CN112512536A - 基于干细胞工程化inkt细胞的现成细胞疗法 - Google Patents

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Y.朱
C.西特
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Abstract

本公开的实施方案包括与用于临床疗法的现成使用的工程化不变自然杀伤T(iNKT)细胞有关的组合物和方法。在具体实施方案中，iNKT细胞由造血干祖细胞产生，并且由于它们是HLA阴性还适合于同种异体细胞疗法。在具体实施方案中，将细胞在特定体外三维人工胸腺类器官系统中培养，并且所述细胞具有显像和自杀靶向能力。

Description

基于干细胞工程化INKT细胞的现成细胞疗法
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年6月12日提交的美国临时申请第62/683,750号的权益，其内容通过引用整体并入本申请。
发明领域
本公开的实施方案至少涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学领域，至少包括癌症药物。
发明背景
癌症影响全世界数千万人群，并且是美国和加利福尼亚州公共健康的主要威胁。癌症是加利福尼亚州第二大主要死因，每年导致超过56,000人死亡，也给该州经济带来了毁灭性影响。尽管有现有的疗法，癌症患者仍然承受这些治疗的无效性、其毒性和复发的风险。因此，迫切需要用于癌症的新疗法。在过去的十年中，免疫疗法已成为新一代的癌症药物。特别地，基于细胞的细胞疗法已显示出巨大的希望。突出的例子是嵌合抗原受体(CAR)工程化过继T细胞疗法，其靶向某些血液癌的功效令人印象深刻。
然而，当前的大多数治疗方案包括自体过继细胞转移，其中将从患者采集的免疫细胞生产并用于治疗此单个患者。这种方法是昂贵、生产劳动密集且难以广泛地递送给有需要的所有患者。因此，能够大规模生产并可易于分配以治疗更大量的患者的同种异体免疫细胞产品的需求量很大。
尽管有现有的疗法，癌症患者仍然承受这些治疗无效性、其毒性和复发风险。因此，迫切需要用于疾病如癌症和自身免疫性疾病的新疗法。本公开不仅提供了对疗法的长期需求的解决方案，而且提供了可更广泛地递送或分配的疗法。
发明概述
提供实施方案以解决对新疗法的需求，更具体地，对不受使用自体细胞使疗法个体化面临的挑战所阻碍的细胞疗法的需求。制造治疗性细胞群或可用于形成“现成的(off-the-shelf)”治疗性细胞群的细胞群的能力提高了新细胞疗法的可用性和实用性。
实施方案涉及工程化不变自然杀伤T(iNKT)细胞或工程化iNKT细胞群。在至少一些情况下，工程化iNKT细胞包含工程化嵌合抗原受体(CAR；CAR-iNKT细胞)和/或工程化T细胞受体(TCR-iNKT细胞)。在细胞的背景下讨论的任何实施方案都可应用于此类细胞群。在特定实施方案中，工程化iNKT细胞包含含有以下1、2和/或3种的核酸：i)全部或部分不变αT细胞受体编码序列；ii)全部或部分不变βT细胞受体编码序列；或iii)自杀基因。在进一步的实施方案中，存在工程化iNKT细胞，其包含具有编码以下项的序列的核酸：i)全部或部分不变αT细胞受体；或ii)全部或部分不变βT细胞受体；和/或iii)自杀基因产物。
其他方面涉及具有增加水平的NK激活受体、减少水平的NK抑制性受体、和/或增加水平的细胞毒性分子的工程化iNKT细胞。在一些实施方案中，NK激活受体包含NKG2D和/或DNAM-1。在一些实施方案中，细胞毒性分子包含穿孔蛋白和/或粒酶B。在一些实施方案中，抑制性受体包含KIR。增加或减少可以是相对于从健康个体分离的非工程化iNKT中同一标志物的水平。其他方面涉及工程化iNKT细胞群，其中所述细胞群具有增加水平的NK激活受体、减少水平的NK抑制性受体、和/或增加水平的细胞毒性分子。在一些实施方案中，工程化iNKT细胞群具有至少、正好、或大于70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的表达高水平NKG2D的细胞。在一些实施方案中，工程化iNKT细胞群具有至少、正好或大于80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95 96、97、98或99％的表达高水平DNAM-1的细胞。在一些实施方案中，工程化iNKT细胞群具有至多、正好或小于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30％的表达高水平KIR的细胞。在一些实施方案中，工程化iNKT细胞群具有至少、正好或大于65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的表达高水平穿孔蛋白的细胞。在一些实施方案中，工程化iNKT细胞群具有至少、正好或大于50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的表达高水平粒酶B的细胞。本公开的其他方面涉及包含高水平NK激活物NKG2D和DNAM-1、低水平或检测不到的水平的NK抑制性受体KIR、以及高水平细胞毒性分子穿孔蛋白和粒酶B的工程化iNKT细胞或细胞群。本公开的其他方面涉及工程化iNKT细胞群，其中超过90％的群包含高水平NK激活物NKG2D和DNAM-1、低水平或检测不到的水平的NK抑制性受体KIR、以及高水平细胞毒性分子穿孔蛋白和粒酶B。
在一些实施方案中，工程化iNKT细胞包含受异源启动子控制的核酸，这意指该启动子不是控制该核酸转录的同一基因组启动子。涵盖工程化iNKT细胞包含含有一个或多个编码序列的外源核酸，一些或全部所述编码序列在本文所述的许多实施方案中受异源启动子控制。
特别指出的是，就任何其他细胞或细胞群实施方案而言可以采用在特定细胞或细胞群实施方案的背景下讨论的任何实施方案。此外，在特定方法的背景下采用的任何实施方案可在本文所述的任何其他方法的背景下实施。此外，本文所述不同方法的方面可组合以实现其他方法，以及形成或描述任何细胞或细胞群的用途。特别涵盖的是，一种或多种实施方案的方面可组合本文所述的一种或多种其他实施方案的方面。此外，本文所述的任何方法可以被表述为阐明本文所述细胞或细胞群的一种或多种用途。例如，可从本文所述的任何方法阐述工程化iNKT细胞或iNKT细胞群的用途。
在特定实施方案中，存在工程化不变自然杀伤T(iNKT)细胞，其表达至少一种不变自然杀伤T细胞受体(iNKT TCR)和外源自杀基因产物，其中所述至少一种iNKT TCR从经重组修饰的启动子区转录控制下的外源核酸和/或内源不变TCR基因表达。iNKT TCR是指“识别CD1d分子呈递的脂质抗原的TCR”。它可包括α-TCR、β-TCR或两者。在某些情况下，使用的TCR可以属于较宽的“不变TCR”组，例如MAIT细胞TCR、GEM细胞TCR或γ/δTCR，分别产生HSC工程化MAIT细胞、GEM细胞或γ/δT细胞。
在某些实施方案中，存在工程化iNKT细胞群。在特定实施方案中，存在工程化iNKT细胞群，其包括：工程化iNKT克隆细胞，其包含改变的基因组不变T细胞受体序列或编码不变T细胞受体(TCR)且缺乏一种或多种HLA-I或HLA-II基因表达的外源核酸。“改变的基因组不变T细胞受体序列”是指已通过重组DNA技术改变的序列。术语“克隆”细胞是指经工程化以表达克隆的转基因iNKT TCR的iNKT细胞。在一些实施方案中，克隆细胞来自同一祖细胞。涵盖的是在一些实施方案中，存在混合的克隆细胞群，这意味着该群包含来自一组祖细胞的克隆细胞；该组可以是，至少或至多为10、20、30、40、50、60 70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个祖细胞(或其中可引出的任何范围)，意指该群中的细胞是最初转染/感染的祖细胞组的后代。在包含外源核酸或改变的基因组DNA序列的细胞的情况下，克隆细胞可源自其中引入外源核酸的祖细胞。一些实施方案涉及克隆细胞群，意指该群包含源自同一祖细胞的后代细胞。涵盖的是一些细胞群可以包含不同克隆细胞的混合物，意指该群源自不同祖细胞，该祖细胞包含外源核酸，但可以以可识别的方式有所不同，例如外源核酸的整合位点。已经引入细胞(单独或作为较长核酸序列的部分)并被整合而使得后代细胞包含整合的核酸序列的核酸序列被认为是外源核酸。染色体外维持的所引入的核酸序列也被认为是外源核酸。
在利用iNKTαT细胞受体的部分或iNKTβT细胞受体的部分的实施方案中，涵盖实施方案涉及iNKTαT细胞受体的功能部分或iNKTβT细胞受体的功能部分，使得至少基于评估识别由CD1d分子呈递的脂质抗原的能力的测定法，表达它们两者的细胞是功能性iNKT细胞。
在一些实施方案中，核酸包含与编码iNKT TCR-α或iNKT TCR-β多肽的50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500个氨基酸或连续氨基酸残基(或其中可引出的任何范围)的序列为、至少、或至多60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％同一性(或其中可引出的任何范围)的序列。
在某些实施方案中，自杀基因是基于酶的，意味着自杀基因的基因产物是酶，并且自杀功能取决于酶活性。可在单一细胞或克隆群中利用一种或多种自杀基因。在一些实施方案中，自杀基因编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、羧肽酶G2、细胞色素P450、亚麻苦苷酶(linamarase)、β-内酰胺酶、硝基还原酶(nitroreductase)(NTR)、羧肽酶A或诱导型胱天蛋白酶9。可采用本领域中自杀基因使用的方法，例如美国专利号8628767，美国专利公开20140369979、U.S.20140242033和U.S.20040014191，其全部通过引用整体并入本文。在其他实施方案中，TK基因是病毒TK基因，即来自病毒的TK基因。在特定实施方案中，TK基因是单纯疱疹病毒TK基因。在一些实施方案中，自杀基因产物被底物激活。胸苷激酶是被更昔洛韦(ganciclovir)、喷昔洛韦(penciclovir)或其衍生物激活的自杀基因产物。在某些实施方案中，激活自杀基因产物的底物被标记以便检测。在一些情况下，底物可被标记用于显像。在一些实施方案中，自杀基因产物可由编码TCR-α或TCR-β之一或两者的相同或不同核酸分子编码。在某些实施方案中，自杀基因是sr39TK或诱导型胱天蛋白酶9。在可选择的实施方案中，细胞不表达外源自杀基因。在一些实施方案中，工程化iNKT细胞特异性结合α-半乳糖神经酰胺(α-GC)。
在另外的实施方案中，细胞缺乏至少一种HLA-I或HLA-II分子的表面表达或具有减少的至少一种HLA-I或HLA-II分子的表面表达。在一些实施方案中，缺乏HLA-I和/或HLA-II分子的表面表达通过以下来实现：破坏编码单独HLA-I/II分子的基因，或破坏编码作为所有HLA-I复合体分子的共有组分的B2M(β2微球蛋白)的基因，或破坏编码作为控制所有HLA-II基因表达的关键转录因子的CIITA(II类主要组织相容性复合体反式激活物)的基因。在特定实施方案中，细胞缺乏一种或多种HLA-I和/或HLA-II分子的表面表达，或表达减少(或至少减少)50、60、70、80、90、100％(或其中可引出的任何范围)的此类分子的水平。在一些实施方案中，HLA-I或HLA-II在iNKT细胞中不表达，因为该细胞由基因编辑操纵。在一些实施方案中，涉及的基因编辑是CRISPR-Cas9。代替Cas9，可涉及CasX或CasY。锌指核酸酶(ZFN)和TALEN，是其他基因编辑技术，以及Cpf1，它们都可以被采用。在其他实施方案中，iNKT细胞包含靶向减少HLA-I/II分子、B2M和/或CIITA表达的一种或多种不同的siRNA或miRNA分子。
在一些实施方案中，iNKT细胞包含重组载体或来自引入细胞的重组载体的核酸序列。在某些实施方案中，重组载体是病毒载体。在其他实施方案中，病毒载体是慢病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒、或腺病毒。应当理解的是，某些病毒载体的核酸整合至宿主基因组序列中。
在一些实施方案中，细胞不暴露于包含动物血清的培养基。在其他实施方案中，细胞是冷冻的或冷冻了的。在一些实施方案中，细胞先前已被冷冻并且该先前冷冻的细胞在室温下稳定至少1小时。在一些实施方案中，细胞先前已被冷冻并且该先前冷冻的细胞在室温下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、24、30或48小时(或其中可引出的任何范围)。在某些实施方案中，细胞或细胞群在包含右旋糖(dextrose)、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖和/或DMSO的溶液中。在其他实施方案中，细胞在无菌、无热源且等张的溶液中。
在某些实施方案中，iNKT细胞已被激活或被激活。在具体实施方案中，iNKT细胞已用α-半乳糖神经酰胺(α-GC)激活。
在涉及多种细胞的实施方案中，细胞群可包含、包含至少或包含至多约102,103,104,,105,106,107,,108,109,1010,1011,1012,1013,1014,1015个或更多细胞(或其中可引出的任何范围)，在一些实施方案中是工程化iNKT细胞。在一些情况下，细胞群包含至少约106至1012个工程化iNKT细胞。涵盖在一些实施方案中，具有这些数目的细胞群是由细胞的单个批次产生，而不是合并单独产生的细胞批次的结果。
在特定实施方案中，存在iNKT细胞群，其包括：克隆iNKT细胞，其包含编码iNKT T细胞受体(TCR)和胸苷激酶自杀基因产物的一种或多种外源核酸，其中克隆iNKT细胞已被工程化为不表达功能性β-2-微球蛋白(B2M)和/或主要组织相容性复合体II类或反式激活物(CIITA)，并且其中细胞群至少为约106至1012个总细胞，并且包含至少约102至106个工程化iNKT细胞。在某些情况下，细胞在溶液中冷冻。
一些实施方案涉及制备iNKT细胞或细胞群，特别是如下的群，其中一些或全部细胞是克隆的。在某些实施方案中，细胞群包含细胞，其中至少或至多50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％(或其中可引出的任何范围)的细胞是克隆的，即已经与群中的另一个细胞源自相同祖细胞的细胞的百分比。在其他实施方案中，细胞群包含由自、自至少或自至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、7、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100(或其中可引出的任何范围)种不同亲代细胞产生的细胞组成的细胞群。
提供了制备、制作、制造和使用工程化iNKT细胞和iNKT细胞群的方法。在实施方案中，方法包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个以下步骤：获得造血细胞；获得造血祖细胞；获得能够成为一种或多种造血细胞的祖细胞；获得能够成为iNKT细胞的祖细胞；使用一种或多种细胞表面标志物从混合细胞群中选择细胞；从细胞群中选择CD34+细胞；从细胞群中分离CD34+细胞；将CD34+和CD34-细胞彼此分开；基于非CD34或除CD34之外的细胞表面标志物选择细胞；将一种或多种编码iNKT T细胞受体(TCR)的核酸引入细胞；用编码iNKT T细胞受体(TCR)的病毒载体感染细胞；用编码iNKT T细胞受体(TCR)的一种或多种核酸转染细胞；用编码iNKT T细胞受体(TCR)的表达构建体转染细胞；将编码iNKT T细胞受体(TCR)的外源核酸整合至细胞基因组；将编码自杀基因产物的一种或多种核酸引入细胞；用编码自杀基因产物的病毒载体感染细胞；用编码自杀基因产物的一种或多种核酸转染细胞；用编码自杀基因产物的表达构建体转染细胞；将编码自杀基因产物的外源核酸整合至细胞基因组；将编码一种或多种多肽的一种或多种核酸和/或用于基因编辑的核酸分子引入细胞；用编码一种或多种多肽的病毒载体和/或用于基因编辑的核酸分子感染细胞；用编码一种或多种多肽的一种或多种核酸和/或用于基因编辑的核酸分子转染细胞；用编码一种或多种多肽的表达构建体和/或用于基因编辑的核酸分子转染细胞；整合编码一种或多种多肽的外源核酸和/或用于基因编辑的核酸分子；编辑细胞的基因组；编辑细胞的启动子区；编辑用于iNKT TCR基因的启动子和/或增强子区；消除一种或多种基因的表达；消除分离的人CD34+细胞中一种或多种HLA-I/II基因的表达；将用于基因编辑的一种或多种核酸转染至细胞；培养所分离或选择的细胞；扩增所分离或选择的细胞；培养针对一种或多种细胞表面标志物选择的细胞；培养分离的表达iNKT TCR的CD34+细胞；扩增分离的CD34+细胞；在产生或扩增iNKT细胞的条件下培养细胞；在人工胸腺类器官(ATO)系统中培养细胞以产生iNKT细胞；在无血清培养基中培养细胞；在ATO系统中培养细胞，其中所述ATO系统包含3D细胞聚集体和无血清培养基，所述3D细胞聚集体包含选择的表达Notch配体的基质细胞群。特别涵盖在实施方案中可排除一个或多个步骤。
在一些实施方案中，存在制备克隆iNKT细胞群的方法，其包括：a)从人外周血细胞(PBMC)中选择CD34+细胞；b)引入编码人T细胞受体(TCR)的一种或多种核酸；c)在分离的人CD34+细胞中消除一种或多种HLA-I/II基因的表面表达；和d)在人工胸腺类器官(ATO)系统中培养分离的表达iNKT TCR的CD34+细胞来生产iNKT细胞，其中ATO系统包含3D细胞聚集体和无血清培养基，所述聚集体包含选择的表达Notch配体的基质细胞群。
可用于产生工程化iNKT细胞的细胞是造血祖干细胞。细胞可来自外周血单个核细胞(PBMC)、骨髓细胞、胎儿肝细胞、胚胎干细胞、脐带血细胞、诱导多能干细胞(iPS细胞)或其组合。
在一些实施方案中，方法包括分离CD34-细胞或分离CD34-和CD34+细胞。尽管实施方案涉及进一步操纵CD34+细胞，但是CD34-细胞可用于形成iNKT细胞。因此，在一些实施方案中，CD34-细胞随后被使用，并且可为此目的将其保存。
某些方法涉及在将一种或多种核酸引入细胞之前，在培养基中培养选择的CD34+细胞。培养细胞可包括将选择的CD34+细胞用包含一种或多种生长因子的培养基温育。在一些实施方案中，一种或多种生长因子包括c-kit配体、flt-3配体和/或人血小板生成素(TPO)。在其他实施方案中，培养基包含c-kit配体flt-3配体和TPO。在一些实施方案中，相对于每种生长因子或任何和所有这些特定生长因子的总和，一种或多种生长因子的浓度为约5ng/ml至约500ng/ml。培养基中单个生长因子或生长因子组合的浓度可以为约，至少约或至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500(或任何可引出的范围)ng/ml或μg/ml或更高。
在一些实施方案中，如本文所讨论，核酸可包含编码α-TCR和/或β-TCR的核酸序列。在某些实施方案中，一种核酸编码α-TCR和β-TCR两者。在另外的实施方案中，核酸还包含编码自杀基因产物的核酸序列。在一些实施方案中，引入选择的CD34+细胞的核酸分子编码α-TCR、β-TCR和自杀基因产物。在其他实施方案中，方法还涉及将编码自杀基因产物的核酸引入选择的CD34+细胞，在这种情况下，编码自杀基因产物的核酸分子与编码至少一种TCR基因的核酸不同。
如所讨论，在一些实施方案中，iNKT细胞在细胞表面上不表达HLA-I和/或HLA-II分子，这可以通过破坏编码β-2-微球蛋白(B2M)、反式激活物(CIITA)或者HLA-I和HLA-II分子的基因表达来实现。在某些实施方案中，方法涉及在分离的人CD34+细胞中消除一种或多种HLA-I/II分子的表面表达。在特定实施方案中，消除表达可通过细胞基因组DNA的基因编辑来实现。一些方法包括将CRISPR和对应于B2M或CIITA的一种或多种向导RNA(gRNA)引入细胞。在特定实施方案中，通过电穿孔或脂质介导的转染将CRISPR或一种或多种gRNA转染至细胞。因此，方法可涉及通过用编码CRISPR和一种或多种gRNA的核酸转染细胞，将CRISPR和一种或多种gRNA引入细胞。在一些实施方案中，可采用不同的基因编辑技术。
类似地，在一些实施方案中，将编码TCR受体的一种或多种核酸引入细胞。这可通过用重组载体转染或感染细胞来完成，所述重组载体可以是或可以不是本文讨论的病毒载体。在一些实施方案中，外源核酸可掺入细胞的基因组中。
在一些实施方案中，细胞在无细胞培养基中培养。在某些实施方案中，无血清培养基还包含外部添加的抗坏血酸。在特定实施方案中，方法涉及添加抗坏血酸介质。在进一步的实施方案中，无血清培养基还包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或全部16种(或其中可引出的范围)以下外部添加的成分：FLT3配体(FLT3L)、白介素7(IL-7)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-21、TNF-α、TGF-β、干扰素-γ、干扰素-λ、TSLP、胸腺喷丁、pleotrophin或中期因子(midkine)。在另外的实施方案中，无血清培养基包含一种或多种维生素。在某些情况下，无血清培养基包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种(或其中可引出的任何范围)以下维生素：包含生物素、DLα-生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇(pyridoxine)、核黄素、硫胺素、肌醇、维生素B12或其盐。在某些实施方案中，培养基包含或至少包含生物素、DLα-生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A或其组合或盐。在另外的实施方案中，无血清培养基包含一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，无血清培养基包含1、2、3、4、5、6或更多种(或其中可引出的任何范围)以下蛋白质：白蛋白或牛血清白蛋白(BSA)、BSA的级份，过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶或其组合。在其他实施方案中，无血清培养基包含1、2、3、4、5、7、8、9、10或11种以下化合物：皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、或三碘甲状腺素(triodo-I-thyronine)、或其组合。在其他实施方案中，无血清培养基包含
Figure BDA0002916540480000111
补充剂、无异物(xeno-fee)
Figure BDA0002916540480000112
补充剂、GS21TM补充剂、或其组合。在另外的实施方案中，无血清培养基包含或进一步包含氨基酸、单糖和/或无机离子。在一些方面，无血清培养基包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种以下氨基酸：精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、或缬氨酸、或其组合。在其他方面，无血清培养基包含1、2、3、4、5或6种以下无机离子：钠、钾、钙、镁、氮、或磷、或其组合或盐。在其他方面，无血清培养基包含1、2、3、4、5、6或7种以下元素：钼、钒、铁、锌、硒、铜、或锰、或其组合。
在一些方法中，细胞在人工胸腺类器官(ATO)系统中培养。ATO系统涉及三维(3D)细胞聚集体，其是细胞的聚集体。在某些实施方案中，3D细胞聚集体包含选择的表达Notch配体的基质细胞群。在一些实施方案中，3D细胞聚集体通过在物理基质或支架上将CD34+转导的细胞与选择的基质细胞群混合而产生。在其他实施方案中，方法包括离心CD34+转导的细胞和基质细胞以形成置于物理基质或支架上的细胞团块。在某些实施方案中，基质细胞表达Notch配体，其是完整的、部分的或经修饰的DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、或其组合。在其他实施方案中，Notch配体是人Notch配体。在其他实施方案中，Notch配体是人DLL1。
在其他方面，基质细胞与CD34+细胞的比例为约、至少约或至多约5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2，1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50(或其中任何可引出的范围)。在特定实施方案中，基质细胞与CD34+细胞的比例为约1:5至1:20。在特定实施方案中，基质细胞是鼠基质细胞系、人基质细胞系、选择的原代基质细胞群、选择的从多能干细胞体外分化的基质细胞群、或其组合。在某些实施方案中，基质细胞是选择的从造血干细胞或祖细胞体外分化的基质细胞群。CD34+细胞和基质细胞的共培养可以发生约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7天和/或1、2、3、4、5、6天，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多周(或其中可引出的任何范围)。在一些实施方案中，在共培养之前辐照基质细胞。
本公开的方法可产生细胞群，其包含至少1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、或1×1021个(或其中可引出的任何范围)细胞，其可表达标志物或具有高或低水平的某一标志物。细胞群数目可以是无需基于标志物表达的细胞分选或无需基于NK标志物表达的细胞分选或无需基于T细胞标志物表达的细胞分选获得的数目。在一些实施方案中，细胞群大小可以是无需基于抗原与异源靶向元件如CAR、TCR、BiTE或其他异源肿瘤靶向剂结合的细胞分选获得的大小。此外，所获得的细胞群可以是包含至少1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、或1×1021个(或其中可引出的任何范围)细胞的群，该细胞在一定时间段内制备，如至少、至多、或正好10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41天或7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30周(或其中可引出的任何范围)的时间段。高水平或低水平的标志物表达(如NK激活物、抑制剂或细胞毒性分子)可以与如由FACS分析确定的高表达有关。在一些实施方案中，高水平是相对于非NK细胞或非iNKT细胞，或者非T细胞的细胞。在一些实施方案中，高水平或低水平由FACS分析确定。
在一些实施方案中，方法中使用的饲养细胞包括CD34-细胞。这些CD34-细胞可以来自针对CD34+细胞选择的相同的细胞群。在另外的实施方案中，细胞可以被激活。在某些实施方案中，方法包括激活iNKT细胞。在具体实施方案中，iNKT细胞已用α-半乳糖神经酰胺(α-GC)激活和扩增。可将细胞与α-GC一起温育或培养来激活和扩增它们。在一些实施方案中，饲养细胞已用α-GC脉冲。
在一些方法中，选择缺乏一种或多种HLA-I或–II分子表面表达的iNKT细胞。在一些方面，选择缺乏HLA-I和/或HLA-II分子表面表达的iNKT细胞保护这些细胞免于受体免疫细胞的消减。
细胞可立即使用，或者它们可保存供将来使用。在某些实施方案中，用于形成iNKT细胞的细胞被冷冻，而在一些实施方案中，所产生的iNKT细胞可被冷冻。在一些方面，细胞在包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖和DMSO的溶液中。在其他实施方案中，细胞在无菌、无热原且等张的溶液中。在一些实施方案中，工程化iNKT细胞源自造血干细胞。在一些实施方案中，工程化iNKT细胞源自G-CSF动员的CD34+细胞。在一些实施方案中，细胞源自未患癌症的人患者的细胞。在一些实施方案中，细胞不表达内源TCR。
由生产周期产生的细胞数量可以为约、至少约或至多约102、103、104,、105、106、107,、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015个或更多个(或其中可引出的任何范围)细胞，在一些实施方案中，所述细胞是工程化iNKT细胞。在一些情况下，细胞群包含至少约106至1012个工程化iNKT细胞。涵盖在一些实施方案中，具有这些数目的细胞群是由细胞的单个批次产生，而不是合并单独产生的细胞的批次的结果，即，来自单一生产周期。
在一些实施方案中，细胞群被冷冻然后解冻。可将细胞群用于产生工程化iNKT细胞，或者它们可包含工程化iNKT细胞。
可将工程化iNKT细胞用于治疗患者。在一些实施方案中，方法包括将一种或多种另外的核酸引入细胞群，所述细胞群先前可以已被或未被冷冻和解冻。这种用途提供了形成现成iNKT细胞的优势之一。在特定实施方案中，一种或多种另外的核酸编码一种或多种治疗性基因产物。治疗性基因产物的实例至少包括以下：1.抗原识别分子，如CAR(嵌合抗原受体)和/或TCR(T细胞受体)；2.共刺激分子，如CD28、4-1BB、4-1BBL、CD40、CD40L、ICOS；和/或3.细胞因子，如IL-1、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、IFN-γ、TNF-γ、TGF-β、G-CSF、GM-CSF；4.转录因子，如T-bet、GATA-3、RORγt、FOXP3、和Bcl-6。包括治疗性抗体，也包括嵌合抗原受体、单链抗体、单抗体(monobody)、人源化抗体、双特异性抗体、单链FV抗体、或其组合。
在一些实施方案中，存在制备包括工程化不变自然杀伤(iNKT)T细胞的细胞群的方法，其包括：a)从人外周血细胞(PBMC)中选择CD34+细胞；b)用包含生长因子的培养基培养CD34+细胞，所述生长因子包括c-kit配体、flt-3配体和人血小板生成素(TPO)；c)用慢病毒载体转导选择的CD34+细胞，所述慢病毒载体包含编码α-TCR、β-TCR、胸苷激酶和自杀基因如sr39TK的核酸序列；d)将Cas9和用于β2微球蛋白(B2M)和/或CTIIA的gRNA引入选择的CD34+细胞，以破坏B2M和/或CTIIA的表达；e)用表达外源Notch配体的经辐照的基质细胞系培养所转导的细胞2至12(如2至10或6至12)周，以在3D聚集细胞培养物中扩增iNKT细胞；f)选择缺乏HLA-I和/或HLA-II分子表面表达的iNKT细胞；以及g)用经辐照的负载α-GC的饲养细胞培养选择的iNKT细胞。
在一些实施方案中，通过包括以下的方法产生工程化iNKT细胞：a)从人外周血细胞(PBMC)中选择CD34+细胞；b)用包含生长因子的培养基培养CD34+细胞，所述生长因子包括c-kit配体、flt-3配体和人血小板生成素(TPO)；c)用慢病毒载体转导选择的CD34+细胞，所述慢病毒载体包含编码α-TCR、β-TCR、胸苷激酶和报告基因产物的核酸序列；d)将Cas9和用于β2微球蛋白(B2M)和/或CTIIA的gRNA引入选择的CD34+细胞，以消除B2M或CTIIA表达；e)用经辐照的表达外源Notch配体的基质细胞系培养所转导的细胞2-10周，以在3D聚集细胞培养物中扩增iNKT细胞；f)选择缺乏B2M和/或CTIIA表达的iNKT细胞；以及g)用经辐照的饲养细胞培养选择的iNKT细胞。
还提供了用iNKT细胞或细胞群治疗患者的方法。在某些实施方案中，患者患有癌症。在一些实施方案中，患者患有涉及炎症的疾病或病况，在一些实施方案中，排除癌症。在具体实施方案中，患者患有自身免疫疾病或病况。在特定方面，细胞或细胞群对于患者是同种异体的。在另外的实施方案中，患者未显示细胞或细胞群的排斥或消减的体征。一些治疗方法还包括向患者施用激活iNKT细胞的刺激性分子(如单独或加载到APC的α-GC)或启动自杀基因产物的化合物。
在一些实施方案中，用工程化iNKT细胞治疗的癌症包括白血病。在一些实施方案中，用工程化iNKT细胞治疗的癌症包括慢性骨髓性白血病细胞。在一些实施方案中，用工程化iNKT细胞治疗的癌症包括血液癌。在一些实施方案中，用工程化iNKT细胞治疗的癌症包括多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，用工程化iNKT细胞治疗的癌症包括前列腺癌。在一些实施方案中，用工程化iNKT细胞治疗的癌症包括肺癌。
用iNKT细胞治疗癌症患者可导致在向患者施用细胞或细胞群后癌症患者的肿瘤细胞被杀伤。炎性疾病或病况的治疗可导致炎症减轻。在其他实施方案中，患有自身免疫性疾病或病况的患者可经历该疾病或病况的症状的改善，或可经历来自iNKT细胞的其他治疗益处。可采用用iNKT细胞和标准治疗方案或其他免疫治疗方案的联合治疗。
前述内容已相当广泛地概述了本公开的特征和技术优点，以便可更好地理解以下的详细描述。在下文中将描述形成本文权利要求主题的附加特征和优点。本领域技术人员应当理解的是，所公开的概念和特定实施方案可以容易地用作修改或设计用于实现本设计的相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应当认识到，这样的等同构造不脱离所附权利要求书中所阐述的精神和范围。当结合附图考虑时，从以下描述将更好地理解关于组织和操作方法被认为是本文公开设计的特征的新颖特征以及进一步的目的和优点。然而，应当明确理解的是，提供每个附图仅出于说明和描述的目的，并且不作为本公开的范围的限定。
附图简述
为了更完整地理解本公开，现在结合附图参考以下描述，其中：
图1示出生产和使用现成的通用造血干细胞(HSC)工程化iNKT(UHSC-iNKT)细胞过继疗法实例的示意图。
图2A至图2D涉及在BLT(人骨髓-肝-胸腺移植的NOD/SCID/γc-/-小鼠)人源化小鼠模型中产生人HSC工程化iNKT细胞。(2A)实验设计的示例。(2B)脾细胞的FACS图。HSC-iNKTBLT：在BLT小鼠中产生的人HSC工程化iNKT细胞。hTc：人常规T细胞。图2C至图2D显示在人工胸腺类器官(ATO)体外培养系统中产生人HSC工程化NY-ESO-1特异性常规T细胞。(2C)实验设计的示例。(2D)细胞产率(n＝3-6)。根据学生t检验，**P<0.01。
图3A至图3D表明初步CMC研究，其中在稳健且高产率的2阶段ATO-αGC体外培养系统中产生人HSC工程化iNKT细胞(研究HSC-iNKTATO细胞作为治疗替代物)。HSC-iNKTATO：在ATO培养中产生人HSC工程化iNKT细胞。(3A)2阶段ATO-αGC体外培养系统。ATO：人工胸腺类器官；αGC：α-半乳糖神经酰胺，特异性刺激iNKT细胞的有效激动剂配体。(3B)在ATO培养阶段产生HSC-iNKTATO细胞。6B11是与iNKT TCR特异性结合的单克隆抗体。(3C)在PBMC/αGC培养阶段扩增HSC-iNKTATO细胞。(3D)HSC-iNKTATO细胞输出。
图4A至图4B提供人HSC工程化iNKT细胞的表型和功能性的初步药理学研究。(研究HSC-iNKTATO和HSC-iNKTBLT细胞作为治疗替代物)。(4A)表面FACS染色。(4B)细胞内FACS染色。PBMC-iNKT：体外扩增自健康供体PBMC的内源iNKT细胞；PBMC-Tc：来自健康供体PBMC的内源常规T细胞。
图5A至图5K提供人HSC工程化iNKT细胞的肿瘤杀伤效力的初步效力研究。(研究HSC-iNKTATO和HSC-iNKTBLT细胞作为治疗替代物)。(5A-5F)血液癌模型。(5A)MM.1S-hCD1d-FG人多发性骨髓瘤(MM)细胞系。(5B)体外肿瘤杀伤测定法。(5C)体外肿瘤杀伤的萤光素酶活性分析(n＝3)。(5D)使用NSG小鼠人MM转移模型的体内肿瘤杀伤测定法。(E-F)体内肿瘤杀伤的活体动物生物发光显像(BLI)分析。显示了第14天的代表性BLI图像(5E)和全身发光的时间过程测量(TBL；5F)(n＝3-4)。(5G-5K)实体瘤模型。(5G)A375-hCD1d-FG人黑素瘤细胞系。(5H)使用NSG小鼠人黑素瘤实体瘤模型的体内肿瘤杀伤测定法。(5I)肿瘤重量(第25天)。(5J)显示HSC-iNKTBLT细胞浸润到肿瘤部位(第25天)的FACS图。(5K)J的定量(n＝4)。根据学生t检验，**P<0.01，***P<0.001。
图6A至图6C显示毒理学/致瘤性的初步安全性研究(研究HSC-iNKTBLT细胞作为治疗替代物)。(6A)小鼠体重(n＝9-10)。ns，不显著，根据学生t检验。(6B)小鼠存活率(n＝9-10)。(6C)小鼠病理学。收集各种组织并由UCLA病理学中心(UCLA Pathology Core)分析(n＝9-10)。
图7A至图7D提供用于PET显像和安全对照的sr39TK基因的初步安全研究。(研究HSC-iNKTBLT细胞作为治疗替代物)。(7A)实验设计。(7B)GCV治疗前和后BLT-iNKTTK小鼠的PET/CT图像(n＝4-5)。(7C)显示GCV治疗后HSC-iNKTBLT细胞的有效且特异性消减的FACS图(n＝4-5)。(7D)对7C中的FACS图的定量(n＝4-5)。ns，不显著；**P<0.01，根据学生t检验。
图8A至图8F示出产生UHSC-iNKT细胞的制造过程示例。(8A)实验设计。(8B)HSC中Lenti/iNKT-sr39TK载体介导的iNKT TCR表达。(8C)HSC中HLA-I/II表达的CRISPR-Cas9/B2M-CIITA-gRNA复合物介导的敲除。(8D)显示阶段1培养和阶段2培养之间的纯化步骤图。(8E)2M2/Tü39mAb介导的HLA-I/IIneg细胞的MACS阴性选择。(8F)6B11 mAb介导的HSC-iNKTATO细胞的MACS阳性选择。
图9A至图9E提供作用机理(MOA)研究的示例。(9A)iNKT细胞靶向肿瘤使用的可能机制。(9B-9C)CD1d/TCR介导的肿瘤细胞直接杀伤研究。(9B)实验设计；(9C)杀伤MM.1S-hCD1d-FG人多发性骨髓瘤细胞(n＝3)。(9D-9E)通过激活NK细胞的CD1d非依赖性靶向肿瘤细胞的研究。(9D)实验设计；(9E)杀伤K562肿瘤细胞(n＝2)。将经辐照的负载αGC的PBMC用作抗原呈递细胞(APC)，ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001，根据单向ANAVO。
图10A至图10G显示安全注意事项。(10A)可能的GvHD和HvG反应以及工程化安全控制策略。(10B)用于研究GvHD反应的体外混合淋巴细胞培养(MLC)测定法。(10C)MLC测定法中的IFN-γ产生，显示没有由HSC-iNKTATO细胞诱导的GvHD反应(n＝3)。包括来自3个不同健康供体的PBMC作为应答物。(10D)用于研究HvG反应的体外混合淋巴细胞培养(MLC)测定法。(10E)MLC测定法中的IFN-γ产生，显示对HSC-iNKTATO细胞的较小HvG反应(n＝3)。实验中使用了来自2个不同健康供体的PBMC。(10F)在体外混合NK/iNKT培养中HSC-iNKTBLT细胞抵抗不匹配供体NK细胞的杀伤。(10G)体内混合淋巴细胞过继转移(MLT)测定法研究GvHD和HvD反应。ns，不显著，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，根据单向ANAVO。
图11A至图11G显示联合疗法的示例。(11A)研究UHSC-iNKT细胞疗法联合检查点阻断疗法的实验设计。(11B)UHSCCAR-iNKT细胞。(11C)A375-hCD1d-hCD19-FG人黑素瘤细胞系。(11D)研究UHSCCAR-iNKT细胞的抗肿瘤效力的实验设计。(11E)UHSCTCR-iNKT细胞。(11F)A375-hCD1d-A2/ESO-FG人黑素瘤细胞系。(11G)研究UHSCTCR-iNKT细胞抗肿瘤效力的实验设计。
图12示出药动学/药效学(PK/PD)研究的示例。
图13显示iNKT-sr39TK慢病毒载体的一个示例。
图14示出用于产生UHSC-iNKT细胞的细胞制造过程的一个示例。
图15HSC-iNKT细胞的表型和功能。给出了代表性FACS图，显示NK激活受体(NKG2D和DNAM-1)和抑制性受体(KIR)的表面染色，以及细胞毒性分子(穿孔蛋白和粒酶B)的细胞内染色。包括从健康人供体外周血中分离的天然NK细胞(PBMC-NK细胞)作为对照。
