーダー層上で、塩基性線維芽細胞成長因子の存在下で培養することによってヒトＥＳ細胞を成長させることができる（Amit et al., 2000）。他の方法では、フィーダー細胞層を用いずに、細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはラミニンなどのタンパク質マトリックス上、塩基性線維芽細胞成長因子を含有する「条件」培地の存在下で培養することによってヒトＥＳ細胞を成長させることができる（Xu et al., 2001）。培地は、線維芽細胞と共培養することによって予め馴化する。
アカゲザルおよびコモンマーモセットＥＳ細胞を単離するための方法も公知である（Thomson, and Marshall, 1998；Thomson et al., 1995；Thomson and Odorico, 2000）。
ＥＳ細胞の別の供給源は、樹立されたＥＳ細胞株である。種々のマウス細胞株およびヒトＥＳ細胞株が公知であり、それらの成長および繁殖のための条件が定義されている。例えば、マウスＣＧＲ８細胞株は、マウス系統１２９の胚の内部細胞塊から樹立されたものであり、ＣＧＲ８細胞の培養物は、フィーダー層を用いずに、ＬＩＦの存在下で成長させることができる。さらなる例として、ヒトＥＳ細胞株Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３およびＨ１４がThompson et alにより樹立された。さらに、Ｈ９株のサブクローンＨ９．１およびＨ９．２が開発されている。
ＥＳ細胞の供給源は、胚盤胞、胚盤胞の内部細胞塊の培養に由来する細胞、または樹立細胞株の培養によって得られる細胞であり得る。したがって、本明細書で使用される場合、「ＥＳ細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊細胞、内部塊細胞の培養により得られるＥＳ細胞、およびＥＳ細胞株の培養により得られるＥＳ細胞を指し得る。
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ＥＳ細胞の特徴を有するが、分化した体細胞の再プログラミングによって得られる細胞である。人工多能性幹細胞は、様々な方法によって得られている。１つの方法では、ヒト成体皮膚線維芽細胞に転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４をレトロウイルスによる形質導入を使用してトランスフェクトする（Takahashi et al., 2007）。トランスフェクトされた細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を補充した培地中、ＳＮＬフィーダー細胞（ＬＩＦを産生するマウス線維芽細胞株）にプレーティングする。およそ２５日後、ヒトＥＳ細胞コロニーと似たコロニーが培養物中に出現する。ＥＳ細胞様コロニーを選び取り、フィーダー細胞上、ｂＦＧＦの存在下で増大させる。
細胞の特徴に基づくと、ＥＳ細胞様コロニーの細胞は人工多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞と形態学的に同様であり、種々のヒトＥＳ細胞マーカーを発現する。また、ヒトＥＳ細胞の分化をもたらすことが分かっている条件下で成長させると、人工多能性幹細胞はそれに応じて分化する。例えば、人工多能性幹細胞は、ニューロン構造および神経細胞マーカーを有する細胞に分化することができる。
別の方法では、ヒト胎児または新生児線維芽細胞に、４種の遺伝子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８をレンチウイルスによる形質導入を使用してトランスフェクトする（Yu et al., 2007）。感染の１２〜２０日後に、ヒトＥＳ細胞形態を有するコロニーが目に見えるようになる。コロニーを選び取り、増大させる。コロニーを構成する人工多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞と形態学的に同様であり、種々のヒトＥＳ細胞マーカーを発現し、マウスへの注射後に、神経組織、軟骨および消化管上皮を有する奇形腫を形成する。
マウスから人工多能性幹細胞を調製する方法も公知である（Takahashi and Yamanaka, 2006）。ｉＰＳ細胞の誘導には、一般には、Ｓｏｘファミリーから少なくとも１メンバーおよびＯｃｔファミリーから少なくとも１メンバーの発現またはそれらへの曝露が必要である。ＳｏｘおよびＯｃｔは、ＥＳ細胞同一性を特定する転写調節階層の中心にあると考えられる。例えば、Ｓｏｘは、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５、またはＳｏｘ−１８であり得る；ＯｃｔはＯｃｔ−４であり得る。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、またはｃ−Ｍｙｃなどの追加的な因子により、再プログラミング効率を増加させることができる；再プログラミング因子の特定のセットは、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、および必要に応じてＬｉｎ−２８を含むセット；またはＳｏｘ−２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ、および必要に応じてｃ−Ｍｙｃを含むセットであり得る。
ＥＳ細胞のようなｉＰＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４に対する抗体（Developmental Studies Hybridoma Bank, National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda Md.）、ならびにＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１に対する抗体（Andrews et al., 1987）を使用し、免疫組織化学的検査またはフローサイトメトリーによって同定または確認することができる特徴的な抗原を有する。胚性幹細胞の多能性は、およそ０．５〜１０×１０６個の細胞を８〜１２週齢雄ＳＣＩＤマウスの後肢筋肉に注射することによって確認することができる。３つの胚葉のそれぞれのうちの少なくとも１つの細胞型を示す奇形腫が発生する。
ＶＩＩ．細胞を使用する方法
本開示のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、作製直後に利用してもよく、作製直後に利用しなくてもよい。一部の場合では、本開示のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を後の目的のために保管する。いずれにしても、本開示のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を、患者などの哺乳動物対象（ヒト、イヌ、ネコ、ウマなど）に対する治療または予防的適用に利用することができる。患者は、任意の種類の医学的状態に対して同種異系細胞療法を含めた細胞療法を必要とする患者であり得る。
治療有効量の本開示のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞で患者を処置する方法は、細胞またはそのクローン集団を患者に投与することを含む。細胞または細胞集団は、患者に対して同種異系であり得る。特定の実施形態では、患者は、細胞や細胞集団の枯渇の徴候を示さない。患者は、がんおよび／または炎症を伴う疾患もしくは状態を有する場合もあり、有さない場合もある。患者ががんを有する特定の実施形態では、がん患者に細胞または細胞集団を投与した後、その患者の腫瘍細胞が殺滅される。患者が炎症を有する特定の場合では、細胞または細胞集団を患者に投与した後、炎症が低減する。処置方法の特定の実施形態では、方法は、患者に自殺遺伝子産物を引き起こす化合物を投与することをさらに含む。
がんを有する患者に関しては、この細胞製品は、患者に注入されたら、多数の機序を使用して、腫瘍細胞を標的とし、それを根絶することができることが予想される。注入された細胞は、ＣＤ１ｄ＋腫瘍細胞を直接認識し、それを細胞傷害性によって死滅させることができる。注入された細胞は、ＩＦＮ−γなどのサイトカインを分泌して、ＮＫ細胞を活性化してＨＬＡ陰性腫瘍細胞を死滅させることができ、また、ＤＣも活性化し、次いでそれにより細胞傷害性Ｔ細胞が刺激されて、ＨＬＡ陽性腫瘍細胞を死滅させる。したがって、この細胞製品のがん治療に関する薬理学的有効性を実証するために、一連のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験を計画する。
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は腫瘍抗原による制限およびＭＨＣによる制限を伴わずに広範囲のがんを標的とすることができるので、既製のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞製品は、任意の型のがんおよびがん患者の大きな集団を処置するための一般的ながん免疫療法として有用である。特定の場合では、本治療は、例えば、多数の型の固形腫瘍（黒色腫、結腸がん、肺がん、乳がん、および頭頸部がん）ならびに血液がん（白血病、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群）を含めた、ｉＮＫＴ細胞調節を受けることが臨床的に示されているがんを有する患者に有用である。
上に開示されている方法のいずれかの一部の実施形態では、対象は、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または移植片拒絶を有するまたは有するリスクがある。対象は、そのような疾患の診断を受けた対象または遺伝子もしくは家族歴の分析に基づいて、そのような疾患に対する素因を有することが決定されている対象であり得る。対象は、移植の準備をしているまたは移植を受けた対象の場合もある。一部の実施形態では、方法は、自己免疫疾患、ＧＶＨＤ、または移植片拒絶を処置するためのものである。
本細胞療法で処置される個体は、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞療法を受ける前に特定の医学的状態に対する処置を受けていても受けていなくてもよい。個体ががんを有する場合、がんは、原発性、転移性、治療抵抗性などであり得る。従来の処置選択肢で消耗した患者。
特定の実施形態では、細胞を患者に用量当たり細胞１０７〜１０９個で提供する。特定の実施形態では、投与レジメンは、リンパ枯渇コンディショニング後に同種異系ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の単回投与である。例えば、フルダラビンおよびシクロホスファミドを用いたリンパ枯渇コンディショニング後に細胞を静脈内に投与することができる。
その後のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療事例のためにｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍有効性を特徴付ける場合、ｉｎ ｖｉｖｏ薬理学的反応を、腫瘍担持ＮＳＧマウスを漸増用量（１×１０６個、５×１０６個、１０×１０６個）のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞で処置することによって測定することができる（群当たりｎ＝８）；ＰＢＳによる処置を対照として含めることができる。例として、２つの腫瘍モデルを利用することができる。Ａ３７５．ＣＤ１ｄ（１×１０６個、ｓ．ｃ．）を固形腫瘍モデルとして使用することができ、ＭＭ．１Ｓ．Ｌｕｃ（５×１０６個、ｉ．ｖ．）を血液悪性腫瘍モデルとして使用することができる。腫瘍成長を、サイズを測定すること（Ａ３７５．ＣＤ１ｄ）または生物発光イメージング（ＭＭ．１Ｓ．Ｌｕｃ）のいずれかによってモニタリングすることができる。抗腫瘍免疫応答を、ＰＥＴイメージング、定期的な採血、ならびにエンドポイント腫瘍収集、その後のフローサイトメトリーおよびｑＰＣＲによって測定することができる。ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴによる処置に応答した腫瘍成長の阻害により、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞療法の治療有効性が示され得る。腫瘍阻害とｉＮＫＴ用量の相関により、ｉＮＫＴ細胞の治療的役割が確認され、ヒト治療に関する有効な治療域が示され得る。腫瘍に対するｉＮＫＴ細胞応答の検出により、これらの細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける薬理学的な抗腫瘍活性が実証され得る。
医学的状態の１つもしくは複数の症状を有する医学的状態に関して検査陽性の個体、またはそのような状態が発生するリスクがあると思われる個体に対して方法を使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、本明細書において列挙されているおよび／または当技術分野で公知の障害の炎症性または自己免疫性成分を処置する。
本開示のある特定の態様は、がんの処置および／またはがん抗原の使用に関する。処置されるがんまたは抗原は、当技術分野で公知の任意のがん、または、例えば、上皮がん（例えば、乳がん、消化器がん、肺がん）、前立腺がん、膀胱がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、結腸がん、卵巣がん、脳がん、胃がん、腎細胞癌、膵がん、肝がん、食道がん、頭頸部がん、または結腸直腸がんに関連する抗原であり得る。一部の実施形態では、処置されるがんまたは抗原は、以下のがんうちの１つに由来する：副腎皮質癌、特発性骨髄化生、ＡＩＤＳ関連がん（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫）、肛門がん、虫垂癌、星状細胞腫（例えば、小脳星状細胞腫および大脳星状細胞腫）、基底細胞癌、胆管がん（例えば、肝外胆管がん）、膀胱がん、骨がん（骨肉腫および悪性線維性組織球腫）、脳腫瘍（例えば、神経膠腫、脳幹神経膠腫、小脳または大脳星状細胞腫（例えば、毛様細胞性星状細胞腫、びまん性星状細胞腫、退形成（悪性）星状細胞腫）、悪性神経膠腫、上衣腫、オリゴデングリオーマ、髄膜腫、髄膜肉腫、頭蓋咽頭腫、血管芽腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視路および視床下部神経膠腫、および神経膠芽腫）、乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍（例えば、消化管カルチノイド腫瘍）、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、慢性骨髄増殖性障害、子宮体がん（例えば、子宮がん）、上衣腫、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん（例えば、眼内黒色腫および網膜芽細胞腫）、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、卵巣胚細胞性腫瘍）、妊娠性絨毛性腫瘍、頭頸部がん、肝細胞がん（肝臓がん）（例えば、肝臓癌およびヘパトーマ）、下咽頭がん、膵島細胞癌（膵内分泌部癌）、喉頭がん、喉頭がん、白血病、口唇・口腔がん、口腔がん（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、および肺扁平上皮癌）、リンパ性新生物（例えば、リンパ腫）、髄芽腫、卵巣がん、中皮腫、転移性扁平上皮性頸部がん、口腔がん（ｍｏｕｔｈ ｃａｎｃｅｒ）、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、鼻腔・副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、神経内分泌がん、中咽頭がん、卵巣がん（例えば、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍）、膵がん、副甲状腺がん、陰茎がん、腹膜のがん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫（小グリア細胞腫）、肺リンパ管筋腫症、直腸がん、腎がん（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、腎盂尿管がん（移行上皮がん）、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮膚がん（例えば、非黒色腫（例えば、扁平上皮癌）、黒色腫、およびメルケル細胞癌）、小腸がん、扁平上皮がん、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、結節性硬化症、尿道がん、膣がん、外陰がん、ウィルムス腫瘍、および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するものなど）、またはメイグス症候群。
本開示のある特定の態様は、自己免疫性状態の処置および／または自己免疫関連抗原の使用に関する。処置される自己免疫疾患または抗原は、当技術分野で公知の任意の自己免疫性状態、または、例えば、以下に関連する抗原であり得る：糖尿病、移植片拒絶、ＧＶＨＣ、関節炎（関節リウマチ、例えば、急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風または痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、急性免疫性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、ＩＩ型コラーゲン誘発性関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スチル病、脊椎関節炎、および若年発症関節リウマチ、変形性関節症、慢性進行性関節炎、変形関節炎、慢性原発性多発性関節炎、反応性関節炎、および強直性脊椎炎）、炎症性過剰増殖性皮膚疾患、尋常性乾癬（plaque psoriasis）、滴状乾癬（gutatte psoriasis）、膿疱性乾癬、および爪の乾癬などの乾癬、枯草熱およびヨブ症候群などのアトピー性疾患を含めたアトピー、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、剥脱性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激性接触皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎を含めた皮膚炎、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、慢性自己免疫性蕁麻疹を含めた慢性アレルギー性蕁麻疹および慢性特発性蕁麻疹などの蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死融解症、強皮症（全身性強皮症を含む）、硬化症、例えば、全身性硬化症、脊椎−視覚ＭＳ、一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）、および再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）などの多発性硬化症（ＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症、失調性硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、自己免疫性媒介性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ ｕｌｃｅｒｏｓａ）、顕微鏡的大腸炎、膠原性大腸炎、ポリープ様大腸炎、壊死性腸炎、および全層性大腸炎などの大腸炎、ならびに自己免疫性炎症性腸疾患）、腸炎、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、成人または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含めた呼吸窮迫症候群、髄膜炎、ぶどう膜の全部または一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液学的障害、リウマチ様脊椎炎、リウマチ様滑膜炎、遺伝性血管性浮腫、髄膜炎において見られるような頭蓋神経損傷、妊娠性疱疹、妊娠性類天疱瘡、陰嚢掻痒症（pruritis scroti）、自己免疫性早発性卵巣機能不全、自己免疫性状態に起因する突発性聴力損失、アナフィラキシーおよびアレルギー性かつアトピー性鼻炎などのＩｇＥ媒介性疾患、ラスムッセン脳炎および辺縁系および／または脳幹脳炎などの脳炎、前部ぶどう膜炎、急性前部ぶどう膜炎、肉芽腫性ぶどう膜炎、非肉芽腫性ぶどう膜炎、水晶体起因性ぶどう膜炎（phacoantigenic uveitis）、後部ぶどう膜炎、または自己免疫性ぶどう膜炎などのぶどう膜炎、ネフローゼ症候群を伴う、および伴わない糸球体腎炎（ＧＮ）、例えば、原発性ＧＮ、免疫媒介性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、特発性膜性ＧＮまたは特発性膜性腎症、Ｉ型およびＩＩ型を含めた膜性または膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、ならびに急速進行性ＧＮなどの慢性または急性糸球体腎炎、増殖性腎炎、自己免疫性多腺性内分泌機能障害、形質細胞限局性亀頭炎（balanitis circumscripta plasmacellularis）を含めた亀頭炎、亀頭包皮炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、扁平苔癬、葉状魚鱗癬、表皮溶解性角化症、前がん性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー性の状態および応答、アレルギー反応、アレルギー性またはアトピー性湿疹を含めた湿疹、皮脂欠乏性湿疹、異汗性湿疹、および水疱性掌蹠湿疹、気管支喘息（ａｓｔｈｍａ ｂｒｏｎｃｈｉａｌｅ）、気管支喘息（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｔｈｍａ）、および自己免疫性喘息などの喘息、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症性応答を伴う状態、妊娠中の胎児Ａ−Ｂ−Ｏ血液型などの外来抗原に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、ループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループスおよび円板状エリテマトーデス、脱毛性ループス、皮膚ＳＬＥまたは亜急性皮膚ＳＬＥなどの全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、新生児ループス症候群（ＮＬＥ）、ならびに播種状エリテマトーデスを含めたループス、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含めた若年発症型（１型）糖尿病、および成人発症型糖尿病（２型糖尿病）、ならびに自己免疫性糖尿病。以下も意図されている：サイトカインおよびＴ−リンパ球によって媒介される急性過敏症および遅延型過敏症に関連する免疫応答、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症を含めた肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎、大型血管炎（リウマチ性多発筋痛および巨細胞（高安）動脈炎を含む）、中型血管炎（川崎病および結節性多発性動脈炎／結節性動脈周囲炎を含む）、顕微鏡的多発動脈炎、免疫血管炎、ＣＮＳ血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎などの壊死性血管炎、ならびにチャーグ・ストラウス血管炎または症候群（ＣＳＳ）およびＡＮＣＡ関連小型血管炎などのＡＮＣＡ関連血管炎を含めた血管炎、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含めた溶血性貧血または免疫性溶血性貧血、アジソン病、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、敗血症、外傷または出血に続発するものなどの多臓器傷害症候群、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜抗体病、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病／症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、水疱性類天疱瘡および皮膚類天疱瘡などの類天疱瘡、天疱瘡（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、天疱瘡粘膜類天疱瘡（pemphigus mucus-membrane pemphigoid）、および紅斑性天疱瘡を含む）、自己免疫性多内分泌障害、ライター病または症候群、熱傷、子癇前症、免疫複合体腎炎などの免疫複合体障害、抗体媒介性腎炎、多発ニューロパチー、ＩｇＭ多発ニューロパチーまたはＩｇＭ媒介性ニューロパチーなどの慢性ニューロパチー、慢性または急性ＩＴＰを含めた特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの自己免疫性または免疫媒介性血小板減少症、特発性角膜強膜炎などの強膜炎、上強膜炎、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含めた精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）などの甲状腺炎を含めた自己免疫性内分泌疾患、または亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、自己免疫性多腺性症候群（または多腺性内分泌障害症候群）などの多腺性症候群、ランバート・イートン筋無力症候群またはイートン・ランバート症候群などの神経性腫瘍随伴症候群を含めた腫瘍随伴症候群、スティッフマンまたはスティッフパーソン症候群、アレルギー性脳脊髄炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）またはアレルギー性脳脊髄炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ａｌｌｅｒｇｉｃａ）などの脳脊髄炎および実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎、胸腺腫関連重症筋無力症などの重症筋無力症、小脳変性、神経性筋強直症、眼球クローヌスまたは眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、および感覚性ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＬＩＰ）、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギラン・バレー症候群、ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、線状ＩｇＡ皮膚症、急性熱性好中球性皮膚症、角層下膿疱性皮膚症、一過性棘融解性皮膚症、原発性胆汁性肝硬変症および肺硬変症などの硬変症、自己免疫性腸症症候群、セリアック病（Ｃｅｌｉａｃ ｏｒ Ｃｏｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、セリアックスプルー（グルテン腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、寒冷グロブリン血症、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）、冠動脈疾患、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）などの自己免疫性耳疾患、自己免疫性聴力損失、難治性または再発したまたは再発性多発性軟骨炎などの多発性軟骨炎、肺胞タンパク症、コーガン症候群／非梅毒性角膜実質炎、ベル麻痺、スウィート病／症候群、自己免疫性酒さ、帯状疱疹関連疼痛、アミロイドーシス、非がん性リンパ球増多症、モノクローナルＢ細胞リンパ球増多症（例えば、良性単クローン性免疫グロブリン血症および意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、ＭＧＵＳ）を含む一次リンパ球増多症、末梢性ニューロパチー、腫瘍随伴症候群、てんかんなどのチャネル病、片頭痛、不整脈、筋肉障害、聴覚消失、失明、周期性四肢麻痺、およびＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパチー、限局性または分節性または限局性分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌眼症（endocrine opthalmopathy）、ぶどう膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病学的障害、線維筋痛症、多発性内分泌腺不全症、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期認知症、自己免疫性脱髄性疾患および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーなどの脱髄性疾患、ドレスラー症候群、円形脱毛症、完全脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道蠕動低下、強指症（sclerodactyl））、および毛細血管拡張症）、例えば抗精子抗体に起因する男性および女性自己免疫性不妊症、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形性紅斑、心臓切開術後症候群、クッシング症候群、鳥飼育者肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、アレルギー性肺胞炎および線維性肺胞炎などの肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、寄生虫症、例えばリーシュマニア症、キパノソミアシス（kypanosomiasis）、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、サムプター症候群、カプラン症候群、デング、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、長期隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎（eosinophilic faciitis）、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症（flariasis）、慢性毛様体炎、異色性毛様体炎（heterochronic cyclitis）、虹彩毛様体炎（急性もしくは慢性）、またはフックス毛様体炎などの毛様体炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、ＳＣＩＤ、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、エコーウイルス感染症、敗血症、内毒素血症、膵炎、甲状腺中毒症（thyroxicosis）、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染症、エプスタイン・バーウイルス感染症、流行性耳下腺炎、エバンス症候群、自己免疫性性腺機能不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓血管炎（thromboangitis ubiterans）、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、慢性過敏性肺臓炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小変化型腎症、良性家族性および虚血再灌流障害、移植臓器再灌流、網膜自己免疫、関節の炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道／肺疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化障害、精子形成不全症、自己免疫性溶血、ベック病、寒冷グロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、アレルギー性腸炎、らい性結節性紅斑、特発性顔面麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ熱、ハマン・リッチ病、感音難聴（sensoneur