图16A至图16G体外效力和MOA研究。(A)研究HSC-iNKT细胞杀伤NK细胞样肿瘤细胞的实验设计。在本研究中使用多种人肿瘤细胞系并将其工程化改造为过表达萤火虫萤光素酶(Fluc)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双重报告基因，从而能够使用萤光素酶活性测定法灵敏地测量肿瘤杀伤。A375-FG，工程化人黑素瘤肿瘤细胞系；K562-FG，工程化人慢性骨髓性白血病细胞系；MM.1S-FG，工程化人多发性骨髓瘤细胞系；H292-FG，工程化人肺癌细胞系；PC3-FG，工程化人前列腺癌细胞系。(B-F)通过新鲜或冷冻/解冻的HSC-iNKT细胞体外杀伤各种人肿瘤细胞的萤光素酶活性分析。包括新鲜或冷冻/解冻的PBMC-NK细胞作为对照。(G)在NKG2D或/和DNAM-1阻断抗体存在下，HSC-iNKT细胞对肿瘤细胞杀伤效力的萤光素酶活性分析。代表2个实验。数据表示为平均值±SEM。ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，根据单向ANOVA。
图17A至图17D体内效力研究。(A)实验设计。(B)全身发光(TBL)随时间的定量(n＝5)。(C)随时间测量肿瘤大小(n＝5)。(D)第26天测量肿瘤重量(n＝5)。代表2个实验。数据表示为平均值±SEM。ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，根据学生t检验。
发明详述
1.定义示例
如本文中所用，说明书中的“一个”或“一种”可以表示一个/种或多个/种。如在本文权利要求中所使用，当与词“包括”结合使用时，词“一个”或“一种”可以表示一个/种或超过一个/种。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二或更多。在具体实施方案中，例如，本发明的各方面可“基本上由本发明的一个或多个序列组成”或“由本发明的一个或多个序列组成”。本发明的一些实施方案可由本发明的一个或多个元件、方法步骤和/或方法组成或基本上由本发明的一个或多个元件、方法步骤和/或方法组成。预期可对于本文描述的任何其他方法或组合物实施本文描述的任何方法或组合物。
本公开涵盖“HSC-iNKT细胞”，从造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)工程化的不变自然杀伤T(iNKT)细胞及其制备和使用方法。如本文所用，“HSC”用于指HSC、HPC、或HSC和HPC两者。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指有效减轻、改善或预防待治疗的疾病或病症的至少一种症状或体征的量。
术语“外源TCR”是指已转移(即通过基因转移/转导/转染技术)至细胞的TCR基因或TCR基因衍生物，或者是已接收TCR基因或TCR基因衍生物的细胞的后代。将外源TCR基因插入受体细胞的基因组中。在一些实施方案中，插入是随机插入。通过本领域已知的方法容易地实现TCR基因的随机插入。在一些实施方案中，将TCR基因插入内源基因座(如内源TCR基因基因座)。在一些实施方案中，细胞包含插入非内源基因座的基因座的一个或多个TCR基因。在一些实施方案中，细胞还包含异源序列，如标志物或抗性基因。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指工程化受体，其将任意特异性移植到免疫效应细胞。这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞；通过逆转录病毒或慢病毒载体促进其编码序列的转移。受体被称为嵌合体，因为它们由不同来源的部分组成。这些分子最常见形式是源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)与CD3-ζ跨膜和内域；CD28或41BB细胞内域或其组合融合的融合体。此类分子响应于scFv识别其靶标而产生信号传输。此类构建体的例子是14g2a-Zeta，它是源自杂交瘤14g2a(其识别双唾液酸神经节苷脂GD2)的scFv的融合体。当T细胞表达该分子时(作为通过肿瘤逆转录病毒载体实现的例子)，它们识别并杀伤表达GD2的靶细胞(如神经母细胞瘤细胞)。为了靶向恶性B细胞，研究人员使用对B谱系分子CD19特异的嵌合免疫受体重定向T细胞的特异性。免疫球蛋白重链和轻链的可变部分通过柔性接头融合形成scFv。该scFv之前是信号肽，用于将新生蛋白引导至内质网并随后表面表达(这被切割)。柔性间隔物允许scFv沿不同方向定向以实现抗原结合。跨膜域是典型的疏水性α螺旋，通常源自信号传导内域的原始分子，该分子突出至细胞中并传输所期望的信号。
术语“抗原”是指引起免疫系统产生针对其的抗体或T细胞反应的任何物质。在一些实施方案中，抗原是长度为5至50个氨基酸或至少、至多或正好为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55，60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250或300个氨基酸或其中可引出的任何范围。
术语“对于受体而言同种异体的”意指不是从受体分离的细胞。在一些实施方案中，细胞不是从患者分离的。在一些实施方案中，细胞不是从遗传匹配的个体(如具有相容基因型的亲戚)分离。
术语“惰性的”是指不会导致不希望的临床毒性的物质。这可以是中靶或脱靶的毒性。“惰性”可基于已知或预测的临床安全数据。
当与培养基、细胞外基质或培养条件关联使用时，术语“无异物(xeno-free,XF)”或“无动物成分(ACF)”或“无动物”是指培养基、细胞外基质或培养条件基本不含异质动物来源的成分。对于培养人细胞，非人类动物如小鼠的任何蛋白质都是异物成分。在某些方面，无异物基质可基本上不含任何非人类动物来源的组分，因此不包括小鼠饲养细胞或MatrigelTM。MatrigelTM是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤(富含细胞外基质蛋白的肿瘤)中提取的可溶性基底膜制备物，以包括层粘连蛋白(主要成分)、胶原蛋白IV、硫酸肝素蛋白聚糖和巢蛋白。
与培养基、细胞外基质或培养条件关联使用时，术语“确定的”是指其中几乎所有组分的性质和量均是已知的培养基、细胞外基质或培养条件。
“化学成分确定的培养基”是指其中几乎所有成分的化学性质及其量均是已知的培养基。这些培养基又被称为合成培养基。化学成分确定的培养基的示例包括TeSRTM。
如本文所用，细胞“基本上不含”某些试剂或元件，例如血清、信号传导抑制剂、动物成分或饲养细胞、外源遗传元件或载体元件，此时它们具有少于10％的元素时，并且当它们具有少于1％的元件时，细胞“本质上不含”某些试剂或元素。然而，甚至更理想的是，其中少于0.5％或少于0.1％总细胞群的细胞群包含外源遗传元件或载体元件。
当培养物、基质或培养基具有的这些试剂的水平分别比使用本领域普通技术人员已知的常规检测方法的可检测水平更低或尚未将这些试剂外在地添加到培养物、基质或培养基中时，培养物、基质或培养基“本质上不含”某些试剂或元素，例如血清、信号传导抑制剂、动物成分、或饲养细胞。无血清的培养基本质上不含血清。
“外周血细胞”是指血液的细胞成分，包括在血液循环池中发现的红细胞、白细胞和血小板。
“造血干细胞和祖细胞”或“造血前体细胞”是指定型到造血谱系但能够进一步造血分化的细胞，包括造血干细胞、多能造血干细胞(成血细胞)、髓系祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴样祖细胞。“造血干细胞(HSC)”是多能干细胞，可产生所有血细胞类型，包括髓系(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴样谱系(T-细胞、B细胞、NK细胞)。在本公开中，HSC是指“造血干细胞和祖细胞”和“造血前体细胞”。
造血干细胞和祖细胞可以表达或可以不表达CD34。造血干细胞可共表达CD133，并且是CD38表达阴性，CD90阳性，CD45RA阴性，谱系标志物阴性或其组合。造血祖细胞/前体细胞包括CD34(+)/CD38(+)细胞和CD34(+)/CD45RA(+)/lin(-)CD10+(常见淋巴样祖细胞)、CD34(+)CD45RA(+)lin(-)CD10(-)CD62L(hi)(淋巴样引导多能祖细胞)、CD34(+)CD45RA(+)lin(-)CD10(-)CD123+(粒细胞-单核细胞祖细胞)、CD34(+)CD45RA(-)lin(-)CD10(-)CD123+(常见髓样祖细胞)、或CD34(+)CD45RA(-)lin(-)CD10(-)CD123-(巨核细胞-红细胞祖细胞)。
“载体”或“构建体”(有时被称为基因递送或基因转移“媒介物”)是指体外或体内包含待递送至宿主细胞的多核苷酸的大分子、分子复合体或病毒颗粒。多核苷酸可以是线性或环状分子。
载体的常见类型“质粒”，是与染色体DNA分离的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA复制。在某些情况下，它是环形双链的。
“表达构建体”或“表达盒”是指能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包括启动子或功能上等同于启动子的结构。还可包括其他元件，例如增强子和/或转录终止信号。
当与细胞或生物体中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸关联使用时，术语“外源”是指已通过人工手段引入细胞或生物体中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸，或者就细胞而言是指被分离并随后通过人工手段引入其他细胞或生物体的细胞。外源核酸可来自不同的生物体或细胞，或者它可以是在该生物体或细胞中天然存在的核酸的一个或多个其他拷贝。外源细胞可以来自不同生物，或者它可以来自同一生物体。作为非限制性实例，外源核酸位于与天然细胞的染色体位置不同的染色体位置，或者在其它情况下侧翼有与天然存在的核酸序列不同的核酸序列。
术语“对应于”在本文中用于指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源(即，是相同的而非严格进化相关)，或者多肽序列与参考多肽序列相同。相反，术语“与...互补”在本文中用于指该互补序列与参考多核苷酸序列的全部或一部分同源。为了说明，核苷酸序列“TATAC”对应于参考序列“TATAC”并且与参考序列“GTATA”互补。
“编码”特定蛋白的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转基因”是置于适当调节序列的控制下时，在体外或体内被转录并任选地还被翻译成基因产物如多肽的核酸分子。编码区可以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，核酸分子可以是单链(即有义链)或双链。编码区的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子确定。基因可包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA，来自原核或真核DNA的基因组DNA序列，以及合成DNA序列。转录终止序列通常位于基因序列的3'端。
术语“细胞”在本文中使用其在本领域中最广泛的含义，是指活体，其是多细胞生物体的组织的结构单元，被将其与外界隔离的膜结构包围，具有自我复制的能力，并具有遗传信息和表达它的机制。本文所用的细胞可以是天然存在的细胞或经人工修饰的细胞(例如融合细胞，经遗传修饰的细胞等)。
如本文所用，术语“干细胞”是指能够自我复制且具有多能性或专能性的细胞。通常，干细胞可再生受伤的组织。本文中的干细胞可以是但不限于胚胎干(ES)细胞、诱导型多能干细胞或组织干细胞(又被称为组织特异性干细胞或成体干细胞)。
“胚胎干(ES)细胞”是源自早期胚胎的多能干细胞。ES细胞首次建立于1981年，自1989年以来也已应用于产生敲除小鼠。1998年建立人ES细胞，目前可用于再生医学。
与ES细胞不同，组织干细胞具有有限的分化潜能。组织干细胞存在于组织中的特定位置，并具有未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多能性通常较低。组织干细胞具有较高的细胞核/细胞质比率，并且细胞内细胞器很少。大多数组织干细胞具有低多能性，较长的细胞周期和超过个体寿命的增殖能力。基于细胞来源的位置，将组织干细胞分为几类，例如真皮系统、消化系统、骨髓系统、神经系统等。真皮系统中的组织干细胞包括表皮干细胞、毛囊干细胞等。消化系统中的组织干细胞包括胰腺(普通)干细胞、肝干细胞等。骨髓系统中的组织干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞等。神经系统中的组织干细胞包括神经干细胞、视网膜干细胞等。
“诱导多能干细胞”，通常缩写为iPS细胞或iPSC，是指从非多能细胞(通常是成人体细胞或终末分化的细胞，例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等)通过引入被称为重编程因子的某些因子人工制备的多能干细胞类型。
如本文所用，“分离的”，例如关于细胞和/或核酸时，是指通过人为干预而改变或去除自然状态。
“多能性”是指具有分化成构成一个或多个组织或器官或者特别是任何三个胚层(内胚层(内部胃粘膜、胃肠道、肺)，中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)或外胚层(表皮组织和神经系统))的所有细胞的潜能的干细胞。本文使用的“多能干细胞”是指能分化为源自三个胚层中的任何一个的细胞(如,全能细胞的直接后代或诱导的多能细胞)的细胞。
就核酸分子而言“可操作地连接”意指两个或多个核酸分子(如，待转录的核酸分子、启动子和增强子元件)以允许核酸分子转录的方式连接。提及肽和/或多肽分子“可操作地连接”意指两个或多个肽和/或多肽分子以产生单个多肽链(即，融合多肽，其具有融合体的每个肽和/或多肽组分的至少一种特性)的方式连接。融合多肽是特别嵌合的，即由异源分子组成。
本公开的实施方案涉及HSC细胞，其经工程化以充当具有NKT细胞T细胞受体(TCR)的iNKT细胞，还具有显像和自杀靶向能力，且对宿主免疫细胞靶向的消减具有抗性。此类细胞是在人工胸腺类器官(ATO)体外培养系统中产生的，该系统可支持TCR工程化HSC以高效率和高产率分化为克隆T细胞。
II.通用造血干细胞(HSC)工程化不变NKT细胞(UHSC-iNKT细胞)
本公开的实施方案利用细胞(如HSC)，其经修饰以充当不变NKT细胞，并且被工程化以具有使该细胞适合普遍应用(用于除获得原始细胞的个体之外的个体)的一种或多种特征，但在细胞的受体中没有有害的免疫反应。本公开涵盖工程化不变自然杀伤T(iNKT)细胞，其包含核酸，所述核酸包含：i)全部或部分的iNKTαT细胞受体基因；ii)全部或部分iNKTβT细胞受体基因；和iii)自杀基因，其中细胞的基因组已被改变以消除至少一种HLA-I或HLA-II分子的表面表达。
A.iNKT细胞
在特定实施方案中，本公开的工程化iNKT细胞由其他类型的细胞产生，以促进其作为iNKT细胞的活性。iNKT细胞是αβT细胞小亚群，具有几个独特的功能，使其可用于现成的细胞疗法，至少包括用于癌症疗法。非iNKT细胞由于以下iNKT细胞的优点而被工程化来充当iNKT细胞：
1)iNKT细胞具有靶向多种类型的癌症而不受肿瘤抗原和MHC限制的卓越能力(Fujii et al.，2013)。iNKT细胞识别非多态性CD1d呈递的糖脂抗原，从而使它们免受MHC限制。尽管iNKT细胞的天然配体仍有待确定，但建议iNKT细胞可识别源自许多肿瘤组织的某些保守糖脂抗原。iNKT细胞可通过识别这些由CD1d+肿瘤细胞直接呈递的糖脂抗原，或在CD1d-肿瘤的情况下由肿瘤浸润抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞或树突细胞(DC)间接交叉呈递的糖脂抗原来刺激。因此，iNKT细胞对CD1d+和CD1d-肿瘤都有反应。
2)iNKT细胞可采用多种机制攻击肿瘤细胞(Vivier et al.，2012；Fujii et al.，2013)。iNKT细胞可通过细胞毒性直接杀伤CD1d+肿瘤细胞，但其最有效的抗肿瘤活性来自其免疫佐剂效应。iNKT细胞在刺激前保持静止，但在刺激后，它们立即产生大量细胞因子，主要是IFN-γ。IFN-γ激活NK细胞杀伤MHC阴性肿瘤靶细胞。同时，iNKT细胞还激活DC，然后刺激CTL杀伤MHC阳性肿瘤靶细胞。因此，iNKT细胞诱导的抗肿瘤免疫可有效地靶向多种类型的癌症，而不受肿瘤抗原和MHC的限制，从而有效阻断肿瘤免疫逃逸并使肿瘤复发的机会最小化。
3)iNKT细胞不引起移植物抗宿主病(GvHD)。由于iNKT细胞不识别错配的MHC分子和蛋白自身抗原，预计这些细胞不会引起GvHD。这一观点得到了分析接受同种异体骨髓或外周血干细胞移植的血液癌症患者的供体来源的iNKT细胞的临床数据的有力支持。这些临床数据表明，患者中移植的同种异体iNKT细胞水平与移植物抗白血病作用正相关，与GvHD负相关(Haraguchi et al.，2004；de Lalla et al.，2011)。
4)可将iNKT细胞工程化以避免宿主抗移植物(HvG)消减。可利用像CRISPR-Cas9系统这样的强大基因编辑工具，使得遗传修饰iNKT细胞以使其可能对宿主免疫细胞靶向的消减具有抵抗力：敲除β2-微球蛋白(B2M)基因将消除iNKT细胞表达HLA-I分子，以避免宿主CD8+T细胞介导的杀伤；敲除CIITA基因将消除iNKT细胞表达HLA-II分子，以避免CD4+T细胞介导的杀伤。B2M和CIITA基因均是认可的人原代细胞中CRISPR-Cas9系统的良好靶标(Renet al.，2017；Abrahimi et al.，2015)。消除iNKT细胞表达HLA-I可使其成为宿主NK细胞的靶标。然而，iNKT细胞似乎天然抵抗同种异体NK细胞杀伤。但是，如果有必要，可通过将NK抑制基因(如HLA-E)递送至iNKT细胞来解决此问题。
5)iNKT细胞与癌症有很强的相关性。有强力证据表明iNKT细胞在小鼠肿瘤监测中的重要作用，其中iNKT细胞缺陷使它们易患癌症，而iNKT细胞的过继转移或刺激可提供抗癌保护(Vivier et al.，2012；Berzins et al.，2011)。在人类中，iNKT细胞频率在患有实体瘤(包括黑素瘤、结肠、肺、乳腺和头颈癌)和血液癌症(包括白血病、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征)的患者中降低，而增加的iNKT细胞数量与更好的预后相关(Berzins etal.，2011)。在某些情况下，尽管可能是由于用于转移的iNKT细胞数量有限以及此后这些细胞的消减，iNKT细胞的增加是短暂的并且临床益处是短期的，但是施用α-GalCer负载的DC和离体扩增的自体iNKT细胞已给患有肺癌和头颈癌的患者带来了有希望的临床益处(Fujii et al.，2012；Yamasaki et al.，2011)。因此，提出“现成”iNKT细胞产品是合理的，该产品能够以多个剂量将足够的iNKT细胞转移到患者体内，从而为患者提供了利用iNKT细胞的全部潜力与其疾病作斗争的最佳机会。
然而，同种异体的现成iNKT细胞产品的开发受到其可用性的极大阻碍—这些细胞在人类中的数量极少且变异性很高(在人类血液中约0.001-1％)，使得从同种异体的人供体的血细胞中生长治疗数量的iNKT细胞非常困难。因此，能够可靠地大量生成同源的iNKT细胞群的新方法是开发现成iNKT细胞疗法的关键。
鉴于缺乏足够数量的用于临床应用的iNKT细胞，本公开的实施方案涵盖非iNKT细胞的工程化改造，使所得到的工程化细胞充当iNKT细胞。在特定实施方案中，将充当iNKT细胞的细胞进一步修饰以具有一个或多个期望的特性。在特定实施方案中，通过转导非iNKT细胞以表达iNKT T细胞受体(TCR)，对非iNKT细胞进行遗传修饰。
B.由HSC细胞产生的iNKT细胞
在本公开的实施方案中，将由其他类型细胞产生的iNKT细胞工程化以具有一个或多个特征，以使其适合普遍应用。在具体实施方案中，细胞经遗传修饰以包含至少一个外源不变自然杀伤T细胞受体(iNKT TCR)核酸分子。在一些实施方案中，细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，细胞是造血祖细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是CD34+细胞。在一些实施方案中，细胞是人CD34+细胞。在一些实施方案中，细胞是重组细胞。在一些实施方案中，细胞是培养的株系。
在一些实施方案中，iNKT TCR核酸分子来自人不变天然杀伤T细胞。在一些实施方案中，iNKT TCR核酸分子包含获自人iNKT TCR的一个或多个核酸序列。在一些实施方案中，可从iNKT细胞的任何亚群获得iNKT TCR核酸序列，如CD4/DN/CD8亚群，或产生Th1、Th2或Th17细胞因子的亚群，并且包括双阴性iNKT细胞。在一些实施方案中，iNKT TCR核酸序列获自患有癌症如黑素瘤、肾癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、血液恶性肿瘤等的供体。在一些实施方案中，iNKT TCR核酸分子具有来自一种iNKT细胞的TCR-α序列和来自不同iNKT细胞的TCR-β序列。在一些实施方案中，从其获得TCR-α序列的iNKT细胞和从其获得TCR-β序列的iNKT细胞来自同一供体。在一些实施方案中，从其获得TCR-α序列的iNKT细胞的供体不同于从其获得TCR-β序列的iNKT细胞的供体。在一些实施方案中，TCR-α序列和/或TCR-β序列经密码子优化表达。在一些实施方案中，与由未经修饰的序列编码的多肽相比，对TCR-α序列和/或TCR-β序列进行修饰以编码具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或截短的多肽。在一些实施方案中，iNKT TCR核酸分子编码T细胞受体，其识别存在于CD1d的α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)。在一些实施方案中，iNKT TCR核酸分子包含选自以下的一个或多个序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、以及SEQ ID NO:64。在一些实施方案中，iNKT TCR核酸分子编码包含选自以下的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:62、以及SEQ ID NO:65。在一些实施方案中，工程化细胞缺乏外源致癌基因，如Oct4、Sox2、Klf、c-Myc等。
在一些实施方案中，工程化细胞是功能性iNKT细胞。在一些实施方案中，工程化细胞能够产生一种或多种细胞因子和/或趋化因子，如IFN-γ、TNF-α、TGF-α、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5、IL。-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-21、RANTES、Eotaxin、MIP-1-α、MIP-1-β等。
供体HSPC可获自供体的骨髓、外周血、羊水或脐带血。供体可以是自体供体，即待用HSPC-iNKT细胞治疗的受试者，或同种异体供体，即与待用HSPC-iNKT细胞治疗的受试者不同的供体。在供体是同种异体供体的实施方案中，同种异体供体的组织(HLA)类型优选匹配用源自供体HSPC的HSPC-iNKT细胞治疗的受试者的组织(HLA)类型。
根据本公开，用一个或多个外源iNKT TCR核酸分子转导HSPC。如本文所用，“iNKTTCR核酸分子”是编码iNKT T细胞受体的α链(TCR-α-)，iNKT T细胞受体(TCR-β)的β链或两者的核酸分子。如本文所用，“iNKT T细胞受体”是在iNKT细胞中表达并识别存在于CD1d的α-GalCer的受体。可使用本领域的方法克隆和/或重组工程化改造iNKT TCR的TCR-α和TCR-β序列。例如，iNKT细胞可获自供体，并且iNKT细胞的TCRα和β基因可如本文所述进行克隆。待克隆的iNKT TCR可获自任何哺乳动物，包括人类，非人类灵长类如猴子，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和其他啮齿动物，兔子，猫，狗，马，牛，绵羊，山羊，猪等。在一些实施方案中，待克隆的iNKT TCR是人iNKT TCR。在一些实施方案中，iNKT TCR克隆包含人iNKT TCR序列和非人iNKT TCR序列。
在一些实施方案中，克隆的TCR可具有来自一个iNKT细胞的TCR-α链和来自不同iNKT细胞的TCR-β链。在一些实施方案中，从其获得TCR-α链的iNKT细胞和从其获得TCR-β链的iNKT细胞来自同一供体。在一些实施方案中，从其获得TCR-α链的iNKT细胞的供体不同于从其获得TCR-β链的iNKT细胞的供体。在一些实施方案中，对编码TCR克隆的TCR-α链的序列和/或编码TCR-β链的序列进行修饰。在一些实施方案中，经修饰的序列可编码与未经修饰的TCR克隆相同的多肽序列，例如序列经密码子优化表达。在一些实施方案中，经修饰的序列可编码具有与未经修饰的TCR克隆不同的序列的多肽，例如，经修饰的序列编码具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或截短的多肽序列。
C.具有显像和消减特征的HLA阴性HSC-iNKT细胞
在特定实施方案中，对由HSPC细胞产生的iNKT细胞进行进一步修饰以具有一个或多个特征，包括致使该细胞适合于同种异体应用或相比未进一步修饰细胞以具有一个或多个特征的情况更适合于同种异体应用。如果需要，本公开涵盖适用于同种异体应用的UHSC-iNKT细胞。在一些实施方案中，HSC-iNKT细胞是非同种异体反应的，并表达外源iNTK TCR。这些细胞可用于“现成”细胞疗法，不需要使用患者自身iNKT或其他细胞。因此，当前的方法提供了更具成本效益，更少劳动密集的细胞免疫疗法。
在具体实施方案中，将HSC-iNKT细胞工程化改造为HLA阴性，以实现安全成功的同种异体移植，而不会引起移植物抗宿主病(GvHD)，并且不会被宿主免疫细胞排斥(HvG排斥)。在具体实施方案中，同种异体HSC-iNKT细胞不表达内源TCR且不引起GvHD，因为转基因iNKT TCR基因的表达通过等位基因排斥阻止内源TCR的重组。在特定实施方案中，同种异体UHSC-iNKT细胞在细胞表面不表达HLA-I和/或HLA-II分子，并且抵抗宿主CD8+和CD4+T细胞介导的同种异体移植物消减和sr39TK免疫原靶向性消减。
因此，在某些实施方案中，工程化iNKT细胞不表达表面HLA-I或-II分子，这是通过破坏编码与HLA-I/II表达相关的蛋白的基因实现的，所述蛋白包括但不限于β-2-微球蛋白(B2M)，主要组织相容性复合体II反式激活物(CIITA)或HLA-I/II分子。在一些情况下，HLA-I或HLA-II不表达于iNKT细胞表面，因为这些细胞通过基因编辑操纵，基因编辑可以涉及或不涉及CRISPR-Cas9。
在iNKT细胞已经修饰以显示任何一种或多种特征的情况下，iNKT细胞可包含来自引入细胞的重组载体的核酸序列。载体可以是非病毒载体如质粒，或病毒载体如慢病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒或腺病毒。
本公开的iNKT细胞在其产生之前，期间或之后可以已暴露或可以未暴露于一种或多种特定条件。在特定情况下，细胞未暴露于包含动物血清的培养基。细胞可被冷冻。细胞可存在于包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖和/或DMSO的溶液中。存在细胞的任何溶液可以是无菌、无热源且等张的溶液。细胞可通过任何合适的方式激活和扩增，例如用α-半乳糖苷神经酰胺(α-GC)激活。
本公开的方面涉及人细胞，其包含：β2微球蛋白(B2M)、CIITA、TRAC、TRBC1或TRBC2中的一种或多种的i)外源表达或活性抑制剂；或ii)基因组突变。在一些实施方案中，细胞包含基因组突变。在某些实施方案中，基因组突变包括细胞基因组中一种或多种内源基因的突变，其中一种或多种内源基因包括B2M、CIITA、TRAC、TRBC1或TRBC2基因。在一些实施方案中，突变包括功能丧失突变。在一些实施方案中，抑制剂是表达抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂包括抑制性核酸。在一些实施方案中，抑制性核酸包括siRNA、shRNA、miRNA或反义分子中的一种或多种。在一些实施方案中，细胞包含活性抑制剂。在一些实施方案中，修饰后细胞缺乏B2M、CIITA、TRAC、TRBC1或TRBC2蛋白中一种或多种的可检测表达。在一些实施方案中，细胞包含B2M的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，细胞包含CIITA的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，细胞包含TRAC的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，细胞包含TRBC1的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，细胞包含TRBC2的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，至少90％的编码B2M、CIITA、TRAC、TRBC1和/或TRBC2的基因组DNA被删除。在一些实施方案中，至少或至多5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99或100％(或其中可引出的任何范围)的编码B2M、CIITA、TRAC、TRBC1和/或TRBC2的基因组DNA被删除。在其他实施方案中，在基因组DNA中进行缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，细胞是任干细胞或祖细胞的后代。
经修饰为HLA阴性的UHSC-iNKT细胞可通过任何合适的方式进行遗传修饰。可通过本领域已知的方法引入本公开的基因突变，例如CIITA和/或B2M基因中的那些突变。在某些实施方案中，可将工程化核酸酶用于引入外源核酸序列，以对本文所提及的任何细胞进行遗传修饰。基因组编辑或使用工程核酸酶(GEEN)的基因组编辑是一种遗传工程，其中可使用人工工程化改造的核酸酶或“分子剪刀”将DNA插入、替换或从基因组移除。核酸酶在基因组中期望位置产生特定的双链断裂(DSB)，并利用细胞的内源性机制通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)的自然过程来修复诱导的断裂。非限制性工程化核酸酶包括：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas9系统、以及工程化大范围核酸酶重新工程化的归巢内切核酸酶。本领域已知的任何工程化核酸酶都可用于所述方法和组合物的某些方面。
可使用采用RNA干扰的方法来修饰工程化iNKT细胞。在遗传分析中常用的方法是，为了理解基因或蛋白功能的功能，以序列特异的方式进行干扰并监测其对生物体的影响。然而，在某些生物体中，很难或不可能进行位点特异性诱变，因此必须使用更间接的方法，例如通过短RNA干扰(siRNA)沉默目的基因。然而，siRNA对基因的破坏可能是可变且不完整的。利用如ZFN的核酸酶进行基因组编辑与siRNA的不同之处在于，工程化核酸酶能够修饰DNA结合特异性，因而原则上可切割基因组中的任何目标位置，并对由常规RNAi无法特异性靶向的基因引入内源序列的修饰。此外，ZFN和TALEN的特异性得到增强，因为需要两个ZFN识别靶标的各自部分并随后指向邻近序列。
可采用大范围核酸酶修饰工程化iNKT细胞。在微生物物种中普遍存在的大范围核酸酶具有独特的特性，即具有非常长的识别序列(>14bp)，因而使其天然具有很高的特异性。这可被用来在基因组编辑中制造位点特异性DSB；然而，挑战在于目前已知的或将来可能已知的大范围核酸酶还不够多，不足以覆盖所有可能的靶序列。为了克服这一挑战，诱变和高通量筛选方法已用于产生识别独特序列的大范围核酸酶变体。其他人已能够融合各种大范围核酸酶并产生识别新序列的杂合酶。还有人尝试用称为合理设计的大范围核酸酶的方法改变大范围核酸酶的DNA相互作用氨基酸来设计序列特异性大范围核酸酶(美国专利8,021,867，在此通过引用并入)。与诸如ZFN之类的方法相比，大范围核酸酶具有在细胞中引起较小毒性的益处，这可能是因为更严格的DNA序列识别；然而，构建所有可能序列的序列特异性酶是昂贵且耗时的，因为不能从诸如ZFN和TALEN的方法所利用的组合可能性中受益。因此，既有优点也有缺点。
与大范围核酸酶相反，ZFN和TALEN背后的概念更多地基于非特异性DNA切割酶，其随后将与特异性DNA序列识别肽如锌指和转录激活物样效应物(TALE)连接。一种方法是找到DNA识别位点和切割位点彼此分开的核酸内切酶，这种情况在限制酶中并不常见。一旦发现该酶，就可将其切割部分分离出来，这将是非常非特异性的，因为它没有识别能力。然后可将该部分与可能导致非常高特异性的识别肽序列连接。具有这种特性的限制酶的例子是FokI。另外，FokI具有要求二聚化以具有核酸酶活性的优势，这意味着特异性显著提高，因为每个核酸酶伴侣会识别独特的DNA序列。为了增强这种效果，已对FokI核酸酶进行工程化改造，使其只能以异二聚体起作用并具有增强的催化活性。异二聚体功能性核酸酶会避免不需要的同二聚体活性的可能性，从而提高DSB的特异性。
尽管ZFN和TALEN的核酸酶部分具有相似的特性，但是这些工程化核酸酶之间的差异在于它们的DNA识别肽。ZFN依赖于Cys2-His2锌指，TALEN依赖于TALE。这两种DNA识别肽域均具有天然存在于它们的蛋白组合中的特征。Cys2-His2锌指通常以3bp间隔的重复序列出现，并且在多种核酸相互作用蛋白如转录因子中以不同组合存在。另一方面，TALE存在于具有氨基酸与被识别核苷酸对之间一比一识别比率的重复序列中。由于锌指和TALE均以重复序列模式存在，因此可尝试不同组合来产生多种序列特异性。锌指已在这些术语和方法中得到了更广泛的证实，例如模块化组装(其中与三联体序列相关联的锌指连成一行以覆盖所需序列)，OPEN(低严格性选择肽域相比三联体核苷酸，之后高严格性选择肽组合相比细菌系统中的最终靶标)，以及锌杂指库的细菌单杂交筛选等方法已用于制备位点特异性核酸酶。
因此，本公开的实施方案可包括或不包括靶向内源序列以减少或敲除一个或多个某些内源序列的表达。在具体实施方案中，破坏下列一种或多种基因可阻止内源TCR的重排。为了产生向导RNA或siRNA，例如，靶向下面提到的基因，以下提供它们的序列作为示例：
Β-2微球蛋白(B2M)(又被称为IMD43)位于15q21.1，具有以下mRNA序列：
agtggaggcgtcgcgctggcgggcattcctgaagctgacagcattcgggccgagatgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggctatccagcgtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctatgtgtctgggtttcatccatccgacattgaagttgacttactgaagaatggagagagaattgaaaaagtggagcattcagacttgtctttcagcaaggactggtctttctatctcttgtactacactgaattcacccccactgaaaaagatgagtatgcctgccgtgtgaaccatgtgactttgtcacagcccaagatagttaagtggggtaagtcttacattcttttgtaagctgctgaaagttgtgtatgagtagtcatatcataaagctgctttgatataaaaaaggtctatggccatactaccctgaatgagtcccatcccatctgatataaacaatctgcatattgggattgtcagggaatgttcttaaagatcagattagtggcacctgctgagatactgatgcacagcatggtttctgaaccagtagtttccctgcagttgagcagggagcagcagcagcacttgcacaaatacatatacactcttaacacttcttacctactggcttcctctagcttttgtggcagcttcaggtatatttagcactgaacgaacatctcaagaaggtataggcctttgtttgtaagtcctgctgtcctagcatcctataatcctggacttctccagtactttctggctggattggtatctgaggctagtaggaagggcttgttcctgctgggtagctctaaacaatgtattcatgggtaggaacagcagcctattctgccagccttatttctaaccattttagacatttgttagtacatggtattttaaaagtaaaacttaatgtcttccttttttttctccactgtctttttcatagatcgagacatgtaagcagcatcatggaggtaagtttttgaccttgagaaaatgtttttgtttcactgtcctgaggactatttatagacagctctaacatgataaccctcactatgtggagaacattgacagagtaacattttagcagggaaagaagaatcctacagggtcatgttcccttctcctgtggagtggcatgaagaaggtgtatggccccaggtatggccatattactgaccctctacagagagggcaaaggaactgccagtatggtattgcaggataaaggcaggtggttacccacattacctgcaaggctttgatctttcttctgccatttccacattggacatctctgctgaggagagaaaatgaaccactcttttcctttgtataatgttgttttattcttcagacagaagagaggagttatacagctctgcagacatcccattcctgtatggggactgtgtttgcctcttagaggttcccaggccactagaggagataaagggaaacagattgttataacttgatataatgatactataatagatgtaactacaaggagctccagaagcaagagagagggaggaacttggacttctctgcatctttagttggagtccaaaggcttttcaatgaaattctactgcccagggtacattgatgctgaaaccccattcaaatctcctgttatattctagaacagggaattgatttgggagagcatcaggaaggtggatgatctgcccagtcacactgttagtaaattgtagagccaggacctgaactctaatatagtcatgtgttacttaatgacggggacatgttctgagaaatgcttacacaaacctaggtgttgtagcctactacacgcataggctacatggtatagcctattgctcctagactacaaacctgtacagcctgttactgtactgaatactgtgggcagttgtaacacaatggtaagtatttgtgtatctaaacatagaagttgcagtaaaaatatgctattttaatcttatgagaccactgtcatatatacagtccatcattgaccaaaacatcatatcagcattttttcttctaagattttgggagcaccaaagggatacactaacaggatatactctttataatgggtttggagaactgtctgcagctacttcttttaaaaaggtgatctacacagtagaaattagacaagtttggtaatgagatctgcaatccaaataaaataaattcattgctaacctttttcttttcttttcaggtttgaagatgccgcatttggattggatgaattccaaattctgcttgcttgctttttaatattgatatgcttatacacttacactttatgcacaaaatgtagggttataataatgttaacatggacatgatcttctttataattctactttgagtgctgtctccatgtttgatgtatctgagcaggttgctccacaggtagctctaggagggctggcaacttagaggtggggagcagagaattctcttatccaacatcaacatcttggtcagatttgaactcttcaatctcttgcactcaaagcttgttaagatagttaagcgtgcataagttaacttccaatttacatactctgcttagaatttgggggaaaatttagaaatataattgacaggattattggaaatttgttataatgaatgaaacattttgtcatataagattcatatttacttcttatacatttgataaagtaaggcatggttgtggttaatctggtttatttttgttccacaagttaaataaatcataaaacttga(SEQ ID NO:66)
人II类主要组织相容性复合体反式激活物(CIITA)基因位于16p13.13，其mRNA序列为：
ggttagtgatgaggctagtgatgaggctgtgtgcttctgagctgggcatccgaaggcatccttggggaagctgagggcacgaggaggggctgccagactccgggagctgctgcctggctgggattcctacacaatgcgttgcctggctccacgccctgctgggtcctacctgtcagagccccaaggcagctcacagtgtgccaccatggagttggggcccctagaaggtggctacctggagcttcttaacagcgatgctgaccccctgtgcctctaccacttctatgaccagatggacctggctggagaagaagagattgagctctactcagaacccgacacagacaccatcaactgcgaccagttcagcaggctgttgtgtgacatggaaggtgatgaagagaccagggaggcttatgccaatatcgcggaactggaccagtatgtcttccaggactcccagctggagggcctgagcaaggacattttcaagcacataggaccagatgaagtgatcggtgagagtatggagatgccagcagaagttgggcagaaaagtcagaaaagacccttcccagaggagcttccggcagacctgaagcactggaagccagctgagccccccactgtggtgactggcagtctcctagtgggaccagtgagcgactgctccaccctgccctgcctgccactgcctgcgctgttcaaccaggagccagcctccggccagatgcgcctggagaaaaccgaccagattcccatgcctttctccagttcctcgttgagctgcctgaatctccctgagggacccatccagtttgtccccaccatctccactctgccccatgggctctggcaaatctctgaggctggaacaggggtctccagtatattcatctaccatggtgaggtgccccaggccagccaagtaccccctcccagtggattcactgtccacggcctcccaacatctccagaccggccaggctccaccagccccttcgctccatcagccactgacctgcccagcatgcctgaacctgccctgacctcccgagcaaacatgacagagcacaagacgtcccccacccaatgcccggcagctggagaggtctccaacaagcttccaaaatggcctgagccggtggagcagttctaccgctcactgcaggacacgtatggtgccgagcccgcaggcccggatggcatcctagtggaggtggatctggtgcaggccaggctggagaggagcagcagcaagagcctggagcgggaactggccaccccggactgggcagaacggcagctggcccaaggaggcctggctgaggtgctgttggctgccaaggagcaccggcggccgcgtgagacacgagtgattgctgtgctgggcaaagctggtcagggcaagagctattgggctggggcagtgagccgggcctgggcttgtggccggcttccccagtacgactttgtcttctctgtcccctgccattgcttgaaccgtccgggggatgcctatggcctgcaggatctgctcttctccctgggcccacagccactcgtggcggccgatgaggttttcagccacatcttgaagagacctgaccgcgttctgctcatcctagacggcttcgaggagctggaagcgcaagatggcttcctgcacagcacgtgcggaccggcaccggcggagccctgctccctccgggggctgctggccggccttttccagaagaagctgctccgaggttgcaccctcctcctcacagcccggccccggggccgcctggtccagagcctgagcaaggccgacgccctatttgagctgtccggcttctccatggagcaggcccaggcatacgtgatgcgctactttgagagctcagggatgacagagcaccaagacagagccctgacgctcctccgggaccggccacttcttctcagtcacagccacagccctactttgtgccgggcagtgtgccagctctcagaggccctgctggagcttggggaggacgccaagctgccctccacgctcacgggactctatgtcggcctgctgggccgtgcagccctcgacagcccccccggggccctggcagagctggccaagctggcctgggagctgggccgcagacatcaaagtaccctacaggaggaccagttcccatccgcagacgtgaggacctgggcgatggccaaaggcttagtccaacacccaccgcgggccgcagagtccgagctggccttccccagcttcctcctgcaatgcttcctgggggccctgtggctggctctgagtggcgaaatcaaggacaaggagctcccgcagtacctagcattgaccccaaggaagaagaggccctatgacaactggctggagggcgtgccacgctttctggctgggctgatcttccagcctcccgcccgctgcctgggagccctactcgggccatcggcggctgcctcggtggacaggaagcagaaggtgcttgcgaggtacctgaagcggctgcagccggggacactgcgggcgcggcagctgctggagctgctgcactgcgcccacgaggccgaggaggctggaatttggcagcacgtggtacaggagctccccggccgcctctcttttctgggcacccgcctcacgcctcctgatgcacatgtactgggcaaggccttggaggcggcgggccaagacttctccctggacctccgcagcactggcatttgcccctctggattggggagcctcgtgggactcagctgtgtcacccgtttcagggctgccttgagcgacacggtggcgctgtgggagtccctgcagcagcatggggagaccaagctacttcaggcagcagaggagaagttcaccatcgagcctttcaaagccaagtccctgaaggatgtggaagacctgggaaagcttgtgcagactcagaggacgagaagttcctcggaagacacagctggggagctccctgctgttcgggacctaaagaaactggagtttgcgctgggccctgtctcaggcccccaggctttccccaaactggtgcggatcctcacggccttttcctccctgcagcatctggacctggatgcgctgagtgagaacaagatcggggacgagggtgtctcgcagctctcagccaccttcccccagctgaagtccttggaaaccctcaatctgtcccagaacaacatcactgacctgggtgcctacaaactcgccgaggccctgccttcgctcgctgcatccctgctcaggctaagcttgtacaataactgcatctgcgacgtgggagccgagagcttggctcgtgtgcttccggacatggtgtccctccgggtgatggacgtccagtacaacaagttcacggctgccggggcccagcagctcgctgccagccttcggaggtgtcctcatgtggagacgctggcgatgtggacgcccaccatcccattcagtgtccaggaacacctgcaacaacaggattcacggatcagcctgagatgatcccagctgtgctctggacaggcatgttctctgaggacactaaccacgctggaccttgaactgggtacttgtggacacagctcttctccaggctgtatcccatgagcctcagcatcctggcacccggcccctgctggttcagggttggcccctgcccggctgcggaatgaaccacatcttgctctgctgacagacacaggcccggctccaggctcctttagcgcccagttgggtggatgcctggtggcagctgcggtccacccaggagccccgaggccttctctgaaggacattgcggacagccacggccaggccagagggagtgacagaggcagccccattctgcctgcccaggcccctgccaccctggggagaaagtacttctttttttttatttttagacagagtctcactgttgcccaggctggcgtgcagtggtgcgatctgggttcactgcaacctccgcctcttgggttcaagcgattcttctgcttcagcctcccgagtagctgggactacaggcacccaccatcatgtctggctaatttttcatttttagtagagacagggttttgccatgttggccaggctggtctcaaactcttgacctcaggtgatccacccacctcagcctcccaaagtgctgggattacaagcgtgagccactgcaccgggccacagagaaagtacttctccaccctgctctccgaccagacaccttgacagggcacaccgggcactcagaagacactgatgggcaacccccagcctgctaattccccagattgcaacaggctgggcttcagtggcagctgcttttgtctatgggactcaatgcactgacattgttggccaaagccaaagctaggcctggccagatgcaccagcccttagcagggaaacagctaatgggacactaatggggcggtgagaggggaacagactggaagcacagcttcatttcctgtgtcttttttcactacattataaatgtctctttaatgtcacaggcaggtccagggtttgagttcataccctgttaccattttggggtacccactgctctggttatctaatatgtaacaagccaccccaaatcatagtggcttaaaacaacactcacattta(SEQ ID NO:67)
人T细胞受体α链(TRAC)mRNA序列如下：
ttttgaaacccttcaaaggcagagacttgtccagcctaacctgcctgctgctcctagctcctgaggctcagggcccttggcttctgtccgctctgctcagggccctccagcgtggccactgctcagccatgctcctgctgctcgtcccagtgctcgaggtgatttttaccctgggaggaaccagagcccagtcggtgacccagcttggcagccacgtctctgtctctgaaggagccctggttctgctgaggtgcaactactcatcgtctgttccaccatatctcttctggtatgtgcaataccccaaccaaggactccagcttctcctgaagtacacatcagcggccaccctggttaaaggcatcaacggttttgaggctgaatttaagaagagtgaaacctccttccacctgacgaaaccctcagcccatatgagcgacgcggctgagtacttctgtgctgtgagtgatctcgaaccgaacagcagtgcttccaagataatctttggatcagggaccagactcagcatccggccaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagctgagatctgcaagattgtaagacagcctgtgctccctcgctccttcctctgcattgcccctcttctccctctccaaacagagggaactctcctacccccaaggaggtgaaagctgctaccacctctgtgcccccccggtaatgccaccaactggatcctacccgaatttatgattaagattgctgaagagctgccaaacactgctgccaccccctctgttcccttattgctgcttgtcactgcctgacattcacggcagaggcaaggctgctgcagcctcccctggctgtgcacattccctcctgctccccagagactgcctccgccatcccacagatgatggatcttcagtgggttctcttgggctctaggtcctggagaatgttgtgaggggtttatttttttttaatagtgttcataaagaaatacatagtattcttcttctcaagacgtggggggaaattatctcattatcgaggccctgctatgctgtgtgtctgggcgtgttgtatgtcctgctgccgatgccttcattaaaatgatttggaa(SEQID NO:72).
人T细胞受体β链(TRBC1)mRNA序列如下：
tgcatcctagggacagcatagaaaggaggggcaaagtggagagagagcaacagacactgggatggtgaccccaaaacaatgagggcctagaatgacatagttgtgcttcattacggcccattcccagggctctctctcacacacacagagcccctaccagaaccagacagctctcagagcaaccctggctccaacccctcttccctttccagaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcaggtgagtggggcctggggagatgcctggaggagattaggtgagaccagctaccagggaaaatggaaagatccaggtagcagacaagactagatccaaaaagaaaggaaccagcgcacaccatgaaggagaattgggcacctgtggttcattcttctcccagattctcagcccaacagagccaagcagctgggtcccctttctatgtggcctgtgtaactctcatctgggtggtgccccccatccccctcagtgctgccacatgccatggattgcaaggacaatgtggctgacatctgcatggcagaagaaaggaggtgctgggctgtcagaggaagctggtctgggcctgggagtctgtgccaactgcaaatctgactttacttttaattgcctatgaaaataaggtctctcatttattttcctctccctgctttctttcagactgtggctttacctcgggtaagtaagcccttccttttcctctccctctctcatggttcttgacctagaaccaaggcatgaagaactcacagacactggagggtggagggtgggagagaccagagctacctgtgcacaggtacccacctgtccttcctccgtgccaacagtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtaagcaggagggcaggatggggccagcaggctggaggtgacacactgacaccaagcacccagaagtatagagtccctgccaggattggagctgggcagtagggagggaagagatttcattcaggtgcctcagaagataacttgcacctctgtaggatcacagtggaagggtcatgctgggaaggagaagctggagtcaccagaaaacccaatggatgttgtgatgagccttactatttgtgtggtcaatgggccctactactttctctcaatcctcacaactcctggctcttaataacccccaaaactttctcttctgcaggtcaagagaaaggatttctgaaggcagccctggaagtggagttaggagcttctaacccgtcatggtttcaatacacattcttcttttgccagcgcttctgaagagctgctctcacctctctgcatcccaatagatatccccctatgtgcatgcacacctgcacactcacggctgaaatctccctaacccagggggaccttagcatgcctaagtgactaaaccaataaaaatgttctggtctggcctgactctgacttgtgaatgtctggatagctccttggctgtctctgaactccctgtgactctccccattcagtcaggatagaaacaagaggtattcaaggaaaatgcagactcttcacgtaagagggatgaggggcccaccttgagatcaatagcag(SEQID NO:73).
人TRBC2 T细胞受体β恒定2(TCRB2)序列如下：
atggcgtagtccccaaagaacgaggacctagtaacataattgtgcttcattatggtcctttcccggccttctctctcacacatacacagagcccctaccaggaccagacagctctcagagcaaccctagccccattacctcttccctttccagaggacctgaaaaacgtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacagacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacctgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcaggtgagtggggcctggggagatgcctggaggagattaggtgagaccagctaccagggaaaatggaaagatccaggtagcggacaagactagatccagaagaaagccagagtggacaaggtgggatgatcaaggttcacagggtcagcaaagcacggtgtgcacttcccccaccaagaagcatagaggctgaatggagcacctcaagctcattcttccttcagatcctgacaccttagagctaagctttcaagtctccctgaggaccagccatacagctcagcatctgagtggtgtgcatcccattctcttctggggtcctggtttcctaagatcatagtgaccacttcgctggcactggagcagcatgagggagacagaaccagggctatcaaaggaggctgactttgtactatctgatatgcatgtgtttgtggcctgtgagtctgtgatgtaaggctcaatgtccttacaaagcagcattctctcatccatttttcttcccctgttttctttcagactgtggcttcacctccggtaagtgagtctctcctttttctctctatctttcgccgtctctgctctcgaaccagggcatggagaatccacggacacaggggcgtgagggaggccagagccacctgtgcacaggtacctacatgctctgttcttgtcaacagagtcttaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcttgctagggaaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccctcgtgctgatggccatggtaaggaggagggtgggatagggcagatgatgggggcaggggatggaacatcacacatgggcataaaggaatctcagagccagagcacagcctaatatatcctatcacctcaatgaaaccataatgaagccagactggggagaaaatgcagggaatatcacagaatgcatcatgggaggatggagacaaccagcgagccctactcaaattaggcctcagagcccgcctcccctgccctactcctgctgtgccatagcccctgaaaccctgaaaatgttctctcttccacaggtcaagagaaaggattccagaggctagctccaaaaccatcccaggtcattcttcatcctcacccaggattctcctgtacctgctcccaatctgtgttcctaaaagtgattctcactctgcttctcatctcctacttacatgaatacttctctcttttttctgtttccctgaagattgagctcccaacccccaagtacgaaataggctaaaccaataaaaaattgtgtgttgggcctggttgcatttcaggagtgtctgtggagttctgctcatcactgacctatcttctgatttagggaaagcagcattcgcttggacatctgaagtgacagccctctttctctccacccaatgctgctttctcctgttcatcctgatggaagtctcaacaca(SEQ ID NO:74).
在某些实施方案中考虑本领域已知的抑制性核酸或抑制CIITA和/或B2M基因表达的任何方式。抑制性核酸的实例包括但不限于siRNA(小干扰RNA)、短发夹RNA(shRNA)、双链RNA、反义寡核苷酸、核酶及其编码核酸。抑制性核酸可抑制细胞中基因的转录或阻止基因转录本的翻译。抑制性核酸可以为16至1000个核苷酸长，并且在某些实施方案中为18至100个核苷酸长。核酸可具有至少或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、50、60、70、80、90(或从中引出的任何范围)个核苷酸。天然存在于活体动物中的siRNA未被“分离”，但是合成siRNA或者从其自然状态的共存物质部分或完全分离的siRNA是“分离的”。分离的siRNA可以基本上纯化的形式存在，或可存在于非天然环境，例如递送siRNA至其中的细胞中。
抑制性核酸是本领域众所周知的。例如，siRNA和双链RNA已描述于美国专利6,506,559和6,573,099以及美国专利公开2003/0051263、2003/0055020、2004/0265839、2002/0168707、2003/0159161和2004/0064842，其全部通过引用整体并入本文。
特别地，抑制性核酸可能能够降低蛋白或mRNA的表达至少10％、20％、30％或40％，更特别地至少50％、60％或70％，最特别地至少75％、80％、90％、95％或更多，或前述之间的任何范围或值。
在进一步的实施方案中，存在作为蛋白抑制剂的合成核酸。抑制剂可能为17至25个核苷酸长，并包含与成熟mRNA的5'至3'序列至少90％互补的5'至3'序列。在某些实施方案中，抑制剂分子为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸长，或其中可引出的任何范围。此外，抑制剂分子的序列(5'至3')与成熟mRNA(特别是成熟的天然存在的mRNA，例如B2M、CIITA、TRAC、TRBC1或TRBC2的mRNA)的5'至3'序列为或为至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.8、99.9或100％互补，或其中可引出的任何范围。本领域技术人员可使用与成熟mRNA的序列互补的探针序列的一部分作为mRNA抑制剂的序列。此外，探针序列的该部分可被改变，使它仍然与成熟mRNA序列90％互补。
在工程化iNKT细胞包含一个或多个自杀基因以便在需要时随后消减的情况下，自杀基因可以是任何合适的种类。本公开的iNKT细胞可表达例如可基于酶的自杀基因产物。自杀基因产物的实例包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、羧肽酶G2、细胞色素P450、亚麻苦苷酶、β-内酰胺酶、硝基还原酶(NTR)、羧肽酶A、或诱导型半胱天冬酶9。因此，在特定情况下，自杀基因可编码胸苷激酶(TK)。在特定情况下，TK基因是病毒TK基因，例如单纯疱疹病毒TK基因。在特定实施方案中，自杀基因产物被诸如更昔洛韦、喷昔洛韦或其衍生物的底物激活。
在具体实施方案中，自杀基因是sr39TK，并且相应序列的实例如下：
sr39TK cDNA序列(密码子优化的)：
atgcctacactgctgcgggtgtacatcgatggccctcacggcatgggcaagaccacaaccacacagctgctggtggccctgggcagcagggacgatatcgtgtacgtgccagagcccatgacatattggcgcgtgctgggagcatccgagacaatcgccaacatctacaccacacagcacagactggatcagggagagatctccgccggcgacgcagcagtggtcatgaccagcgcccagatcacaatgggcatgccatatgcagtgaccgacgccgtgctggcacctcacatcggaggagaggcaggctctagccacgcaccaccccctgccctgacaatctttctggatcggcaccctatcgccttcatgctgtgctacccagccgccagatatctgatgggcagcatgaccccacaggccgtgctggccttcgtggccctgatcccacccaccctgccaggaacaaatatcgtgctgggcgccctgccagaggacaggcacatcgatagactggccaagaggcagcgccccggagagcggctggacctggcaatgctggcagcaatcaggagagtgtacggcctgctggccaacaccgtgcggtatctgcagtgtggaggctcctggagagaggactggggacagctgtctggaacagcagtgcctccacagggagcagagccacagtccaatgcaggacctaggccacacatcggcgataccctgttcacactgtttcgcgcaccagagctgctggcacctaacggcgatctgtacaacgtgttcgcatgggcactggacgtgctggcaaagcggctgagatctatgcacgtgttcatcctggactacgaccagagcccagccggctgtagagatgccctgctgcagctgacaagcggcatggtgcagacccacgtgaccacacccggctctattccaacaatctgcgacctggctaggacctttgcaagagaaatgggcgaagctaactga(SEQ ID NO:70)
sr39TK氨基酸序列：
MPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTIFLDRHPIAFMLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQCGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRSMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN(SEQ ID NO:71)
在一些实施方案中，工程化iNKT细胞能够被显像或以其他方式检测。在特定情况下，细胞包含编码具有可被标记显像的底物的多肽的外源核酸，并且显像可以是荧光、放射性、比色等。在特定情况下，可通过正电子发射断层摄影术检测细胞。至少在某些情况下，细胞表达sr39TK基因，其为正电子发射断层扫描(PET)报告基因/胸苷激酶基因，允许利用PET显像追踪这些经遗传修饰的细胞，并通过sr39TK自杀基因功能消除这些细胞。
本公开涵盖工程化iNKT细胞群。在特定方面，iNKT克隆细胞包含编码iNKT T细胞受体(T细胞受体)且缺乏一种或多种HLA-I或HLA-II分子表面表达的外源核酸。iNKT细胞可包含编码自杀基因的外源核酸，所述自杀基因包括基于酶的自杀基因，如胸苷激酶(TK)。TK基因可以是病毒TK基因，如单纯疱疹病毒TK基因。在群体的细胞中，自杀基因可被底物如更昔洛韦、喷昔洛韦或其衍生物激活。细胞可包含编码具有可被标记显像的底物的多肽的外源核酸，并且在某些情况下，自杀基因产物是具有可被标记显像的底物的多肽。在特定方面，自杀基因是sr39TK。
在iNKT细胞群的某些实施方案中，由于编码β-2-微球蛋白(B2M)、主要组织相容性复合体II类反式激活物(CIITA)和/或HLA-I或HLA-II分子的基因表达被破坏，iNKT细胞不表达表面HLA-I或-II分子。在特定情况下，HLA-I或HLA-II分子不表达于iNKT细胞的细胞表面，因为这些细胞通过基因编辑操纵。基因编辑可能涉及或不涉及CRISPR-Cas9。
在iNKT细胞群的特定情况下，iNKT细胞包含来自引入细胞中的重组载体的核酸序列，例如病毒载体，至少包括慢病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒或腺病毒。
在某些实施方案中，iNKT细胞群的细胞可能已暴露于或未暴露于或者暴露于一种或多种特定条件。在某些情况下，例如，群体中的细胞未暴露或未被暴露于包含动物血清的培养基。群体中的细胞可能被冷冻或未被冷冻。在某些情况下，群体中的细胞在包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖和/或DMSO的溶液中。该溶液可包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖和DMSO。细胞可在无菌、无热源且等张的溶液中。在特定情况下，iNKT细胞已被激活，例如用α-半乳糖神经酰胺(α-GC)激活。在特定方面，细胞群包含至少约102至106个克隆细胞。在某些情况下，细胞群可包含至少约106至1012个总细胞。
在特定实施方案中，存在不变自然杀伤T(iNKT)细胞群，其包括：克隆iNKT细胞，其包含编码iNKT T细胞受体(T细胞受体)和胸苷激酶自杀的一种或多种外源核酸，其中克隆iNKT细胞已被工程化改造为不表达功能性β-2-微球蛋白(B2M)、主要组织相容性复合体II类反式激活物(CIITA)和/或HLA-I和HLA-II分子，并且其中细胞数量为至少约106至1012个总细胞且包含至少约102至106个克隆细胞。在某些情况下，细胞被冷冻于溶液中。
III.细胞的配制和培养
在特定实施方案中，可对UHSC-iNKT细胞和/或其前体进行特别配制和/或可在产生UHSC-iNKT细胞过程的任何阶段在特定培养基中培养它们(无论它们是否存在于体外ATO培养系统中)。细胞可以以使得适合于递送至接受体而无有害作用的方式配制。
在某些方面，培养基可使用用于培养动物细胞的培养基作为其基础培养基来制备，例如AIM V、X-VIVO-15、NeuroBasal、EGM2、TeSR、BME、BGJb、CMRL 1066、Glasgow MEM、改良型MEM Zinc Option、IMDM、Medium 199、Eagle MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI-1640和Fischer培养基中的任一种以及它们的任何组合，但是培养基可能不特别受限制，只要它可用于培养动物细胞即可。特别地，培养基可以是无异物或化学成分明确的。
培养基可以是含血清或无血清的培养基，或无异物培养基。从防止异质动物来源的成分污染的角度来看，血清可源自干细胞来源的同一动物。无血清培养基是指没有未经处理或未经纯化的血清的培养基，因此可包括具有纯化的血液衍生成分或动物组织衍生成分(如生长因子)的培养基。
培养基可以包含或可以不包含血清的任何替代物。血清替代物可包括适当含有白蛋白的物质(例如富含脂质的白蛋白、牛白蛋白、白蛋白替代品如重组白蛋白或人源化白蛋白、植物淀粉、葡聚糖和蛋白水解物)，转铁蛋白(或其他铁转运蛋白)，脂肪酸，胰岛素，胶原蛋白前体，微量元素，2-巯基乙醇，3'-巯基甘油、或其等同物。血清替代物可通过例如国际公开号98/30679(其整体并入本文)公开的方法制备。可选择地，可使用任何可商购的材料以更方便。可商购的材料包括敲除血清替代品(knockout Serum Replacement,KSR)，化学成分确定的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)(Gibco)和Glutamax(Gibco)。
在进一步的实施方案中，培养基可以是适合用于细胞发育的无血清培养基。例如，培养基可包含以用于从3D细胞聚集体中产生T细胞的有效浓度的
Figure BDA0002916540480000381
补充剂，无异物
Figure BDA0002916540480000382
补充剂(可在以下网址获得：thermofisher.com/us/en/home/technical-resources/media-formulation.250.html)，NS21补充剂(Chen et al.,J NeurosciMethods,2008Jun 30；171(2):239-247,以整体并入本文)，GS21TM补充剂(可在万维网amsbio.com/B-27.aspx获得)，或它们的组合。
在某些实施方案中，培养基可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种下列成分：维生素，如生物素；DLα-生育酚乙酸酯；DLα-生育酚；维生素A(醋酸盐)；蛋白质，例如BSA(牛血清白蛋白)或人白蛋白，无脂肪酸级份V(fatty acidfree Fraction V)；过氧化氢酶；人重组胰岛素；人转铁蛋白；超氧化物歧化酶；其他成分，例如皮质酮；D-半乳糖；乙醇胺HCl；谷胱甘肽(还原)；L-肉碱HCl；亚油酸；亚麻酸；孕酮；腐胺2HCl；亚硒酸钠；和/或T3(三碘甲状腺原氨酸)。
在一些实施方案中，培养基还包含维生素。在一些实施方案中，培养基包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种(以及其中可引出的任何范围)下列成分：生物素、DLα-生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、肌醇、维生素B12、或者培养基包含它们的组合物或它们的盐。在一些实施方案中，培养基包含以下或基本由以下组成：生物素、DLα-生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、胆碱氯化物、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、肌醇和维生素B12。在一些实施方案中，维生素包括以下或基本由以下组成：生物素、DLα-生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A或其组合或盐。在一些实施方案中，培养基进一步包含蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质包括白蛋白或牛血清白蛋白、BSA级份、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶、或其组合。在一些实施方案中，培养基还包含以下一种或多种：皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、或三碘甲状腺原氨酸、或其组合。在一些实施方案中，培养基包含以下一种或多种：
Figure BDA0002916540480000391
补充剂、无异物
Figure BDA0002916540480000392
补充剂、GS21TM补充剂或其组合。在一些实施方案中，培养基包含或进一步包含氨基酸、单糖、无机离子。在一些实施方案中，氨基酸包括精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、或缬氨酸、或其组合。在一些实施方案中、无机离子包括钠、钾、钙、镁、氮、或磷、或其组合或盐。在一些实施方案中，培养基还包含以下一种或多种：钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰、或其组合。在某些实施方案中，培养基包含本文讨论的一种或多种维生素和/或本文讨论的一种或多种蛋白质和/或以下一种或多种或者基本上由本文讨论的一种或多种维生素和/或本文讨论的一种或多种蛋白质和/或以下一种或多种组成：皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘甲状腺原氨酸、
Figure BDA0002916540480000393
补充剂、无异物
Figure BDA0002916540480000394
补充剂、GS21TM补充剂、氨基酸(例如精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸)、单糖、无机离子(如钠、钾、钙、镁、氮和/或磷)或其盐、和/或钼、钒、铁、锌、硒、铜、或锰。
在进一步的实施方案中，培养基可包含外部添加的抗坏血酸。培养基还可包含一种或多种外部添加的脂肪酸或脂质、氨基酸(如，非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、和/或无机盐。
一种或多种培养基组分可以以至少、至多或大约0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、180、200、250ng/L，ng/ml，μg/ml，mg/ml或其中引出的任何范围的浓度添加。
所使用的培养基可补充有至少一种外部添加的细胞因子，其浓度为约0.1ng/mL至约500ng/mL，更特别地为1ng/mL至100ng/mL，或至少、至多、或大约0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90，95、100、150、180、200、250ng/L，ng/ml，μg/ml，mg/ml或其中可引出的任何范围。合适的细胞因子包括但不限于FLT3配体(FLT3L)、白介素7(IL-7)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-21、TNF-α、TGF-β、干扰素-γ、干扰素-λ、TSLP、胸腺五肽、pleotrophin和/或中期因子。特别地，培养基可包含FLT3L和IL-7中的至少一种。更特别地，培养基可包含FLT3L和IL-7二者。
其他培养条件可适当地确定。例如，培养温度可为约20至40℃，例如至少、至多、或大约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32，33、34、35、36、37、38、39、40℃(或其中可引出的任何范围)，但是温度可能高于或低于这些值。CO2浓度可为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％(或其中可引出的任何范围)，例如约2％至10％，例如约2％至5％，或其中可引出的任何范围。氧含量可为至少或大约1、5、8、10、20％，或其中可引出的任何范围。
在特定实施方案中，同种异体HSC工程化HLA阴性iNKT细胞是特别配制的。它们可以配制成或不配制成细胞悬液。在特定情况下，它们以单次剂量形式配制。它们可配置为全身或局部施用。在某些情况下，在使用前将细胞配制保存，并且细胞配制剂可包含一种或多种冷冻保存剂，如DMSO(如在5％DMSO中)。细胞配制剂可包含白蛋白，包括人白蛋白，其中特定配制剂包含2.5％人白蛋白。可将细胞专门配制用于静脉内施用；例如，它们被配制用于少于1小时内的静脉内施用。在特定实施方案中，细胞在配制的细胞悬液中，其从解冻时间开始在室温下稳定1、2、3或4小时或更长时间。
在一些实施方案中，该方法还包括引发T细胞。在一些实施方案中，T细胞用抗原呈递细胞引发。在一些实施方案中，抗原呈递细胞呈递肿瘤抗原。