al hearing loss）、発作性ヘモグロビン尿症（haemoglobinuria paroxysmatica）、性腺機能低下症、限局性回腸炎、白血球減少、伝染性単核球症、横断性脊髄炎（traverse myelitis）、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感神経性眼炎、肉芽腫性精巣炎、膵炎、急性多発性神経根炎、壊疽性膿皮症、ケルバン甲状腺炎（Quervain's thyreoiditis）、後天性脾臓萎縮症、非悪性胸腺腫、白斑、毒素性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤が伴う状態、白血球粘着不全症、サイトカインおよびＴ−リンパ球によって媒介される急性過敏症および遅延型過敏症に関連する免疫応答、白血球漏出が伴う疾患、多臓器傷害症候群、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜抗体病、アレルギー性神経炎、自己免疫性多内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全、Ｉ型自己免疫性多腺性症候群、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、拡張型心筋症などの心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、篩骨、前頭、上顎、または蝶形骨副鼻腔炎、好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増多筋痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増多症、気管支肺炎性アスペルギルス症、アスペルギルス腫、または好酸球を含有する肉芽腫などの好酸球関連障害、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多内分泌自己免疫疾患（polyendocrine autoimmune disease）、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ブルトン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、血管拡張症、膠原病に関連する自己免疫障害、リウマチ、神経疾患、リンパ節炎、血圧応答の低下、血管機能障害、組織傷害、心血管虚血、痛覚過敏、腎臓虚血、脳虚血、および血管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症 障害、糸球体腎炎（glomerulonephritides）、再灌流傷害、虚血性再灌流障害、心筋または他の組織の再灌流傷害、リンパ腫気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性炎症性成分を伴う皮膚疾患、多臓器不全、水疱症、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性障害、眼および眼窩の炎症性障害、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、ナルコレプシー、急性の重篤な炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内増殖症、消化性潰瘍、弁膜炎、移植片対宿主病、接触過敏症、喘息性気道過敏、および子宮内膜症。
さらなる態様は、微生物感染症の処置もしくは予防および／または微生物抗原の使用に関する。処置もしくは予防される微生物感染症または抗原は、当技術分野で公知の任意の微生物感染症、または、例えば、以下に関連する抗原であり得る：炭疽、子宮頸がん（ヒトパピローマウイルス）、ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヘモフィルスインフルエンザｂ菌（Ｈｉｂ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザ（ｆｌｕ）、日本脳炎（ＪＥ）、ライム病、麻疹、髄膜炎菌、サル痘、流行性耳下腺炎、百日咳、肺炎球菌、ポリオ、狂犬病、ロタウイルス、風疹、帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ）（帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ ｚｏｓｔｅｒ））、天然痘、破傷風、腸チフス、結核（ＴＢ）、水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ）（水痘（Ｃｈｉｃｋｅｎｐｏｘ））、および黄熱病。
一部の実施形態では、方法および組成物は、例えば、がん、炎症、感染などの医学的状態を予防するための個体へのワクチン接種用であり得る。
ＶＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は、本発明者が本発明の実施においてよく機能することを発見した技法であり、したがって、それを実施するための好ましい方式を構成すると考えられることが当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
（実施例１）
既製のＩＮＫＴ細胞を操作するための造血幹細胞（ＨＳＣ）による手法
本実施例は、１つまたは複数のＨＬＡ−Ｉ分子および／またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現の欠如または下方調節（lack of or down-regulated surface expression of of one or more HLA-I and/or HLA-II molecules）を含む既製ｉＮＫＴ細胞の生成に関する。特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞を健康なドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から増大させ、その後、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９により操作して、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトする。ヒト集団におけるｉＮＫＴ細胞は変動性が高く、発生頻度が低いので（血液中、約０．００１〜０．１％）、ｉＮＫＴ細胞を得るための代替手段を可能にする方法を生むことが有益である。
本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）をｉＮＫＴ ＴＣＲ遺伝子で遺伝子操作し、これらのＨＳＣをｉＮＫＴ細胞に発達するようにプログラミングすることによってＨＳＣからｉＮＫＴ細胞を生成するための強力な方法を提供する（Smith et al., 2015）。この方法では、ｉＮＫＴ細胞発達を支配する２つの分子機序：１）トランスジェニックｉＮＫＴ ＴＣＲ遺伝子の存在下で内因性ＴＣＲ遺伝子の再編成を遮断する対立遺伝子排除機序、および２）Ｔ細胞がｉＮＫＴ系列の道を進むようにガイドするＴＣＲ指示機序を利用する（Smith et al., 2015）。得られたＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ（ＨＳＣ−ｉＮＫＴ）細胞は、内因性ＴＣＲを発現しない均一な「クローン」集団である。マウス骨髄移植および黒色腫肺転移モデルにおいてこれらのｉＮＫＴ細胞の強力な抗がん有効性を有するマウスＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞が生成されている（Smith et al., 2015）。
ＨＳＣの操作によるヒトｉＮＫＴ細胞は、ヒトＣＤ３４＋末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）をヒトｉＮＫＴ ＴＣＲ遺伝子で遺伝子操作し、その後、操作されたＰＢＳＣをＢＬＴヒト化マウスモデルに移入することによって作製される（図２Ａおよび２Ｂ）。しかし、そのようなｉｎ ｖｉｖｏ手法は、自己ＨＳＣ養子治療にしか変換され得ない。特定の実施形態では、ＴＣＲの操作によるヒトＣＤ３４＋ＨＳＣのクローンＴ細胞への高効率かつ高収量での分化を支持する無血清の「人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）」ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系（図２Ｃおよび２Ｄ）（Seet et al., 2017）を利用する。このＡＴＯ培養系により、ＨＳＣ−ｉＮＫＴ作製をｉｎ ｖｉｔｒｏ系に移すことができ、これに基づいて、既製の普遍的なＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ（ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ）細胞養子治療を利用することができる（図１）。
遺伝子操作された健康なドナーＨＳＣ由来のｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された同種異系ＨＬＡ陰性ヒトｉＮＫＴ細胞が本明細書に包含される。それらの作製の例を以下に提示する。
Ａ．最初のＣＭＣ試験（図３）
特に断りのない限り、ヒトＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血ＣＤ３４＋細胞は、造血幹細胞・前駆細胞の両方を含有する。本明細書では、これらのＣＤ３４＋細胞はＨＳＣと称される。
最初の化学、製造、および管理（ＣＭＣ）試験を行って、ヒトＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける製造を試験する。特定の場合では、二段階ＡＴＯ−□ＧＣ培養系でｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生成されたＨＳＣの操作によるヒトｉＮＫＴ細胞であるＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯ細胞を作製する。
Ｇ−ＣＳＦにより動員されたヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを３名の異なる健康なドナーから採取し、類似体レンチウイルスベクターレンチ／ｉＮＫＴ−ＥＧＦＰで形質導入し、その後、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて二段階ＡＴＯ−αＧＣ培養系で培養した（図３Ａ）。人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養段階では、８週間にわたり、遺伝子操作されたＨＳＣ（ＧＦＰ＋と標識される）をヒトｉＮＫＴ細胞に効率的に分化させ（図３Ｂ）、次いで、ＰＢＭＣ／αＧＣ刺激段階でさらに２〜３週間増大させた（図３Ｃ）。この製造プロセスは、試験した３名のドナー全てについて頑強であり、収量が多く、純度が高いものであった（図３Ｄ）。結果に基づいて、１×１０６個の投入ＨＳＣ（レンチウイルスベクターによる形質導入率は約３０〜５０％）、約３〜９×１０１０個のＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯ細胞（純度＞９５％）を作製することができ、単一のランダムなドナーから１０１２個よりも多くの治療用ｉＮＫＴ細胞という理論収量が得られたことが推定された（図３Ｄ）。
Ｂ．最初の薬理学試験（図４）
最初の薬理学試験を実施して、ヒトＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性を試験した。ヒトＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性を、フローサイトメトリーを使用して試験した。ＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯ細胞（ＡＴＯ培養系でｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生成された、ＨＳＣの操作によるヒトｉＮＫＴ細胞）ヒト化マウスモデルおよびＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞（ＢＬＴ（ヒト骨髄−肝臓−胸腺を生着させたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−においてｉｎ ｖｉｖｏで生成された、ＨＳＣの操作によるヒトｉＮＫＴ細胞）ヒト化マウスモデルのどちらも、内因性ＰＢＭＣ−ｉＮＫＴ細胞と同様の典型的なｉＮＫＴ細胞表現型および機能性を示し、メモリーＴ細胞マーカーＣＤ４５ＲＯおよびＮＫ細胞マーカーＣＤ１６１を高レベルで発現し（図４Ａ）、ＣＤ４およびＣＤ８補助受容体を混合パターンで発現し（ＣＤ４シングルポジティブ、ＣＤ８シングルポジティブ、およびＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ）（図４Ａ）、ＩＦＮ−γなどのエフェクターサイトカインならびにパーフォリンおよびグランザイムＢなどの細胞傷害性分子を従来のＰＢＭＣ−Ｔｃ細胞と比較して極めて高レベルで産生した（図４Ｂ）。
Ｃ．最初の有効性試験（図５）
最初の有効性試験を実施して、ヒトＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ細胞の腫瘍殺滅有効性を試験した。ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株ＭＭ．１Ｓを、ヒトＣＤ１ｄ遺伝子、ならびにホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）レポーター遺伝子および高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レポーター遺伝子を過剰発現するように操作した（図５Ａ）。次いで、得られたＭＭ．１Ｓ−ｈＣＤ１ｄ−ＦＧ細胞株を使用して、ｉＮＫＴ細胞により標的化される腫瘍殺滅を混合培養アッセイにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで（図５Ｂ）、およびＮＳＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−）マウスヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）転移モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで（図５Ｄ）試験した。ＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯ細胞およびＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞のどちらもｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて効率的な同等の腫瘍殺滅を示した（図５Ｃ）。ＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞はｉｎ ｖｉｖｏでも試験し、ＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞により頑強な腫瘍殺滅が媒介された（図５Ｅおよび５Ｆ）。固形腫瘍に対する腫瘍殺滅有効性を試験するために、Ａ３７５−ｈＣＤ１ｄ−ＦＧヒト黒色腫細胞株を生成した（図５Ｇ）。ＮＳＧマウスＡ３７５−ｈＣＤ１ｄ−ＦＧ異種移植固形腫瘍モデルにおいて試験した場合（図５Ｈ）、ＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞により固形黒色腫腫瘍成長が効率的に抑制された（図５Ｉ）。重要なことに、ＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞は、腫瘍部位への標的化浸潤を示し、これはおそらくこれらの細胞の強力な腫瘍輸送能に起因するものであった（図５Ｊおよび５Ｋ）。
Ｄ．最初の安全性試験−ＧｖＨＤ／毒性学／腫瘍形成性（図６）
ヒトＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける長期ＧｖＨＤ、毒性学、および腫瘍形成性を評価する（access）ために、ＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞を抱えたＢＬＴヒト化マウスをＨＳＣ移入後５カ月にわたってモニタリングし、その後、組織採取および病理学的分析を行った（図６）。マウス体重（図６Ａ）、生存（図６Ｂ）、および病理組織（図６Ｃ）のモニタリングにより、ＢＬＴ−ｉＮＫＴＴＫマウス（図２Ａ）では、対照ＢＬＴマウスと比較して、ＧｖＨＤも毒性も腫瘍形成性もないことが明らかになった。
Ｅ．最初の安全性試験−ＰＥＴイメージングおよび安全性管理のためのｓｒ３９ＴＫ遺伝子（図７）
ヒトＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ（ＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ）細胞を抱えるＢＬＴ−ｉＮＫＴＴＫヒト化マウスを試験した（図７Ａ）。ＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞を、レンチ／ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫレンチウイルスベクターで形質導入したヒトＨＳＣから工学的に作製した（図１３）。ＰＥＴイメージングをＣＴスキャンと併せて使用し、ＢＬＴ−ｉＮＫＴＴＫマウスのリンパ組織にわたる、特に骨髄（ＢＭ）および脾臓への遺伝子操作されたヒト細胞の分布を検出した（図７Ｂ）。ＢＬＴ−ｉＮＫＴＴＫマウスをＧＣＶで処置することにより、遺伝子操作されたヒト細胞が体内にわたって有効に枯渇した（図７Ｂ）。重要なことに、ＧＣＶにより誘導される枯渇は特異的であった。これは、フローサイトメトリーによって測定したところＢＬＴ−ｉＮＫＴＴＫマウスにおいてＨＳＣの操作によるヒトｉＮＫＴ細胞が選択的に枯渇し、他のヒト免疫細胞は枯渇しなかったことによって証明された（図７Ｃおよび７Ｄ）。
Ｆ．普遍的なＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ細胞の作製
特定の実施形態では、同種異系ＨＳＣの操作によるＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ陰性ヒトｉＮＫＴ細胞（普遍的なＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ細胞、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞と表される）を含む、幹細胞に基づく治療用組成物を作製する。
レンチ−ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫベクターの生成
ある特定の実施形態では、臨床的なレンチウイルスベクターレンチ／ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫを利用する（図８Ａ）。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ−ＣＩＩＴＡ−ｇＲＮＡ複合体の生成
特定の実施形態では、強力なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ遺伝子編集ツールを使用して、ヒトＨＳＣにおけるＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊する（Ren et al., 2017；Liu et al., 2017）。そのような遺伝子編集されたＨＳＣに由来するｉＮＫＴ細胞は、ＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ発現を欠き、それにより、宿主Ｔ細胞による拒絶反応が回避される。最初の試験において、ＣＩＲＳＰＲ−Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ−ＣＩＩＴＡ−ｇＲＮＡ複合体を首尾よく生成し、試験した（Ｃａｓ９はＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ ＭａｃｒｏＬａｂ Ｆａｃｉｌｉｔｙから；ｇＲＮＡはＳｙｎｔｈｅｇｏから；Ｂ２Ｍ−ｇＲＮＡ配列５’−ＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＵＡＡＧＧＣＣＡ−３’（配列番号６８）（Ren et al., 2017）；ＣＩＩＴＡ−ｇＲＮＡ配列５’−ＧＡＵＡＵＵＧＧＣＡＵＡＡＧＣＣＵＣＣＣ−３’（配列番号６９）（Abrahimi et al., 2015））。「オフターゲット」の影響を最小限にするために、ＩＤＴの高忠実度のＣａｓ９タンパク質を利用することができる（Kohn et al., 2016；Slaymaker et al., 2016；Tsai and Joung, 2016）。予備試験した単一の優性Ｂ２Ｍ−ｇＲＮＡおよびＣＩＩＴＡ−ｇＲＮＡを用いて開始することができるが、特定の実施形態では、遺伝子編集効率をさらに改善するために、多数のｇＲＮＡを組み入れる。
Ｇ−ＣＳＦにより動員されたＣＤ３４＋ＨＳＣの採取
商業的なベンダーから少なくとも２名の異なる健康なドナーのＧ−ＣＳＦにより動員されたｌｅｕｋｏｐａｋを得ることができ、その後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ系を使用してＣＤ３４＋ＨＳＣを単離することができる。単離後、Ｇ−ＣＳＦにより動員されたＣＤ３４＋ＨＳＣを凍結保存し、後で使用することができる。
ＨＳＣの遺伝子操作
ＨＳＣを、レンチ−ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫベクターおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ−ＣＩＩＴＡ−ｇＲＮＡ複合体の両方を用いて操作することができる。凍結保存したＣＤ３４＋ＨＳＣを解凍し、レトロネクチンでコーティングしたフラスコ中、１％ＨＡＳおよびＴＰＯ／ＦＬＴ３Ｌ／ＳＣＦを補充したＸ−Ｖｉｖｏ−１５無血清培地で１２時間培養し、その後、レンチ／ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫベクターを添加してさらに８時間培養することができる（Gschweng et al., 2014）。レンチウイルスベクター形質導入の２４時間後、細胞を、予め形成されたＣＩＲＳＰＲ−Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ−ＣＩＩＴＡ−ｇＲＮＡ複合体と混合し、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して電気穿孔に供することができる。最初の試験において、ランダムなドナー由来のＣＤ３４＋ＨＳＣを使用して高いレンチウイルスベクターによる形質導入率（形質導入率＞５０％、細胞当たりＶＣＮ＝１〜３；図８Ｂ）および高いＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ発現欠損（単一ラウンドの電気穿孔後のＨＬＡ−Ｉ／ＩＩダブルネガティブ細胞が約６０％；図８Ｃ）が実現された。効率を改善するために遺伝子編集手順をさらに最適化することができる。評価パラメータは、細胞生存率、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡ部位を標的とするＴ７Ｅ１アッセイによって測定される欠失（インデル）頻度（オンターゲット効率）および次世代配列決定（ＮＧＳ）（Tsai et al., 2015）、フローサイトメトリーによるＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ発現、ならびにコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイによって測定される編集されたＨＳＣの造血機能を含み得る。ＨＳＣの３０〜５０％の三重遺伝子編集効率を実現することができ、最初の試験においてＡＴＯ培養後に投入ＨＳＣ当たり約１００個のｉＮＫＴ細胞を生じさせることができた（図３）。
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の作製
レンチウイルスベクターおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ｇＲＮＡにより２重に遺伝子操作されたＨＳＣを２段階ＡＴＯ−αＧＣ ｉｎ ｖｉｔｒｏ系で培養して、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を産生させることができる。段階１では、標準のプロトコールに従って遺伝子操作されたＨＳＣを人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養によってｉＮＫＴ細胞に分化させる（図８Ａ）（Seet et al., 2017）。ＡＴＯは、ＨＳＣ（１×１０４個）と照射（８０Ｇｙ）ＭＳ５−ｈＤＬＬ１間質細胞（１．５×１０５個）の混合物を含有する細胞スラリー（５μｌ）を滴下形式で０．４μｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌトランスウェルインサート上にピペッティングし、次いで、インサートをＲＢ２７培地１ｍｌを含有する６ウェルプレートに入れることを伴う（Seet et al., 2017）。８週間にわたり、培地を４日毎に交換する（Seet et al., 2017）。段階１からの総収集物は細胞の混合物を含有すると予測される。精製ステップを実施して、ＭＡＣＳ選別（２Ｍ２／Ｔｕ３９ ｍＡｂ媒介性負の選択、その後、６Ｂ１１ ｍＡｂ媒介性正の選択）によってＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を精製することができる（図８Ｄ）。このＭＡＣＳ選別戦略の効果を示す最初の試験（図８Ｅおよび８Ｆ）を完了する。次いで、精製されたＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を段階２培養下に置き、照射したマッチドナーＣＤ３４−ＰＢＭＣを負荷したαＧＣで刺激し（ＡＰＣとして）、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を補充する（図８Ａ）。最初の試験に基づいて（図３）、１×１０６個の出発ＨＳＣ毎に約１０１０個の規模のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞（純度＞９９％）を作製することができ、単一のランダムなドナーのＨＳＣから約１０１２個の純粋かつ均一のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞製品がもたらされる（図８Ａ）。次いで、得られたＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を凍結保存し、前臨床的特徴付けのための準備を整えることができる。
Ｇ．ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の特徴付け
同一性／活性／純度
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞製品の純度、表現型、および機能性を、予め確立されたフローサイトメトリーアッセイを使用して試験することができる（図４）。特定の場合では、純度＞９９％のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞（ｈＴＣＲαβ＋６Ｂ１１＋ＨＬＡ−Ｉ／ＩＩｎｅｇとしてゲーティングされる）が得られる。特定の実施形態では、これらのＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、典型的なｉＮＫＴ細胞表現型（ｈＣＤ４５ＲＯｈｉｈＣＤ１６１ｈｉｈＣＤ４＋／−ｈＣＤ８＋／−）を示し、対立遺伝子排除に起因して検出可能な内因性ＴＣＲを発現せず（Seet et al., 2017；Smith et al., 2015；Giannoni et al., 2013）、過剰量のエフェクターサイトカイン（ＩＦＮ−γ）および細胞傷害性分子（グランザイムＢ、パーフォリン）を産生することによってＰＢＭＣ／αＧＣ刺激に応答する（図４）（Watarai et al., 2008）。
薬物動態学／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を腫瘍担持ＮＳＧマウスに養子移入することによってこれらの細胞の生体内分布およびｉｎ ｖｉｖｏダイナミクスを試験することができる。例えば、予め確立されたＡ３７５ヒト黒色腫固形腫瘍異種移植モデルを使用することができる（図５Ｈ）。フローサイトメトリー分析を実施して、組織内のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の存在を試験することができる。確立されたプロトコールに従ってＰＥＴイメージングを実施して、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の全身分布を試験することができる（図７）。最初の試験に基づいて、特定の実施形態では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、腫瘍担持動物において養子移入後しばらくの間存続することができ、リンパ器官（脾臓および骨髄）に戻ることができ、最も重要なことに、固形腫瘍に移動し、浸潤することができる（図５Ｉ〜５Ｋ）。
作用機序（ＭＯＡ）
ｉＮＫＴ細胞は、多数の機序によって腫瘍を標的とし得る：１）ＣＤ１ｄ＋腫瘍細胞をｉＮＫＴ ＴＣＲ刺激によって直接死滅させることができ、２）腫瘍関連抗原提示細胞（絶えずＣＤ１ｄを発現する）によって提示される腫瘍由来の糖脂質を認識し、次いで、ＮＫ細胞およびＣＴＬなどの下流のエフェクター細胞を活性化し、ＣＤ１ｄ−腫瘍細胞を死滅させることによって、これらのＣＤ１ｄ−腫瘍細胞を間接的に標的とすることができる（図９Ａ）（Vivier et al., 2012）。多くのがん細胞が、ｉＮＫＴ細胞を刺激し得る糖脂質を産生するが、そのような「変更された」糖脂質の性質はまだ解明されていない（Bendelac et al., 2007）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ直接腫瘍殺滅アッセイを使用したところ（図９Ｂ）、治療代用物ＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯおよびＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞は腫瘍細胞をＣＤ１ｄ／ＴＣＲ依存的に直接死滅させた（図９Ｃ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ混合培養アッセイを使用して（図９Ｄ）、ＡＰＣによって刺激したＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞により、ＮＫ細胞を活性化し、ＣＤ１ｄ−ＨＬＡ−Ｉ−／−Ｋ５６２ヒト骨髄性白血病細胞を死滅させることができたことがさらに示された（図９Ｅ）。これらの予め確立されたアッセイを利用して、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞による腫瘍細胞の標的化を試験することができる。特定の実施形態では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、直接殺滅およびアジュバント効果の両方によって腫瘍を標的とすることができる。
有効性
予め確立されたｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用してＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の腫瘍殺滅有効性を試験することができる（図５）。例えば、ヒト血液がんモデル（ＭＭ１．Ｓ多発性骨髄腫）およびヒト固形腫瘍モデル（Ａ３７５黒色腫）の両方を使用することができる（図５）。ある特定の実施形態では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞により、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＭＭ１．ＳおよびＡ３７５腫瘍細胞の両方を、治療代用物ＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯおよびＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞で観察されるものと同様に有効に死滅させることができる（図５）。
安全性
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ養子治療の安全性を、例として３つの側面：ａ）一般的な毒性／腫瘍形成性、ｂ）免疫原性、およびｃ）自殺遺伝子「殺滅スイッチ」に関して試験することができる。１）ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の長期ＧｖＨＤ（レシピエント動物組織に対するもの）、毒性学、および腫瘍形成性を、これらの細胞をＮＳＧマウスに養子移入し、レシピエントマウスを２０週間モニタリングし、確立されたプロトコールに従った最終的な病理分析で終了することによって試験することができる（図６）。ＧｖＨＤ、毒性、および腫瘍形成性のいずれも予測されない（図６）。２）免疫細胞に基づく養子治療に関しては、常に２つの免疫原性の懸念がある：ａ）移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）応答、およびｂ）宿主対移植片（ＨｖＧ）応答。操作された安全管理戦略により、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞製品に関して可能性のあるＧｖＨＤおよびＨｖＧリスクが軽減する（図１０Ａ）。可能性のあるＧｖＨＤおよびＨｖＧ応答は、確立されたｉｎ ｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ（図１０Ｂおよび１０Ｄ）およびｉｎ ｖｉｖｏ混合リンパ球養子移入（ＭＬＴ）アッセイ（図１０Ｇ）を使用して試験される。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＭＬＣアッセイの読み取りは、ＥＬＩＳＡによって分析されるＩＦＮ−γ産生であり得、一方、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＬＴアッセイの読み取りは、採血およびフローサイトメトリーによって分析される、標的とされた細胞の排除であり得る（ＧｖＨＤ応答の測定値としてミスマッチドナーＰＢＭＣの殺滅、またはＨｖＧ応答の測定値としてＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の殺滅のいずれか）。最初の試験に基づいて、特定の実施形態では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞により宿主動物組織に対するＧｖＨＤ応答は誘導されず（図６）、ミスマッチドナーＰＢＭＣに対するＧｖＨＤ応答も誘導されない（図１０Ｃ）。特定の実施形態では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、ＨｖＧにより誘導される排除に対して抵抗性である。最初の試験から、ＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ発現を有するとしても、ＨＳＣ−ｉＮＫＴＡＴＯ細胞はすでにミスマッチドナーＰＢＭＣ Ｔ細胞の弱い標的になっていることが示された（図１０Ｅ）。特定の場合では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞に対するＴ細胞媒介性ＨｖＧ応答は全くない。興味深いことに、最初の試験から、代用物ＨＳＣ−ｉＮＫＴＢＬＴ細胞がミスマッチドナーＮＫ細胞による殺滅に対して抵抗性であることが示された（図１０Ｆ）。一部の場合では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞におけるＨＬＡ−Ｉ発現の欠如により、これらの細胞がＮＫ殺滅をより受けやすくなり得る。したがって、最終的なＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞製品を試験してもよい。３）確立されたプロトコールに従ってＧＣＶを投与することにより、レシピエントＮＳＧマウスにおけるＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の排除を試験することができる（図７）。最初の試験に基づいて、ｓｒ３９ＴＫ自殺遺伝子は、安全のために必要な場合にＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を排除するための強力な「殺滅スイッチ」として機能し得る。
併用療法
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を併用免疫療法について調べることができる。具体的には、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ養子治療をチェックポイント遮断療法（例えば、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４遮断）と組み合わせることで相乗的な治療効果がある（Pilones et al., 2012；Durgan et al., 2011）。予め確立されたヒト黒色腫固形腫瘍モデル（Ａ３７５−ｈＣＤ１ｄ−ＦＧ）を使用することができる（図１１Ａ）。次世代の普遍的ＣＡＲ−ｉＮＫＴおよびＴＣＲ−ｉＮＫＴ治療（ＵＨＳＣＣＡＲ−ｉＮＫＴおよびＵＨＳＣＴＣＲ−ｉＮＫＴ治療と表される）のために、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を、がん標的化ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）またはＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）を発現するようにさらにに操作することができる（Oberschmidt et al., 2017；Bollino and Webb, 2017；Heczey et al., 2014；Chodon et al., 2014）。ＵＨＳＣＣＡＲ−ｉＮＫＴ治療を試験するために、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞にＣＤ１９−ＣＡＲ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターで形質導入することができる（図１１Ｂ）。その間に、例としてヒト黒色腫細胞株Ａ３７５−ｈＣＤ１ｄ−ＦＧを、ヒトＣＤ１９抗原を過剰発現するようにさらに操作することができる（図１１Ｃ）。Ａ３７５−ｈＣＤ１ｄ−ｈＣＤ１９−ＦＧ腫瘍異種移植モデルを使用してＵＨＳＣＣＡＲ−ｉＮＫＴ細胞の抗腫瘍有効性を試験することができる（図１１Ｄ）。ＵＨＳＣＴＣＲ−ｉＮＫＴ治療を試験するために、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞にＮＹ−ＥＳＯ−１ ＴＣＲ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターで形質導入することができる（図１１Ｅ）。Ａ３７５−ｈＣＤ１ｄ−ＦＧ細胞株を、ヒトＨＬＡ−Ａ２分子およびＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を過剰発現するようにさらに操作することができる（図１１Ｆ）。Ａ３７５−ｈＣＤ１ｄ−Ａ２／ＥＳＯ−ＦＧ腫瘍異種移植モデルを使用してＵＨＳＣＴＣＲ−ｉＮＫＴ細胞の抗腫瘍有効性を試験することができる（図１１Ｇ）。
Ｈ．薬理学の実施形態
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ治療に関する薬物機序
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴは、少なくとも一部の場合では、１）ドナーＨＳＣを、ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現するようにレンチウイルスベクターによって遺伝子改変することおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集によってＨＬＡをノックアウトすること、２）ＡＴＯ培養によってｉｎ ｖｉｔｒｏでｉＮＫＴ細胞に分化させること、３）ｉｎ ｖｉｔｒｏでｉＮＫＴ細胞を増大させること、ならびに４）製剤化し、凍結保存することによって生成される細胞製品である。少なくとも一部の実施形態では、この細胞製品は、患者に注入されると、多数の機序を使用して、腫瘍細胞を標的とし、根絶することができる。注入された細胞は、ＣＤ１ｄ＋腫瘍細胞を直接認識し、それを細胞傷害性によって死滅させることができる。注入された細胞は、ＩＦＮ−γなどのサイトカインを分泌して、ＮＫ細胞を活性化してＨＬＡ陰性腫瘍細胞を死滅させることができ、また、ＤＣも活性化し、今度はそれにより細胞傷害性Ｔ細胞が刺激されて、ＨＬＡ陽性腫瘍細胞を死滅させる。したがって、一連のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験を利用して、この細胞製品のがん治療に関する薬理学的有効性を実証することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける表面および機能的特徴付け
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を生成するための効率的なプロトコールが本明細書に提示される。Ｂ２ＭのノックアウトによってクラスＩ ＨＬＡの発現を除去するためのＨＳＣの効率的な遺伝子編集も実証される。マルチプレックス編集ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を活用すると、検証されたｇＲＮＡ配列を使用して（Abrahimi et al., 2015）、ＨＬＡ−ＩＩ発現の重要な調節因子であるクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）の遺伝子をノックアウトすることにより、クラスＩＩ ＨＬＡ発現を同時に妨害することもできる（Steimle et al., 1994）。したがって、ＨＬＡ−ＩおよびＨＬＡ−ＩＩ発現を妨害するためのこの遺伝子編集ステップならびにマイクロビーズによる精製ステップを組み入れることにより、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を生成することができる（詳細は本明細書の他の箇所に提示されている）。これらの操作されたｉＮＫＴ細胞の純度および表面表現型を測定するために、フローサイトメトリー分析を使用することができる。細胞純度は、ＴＣＲ Ｖα２４−Ｊα１８（６Ｂ１１）＋ＨＬＡ−Ｉ／ＩＩｎｅｇによって特徴付けることができる。少なくとも一部の場合には、このｉＮＫＴ細胞集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１６１＋であるはずであり、これは、メモリーおよびＮＫ表現型を示し、ＣＤ４＋ＣＤ８−（ＣＤ４シングルポジティブ）、ＣＤ４−ＣＤ８＋（ＣＤ８シングルポジティブ）、およびＣＤ４−ＣＤ８−（ダブルネガティブ（double-genative）、ＤＮ）を示す（Kronenberg and Gapin, 2002）。最近の試験でＣＤ６２Ｌの発現がｉＮＫＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ持続性およびそれらの抗腫瘍活性と関連することが示されたので（Tian et al., 2016）、ＣＤ６２Ｌ発現を解析することができる。これらの表現型のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴをＰＢＭＣ由来のｉＮＫＴと比較することができる。ＲＮＡｓｅｑを使用して、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴおよびＰＢＭＣ ｉＮＫＴ細胞に対する比較遺伝子発現解析を実施することができる。
ＰＢＭＣ ｉＮＫＴをベンチマーク対照として使用し、ＩＦＮ−γ産生および細胞傷害性アッセイを使用して、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴの機能的特性を評価することができる。ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を、αＧａｌＣｅｒをパルスした照射ＰＢＭＣを用いてシミュレートすることができ、１日刺激から収集された上清をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡに供する（Smith et al,. 2015）。ｉＮＫＴ細胞に対して、６時間にわたって刺激した後にＩＦＮ−γの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）も実施することができる。エフェクターＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を、ルシフェラーゼおよびＧＦＰを発現するように操作された、αＧＣが負荷されたＡ３７５．ＣＤ１ｄ標的細胞と一緒に４時間インキュベートすることによって細胞傷害性アッセイを行うことができ、その発光強度に関してプレートリーダーによって細胞傷害性を測定することができる。ｓｒ３９ＴＫはＰＥＴ／自殺遺伝子として導入されるので、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴをガンシクロビル（ＧＣＶ）と一緒にインキュベートすることによってその機能を確証することができ、ＭＴＴアッセイおよびアネキシンＶに基づくフローサイトメトリーアッセイによって細胞生存率を測定することができる。
薬物動態学／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）試験
ＰＫ／ＰＤ試験により、動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで以下を決定することができる：１）注入されたＵＨＳＣ−ｉＮＫＴの増大カイネティクスおよび持続性；２）種々の組織／器官におけるＵＨＳＣ−ｉＮＫＴの体内分布；３）ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴの腫瘍への輸送能およびこの濾過が腫瘍成長にどのように関連するか。Ａ３７５．ＣＤ１ｄ（Ａ３７５．ＣＤ１ｄ）腫瘍を担持する免疫不全ＮＳＧマウスを固形腫瘍動物モデルとして利用することができる。試験設計を図１１に概説する。細胞用量群の２つの例（１×１０６個および１０×１０６個；ｎ＝８）を調査することができる。−４日目に腫瘍を接種し（ｓ．ｃ．）、０日目にベースラインＰＥＴイメージングおよび採血を行う。その後、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を静脈内に注入し（ｉ．ｖ．）、１）７日目および２１日目の生きている動物におけるＰＥＴイメージング；２）７日目、１４日目および２１日目の定期的な採血；３）２１日目の動物屠殺後のエンドポイント組織採取によってモニタリングする。種々の採血から採取された細胞をフローサイトメトリーによって分析することができる；特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞はＴＣＲαβ＋６Ｂ１１＋である。ｉＮＫＴサブセットが経時的にどれほど変動するかを知るために、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１６１、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ４／ＣＤ８などの他のマーカーの発現を調べることができる。ｓｒ３９ＴＫを介したＰＥＴイメージングにより、腫瘍および骨、肝臓、脾臓、胸腺などの他の組織／器官におけるｉＮＫＴ細胞の存在を追跡することが可能になる。試験の最後に、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の分布を調べるために、腫瘍および脾臓、肝臓、脳、心臓、腎臓、肺、胃、骨髄、卵巣、腸などを含めたマウス組織をｑＰＣＲ解析のために収集する。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍有効性
ｉｎ ｖｉｖｏ薬理学的反応を、腫瘍担持ＮＳＧマウスを漸増用量（１×１０６個、５×１０６個、１０×１０６個）のＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞で処置することによって測定する（群当たりｎ＝８）；ＰＢＳによる処置を対照として含める。例として、２つの腫瘍モデルを利用することができる。Ａ３７５．ＣＤ１ｄ（１×１０６個、ｓ．ｃ．）を固形腫瘍モデルとして使用することができ、ＭＭ．１Ｓ．Ｌｕｃ（５×１０６個、ｉ．ｖ．）を血液悪性腫瘍モデルとして使用することができる。腫瘍成長を、サイズを測定すること（Ａ３７５．ＣＤ１ｄ）または生物発光イメージング（ＭＭ．１Ｓ．Ｌｕｃ）のいずれかによってモニタリングする。抗腫瘍免疫応答を、ＰＥＴイメージング、定期的な採血、ならびにエンドポイント腫瘍収集、その後のフローサイトメトリーおよびｑＰＣＲによって測定する。ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴによる処置に応答した腫瘍成長の阻害により、提唱されたＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞療法の治療有効性が示される。腫瘍阻害とｉＮＫＴ用量の相関により、ｉＮＫＴ細胞の治療的役割が確認され、ヒト治療に関する有効な治療域が示され得る。腫瘍に対するｉＮＫＴ細胞応答の検出により、これらの細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける薬理学的な抗腫瘍活性が実証される。