在特定实施方案中，UHSC-iNKT细胞的外源TCR可具有任何确定的抗原特异性。在一些实施方案中，它可基于对意图接受者的缺乏或降低的同种异体反应性进行选择(实例包括某些病毒特异性TCR，异物特异性TCR、或睾丸癌抗原特异性TCR)。在外源TCR是非同种异体反应的示例中，T细胞分化期间，外源TCR通过被称为等位基因排斥的发育过程抑制内源TCR基因座的重排和/或表达，产生仅表达非同种异体反应的外源TCR的T细胞，因而是非同种异体反应的。在一些实施方案中，不一定基于同种异体反应的缺乏来限定外源TCR的选择。在一些实施方案中，内源TCR基因已通过基因组编辑修饰，使它们不表达蛋白。基因编辑的方法，例如使用CRISPR/Cas9系统的方法，是本领域已知的且描述于本文中。
在一些实施方案中，分离的UHSC-iNKT细胞或其群体包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。CAR可以针对的肿瘤细胞抗原的实例至少包括，例如5T4、8H9、αvβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、EPCAM、EphA2、EpCAM、叶酸受体-a、FAP、FBP、胎儿AchR、FR、GD2、G250/CAIX、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)、Her2、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、KDR、MAGE、MCSP、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSC1、PSCA、PSMA、ROR1、SP17、存活蛋白、TAG72、TEM、癌胚抗原、HMW-MAA、AFP、CA-125、ETA、酪氨酸酶、MAGE、层粘连蛋白受体、HPV E6、E7、BING-4、钙激活氯通道2、细胞周期蛋白-B1、9D7、EphA3、端粒酶、SAP-1、BAGE家族、CAGE家族、GAGE家族、MAGE家族、SAGE家族、XAGE家族、NY-ESO-1/LAGE-1、PAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、GP100/pmel17、TRP-1/-2、P.多肽(P.polypeptide)、MC1R、前列腺特异性抗原、β-连环蛋白、BRCA1/2、CML66、纤连蛋白、MART-2、TGF-βRII、或VEGF受体(如VEGFR2)。CAR可以是第一、第二、第三代以上的CAR。CAR可以对任何两种不同抗原具有双特异性，或者它可以对超过两种的不同抗原具有特异性。
IV.其他修饰和多肽实施方案
另外，可对本公开的多肽进行化学修饰。多肽的糖基化可通过例如修饰多肽序列内的一个或多个糖基化位点以增加多肽对抗原的亲和力来改变(美国专利号5,714,350和6,350,861)。
涵盖本公开的多肽的区域或片段或者本公开的编码多肽的核酸，所述多肽可具有氨基酸序列，该氨基酸序列对于SEQ ID NO:20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65或71中的任何一个或者对于SEQ ID NO:1-19、21、22、24、25、27、28、30、31、33、34、36、37、39，40、42、43、45、46、48、49、51、52、54、55、57、58、60、61、63、64、66-70或72-74中的任何一个编码的多肽具有、具有至少或具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、17 7、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、199、200或更多个氨基酸取代、连续氨基酸添加或连续氨基酸缺失。
可选择地，本公开的多肽的区域或片段可具有包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成的氨基酸序列，其与SEQ ID NO:20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65或71中的任何一个或由SEQ ID NO:1-19、21、22、24、25、27、28、30、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、48、49、51、52、54、55、57、58、60、61、63、64、66-70或72-74中的任何一个编码的多肽为、为至少或为至多50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％(或其中引出的任何范围)相同。此外、在一些实施方案中、区域或片段包含起始于SEQ ID NO:20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62,65或71中的任何一个或者由SEQ ID NO:1-19、21、22、24、25、27、28、30、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、48、49、51、52、54、55、57、58、60、61、63、64、66-70或72-74中的任何一个编码的多肽的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337 338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500处的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、2 07、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331 332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、490、491、492、493、494、495、496、496、497、498、499、500或更多个连续氨基酸的氨基酸区域。(其中位置1位于SEQ ID NO的N末端或由SEQ ID NO编码的多肽的N末端)。本公开的多肽可包含SEQ ID NOS:20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65或71中的任何一个或由SEQ ID NO:1-19、21、22、24、25、27、28、30、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、48、49、51、52、54、55、57、58、60、61、63、64、66-70或72-74中的任何一个编码的多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50或更多个变体氨基酸或核酸取代，或者与SEQID NOS:20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65或71中的任何一个或由SEQID NO:1-19、21、22、24、25、27、28、30、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、48、49、51、52、54、55、57、58、60、61、63、64、66-70或72-74中的任何一个编码的多肽至少或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000、1500或2000或更多个连续氨基酸或核酸或其中引出的任何范围至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相似，相同，或同源。
本公开的多肽可包括至少，至多或正好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615个取代(或其中引出的任何范围)。
取代可位于SEQ ID NOS:20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65或71中的任何一个或者由SEQ ID NOS:1-19、21、22、24、25、27、28、30、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、48、49、51、52、54、55、57、58、60、61、63、64、66-70或72-74中的任何一个编码的多肽的氨基酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、650、700、750、800、850、900、1000、1500或2000(或其中可引出的任何范围)。
本文所述的多肽可具有固定长度，其至少，至多或正好是SEQ ID NO:20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65或71或者由SEQ ID NO:1-19、21、22、24、25、27、28、30、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、48、49、51、52、54、55、57、58、60、61、63、64、66-70或72-74中任一个编码的多肽的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000或更多个氨基酸(或其中可引出的任何范围)。
取代变体通常在蛋白内的一个或多个位置包含一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，并且可被设计为调节多肽的一个或多个特性，有或没有其他功能或特性的损失。取代可以是保守的，即一种氨基酸被相似形状和电荷的氨基酸取代。保守取代在本领域中是众所周知的，并且包括例如以下改变：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；谷氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。可选择地，取代可以是非保守的，从而影响多肽的功能或活性。非保守变化通常涉及用化学上不同的氨基酸来取代残基，例如极性或带电荷的氨基酸取代非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。
蛋白质可以是重组的或在体外合成。可选择地，可从细菌中分离非重组或重组的蛋白。还预期可在组合物和方法中实施含有此类变体的细菌。因此，蛋白无需分离。
术语“功能上等同的密码子”在本文中用于指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的六个密码子，并且还指编码生物学上等同的氨基酸的密码子。
还应当理解的是，氨基酸和核酸序列可包括另外的残基，例如分别为另外的N-或C-末端氨基酸，或者5'或3'序列，并且实质上仍然如本文所公开的序列之一所述，只要序列满足上述标准，包括在涉及蛋白质表达的情况下维持生物蛋白活性。末端序列的添加特别适用于核酸序列，其可以例如包括位于编码区的5'或3'部分侧翼的各种非编码序列。
以下是基于改变蛋白质的氨基酸以产生等同，或甚至改进的第二代分子的讨论。例如，某些氨基酸可取代蛋白质结构中的其他氨基酸而不会明显损失相互作用结合能力。例如，如酶催化域或相互作用组分的结构可具有维持这种功能的氨基酸取代。由于决定蛋白质的生物学功能活性的是蛋白质的相互作用能力和性质，因而可在蛋白质序列及其潜在的DNA编码序列中进行某些氨基酸取代，从而产生具有类似特性的蛋白质。因此，发明人预期可对基因的DNA序列进行各种改变而不明显损失其生物学效用或活性。
在其他实施方案中，通过引入一个或多个取代意图改变多肽的功能。例如，某些氨基酸可取代蛋白质结构中的其他氨基酸，目的是改变相互作用组分的相互作用结合能力。例如，如蛋白质相互作用域、核酸相互作用域和催化位点的结构可具有改变这种功能的氨基酸取代。由于决定蛋白质的生物学功能活性的是蛋白质的相互作用能力和性质，因而可在蛋白质序列及其潜在的DNA编码序列中进行某些氨基酸取代，从而产生具有不同特性的蛋白质。因此，发明人预期可对基因的DNA序列进行各种改变而明显改变其生物学效用或活性。
在进行这类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。本领域普遍理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能中的重要性(Kyte and Doolittle，1982)。普遍认为氨基酸的相对亲水特性有助于所得到蛋白质的二级结构，这反过来限定了蛋白质与其他分子，如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。
在本领域中还应当理解的是，相似氨基酸的取代可基于亲水性有效地进行。美国专利4,554,101(通过引用并入本文)指出，蛋白质的最大局部平均亲水性(由其相邻氨基酸的亲水性决定)与蛋白质的生物学特性相关。应当理解的是，氨基酸可被具有相似亲水性值的另一氨基酸取代，并且仍然产生生物学等同和免疫学等同的蛋白质。
如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到前述各种特征的示例性取代是众所周知的，包括：精氨酸和赖氨酸；以及精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。
在具体实施方案中，本文所述的全部或部分蛋白质同样可根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成。各种自动合成器是可商购的，并且可根据已知协议使用。参见，例如，Stewart and Young(1984)；Tam等(1983)；Merrifield(1986)；以及Barany andMerrifield(1979)，各自通过引用并入本文。可选择地，可采用重组DNA技术，其中将编码肽或多肽的核苷酸序列插入表达载体，转化或转染到合适的宿主细胞中，并在适合表达的条件下培养。
一个实施方案包括将基因转移到包括微生物的细胞中，用于产生和/或呈递蛋白。可将目标蛋白的基因转移到合适的宿主细胞中，然后在合适的条件下培养细胞。实质上可采用编码任何多肽的核酸。本文讨论了重组表达载体的产生以及其中包含的元件。可选择地，待产生的蛋白可以是通常由用于蛋白质生产的细胞合成的内源蛋白。
V.产生UHSC-iNKT细胞的方法
UHSC-iNKT细胞可通过任何合适的方法产生。方法可利用一个或多个连续进行的步骤对细胞进行一种或多种修饰和/或利用一个或多个同时进行的步骤对细胞进行一种或多种修饰。在具体实施方案中，对细胞的起始来源进行修饰以充当iNKT细胞，随后进行一个或多个步骤向细胞添加一个或多个附加特征，例如被显像的能够，和/或能够被选择性杀伤的能力，和/或能够被同种异体使用的能力。在具体实施方案中，产生UHSC-iNKT细胞的过程的至少一部分发生在特定体外培养系统中。具体的体外培养系统的例子是允许以高效率和高产率分化某些细胞的系统。在具体实施方案中，体外培养系统是人工胸腺类器官(ATO)系统。
在特定情况下，UHSC-iNKT细胞可通过以下产生：1)供体HSC的遗传修饰，以(如，通过慢病毒载体)表达iNKT TCR并(如，通过基于CRISPR/Cas9的基因编辑)消除HLA-I/II分子的表达；2)通过ATO培养体外分化为iNKT细胞；3)体外iNKT细胞的纯化和扩增，以及4)配制和冷冻保存和/或应用。
本公开的特定实施方案提供了制备克隆不变自然杀伤T细胞(iNKT)的方法，所述方法包括：a)从人外周血细胞(PBMC)中选择CD34+细胞；b)引入一种或多种编码人iNKT T细胞受体(TCR)的核酸；c)消除所分离的人CD34+细胞中一种或多种HLA-I/II基因的表达；和d)在人工胸腺类器官(ATO)系统中培养所分离的表达iNKT TCR的CD34+细胞，以产生iNKT细胞，其中ATO系统包含3D细胞聚集体和无血清培养基，所述3D细胞聚集体包含所选择的表达Notch配体的基质细胞群。该方法可进一步包括分离CD34-细胞。在可选择的实施方案中，采用除ATO系统以外的其他培养系统，例如2-D培养系统或其他形式的3-D培养系统(例如，FTOC样培养，metrigel辅助的培养)。
本公开的特定方面涉及新的三维细胞培养系统，以从分化程度较低的细胞(如胚胎干细胞、多能干细胞、造血干细胞或祖细胞、诱导多能干(iPS)细胞或干细胞或祖细胞)产生iNKT细胞。可从各种资源中利用任何类型的干细胞，至少包括例如胎儿肝脏、脐带血和外周血CD34+细胞(G-CSF动员或非G-CSF动员)。
在特定实施方案中，该系统涉及使用无血清培养基。在某些方面，该系统使用适合于细胞发育的无血清培养基用于培养三维细胞聚集体。此类系统产生足够量的UHSC-iNKT细胞。在本公开的实施方案中，将3D细胞聚集体在包含胰岛素的无血清培养基中培养足以将干细胞或祖细胞体外分化为UHSC-iNKT细胞或UHSC-iNKT细胞前体的时间段。
细胞培养组合物的实施方案包括ATO 3D培养物，其利用高度标准化的无血清成分和基质细胞系来促进来自人HSC的稳健且高度可再现的T细胞分化。在某些实施方案中，ATO中的细胞分化紧密模拟内源胸腺生成，而与单层共培养相反，支持功能性UHSC-iNKT的有效阳性选择。3D培养组合物的某些方面使用无血清条件，避免使用人胸腺组织或专有支架材料，并有助于从来源细胞阳性选择并稳健地生成全功能的成熟人UHSC-iNKT细胞。
在特定实施方案中，在包含FLT3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)、B27和抗坏血酸的优化培养基的存在下，该ATO 3D培养系统可包含位于人HSC的3D结构中的具有表达Notch配体的基质细胞的聚集体。也可以存在允许在空气-流体界面处进行培养的条件。已经确定，ATO内来自可溶性因子(细胞因子、抗坏血酸、B27成分、和基质细胞衍生因子)的组合信号传导以及造血细胞和基质细胞之间的3D细胞-细胞相互作用有助于人T谱系定型、阳性选择和有效分化为功能成熟的T细胞。
在特定实施方案中，3D细胞聚集体通过在物理基质或支架上将CD34+转导细胞与所选择的基质细胞群混合来形成。该方法还可包括离心CD34+转导细胞和基质细胞以形成放置于物理基质或支架上的细胞团块。基质细胞表达的Notch配体可以是完整的，部分的或经修饰的DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、或它们的组合。例如，在特定情况下，Notch配体是人Notch配体，如人DLL1。
用于产生iNKT细胞的ATO系统可具有一定比例的基质细胞与CD34+细胞。在特定情况下，基质细胞与CD34+细胞之间的比例为约1:5至1:20。基质细胞可以是鼠基质细胞系、人基质细胞系、所选择的原代基质细胞群、从多能干细胞体外分化的基质细胞的所选择群体、或其组合。基质细胞可以是从造血干细胞或祖细胞体外分化的所选择的基质细胞群。
在制备克隆iNKT细胞群的方法中，选择缺乏HLA-I和HLA-II分子表面表达的iNKT细胞可包括使iNKT细胞与磁珠接触，该磁珠结合并阳性选择iNKT细胞且阴性选择HLA-I/II阴性细胞。在具体实施方案中，磁珠涂有识别人iNKT TCR、HLA-I分子或HLA-II分子的单克隆抗体。在特定实施方案中，单克隆抗体是克隆6B11(识别人TCR Vα24-Jα18，由此识别人iNKT不变TCRα链)，克隆2M2(识别人B2M，由此识别细胞表面展示的人HLA-I分子)，克隆W6/32(识别HLA-A、B、C，由此识别人HLA-I分子)，以及克隆Tü39(识别人HLA-DR、DP、DQ，由此识别人HLA-II分子)。
通过制备方法产生的细胞可被冷冻。所产生的细胞可在包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖和DMSO的溶液中。该溶液可以是无菌、无热源且等张的。
在特定实施方案中，ATO系统利用可包含CD34-细胞的饲养细胞。
制备方法可进一步包括激活和扩增所选择的iNKT细胞；例如，所选择的iNKT细胞已用α-半乳糖神经酰胺(α-GC)激活。饲养细胞可以已用α-GC脉冲。
本公开的制备方法可产生包含至少约102至106个克隆iNKT细胞的克隆iNKT细胞群。该方法可产生包含至少约106至1012个总细胞的细胞群。产生的细胞群可以被冷冻然后解冻。在制备方法的某些情况下，方法进一步包括引入一个或多个其他核酸至冷冻和解冻的细胞群，例如，如编码一种或多种治疗基因产物的一个或多个其他核酸。
在特定实施方案中，可提供所开发的3D培养组合物(例如，ATO生产)的方法，其涉及用人DLL1(MS5-hDLL1，下文)和分离自人脐带血、骨髓或G-CSF动员的外周血的CD34+HSPC转导的MS-5鼠基质细胞系聚集体。多达1x106个HSPC与MS5-hDLL1细胞以最佳比例混合(HSPC与基质细胞通常为1:10)。
例如，聚集体通过离心混合的细胞悬浮液(“压紧聚集”)，然后抽吸无细胞的上清液来获得。在特定实施方案中，接着可将细胞团块作为浆液吸入5至10ul的分化培养基，并以液滴转移至0.4μm尼龙transwell培养插入物，将其漂浮在分化培养基的孔中，使得插入物的底部与培养基接触，顶部与空气接触。
例如，分化培养基可包含RPMI-1640、5ng/ml人FLT3L、5ng/ml人IL-7、4％无血清B27补充剂和30uM L-抗坏血酸。可每隔3至4天完全更换培养插入物周围的培养基。在培养的前2周期间，细胞聚集体会自身组织为ATO，并且会发生早期T细胞谱系定型和分化。在某些方面，将ATO培养至少6周以允许最优T细胞分化。从ATO中提取造血细胞可通过移液分解ATO来实现。
方案中的变化允许使用对效力有不同影响的替代组分，特别是：
基础培养基RPMI可替代为几种可商购的替代品(例如IMDM)。
使用的基质细胞系是MS-5，先前描述的鼠骨髓细胞系(Itoh et al.，1989)，但是MS-5可替代为相似的鼠基质细胞系(如，OP9、S17)、人基质细胞系(如，HS-5、HS-27a)、原代人基质细胞、或人多能干细胞衍生的基质细胞。
基质细胞系用编码人DLL1 cDNA的慢病毒转导；但是，基因递送的方法以及Notch配体基因可以有所不同。可选择的Notch配体基因包括DLL4、JAG1、JAG2等。Notch配体还包括在美国专利号7,795,404和8,377,886中描述的那些，其通过引用并入本文。Notch配体还包括Delta 1、3和4以及Jagged 1、2。
HSC的类型和来源可包括骨髓、脐带血、外周血、胸腺或其他主要来源；或者源自人胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)的HSC。
细胞因子条件可以改变：例如，可改变FLT3L和IL-7的水平，以改变T细胞分化动力学；可添加其他造血细胞因子，例如干细胞因子(SCF/KIT配体)、血小板生成素(TPO)、IL-2、IL-15。
还可将遗传修饰引入某些组分以产生抗原特异性T细胞，并模拟阳性和阴性选择。这些修饰的例子包括：用编码抗原特异性T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒载体转导HSC，以产生抗原特异性、等位基因排除的幼稚T细胞；用基因转导HSC，以将谱系定型到专门的淋巴样细胞。例如，用与TCR相关的不变自然杀伤T细胞(iNKT)转导HSC，以在ATO中产生功能性iNKT细胞；用人MHC基因(如，人CD1d基因)转导ATO基质细胞系(如，MS5-hDLL1)，以增强ATO中TCR工程化或非工程化T细胞的阳性选择和成熟；和/或用抗原加共刺激分子或细胞因子转导ATO基质细胞系，以增强ATO中CAR T细胞的阳性选择。
在产生工程化iNKT细胞时，可通过引入某些外源基因和敲除某些内源基因来修饰来自人外周血细胞(PBMC)的CD34+细胞。该方法可进一步包括将一种或多种核酸引入细胞之前，在培养基中培养所选择的CD34+细胞。在某些情况下，该培养可包括将所选择的CD34+细胞与包含一种或多种生长因子的培养基温育，并且一种或多种生长因子可包含例如c-kit配体、flt-3配体和/或人血小板生成素(TPO)。生长因子可以是在一定浓度或可以不在一定浓度，例如约5ng/ml至约500ng/ml。
在特定方法中，待引入细胞中的核酸是包含编码α-TCR和β-TCR的核酸序列的一个或多个核酸。方法可进一步包括将编码自杀基因的核酸引入所选择的CD34+细胞。在特定方面，一个核酸编码α-TCR和β-TCR两者，或者一个核酸编码α-TCR、β-TCR和自杀基因。自杀基因可以是基于酶的，如胸苷激酶(TK)，包括病毒TK基因，如来自单纯疱疹病毒TK基因。自杀基因可被诸如更昔洛韦、喷昔洛韦或其衍生物的底物激活。可将细胞工程化改造为包含编码多肽的外源核酸，所述多肽具有可被标记显像的底物。在某些情况下，自杀基因产物是具有可被标记显像的底物的多肽，例如sr39TK。
可工程化改造细胞以缺乏HLA-I和/或HLA-II分子的表面表达，例如通过破坏编码β-2-微球蛋白(B2M)、主要组织相容性复合体II类反式激活物(CIITA)、和/或HLA-I和HLA-II分子的基因的功能表达。在产生方法中，消除一个或多个HLA-I/II分子在所分离的人CD34+细胞中的表面表达可包括将CRISPR和与B2M、CIITA或单独HLA-I或HLA-II分子对应的一种或多种向导RNA(gRNA)引入细胞。在某些情况下，通过电穿孔或脂质介导转染将CRISPR或一种或多种gRNA转染至细胞。在特定实施方案中，使用重组载体将编码TCR受体的核酸引入细胞，所述重组载体如病毒载体，至少包括例如慢病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒、或腺病毒。
在制造工程化iNKT细胞中，细胞可存在于特定无血清培养基中，包括包含外部添加的抗坏血酸的培养基。在特定方面，无血清培养基还包含外部添加的FLT3配体(FLT3L)、白介素7(IL-7)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-21、TNF-α、TGF-β、干扰素-γ、干扰素-λ、TSLP、胸腺五肽、pleotrophin、中期因子、或其组合。无血清培养基可进一步包含维生素，包括生物素、DLα-生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、肌醇、维生素B12、或其组合或其盐。无血清培养基可进一步包含一种或多种外部添加的蛋白质，例如白蛋白或牛血清白蛋白、BSA的级份、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶或其组合(或不添加)。无血清培养基可包含
Figure BDA0002916540480000581
补充剂、无异物
Figure BDA0002916540480000582
补充剂、GS21TM补充剂、或其组合。无血清培养基中可存在氨基酸(包括精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、或缬氨酸、或其组合)，单糖、和/或无机离子(包括如钠、钾、钙、镁、氮、或磷、或其组合或盐)。无血清培养基可进一步包含钼、钒、铁、锌、硒、铜、或锰、或其组合。
可提供用于培养本文所述的3D细胞聚集体以及产生T细胞和/或阳性/阴性选择T细胞的细胞培养条件。在某些方面，所选择群体的起始细胞可包含至少或大约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013个细胞或其中可引出的任何范围。起始细胞群的接种密度可以是至少或大约10、101、102、103、104、105、106、107、108个细胞/ml，或其中可引出的任何范围。
用于培养3D细胞聚集体或其后代细胞的培养容器可包括但不特别限于：烧瓶、用于组织培养的烧瓶、培养皿、皮氏培养皿、用于组织培养的培养皿、多用培养皿、微型板、微孔板、多用板、多孔板、多孔板、微玻片、腔室玻片、试管、托盘、
Figure BDA0002916540480000583
培养室、培养袋和滚瓶，只要能够在其中培养干细胞即可。根据培养的需要、干细胞可以在至少或大约0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、550ml、600ml、800ml、1000ml、1500ml或其中可引出的任何范围的体积中培养。在某些实施方案中，培养容器可以是生物反应器，其可指支持生物活性环境的任何装置或系统。生物反应器可具有至少或大约2、4、5、6、8、10、15、20、25、50、75、100、150、200、500升，1、2、4、6，8、10、15立方米或其中引出的任何范围的体积。
培养容器可以是细胞粘附性的或非粘附性的，并根据目的进行选择。细胞粘附培养容器可涂有用于细胞粘附的任何基质，例如细胞外基质(ECM)，以改善容器表面对细胞的粘附性。用于细胞粘附的基质可以是旨在附着干细胞或饲养细胞(如果使用的话)的任何材料。用于细胞粘附的基质包括胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、和纤连蛋白、及它们的混合物，例如MatrigelTM，以及裂解细胞膜制备物。
各种确定的基质成分可用于培养方法或组合物中。例如，重组的胶原蛋白IV、纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白的组合可用于包被培养表面，作为为多能细胞生长提供固体支持的方式，如Ludwig等(2006a；2006b)所述，其通过引用整体并入本文。
可将基质组合物固定在表面上以为细胞提供支持。基质组合物可包含一种或多种细胞外基质(ECM)蛋白和水溶剂。术语“细胞外基质”是本领域公认的。它的成分包括以下一种或多种蛋白质：纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、腱生蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、弹性蛋白、明胶、胶原蛋白、原纤蛋白、分区蛋白、锚定蛋白、软骨粘连蛋白、连接蛋白、涎蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白、表面连接蛋白(epinectin)、透明质粘连蛋白(hyaluronectin)、粗纤维调节素(undulin)、表皮整联配体蛋白(epiligrin)和缰蛋白(kalinin)。其他细胞外基质蛋白描述于Kleinman等(1993)，通过用并入本文。意图术语“细胞外基质”涵盖目前未知、可能在将来发现的细胞外基质，因为其表征为细胞外基质是本领域技术人员容易确定的。
在一些方面，基质组合物中的总蛋白浓度可以为约1ng/mL至约1mg/mL。在一些实施方案中，基质组合物中的总蛋白浓度为约1μg/mL至约300μg/mL。在更优选的实施方案中，基质组合物中的总蛋白浓度为约5μg/mL至约200μg/mL。
细胞外基质(ECM)蛋白可以是天然来源的并且从人或动物组织中纯化。可选择地，ECM蛋白可以是遗传工程化改造的重组蛋白或天然合成的。ECM蛋白可以是天然或工程化改造的完整蛋白或肽片段形式。在细胞培养基质中可以有用的ECM蛋白的实例包括层粘连蛋白、胶原I、胶原IV、纤连蛋白和玻连蛋白。在一些实施方案中，基质组合物包括纤连蛋白合成产生的肽片段或重组纤连蛋白。
在其他实施方案中，基质组合物包括至少纤连蛋白和玻连蛋白的混合物。在一些其他实施方案中，基质组合物优选包括层粘连蛋白。
基质组合物优选包括单一类型的细胞外基质蛋白。在一些实施方案中，基质组合物包括纤连蛋白，特别是与培养祖细胞一起使用。例如，合适的基质组合物可通过在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中稀释人纤连蛋白，例如由Becton(Dickinson&Co.ofFranklin Lakes，NJ(BD)(目录号354008)出售的人纤连蛋白至蛋白浓度5μg/mL至约200μg/mL来制备。在特定实例中，基质组合物包括纤连蛋白片段，如
Figure BDA0002916540480000601
是约63kDa的蛋白质(574个氨基酸)，其包含中央细胞结合域(III型重复序列，8、9、10)，高亲和力的肝素结合域II(III型重复序列，12、13、14)和位于人纤连蛋白可变剪接的IIICS区域内的CS1位点。
在一些其他实施方案中，基质组合物可包含层粘连蛋白。例如，合适的基质组合物可通过在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中稀释层粘连蛋白(Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo.)；目录号L6274和L2020)至蛋白浓度5μg/ml至约200μg/ml来制备。
在一些实施方案中，基质组合物是无异物的，因为基质或其组成蛋白仅是人类来源的。这对于某些研究应用可能是期望的。例如，在培养人细胞的无异物基质中，可使用人来源的基质成分，其中可排除任何非人类动物成分。在某些方面，MatrigelTM可从培养组合物中排除作为基质。MatrigelTM是小鼠肿瘤细胞分泌的凝胶蛋白混合物，可从BDBiosciences(New Jersey,USA)商购获得。这种混合物类似于在许多组织中存在的复杂细胞外环境，细胞生物学家经常将其用作细胞培养的基质，但它可以引入非期望的异物抗原或污染物。
在某些实施方案中，含有外源核酸的细胞可通过在表达载体或外源核酸中包括标志物进行体外或体内鉴定。这类标志物会赋予细胞以可识别的改变，从而允许容易地鉴定含有表达载体的细胞。通常，选择性标志物可以是赋予允许选择的特性的标志物。阳性选择标志物可以是其中标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性选择标志物是其中它的存在阻止其选择的标志物。阳性选择标志物的例子是抗药性标志物。
通常包含药物选择标志物有助于转化体的克隆和鉴定，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇的抗性的基因是有用的选择性标志物。除了赋予表型以允许基于条件的实施来区分转化体的标志物之外，还考虑了其他类型的标志物，包括可筛选标志物，例如GFP，其基础是比色分析。可选择地，可使用作为阴性选择标志物的可筛选的酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还将知道如何使用免疫学标志物，可能结合FACS分析。认为所使用的标志物并不重要，只要能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择和选择性标志物的其他例子是本领域技术人员所熟知的。
选择性标志物可包括在实验室微生物学、分子生物学和遗传工程中使用的报告基因类型，以指示转染或旨在将外源DNA引入细胞的其他程序的成功。选择性标志物通常是抗生素抗性基因；经受引入外来DNA程序的细胞在含有抗生素的培养基上生长，并且那些可以生长的细胞已成功吸收并表达所引入的遗传物质。选择性标志物的例子包括：来自Tn5的Abicr基因或Neo基因，其赋予抗生素对遗传霉素的抗性。
选择性标志物可包含报告基因，其允许研究者区分需要和不需要的细胞。本发明的某些实施方案利用报告基因来指示特定的细胞谱系。例如，报告基因可位于表达元件内，并在通常与心室或心房选择性基因的编码区相关的心室或心房选择性调节元件的控制下同时表达。报告分子允许分离特定谱系的细胞，而无需将其置于药物或其他选择压力下，否则会危及细胞存活力。
这类报告分子的例子包括编码细胞表面蛋白(如，CD4、HA表位)、荧光蛋白、抗原决定簇和酶(如，β-半乳糖苷酶)的基因。包含载体的细胞可例如，通过FACS利用针对细胞表面蛋白的荧光标记的抗体或可被载体编码的酶转化为荧光产物的底物来分离。
在特定实施方案中，报告基因是荧光蛋白。已开发了广泛的荧光蛋白遗传变体，其特征荧光发射光谱分布几乎覆盖了整个可见光谱。原始维多利亚多管水母绿色荧光蛋白的诱变成就产生了新的荧光探针，其颜色范围从蓝色到黄色，是生物学研究中使用最广泛的体内报告分子之一。在橙色和红色光谱区发射较长波长的荧光蛋白，是从属于珊瑚纲类的海葵、Discosoma striata和造礁石珊瑚中开发的。还开发了其他物种来产生具有蓝绿色、绿色、黄色、橙色和深红色荧光发射的相似蛋白质。正在进行开发研究工作以改进荧光蛋白的亮度和稳定性，从而提高其整体用途。
在某些实施方案中，可通过在分化之前或之后通过遗传工程化改造细胞使细胞包含一种或多种基因改变(US 2002/0168766)。通过任何合适的人工操作手段将外源核酸或多核苷酸转移至细胞时，或者细胞是遗传了多核苷酸的原始改变的细胞后代时，则称细胞为“遗传改变”，“遗传修饰”或“转基因”。例如，在细胞发展成受限的发育谱系细胞或终末分化的细胞之前或之后，可通过遗传改变细胞以表达端粒酶逆转录酶来处理细胞，以增加其复制潜力(美国专利申请公开2003/0022367)。
在某些实施方案中，含有外源核酸构建体的细胞可通过在表达载体中包含标志物(如，选择性或筛选标志物)在体外或体内鉴定。这类标志物会赋予细胞可识别的改变，从而允许容易地鉴定含有表达载体的细胞，或者通过使用组织特异性启动子来帮助富集或鉴定分化的心肌细胞。例如，在心肌细胞分化方面，可使用心肌特异性启动子，例如心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌节肌球蛋白重链(MHC)、GATA-4、Nkx2.5、N-钙粘素、1-肾上腺受体、ANF、MEF-2转录因子家族、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌红蛋白、或心钠素(ANF)。在神经元分化方面，可使用神经元特异性启动子，包括但不限于TuJ-1、Map-2、Dcx或突触蛋白。在肝细胞分化方面，可使用定形内胚层和/或肝细胞特异性启动子，包括但不限于ATT、Cyp3a4、ASPGR、FoxA2、HNF4a或AFP。
通常，选择性标志物是赋予允许选择的特性的标志物。阳性选择标志物是其中存在标志物允许其选择的标志物，而阴性选择标志物是其中它的存在阻止其选择的标志物。阳性选择标志物的例子是抗药性标志物。
通常，包含药物选择标志物有助于转化体的克隆和鉴定，例如，赋予对杀稻瘟菌素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇的抗性的基因是有用的选择性标志物。除了赋予表型以允许基于条件的实施来区分转化体的标志物之外，还考虑了其他类型的标志物，包括筛选标志物，例如GFP，其基础是比色分析。可选择地，可使用可筛选的酶，例如氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还将知道如何使用免疫学标志物，可能结合FACS分析。认为所使用的标志物并不重要，只要能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择性和筛选标志物的其他例子是本领域技术人员所熟知的。
在细胞经遗传修饰以增加或减少一个或多个特征的实施方案中，遗传修饰可通过任何合适的方法进行。例如，可使用任何遗传修饰组合物或方法将外源核酸引入细胞或编辑基因组DNA，例如基因编辑，同源重组或非同源重组，RNA介导的基因递送或任何常规核酸递送方法。遗传修饰方法的非限制性实例可包括诸如通过CRISPR/CAS9、锌指核酸酶或TALEN技术的基因编辑方法。
遗传修饰还可包括引入选择性或筛选标志物，其有助于体外或体内选择或筛选或显像。特别地，体内显像剂或自杀基因可被外源表达或添加到起始细胞或后代细胞中。在其他方面，该方法可涉及图像引导的过继细胞疗法。
具体实施方案
在本公开的特定实施方案中，提供了制备包含克隆不变自然杀伤(iNKT)T细胞的细胞群的方法，所述方法包括：a)从人外周血细胞(PBMC)选择CD34+细胞；b)用包含生长因子的培养基培养CD34+细胞，其中生长因子包括c-kit配体、flt-3配体和人血小板生成素(TPO)；c)用慢病毒载体转导所选择的CD34+细胞，所述慢病毒载体包含编码α-TCR、β-TCR和胸苷激酶的核酸序列；d)将Cas9和用于β2微球蛋白(B2M)和/或CTIIA的gRNA引入所选择的CD34+细胞，以破坏B2M或CTIIA基因的表达，从而消除HLA-I和/或HLA-II分子的表面表达；e)用经辐照的表达外源Notch配体的基质细胞系培养所转导的细胞2至12(或2至10或6至12)周，以在3D聚集细胞培养物中扩增iNKT细胞；f)选择缺乏HLA-I/II分子表面表达的iNKT细胞；以及g)用经辐照的饲养细胞培养所选择的iNKT细胞。在特定实施方案中，从所选择的CD34+细胞制备108至1013个iNKT细胞。
因此，本公开涵盖了基于HSC的通用且现成的先进iNKT细胞疗法(图1)。具体而言，可从健康供体或细胞库中收获G-CSF动员的CD34+HSC。从单个供体可收集大约1至5x108个HSC。在特定情况下，将这些HSC用Lenti/iNKT-sr39TK慢病毒载体和CRISPR-Cas9/B2M-CIITA-gRNA复合体进行体外工程化改造，接着在人工胸腺类器官(ATO)培养中在8周中分化为iNKT细胞。然后可将iNKT细胞纯化，并在体外再扩增2至4周，接着进行冷冻保存并批放行。在特定方面，从单个供体的HSC产生约1012个iNKT细胞，其可被配制成1,000至10,000个剂量(如，每个剂量约108至109个细胞)。然后，可以很容易地保存和分配所产生的冷冻保存的细胞产物，即通用HSC工程化iNKT(UHSC-iNKT)细胞，以通过同种异体过继细胞转移现成地治疗癌症患者。由于iNKT细胞可靶向多种类型的癌症而不受肿瘤抗原和主要组织相容性复合体(MHC)的限制，UHSC-iNKT疗法可用作治疗多种癌症和大癌症患者群体的通用癌症疗法，从而解决了尚未满足的医疗需求(图1)(Vivier et al.，2012；Berzins et al.，2011)。特别地，所公开的HSC-iNKT疗法可用于治疗临床上暗示服从iNKT细胞调节的多种类型的癌症，包括血液癌(白血病、多发性骨髓瘤和髓样增生异常综合症)和实体瘤(黑素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌和头颈癌)(Berzins et al.，2011)。
UHSC-iNKT疗法之下的科学实施方案是：1)慢病毒载体介导的人iNKT T细胞受体(TCR)基因表达，编程HSC以分化为iNKT细胞；2)包含sr39TK PET显像/自杀基因允许利用PET显像监测患者中的UHSC-iNKT细胞，以及如果安全需要通过施用更昔洛韦(GCV)来消减这些细胞；3)HSC的基于CRISPR-Cas9/B2M-CIITA-gRNA的基因编辑敲除B2M和CIITA基因，产生适合同种异体输注的HLA-I/II阴性细胞产物；4)ATO培养系统在体外支持人iNKT细胞的高效形成；5)制造过程是高产率和高纯度的。本文的实施例部分提供了支持这些科学实施方案的数据。
在特定情况下，制造UHSC-iNKT涉及：1)收集G-CSF动员的leukopak。2)将G-CSF-leukopak纯化成CD34+HSC；3)用慢病毒载体Lenti/iNKT-sr39TK转导HSC；4)通过CRISPR/Cas9对B2M和CIITA进行基因编辑；5)通过ATO体外分化为iNKT细胞；6)纯化iNKT细胞；7)体外细胞扩增；8)细胞收集、配制和冷冻保存。在某些实施方案中，存在两种药物物质(Lenti/iNKT-sr39TK载体和UHSC-iNKT细胞)，并且最终药物产品可以是在特定情况下配制并冷冻保存于输液袋中的UHSC-iNKT。
本文提供了产生UHSC-iNKT细胞的有效方案实例。本文证实HSC的有效基因编辑，以通过敲除B2M消融I类HLA的细胞表面表达。利用多重编辑CRISPR/Cas9，例如使用经验证的gRNA序列(Abrahimi et al.，2015)，还可通过敲除II类反式激活物(CIITA，HLA-II表达的关键调节因子(Steimle et al.，1994))的基因同时破坏细胞表面II类HLA表达。因此，并入破坏细胞表面HLA-I和HLA-II表达的此基因编辑步骤和微珠纯化步骤，我们将产生UHSC-iNKT细胞。可将流式细胞术测定法用于测量这些工程化iNKT细胞的纯度和表面表型。细胞纯度可通过TCR Vα24+Jα18+HLA-I-HLA-II-来表征。在具体实施方案中，此iNKT细胞群是指示记忆和NK表型的CD45RO+CD161+，并且包含CD4+CD8-(CD4单阳性)、CD4-CD8+(CD8单阳性)和CD4-CD8-(双阴性，DN)(Kronenberg and Gapin,2002)。可分析CD62L表达，因为最近研究表明其表达与iNKT细胞的体内持久性及其抗肿瘤活性有关(Tian et al.，2016)。可将UHSC-iNKT的这些表型与来自PBMC的iNKT的表型进行比较。可采用RNAseq对UHSC-iNKT和PBMCiNKT细胞进行比较基因表达分析。
使用PBMC iNKT作为基准对照，可将IFN-γ产生和细胞毒性测定用于评估UHSC-iNKT的功能特性。UHSC-iNKT细胞可用已被αGC脉冲的经辐照的PBMC刺激，并对从一天刺激所收获的上清液进行IFN-γELISA(Smith et al.，2015)。刺激6小时后，还可对iNKT细胞进行IFN-γ的细胞内细胞因子染色(ICCS)。细胞毒性测定可通过将效应物UHSC-iNKT细胞与经工程化以表达萤光素酶和GFP的负载αGC的A375.CD1d靶细胞温育4小时来进行，并且细胞毒性可通过酶标仪测定其发光强度。由于sr39TK作为PET/自杀基因引入，因此可通过将UHSC-iNKT与更昔洛韦(GCV)温育来验证其功能，并且细胞存活率可通过例如MTT测定法和基于膜联蛋白V的流式细胞术测定法来测量。
可进行药动学/药效学(PK/PD)研究。PK/PD研究在动物模型体内可确定以下：1)所输注UHSC-iNKT的扩增动力学和持久性；2)UHSC-iNKT在各种组织/器官中的生物分布；3)UHSC-iNKT转运至肿瘤的能力以及这种过滤与肿瘤生长如何相关。可利用负荷A375.CD1d(A375.CD1d)肿瘤的免疫缺陷NSG小鼠作为实体瘤动物模型。研究设计在图12中概述。可研究两个细胞剂量组(1x106和10x106；n＝8)。可在第4天接种肿瘤(s.c.)，在第0天进行基线PET显像和采血。随后，可静脉内(i.v.)输注UHSC-iNKT细胞，并通过以下监测：1)在第7和21天对活体动物进行PET显像；2)在第7、14和21天定期采血；3)在第21天动物终止后收集终点组织。各次采血收集的细胞可通过流式细胞术测定法；iNKT细胞应当为CD161+6B11+。可检查其他标志物如CD45RO、CD62L和CD4的表达，以了解iNKT亚群如何随时间变化。通过sr39TK进行PET显像将允许追踪肿瘤和其他组织/器官如骨骼、肝脏、脾脏、胸腺等中iNKT细胞的存在。在研究结束时，可收获肿瘤和小鼠组织(包括脾脏、肝脏、大脑、心脏、肾脏、肺、胃、骨髓、卵巢、肠等)进行qPCR分析，从而检测UHSC-iNKT细胞的分布。
可表征细胞的作用机制(MOA)。已知iNKT细胞可通过直接杀伤靶肿瘤细胞，或通过大量释放IFN-γ以引导NK和CD8T细胞根除肿瘤来靶向肿瘤细胞(Fujii et al.，2013)。体外药理学研究提供了直接细胞毒性的证据。在这里，可研究NK和CD8 T细胞在体内协助抗肿瘤反应中的作用。荷瘤NSG小鼠(A375.CD1d或MM.1S.Luc)可用单独的UHSC-iNKT(基于上述体内研究选择剂量)或与PBMC(不匹配供体，5x106)联合输注；由于UHSC-iNKT的MHC阴性，因此UHSC-iNKT与无关PBMC之间可能不会发生同种异体免疫反应。可监测和比较有PBMC组和无PBMC组之间的肿瘤生长(每组n＝8)。在具体实施方案中，如果从联合组观察到更大的抗肿瘤反应，则这可能表明PBMC中的组分如NK和/或CD8 T细胞，发挥促进治疗效力的作用。为了进一步确定它们各自的作用，可将消减NK(通过CD56珠)、CD8 T细胞(通过CD8珠)或骨髓细胞(通过CD14珠)的PBMC与UHSC-iNKT细胞一起共同输注至荷瘤小鼠。已显示免疫检查点抑制剂如PD-1和CTLA-4调节iNKT细胞的功能(Pilones et al.，2012；Durgan et al.，2011)。通过在UHSC-iNKT疗法中添加抗PD-1或抗CTLA-4治疗，可确定这些分子如何调节UHSC-iNKT疗法，并提供有关联合癌症疗法设计的信息。
可利用特定载体来产生UHSC-iNKT细胞和/或其用途。可利用将HSC遗传工程化到iNKT细胞的载体，例如编码人iNKT TCR基因以及sr39TK PET显像/自杀基因的源自HIV-1的慢病毒载体Lenti/iNKT-sr39TK(图13)。这种第三代自失活(SIN)载体的组分是：1)3'长期自失活重复序列(ΔLTR)；2)Ψ区域载体基因组包装信号；3)Rev应答元件(RRE)，增强未剪接载体RNA的核输出；4)中央聚嘌呤区(cPPT)，利于载体基因组的不明确导入；5)人iNKTTCR的α链基因(TCRα)和β链基因(TCRβ)的表达盒，以及由来自鼠干细胞病毒(MSCV)的内部启动子驱动的PET/自杀基因sr39TK(Gscheng et al.,2014)。iNKT TCRα和TCRβ和sr39TK基因均经密码子优化，并通过2A自切割序列(T2A和P2A)连接以实现它们的最优共表达(Gscheng et al.，2014)。
关于载体的质量控制，可进行一系列QC分析以确保载体产物的高质量。诸如载体身份、载体物理滴度和载体纯度(无菌性、支原体、病毒污染物、有复制能力的慢病毒(RCL)检测、内毒素、残留DNA和benzonase)的那些标准分析可以IU VPF进行，并在检验报告(COA)中提供。可进行的其他QC分析包括：1)转导/生物滴度(通过转导连续稀释的HT29细胞并进行ddPCR，≥1x106TU/ml)；2)载体原病毒完整性(通过测序所转导HT29细胞基因组DNA的载体整合部分，与原始载体质粒序列相同)；3)载体功能。可通过转导人PBMC T细胞来测量载体功能(Chodon et al.，2014)。iNKT TCR基因的表达可通过用iNKT TCR特异的6B11染色来检测(Montoya et al.，2007)。所表达iNKT TCR的功能将通过响应αGalCer刺激的IFN-γ产生进行分析(Watarai et al.，2008)。sr39TK基因的表达和功能可通过喷昔洛韦更新测定和GCV杀伤测定进行分析(Gschweng et al.，2014)。载体原液(保存于-80冷冻器)的稳定性可每隔3个月通过测量其转导滴度来检测。
VI.具体细胞生产和产品配制
提供了UHSC-iNKT细胞的概述和具体生产过程。在具体实施方案中，UHSC-iNKT细胞是关键的药物，其充当“活体药物”来靶向并对抗哺乳动物疾病，包括，例如对抗肿瘤细胞。在特定实施方案中，它们是通过遗传修饰供体HSC的体外分化和扩增产生的。数据表明以实验室规模产生细胞的新颖有效的方案，并且在具体实施方案中，以等同GMP生产过程将细胞制成“现成”细胞产品。在特定情况下，生产规模为每批1012个细胞，估计治疗1000至10,000名患者。
图14中概述了细胞制造过程，在至少一些情况中，具有时间表和每个过程步骤的“中间过程控制(IPC)”测量的实例。步骤1是在采血设施中收获供体G-CSF动员的PBSC，其已成为许多医院的常规程序(Deotare et al.，2015)。对于本项目，可从HemaCare获得Leukopaks中的新鲜PBSC；HemaCare具有IRB批准的收集协议和捐赠者同意书，并且可支持临床试验和商业产品生产。步骤2是使用CliniMACS系统从PBSC中富集CD34+HSC；可使用位于UCLA GMP设施中的这种系统来完成此步骤，并在具体方面可以产生至少108个CD34+细胞。也可以收集和保存CD34-细胞(它们在步骤7中可用作PBMC饲养者)。
步骤3涉及HSC培养和载体转导。在涂有Retronectin的烧瓶中，可以将CD34+细胞在补充有1％HAS(USP)和生长因子混合物(c-kit配体、flt-3配体和tpo；各自为50ng/ml)的X-VIVO15培养基中培养12小时，然后添加Lenti/iNKT-sr39TK载体，再持续8小时(Gschwenget al.，2014)。载体整合拷贝(VCN)可以通过对所转导细胞的甲基纤维素测定中形成的约50个菌落取样来测量，每个细胞的平均载体拷贝数可使用ddPCR来确定(Nolta et al.，1994)。在具体情况下，规程是优化的，并且VCN＝1-3/细胞时常规实现>50％的转导。
步骤4是利用强大的CRISPR/Cas9多重基因编辑方法靶向HSC中的B2M和CIITA基因组基因座并破坏它们的基因表达(Ren et al.，2017；Liu et al.，2017)，并且源自经编辑的HSC的iNKT细胞将缺乏MHC/HLA表达，从而避免宿主免疫系统的排斥。初步数据表明，通过电穿孔Cas9/B2M-gRNA以高效率对CD34+HSC的B2M破坏获得成功(通过流式分析得到约75％)。B2M/CIITA双敲除可通过电穿孔RNP混合物(Cas9/B2M-gRNA和Cas9/CIITA-gRNA(Abrahimi et al.，2015))来实现。可通过改变电穿孔参数、两种RNP的比例、电穿孔前干细胞培养时间(转导后24、48或72小时)等来优化和验证该过程(Gundry et al.，2016)；可使用来自IDT的高保真Cas9蛋白(Slaymaker et al.，2016；Tsai and Joung，2016)来最小化“脱靶”效应。示例性评估参数可以是存活力，通过T7E1测定和靶向B2M和CIITA位点的下一代测序(NGS)所测量的缺失(indel)频率(中靶效率)，通过流式细胞术得到的MHC表达，以及通过集落形成单位(CFU)测定所测量的经编辑的HSC的造血功能。
步骤5是通过人工胸腺类器官(ATO)培养1将经修饰的CD34+HSC体外分化为iNKT细胞。初步研究已经表明，功能性iNKT细胞可从经工程化改造以表达iNKT TCR的HSC有效地产生。根据此数据，可测试并验证符合GMP的8周ATO培养过程，以从108个经修饰的CD34+HSC产生1010个iNKT细胞。ATO涉及将含有HSC(5x104)和经辐照(80Gy)的MS5-hDLL1基质细胞(106)混合物的细胞浆液(5μl)以液滴形式移液至0.4μm Millicell Transwell插入物，然后将插入物放置到含1ml RB27培养基的6孔板中1；培养基每隔4天更换一次，持续8周。考虑到每个插入物3个ATO，每批生产可利用大约170个六孔板。可使用置于用于分配ATO液滴和更换培养基的生物安全柜中的自动可编程移液/分液系统(Eppendorf的EpMontion 5070f)；完成每轮170个平板可能需要操作2小时。在ATO培养结束时，可以收获并表征iNKT细胞。在具体的实施方案中，ATO组分是MS5-hDLL1基质细胞系，其通过慢病毒转导表达人DLL1，接着进行细胞分选而构建。在准备某些GMP过程中，可对该多克隆细胞群进行单细胞克隆选择过程，以建立几个克隆MS5-hDLL1细胞系，从所述细胞系中可选择有效的细胞系(通过ATO培养评估)并且使用它产生主细胞库。此库可用于为将来的临床级ATO培养提供经辐照的基质细胞。
步骤6是使用CliniMACS系统纯化ATO来源的iNKT细胞。该步骤纯化是为了消减MHCI+和MHCII+细胞并富集iNKT+细胞。抗MHCI和抗MHCII珠可通过将Miltenyi抗生物素珠与以下温育来制备：可商购的生物素化抗MHCI(克隆W6/32，HLA-A，B，C)，抗B2M(克隆2M2)，和抗MHCII(克隆Tu39，HLA-DR，DP，DQ)和抗TCRVα24-Jα18(克隆6B11)。直接涂有6B11的微珠也可从Miltenyi获得；抗iNKT珠可从Miltenyi Biotec获得。所收获的iNKT细胞可以用抗MHC珠混合物标记，洗涤两次，并可以使用CliniMACS消减程序消减MHCI+和/或MHCII+细胞；如果需要，可重复消减步骤以进一步除去残留的MHC+细胞。随后，可以使用标准抗iNKT珠和CliniMACS富集程序进一步纯化iNKT细胞。例如，细胞纯度可通过流式细胞术测量。
步骤7是在体外扩增所纯化的iNKT细胞。从1010个细胞开始，可使用已经验证的基于PBMC饲养者的体外扩增方案(Yamasaki et al.，2011；Heczey et al.，2014)扩增到1012个iNKT细胞。可评估用于这种细胞扩增的基于G-Rex的生物过程。G-Rex是细胞生长瓶，其底部具有透气膜，允许更有效地进行气体交换；G-Rex500M瓶具有在10天内支持100倍的细胞扩增的能力(Vera et al.，2010；Bajgain et al.，2014；Jin et al.，2012)。可以将步骤1中保存的CD34-细胞(用作饲养细胞)解冻，用αGalCer(100ng/ml)脉冲，然后辐照(40Gy)。可将iNKT细胞与经辐照的饲养细胞混合(比例为1:4)，接种到G-Rex烧瓶(各1.25x108个iNKT，80个瓶)，并允许扩增2周。每隔2至3天添加IL-2(200U/ml)，并且在第7天进行一次培养基更换；蠕动泵可实现所有培养基操作。这种扩增过程符合GMP，因为类似的基于PBMC饲养者的扩增程序(称为快速扩增方案)已被许多临床试验利用来生产治疗性T细胞(Dudley etal.，2008；Rosenberg et al.，2008)。
步骤8是将步骤7中收获的iNKT细胞(活性药物成分)配制成细胞悬液用于直接输注。至少全面清洗3轮后，可对步骤7中的细胞进行计数并将其悬浮在输注/冷藏兼容溶液(107至108个细胞/ml)中，该溶液由以下组成：Plasma-Lyte A注射液(31.25％v/v)，右旋糖和氯化钠注射液(31.25％v/v)、人白蛋白(20％v/v)、右旋糖注射液中的葡聚糖40(10％，v/v)和Cryoserv DMSO(7.5％，v/v)；该溶液已被用于配制Novartis的批准的T细胞产品tisagenlecleucel(Grupp et al.，2013)。一旦装入FDA批准的冷冻袋(如Miltenyi Biotec的CryoMACS冷冻袋)，就可将产品在可控速率的冷冻器中冷冻并保存在液氮冷冻器中。可通过测量存活力和回收率进行验证和/或优化研究，以确保该配制剂适合我们的UHSC-iNKT细胞产品。
可将诸如细胞计数、存活力、无菌性、支原体、身份、纯度、VCN等的各种IPC检测并入所建议的生物过程中，以确保高质量生产。测试可以包括以下者：1)外观(颜色、不透明度)；2)细胞存活力和计数；3)通过qPCR得出iNKT TCR的身份和VCN；4)通过iNKT阳性和B2M阴性获得纯度；5)内毒素；6)无菌性；7)支原体；8)通过响应αGalCer刺激的IFN-γ释放测量的潜能；9)RCL(有复制能力的慢病毒)(Cornetta et al.，2011)。这些测定大多数是标准生物学测定或该产品特有的特定测定。产品稳定性测试可通过定期解冻LN储存袋并测量其细胞存活力、纯度、回收、效力(IFN-γ释放)和无菌性来进行。在特定实施方案中，该产品稳定至少一年。
A.起始细胞来源
起始细胞，如多能干细胞或造血干细胞或祖细胞，可在用于沿选定的T细胞谱系分化的某些组合物或方法中使用。可将基质细胞用于与干细胞或祖细胞共培养。
B.基质细胞
基质细胞是任何器官例如骨髓、胸腺、子宫粘膜(子宫内膜)、前列腺和卵巢中的结缔组织细胞。它们是支持该器官的实质细胞功能的细胞。成纤维细胞(又被称为间充质基质细胞/MSC)和周细胞是最常见的基质细胞类型。
已知基质细胞和肿瘤细胞之间的相互作用在癌症生长和进展中起主要作用。另外，已描述了骨髓基质细胞通过调节局部细胞因子网络(如，M-CSF、LIF)参与人类造血和炎症过程。
骨髓、胸腺和其他造血器官中的基质细胞通过细胞-细胞配体-受体相互作用并通过释放可溶性因子，包括细胞因子和趋化因子来调节造血和免疫细胞发育。这些组织中的基质细胞形成调节干细胞维持，谱系特化和定型以及分化为效应细胞类型的小生境。
基质由非恶性宿主细胞组成。基质细胞还提供细胞外基质，组织特异性细胞类型(在某些情况下为肿瘤)可在所述细胞外基质上生长。
C.造血干细胞和祖细胞
由于造血干细胞和祖细胞的重大医学潜力，已进行了大量工作尝试改进从胚胎干细胞分化造血祖细胞的方法。在成人中，主要存在于骨髓中的造血干细胞产生造血(CD34+)祖细胞的异质群体，这些细胞分化为血液系统的所有细胞。在成年人中，造血祖细胞增殖并分化，导致每天产生数千亿个成熟血细胞。造血祖细胞还存在于脐带血中。在体外，人胚胎干细胞可分化为造血祖细胞。造血祖细胞还可从外周血样品中扩增或富集，如下所述。造血细胞可以是人源，鼠源或任何其他哺乳动物物种。
造血祖细胞的分离包括任何选择方法，包括细胞分选仪，使用抗体包被的磁珠进行磁分离，填充柱；亲和色谱法；连接至单克隆抗体或与单克隆抗体结合使用的细胞毒剂，包括但不限于补体和细胞毒素；以及用附着于固体基质(如，平板)的抗体进行“淘选”，或任何其他方便的技术。
分离或隔离技术的使用包括但不限于，基于物理(密度梯度离心和逆流离心淘析)，细胞表面(凝集素和抗体亲和力)和活体染色特性(线粒体结合染料rho123和DNA结合染料Hoechst 33342)差异的那些。提供精确分离的技术包括但不限于FACS(荧光激活细胞分选)或MACS(磁性激活细胞分选)，它们可具有不同的复杂程度，例如多颜色通道，低角度和钝角光散射检测通道，阻抗通道等。
在先前技术或用于评估细胞类型纯度的技术(例如流式细胞术)中使用的抗体可与可识别的试剂缀合，所述试剂包括但不限于酶、磁珠、胶体磁珠、半抗原、荧光染料、金属化合物、放射性化合物、药物或半抗原。可与抗体缀合的酶包括但不限于碱性磷酸酶、过氧化物酶、尿素酶和β-半乳糖苷酶。可与抗体缀合的荧光染料包括但不限于异硫氰酸荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明、藻红蛋白、别藻蓝蛋白和德克萨斯红(Texas Red)。有关可与抗体缀合的其他荧光染料，参见Haugland,Molecular Probes:Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals(1992-1994)。可与抗体缀合的金属化合物包括但不限于铁蛋白、胶体金、尤其是胶体超顺磁珠。可与抗体缀合的半抗原包括但不限于生物素、洋地黄毒苷(digoxygenin)、恶唑酮(oxazalone)和硝基酚。可缀合或掺入抗体的放射性化合物是本领域已知的，包括但不限于锝99m(9TC)，125I和包含任何放射性核素的氨基酸，包括但不限于14C、3H和35S。
可采用其他阳性选择技术，其允许准确的分离，例如亲和柱等。该方法应当允许除去非靶细胞群的小于约20％，优选小于约5％的残留量。
可基于光散射特性以及它们对各种细胞表面抗原的表达来选择细胞。通过FACS分析，纯化的干细胞具有低侧向散射和低至中等正向散射概况。细胞离心涂片器(Cytospin)制备物显示富集的干细胞具有介于成熟淋巴样细胞和成熟粒细胞之间的大小。
使用例如Sutherland等(1992)的方法和美国专利号4,714,680所描述的方法，还可在培养之前富集CD34+细胞的接种群体。例如，对细胞进行阴性选择以除去表达谱系特异性标志物的那些细胞。在说明性实施方案中，可对细胞群进行阴性选择以消减非CD34+造血细胞和/或特定的造血细胞亚群。可基于多种分子的细胞表面表达来进行阴性选择，这些分子包括T细胞标志物，如CD2、CD4和CD8；B细胞标志物，如CD10、CD19和CD20；单核细胞标志物CD14；NK细胞标志物CD2、CD16和CD56或任何谱系特异性标志物。可基于多种分子的细胞表面表达进行阴性选择，例如抗体的混合物(例如，CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123和CD235a)，其用于分离其他细胞类型，例如通过MACS或色谱柱分离。
如本文所用，谱系阴性(LIN-)是指缺少至少一种与谱系定型细胞相关的标志物，例如与T细胞(如CD2、3、4和8)，B细胞(如CD10、19和20)，髓样细胞(如CD14、15、16和33)，自然杀伤(NK)细胞(如CD2、16和56)，RBC(如糖蛋白A)，巨核细胞(CD41)，肥大细胞，嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞有关的标志物或其他标志物，如CD38、CD71和HLA-DR。优选地，谱系特异性标志物包括但不限于CD2、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD33、CD38、HLA-DR和CD71中的至少一种。更优选地，LIN-至少包括CD14和CD15。可通过阳性选择例如c-kit+或Thy-1+来实现进一步纯化。通过使用线粒体结合染料若丹明123并通过本领域已知的方法选择若丹明+细胞，可获得进一步的富集。高度富集的组合物可通过选择性分离CD34+，优选CD34+LIN-，最优选CD34+Thy-1+LIN-的细胞获得。高度富集干细胞的群体及其获得方法是本领域技术人员所熟知的，参见例如描述于PCT专利申请号PCT/US94/09760；PCT/US94/08574和PCT/US94/10501的方法。
采用各种技术通过最初除去专用谱系的细胞来分离细胞。单克隆抗体对于鉴定与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标志物特别有用。抗体可附着于固体支持物上进行粗分离。所采用的分离技术应当最大程度地保留待收集级份的存活力。可以采用不同功效的各种技术来获得“相对粗”的分离。此类分离在存在的总细胞中至多10％，通常不大于约5％，优选不大于约1％是不期望的细胞的情况中，所述不期望的细胞与要保留的细胞群保留在一起。所采用的特定技术取决于分离效率、相关的细胞毒性、操作的简易性和速度，以及复杂设备和/或技术技能的必要性。
祖细胞的选择不需要仅用对细胞特异的标志物来实现。通过使用阴性选择和阳性选择组合可获得富集的细胞群。
D.血细胞来源
造血干细胞(HSC)通常位于骨髓中，但会被迫进入血液，这一过程被称为动员，在临床上用于收获外周血中的大量HSC。选择的动员剂的一个实例是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
外周血中循环的CD34+造血干细胞或祖细胞可通过单采血液成分术(apheresis)技术以未扰动状态或在外部施用造血生长因子如G-CSF后动员后收集。动员后收集的干细胞或祖细胞数量比无扰动状态的单采血液成分术后获得者更多。在本发明的特定方面，细胞群的来源是受试者，该受试者的细胞尚未被外部施加因子动员，因为不需要在体内富集造血干细胞或祖细胞。
用于本文所述方法的细胞群可以是哺乳动物细胞，例如人细胞、非人灵长类细胞、啮齿动物细胞(如，小鼠或大鼠)、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、马细胞、绵羊细胞、犬细胞和猫细胞或其混合物。非人灵长类细胞包括恒河猴细胞。细胞可获自动物，如人患者，或它们可获自细胞系。如果细胞获自动物，则可将它们以原样使用，例如作为未分离的细胞(即，混合群)；也可以将它们先在培养物中建立，例如通过转化；或者已使它们经过初步纯化方法。例如，可基于细胞表面标志物的表达通过阳性选择或阴性选择来操纵细胞群；在体外或体内用一种或多种抗原刺激；在体外或体内用一种或多种生物修饰剂处理；或这些的任一种或全部的组合。
细胞群包括外周血单个核细胞(PBMC)，包含混合群体的全血或其部分，脾细胞，骨髓细胞，肿瘤浸润淋巴细胞，通过白细胞分离术(leukapheresis)获得的细胞，生检组织，淋巴结，例如从肿瘤引流的淋巴结。合适的供体包括经免疫的供体，未经免疫的(天然)供体，经处理或未经处理的供体。“经处理的”供体是已经暴露于一种或多种生物修饰剂的供体。“未经处理的”供体尚未暴露于一种或多种生物修饰剂。
例如，可按照本领域已知的方法获得外周血单个核细胞(PBMC)。这类方法的例子由Kim等(1992)；Biswas等(1990)；Biswas等(1991)讨论。
从细胞群获得前体细胞的方法也是本领域所熟知的。前体细胞可使用多种细胞因子(如hSCF，hFLT3和/或IL-3)扩增(Akkina et al.，1996)，或者CD34+细胞可使用MACS或FACS富集。如上所述，阴性选择技术也可用于富集CD34+细胞。
还可从受试者获得细胞样品，然后使其富集以获得所需的细胞类型。例如，PBMC和/或CD34+造血细胞可如本文所述从血液中分离。还可使用多种技术将细胞与其他细胞分离，例如用与所需细胞类型的细胞表面上的表位结合的抗体分离和/或激活。可使用的另一种方法包括使用针对细胞表面标志物的抗体进行阴性选择，以选择性富集特定的细胞类型，而无需通过受体接合激活细胞。
骨髓细胞可获自髂骨、股骨，胫骨，脊柱，肋骨或其他髓腔。骨髓可从患者体内取出，并通过各种分离和清洗程序分离。用于分离骨髓细胞的示例性程序包括以下步骤：a)将骨髓悬浮液离心分离成三个级分，收集中间级分或血沉棕黄层；b)将步骤a)的血沉棕黄层级分在分离液(通常为Ficoll,Pharmacia Fine Chemicals AB的商标)中再离心一次，收集含有骨髓细胞的中间级分；以及c)洗涤步骤b)中收集的级分，以回收可再输注的骨髓细胞。
E.多能干细胞
适用于本文所述组合物和方法的细胞可以是造血干细胞和祖细胞，其还可通过体外多能干细胞的分化来制备。在一些实施方案中，本文所述方法中使用的细胞是直接接种到ATO中的多能干细胞(胚胎干细胞或诱导多能干细胞)。在进一步的实施方案中，本文所述方法和组合物中使用的细胞是PSC的衍生物或后代，例如但不限于中胚层祖细胞，造血内皮祖细胞或造血祖细胞。
术语“多能干细胞”是指能够产生所有三个胚层，即内胚层、中胚层和外胚层细胞的细胞。尽管理论上多能干细胞可分化为人体的任何细胞，但多能性的实验测定通常是基于将多能细胞分化为每个胚层的几种细胞类型。在一些实施方案中，多能干细胞是源自胚泡内细胞团的胚胎干(ES)细胞。在其他实施方案中，多能干细胞是通过重新编程体细胞而衍生的诱导多能干细胞。在某些实施方案中，多能干细胞是通过体细胞核转移衍生的胚胎干细胞。
胚胎干(ES)细胞是源生自胚泡的内细胞团的多能细胞。ES细胞可通过除去发育中的胚胎的滋养外胚层外层，然后在非生长细胞的饲养层上培养内团细胞来分离。在适当条件下，产生增殖的未分化ES细胞集落。集落可被取出，解离成单个细胞，然后重新接种在新鲜饲养层上。重新接种的细胞可继续增殖，产生未分化的ES细胞的新集落。然后，可以取出新的集落，解离，再次重新接种并允许生长。这种“继代培养”或“传代”未分化ES细胞的过程可重复多次，以产生含有未分化ES细胞的细胞系(美国专利号5,843,780；6,200,806；7,029,913)。“原代细胞培养物”是直接从组织如胚泡的内细胞团获得的细胞培养物。“继代培养物”是源自原代细胞培养物的任何培养物。
用于获得小鼠ES细胞的方法是所熟知的。在一种方法中，用小鼠抗血清处理来小鼠品系129的植入前胚泡以除去滋养外胚层，并在含有胎牛血清的培养基中化学失活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层上培养内细胞团。在胎牛血清存在下，将形成的未分化ES细胞集落在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上传代培养，以产生ES细胞群。在某些方法中，通过在含血清的培养基中添加细胞因子白血病抑制因子(LIF)，小鼠ES细胞可在没有饲养层的情况下生长(Smith，2000)。在其他方法中，在骨形态发生蛋白和LIF存在的条件下，小鼠ES细胞可在无血清培养基中生长(Ying et al.，2003)。
人ES细胞可使用先前所述方法从胚泡获得(Thomson et al.，1995；Thomson etal.，1998；Thomson和Marshall，1998；Reubinoff et al.，2000)。在一种方法中，将第5天的人胚泡暴露于兔抗人脾细胞抗血清，然后暴露于1:5稀释的豚鼠补体中，以裂解滋养外胚层细胞。从完整内细胞团消除裂解的滋养外胚层细胞后，在胎牛血清存在下，于γ灭活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养内细胞团。9至15天后，可将源自内细胞团的细胞团块用化学(即，暴露于胰蛋白酶)或机械解离，并重新接种在含有胎牛血清和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的新鲜培养基中。在进一步增殖后，具有未分化形态的集落通过微量移液器选择，机械解离成团块，并重新接种(参见美国专利号6,833,269)。ES样形态的特征是紧凑的集落，具有明显高的核质比和突出的核仁。产生的ES细胞可通过短暂胰蛋白酶消化或通过微量移液器选择单个集落来常规传代。在一些方法中，在碱性成纤维细胞生长因子存在下，通过在成纤维细胞饲养层上培养ES细胞，人ES细胞可在无血清的情况下生长(Amit et al.，2000)。在其他方法中，在含有碱性成纤维细胞生长因子的“条件化”培养基存在下，通过在蛋白质基质(如，MatrigelTM或层粘连蛋白)上培养细胞，人ES细胞可在无饲养细胞层的情况下生长(Xu et al.，2001)。培养基通过与成纤维细胞共培养来预先条件化。
分离恒河猴和普通狨猴ES细胞的方法也是已知的(Thomson and Marshall，1998；Thomson et al.，1995；Thomson and Odorico，2000)。
ES细胞的另一个来源是已建立的ES细胞系。已知多种小鼠细胞系和人ES细胞系，并且已限定了它们的生长和增殖条件。例如，从小鼠品系129胚胎的内细胞团建立了小鼠CGR8细胞系，并且CGR8细胞培养物可在没有饲养层的LIF存在下生长。作为另一个例子，Thompson等建立了人ES细胞系H1、H7、H9、H13和H14。另外，已开发了H9系的亚克隆H9.1和H9.2。
ES细胞的来源可以是胚泡，从培养胚泡内细胞团衍生的细胞，或获自已建立细胞系的培养物的细胞。因此，如本文所用，术语“ES细胞”可指胚泡的内细胞团细胞，从内团细胞的培养物获得的ES细胞，以及从ES细胞系的培养物获得的ES细胞。
诱导多能干(iPS)细胞是具有ES细胞特征但是通过重新编程已分化的体细胞获得的细胞。诱导多能干细胞已通过各种方法获得。在一种方法中，使用逆转录病毒转导，用转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4转染成人真皮成纤维细胞(Takahashi et al.，2007)。将所转染的细胞接种在补充了碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中的SNL饲养细胞(产生LIF的小鼠细胞成纤维细胞系)上。大约25天后，在培养物中出现类似于人ES细胞集落的集落。挑选ES细胞样集落，并在bFGF存在下于饲养细胞上扩增。
基于细胞特征，ES细胞样集落的细胞是诱导多能干细胞。诱导多能干细胞在形态上与人ES细胞相似，并表达各种人ES细胞标志物。同样，在已知导致人ES细胞分化的条件下生长时，诱导多能干细胞也相应地分化。例如，诱导多能干细胞可分化为具有神经元结构和神经元标志物的细胞。
在另一种方法中，使用慢病毒转导，用四个基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28转染人胎儿或新生成纤维细胞(Yu et al.，2007)。感染后12至20天，可见具有人ES细胞形态的集落。挑选并扩增集落。组成集落的诱导多能干细胞在形态上类似于人ES细胞，表达各种人ES细胞标志物，并在注射入小鼠后形成具有神经组织，软骨和肠上皮的畸胎瘤。
从小鼠制备诱导多能干细胞的方法也是已知的(Takahashi and Yamanaka，2006)。iPS细胞的诱导通常需要表达或暴露于来自Sox家族的至少一个成员和来自Oct家族的至少一个成员。Sox和Oct被认为是指定ES细胞身份的转录调控阶层系统的核心。例如，Sox可以是Sox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15或Sox-18；Oct可能是Oct-4。其他因子可以提高重新编程效率，例如Nanog、Lin28、Klf4或c-Myc；特定的重编程因子组可以是包含Sox-2、Oct-4、Nanog和任选Lin-28的组；或包含Sox-2、Oct4、Klf和任选c-Myc的组。
IPS细胞如ES细胞具有特征抗原，通过免疫组织化学或流式细胞术可使用以下鉴定或确认，使用针对SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4(Developmental Studies Hybridoma Bank,National Institute of Child Health and Human Development,Bethesda Md.)和TRA-1-60和TRA-1-81(Andrews et al.,1987)的抗体。可通过向8至12周大的雄性SCID小鼠的后腿肌肉注射大约0.5-10X106个细胞来确认胚胎干细胞的多能性。畸胎瘤的发展表明三个胚层中每一个的至少一种细胞类型。
VII.使用细胞的方法
在产生之后可以直接利用或可以不直接利用本公开的UHSC-iNKT细胞。在某些情况下，将它们保存用于以后目的。无论如何，可将它们用于诸如患者的哺乳动物受试者(人、狗、猫、马等)的治疗或预防应用。患者可能需要对任何种类医学病况的细胞疗法，包括同种异体细胞疗法。
用本公开治疗有效量的UHSC-iNKT细胞治疗患者的方法包括向患者施用细胞或其克隆群。细胞或细胞群对于患者可以是同种异体的。在特定实施方案中，患者没有表现出细胞或细胞群消减的体征。患者可以患有或可以不患有癌症和/或涉及炎症的疾病或病况。在患者患有癌症的具体实施方案中，在向患者施用细胞或细胞群之后杀伤癌症患者的肿瘤细胞。在患者患有炎症的特定情况下，在向患者施用细胞或细胞群之后减轻炎症。在治疗方法的具体实施方案中，该方法进一步包括向患者施用引发自杀基因产物的化合物。
对于患有癌症的患者，一旦被输注入患者体内，预期该细胞产物可采用多种机制靶向和根除肿瘤细胞。所输注的细胞可通过细胞毒性直接识别并杀伤CD1d+肿瘤细胞。它们可以分泌诸如IFN-γ的细胞因子来激活NK细胞杀伤HLA阴性肿瘤细胞，并且还激活DC，其然后刺激细胞毒性T细胞杀伤HLA阳性肿瘤细胞。因此，我们计划进行一系列体外和体内研究，以证明该细胞产品用于癌症疗法的药理功效。
因为UHSC-iNKT细胞可靶向多种癌症而不受肿瘤抗原和MHC限制，所以现成UHSC-iNKT细胞产品可用作治疗任何类型癌症和大量癌症患者的一般癌症免疫疗法。在特定情况下，本疗法对已经临床证明受iNKT细胞调节的癌症患者有用，包括例如多种类型的实体瘤(黑素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌和头颈癌)和血液癌(白血病、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合症)。
在任何以上公开方法的一些实施方案中，受试者患有或有风险患有自身免疫疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或移植物排斥。受试者可以是被诊断出患有此类疾病的受试者，或者是根据遗传或家族史分析被确定对这种疾病有易感性的受试者。受试者还可以是正在准备或已进行移植的受试者。在一些实施方案中，该方法用于治疗自身免疫疾病、GVHD或移植排斥。
用本细胞疗法治疗的个体在接受UHSC-iNKT细胞疗法之前可以已经接受过或可以尚未接受针对特定医学状况的治疗。在个体患有癌症的情况下，癌症可以是原发性、转移性、对治疗抵抗等。用尽传统治疗选择的患者。
在特定实施方案中，将细胞以每剂107至109个细胞提供给患者。在特定实施方案中，给药方案是在淋巴消减调理后单剂量的同种异体UHSC-iNKT细胞。例如，可在用氟达拉滨和环磷酰胺进行淋巴消减调理后静脉内施用细胞。
在对随后的体内治疗情况表征体内抗肿瘤效力的情况下，可通过用递增剂量(1x106,5x106,10x106)的UHSC-iNKT细胞(n＝8/组)治疗荷瘤NSG小鼠来测量体内药理学反应；可包括PBS治疗作为对照。作为示例，可利用两个肿瘤模型。可将A375.CD1d(1x106s.c.)用作实体瘤模型，可将MM.1S.Luc(5x106 i.v.)用作血液系统恶性肿瘤模型。可通过测量大小(A375.CD1d)或生物发光成像(MM.1S.Luc)来监测肿瘤的生长。抗肿瘤免疫反应可通过PET显像，定期采血和终点肿瘤收获，然后通过流式细胞术和qPCR进行测量。响应UHSC-iNKT治疗而抑制肿瘤生长可表明UHSC-iNKT细胞疗法的治疗功效。肿瘤抑制与iNKT剂量的相关性可确认iNKT细胞的治疗作用，并为人类治疗显示有效的治疗窗口。检测iNKT细胞对肿瘤的反应可表明这些细胞在体内的药理抗肿瘤活性。
方法可针对已测试对医学病况为阳性，具有医学病况的一种或多种症状或被认为有发展此类病况的风险的个体采用。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法用于治疗本文所列和/或本领域已知的病症的炎性或自身免疫组分。