作用機序（ＭＯＡ）
ｉＮＫＴ細胞は、直接殺滅によって、またはＩＦＮ−γを大量放出して、ＮＫ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞を腫瘍の根絶へと方向付けることによってのいずれかで腫瘍細胞を標的とすることが公知である（Fujii et al., 2013）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬理学試験により、直接細胞傷害性のエビデンスがもたらされる。ここで、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍反応性の補助におけるＮＫ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の可能性のある役割を調査することができる。腫瘍担持ＮＳＧマウス（Ａ３７５．ＣＤ１ｄまたはＭＭ．１Ｓ．Ｌｕｃ）に、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴを単独で（上記のｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて選択される用量）またはＰＢＭＣ（ミスマッチドナー、５×１０６個）と組み合わせて注入することができる；ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴはＭＨＣ陰性であるので、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴと無関係のＰＢＭＣとの間で同種異系免疫応答は予測されない。腫瘍成長をモニタリングし、ＰＢＭＣ群を伴う場合と伴わない場合を比較することができる（群当たりｎ＝８）。組合せ群でより大きな抗腫瘍応答が観察される場合、少なくとも特定の実施形態では、ＰＢＭＣの成分、おそらくＮＫ細胞および／またはＣＤ８Ｔ細胞が治療有効性を高める役割を果たすことが示される。それらの個々の役割をさらに決定するために、ＮＫ細胞を枯渇させたＰＢＭＣ（ＣＤ５６ビーズによって）、ＣＤ８Ｔ細胞を枯渇させたＰＢＭＣ（ＣＤ８ビーズによって）、または骨髄系細胞を枯渇させたＰＢＭＣ（ＣＤ１４ビーズによって）をＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞と一緒に腫瘍担持マウスに共注入することができる。ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４などの免疫チェックポイント阻害因子によりｉＮＫＴ細胞機能が調節されることが示唆されている（Pilones et al., 2012；Durgan et al., 2011）。抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４による処置をＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ治療に追加することにより、これらの分子によりＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ治療がどのようにモジュレートされるかを理解し、例えば、組合せがん治療に関する設計に関する有益な手引きを提供することができる。
Ｉ．化学、製造および管理の複数の実施形態
ＣＭＣ概要
ある特定の実施形態では、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴの製造は、１）Ｇ−ＣＳＦにより動員されたｌｅｕｋｏｐａｋを採取すること；２）ＧＣＳＦ−ｌｅｕｋｏｐａｋを精製してＣＤ３４＋ＨＳＣにすること；３）ＨＳＣにレンチウイルスベクターレンチ／ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫで形質導入すること；４）Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって遺伝子編集すること；５）ＡＴＯによってｉｎ ｖｉｔｒｏでｉＮＫＴ細胞に分化させること；６）ｉＮＫＴ細胞を精製すること；７）ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増大させること；８）細胞を採取し、製剤化し、凍結保存することを伴う（図１４）。例として、２つの原薬（レンチ／ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫベクターおよびＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞）が存在し、最終医薬品は、少なくとも一部の場合では、注入用バッグに入った、製剤化され凍結保存されたＵＨＳＣ−ｉＮＫＴである。
１．ベクターの製造
ベクター構造
ＨＳＣを遺伝子操作してｉＮＫＴ細胞にするための１つのベクターは、ヒトｉＮＫＴ ＴＣＲ遺伝子をｓｒ３９ＴＫ ＰＥＴイメージング／自殺遺伝子と一緒にコードするＨＩＶ−１由来レンチウイルスベクターレンチ／ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫである（図１３）。この第３世代自己不活化型（ＳＩＮ）ベクターの重要な成分は以下の通りである：１）３’自己不活化型長末端反復（ΔＬＴＲ）；２）ψ領域ベクターゲノムパッケージングシグナル；３）スプライシングされていないベクターＲＮＡの核外輸送を増強するためのＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）；４）ベクターゲノムの核内移行を容易にするための中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）；５）マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来の内部プロモーターによって駆動される、ヒトｉＮＫＴ ＴＣＲのα鎖遺伝子（ＴＣＲα）およびβ鎖遺伝子（ＴＣＲβ）、ならびにＰＥＴ／自殺遺伝子ｓｒ３９ＴＫ（Gschweng et al., 2014）の発現カセット。ｉＮＫＴ ＴＣＲαおよびＴＣＲβおよびｓｒ３９ＴＫ遺伝子は全て、それらの最適な共発現を実現するために、コドン最適化され、２Ａ自己切断性配列（Ｔ２ＡおよびＰ２Ａ）と連結したものである（Gschweng et al., 2014）。
ベクターの品質管理
ベクター製品が高品質であることを確実にするために、一連のＱＣアッセイを実施することができる。ベクター同一性、ベクター物理的力価、およびベクター純度（無菌性、マイコプラズマ、ウイルス夾雑物、複製コンピテントレンチウイルス（ＲＣＬ）試験、内毒素、残留ＤＮＡおよびベンゾナーゼ）などの標準のアッセイをＩＵ ＶＰＦで行い、試験成績書（ＣＯＡ）に提示する。実施することができる追加的なＱＣアッセイとしては、１）形質導入／生物学的力価（ＨＴ２９細胞に段階希釈物で形質導入し、ｄｄＰＣＲを実施することによるもの、≧１×１０６ＴＵ／ｍｌ）；２）ベクタープロウイルス完全性（形質導入されたＨＴ２９細胞のゲノムＤＮＡのベクターが組み込まれた部分の配列決定によるもの、元のベクタープラスミド配列と同じ）；３）ベクター機能が挙げられる。ベクター機能は、ヒトＰＢＭＣ Ｔ細胞に形質導入することによって測定することができる（Chodon et al., 2014）。ｉＮＫＴ ＴＣＲ遺伝子の発現は、ｉＮＫＴ ＴＣＲに特異的な６Ｂ１１による染色によって検出することができる（Montoya et al., 2007）。発現されたｉＮＫＴ ＴＣＲの機能性を、αＧａｌＣｅｒによる刺激に応答したＩＦＮ−γ産生によって分析することができる（Watarai et al,. 2008）。ｓｒ３９ＴＫ遺伝子の発現および機能性を、ペンシクロビルアップデートアッセイおよびＧＣＶ殺滅アッセイによって分析することができる（Gschweng et al., 2014）。ベクターストックの安定性（−８０℃のフリーザー中で保管）を、３カ月毎にその形質導入力価を測定することによって試験することができる。これらのＱＣアッセイを検証することができる。
２．細胞製造および製品の製剤化
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の製造の概要
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、腫瘍細胞を標的とし、それと闘うための「生きた薬物」として機能する原薬の一実施形態である。ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、遺伝子改変されたドナーＨＳＣをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化および増大させることによって生成される。最初のデータから、これらの細胞を実験室規模で作製するための新規の効率的なプロトコールが実証される。これらの細胞を「既製の」細胞製品として作出するために、ＧＭＰと同等の製造プロセスを開発し、検証することができる。例として、作製規模の目標は、バッチ当たり細胞１０１２個であり、これにより、１０００〜１０，０００名の患者が処置されると推定される。
細胞製造プロセス
細胞製造プロセスの一実施形態を、定義された時系列および各工程段階についての重要な「工程内管理（ＩＰＣ）」測定と共に図１３に概説する。ステップ１は、血液採取施設においてＧ−ＣＳＦにより動員されたドナーのＰＢＳＣを収集することであり、これは、多くの病院において常套的な手順になっている（Deotare et al., 2015）。このプロジェクトのためにＨｅｍａＣａｒｅからのＬｅｕｋｏｐａｋ中に新鮮なＰＢＳＣを得ることができる；ＨｅｍａＣａｒｅは、ＩＲＢにより承認された採取プロトコールおよびドナーの同意を有し、臨床試験および商業製品製造を支持することができる（Ｈｅｍａｃａｒｅからのサポートレターは本出願に含まれる）。ステップ２は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ系を使用してＰＢＳＣからＣＤ３４＋ＨＳＣを富化することである；ＵＣＬＡ ＧＭＰ施設にあるそのようなシステムを使用して、このステップを完了することができ、少なくとも１０８個のＣＤ３４＋細胞が得られることが予想される。ＣＤ３４−細胞も採取し、保管する（ステップ７においてＰＢＭＣフィーダーとして使用することができる）。
ステップ３は、ＨＳＣの培養およびベクターの形質導入を伴う。ＣＤ３４＋細胞を、レトロネクチンでコーティングしたフラスコ中１％ＨＡＳ（ＵＳＰ）および成長因子カクテル（ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ−３リガンドおよびｔｐｏ；各５０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＸ−ＶＩＶＯ１５培地で１２時間にわたって培養し、その後、レンチ／ｉＮＫＴ−ｓｒ３９ＴＫベクターを添加し、さらに８時間培養する（Gschweng et al., 2014）。形質導入された細胞についてメチルセルロースアッセイにおいて形成された約５０コロニーを試料採取することによってベクター組込みコピー（ＶＣＮ）を測定し、ｄｄＰＣＲを使用して細胞当たりの平均ベクターコピー数を決定することができる（Nolta et al., 1994）。少なくとも一部の場合では、＞５０％の形質導入を常套的に実現することができ、細胞当たりＶＣＮ＝１〜３である。
ステップ４は、強力なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９マルチプレックス遺伝子編集法を利用して、ＨＳＣにおけるＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡの両方のゲノム遺伝子座を標的とし、それらの遺伝子発現を妨害することであり（Ren et al., 2017；Liu et al., 2017）、編集されたＨＳＣに由来するｉＮＫＴ細胞はＭＨＣ／ＨＬＡ発現を欠き、それにより、宿主免疫系による拒絶反応が回避される。最初のデータから、Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ−ｇＲＮＡの電気穿孔によりＣＤ３４＋ＨＳＣに対するＢ２Ｍ破壊が高効率（フロー分析により約７５％）で成功したことが実証された。Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ２重ノックアウトをＲＮＰの混合物（Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ−ｇＲＮＡおよびＣａｓ９／ＣＩＩＴＡ−ｇＲＮＡ）の電気穿孔によって実現することができる（Abrahimi et al., 2015）。電気穿孔パラメータ、２つのＲＮＰの比、電気穿孔前の幹細胞培養時間（形質導入後２４時間、４８時間、または７２時間）などを変動させることによって、このプロセスを最適化し、検証することができる（Gundry et al., 2016）；ＩＤＴからの高忠実度Ｃａｓ９タンパク質（Slaymaker et al., 2016；Tsai and Joung, 2016）を使用して、「オフターゲットの」影響を最小限にすることができる。例えば、評価パラメータは、生存率、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡ部位を標的とするＴ７Ｅ１アッセイによって測定される欠失（インデル）頻度（オンターゲット効率）および次世代配列決定（ＮＧＳ）、フローサイトメトリーによるＭＨＣ発現、ならびにコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイによって測定される編集されたＨＳＣの造血機能であり得る。
ステップ５は、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養により、改変されたＣＤ３４＋ＨＳＣをｉＮＫＴ細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させることである（Seet et al., 2017）。最初の試験から、ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現するように操作されたＨＳＣから機能的なｉＮＫＴ細胞を効率的に生成することができることが示されている。このデータを元に、１０８個の改変されたＣＤ３４＋ＨＳＣから１０１０個のｉＮＫＴ細胞を作製するための８週間のＧＭＰに適合するＡＴＯ培養プロセスを試験し、検証することができる。ＡＴＯは、ＨＳＣ（５×１０４個）と照射（８０Ｇｙ）ＭＳ５−ｈＤＬＬ１間質細胞（１０６個）の混合物を含有する細胞スラリー（５μｌ）を滴下形式で０．４μｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌトランスウェルインサート上にピペッティングし、次いで、インサートをＲＢ２７培地１ｍｌを含有する６ウェルプレートに入れることを伴う（Seet et al., 2017）；８週間にわたり、培地を４日毎に交換することができる。インサート当たり３つのＡＴＯと考えると、各バッチ作製に対しておよそ１７０個の６ウェルプレートが必要になり得る。ＡＴＯ液滴のプレーティングおよび培地交換のために、バイオセーフティキャビネット内に置かれた自動化されたプログラム可能なピペット操作／分注系（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆからのｅｐＭｏｎｔｉｏｎ ５０７０ｆ）を使用することができる；各ラウンド１７０プレートを完了するためには２時間の操作が必要になり得る。ＡＴＯ培養の最後に、ｉＮＫＴ細胞を収集し、特徴付ける。一例として、ＡＴＯの成分は、ヒトＤＬＬ１を発現させるためのレンチウイルスによる形質導入、その後の細胞選別によって構築されるＭＳ５−ｈＤＬＬ１間質細胞株である。ＧＭＰプロセスの一実施形態の調製では、このポリクローナル細胞集団に対して単一細胞クローン選択プロセスを実施して、いくつかのクローンＭＳ５−ｈＤＬＬ１細胞株を確立することができ、その中から効率的なものを選択し（ＡＴＯ培養によって評価する）、それを使用してマスターセルバンクを生成することができる。認定されたら、このバンクを使用して、将来の臨床グレードのＡＴＯ培養のための照射間質細胞を供給することができる。
ステップ６は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ系を使用してＡＴＯ由来のｉＮＫＴ細胞を精製することである。この精製ステップは、ＭＨＣＩ＋細胞およびＭＨＣＩＩ＋細胞を枯渇させ、ｉＮＫＴ＋細胞を富化するためのものである。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗ビオチンビーズを市販のビオチン化抗Ｂ２Ｍ（クローン２Ｍ２）、抗ＭＨＣＩ（クローンＷ６／３２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）、抗ＭＨＣＩＩ（クローンＴｕ３９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ）、および抗ＴＣＲ Ｖα２４−Ｊα１８（クローン６Ｂ１１）抗体と一緒にインキュベートすることにより、抗ＭＨＣＩビーズおよび抗ＭＨＣＩＩビーズを調製することができる；６Ｂ１１抗体が直接コーティングされたマイクロビーズもＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃからから入手可能である。収集されたｉＮＫＴ細胞を抗ＭＨＣビーズ混合物によって標識し、２回洗浄し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ枯渇プログラムを使用してＭＨＣＩ＋および／またはＭＨＣＩＩ＋細胞を枯渇させる；必要であれば、この枯渇ステップを繰り返して、残留するＭＨＣ＋細胞をさらに除去することができる。その後、標準の抗ｉＮＫＴビーズおよびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ富化プログラムを使用してｉＮＫＴ細胞をさらに精製する。細胞純度をフローサイトメトリーによって測定することができる。
ステップ７は、精製されたｉＮＫＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させることである。検証済みのＰＢＭＣフィーダーに基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ増大プロトコールを使用し、１０１０個の細胞から出発して１０１２個のｉＮＫＴ細胞まで増大させることができる（Yamasaki et al., 2011；Heczey et al., 2014）。この細胞増大に関してＧ−Ｒｅｘに基づくバイオプロセスを評価することができる。Ｇ−Ｒｅｘは、底部にガス透過性膜を有し、より効率的なガス交換が可能な細胞成長フラスコである；Ｇ−Ｒｅｘ５００Ｍフラスコは、１０日間で１００倍の細胞増大を支持する能力を有する（Vera et al., 2010；Bajgain et al., 2014；Jin et al., 2012）。ステップ１で保管しておいたＣＤ３４−細胞（フィーダー細胞として使用される）を解凍し、αＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）をパルスし、照射を行う（４０Ｇｙ）。ｉＮＫＴ細胞を照射フィーダー細胞と混合し（１：４の比）、Ｇ−Ｒｅｘフラスコに播種し（各１．２５×１０８個のｉＮＫＴ、フラスコ８０個）、２週間にわたって増大させる。ＩＬ−２（２００Ｕ／ｍｌ）を２〜３日毎に添加し、培地交換を７日目に一度行う；培地操作は全て蠕動ポンプによって実現することができる。この増大プロセスは、同様のＰＢＭＣフィーダーに基づく増大手順（迅速な増大プロトコールと称される）が多くの臨床試験に関して治療的用Ｔ細胞を作製するためにすでに利用されているので（Dudley et al., 2008；Rosenberg et al., 2008）、ＧＭＰに適合するはずである。
ステップ８は、ステップ７から収集されたｉＮＫＴ細胞（活性な薬物成分）を直接注入用に細胞浮遊液として製剤化することである。少なくとも３ラウンドの広範囲にわたる洗浄後、ステップ７からの細胞を計数し、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ Ａ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（３１．２５％ｖ／ｖ）、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｎｄ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（３１．２５％ｖ／ｖ）、Ｈｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎ（２０％ｖ／ｖ）、Ｄｅｘｔｒａｎ ４０ ｉｎ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｉｎｊｅｃｔ（１０％、ｖ／ｖ）およびＣｒｙｏｓｅｒｖ ＤＭＳＯ（７．５％、ｖ／ｖ）で構成される、注入／低温保管に適合する溶液中に浮遊させることができる（１ｍｌ当たり細胞１０７〜１０８個）；この溶液は、Ｎｏｖａｒｔｉｓの承認されたＴ細胞製品であるチサゲンレクロイセルを製剤化するために使用されている（Grupp et al., 2013）。ＦＤＡに認可された凍結用バッグ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＣｒｙｏＭＡＣＳ凍結用バッグなど）に充填したら、製品を速度制御型フリーザーで凍結させ、液体窒素フリーザーで保管することができる。この製剤が本発明者らのＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞製品として適切であることを確実にするために、生存率および率を測定することによって検証および／または最適化試験を実施することができる。
バイオプロセシングおよび製品の品質管理
高品質の作製を確実にするために、提唱されたバイオプロセスに例えば細胞計数、生存率、無菌性、マイコプラズマ、同一性、純度、ＶＣＮなどの種々のＩＰＣアッセイを組み入れることができる。提唱された製品リリース試験は、以下を含む１）外観（色、不透明度）；２）細胞生存率および計数；３）ｉＮＫＴ ＴＣＲについてのｑＰＣＲによる同一性およびＶＣＮ；４）ｉＮＫＴ陽性およびＢ２Ｍ陰性による純度；５）内毒素；６）無菌性；７）マイコプラズマ；８）αＧａｌＣｅｒによる刺激に応答したＩＦＮ−γ放出によって測定される効力；９）ＲＣＬ（複製コンピテントレンチウイルス）（Cornetta et al., 2011）。これらのアッセイの大部分は、標準の生物学的アッセイまたは検証することができるこの製品に独特の特定のアッセイのいずれかである。ＬＮ保管バッグを定期的に解凍し、それらの細胞生存率、純度、回収率、効力（ＩＦＮ−γ放出）および無菌性を測定することによって製品安定性試験を実施することができる。特定の実施形態では、製品は少なくとも１年にわたって安定である。
Ｊ．安全性実施形態
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍形成性ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける急性毒性
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の形質転換または自律的増殖に関する潜在性を評価することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、１）αＧａｌＣｅｒにより再刺激し、活発に分裂しているＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞に対して実施して、正常な核型が維持されているかどうかを決定することができるＧ−バンド核型分析；２）ＰＫＨ色素で標識された細胞の希釈物のフローサイトメトリー分析によって測定することができる、細胞製品の恒常性増殖（刺激を伴わない）（αＧａｌＣｅｒで刺激した細胞群を増殖陽性対照として使用する）（Hurton et al., 2016）；３）ｉＮＫＴ細胞製品の足場非依存性成長能を評価するために使用することができる、軟寒天コロニー形成アッセイ（Horibata et al., 2015）を含む。ｉＮＫＴ細胞１０７個を注入したＮＳＧナイーブマウスを使用して、種々の収集された組織／器官をあらゆる異常について分析することによって、ならびに異常な増殖について血液、脾臓、骨髄および肝臓におけるｉＮＫＴ細胞の存在を測定することによってｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍形成性および長期毒性（４〜６カ月、ｎ＝６）を調査することができる（Hurton et al., 2016）；対照群は、ＰＢＭＣから精製されたｉＮＫＴ細胞を移入したマウスであり得る。ナイーブなＮＳＧマウスに低用量（１０６個）または高用量（１０７個）のｉＮＫＴ細胞を注入することによってパイロットｉｎ ｖｉｖｏ急性毒性試験を行うことができる。次いで、マウス（ｎ＝８）を、体重および摂食量のあらゆる変化、ならびにあらゆる異常挙動について２週間にわたって観察することができる。２週間後、マウスを安楽死させることができ、血液学的検査および血清化学分析（ＵＣＳＤマウス血液学的検査および凝固コアラボ（core lab））のために血液を採取することができる；種々のマウス組織を収集し、病理学的分析のためにＵＣＬＡコアに寄託することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける同種移植関連安全性試験
ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ治療は、同種移植性であり、したがって、それに関連する安全性を評価することができる。まず、同種異系反応の潜在性を標準の二方向ｉｎ ｖｉｔｒｏ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイによって決定することができる（Bromelow et al., 2001）。ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞をミスマッチドナーＰＢＭＣ（少なくとも３種の異なるドナーバッチ）と混合することができ、Ｔ細胞増殖をＢｒｄＵ組み入れアッセイによって測定することができる。ＧｖＨＤを試験するために、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴを応答細胞とすることができ、ＰＢＭＣを刺激細胞とすることができる。逆の設定を使用して、ＨｖＧ反応性を調査することができる；インキュベート前に刺激細胞に照射を行う。ｉｎ ｖｉｖｏ ＧｖＨＤおよびＨｖＧ反応を評価するために、ｉｎ ｖｉｖｏ ＮＳＧマウスモデルを活用することもできる。マウスにＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ（５×１０６個、群１）、ヒトＰＢＭＣ（５×１０６個、群２）、または組合せ（各５×１０６個、群３）を注入することができる。マウスを２カ月にわたって毒性のあらゆる徴候（体重減少、挙動など）について観察することができる。隔週でのマウス採血からの単核細胞をヒトＴ細胞活性化マーカー（ｈＣＤ６９およびｈＣＤ４４の上方調節、ｈＣＤ６２Ｌの下方調節）について分析することができる；ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞、ヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、およびヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞をそれぞれｈＣＤ４５＋６Ｂ１１＋、ｈＣＤ４５＋６Ｂ１１−ＴＣＲαβ＋ＣＤ８＋、およびｈＣＤ４５＋６Ｂ１１−ＴＣＲαβ＋ＣＤ４＋によって同定することができる。群１および２と比較して、群３マウスにおいてｉＮＫＴ細胞の活性化がなく、ＰＢＭＣの枯渇がないことにより、ＧｖＨＤ反応がないことが示され得、一方、群３マウスにおいてＰＢＭＣ ＣＤ８／ＣＤ４Ｔ細胞の活性化がなく、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の枯渇がないことにより、ＨｖＧ反応がないことが示され得る。
レンチウイルスベクターの安全性および遺伝子編集関連オフターゲット解析
製品リリース試験として、ＲＣＬアッセイを測定して、患者が複製性ウイルスに偶発的に曝露しないことを確実にすることができる。公知のレンチウイルス組込みパターン以外のあらゆる普通でない組込みを検出するために、ＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、レンチウイルス組込み部位配列決定のために寄託することもできる（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．）。遺伝子編集に関連するオフターゲットの影響を解析するために、ＭＩＴのＣＲＩＳＰＲ設計ツールを使用して、潜在的なオフターゲット部位を予測し、それらをＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞のゲノムＤＮＡの標的化再配列決定によって評価／確認することができる。さらに、Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ−ｇＲＮＡおよびＣａｓ９／ＣＩＩＴＡ−ｇＲＮＡ ＲＮＰおよびｄｓＯＤＮタグを電気穿孔したＫ５６２細胞に対してＧＵＩＬＤＥ−ｓｅｑを使用し、オフターゲット部位に関して不偏ゲノムワイドスキャンを実施することができる（Tsai et al., 2015）；次いで、これらのオフターゲット部位をＵＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞におけるＮＧＳによって解析して、オフターゲット活性の発生頻度を検出することができる。
（実施例２）
ＮＫ細胞様経路によるＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の抗腫瘍有効性
Ａ．薬理学試験（図１）
ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されたＨＳＣの操作によるｉＮＫＴ（ＨＳＣ−ｉＮＫＴ）細胞は、ＮＫ細胞様表現型および機能性を示した（図１５）。興味深いことに、健康なドナーＰＢＭＣから単離されたネイティブなＮＫ細胞（ＰＢＭＣ−ＮＫ細胞）と比較して、ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１などのＮＫ活性化受容体を高レベルで発現し、パーフォリンおよびグランザイムＢなどの細胞傷害性分子を高レベルで発現したが、ＫＩＲなどのＮＫ阻害性受容体のレベルは検出できないものであった（図１５）。これらの結果により、ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞がネイティブなＮＫ細胞よりも強力なＮＫ細胞様腫瘍細胞標的化および殺滅能を示し得ることが示唆される。
Ｂ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性およびＭＯＡ試験（図２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞殺滅アッセイを使用して試験した場合（図１６Ａ）、ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞により、Ｋ５６２ヒト慢性骨髄性白血病細胞などの、ＰＢＭＣ−ＮＫ細胞殺滅に対して感受性である腫瘍細胞の殺滅の増強が示された（図１６Ｂ）。最も印象的なことには、ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞は、ＭＭ．１Ｓヒト多発性骨髄腫細胞株（図１６Ｅ）、Ａ３７５ヒト黒色腫細胞株（図１６Ｃ）、ＰＣ３ヒト前立腺がん細胞株（図１６Ｄ）、およびＨ２９２ヒト肺がん細胞株（図１６Ｆ）を含めたＰＢＭＣ−ＮＫ細胞殺滅に対して感受性ではない多数のヒト血液がんおよび固形腫瘍細胞株を有効に殺滅した。さらに、ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞では、ＰＢＭＣ−ｉＮＫＴ細胞とは異なり、凍結／解凍サイクル後にそれらの腫瘍細胞殺滅能が大きく保持され、これにより、ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞を「既製の」治療のための凍結細胞製品として製剤化することができることが示唆される（図１６Ｂ〜２Ｆ）。これらの腫瘍細胞のＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞による殺滅は、ＮＫ活性化受容体の刺激によって誘導され、これは、ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１遮断抗体によって腫瘍細胞殺滅有効性が低下したことによって証明された（図１６Ｇ）。
Ｃ．ｉｎ ｖｉｖｏ有効性および安全性試験（図３）
ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を、Ａ３７５−ＩＬ−１５−ＦＧヒト黒色腫異種移植ＮＳＧマウスモデルを使用して試験した（図１７Ａ）。ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の養子移入により、腫瘍成長が有意に阻害された（図１７Ｂ〜Ｄ）。重要なことに、ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞移入を受けた腫瘍担持動物において毒性および組織異常は観察されず、これにより、ＨＳＣ−ｉＮＫＴ細胞の安全性が示される。
本開示およびその利点が詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲によって定義される設計の主旨および範囲から逸脱することなく本発明に種々の変化、置換および変更を行うことができることが理解されるべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されているプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されるものではない。本開示から当業者には容易に理解される通り、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を実施するまたは実質的に同じ結果を実現する現在存在しているまたは後に開発されるプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、またはステップを本開示に従って利用することができる。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、またはステップをその範囲内に含むものとする。
参考文献
本明細書に記載の特許および刊行物は全て、本発明が関係する分野の当業者のレベルを示すものである。特許および刊行物は全て、個々の刊行物がそれぞれ具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じ程度にそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2021526838
Figure 2021526838
Figure 2021526838
 特許および特許出願
米国特許第５，８４３，７８０号
米国特許第６，２００，８０６号
米国特許第６，５０６，５５９号
米国特許第６，５７３，０９９号
米国特許第６，８３３，２６９号
米国特許第７，０２９，９１３号
米国特許第７，７９５，４０４号
米国特許第８，０２１，８６７号
米国特許第８，３７７，８８６号
米国特許第８，６２８，７６７号
米国特許出願公開第２００２／０１６８７０７号
米国特許出願公開第２００３／０１５９１６１号
米国特許出願公開第２００３／００２２３６７号
米国特許出願公開第２００３／００５１２６３号
米国特許出願公開第２００３／００５５０２０号
米国特許出願公開第２００４／００１４１９１号
米国特許出願公開第２００４／０２６５８３９号
米国特許出願公開第２００４／００６４８４２号
米国特許出願公開第２０１４／０３６９９７９号
米国特許出願公開第２０１４／０２４２０３３号
ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９７６０号
ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８５７４号
ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／１０５０１号
前述は、続く詳細な説明をよりよく理解することができるように本開示の特色および技術的利点をいくぶん広範に概説したものである。本明細書の請求項の主題を形成する追加的な特色および利点を下に記載する。開示される概念および特定の実施形態を、本設計の同じ目的を実行するために他の構造を改変または設計するための基礎として容易に利用することができることが当業者には理解されるはずである。そのような等価の構築物は添付の特許請求の範囲に記載されている主旨および範囲から逸脱しないことも当業者には理解されるはずである。組織化および操作の方法（method of operation）の両方に関して本明細書に開示される設計の特徴であると考えられる新規の特色は、別の目的および利点と共に、以下の説明を添付の図面と併せて検討すればよりよく理解されよう。しかし、各図面は単に例示および説明のために提示され、本開示を限定する定義として意図されていないことが明白に理解されるべきである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し、（１）外因性自殺遺伝子産物を発現すること；および（２）前記細胞のゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｉ分子またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を排除するように変更されていることのうちの一方または両方が該当し、前記少なくとも１つのｉＮＫＴ ＴＣＲが、外因性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域による転写制御下にある内因性インバリアントＴＣＲ遺伝子から発現される、操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目２）
前記細胞のゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｉ分子またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を排除するように変更されている、項目１に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目３）
前記インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、アルファＴＣＲ遺伝子産物である、項目１または２に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目４）
前記インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、ベータＴＣＲ遺伝子産物である、項目１から３までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目５）
アルファＴＣＲ遺伝子産物およびベータＴＣＲ遺伝子産物の両方が発現される、項目１から４までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目６）
少なくとも１つのインバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、外因性核酸から発現される、項目１から５までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目７）
前記外因性自殺遺伝子産物および／または前記外因性核酸が、前記細胞における発現のために最適化された１つまたは複数のコドンを有する、項目１から６までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目８）
自殺遺伝子産物が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、または誘導性カスパーゼ９である、項目１から７までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目９）
前記自殺遺伝子が、酵素に基づくものである、項目１から８までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目１０）
前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または誘導性カスパーゼ９をコードする、項目９に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目１１）
前記ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、項目１０に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目１２）
前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、項目１１に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目１３）
前記自殺遺伝子産物が、基質によって活性化される、項目１から１２までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目１４）
前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、項目１３に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目１５）
イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、項目１から１４までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目１６）
前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドである、項目１５に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目１７）
前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫまたは誘導性カスパーゼ９である、項目１から１６までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目１８）
前記ｉＮＫＴ ＴＣＲが、アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）に特異的に結合する、項目１から１７までのいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目１９）
ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合性遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ならびに／または個々のＨＬＡ−Ｉ分子およびＨＬＡ−ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することにより表面ＨＬＡ−Ｉ分子および表面ＨＬＡ−ＩＩ分子を発現しない、項目１から１８までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目２０）
前記ｉＮＫＴ細胞が遺伝子編集によって操作されたことに起因して前記細胞の表面に前記ＨＬＡ−ＩまたはＨＬＡ−ＩＩが発現されない、項目１９に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目２１）
前記遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が関与した、項目２０に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目２２）
前記ｉＮＫＴ細胞に導入された組換えベクター由来の核酸を含む、項目１から２１までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目２３）
前記核酸が前記細胞のゲノム内に組み入れられている、項目２２に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目２４）
前記組換えベクターがウイルスベクターである、項目２２または２３に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目２５）
前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである、項目２４に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目２６）
動物血清を含む培地に曝露されなかった、項目１から２５までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目２７）
凍結している、項目１から２６までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目２８）
予め凍結したものであり、室温で少なくとも１時間にわたって安定である、項目１から２６までのいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目２９）
デキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯのうちの１つまたは複数を含む溶液中に存在する、項目１から２８までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目３０）
無菌性、非発熱性、かつ等張性の溶液中に存在する、項目１から２９までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目３１）
造血幹細胞に由来する、項目１から３０までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目３２）
Ｇ−ＣＳＦにより動員されたＣＤ３４＋細胞に由来する、項目３１に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目３３）
がんを有さないヒト患者由来の細胞に由来する、項目１から３２までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目３４）
内因性ＴＣＲを発現しない、項目１から３３までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目３５）
項目１から３４までのいずれかに記載の操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞を含む細胞集団。
（項目３６）
前記ｉＮＫＴ細胞が、自殺遺伝子をコードする外因性核酸を含む、項目３５に記載の細胞集団。
（項目３７）
前記自殺遺伝子が、酵素に基づくものである、項目３６に記載の細胞集団。
（項目３８）
前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または誘導性カスパーゼ９をコードする、項目３７に記載の細胞集団。
（項目３９）
前記ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、項目３８に記載の細胞集団。
（項目４０）
前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、項目３９に記載の細胞集団。
（項目４１）
前記自殺遺伝子産物が、基質によって活性化される、項目３６から４０までのいずれかに記載の細胞集団。
（項目４２）
前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、項目４１に記載の細胞集団。
（項目４３）
前記細胞が、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、項目３５から４２までのいずれかに記載の細胞集団。
（項目４４）
前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドである、項目４３に記載の細胞集団。
（項目４５）
前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫである、項目３９から４４までのいずれかに記載の細胞集団。
（項目４６）
前記ｉＮＫＴ細胞が、ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合性遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ならびに／または個々のＨＬＡ−Ｉ分子およびＨＬＡ−ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することにより表面ＨＬＡ−Ｉ分子および表面ＨＬＡ−ＩＩ分子を発現しない、項目３５から４５までのいずれかに記載の細胞集団。
（項目４７）
前記ｉＮＫＴ細胞が遺伝子編集によって操作されたことに起因して前記細胞の表面に前記ＨＬＡ−ＩまたはＨＬＡ−ＩＩが発現されない、項目４６に記載の細胞集団。
（項目４８）
前記遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が関与した、項目４７に記載の細胞集団。
（項目４９）
前記ｉＮＫＴ細胞が、前記細胞に導入された組換えベクター由来の核酸配列を含む、項目３５から４８までのいずれかに記載の細胞集団。
（項目５０）
前記組換えベクターが、ウイルスベクターである、項目４９に記載の細胞集団。
（項目５１）
前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスであった、項目５０に記載の細胞集団。
（項目５２）
前記細胞が、動物血清を含む培地に曝露されなかった、項目３５から５１までのいずれかに記載の細胞集団。
（項目５３）
前記細胞が凍結している、項目３５から５２までのいずれかに記載の細胞集団。
（項目５４）
前記細胞が、デキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯを含む溶液中に存在する、項目３５から５３までのいずれかに記載の細胞集団。
（項目５５）
前記細胞が、無菌性、非発熱性、かつ等張性の溶液中に存在する、項目３５から５４までのいずれかに記載の細胞集団。
（項目５６）
前記ｉＮＫＴ ＴＣＲが、アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）に特異的に結合する、項目３５から５６までのいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目５７）
前記ｉＮＫＴ細胞が活性化されている、項目３５から５６までのいずれかに記載の細胞集団。
（項目５８）
前記ｉＮＫＴ細胞を、アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）で活性化および増大させている、項目５７に記載の細胞集団。
（項目５９）
操作されたｉＮＫＴ細胞を少なくとも約１０ ２ 〜１０ ６ 個含む、項目３５から５８までのいずれかに記載の細胞集団。
（項目６０）
操作されたｉＮＫＴ細胞を少なくとも約１０ ６ 〜１０ １２ 個含む、項目３５から５９までのいずれかに記載の細胞集団。
（項目６１）
前記細胞の７０％よりも多くが、操作されたｉＮＫＴ細胞である、項目３５から６０までのいずれかに記載の細胞集団。
（項目６２）
前記細胞の８０％よりも多くが、操作されたｉＮＫＴ細胞である、項目６１に記載の細胞集団。
（項目６３）
前記細胞の９０％よりも多くが、操作されたｉＮＫＴ細胞である、項目６２に記載の細胞集団。
（項目６４）
前記細胞の９５％よりも多くが、操作されたｉＮＫＴ細胞である、項目６３に記載の細胞集団。
（項目６５）
前記細胞の９９％よりも多くが、操作されたｉＮＫＴ細胞である、項目６４に記載の細胞集団。
（項目６６）
ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（Ｔ細胞受容体）および自殺チミジンキナーゼをコードする１つまたは複数の外因性核酸を含む操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞を含む細胞集団であって、前記ｉＮＫＴ細胞が、１つまたは複数の表面ＨＬＡ−Ｉ分子および／または表面ＨＬＡ−ＩＩ分子を発現しないように操作されており、前記細胞集団が、少なくとも約１０ ６ 〜１０ １２ 個の操作されたｉＮＫＴ細胞である、細胞集団。
（項目６７）
前記細胞が凍結している、項目６６に記載の細胞集団。
（項目６８）
前記細胞が、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢのうちの１つまたは複数を含む、項目３５から６７までのいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目６９）
前記集団の９０％よりも多くが、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢのうちの１つまたは複数を含む、項目３５から６８までのいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目７０）
前記集団の９０％よりも多くが、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢを含む、項目６９に記載の細胞集団。
（項目７１）
操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の集団を調製する方法であって、
ａ）複数の造血幹細胞または前駆細胞からＣＤ３４＋細胞を選択するステップと、
ｂ）少なくとも１つのヒトインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップと、
ｃ）単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ−Ｉ分子および／またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を排除するステップと、
ｄ）ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を培養してｉＮＫＴ細胞を産生させるステップと
を含む、方法。
（項目７２）
ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を培養するステップが、ＣＤ３４＋細胞を人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で培養して、ｉＮＫＴ細胞を産生させることを含み、前記ＡＴＯ系が、ノッチリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む３Ｄ細胞凝集体および無血清培地を含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記ＣＤ３４＋細胞が、分化した造血細胞を含む集団に由来する、項目７１または７２に記載の方法。
（項目７４）
前記分化した造血細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記幹細胞または前駆細胞が、臍帯血細胞、胎児肝臓細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または骨髄細胞を含む、項目７１または７２に記載の方法。
（項目７６）
ＣＤ３４−細胞を単離するステップをさらに含む、項目７１から７５までのいずれかに記載の方法。
（項目７７）
選択されたＣＤ３４＋細胞に１つまたは複数の核酸を導入する前に、前記細胞を培地中で培養するステップをさらに含む、項目７１から７６までのいずれかに記載の方法。
（項目７８）
培養するステップが、選択された前記ＣＤ３４＋細胞を、１つまたは複数の成長因子を含む培地と一緒にインキュベートすることを含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記１つまたは複数の成長因子が、ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ−３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記１つまたは複数の成長因子の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌの間である、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
１つの核酸が、α−ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、項目７１から８０までのいずれかに記載の方法。
（項目８２）
１つの核酸が、β−ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、項目７１から８１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
１つの核酸が、α−ＴＣＲおよびβ−ＴＣＲの両方をコードする核酸を含む、項目７１から８２までのいずれかに記載の方法。
（項目８４）
１つの核酸が、α−ＴＣＲをコードする核酸配列を含み、第２の核酸が、β−ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、項目７１から８３までのいずれかに記載の方法。
（項目８５）
選択された前記ＣＤ３４＋細胞に自殺遺伝子をコードする核酸を導入するステップをさらに含む、項目７１に記載の方法。
（項目８６）
１つの核酸が、前記α−ＴＣＲおよび前記β−ＴＣＲの両方をコードする、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
１つの核酸が、前記α−ＴＣＲ、前記β−ＴＣＲ、および前記自殺遺伝子をコードする、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記自殺遺伝子が、酵素に基づくものである、項目８５から８７までのいずれかに記載の方法。
（項目８９）
前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または誘導性カスパーゼ９をコードする、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、項目８９に記載の方法。
（項目９２）
自殺遺伝子産物が、基質によって活性化される、項目８５から９１までのいずれかに記載の方法。
（項目９３）
前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記細胞が、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、項目７１から９３までのいずれかに記載の方法。
（項目９５）
前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドである、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫである、項目９１から９５までのいずれかに記載の方法。
（項目９７）
前記ｉＮＫＴ細胞が、ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合性遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ならびに／または個々のＨＬＡ−Ｉ分子およびＨＬＡ−ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害すると表面ＨＬＡ−Ｉ分子および／または表面ＨＬＡ−ＩＩ分子を発現しない、項目７１から９６までのいずれかに記載の方法。
（項目９８）
前記単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における細胞表面ＨＬＡ−Ｉ分子および／または細胞表面ＨＬＡ−ＩＩ分子の発現を排除するステップが、ＣＲＩＳＰＲおよびＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ならびに／または個々のＨＬＡ−Ｉ分子およびＨＬＡ−ＩＩ分子に対応する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を前記細胞に導入することを含む、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
ＣＲＩＳＰＲまたは前記１つまたは複数のｇＲＮＡを、電気穿孔または脂質媒介性トランスフェクションによって前記細胞にトランスフェクトする、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記ＴＣＲ受容体をコードする核酸を、組換えベクターを使用して前記細胞に導入する、項目７１から９９までのいずれかに記載の方法。
（項目１０１）
前記組換えベクターが、ウイルスベクターである、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記無血清培地が、外部から添加されたアスコルビン酸をさらに含む、項目７１から１０３までのいずれかに記載の方法。
（項目１０５）
前記無血清培地が、外部から添加されたＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インターフェロン−ラムダ、ＴＳＬＰ、チモペンチン、プレイオトロフィン、ミッドカイン、またはこれらの組合せをさらに含む、項目７１から１０４までのいずれかに記載の方法。
（項目１０６）
前記無血清培地が、ビタミンをさらに含む、項目７１から１０５までのいずれかに記載の方法。
（項目１０７）
前記ビタミンが、ビオチン、ＤＬアルファ酢酸トコフェロール、ＤＬアルファトコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２、またはこれらの組合せもしくはこれらの塩を含む、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記ビタミンが、ビオチン、ＤＬアルファ酢酸トコフェロール、ＤＬアルファトコフェロール、ビタミンＡ、またはこれらの組合せもしくは塩を含む、項目１０６に記載の方法。
（項目１０９）
前記無血清培地が、タンパク質をさらに含む、項目７１から１０８までのいずれかに記載の方法。
（項目１１０）
前記タンパク質が、アルブミンまたはウシ血清アルブミン、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、またはこれらの組合せを含む、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記無血清培地が、コルチコステロン、Ｄ−ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ−カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、またはトリヨード−Ｉ−チロニン、またはこれらの組合せをさらに含む、項目７１から１１０までのいずれかに記載の方法。
（項目１１２）
前記無血清培地が、Ｂ−２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ−２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２１（商標）サプリメント、またはこれらの組合せを含む、項目７１から１１１までのいずれかに記載の方法。
（項目１１３）
前記無血清培地が、アミノ酸、単糖、無機イオンを含むまたはさらに含む、項目７１から１１２までのいずれかに記載の方法。
（項目１１４）
前記アミノ酸が、アルギニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、またはバリン、またはこれらの組合せを含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記無機イオンが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素、もしくはリン、またはこれらの組合せもしくは塩を含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１６）
前記無血清培地が、モリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、もしくはマンガン、またはこれらの組合せをさらに含む、項目７１から１１５までのいずれかに記載の方法。
（項目１１７）
前記３Ｄ細胞凝集体が、ＣＤ３４＋形質導入細胞と前記間質細胞の選択された集団を物理的マトリックスまたは足場上で混合することによって作り出される、項目７１から１１６までのいずれかに記載の方法。
（項目１１８）
前記ＣＤ３４＋形質導入細胞および間質細胞を遠心分離して、前記物理的マトリックスまたは足場上に置かれる細胞ペレットを形成するステップをさらに含む、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
前記間質細胞によって発現される前記ノッチリガンドが、インタクトな、部分的な、または改変されたＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、またはこれらの組合せである、項目７１から１１８までのいずれかに記載の方法。
（項目１２０）
前記ノッチリガンドが、ヒトノッチリガンドである、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
前記ノッチリガンドが、ヒトＤＬＬ１またはＤＬＬ４である、項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）
間質細胞とＣＤ３４＋細胞の比が、約１：５〜１：２０である、項目７１から１２１までのいずれかに記載の方法。
（項目１２３）
前記間質細胞が、マウス間質細胞株、ヒト間質細胞株、一次間質細胞の選択された集団、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて多能性幹細胞から分化した間質細胞の選択された集団、またはこれらの組合せである、項目７１から１２２までのいずれかに記載の方法。
（項目１２４）
前記間質細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて造血幹細胞または前駆細胞から分化した間質細胞の選択された集団である、項目７１から１２３までのいずれかに記載の方法。
（項目１２５）
ＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ分子の表面発現を欠くｉＮＫＴ細胞を選択するステップが、マイクロビーズまたはフローサイトメトリーを使用したｉＮＫＴ細胞の正の選択およびＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ陰性細胞の負の選択を含む、項目７１から１２４までのいずれかに記載の方法。
（項目１２６）
前記細胞が、凍結している、項目７１から１２５までのいずれかに記載の方法。
（項目１２７）
前記細胞が、デキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯを含む溶液中に存在する、項目１から１２６までのいずれかに記載の方法。
（項目１２８）
前記細胞が、無菌性、非発熱性、かつ等張性の溶液中に存在する、項目１から１２７までのいずれかに記載の方法。
（項目１２９）
前記細胞が、がんを有さないヒト患者由来の細胞に由来する、項目７１から１２８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３０）
前記細胞が、内因性ＴＣＲを発現しない、項目７１から１２９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３１）
フィーダー細胞が、ＣＤ３４ − 細胞を含む、項目１から１３０までのいずれかに記載の方法。
（項目１３２）
選択された前記ｉＮＫＴ細胞を活性化するステップをさらに含む、項目７１から１３１までのいずれかに記載の方法。
（項目１３３）
選択された前記ｉＮＫＴ細胞を、アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）で活性化および増大させている、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
フィーダー細胞が、α−ＧＣでパルスされている、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
操作されたｉＮＫＴ細胞を少なくとも約１０ ２ 〜１０ ６ 個含む操作されたｉＮＫＴ細胞の集団を作製する、項目７１から１３４までのいずれかに記載の方法。
（項目１３６）
操作されたｉＮＫＴ細胞を少なくとも約１０ ６ 〜１０ １２ 個含む細胞集団を作製する、項目７１から１３５までのいずれかに記載の方法。
（項目１３７）
前記細胞集団を凍結させ、次いで解凍する、項目７１から１３６までのいずれかに記載の方法。
（項目１３８）
凍結させ、解凍した前記細胞集団に１つまたは複数の追加的な核酸を導入するステップをさらに含む、項目１３７に記載の方法。
（項目１３９）
前記１つまたは複数の追加的な核酸が、１つまたは複数の治療用遺伝子産物をコードする、項目１３８に記載の方法。
（項目１４０）
操作されたｉＮＫＴ細胞の前記集団の９０％よりも多くが、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢのうちの１つまたは複数を含む、項目７１から１３８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１４１）
操作されたｉＮＫＴ細胞の前記集団の９０％よりも多くが、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢを含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１４２）
操作されたインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞を含む細胞集団をｅｘ ｖｉｖｏで調製する方法であって、
ａ）ヒト末梢血単核細胞からＣＤ３４＋細胞を選択するステップと、
ｂ）前記ＣＤ３４＋細胞を、ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ−３リガンド、およびヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む成長因子を含む培地中で培養するステップと、
ｃ）選択された前記ＣＤ３４＋細胞に、ｉＮＫＴ ＴＣＲアルファ鎖、ｉＮＫＴ ＴＣＲベータ鎖、および自殺チミジンキナーゼ／イメージングレポーター遺伝子をコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入するステップと、
ｄ）選択された前記ＣＤ３４＋細胞に、Ｃａｓ９ならびにベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）および／またはＣＴＩＩＡに対するｇＲＮＡを導入して、Ｂ２Ｍ遺伝子またはＣＴＩＩＡ遺伝子の発現を妨害するステップと、
ｅ）形質導入された前記細胞を、外因性ノッチリガンドを発現する照射間質細胞株と一緒に２〜１０週間にわたって培養して、ｉＮＫＴ細胞を３Ｄ凝集体細胞培養で増大させるステップと、
ｆ）ＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ分子の表面発現を欠くｉＮＫＴ細胞を選択するステップと、
ｇ）選択された前記ｉＮＫＴ細胞を照射フィーダー細胞と一緒に培養するステップと
を含む方法。
（項目１４３）
選択された前記ＣＤ３４＋細胞から１０ ８ 〜１０ １３ 個のｉＮＫＴ細胞が調製される、項目１４２に記載の方法。
（項目１４４）
ｉＮＫＴ細胞で患者を処置する方法であって、前記患者に項目１から３４までに記載の細胞または項目３５から７０までに記載の細胞集団のいずれかを投与するステップを含む方法。
（項目１４５）
前記患者が、がんを有する、項目１４４に記載の方法。
（項目１４６）
前記患者が、炎症を伴う疾患または状態を有する、項目１４４に記載の方法。
（項目１４７）
前記疾患または状態が、自己免疫疾患である、項目１４６に記載の方法。
（項目１４８）
前記細胞または細胞集団が、前記患者に対して同種異系である、項目１４４から１４７までのいずれかに記載の方法。
（項目１４９）
前記患者が、前記細胞または細胞集団の完全な枯渇の徴候を示さない、項目１４４から１４８までのいずれかに記載の方法。
（項目１５０）
前記患者に前記自殺遺伝子産物を引き起こす化合物を投与するステップをさらに含む、項目１４４から１４９までのいずれかに記載の方法。
（項目１５１）
前記患者に前記細胞または細胞集団を投与した後、前記患者における腫瘍進行が制御または抑制される、項目１４５に記載の方法。
（項目１５２）
炎症が低減する、項目１４６または１４７のいずれかに記載の方法。
（項目１５３）
少なくとも１つのインバリアントＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子産物および外因性自殺遺伝子産物を発現する操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ細胞であって、前記少なくとも１つのインバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、外因性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域による転写制御下にある内因性インバリアントＴＣＲ遺伝子から発現され、前記ｉＮＫＴ細胞が、
ａ）複数の造血幹細胞または前駆細胞からＣＤ３４＋細胞を選択するステップと、
ｂ）少なくとも１つのヒトインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップと、
ｃ）単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ−Ｉ分子および／またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を排除するステップと、
ｄ）ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を培養してｉＮＫＴ細胞を産生させるステップと
を含むプロセスによって作製される、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞。
（項目１５４）
少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する操作されたｉＮＫＴ細胞であって、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢを含む、操作されたｉＮＫＴ細胞。
（項目１５５）
少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する操作されたｉＮＫＴ細胞の集団であって、前記集団の９０％よりも多くが、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢを含む、ｉＮＫＴ細胞の集団。