本公开的某些方面涉及癌症的治疗和/或癌症抗原的应用。待治疗的癌症或抗原可以是与本领域已知的任何癌症相关的抗原，例如上皮癌(如，乳腺癌，胃肠道癌，肺癌)，前列腺癌，膀胱癌，肺癌(如，小细胞肺癌)，结肠癌，卵巢癌，脑癌，胃癌，肾细胞癌，胰腺癌，肝癌，食道癌，头颈癌或结直肠癌。在一些实施方案中，待治疗的癌症或抗原来自以下癌症中的一种：肾上腺皮质癌(adenocortical carcinoma)，原因不明性髓样化生(agnogenicmyeloid metaplasia)，AIDS相关癌症(如，AIDS相关淋巴瘤)，肛门癌，阑尾癌，星形细胞瘤(如，小脑和大脑)，基底细胞癌，胆管癌(如，肝外)，膀胱癌，骨癌(骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)，脑瘤(如，神经胶质瘤，脑干神经胶质瘤，小脑或大脑星形细胞瘤(如，毛细胞性星形细胞瘤，弥漫性星形细胞瘤，间变性(恶性)星形细胞瘤)，恶性神经胶质瘤，室管膜瘤，少突神经胶质瘤(oligodenglioma)，脑膜瘤，脑膜肉瘤(meningiosarcoma)，颅咽管瘤，血管母细胞瘤(haemangioblastomas)，髓母细胞瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤(supratentorialprimitive neuroectodermal tumor)，视通路和下丘脑神经胶质瘤和胶质母细胞瘤)，乳腺癌，支气管腺癌/类癌，类癌瘤(如，胃肠道类癌瘤)，原发灶不明癌(carcinoma of unknownprimary)，中枢神经系统淋巴瘤，宫颈癌，结肠癌，结直肠癌，慢性骨髓增生性病症，子宫内膜癌(如，子宫癌)，室管膜瘤，食道癌，尤文氏肿瘤家族，眼癌(如，眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤)，胆囊癌，胃(胃部)癌，胃肠道类癌肿瘤，胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromaltumor，GIST)，生殖细胞瘤(如，颅外，性腺外，卵巢)，妊娠滋养细胞肿瘤(gestationaltrophoblastic tumor)，头颈癌，肝细胞(肝脏)癌(如，肝癌和肝瘤(heptoma))，下咽癌，胰岛细胞癌(内分泌胰腺)，喉癌，喉癌，白血病，唇和口腔癌，口腔癌，肝癌，肺癌(如，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌和鳞状肺癌)，淋巴样新生物(如，淋巴瘤)，髓母细胞瘤，卵巢癌，间皮瘤，转移性鳞状颈癌，口腔癌，多发性内分泌新生物综合征，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增生性疾病，鼻腔和鼻旁窦癌，鼻咽癌，成神经细胞瘤，神经内分泌癌，口咽癌，卵巢癌(如，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢低度恶性潜能肿瘤(ovarian lowmalignant potential tumor))，胰腺癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，腹膜癌，咽癌，嗜铬细胞瘤，成松果体细胞瘤(pineoblastoma)和幕上原始神经外胚层肿瘤(supratentorialprimitive neuroectodermal tumor)，垂体瘤，胸膜肺母细胞瘤(pleuropulmonaryblastoma)，淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤(小神经胶质细胞瘤)，肺淋巴管肌瘤病，直肠癌，肾癌，肾盂和输尿管癌(移行细胞癌)，横纹肌肉瘤，唾腺癌，皮肤癌(如，非黑素瘤(如鳞状细胞癌)，黑素瘤和Merkel细胞癌)，小肠癌，鳞状细胞癌，睾丸癌，喉癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，结节性硬化症，尿道癌，阴道癌，外阴癌，维尔姆斯瘤(Wilms’tumor)，以及移植后淋巴增生性病症(PTLD)，与斑痣性错构瘤病(phakomatoses)相关的异常血管增殖，水肿(如，脑肿瘤相关的水肿)，或梅格斯氏综合征(Meigs’syndrome)。
本公开的某些方面涉及自身免疫性病况的治疗和/或自身免疫相关抗原的应用。待治疗的自身免疫性疾病或抗原可以是与本领域已知的任何自身免疫性病况相关的抗原，或者例如糖尿病，移植排斥，GVHC，关节炎(类风湿性关节炎，如急性关节炎，慢性类风湿性关节炎，痛风或痛风性关节炎，急性痛风性关节炎，急性免疫性关节炎，慢性炎症性关节炎，变性关节炎，II型胶原诱导性关节炎，感染性关节炎，莱姆关节炎(Lyme arthritis)，增生性关节炎，银屑病关节炎，斯提耳病(Still’s disease)，脊椎关节炎，和幼发型类风湿关节炎(juvenile-onset rheumatoid arthritis)，骨关节炎，慢性进行性关节炎(arthritischronica progrediente)，变形性关节炎(arthritis deformans)，原发性慢性多关节炎(polyarthritis chronica primaria)，反应性关节炎和强直性脊柱炎)，炎症性过度增生性皮肤病，银屑病(如斑块状银屑病，滴状银屑病(gutatte psoriasis)，脓疱性银屑病和指甲银屑病)，特应性，包括特应性疾病，如花粉热和乔布综合征(Job’s syndrome)，皮炎(包括接触性皮炎，慢性接触性皮炎，剥脱性皮炎，变应性皮炎，变应性接触性皮炎，疱疹样皮炎，钱币状皮炎，脂溢性皮炎，非特异性皮炎，原发性刺激性接触性皮炎和特应性皮炎，X连锁高IgM综合征，变应性眼内炎性疾病，荨麻疹如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹，肌炎，多肌炎/皮肌炎，幼年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解(toxic epidermal necrolysis)，硬皮病(包括全身性硬皮病)，硬化(如系统性硬化，多发性硬化(MS)如脊髓-眼MS，原发性进行性MS(PPMS)和复发缓解MS(relapsing remittingMS,RRMS)，进行性系统性硬化，动脉粥样硬化，动脉硬化，播散性硬化(sclerosisdisseminata)，共济失调硬化(ataxic sclerosis)，视神经脊髓炎(NMO)，炎性肠病(IBD)(如，克罗恩(Crohn)氏病，自身免疫介导的胃肠道疾病，结肠炎如溃疡性结肠炎，结肠炎溃疡，微管结肠炎(microscopic colitis)，胶原性结肠炎(collagenous colitis)，息肉性结肠炎(colitis polyposa)，坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎(transmural colitis)，以及自身免疫性炎症性肠病)，肠炎，坏疽性脓皮病(pyoderma gangrenosum)，结节性红斑(erythema nodosum)，原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis)，呼吸窘迫综合征(包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS))，脑膜炎，全部或部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性血液病症，类风湿性脊椎炎，类风湿性滑膜炎，遗传性血管性水肿，颅神经损伤如在脑膜炎中，妊娠疱疹，妊娠类天疱疮，阴囊瘙癣(pruritis scroti)，自身免疫性卵巢功能早衰，由于自身免疫性病况引起的突发性听力丧失(sudden hearingloss)，IgE介导的疾病如过敏反应和变应性和特应性鼻炎，脑炎，如腊斯默森脑炎(Rasmussen’s encephalitis)和边缘和/或脑干脑炎，葡萄膜炎如前葡萄膜炎，急性前葡萄膜炎，肉芽肿葡萄膜炎，非肉芽肿葡萄膜炎，晶状体抗原性葡萄膜炎，后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和不具有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)，例如慢性或急性肾小球肾炎，如原发性GN，免疫介导的GN，膜性GN(膜性肾病)，特发性膜性GN或特发性膜性肾病，膜或膜性增生性GN(MPGN)(包括I型和II型)和快速进展性GN(rapidly progressive GN)，增殖性肾炎，自身免疫性多腺体内分泌障碍，龟头炎(balanitis)，包括浆细胞性局限性龟头炎(balanitis circumscripta plasmacellularis)，龟头包皮炎(balanoposthitis)，离心性环状红斑，持久性色素异常性红斑，多形性红斑(eythema multiform)，环形肉芽肿，光泽苔藓(lichen nitidus)，硬化萎缩性苔藓(lichen sclerosus et atrophicus)，慢性单纯性苔藓(lichen simplex chronicus)，小棘苔藓(lichen spinulosus)，扁平苔癣，片层状鱼鳞病，表皮松解角化过度症(epidermolytic hyperkeratosis)，恶性前角化(premalignantkeratosis)，坏疽性脓皮，变应性病况和响应，变应性反应，湿疹，包括变应性或特应性湿疹，干性湿疹，汗疱湿疹和水疱样掌跖湿疹(vesicular palmoplantar eczema)，哮喘，如支气哮喘(asthma bronchiale)，支气管哮喘(bronchial asthma)和自身免疫性哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病况，针对外来抗原的免疫反应，如妊娠期间胎儿A-B-O血型，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附不足(leukocyte adhesiondeficiency)，狼疮，包括狼疮性肾炎，狼疮性脑炎，小儿狼疮(pediatric lupus)，非肾脏狼疮，肾外狼疮，盘状狼疮和盘状红斑狼疮，脱发性狼疮(alopecia lupus)，系统性红斑狼疮(SLE)如皮肤SLE或亚急性皮肤SLE，新生儿狼疮综合征(NLE)和播散性红斑狼疮传染，青少年发作(I型)糖尿病，包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和成人发作性糖尿病(II型糖尿病)和自身免疫性糖尿病。还考虑的是与由细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫反应，结节病，肉芽肿病，包括淋巴瘤样肉芽肿病，韦格纳肉芽肿病，粒细胞缺少，血管炎病，包括血管炎，大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏)动脉炎)，中血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)，微观多动脉炎(microscopic polyarteritis)，免疫血管炎，CNS血管炎，皮肤血管炎，超敏感性血管炎，坏死性血管炎如全身性坏死性血管炎和ANCA相关性血管炎，如变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss vasculitis)或综合征(CSS)以及ANCA相关小血管血管炎，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，库姆斯(Coombs)阳性贫血，戴-布二氏贫血(Diamond Blackfan anemia)，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，艾迪生病(Addison’s disease)，自身免疫性中性粒细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞血细胞渗出的疾病，CNS炎性病症，阿尔茨海默病，帕金森病，多器官损伤综合征，例如继发于败血症，创伤或出血的那些，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，白塞氏病/综合征，卡斯尔曼(Castleman)综合征，肺出血肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)，雷诺综合征(Reynaud’s syndrome)，干燥综合征(Sjogren’s syndrome)，史-约综合征(Stevens-Johnson syndrome)，类天疱疮，例如大疱性类天疱疮(pemphigoid bullous)和皮肤类天疱疮(skin pemphigoid)，天疱疮(包括寻常型天疱疮，落叶型天疱疮，天疱疮粘膜类天疱疮和红斑性天疱疮)，自身免疫性多内分泌腺病(polyendocrinopathies)，赖特尔(Reiter)病或综合征，热损伤，先兆子痫，免疫复合物病症，如免疫复合物肾炎，抗体介导的肾炎，多神经病，慢性神经病，如IgM多神经病或IgM介导的神经病，自身免疫或免疫介导的血小板减少症，如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP，巩膜炎，如特发性角膜-巩膜炎，巩膜外层炎，睾丸和卵巢的自身免疫病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退，甲状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌疾病，包括甲状腺炎，如自身免疫性甲状腺炎，桥本(Hashimoto)氏病，慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺疾病，特发性甲状腺功能减退，格雷夫斯(Grave)氏病，多腺综合征，如自身免疫性多腺综合征(或多腺内分泌病综合征)，副肿瘤综合征(paraneoplastic syndromes)，包括神经副肿瘤综合征(neurologic paraneoplastic syndrome)，如Lambert-Eaton肌无力综合征或朗-爱二氏肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)，僵人(stiff-man或stiff-person)综合征，脑脊髓炎，如变应性脑脊髓炎或脑脊髓炎变应性和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，实验性自身免疫性脑脊髓炎，重症肌无力，如胸腺瘤相关性重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，以及感觉神经病，多灶性运动神经病，席汉综合征(Sheehan’s syndrome)，自身免疫性肝炎，慢性肝炎，类狼疮性肝炎(lupoid hepatitis)，巨细胞肝炎，慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，淋巴样间质性肺炎(LIP)，闭塞性细支气管炎(非移植)对NSIP，格-巴二氏综合征，贝格尔(Berger)病(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，急性热性嗜中性粒细胞性皮肤病(acute febrile neutrophilic dermatosis)，角膜下脓疱性皮肤病，暂时性棘层松解性皮肤病(transient acantholytic dermatosis)，肝硬化，如原发性胆汁性肝硬化和肺硬化(pneumonocirrhosis)，自身免疫性肠病综合征，乳糜泻，口炎性腹泻(麸质肠病)，难治性口炎性腹泻(refractory sprue)，特发口炎性腹泻，冷球蛋白血症，肌萎缩性侧索硬化(amylotrophic lateral sclerosis)(ALS；Lou Gehrig病)，冠状动脉病，自身免疫性耳病，如自身免疫性内耳病(AIED)，自身免疫性听力丧失，多软骨炎，如难治或复发的或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，寇甘(Cogan)综合征/非梅毒性基质性角膜炎(nonsyphiliticinterstitial keratitis)，贝尔(Bell)麻痹，Sweet病/综合征，自身免疫性酒渣鼻，带状疱疹相关疼痛，淀粉样变，非癌性淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多，包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如，良性单克隆丙种球蛋白病和意义未明的单克隆丙种球蛋白病，MGUS)，周围神经病，副肿瘤综合征，通道病(channelopathies)，如癫痫，偏头痛，心律失常，肌肉病症，聋，失明，周期性瘫痪和CNS通道病，自闭症，炎性肌病，局灶或节段性或局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)，内分泌眼病，葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝脏病学病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特(Schmidt)氏综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病，如自身免疫性脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘性多神经病，德雷斯勒(Dressler)综合征，斑秃(alopecia greata)，全秃，CREST综合征(钙质沉着症，雷诺(Raynaud)现象，食管活动不良(esophageal dysmotility)，指硬皮病)和毛细管扩张)，男性和女性自身免疫性不育/不孕，如由于抗精子(spermatozoan)抗体，混合性结缔组织病，恰加斯(Chagas)病，风湿热，反复流产，农民肺(farmer’s lung)，多形性红斑(erythemamultiforme)，心切开术后综合征(post-cardiotomy syndrome)，柯兴(Cushing)综合征，养鸟人肺(bird-fancier’s lung)，变应性肉芽肿脉管炎(allergic granulomatousangiitis)，良性淋巴细胞性脉管炎，家族性出血性肾炎(Alport’s syndrome)，肺泡炎，如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风病，疟疾，寄生性疾病，如利什曼病(leishmaniasis)，锥虫病(kypanosomiasis)，血吸虫病，蛔虫病，曲霉病，Sampter综合征，卡普兰综合征(Caplan’s syndrome)，登革热，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，间质性肺纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久性隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)，胎儿成红细胞增多，嗜酸细胞性筋膜炎(eosinophilic faciitis)，舒尔曼综合征(Shulman’s syndrome)，费尔蒂综合征(Felty’ssyndrome)，丝虫病(flariasis)，睫状体炎，如慢性睫状体炎，异时性睫状体炎(heterochronic cyclitis)，虹膜睫状体炎(急性或慢性)，或富克斯睫状体炎(Fuch’scyclitis)，亨诺-许兰氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，SCID，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，埃可病毒(echovirus)感染，败血症，内毒素血症，胰腺炎，甲状腺毒症(thyroxicosis)，细小病毒感染，风疹病毒感染，疫苗接种后综合征，先天性风疹感染，埃巴病毒感染，腮腺炎，埃文斯综合征，自身免疫性腺衰竭，西登哈姆舞蹈病(Sydenham’s chorea)，链球菌后肾炎(post-streptococcal nephritis)，血栓闭塞性血管炎(thromboangitis ubiterans)，甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞多肌痛，慢性超敏感性肺炎，干燥性角膜结膜炎，流行性角膜结膜炎，特发性肾炎综合征，微小病变肾病(minimal change nephropathy)，良性家族性和缺血再灌注损伤，移植器官再灌注，视网膜自身免疫性(retinal autoimmunity)，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道/肺部疾病，矽肺，口疮，口疮性口炎，动脉硬化病症，asperniogenese，自身免疫性溶血，伯克氏病(Boeck’s disease)，冷球蛋白血症，掌腱膜挛缩(Dupuytren’s contracture)，晶状体过敏性眼内炎(endophthalmia phacoanaphylactica)，变应性肠炎，麻风结节性红斑(erythemanodosum leprosum)，特发性面瘫(idiopathic facial paralysis)，慢性疲劳综合征，风湿性发热(febris rheumatica)，Hamman-Rich病，感觉神经性听力损失，阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica)，性腺机能减退，局部回肠炎(ileitis regionalis)，白细胞减少症，传染性单核细胞增多症(mononucleosis infectiosa)，横贯性脊髓炎(traverse myelitis)，原发性特发性粘液水肿，肾病，交感性眼炎(ophthalmiasymphatica)，肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa)，胰腺炎，急性多神经根炎(polyradiculitis acuta)，坏疽性脓皮病，奎尔万氏甲状腺炎(Quervain’sthyreoiditis)，获得性脾萎缩，非恶性胸腺瘤，白癜风，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的病况，白细胞粘附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫反应，涉及白细胞血细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜疾病，变应性神经炎，自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发性粘液水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿性疾病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌障碍，自身免疫性多腺体综合征I型，成人发作性特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH)，心肌病，如扩张型心肌病，获得性大疱性表皮松解(epidermolisis bullosaacquisita，EBA)，血色素沉着病，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，脓性或非脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛骨，额骨，上颌骨或蝶骨鼻窦炎，嗜酸性粒细胞相关病症，如嗜酸性粒细胞增多症，肺浸润嗜酸性粒细胞增多症，嗜酸性粒细胞增多症-肌痛综合征，吕弗勒(Loffler)综合征，慢性嗜酸细胞性肺炎，热带肺嗜酸性粒细胞增多症，含有嗜酸性粒细胞的支气管肺炎性曲霉病，曲霉肿或肉芽肿，过敏性，血清阴性脊柱关节炎(spondyloarthritides)，多内分泌自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜，巩膜外层，慢性粘膜皮肤念珠菌病，布鲁顿(Bruton)综合征，婴儿期短暂性低丙种球蛋白血症(transienthypogammaglobulinemia of infancy)，Wiskott-Aldrich综合征，共济失调毛细血管扩张综合征，血管紧张，与胶原病有关的自身免疫病，风湿病，神经学疾病，淋巴结炎，血压响应降低，血管功能障碍，组织损伤，心血管缺血，痛觉过敏，肾缺血，脑缺血和伴有血管形成的疾病，变应性超敏感性病症，肾小球性肾炎(glomerulonephritides)，再灌注损伤，缺血性再灌注病症，心肌或其他组织的再灌注损伤，淋巴瘤性气管支气管炎，炎性皮肤病，伴随急性炎性成分的皮肤病，多器官衰竭，大疱性疾病，肾皮质坏死，急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性病症，眼和眶炎性病症，粒细胞输血相关综合征，细胞因子诱导的毒性，发作性睡病，急性严重炎症，慢性难治性炎症，肾盂炎，动脉内增生，消化性溃疡，瓣膜炎，移植物抗宿主病，接触性超敏感性，哮喘性气道高敏性和子宫内膜异位症。
另一些方面涉及治疗或预防微生物感染和/或微生物抗原的应用。待治疗或预防的微生物感染或抗原可以是与本领域已知的任何微生物感染相关的抗原，或者例如炭疽，宫颈癌(人乳头瘤病毒)，白喉，甲型肝炎，乙型肝炎，乙型流感嗜血杆菌(Hib)，人乳头瘤病毒(HPV)，流感(Flu)，日本脑炎(JE)，莱姆病，麻疹，脑膜炎球菌，猴痘，腮腺炎，百日咳，肺炎球菌，脊髓灰质炎，狂犬病，轮状病毒，风疹，带状疱疹(herpes zoster)，天花，破伤风，伤寒，结核病(TB)，水痘(Chickenpox)和黄热病。
在一些实施方案中，方法和组合物可用于为个体接种疫苗以预防疾病，如癌症、炎症、感染等。
VIII.实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解的是，以下实施例中公开的技术代表发明人发现在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可被认为构成其实践的优选方式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解的是，可在所公开特定实施方案中进行许多改变，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下仍可获得类似或相似的结果。
实施例1：造血干细胞(HSC)方法用于工程化改造现成INKT细胞
本实施例涉及包含一个或多个HLA-I和/或HLA-II分子缺乏或下调的表面表达的现成iNKT细胞的产生。在具体实施方案中，从健康供体外周血单个核细胞(PBMC)扩增iNKT细胞，然后进行CRISPR-Cas9工程化改造以敲除B2M和CIITA基因。由于人群中iNKT细胞的高变异性和低频率(在血液中约为0.001-0.1％)，有益的是产生允许获得iNKT细胞的替代手段的方法。
本公开提供了从造血干细胞(HSC)生成iNKT细胞的强大方法，其通过用iNKT TCR遗传工程化改造HSC，并编程这些HSC发育为iNKT细胞(Smith et al.，2015)。该方法利用了控制iNKT细胞发育的两个分子机制：1)在存在转基因iNKT TCR基因的情况下阻止内源TCR基因重排的等位基因排斥机制，以及2)指导发育中的T细胞沿着iNKT谱系路径发展的TCR指导机制(Smith et al.，2015)。产生的HSC工程化iNKT(HSC-iNKT)细胞是不表达内源TCR的同质“克隆”群。已产生小鼠HSC-iNKT细胞，在小鼠骨髓转移和黑素瘤肺转移模型中具有这些iNKT细胞的强力抗癌效力(Smith et al.，2015)。
HSC工程化人iNKT细胞通过如下产生：用人iNKT TCR基因对人CD34+外周血干细胞(PBSC)进行工程化改造，然后将工程化PBSC转移至BLT人源化小鼠模型中(图2A和图2B)。但是，此类体内方法只能翻译为自体HSC过继疗法。在特定实施方案中，利用无血清“人工胸腺类器官(ATO)”体外培养系统以高效率和高产率支持将TCR工程化人CD34+HSC分化为克隆T细胞(图2C和图2D)(Seet et al.,2017)。这种ATO培养系统允许将HSC-iNKT生产移至体外系统，并以此为基础，可利用现成的通用HSC工程化iNKT(UHSC-iNKT)细胞过继疗法(图1)。
本文涵盖了从遗传工程化改造健康供体HSC体外培养的同种异体HLA阴性人iNKT细胞。以下提供了其生产示例。
A.初步CMC研究(图3)
除非另有说明，否则人G-CSF动员的外周血CD34+细胞含有造血干细胞和祖细胞两者。在本文中，这些CD34+细胞被称为HSC。
进行了初步化学、制造和控制(CMC)研究来测试人HSC工程化iNKT细胞的体外制造。在特定情况下，产生HSC-iNKTATO细胞，它们是在两阶段ATO-αGC培养系统中体外产生的HSC工程化人iNKT细胞。
从三个不同的健康供体收集G-CSF动员的人CD34+HSC，用模拟慢病毒载体Lenti/iNKT-EGFP转导，然后在两阶段ATO-αGC培养系统中体外培养(图3A)。经遗传工程化改造的HSC(标记为GFP+)在人工胸腺类器官(ATO)培养阶段中在8周内有效分化为人iNKT细胞(图3B)，然后在PBMC/αGC刺激阶段进一步再扩增2至3周(图3C)。对于所测试的全部三个供体，该制造过程是稳健且具有高产率和高纯度的(图3D)。根据结果，估计从1x106个输入HSC(约30-50％慢病毒载体转导率)可生产约3-9x1010个HSC-iNKTATO细胞(纯度>95％)，从单个随机供体得到超过1012个治疗性iNKT细胞的理论产率(图3D)
B.初步药理学研究(图4)
进行了初步药理学研究，以研究人HSC工程化iNKT细胞的表型和功能。使用流式细胞术研究人HSC工程化iNKT细胞的表型和功能。HSC-iNKTATO细胞(在体外ATO培养系统中产生的HSC工程化人iNKT细胞)和HSC-iNKTBLT细胞(在体内BLT中产生的HSC工程化人iNKT细胞)(人骨髓-肝-胸腺移植NOD/SCID/γc-/-)人源化小鼠模型显示出类似于内源性PBMC-iNKT细胞的典型iNKT细胞表型和功能：它们表达高水平记忆T细胞标志物CD45RO和NK细胞标志物CD161(图4A)；它们以混合模式(CD4单阳性，CD8单阳性和CD4/CD8双阴性)表达CD4和CD8共受体(图4A)；并且与常规的PBMC-Tc细胞相比，它们产生的效应物细胞因子如IFN-γ和细胞毒性分子穿孔蛋白和粒酶B水平非常高(图4B)。
C.初步效力研究(图5)
进行了初步效力研究，以研究人HSC工程化iNKT细胞的肿瘤杀伤效力。将人多发性骨髓瘤(MM)细胞系MM.1S工程化改造以过表达人CD1d基因以及萤火虫萤光素酶(Fluc)报告基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因(图5A)。然后将所产生的MM.1S-hCD1d-FG细胞系用于在体外混合培养测定法中(图5B)和体内NSG(NOD/SCID/γc-/-)小鼠人类多发性骨髓瘤(MM)转移模型(图5D)中研究iNKT细胞靶向肿瘤杀伤。HSC-iNKTATO细胞和HSC-iNKTBLT细胞在体外均显示出有效且相当的肿瘤杀伤作用(图5C)。还在体内测试了HSC-iNKTBLT细胞，它们介导了稳健的肿瘤杀伤作用(图5E和图5F)。为了研究针对实体瘤的肿瘤杀伤效力，产生了A375-hCD1d-FG人黑素瘤细胞系(图5G)。当在NSG小鼠A375-hCD1d-FG异种移植实体瘤模型中进行测试时(图5H)，HSC-iNKTBLT细胞有效抑制实体黑素瘤肿瘤的生长(图5I)。重要的是，HSC-iNKTBLT细胞显示靶向浸润到肿瘤部位，这可能是由于这些细胞的有力肿瘤运输能力(图5J和图5K)。
D.初步安全研究-GvHD/毒理学/致瘤性(图6)
为了获得人HSC工程化iNKT细胞的体内长期GvHD、毒理学和致瘤性，在HSC转移后5个月的时间段内监测携带HSC-iNKTBLT细胞的BLT人源化小鼠，然后进行组织收集和病理分析(图6)。监测小鼠体重(图6A)，存活率(图6B)和组织病理学(图6C)，揭示与对照BLT小鼠相比，BLT-iNKTTK小鼠无GvHD、无毒性和无致瘤性(图2A)。
E.初步安全研究-用于PET显像和安全控制的sr39TK基因(图7)
研究含有人HSC工程化iNKT(HSC-iNKTBLT)细胞的BLT-iNKTTK人源化小鼠(图7A)。HSC-iNKTBLT细胞由用Lenti/iNKT-sr39TK慢病毒载体转导的人HSC工程化改造而成(图13)。使用结合CT扫描的PET显像，我们检测到遗传工程化人细胞在BLT-iNKTTK小鼠的淋巴样组织，特别是骨髓(BM)和脾脏中的分布(图7B)。用GCV治疗BLT-iNKTTK小鼠有效消减整个身体的遗传工程化人细胞(图7B)。重要的是，GCV诱导的消减是特异性的，通过在BLT-iNKTTK小鼠中选择性消减HSC工程化人iNKT细胞而不是其他人免疫细胞所证明，如通过流式细胞术所测量的(图7C和图7D)。
F.通用HSC工程化iNKT细胞的生产
在具体实施方案中，产生了基于干细胞的治疗组合物，其包含同种异体HSC工程化HLA-I/II阴性人iNKT细胞(表示通用HSC工程化iNKT细胞，UHSC-iNKT细胞)。
产生Lenti-iNKT-sr39TK载体在某些实施方案中，利用临床慢病毒载体Lenti/iNKT-sr39TK(图8A)。
产生CRISPR-Cas9/B2M-CIITA-gRNA复合物在具体实施方案中，将强大的CRISPR-Cas9/gRNA基因编辑工具用于破坏人HSC中B2M和CIITA基因(Ren et al.，2017；Liu etal.，2017)。源自此类基因编辑的HSC的iNKT细胞将缺乏HLA-I/II表达，从而避免宿主T细胞的排斥。在初步研究中，成功生成并测试了CIRSPR-Cas9/B2M-CIITA-gRNA复合物(来自UCBerkeley MacroLab Facility的Cas9；来自Synthego的gRNA；B2M-gRNA序列5’-CGCGAGCACAGCUAAGGCCA-3’(SEQ ID NO:68)(Ren et al.,2017)；CIITA-gRNA序列5’-GAUAUUGGCAUAAGCCUCCC-3’(SEQ ID NO:69)(Abrahimi et al.,2015))。为了最小化“脱靶”效应，可利用来自IDT的高保真Cas9蛋白(Kohn et al.,2016；Slaymaker et al.,2016；Tsai and Joung,2016)。可从预先测试的单个显性B2M-gRNA和CIITA-gRNA开始，但是在特定实施方案中，并入多个gRNA以进一步提高基因编辑效率。
收集G-CSF动员的CD34+HSC可从商业供应商处获得至少两种不同的健康供体的G-CSF动员的leukopaks，然后使用CliniMACS系统分离CD34+HSC。分离后，可将G-CSF动员的CD34+HSC冷冻保存，供后续使用。
遗传工程化改造HSC HSC可用Lenti-iNKT-sr39TK载体和CRISPR-Cas9/B2M-CIITA-gRNA复合物进行工程化改造。可将冷冻保存的CD34+HSC解冻，并在涂有Retronectin的烧瓶中的补充1％HAS和TPO/FLT3L/SCF的X-Vivo-15无血清培养基中培养12小时，然后加入Lenti/iNKT-sr39TK载体，再持续8个小时(Gschweng et al.,2014)。慢病毒载体转导后24小时，可将细胞与预先形成的CIRSPR-Cas9/B2M-CIITA-gRNA复合物混合，并使用LonzaNucleofector进行电穿孔。在初步研究中，使用来自随机供体的CD34+HSC，实现高慢病毒载体转导率(>50％转导率，VCN＝1-3/细胞；图8B)和高HLA-I/II表达缺陷(单轮电穿孔后约60％HLA--I/II双阴性细胞后；图8C)。可进一步优化基因编辑程序以提高效率。评估参数可包括细胞存活力，通过T7E1分析和靶向B2M和CIITA位点的下一代测序(NGS)测量的缺失(indel)频率(中靶效率)(Tsai et al.,2015)，通过流式细胞术测量的HLA-I/II表达，以及通过集落形成单位(CFU)测定测量的经编辑的HSC的造血功能。可获得HSC的30-50％三重基因编辑效率，这在初步研究中在ATO培养后每个输入HSC可产生约100个iNKT细胞(图3)。
产生UHSC-iNKT细胞可在2阶段ATO-αGC体外系统中培养慢病毒载体和CRISPR-Cas9/gRNA双工程化HSC来产生UHSC-iNKT细胞。在阶段1，按照标准规程，将遗传工程化HSC通过人工胸腺类器官(ATO)培养分化为iNKT细胞(图8A)(Seet et al.,2017)。ATO涉及将含有HSC(1x104个)和经辐照(80Gy)的MS5-hDLL1基质细胞(1.5x105个)混合物的细胞浆液(5μl)以液滴形式移液至0.4μm Millicell Transwell插入物中，然后将插入物放入含有1mlRB27培养基的6孔板中(Seet et al.,2017)；每隔4天更换一次培养基，持续8周(Seet etal.,2017)。阶段1的总收获预计包含细胞混合物。可进行纯化步骤，以通过MACS分选(2M2/Tü39mAb介导的阴性选择，然后是6B11 mAb介导的阳性选择)纯化UHSC-iNKT细胞(图8D)。涵盖表明该MACS分类策略的有效性的初步研究(图8E和图8F)。然后，所纯化的UHSC-iNKT细胞进入阶段2培养，用加载到经辐照的匹配供体CD34-PBMC(作为APC)的αGC和IL-7和IL-15补充物刺激(图8A)。根据初步研究(图3)，从每1x106个起始HSC可产生约1010个级别的UHSC-iNKT细胞(纯度>99％)，这从单一随机供体的HSC得到约1012个纯且同质的UHSC-iNKT细胞产品(图8A)。然后可将所产生的UHSC-iNKT细胞冷冻保存，并准备好进行临床前表征。
G.UHSC-iNKT细胞的表征
身份/活性/纯度可使用预先建立的流式细胞术测定法研究UHSC-iNKT细胞产品的纯度、表型和功能(图4)。在特定情况下，实现纯度>99％的UHSC-iNKT细胞(门控为hTCRαβ+6B11+HLA-I/IIneg)。在具体实施方案中，这些UHSC-iNKT细胞表现出典型的iNKT细胞表型(hCD45ROhihCD161hihCD4+/-hCD8+/-)，由于等位基因排斥而不表达检测到的内源TCR(Seetet al.,2017；Smith et al.,2015；Giannoni et al.,2013)，并通过产生过量的效应细胞因子(IFN-γ)和细胞毒性分子(粒酶B，穿孔蛋白)响应PBMC/GC刺激(图4)(Watarai etal.,2008)。
药动学/药效学(PK/PD)通过将UHSC-iNKT细胞过继转移到荷瘤NSG小鼠中，可研究UHSC-iNKT细胞的生物分布和体内动力学。例如，可使用预先建立的A375人黑素瘤实体瘤异种移植模型(图5H)。可进行流式细胞术测定法来研究组织中UHSC-iNKT细胞的存在。按照已建立的方案，可进行PET显像以研究UHSC-iNKT细胞的全身分布(图7)。根据初步研究，在具体实施方案中，UHSC-iNKT细胞可在过继转移后在荷瘤动物中持续存在一段时间，可归巢于淋巴样器官(脾脏和骨髓)，最重要的是，可转运并浸润到实体瘤(图5I至图5K)。
作用机理(MOA)iNKT细胞可通过多种机制靶向肿瘤：1)它们可以通过iNKT TCR刺激直接杀伤CD1d+肿瘤细胞；和2)它们可间接靶向CD1d-肿瘤细胞，通过识别由肿瘤相关抗原呈递细胞(其不断表达CD1d)呈递的肿瘤来源的糖脂，然后激活下游效应细胞(如NK细胞和CTL)来杀伤这些CD1d-肿瘤细胞(图9A)(Vivier et al.，2012)。许多癌细胞产生可刺激iNKT细胞的糖脂，尽管这种“改变的”糖脂性质仍有待阐明(Bendelac et al.，2007)。使用体外直接肿瘤杀伤测定法(图9B)，治疗性替代物HSC-iNKTATO和HSC-iNKTBLT细胞以CD1d/TCR依赖性方式直接杀伤肿瘤细胞(图9C)。使用体外混合培养测定法(图9D)，进一步显示由APC刺激的HSC-iNKTBLT细胞可激活NK细胞杀伤CD1d-HLA-I-/-K562人髓样白血病细胞(图9E)。这些预先建立的测定法可用于研究肿瘤细胞的UHSC-iNKT细胞靶向。在特定实施方案中，UHSC-iNKT细胞可通过直接杀伤和佐剂效应靶向肿瘤。
效力可使用预先建立的体外和体内测定研究UHSC-iNKT细胞的肿瘤杀伤效力(图5)。例如，可使用人血液癌症模型(MM1.S多发性骨髓瘤)和人实体瘤模型(A375黑素瘤)两者(图5)。在某些实施方案中，UHSC-iNKT细胞可在体外和体内有效杀伤MM1.S和A375肿瘤细胞，类似于已在治疗性替代物HSC-iNKTATO和HSC-iNKTBLT细胞中所观察到的(图5)。