Claims (155)

  1. 操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し、（１）外因性自殺遺伝子産物を発現すること；および（２）前記細胞のゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｉ分子またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を排除するように変更されていることのうちの一方または両方が該当し、前記少なくとも１つのｉＮＫＴ ＴＣＲが、外因性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域による転写制御下にある内因性インバリアントＴＣＲ遺伝子から発現される、操作されたｉＮＫＴ細胞。
  2. 前記細胞のゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｉ分子またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を排除するように変更されている、請求項１に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  3. 前記インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、アルファＴＣＲ遺伝子産物である、請求項１または２に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  4. 前記インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、ベータＴＣＲ遺伝子産物である、請求項１から３までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  5. アルファＴＣＲ遺伝子産物およびベータＴＣＲ遺伝子産物の両方が発現される、請求項１から４までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  6. 少なくとも１つのインバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、外因性核酸から発現される、請求項１から５までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  7. 前記外因性自殺遺伝子産物および／または前記外因性核酸が、前記細胞における発現のために最適化された１つまたは複数のコドンを有する、請求項１から６までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  8. 自殺遺伝子産物が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、または誘導性カスパーゼ９である、請求項１から７までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  9. 前記自殺遺伝子が、酵素に基づくものである、請求項１から８までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  10. 前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または誘導性カスパーゼ９をコードする、請求項９に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  11. 前記ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、請求項１０に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  12. 前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、請求項１１に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  13. 前記自殺遺伝子産物が、基質によって活性化される、請求項１から１２までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  14. 前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、請求項１３に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  15. イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、請求項１から１４までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  16. 前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドである、請求項１５に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  17. 前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫまたは誘導性カスパーゼ９である、請求項１から１６までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  18. 前記ｉＮＫＴ ＴＣＲが、アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）に特異的に結合する、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  19. ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合性遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ならびに／または個々のＨＬＡ−Ｉ分子およびＨＬＡ−ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することにより表面ＨＬＡ−Ｉ分子および表面ＨＬＡ−ＩＩ分子を発現しない、請求項１から１８までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  20. 前記ｉＮＫＴ細胞が遺伝子編集によって操作されたことに起因して前記細胞の表面に前記ＨＬＡ−ＩまたはＨＬＡ−ＩＩが発現されない、請求項１９に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  21. 前記遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が関与した、請求項２０に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  22. 前記ｉＮＫＴ細胞に導入された組換えベクター由来の核酸を含む、請求項１から２１までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  23. 前記核酸が前記細胞のゲノム内に組み入れられている、請求項２２に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  24. 前記組換えベクターがウイルスベクターである、請求項２２または２３に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  25. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである、請求項２４に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  26. 動物血清を含む培地に曝露されなかった、請求項１から２５までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  27. 凍結している、請求項１から２６までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  28. 予め凍結したものであり、室温で少なくとも１時間にわたって安定である、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  29. デキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯのうちの１つまたは複数を含む溶液中に存在する、請求項１から２８までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  30. 無菌性、非発熱性、かつ等張性の溶液中に存在する、請求項１から２９までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  31. 造血幹細胞に由来する、請求項１から３０までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  32. Ｇ−ＣＳＦにより動員されたＣＤ３４＋細胞に由来する、請求項３１に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  33. がんを有さないヒト患者由来の細胞に由来する、請求項１から３２までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  34. 内因性ＴＣＲを発現しない、請求項１から３３までのいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
  35. 請求項１から３４までのいずれかに記載の操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞を含む細胞集団。
  36. 前記ｉＮＫＴ細胞が、自殺遺伝子をコードする外因性核酸を含む、請求項３５に記載の細胞集団。
  37. 前記自殺遺伝子が、酵素に基づくものである、請求項３６に記載の細胞集団。
  38. 前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または誘導性カスパーゼ９をコードする、請求項３７に記載の細胞集団。
  39. 前記ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、請求項３８に記載の細胞集団。
  40. 前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、請求項３９に記載の細胞集団。
  41. 前記自殺遺伝子産物が、基質によって活性化される、請求項３６から４０までのいずれかに記載の細胞集団。
  42. 前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、請求項４１に記載の細胞集団。
  43. 前記細胞が、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、請求項３５から４２までのいずれかに記載の細胞集団。
  44. 前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドである、請求項４３に記載の細胞集団。
  45. 前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫである、請求項３９から４４までのいずれかに記載の細胞集団。
  46. 前記ｉＮＫＴ細胞が、ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合性遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ならびに／または個々のＨＬＡ−Ｉ分子およびＨＬＡ−ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することにより表面ＨＬＡ−Ｉ分子および表面ＨＬＡ−ＩＩ分子を発現しない、請求項３５から４５までのいずれかに記載の細胞集団。
  47. 前記ｉＮＫＴ細胞が遺伝子編集によって操作されたことに起因して前記細胞の表面に前記ＨＬＡ−ＩまたはＨＬＡ−ＩＩが発現されない、請求項４６に記載の細胞集団。
  48. 前記遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が関与した、請求項４７に記載の細胞集団。
  49. 前記ｉＮＫＴ細胞が、前記細胞に導入された組換えベクター由来の核酸配列を含む、請求項３５から４８までのいずれかに記載の細胞集団。
  50. 前記組換えベクターが、ウイルスベクターである、請求項４９に記載の細胞集団。
  51. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスであった、請求項５０に記載の細胞集団。
  52. 前記細胞が、動物血清を含む培地に曝露されなかった、請求項３５から５１までのいずれかに記載の細胞集団。
  53. 前記細胞が凍結している、請求項３５から５２までのいずれかに記載の細胞集団。
  54. 前記細胞が、デキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯを含む溶液中に存在する、請求項３５から５３までのいずれかに記載の細胞集団。
  55. 前記細胞が、無菌性、非発熱性、かつ等張性の溶液中に存在する、請求項３５から５４までのいずれかに記載の細胞集団。
  56. 前記ｉＮＫＴ ＴＣＲが、アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）に特異的に結合する、請求項３５から５６までのいずれか一項に記載の細胞集団。
  57. 前記ｉＮＫＴ細胞が活性化されている、請求項３５から５６までのいずれかに記載の細胞集団。
  58. 前記ｉＮＫＴ細胞を、アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）で活性化および増大させている、請求項５７に記載の細胞集団。
  59. 操作されたｉＮＫＴ細胞を少なくとも約１０２〜１０６個含む、請求項３５から５８までのいずれかに記載の細胞集団。
  60. 操作されたｉＮＫＴ細胞を少なくとも約１０６〜１０１２個含む、請求項３５から５９までのいずれかに記載の細胞集団。
  61. 前記細胞の７０％よりも多くが、操作されたｉＮＫＴ細胞である、請求項３５から６０までのいずれかに記載の細胞集団。
  62. 前記細胞の８０％よりも多くが、操作されたｉＮＫＴ細胞である、請求項６１に記載の細胞集団。
  63. 前記細胞の９０％よりも多くが、操作されたｉＮＫＴ細胞である、請求項６２に記載の細胞集団。
  64. 前記細胞の９５％よりも多くが、操作されたｉＮＫＴ細胞である、請求項６３に記載の細胞集団。
  65. 前記細胞の９９％よりも多くが、操作されたｉＮＫＴ細胞である、請求項６４に記載の細胞集団。
  66. ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（Ｔ細胞受容体）および自殺チミジンキナーゼをコードする１つまたは複数の外因性核酸を含む操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞を含む細胞集団であって、前記ｉＮＫＴ細胞が、１つまたは複数の表面ＨＬＡ−Ｉ分子および／または表面ＨＬＡ−ＩＩ分子を発現しないように操作されており、前記細胞集団が、少なくとも約１０６〜１０１２個の操作されたｉＮＫＴ細胞である、細胞集団。
  67. 前記細胞が凍結している、請求項６６に記載の細胞集団。
  68. 前記細胞が、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢのうちの１つまたは複数を含む、請求項３５から６７までのいずれか一項に記載の細胞集団。
  69. 前記集団の９０％よりも多くが、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢのうちの１つまたは複数を含む、請求項３５から６８までのいずれか一項に記載の細胞集団。
  70. 前記集団の９０％よりも多くが、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢを含む、請求項６９に記載の細胞集団。
  71. 操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の集団を調製する方法であって、
    ａ）複数の造血幹細胞または前駆細胞からＣＤ３４＋細胞を選択するステップと、
    ｂ）少なくとも１つのヒトインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップと、
    ｃ）単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ−Ｉ分子および／またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を排除するステップと、
    ｄ）ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を培養してｉＮＫＴ細胞を産生させるステップと
    を含む、方法。
  72. ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を培養するステップが、ＣＤ３４＋細胞を人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で培養して、ｉＮＫＴ細胞を産生させることを含み、前記ＡＴＯ系が、ノッチリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む３Ｄ細胞凝集体および無血清培地を含む、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記ＣＤ３４＋細胞が、分化した造血細胞を含む集団に由来する、請求項７１または７２に記載の方法。
  74. 前記分化した造血細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記幹細胞または前駆細胞が、臍帯血細胞、胎児肝臓細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または骨髄細胞を含む、請求項７１または７２に記載の方法。
  76. ＣＤ３４−細胞を単離するステップをさらに含む、請求項７１から７５までのいずれかに記載の方法。
  77. 選択されたＣＤ３４＋細胞に１つまたは複数の核酸を導入する前に、前記細胞を培地中で培養するステップをさらに含む、請求項７１から７６までのいずれかに記載の方法。
  78. 培養するステップが、選択された前記ＣＤ３４＋細胞を、１つまたは複数の成長因子を含む培地と一緒にインキュベートすることを含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記１つまたは複数の成長因子が、ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ−３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記１つまたは複数の成長因子の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌの間である、請求項７９に記載の方法。
  81. １つの核酸が、α−ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、請求項７１から８０までのいずれかに記載の方法。
  82. １つの核酸が、β−ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、請求項７１から８１までのいずれか一項に記載の方法。
  83. １つの核酸が、α−ＴＣＲおよびβ−ＴＣＲの両方をコードする核酸を含む、請求項７１から８２までのいずれかに記載の方法。
  84. １つの核酸が、α−ＴＣＲをコードする核酸配列を含み、第２の核酸が、β−ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、請求項７１から８３までのいずれかに記載の方法。
  85. 選択された前記ＣＤ３４＋細胞に自殺遺伝子をコードする核酸を導入するステップをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
  86. １つの核酸が、前記α−ＴＣＲおよび前記β−ＴＣＲの両方をコードする、請求項８５に記載の方法。
  87. １つの核酸が、前記α−ＴＣＲ、前記β−ＴＣＲ、および前記自殺遺伝子をコードする、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記自殺遺伝子が、酵素に基づくものである、請求項８５から８７までのいずれかに記載の方法。
  89. 前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または誘導性カスパーゼ９をコードする、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、請求項８９に記載の方法。
  92. 自殺遺伝子産物が、基質によって活性化される、請求項８５から９１までのいずれかに記載の方法。
  93. 前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記細胞が、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、請求項７１から９３までのいずれかに記載の方法。
  95. 前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識することができる基質を有するポリペプチドである、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫである、請求項９１から９５までのいずれかに記載の方法。
  97. 前記ｉＮＫＴ細胞が、ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合性遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ならびに／または個々のＨＬＡ−Ｉ分子およびＨＬＡ−ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害すると表面ＨＬＡ−Ｉ分子および／または表面ＨＬＡ−ＩＩ分子を発現しない、請求項７１から９６までのいずれかに記載の方法。
  98. 前記単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における細胞表面ＨＬＡ−Ｉ分子および／または細胞表面ＨＬＡ−ＩＩ分子の発現を排除するステップが、ＣＲＩＳＰＲおよびＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ならびに／または個々のＨＬＡ−Ｉ分子およびＨＬＡ−ＩＩ分子に対応する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を前記細胞に導入することを含む、請求項９７に記載の方法。
  99. ＣＲＩＳＰＲまたは前記１つまたは複数のｇＲＮＡを、電気穿孔または脂質媒介性トランスフェクションによって前記細胞にトランスフェクトする、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記ＴＣＲ受容体をコードする核酸を、組換えベクターを使用して前記細胞に導入する、請求項７１から９９までのいずれかに記載の方法。
  101. 前記組換えベクターが、ウイルスベクターである、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記無血清培地が、外部から添加されたアスコルビン酸をさらに含む、請求項７１から１０３までのいずれかに記載の方法。
  105. 前記無血清培地が、外部から添加されたＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インターフェロン−ラムダ、ＴＳＬＰ、チモペンチン、プレイオトロフィン、ミッドカイン、またはこれらの組合せをさらに含む、請求項７１から１０４までのいずれかに記載の方法。
  106. 前記無血清培地が、ビタミンをさらに含む、請求項７１から１０５までのいずれかに記載の方法。
  107. 前記ビタミンが、ビオチン、ＤＬアルファ酢酸トコフェロール、ＤＬアルファトコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２、またはこれらの組合せもしくはこれらの塩を含む、請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記ビタミンが、ビオチン、ＤＬアルファ酢酸トコフェロール、ＤＬアルファトコフェロール、ビタミンＡ、またはこれらの組合せもしくは塩を含む、請求項１０６に記載の方法。
  109. 前記無血清培地が、タンパク質をさらに含む、請求項７１から１０８までのいずれかに記載の方法。
  110. 前記タンパク質が、アルブミンまたはウシ血清アルブミン、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、またはこれらの組合せを含む、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記無血清培地が、コルチコステロン、Ｄ−ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ−カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、またはトリヨード−Ｉ−チロニン、またはこれらの組合せをさらに含む、請求項７１から１１０までのいずれかに記載の方法。
  112. 前記無血清培地が、Ｂ−２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ−２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２１（商標）サプリメント、またはこれらの組合せを含む、請求項７１から１１１までのいずれかに記載の方法。
  113. 前記無血清培地が、アミノ酸、単糖、無機イオンを含むまたはさらに含む、請求項７１から１１２までのいずれかに記載の方法。
  114. 前記アミノ酸が、アルギニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、またはバリン、またはこれらの組合せを含む、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記無機イオンが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素、もしくはリン、またはこれらの組合せもしくは塩を含む、請求項１１３に記載の方法。
  116. 前記無血清培地が、モリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、もしくはマンガン、またはこれらの組合せをさらに含む、請求項７１から１１５までのいずれかに記載の方法。
  117. 前記３Ｄ細胞凝集体が、ＣＤ３４＋形質導入細胞と前記間質細胞の選択された集団を物理的マトリックスまたは足場上で混合することによって作り出される、請求項７１から１１６までのいずれかに記載の方法。
  118. 前記ＣＤ３４＋形質導入細胞および間質細胞を遠心分離して、前記物理的マトリックスまたは足場上に置かれる細胞ペレットを形成するステップをさらに含む、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記間質細胞によって発現される前記ノッチリガンドが、インタクトな、部分的な、または改変されたＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、またはこれらの組合せである、請求項７１から１１８までのいずれかに記載の方法。
  120. 前記ノッチリガンドが、ヒトノッチリガンドである、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記ノッチリガンドが、ヒトＤＬＬ１またはＤＬＬ４である、請求項１２０に記載の方法。
  122. 間質細胞とＣＤ３４＋細胞の比が、約１：５〜１：２０である、請求項７１から１２１までのいずれかに記載の方法。
  123. 前記間質細胞が、マウス間質細胞株、ヒト間質細胞株、一次間質細胞の選択された集団、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて多能性幹細胞から分化した間質細胞の選択された集団、またはこれらの組合せである、請求項７１から１２２までのいずれかに記載の方法。
  124. 前記間質細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて造血幹細胞または前駆細胞から分化した間質細胞の選択された集団である、請求項７１から１２３までのいずれかに記載の方法。
  125. ＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ分子の表面発現を欠くｉＮＫＴ細胞を選択するステップが、マイクロビーズまたはフローサイトメトリーを使用したｉＮＫＴ細胞の正の選択およびＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ陰性細胞の負の選択を含む、請求項７１から１２４までのいずれかに記載の方法。
  126. 前記細胞が、凍結している、請求項７１から１２５までのいずれかに記載の方法。
  127. 前記細胞が、デキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯを含む溶液中に存在する、請求項１から１２６までのいずれかに記載の方法。
  128. 前記細胞が、無菌性、非発熱性、かつ等張性の溶液中に存在する、請求項１から１２７までのいずれかに記載の方法。
  129. 前記細胞が、がんを有さないヒト患者由来の細胞に由来する、請求項７１から１２８までのいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記細胞が、内因性ＴＣＲを発現しない、請求項７１から１２９までのいずれか一項に記載の方法。
  131. フィーダー細胞が、ＣＤ３４−細胞を含む、請求項１から１３０までのいずれかに記載の方法。
  132. 選択された前記ｉＮＫＴ細胞を活性化するステップをさらに含む、請求項７１から１３１までのいずれかに記載の方法。
  133. 選択された前記ｉＮＫＴ細胞を、アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）で活性化および増大させている、請求項１３２に記載の方法。
  134. フィーダー細胞が、α−ＧＣでパルスされている、請求項１３３に記載の方法。
  135. 操作されたｉＮＫＴ細胞を少なくとも約１０２〜１０６個含む操作されたｉＮＫＴ細胞の集団を作製する、請求項７１から１３４までのいずれかに記載の方法。
  136. 操作されたｉＮＫＴ細胞を少なくとも約１０６〜１０１２個含む細胞集団を作製する、請求項７１から１３５までのいずれかに記載の方法。
  137. 前記細胞集団を凍結させ、次いで解凍する、請求項７１から１３６までのいずれかに記載の方法。
  138. 凍結させ、解凍した前記細胞集団に１つまたは複数の追加的な核酸を導入するステップをさらに含む、請求項１３７に記載の方法。
  139. 前記１つまたは複数の追加的な核酸が、１つまたは複数の治療用遺伝子産物をコードする、請求項１３８に記載の方法。
  140. 操作されたｉＮＫＴ細胞の前記集団の９０％よりも多くが、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢのうちの１つまたは複数を含む、請求項７１から１３８までのいずれか一項に記載の方法。
  141. 操作されたｉＮＫＴ細胞の前記集団の９０％よりも多くが、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢを含む、請求項１４０に記載の方法。
  142. 操作されたインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞を含む細胞集団をｅｘ ｖｉｖｏで調製する方法であって、
    ａ）ヒト末梢血単核細胞からＣＤ３４＋細胞を選択するステップと、
    ｂ）前記ＣＤ３４＋細胞を、ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ−３リガンド、およびヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む成長因子を含む培地中で培養するステップと、
    ｃ）選択された前記ＣＤ３４＋細胞に、ｉＮＫＴ ＴＣＲアルファ鎖、ｉＮＫＴ ＴＣＲベータ鎖、および自殺チミジンキナーゼ／イメージングレポーター遺伝子をコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入するステップと、
    ｄ）選択された前記ＣＤ３４＋細胞に、Ｃａｓ９ならびにベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）および／またはＣＴＩＩＡに対するｇＲＮＡを導入して、Ｂ２Ｍ遺伝子またはＣＴＩＩＡ遺伝子の発現を妨害するステップと、
    ｅ）形質導入された前記細胞を、外因性ノッチリガンドを発現する照射間質細胞株と一緒に２〜１０週間にわたって培養して、ｉＮＫＴ細胞を３Ｄ凝集体細胞培養で増大させるステップと、
    ｆ）ＨＬＡ−Ｉ／ＩＩ分子の表面発現を欠くｉＮＫＴ細胞を選択するステップと、
    ｇ）選択された前記ｉＮＫＴ細胞を照射フィーダー細胞と一緒に培養するステップと
    を含む方法。
  143. 選択された前記ＣＤ３４＋細胞から１０８〜１０１３個のｉＮＫＴ細胞が調製される、請求項１４２に記載の方法。
  144. ｉＮＫＴ細胞で患者を処置する方法であって、前記患者に請求項１から３４までに記載の細胞または請求項３５から７０までに記載の細胞集団のいずれかを投与するステップを含む方法。
  145. 前記患者が、がんを有する、請求項１４４に記載の方法。
  146. 前記患者が、炎症を伴う疾患または状態を有する、請求項１４４に記載の方法。
  147. 前記疾患または状態が、自己免疫疾患である、請求項１４６に記載の方法。
  148. 前記細胞または細胞集団が、前記患者に対して同種異系である、請求項１４４から１４７までのいずれかに記載の方法。
  149. 前記患者が、前記細胞または細胞集団の完全な枯渇の徴候を示さない、請求項１４４から１４８までのいずれかに記載の方法。
  150. 前記患者に前記自殺遺伝子産物を引き起こす化合物を投与するステップをさらに含む、請求項１４４から１４９までのいずれかに記載の方法。
  151. 前記患者に前記細胞または細胞集団を投与した後、前記患者における腫瘍進行が制御または抑制される、請求項１４５に記載の方法。
  152. 炎症が低減する、請求項１４６または１４７のいずれかに記載の方法。
  153. 少なくとも１つのインバリアントＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子産物および外因性自殺遺伝子産物を発現する操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ細胞であって、前記少なくとも１つのインバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、外因性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域による転写制御下にある内因性インバリアントＴＣＲ遺伝子から発現され、前記ｉＮＫＴ細胞が、
    ａ）複数の造血幹細胞または前駆細胞からＣＤ３４＋細胞を選択するステップと、
    ｂ）少なくとも１つのヒトインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップと、
    ｃ）単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ−Ｉ分子および／またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現を排除するステップと、
    ｄ）ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を培養してｉＮＫＴ細胞を産生させるステップと
    を含むプロセスによって作製される、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞。
  154. 少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する操作されたｉＮＫＴ細胞であって、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢを含む、操作されたｉＮＫＴ細胞。
  155. 少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する操作されたｉＮＫＴ細胞の集団であって、前記集団の９０％よりも多くが、高レベルのＮＫ活性化因子ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１、低レベルまたは検出できないレベルのＮＫ阻害性受容体ＫＩＲ、ならびに高レベルの細胞傷害性分子パーフォリンおよびグランザイムＢを含む、ｉＮＫＴ細胞の集団。
JP2020569178A 2018-06-12 2019-06-12 幹細胞の操作によるｉｎｋｔ細胞に基づく既製の細胞療法 Withdrawn JP2021526838A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023062551A JP2023076711A (ja) 2018-06-12 2023-04-07 幹細胞の操作によるｉｎｋｔ細胞に基づく既製の細胞療法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862683750P 2018-06-12 2018-06-12
US62/683,750 2018-06-12
PCT/US2019/036786 WO2019241400A1 (en) 2018-06-12 2019-06-12 Stem cell-engineered inkt cell-based off -the-shelf cellular therapy

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023062551A Division JP2023076711A (ja) 2018-06-12 2023-04-07 幹細胞の操作によるｉｎｋｔ細胞に基づく既製の細胞療法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2021526838A true JP2021526838A (ja) 2021-10-11

Family

ID=68843211

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020569178A Withdrawn JP2021526838A (ja) 2018-06-12 2019-06-12 幹細胞の操作によるｉｎｋｔ細胞に基づく既製の細胞療法
JP2023062551A Pending JP2023076711A (ja) 2018-06-12 2023-04-07 幹細胞の操作によるｉｎｋｔ細胞に基づく既製の細胞療法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023062551A Pending JP2023076711A (ja) 2018-06-12 2023-04-07 幹細胞の操作によるｉｎｋｔ細胞に基づく既製の細胞療法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20210123022A1 (ja)
EP (1) EP3806869A4 (ja)
JP (2) JP2021526838A (ja)
CN (1) CN112512536A (ja)
AU (1) AU2019287483B2 (ja)
CA (1) CA3102801A1 (ja)
WO (1) WO2019241400A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023229013A1 (ja) * 2022-05-27 2023-11-30 北京天一方生物科技▲発▼展有限公司 ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞の製造方法

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023522979A (ja) * 2020-04-23 2023-06-01 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ｉＮＫＴ細胞の活性化による老化細胞の排除
KR20220005208A (ko) * 2020-07-06 2022-01-13 주식회사 지씨셀 면역원성이 감소된 신규한 이식용 세포
CA3193269A1 (en) * 2020-09-10 2022-03-17 The Regents Of The University Of California Combating covid-19 using engineered inkt cells
AR124419A1 (es) * 2020-12-18 2023-03-29 Novo Nordisk As Células seguras invisibles para el sistema inmunitario
CN117858713A (zh) * 2021-04-20 2024-04-09 步行鱼治疗学股份有限公司 工程改造基于b细胞的蛋白质工厂以治疗严重疾病
EP4351598A1 (en) * 2021-05-14 2024-04-17 Appia Bio, Inc. Engineering stem cells for allogenic car t cell therapies
WO2023278525A1 (en) * 2021-06-29 2023-01-05 Biomarin Pharmaceutical Inc. Cell culture feed for recombinant adeno-associated virus production in mammalian cells
CA3235379A1 (en) * 2021-10-14 2023-04-20 Appia Bio, Inc. Engineering stem cell t cells with multiple t cell receptors
WO2023230603A2 (en) * 2022-05-26 2023-11-30 Trustees Of Tufts College Systems and methods for making biological robots
CN114790445B (zh) * 2022-06-22 2022-09-02 北京荟科柘生物科技有限公司 一种cd4-cd8-nkt细胞制备方法及其应用
WO2024040061A2 (en) * 2022-08-16 2024-02-22 The Regents Of The University Of California Alleviating graft versus host disease using engineered inkt cells
WO2024077104A2 (en) * 2022-10-04 2024-04-11 Mink Therapeutics, Inc. Fibroblast activation protein (fap) car-invariant natural killer t cells and uses thereof
CN117030580B (zh) * 2023-09-15 2024-07-16 广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院） LDNs在坏死性小肠结肠炎诊断中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140255363A1 (en) * 2011-09-16 2014-09-11 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
WO2017075389A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 The Regents Of The Universtiy Of California Methods of generating t-cells from stem cells and immunotherapeutic methods using the t-cells
WO2017079673A1 (en) * 2015-11-04 2017-05-11 Fate Therapeutics, Inc. Genomic engineering of pluripotent cells
US20170283481A1 (en) * 2014-07-09 2017-10-05 The Regents Of The University Of California Engineered Invariant Natural Killer T (iNKT) Cells and Methods of Making and Using Thereof
WO2018055152A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Oslo Universitetssykehus Hf Modulation of function of immune effector cells

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070048301A1 (en) * 2002-11-26 2007-03-01 Bodary-Winter Sarah C Compositions and methods for the treatment of immune related diseases

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140255363A1 (en) * 2011-09-16 2014-09-11 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
US20170283481A1 (en) * 2014-07-09 2017-10-05 The Regents Of The University Of California Engineered Invariant Natural Killer T (iNKT) Cells and Methods of Making and Using Thereof
WO2017075389A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 The Regents Of The Universtiy Of California Methods of generating t-cells from stem cells and immunotherapeutic methods using the t-cells
WO2017079673A1 (en) * 2015-11-04 2017-05-11 Fate Therapeutics, Inc. Genomic engineering of pluripotent cells
WO2018055152A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Oslo Universitetssykehus Hf Modulation of function of immune effector cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CANCER RES., 2014, VOL.74, NO.18, PP.5173-5183, JPN6022010330, ISSN: 0004727791 *
PROC. NATL. ACAD. SCI., 2015, VOL.112, NO.5, PP.1523-1528, JPN6022010332, ISSN: 0004727790 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023229013A1 (ja) * 2022-05-27 2023-11-30 北京天一方生物科技▲発▼展有限公司 ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112512536A (zh) 2021-03-16
WO2019241400A1 (en) 2019-12-19
JP2023076711A (ja) 2023-06-01
EP3806869A4 (en) 2022-04-20
AU2019287483A1 (en) 2021-01-21
AU2019287483B2 (en) 2024-03-14
EP3806869A1 (en) 2021-04-21
CA3102801A1 (en) 2019-12-19
US20210123022A1 (en) 2021-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2021526838A (ja) 幹細胞の操作によるｉｎｋｔ細胞に基づく既製の細胞療法
JP7402211B2 (ja) 幹細胞からｔ細胞を作製する方法および該ｔ細胞を用いた免疫療法的方法
US20220257655A1 (en) Engineered off-the-shelf immune cells and methods of use thereof
JP2022078215A (ja) 多能性幹細胞からｈｌａホモ接合免疫細胞への指向分化方法
US20190175648A1 (en) T cells for expression of chimeric antigen receptors and other receptors
CN111278967A (zh) 使用时序性和瞬时质粒载体表达系统进行细胞重编程
EP3638775A1 (en) Compositions and methods for inducing myeloid suppressive cells and use thereof
WO2023168341A1 (en) Engineered cells and methods of use
CN117480249A (zh) 包含未重排的t细胞受体(tcr)基因座的干细胞及其使用方法
CROOKS et al. Sommaire du brevet 3003145
CROOKS et al. Patent 3003145 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210210

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210210

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220315

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220614

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220812

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220909

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20220909

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20221209

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230407

C60 Trial request (containing other claim documents, opposition documents)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60

Effective date: 20230407

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20230413

C21 Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21

Effective date: 20230414

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20230418