安全可从三个方面研究UHSC-iNKT过继疗法的安全，例如：a)一般毒性/致瘤性，b)免疫原性，和c)自杀基因“杀伤开关”。1)按照已建立的方案，可通过将UHSC-iNKT细胞过继转移到NSG小鼠中并在20周的时间段内监测受体小鼠，以终末病理学分析结束来研究UHSC-iNKT细胞的长期GvHD(针对受体动物组织)，毒理学和致瘤性(图6)。预期无GvHD、无毒性和无致瘤性(图6)。2)对于基于免疫细胞的过继疗法，始终存在两个免疫原性问题：a)移植物抗宿主病(GvHD)反应，以及b)移植物抗宿主病(HvG)反应。工程化的安全控制策略减轻UHSC-iNKT细胞产品的可能的GvHD和HvG风险(图10A)。使用已建立的体外混合淋巴细胞培养(MLC)测定法(图10B和图10D)和体内混合淋巴细胞过继转移(MLT)测定法(图10G)研究可能的GvHD和HvG反应。体外MLC测定法的读数可以是通过ELISA分析的IFN-γ产生，而体内MLT测定法的读数可以是通过采血和流式细胞术测定法的靶向细胞的清除(杀伤不匹配供体PBMC作为GvHD反应的测量，或杀伤UHSC-iNKT细胞作为HvG反应的测量)。基于初步研究，在具体实施方案中，UHSC-iNKT细胞不诱导针对宿主动物组织的GvHD反应(图6)，并且不诱导针对不匹配供体PBMC的GvHD反应(图10C)。在具体实施方案中，UHSC-iNKT细胞抵抗HvG诱导的消除。初步研究表明，即使具有HLA-I/II表达，HSC-iNKTATO细胞已是不匹配供体PBMC T细胞的弱靶标(图10E)。在特定情况下，完全没有针对UHSC-iNKT细胞的T细胞介导的HvG反应。有趣的是，初步研究表明，替代的HSC-iNKTBLT细胞抵抗不匹配供体NK细胞的杀伤(图10F)。在某些情况下，UHSC-iNKT细胞缺乏HLA-I表达可能会使这些细胞更容易受到NK杀伤。因此，可测试最终UHSC-iNKT细胞产品。3)按照已建立的方案，可研究通过GCV施用消除受体NSG小鼠中的UHSC-iNKT细胞(图7)。基于初步研究，在安全需要的情况下，sr39TK自杀基因可发挥有力的“杀伤开关”功能来消除UHSC-iNKT细胞。
联合疗法可检查UHSC-iNKT细胞进行联合免疫疗法。特别是，将UHSC-iNKT过继疗法与检查点阻断疗法(例如PD-1和CTLA-4阻断)结合起来具有协同治疗作用(Pilones etal.,2012；Durgan et al.,2011)。可使用预先建立的人黑素瘤实体瘤模型(A375-hCD1d-FG)(图11A)。可进一步工程化改造UHSC-iNKT细胞，以表达靶向癌症的CAR(嵌合抗原受体)或TCR(T细胞受体)，用于下一代通用CAR-iNKT和TCR-iNKT疗法(分别表示为UHSCCAR-iNKT和UHSCTCR-iNKT)(Oberschmidt et al.,2017；Bollino and Webb,2017；Heczey et al.,2014；Chodon et al.,2014)。为了研究UHSCCAR-iNKT疗法，可用编码CD19-CAR基因的慢病毒载体转导UHSC-iNKT细胞(图11B)。同时，作为一个例子，可进一步工程化改造人黑素瘤细胞系A375-hCD1d-FG，以过表达人CD19抗原(图11C)。可使用A375-hCD1d-hCD19-FG肿瘤异种移植模型研究UHSCCAR-iNKT细胞的抗肿瘤效力(图11D)。为了研究UHSCTCR-iNKT疗法，可用编码NY-ESO-1TCR基因的慢病毒载体转导UHSC-iNKT细胞(图11E)。可以进一步工程化改造A375-hCD1d-FG细胞系，以过表达人HLA-A2分子和NY-ESO-1抗原(图11F)。可使用A375-hCD1d-A2/ESO-FG肿瘤异种移植模型研究UHSCTCR-iNKT细胞的抗肿瘤效力(图11G)。
H.药理学实施方案
UHSC-iNKT疗法的药物机制UHSC-iNKT是至少在某些情况下通过以下方式产生的细胞产品：1)对供体HSC进行遗传修饰，以通过慢病毒载体表达iNKT TCR，并通过基于CRISPR/Cas9的基因编辑敲除HLA；2)通过ATO培养体外分化为iNKT细胞；3)体外iNKT细胞扩增；以及4)配制和冷冻保存。在至少一些实施方案中，一旦输注入患者体内，该细胞产品就可采用多种机制靶向和根除肿瘤细胞。输注的细胞可通过细胞毒性直接识别并杀伤CD1d+肿瘤细胞。它们可分泌诸如IFN-γ的细胞因子来激活NK细胞杀伤HLA阴性肿瘤细胞，还可激活DC，其然后刺激细胞毒性T细胞杀伤HLA阳性肿瘤细胞。因此，可利用一系列体外和体内研究来证明该细胞产品用于癌症疗法的药理学功效。
体外表面和功能表征本文提供了产生UHSC-iNKT细胞的有效方案。还证明了HSC的有效基因编辑，以通过敲除B2M来消除I类HLA的表达。利用多重编辑CRISPR/Cas9，使用经验证的gRNA序列(Abrahimi et al.,2015)，还可通过敲除II类反式激活物(CIITA)，HLA-II表达的关键调节因子(Steimle et al.,1994))的基因同时破坏II类HLA表达。因此，掺入破坏HLA-I和HLA-II表达的此基因编辑步骤以及微珠纯化步骤，可产生UHSC-iNKT细胞(在本文其他地方提供细节)。可将流式细胞术测定法用于测量这些工程化iNKT细胞的纯度和表面表型。细胞纯度可通过Vα24-Jα18(6B11)+HLA-I/IIneg来表征。在至少某些情况下，该iNKT细胞群应当为CD45RO+CD161+，指示记忆和NK表型，并且包含CD4+CD8-(CD4单阳性)，CD4-CD8+(CD8单阳性)和CD4-CD8-(双阴性，DN)(Kronenbergand Gapin，2002)。可分析CD62L表达，因为最近研究表明其表达与iNKT细胞的体内持久性及其抗肿瘤活性有关(Tian et al.,2016)。可将UHSC-iNKT的这些表型与来自PBMC的iNKT的表型进行比较。可采用RNAseq对UHSC-iNKT和PBMC iNKT细胞进行比较基因表达分析。
使用PBMC iNKT作为基准对照，可将IFN-γ产生和细胞毒性测定法用于评估UHSC-iNKT的功能特性。可用已被αGalCer脉冲的经辐照的PBMC模拟UHSC-iNKT细胞，并对从一天刺激所收获的上清液进行IFN-γELISA(Smith et al,.2015)。刺激6小时后，还可对iNKT细胞进行IFN-γ的细胞内细胞因子染色(ICCS)。细胞毒性测定法可通过将效应UHSC-iNKT细胞与经工程化以表达萤光素酶和GFP的负载αGC的A375.CD1d靶细胞温育4小时来进行，并且细胞毒性可通过酶标仪测量其发光强度。由于sr39TK作为PET/自杀基因引入，因此可通过将UHSC-iNKT与更昔洛韦(GCV)温育来验证其功能，并且细胞存活率可通过MTT测定法和基于膜联蛋白V的流式细胞术测定法来测量。
药动学/药效学(PK/PD)研究PK/PD研究在动物模型中体内可确定：1)所输注UHSC-iNKT的扩增动力学和持久性；2)UHSC-iNKT在各种组织/器官中的生物分布；3)UHSC-iNKT转运至肿瘤的能力以及这种过滤与肿瘤生长如何相关。可利用负荷A375.CD1d(A375.CD1d)肿瘤的免疫缺陷NSG小鼠作为实体瘤动物模型。研究设计在图11中概述。可研究细胞剂量组的两个示例(1x106和10x106；n＝8)。可在第-4天接种(s.c.)肿瘤，在第0天进行基线PET显像和采血。随后，可静脉内(i.v.)输注UHSC-iNKT细胞，并通过以下监测：1)在第7和21天对活体动物进行PET显像；2)在第7、14和21天定期采血；3)在第21天动物终止后收集终点组织。各次采血中收集的细胞可通过流式细胞术测定法；在特定实施方案中，iNKT细胞是TCRαβ+6B11+。可检查其他标志物如CD45RO、CD161、CD62L和CD4/CD8的表达，以了解iNKT亚群如何随时间变化。通过sr39TK进行PET显像将允许追踪肿瘤和其他组织/器官如骨骼、肝脏、脾脏、胸腺等中iNKT细胞的存在。在研究结束时，可收获肿瘤和小鼠组织(包括脾脏、肝脏、脑、心脏、肾脏、肺、胃、骨髓、卵巢、肠等)进行qPCR分析，从而检测UHSC-iNKT细胞的分布。
体内抗肿瘤效力通过用递增剂量(1x106、5x106、10x106)的UHSC-iNKT细胞(每组n＝8)治疗荷瘤NSG小鼠来测量体内药理学反应；包括PBS治疗作为对照。可使用两个肿瘤模型作为例子。可将A375.CD1d(1x106 s.c.)用作实体瘤模型，可将MM.1S.Luc(5x106 i.v.)用作血液系统恶性肿瘤模型。通过测量大小(A375.CD1d)或生物发光成像(MM.1S.Luc)来监测肿瘤的生长。抗肿瘤免疫反应可通过PET显像，定期采血和终点肿瘤收获，然后进行流式细胞术和qPCR进行测量。响应UHSC-iNKT治疗而抑制肿瘤生长表明所提议UHSC-iNKT细胞疗法的治疗功效。肿瘤抑制与iNKT剂量的相关性确认iNKT细胞的治疗作用，并可以为人类治疗指示有效的治疗窗口。检测iNKT细胞对肿瘤的反应证明这些细胞在体内的药理抗肿瘤活性。
作用机制(MOA)已知iNKT细胞靶向肿瘤细胞，通过直接杀伤，或通过大量释放IFN-γ以引导NK和CD8T细胞以根除肿瘤(Fujii et al.，2013)。体外药理学研究提供了直接细胞毒性的证据。在此可研究NK和CD8 T细胞在体内协助抗肿瘤反应中的可能作用。可用单独的(基于上述体内研究选择剂量)或与PBMC(不匹配供体，5x106)联合的UHSC-iNKT输注荷瘤NSG小鼠(A375.CD1d或MM.1S.Luc)；由于UHSC-iNKT的MHC阴性，因此UHSC-iNKT与无关PBMC之间预期无同种异体免疫反应。可监测肿瘤生长，并且在有PBMC组和无PBMC组之间比较(每组n＝8)。如果从联合组观察到更大的抗肿瘤反应，则它表明至少在具体实施方案中，PBMC中的组分，推测NK和/或CD8 T细胞，发挥促进治疗功效的作用。为了进一步确定它们各自的作用，可将消减NK(通过CD56珠)、CD8 T细胞(通过CD8珠)或髓样细胞(通过CD14珠)的PBMC与UHSC-iNKT细胞一起共同输注至荷瘤小鼠。已显示免疫检查点抑制剂如PD-1和CTLA-4调节iNKT细胞的功能(Pilones et al.，2012；Durgan et al.，2011)。例如，通过在UHSC-iNKT疗法中添加抗PD-1或抗CTLA-4治疗，可理解这些分子如何调节UHSC-iNKT疗法，并为联合癌症治疗的设计提供有价值的指导。
I.化学、制造和控制的实施方案
CMC概述在某些实施方案中，制造UHSC-iNKT涉及：1)收集G-CSF动员的leukopak；2)将G-CSF-leukopak纯化至CD34+HSC中；3)用慢病毒载体Lenti/iNKT-sr39TK转导HSC；4)通过CRISPR/Cas9对B2M和CIITA进行基因编辑；5)通过ATO体外分化为iNKT细胞；6)纯化iNKT细胞；7)体外细胞扩增；8)细胞收集、配制和冷冻保存(图14)。作为示例，存在两种药物物质(Lenti/iNKT-sr39TK载体和UHSC-iNKT细胞)，并且至少在一些情况下，最终药物产品是被配制并冷冻保存于输液袋中的UHSC-iNKT。
1.载体制造
载体结构用于将HSC遗传工程化至iNKT细胞中的一种载体是HIV-1来源的慢病毒载体Lenti/iNKT-sr39TK，其编码人iNKT TCR基因以及sr39TK PET显像/自杀基因(图13)。这种第三代自失活(SIN)载体的关键组分是：1)3'自失活长期重复序列(ΔLTR)；2)Ψ区域载体基因组包装信号；3)Rev应答元件(RRE)以增强未剪接载体RNA的核输出；4)中央聚嘌呤区(cPPT)，以利于载体基因组的不明确输入；5)人iNKT TCR的α链基因(TCRα)和β链基因(TCRβ)的表达盒，以及由来自鼠干细胞病毒(MSCV)的内部启动子驱动的PET/自杀基因sr39TK(Gscheng et al.,2014)。iNKT TCRα和TCRβ和sr39TK基因均经密码子优化，并通过2A自切割序列(T2A和P2A)连接以实现它们的最优共表达(Gscheng et al.，2014)。
载体的质量控制可进行一系列QC分析以确保载体产品具有高质量。诸如载体身份、载体物理滴度和载体纯度(无菌性、支原体、病毒污染物、有复制能力的慢病毒(RCL)检测、内毒素、残留DNA和benzonase)的那些标准分析可以IU VPF进行，并在分析证明(COA)中提供。可进行的其他QC测定包括：1)转导/生物滴度(通过用连续稀释转导HT29细胞并进行ddPCR，≥1x106TU/ml)；2)载体原病毒完整性(通过测序所转导HT29细胞基因组DNA的载体整合部分，与原始载体质粒序列相同)；3)载体功能。可通过转导人PBMC T细胞来测量载体功能(Chodon et al.，2014)。iNKT TCR基因的表达可通过用iNKT TCR特异的6B11染色来检测(Montoya et al.，2007)。所表达iNKT TCR的功能可通过响应αGalCer刺激的IFN-γ产生进行分析(Watarai et al.，2008)。sr39TK基因的表达和功能可通过喷昔洛韦更新测定法和GCV杀伤测定法进行分析(Gschweng et al.，2014)。载体原液(保存于-80冷冻器)的稳定性可每隔3个月通过测量其转导滴度来检测。可验证这些QC测定。
2.细胞制造和产品配制
制造UHSC-iNKT细胞的概述UHSC-iNKT细胞是将充当“活体药物”来靶向并对抗肿瘤细胞的一种药物物质实施方案。它们是通过遗传修饰的供体HSC的体外分化和扩增产生的。初步数据证明以实验室规模生产它们的新颖有效方案。为了使它们成为“现成”细胞产品，可开发和验证等同GMP的制造过程。例如，生产规模的目标是每批1012个细胞，估计治疗1000-10,000名患者。
细胞生产过程图13中概述了细胞制造过程的一种实施方案，具有明确的时间表和每个过程步骤的关键“中间过程控制(IPC)”测量值。步骤1是在采血设施中收获供体G-CSF动员的PBSC，其已成为许多医院的常规程序(Deotare et al.，2015)。对于本项目，可从HemaCare获得Leukopaks中的新鲜PBSC；HemaCare具有IRB批准的收集协议和捐赠者同意书，并且可支持临床试验和商业产品生产(申请中包括来自Hemacare的支持信)。步骤2是使用CliniMACS系统从PBSC中富集CD34+HSC；可使用位于UCLA GMP设施中的这种系统来完成此步骤，并期望产生至少108个CD34+细胞。也收集和保存CD34-细胞(其在步骤7中可用作PBMC饲养者)。
步骤3涉及HSC培养和载体转导。在涂有Retronectin的烧瓶中，将CD34+细胞在补充有1％HAS(USP)和生长因子混合物(c-kit配体、flt-3配体和tpo；各自为50ng/ml)的X-VIVO15培养基中培养12小时，然后添加Lenti/iNKT-sr39TK载体，再持续8小时(Gschwenget al.，2014)。载体整合拷贝(VCN)通过对所转导细胞的甲基纤维素测定中形成的约50个菌落取样来测量，每个细胞的平均载体拷贝数可使用ddPCR来确定(Nolta et al.，1994)。在至少某些情况下，VCN＝1-3/细胞时可常规实现>50％的转导。
步骤4是利用强大的CRISPR/Cas9多重基因编辑方法靶向HSC中的B2M和CIITA基因组基因座并破坏它们的基因表达(Ren et al.，2017；Liu et al.，2017)，并且源自经编辑的HSC的iNKT细胞将缺乏MHC/HLA表达，从而避免宿主免疫系统的排斥。初步数据表明，通过电穿孔Cas9/B2M-gRNA以高效率对CD34+HSC的B2M破坏获得成功(通过流式分析得到约75％)。B2M/CIITA双敲除可通过电穿孔RNP混合物(Cas9/B2M-gRNA和Cas9/CIITA-gRNA(Abrahimi et al.，2015))来实现。可通过改变电穿孔参数、两种RNP的比例、电穿孔前干细胞培养时间(转导后24、48或72小时)等来优化和验证该过程(Gundry et al.，2016)；可使用来自IDT的高保真Cas9蛋白(Slaymaker et al.，2016；Tsai and Joung，2016)来最小化“脱靶”效应。评估参数可以是例如存活力，通过T7E1测定和靶向B2M和CIITA位点的下一代测序(NGS)所测量的缺失(indel)频率(中靶效率)，通过流式细胞术得到的MHC表达，以及通过集落形成单位(CFU)测定所测量的经编辑的HSC的造血功能。
步骤5是通过人工胸腺类器官(ATO)培养(Seet et al.，2017)将经修饰的CD34+HSC体外分化为iNKT细胞。初步研究已经表明，功能性iNKT细胞可从经工程化改造以表达iNKT TCR的HSC有效地产生。根据此数据，可测试并验证符合GMP的8周ATO培养过程，以从108个经修饰的CD34+HSC产生1010个iNKT细胞。ATO涉及将含有HSC(5x104)和经辐照(80Gy)的MS5-hDLL1基质细胞(106)混合物的细胞浆液(5μl)以液滴形式移液至0.4μm MillicellTranswell插入物，然后将插入物放置到含1ml RB27培养基的6孔板中(Seet et al.，2017)；培养基每隔4天更换一次，持续8周。考虑到每个插入物3个ATO，每批生产可能需要大约170个六孔板。可使用置于用于分配ATO液滴和更换培养基的生物安全柜中的自动可编程移液/分液系统(Eppendorf的EpMontion 5070f)；完成每轮170个平板可能需要操作2小时。在ATO培养结束时，收获并表征iNKT细胞。作为一个实例，ATO组分是MS5-hDLL1基质细胞系，其通过慢病毒转导表达人DLL1，接着进行细胞分选而构建。在准备GMP过程的一个实施方案中，可对该多克隆细胞群进行单细胞克隆选择过程，以建立几个克隆MS5-hDLL1细胞系，从所述细胞系中可选择有效的细胞系(通过ATO培养评估)并且使用它产生主细胞库。一旦经验证，此库可用于为将来的临床级ATO培养提供经辐照的基质细胞。
步骤6是使用CliniMACS系统纯化ATO来源的iNKT细胞。该步骤纯化是为了消减MHCI+和MHCII+细胞并富集iNKT+细胞。抗MHCI和抗MHCII珠可通过将Miltenyi抗生物素珠与以下温育来制备：可商购的生物素化抗B2M(克隆2M2)，抗MHCI(克隆W6/32，HLA-A，B，C)，抗MHCII(克隆Tu39，HLA-DR，DP，DQ)和抗TCRVα24-Jα18(克隆6B11)抗体；直接涂有6B11抗体的微珠也可从Miltenyi Biotec获得。所收获的iNKT细胞用抗MHC珠混合物标记，洗涤两次，并使用CliniMACS消减程序消减MHCI+和/或MHCII+细胞；如果需要，可重复消减步骤以进一步除去残留的MHC+细胞。随后，使用标准抗iNKT珠和CliniMACS富集程序进一步纯化iNKT细胞。细胞纯度可通过流式细胞术测量。
步骤7是在体外扩增所纯化的iNKT细胞。从1010个细胞开始，可使用已经验证的基于PBMC饲养者的体外扩增方案(Yamasaki et al.，2011；Heczey et al.，2014)扩增到1012个iNKT细胞。可评估用于这种细胞扩增的基于G-Rex的生物过程。G-Rex是细胞生长瓶，其底部具有透气膜，允许更有效地进行气体交换；G-Rex500M瓶具有在10天内支持100倍的细胞扩增的能力(Vera et al.，2010；Bajgain et al.，2014；Jin et al.，2012)。将步骤1中保存的CD34-细胞(用作饲养细胞)解冻，用αGalCer(100ng/ml)脉冲，然后辐照(40Gy)。可将iNKT细胞与经辐照的饲养细胞混合(比例为1:4)，接种到G-Rex烧瓶(各1.25x108个iNKT，80个瓶)，并允许扩增2周。每隔2至3天添加IL-2(200U/ml)，并且在第7天进行一次培养基更换；蠕动泵可实现所有培养基操作。这种扩增过程应当符合GMP，因为类似的基于PBMC饲养者的扩增程序(称为快速扩增方案)已被许多临床试验利用来生产治疗性T细胞(Dudley etal.，2008；Rosenberg et al.，2008)。
步骤8是将步骤7中收获的iNKT细胞(活性药物成分)配制成细胞悬液用于直接输注。至少全面清洗3轮后，可对步骤7中的细胞进行计数并将其悬浮在输注/冷藏兼容溶液(107至108个细胞/ml)中，该溶液由以下组成：Plasma-Lyte A注射液(31.25％v/v)，右旋糖和氯化钠注射液(31.25％v/v)、人白蛋白(20％v/v)、右旋糖注射液中的葡聚糖40(10％，v/v)和Cryoserv DMSO(7.5％，v/v)；该溶液已被用于配制Novartis的批准的T细胞产品tisagenlecleucel(Grupp et al.，2013)。一旦装入FDA批准的冷冻袋(如Miltenyi Biotec的CryoMACS冷冻袋)，就可将产品在可控速率的冷冻器中冷冻并保存在液氮冷冻器中。可通过测量存活力和回收率进行验证和/或优化研究，以确保该配制剂适合我们的UHSC-iNKT细胞产品。
生物加工和产品的质量控制可将诸如细胞计数、存活力、无菌性、支原体、身份、纯度、VCN等的各种IPC检测并入所建议的生物过程中，以确保高质量生产。所建议的产品放行测试包括：1)外观(颜色、不透明度)；2)细胞存活力和计数；3)通过qPCR得出iNKT TCR的身份和VCN；4)通过iNKT阳性和B2M阴性获得纯度；5)内毒素；6)无菌性；7)支原体；8)通过响应αGalCer刺激的IFN-γ释放测量的潜能；9)RCL(有复制能力的慢病毒)(Cornetta et al.，2011)。这些测定大多数是标准生物学测定或该产品特有的可被验证的特定测定。产品稳定性测试可通过定期解冻LN储存袋并测量其细胞存活力、纯度、回收、效力(IFN-γ释放)和无菌性来进行。在特定实施方案中，该产品稳定至少一年。
J.安全实施方案
体外和体内致瘤性和体内急性毒性可评估UHSC-iNKT细胞转化或自主增殖的潜力。体外测定法包括：1)G带核型分析，其可在αGalCer再刺激的活跃分裂的UHSC-iNKT细胞上进行，以确定是否维持正常核型；2)细胞产品的稳态增殖(无刺激)，其可通过流式细胞术测定法细胞-标记的PKH染料稀释物来测量(将αGalCer刺激的细胞群用作增殖阳性对照)(Hurton et al.，2016)；3)软琼脂集落形成测定法(Horibata et al.，2015)，其可用于评估iNKT细胞产品的锚定非依赖性生长能力。通过分析各种所收获组织/器官的任何异常并通过测量血液、脾脏、骨髓和肝脏中存在的iNKT细胞的任何异常增殖(Hurton et al.，2016)，将用107个iNKT细胞输注的NSG幼稚小鼠用于检测体内的致肿瘤性和长期毒性(4至6个月，n＝6)；对照组可以是用PBMC纯化的iNKT细胞转移的小鼠。可通过用低剂量(106)或高剂量(107)iNKT细胞输注幼稚NSG小鼠实施初步体内急性毒性。然后可观察小鼠(n＝8)的体重和食物消耗的任何变化，以及任何异常行为达2周。2周后，可对小鼠实施安乐死并采集血液进行血液学和血清化学分析(UCSD鼠科动物血液学和凝血中心实验室(UCSD murinehematology and coagulation core lab))；可收获各种小鼠组织并提交给UCLA中心进行病理分析。
体内和体外同种异体移植相关的安全测试UHSC-iNKT疗法具有同种异体移植性质，因而可评估其相关安全。首先可通过标准双向体外混合淋巴细胞反应(MLR)测定法(Bromelow et al.，2001)来确定同种异体反应的可能性。可将UHSC-iNKT细胞与不匹配供体PBMC(至少三个不同供体批次)混合，并且可通过BrdU掺入实验来测量T细胞增殖。对于GvHD研究，UHSC-iNKT可能是应答细胞，而PBMC可能是刺激细胞；可将反向设置用于研究HvG反应性；在温育前辐照刺激细胞。还可采用体内NSG小鼠模型来评估体内GvHD和HvG反应。可用UHSC-iNKT(5x106，第1组)，人PBMC(5x106，第2组)或组合(各5x106，第3组)输注小鼠。观察小鼠的任何毒性体征(体重减轻、行为等)2个月。可分析来自每两周一次小鼠采血的单个核细胞中人T细胞激活标志物(hCD69和hCD44上调，hCD62L下调)；UHSC-iNKT、人PBMC来源的CD8+T和人PBMC来源的CD4+T细胞可分别通过hCD45+6B11+、hCD45+6B11-TCRαβ+CD8+和hCD45+6B11-TCRαβ+CD4+来鉴别。与第1组和第2组相比，第3组小鼠中没有激活iNKT细胞和没有消减PBMC表明没有GvHD反应，而第3组小鼠中没有激活PBMC CD8/CD4 T细胞和没有消减UHSC-iNKT细胞可表明没有HvG反应。
慢病毒载体安全和与基因编辑相关的脱靶分析作为产品放行测试，可测量RCL实验以确保患者未无意中暴露于复制病毒。还可从UHSC-iNKT细胞中提取基因组DNA，并提交其用于慢病毒整合位点测序(Applied Biological Materials Inc.)，以检测除已知慢病毒整合模式以外的任何异常整合。为了分析与基因编辑相关的脱靶效应，可使用来自MIT的CRISPR设计工具来预测潜在的脱靶位点，并通过对UHSC-iNKT细胞基因组DNA进行靶向再测序来评估/确认它们。此外，在用Cas9/B2M-gRNA和Cas9/CIITA-gRNA RNPs和dsODN标签电穿孔的K562细胞中，可使用GUILDE-seq对脱靶位点进行无偏全基因组扫描(Tsai et al.，2015)；然后这些脱靶位点可通过UHSC-iNKT细胞中的NGS进行分析，以检测脱靶活性的频率。
实施例2：HSC-iNKT细胞通过NK细胞样路径的抗肿瘤效力
A.药理学研究(图1)
体外产生的HSC工程化iNKT(HSC-iNKT)细胞显示NK细胞样表型和功能(图15)。有趣的是，与分离自健康供体PBMC的天然NK细胞(PBMC-NK细胞)相比，HSC-iNKT细胞表达更高水平的NK激活受体(如NKG2D和DNAM-1)，更高水平的细胞毒性分子(如穿孔蛋白和粒酶B)，但未检测到NK抑制受体(如KIR)水平(图15)。这些结果表明，HSC-iNKT细胞可表现出比天然NK细胞更强的NK细胞样肿瘤细胞靶向和杀伤能力。
B.体外效力和MOA研究(图2)
在使用体外肿瘤细胞杀伤测定法研究时(图16A)，HSC-iNKT细胞显示对PBMC-NK细胞杀伤敏感的肿瘤细胞的增强的杀伤，例如K562人慢性骨髓性白血病细胞(图16B)。最令人印象深刻的是，HSC-iNKT细胞有效杀伤对PBMC-NK细胞杀伤不敏感的多种人血液癌和实体瘤细胞系，包括MM.1S人多发性骨髓瘤细胞系(图16E)，A375人黑素瘤细胞系(图16C)，PC3人前列腺癌细胞系(图16D)和H292人肺癌细胞系(图16F)。此外，与PBMC-iNKT细胞不同，HSC-iNKT细胞在冷冻/解冻循环后很大程度上保持其杀伤能力，这表明HSC-iNKT细胞可被配制成冷冻细胞产品用于“现成”疗法(图16B-2F)。通过刺激NK激活受体来诱导这些肿瘤细胞的HSC-iNKT细胞杀伤，这由NKG2D和DNAM-1阻断抗体降低肿瘤细胞杀伤效力证明(图16G)。
C.体内效力和安全研究(图3)
HSC-iNKT细胞的体内抗肿瘤效力使用A375-IL-15-FG人黑素瘤异种移植NSG小鼠模型进行研究(图17A)。HSC-iNKT细胞的过继转移显著抑制肿瘤生长(图17B至图17D)。重要的是，在接受HSC-iNKT细胞转移的荷瘤动物中未观察到毒性和组织异常，表明HSC-iNKT细胞安全。
尽管已经详细描述了本公开及其优点，但是应当理解的是，在不脱离由所附权利要求限定的设计的精神和范围的情况下，可在本文中进行各种改变、替换和变更。此外，本申请的范围不旨在限于说明书中描述的过程、设备、制造、物质组成、手段、方法和步骤的特定实施方案。如本领域的普通技术人员将从本公开容易地理解的是，根据本公开，可利用与本文所述相应实施方案执行基本相同功能或实现基本相同结果的目前存在或随后被开发的过程、设备、制造、物质组成、手段、方法或步骤。因此，所附权利要求旨在将这样的过程、设备、制造、物质组成、手段、方法或步骤包括在其范围内。
参考文献
说明书中提到的所有专利和出版物均表明本发明所属领域技术人员的水平。所有专利和出版物都通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物均被明确地和单独地指出通过引用并入一样。
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专利和专利申请
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美国专利号6,833,269
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美国专利申请号2002/0168707
美国专利申请号2003/0159161
美国专利申请号2003/0022367
美国专利申请号2003/0051263
美国专利申请号2003/0055020
美国专利申请号2004/0014191
美国专利申请号2004/0265839
美国专利申请号2004/0064842
美国专利申请号2014/0369979
美国专利申请号2014/0242033
PCT专利申请号PCT/US94/09760
PCT专利申请号PCT/US94/08574
PCT专利申请号PCT/US94/10501
序列表
<110> 加利福尼亚大学董事会
<120> 基于干细胞工程化INKT细胞的现成细胞疗法
<130> UCLA.P0063WO
<140> 未知
<141> 2019-06-12
<150> US 62/683,750
<151> 2018-06-12
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 75
<212> DNA
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<220>
<223> iNKT TCR-alpha链克隆序列
<400> 1
gtgggcgata gaggttcagc cttagggagg ctgcattttg gagctgggac tcagctgatt 60
gtcatacctg acatc 75
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gccagcggtg atgctcgggg ggggggaaat accctctatt ttggaaaagg aagccggctc 60
attgttgtag aggat 75
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gccagcggtg aggggacagc aaacacagaa gtcttctttg gtaaaggaac cagactcaca 60
gttgtagagg at 72
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gtagaggat 69
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gtagaggac 69
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agcagtgacc ggacaggcgt gaacactgaa gctttctttg gacaaggcac cagactcaca 60
gttgtagagg ac 72
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<220>
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gttgtagagg ac 72
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ccagattcca tggttttcgg cacattg 27
<210> 16
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<212> DNA
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<220>
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<400> 16
ggagatatcc ctgatggata caaggcctcc 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> iNKT TCR-beta链反向引物
<400> 17
gggtagcctt ttgtttgttt gcaatctctg 30
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR-alpha链cDNA
<400> 18
atgaaaaagc atctgacgac cttcttggtg attttgtggc tttattttta tagggggaat 60
ggcaaaaacc aagtggagca gagtcctcag tccctgatca tcctggaggg aaagaactgc 120
actcttcaat gcaattatac agtgagcccc ttcagcaact taaggtggta taagcaagat 180
actgggagag gtcctgtttc cctgacaatc atgactttca gtgagaacac aaagtcgaac 240
ggaagatata cagcaactct ggatgcagac acaaagcaaa gctctctgca catcacagcc 300
tcccagctca gcgattcagc ctcctacatc tgtgtggtga gcgacagagg ctcaaccctg 360
gggaggctat actttggaag aggaactcag ttgactgtct ggcctgatat ccagaaccct 420
gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc 480
accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca 540
gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg 600
agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac 660
accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa 720
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aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagctg a 831
<210> 19
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR-alpha链cDNA密码子优化
<400> 19
atgaaaaagc atctgacaac attcctggtc attctgtggc tgtacttcta ccgaggcaac 60
ggcaaaaatc aggtggagca gtccccacag tccctgatca ttctggaggg gaagaactgc 120
actctgcagt gtaattacac cgtgtctccc tttagtaacc tgcgctggta taaacaggac 180
accggacgag gacccgtgag cctgacaatc atgactttct cagagaacac aaagagcaat 240
ggacggtaca ccgctacact ggacgcagat accaaacaga gctccctgca catcacagca 300
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<211> 276
<212> PRT
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<220>
<223> 人iNKT TCR-alpha链
<400> 20
Met Lys Lys His Leu Thr Thr Phe Leu Val Ile Leu Trp Leu Tyr Phe
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Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Gln Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu
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Ile Ile Leu Glu Gly Lys Asn Cys Thr Leu Gln Cys Asn Tyr Thr Val
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Gly Arg Tyr Thr Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Lys Gln Ser Ser Leu
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His Ile Thr Ala Ser Gln Leu Ser Asp Ser Ala Ser Tyr Ile Cys Val
100 105 110
Val Ser Asp Arg Gly Ser Thr Leu Gly Arg Leu Tyr Phe Gly Arg Gly
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Thr Gln Leu Thr Val Trp Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
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Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe
145 150 155 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
165 170 175
Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
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Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys
195 200 205
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210 215 220
Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
225 230 235 240
Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg
245 250 255
Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
260 265 270
Leu Trp Ser Ser
275
<210> 21
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR-beta链cDNA (D/J/N区前)
<400> 21
atgactatca ggctcctctg ctacatgggc ttttattttc tgggggcagg cctcatggaa 60
gctgacatct accagacccc aagatacctt gttataggga caggaaagaa gatcactctg 120
gaatgttctc aaaccatggg ccatgacaaa atgtactggt atcaacaaga tccaggaatg 180
gaactacacc tcatccacta ttcctatgga gttaattcca cagagaaggg agatctttcc 240
tctgagtcaa cagtctccag aataaggacg gagcattttc ccctgaccct ggagtctgcc 300
aggccctcac atacctctca gtacctctgt gccagc 336
<210> 22
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR-beta链cDNA密码子优化
<400> 22
atgaccatcc ggctgctgtg ctacatgggc ttctattttc tgggggcagg cctgatggaa 60
gccgacatct accagactcc cagatacctg gtcatcggaa ccgggaagaa aattacactg 120
gagtgttccc agacaatggg ccacgataag atgtactggt atcagcagga ccctgggatg 180
gaactgcacc tgatccatta ctcctatggc gtgaactcta ccgagaaggg cgacctgagc 240
agcgaatcca ccgtctctcg aattaggaca gagcactttc ctctgactct ggaaagcgcc 300
cgaccaagtc atacatcaca gtacctgtgc gctagc 336
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR-beta链
<400> 23
Met Thr Ile Arg Leu Leu Cys Tyr Met Gly Phe Tyr Phe Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Leu Met Glu Ala Asp Ile Tyr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Val Ile
20 25 30
Gly Thr Gly Lys Lys Ile Thr Leu Glu Cys Ser Gln Thr Met Gly His
35 40 45
Asp Lys Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Asp Pro Gly Met Glu Leu His Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Asn Ser Thr Glu Lys Gly Asp Leu Ser
65 70 75 80
Ser Glu Ser Thr Val Ser Arg Ile Arg Thr Glu His Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Arg Pro Ser His Thr Ser Gln Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 24
gtagcggttg ggccccaaga gacccagtac ttcgggccag gcacgcggct cctggtgctc 60
<210> 25
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 25
gtggcagtcg gacctcagga gacccagtac ttcggacccg gcacccgcct gctggtgctg 60
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 26
Val Ala Val Gly Pro Gln Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg
1 5 10 15
Leu Leu Val Leu
20
<210> 27
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 27
agtgggccag ggtacgagca gtacttcggg ccgggcacca ggctcacggt caca 54
<210> 28
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 28
tcaggacccg gctacgagca gtatttcggc cccggaactc ggctgaccgt gacc 54
<210> 29
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 29
Ser Gly Pro Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
1 5 10 15
Val Thr
<210> 30
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 30
agtccccaat taaacactga agctttcttt ggacaaggca ccagactcac agttgta 57
<210> 31
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 31
tctccacagc tgaacaccga ggccttcttc gggcagggca caaggcttac cgtggtg 57
<210> 32
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 32
Ser Pro Gln Leu Asn Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu
1 5 10 15
Thr Val Val
<210> 33
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 33
agtgaattgc gggcgctcgg gcccagctcc tataattcac ccctccactt tgggaacggg 60
accaggctca ctgtgaca 78
<210> 34
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 34
tccgaactcc gagccctggg gcctagctcc tacaatagcc ccctgcactt tggcaacgga 60
accaggctga cggtcacc 78
<210> 35
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 35
Ser Glu Leu Arg Ala Leu Gly Pro Ser Ser Tyr Asn Ser Pro Leu His
1 5 10 15
Phe Gly Asn Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr
20 25
<210> 36
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 36
agtgaacagg ggactactgc gggagctttc tttggacaag gcaccagact cacagttgta 60
<210> 37
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 37
tccgaacagg gaaccacagc aggagccttc ttcggtcagg gaacaagact gacagtcgtg 60
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 38
Ser Glu Gln Gly Thr Thr Ala Gly Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg
1 5 10 15
Leu Thr Val Val
20
<210> 39
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 39
agtgagtcac gacatgcgac aggaaacacc atatattttg gagagggaag ttggctcact 60
gttgta 66
<210> 40
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 40
agcgagagca ggcacgcaac cgggaacacc atatactttg gcgagggctc ctggctgact 60
gtggtg 66
<210> 41
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 41
Ser Glu Ser Arg His Ala Thr Gly Asn Thr Ile Tyr Phe Gly Glu Gly
1 5 10 15
Ser Trp Leu Thr Val Val
20
<210> 42
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 42
agtgtacccg ggaacgacag gggcaatgaa aaactgtttt ttggcagtgg aacccagctc 60
tctgtcttg 69
<210> 43
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 43
tccgtgcctg gcaacgatag aggtaacgag aagctgtttt tcggatccgg cacacagctg 60
tctgtcctg 69
<210> 44
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 44
Ser Val Pro Gly Asn Asp Arg Gly Asn Glu Lys Leu Phe Phe Gly Ser
1 5 10 15
Gly Thr Gln Leu Ser Val Leu
20
<210> 45
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 45
agtgaagggg ggggccttaa gctagccaaa aacattcagt acttcggcgc cgggacccgg 60
ctctcagtgc tg 72
<210> 46
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 46
agtgagggag ggggactgaa gctggctaag aatattcagt acttcggcgc cggcactaga 60
ctgtctgtgc tg 72
<210> 47
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 47
Ser Glu Gly Gly Gly Leu Lys Leu Ala Lys Asn Ile Gln Tyr Phe Gly
1 5 10 15
Ala Gly Thr Arg Leu Ser Val Leu
20
<210> 48
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 48
agtgaattcg cctcttcggt acgtggaaac accatatatt ttggagaggg aagttggctc 60
actgttgta 69
<210> 49
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 49
tctgagttcg cgagcagcgt ccggggtaat accatttact tcggggaagg cagctggctg 60
accgtggtg 69
<210> 50
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 50
Ser Glu Phe Ala Ser Ser Val Arg Gly Asn Thr Ile Tyr Phe Gly Glu
1 5 10 15
Gly Ser Trp Leu Thr Val Val
20
<210> 51
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 51
agtgcggcat taggccggga gacccagtac ttcgggccag gcacgcggct cctggtgctc 60
<210> 52
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 52
tctgcagccc ttggccgaga gactcagtac ttcggccctg gcacaagact gctcgtgctc 60
<210> 53
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 53
Ser Ala Ala Leu Gly Arg Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg
1 5 10 15
Leu Leu Val Leu
20
<210> 54
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 54
agtgcctccg ggggtgaatc ctacgagcag tacttcgggc cgggcaccag gctcacggtc 60
aca 63
<210> 55
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 55
agcgcctccg gaggagagtc atacgaacag tatttcggcc ctggcacacg cctcactgtg 60
acc 63
<210> 56
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 56
Ser Ala Ser Gly Gly Glu Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
1 5 10 15
Arg Leu Thr Val Thr
20
<210> 57
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 57
agcggtcggg tctcgggggg cgattccctc atagcgtttc taggccaaga gacccagtac 60
ttcgggccag gcacgcggct cctggtgctc 90
<210> 58
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 58
tcaggacgag tgtccggagg ggatagcctc atcgcatttc tggggcagga aactcagtac 60
ttcggacccg gaacacgcct cctggtgctg 90
<210> 59
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 59
Ser Gly Arg Val Ser Gly Gly Asp Ser Leu Ile Ala Phe Leu Gly Gln
1 5 10 15
Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu
20 25 30
<210> 60
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 60
agtgtacccg ggaacgacag gggcaatgaa aaactgtttt ttggcagtgg aacccagctc 60
tctgtcttg 69
<210> 61
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 61
tccgtgcctg gcaacgatag aggtaacgag aagctgtttt tcggatccgg cacacagctg 60
tctgtcctg 69
<210> 62
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR Beta链多样区域(D/J/N)
<400> 62
Ser Val Pro Gly Asn Asp Arg Gly Asn Glu Lys Leu Phe Phe Gly Ser
1 5 10 15
Gly Thr Gln Leu Ser Val Leu
20
<210> 63
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR-beta链cDNA ( D/J/N区后)
<400> 63
gaggacctga acaaggtgtt cccacccgag gtcgctgtgt ttgagccatc agaagcagag 60
atctcccaca cccaaaaggc cacactggtg tgcctggcca caggcttctt ccctgaccac 120
gtggagctga gctggtgggt gaatgggaag gaggtgcaca gtggggtcag cacggacccg 180
cagcccctca aggagcagcc cgccctcaat gactccagat actgcctgag cagccgcctg 240
agggtctcgg ccaccttctg gcagaacccc cgcaaccact tccgctgcca agtccagttc 300
tacgggctct cggagaatga cgagtggacc caggataggg ccaaacccgt cacccagatc 360
gtcagcgccg aggcctgggg tagagcagac tgtggcttta cctcggtgtc ctaccagcaa 420
ggggtcctgt ctgccaccat cctctatgag atcctgctag ggaaggccac cctgtatgct 480
gtgctggtca gcgcccttgt gttgatggcc atggtcaaga gaaaggattt ctga 534
<210> 64
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR-beta链cDNA密码子优化 (/J/N区后)
<400> 64
gaggacctga ataaggtgtt cccccctgag gtggctgtct ttgaaccaag tgaggcagaa 60
atttcacata cacagaaagc caccctggtg tgcctggcta ccggcttctt tcccgatcac 120
gtggagctga gctggtgggt caacggcaag gaagtgcata gcggagtctc cacagaccca 180
cagcccctga aagagcagcc tgctctgaat gattccagat actgcctgtc tagtagactg 240
cgggtgtctg ccaccttctg gcagaaccca aggaatcatt tcagatgtca ggtgcagttt 300
tatggcctga gcgagaacga tgaatggact caggacaggg ctaagccagt gacccagatc 360
gtcagcgcag aggcctgggg aagagcagac tgcgggttta caagcgtgag ctatcagcag 420
ggcgtcctga gcgccacaat cctgtacgaa attctgctgg gaaaggccac tctgtatgct 480
gtgctggtct ccgctctggt gctgatggca atggtcaagc ggaaagattt ctga 534
<210> 65
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人iNKT TCR-beta链( D/J/N区后)
<400> 65
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Phe
<210> 66
<211> 2845
<212> DNA
<213> 智人
<400> 66
aagtggaggc gtcgcgctgg cgggcattcc tgaagctgac agcattcggg ccgagatgtc 60
tcgctccgtg gccttagctg tgctcgcgct actctctctt tctggcctgg aggctatcca 120
gcgtactcca aagattcagg tttactcacg tcatccagca gagaatggaa agtcaaattt 180
cctgaattgc tatgtgtctg ggtttcatcc atccgacatt gaagttgact tactgaagaa 240
tggagagaga attgaaaaag tggagcattc agacttgtct ttcagcaagg actggtcttt 300
ctatctcttg tactacactg aattcacccc cactgaaaaa gatgagtatg cctgccgtgt 360
gaaccatgtg actttgtcac agcccaagat agttaagtgg ggtaagtctt acattctttt 420
gtaagctgct gaaagttgtg tatgagtagt catatcataa agctgctttg atataaaaaa 480
ggtctatggc catactaccc tgaatgagtc ccatcccatc tgatataaac aatctgcata 540
ttgggattgt cagggaatgt tcttaaagat cagattagtg gcacctgctg agatactgat 600
gcacagcatg gtttctgaac cagtagtttc cctgcagttg agcagggagc agcagcagca 660
cttgcacaaa tacatataca ctcttaacac ttcttaccta ctggcttcct ctagcttttg 720
tggcagcttc aggtatattt agcactgaac gaacatctca agaaggtata ggcctttgtt 780
tgtaagtcct gctgtcctag catcctataa tcctggactt ctccagtact ttctggctgg 840
attggtatct gaggctagta ggaagggctt gttcctgctg ggtagctcta aacaatgtat 900
tcatgggtag gaacagcagc ctattctgcc agccttattt ctaaccattt tagacatttg 960
ttagtacatg gtattttaaa agtaaaactt aatgtcttcc ttttttttct ccactgtctt 1020
tttcatagat cgagacatgt aagcagcatc atggaggtaa gtttttgacc ttgagaaaat 1080
gtttttgttt cactgtcctg aggactattt atagacagct ctaacatgat aaccctcact 1140
atgtggagaa cattgacaga gtaacatttt agcagggaaa gaagaatcct acagggtcat 1200
gttcccttct cctgtggagt ggcatgaaga aggtgtatgg ccccaggtat ggccatatta 1260
ctgaccctct acagagaggg caaaggaact gccagtatgg tattgcagga taaaggcagg 1320
tggttaccca cattacctgc aaggctttga tctttcttct gccatttcca cattggacat 1380
ctctgctgag gagagaaaat gaaccactct tttcctttgt ataatgttgt tttattcttc 1440
agacagaaga gaggagttat acagctctgc agacatccca ttcctgtatg gggactgtgt 1500
ttgcctctta gaggttccca ggccactaga ggagataaag ggaaacagat tgttataact 1560
tgatataatg atactataat agatgtaact acaaggagct ccagaagcaa gagagaggga 1620
ggaacttgga cttctctgca tctttagttg gagtccaaag gcttttcaat gaaattctac 1680
tgcccagggt acattgatgc tgaaacccca ttcaaatctc ctgttatatt ctagaacagg 1740
gaattgattt gggagagcat caggaaggtg gatgatctgc ccagtcacac tgttagtaaa 1800
ttgtagagcc aggacctgaa ctctaatata gtcatgtgtt acttaatgac ggggacatgt 1860
tctgagaaat gcttacacaa acctaggtgt tgtagcctac tacacgcata ggctacatgg 1920
tatagcctat tgctcctaga ctacaaacct gtacagcctg ttactgtact gaatactgtg 1980
ggcagttgta acacaatggt aagtatttgt gtatctaaac atagaagttg cagtaaaaat 2040
atgctatttt aatcttatga gaccactgtc atatatacag tccatcattg accaaaacat 2100
catatcagca ttttttcttc taagattttg ggagcaccaa agggatacac taacaggata 2160
tactctttat aatgggtttg gagaactgtc tgcagctact tcttttaaaa aggtgatcta 2220
cacagtagaa attagacaag tttggtaatg agatctgcaa tccaaataaa ataaattcat 2280
tgctaacctt tttcttttct tttcaggttt gaagatgccg catttggatt ggatgaattc 2340
caaattctgc ttgcttgctt tttaatattg atatgcttat acacttacac tttatgcaca 2400
aaatgtaggg ttataataat gttaacatgg acatgatctt ctttataatt ctactttgag 2460
tgctgtctcc atgtttgatg tatctgagca ggttgctcca caggtagctc taggagggct 2520
ggcaacttag aggtggggag cagagaattc tcttatccaa catcaacatc ttggtcagat 2580
ttgaactctt caatctcttg cactcaaagc ttgttaagat agttaagcgt gcataagtta 2640
acttccaatt tacatactct gcttagaatt tgggggaaaa tttagaaata taattgacag 2700
gattattgga aatttgttat aatgaatgaa acattttgtc atataagatt catatttact 2760
tcttatacat ttgataaagt aaggcatggt tgtggttaat ctggtttatt tttgttccac 2820
aagttaaata aatcataaaa cttga 2845
<210> 67
<211> 4654
<212> DNA
<213> 智人
<400> 67
ggttagtgat gaggctagtg atgaggctgt gtgcttctga gctgggcatc cgaaggcatc 60
cttggggaag ctgagggcac gaggaggggc tgccagactc cgggagctgc tgcctggctg 120
ggattcctac acaatgcgtt gcctggctcc acgccctgct gggtcctacc tgtcagagcc 180
ccaaggcagc tcacagtgtg ccaccatgga gttggggccc ctagaaggtg gctacctgga 240
gcttcttaac agcgatgctg accccctgtg cctctaccac ttctatgacc agatggacct 300
ggctggagaa gaagagattg agctctactc agaacccgac acagacacca tcaactgcga 360
ccagttcagc aggctgttgt gtgacatgga aggtgatgaa gagaccaggg aggcttatgc 420
caatatcgcg gaactggacc agtatgtctt ccaggactcc cagctggagg gcctgagcaa 480
ggacattttc aagcacatag gaccagatga agtgatcggt gagagtatgg agatgccagc 540
agaagttggg cagaaaagtc agaaaagacc cttcccagag gagcttccgg cagacctgaa 600
gcactggaag ccagctgagc cccccactgt ggtgactggc agtctcctag tgggaccagt 660
gagcgactgc tccaccctgc cctgcctgcc actgcctgcg ctgttcaacc aggagccagc 720
ctccggccag atgcgcctgg agaaaaccga ccagattccc atgcctttct ccagttcctc 780
gttgagctgc ctgaatctcc ctgagggacc catccagttt gtccccacca tctccactct 840
gccccatggg ctctggcaaa tctctgaggc tggaacaggg gtctccagta tattcatcta 900
ccatggtgag gtgccccagg ccagccaagt accccctccc agtggattca ctgtccacgg 960
cctcccaaca tctccagacc ggccaggctc caccagcccc ttcgctccat cagccactga 1020
cctgcccagc atgcctgaac ctgccctgac ctcccgagca aacatgacag agcacaagac 1080
gtcccccacc caatgcccgg cagctggaga ggtctccaac aagcttccaa aatggcctga 1140
gccggtggag cagttctacc gctcactgca ggacacgtat ggtgccgagc ccgcaggccc 1200
ggatggcatc ctagtggagg tggatctggt gcaggccagg ctggagagga gcagcagcaa 1260
gagcctggag cgggaactgg ccaccccgga ctgggcagaa cggcagctgg cccaaggagg 1320
cctggctgag gtgctgttgg ctgccaagga gcaccggcgg ccgcgtgaga cacgagtgat 1380
tgctgtgctg ggcaaagctg gtcagggcaa gagctattgg gctggggcag tgagccgggc 1440
ctgggcttgt ggccggcttc cccagtacga ctttgtcttc tctgtcccct gccattgctt 1500
gaaccgtccg ggggatgcct atggcctgca ggatctgctc ttctccctgg gcccacagcc 1560
actcgtggcg gccgatgagg ttttcagcca catcttgaag agacctgacc gcgttctgct 1620
catcctagac ggcttcgagg agctggaagc gcaagatggc ttcctgcaca gcacgtgcgg 1680
accggcaccg gcggagccct gctccctccg ggggctgctg gccggccttt tccagaagaa 1740
gctgctccga ggttgcaccc tcctcctcac agcccggccc cggggccgcc tggtccagag 1800
cctgagcaag gccgacgccc tatttgagct gtccggcttc tccatggagc aggcccaggc 1860
atacgtgatg cgctactttg agagctcagg gatgacagag caccaagaca gagccctgac 1920
gctcctccgg gaccggccac ttcttctcag tcacagccac agccctactt tgtgccgggc 1980
agtgtgccag ctctcagagg ccctgctgga gcttggggag gacgccaagc tgccctccac 2040
gctcacggga ctctatgtcg gcctgctggg ccgtgcagcc ctcgacagcc cccccggggc 2100
cctggcagag ctggccaagc tggcctggga gctgggccgc agacatcaaa gtaccctaca 2160
ggaggaccag ttcccatccg cagacgtgag gacctgggcg atggccaaag gcttagtcca 2220
acacccaccg cgggccgcag agtccgagct ggccttcccc agcttcctcc tgcaatgctt 2280
cctgggggcc ctgtggctgg ctctgagtgg cgaaatcaag gacaaggagc tcccgcagta 2340
cctagcattg accccaagga agaagaggcc ctatgacaac tggctggagg gcgtgccacg 2400
ctttctggct gggctgatct tccagcctcc cgcccgctgc ctgggagccc tactcgggcc 2460
atcggcggct gcctcggtgg acaggaagca gaaggtgctt gcgaggtacc tgaagcggct 2520
gcagccgggg acactgcggg cgcggcagct gctggagctg ctgcactgcg cccacgaggc 2580
cgaggaggct ggaatttggc agcacgtggt acaggagctc cccggccgcc tctcttttct 2640
gggcacccgc ctcacgcctc ctgatgcaca tgtactgggc aaggccttgg aggcggcggg 2700
ccaagacttc tccctggacc tccgcagcac tggcatttgc ccctctggat tggggagcct 2760
cgtgggactc agctgtgtca cccgtttcag ggctgccttg agcgacacgg tggcgctgtg 2820
ggagtccctg cagcagcatg gggagaccaa gctacttcag gcagcagagg agaagttcac 2880
catcgagcct ttcaaagcca agtccctgaa ggatgtggaa gacctgggaa agcttgtgca 2940
gactcagagg acgagaagtt cctcggaaga cacagctggg gagctccctg ctgttcggga 3000
cctaaagaaa ctggagtttg cgctgggccc tgtctcaggc ccccaggctt tccccaaact 3060
ggtgcggatc ctcacggcct tttcctccct gcagcatctg gacctggatg cgctgagtga 3120
gaacaagatc ggggacgagg gtgtctcgca gctctcagcc accttccccc agctgaagtc 3180
cttggaaacc ctcaatctgt cccagaacaa catcactgac ctgggtgcct acaaactcgc 3240
cgaggccctg ccttcgctcg ctgcatccct gctcaggcta agcttgtaca ataactgcat 3300
ctgcgacgtg ggagccgaga gcttggctcg tgtgcttccg gacatggtgt ccctccgggt 3360
gatggacgtc cagtacaaca agttcacggc tgccggggcc cagcagctcg ctgccagcct 3420
tcggaggtgt cctcatgtgg agacgctggc gatgtggacg cccaccatcc cattcagtgt 3480
ccaggaacac ctgcaacaac aggattcacg gatcagcctg agatgatccc agctgtgctc 3540
tggacaggca tgttctctga ggacactaac cacgctggac cttgaactgg gtacttgtgg 3600
acacagctct tctccaggct gtatcccatg agcctcagca tcctggcacc cggcccctgc 3660
tggttcaggg ttggcccctg cccggctgcg gaatgaacca catcttgctc tgctgacaga 3720
cacaggcccg gctccaggct cctttagcgc ccagttgggt ggatgcctgg tggcagctgc 3780
ggtccaccca ggagccccga ggccttctct gaaggacatt gcggacagcc acggccaggc 3840
cagagggagt gacagaggca gccccattct gcctgcccag gcccctgcca ccctggggag 3900
aaagtacttc ttttttttta tttttagaca gagtctcact gttgcccagg ctggcgtgca 3960
gtggtgcgat ctgggttcac tgcaacctcc gcctcttggg ttcaagcgat tcttctgctt 4020
cagcctcccg agtagctggg actacaggca cccaccatca tgtctggcta atttttcatt 4080
tttagtagag acagggtttt gccatgttgg ccaggctggt ctcaaactct tgacctcagg 4140
tgatccaccc acctcagcct cccaaagtgc tgggattaca agcgtgagcc actgcaccgg 4200
gccacagaga aagtacttct ccaccctgct ctccgaccag acaccttgac agggcacacc 4260
gggcactcag aagacactga tgggcaaccc ccagcctgct aattccccag attgcaacag 4320
gctgggcttc agtggcagct gcttttgtct atgggactca atgcactgac attgttggcc 4380
aaagccaaag ctaggcctgg ccagatgcac cagcccttag cagggaaaca gctaatggga 4440
cactaatggg gcggtgagag gggaacagac tggaagcaca gcttcatttc ctgtgtcttt 4500
tttcactaca ttataaatgt ctctttaatg tcacaggcag gtccagggtt tgagttcata 4560
ccctgttacc attttggggt acccactgct ctggttatct aatatgtaac aagccacccc 4620
aaatcatagt ggcttaaaac aacactcaca ttta 4654
<210> 68
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 68
cgcgagcaca gcuaaggcca 20
<210> 69
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 69
gauauuggca uaagccuccc 20
<210> 70
<211> 996
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sr39TK cDNA序列密码子优化
<400> 70
atgcctacac tgctgcgggt gtacatcgat ggccctcacg gcatgggcaa gaccacaacc 60
acacagctgc tggtggccct gggcagcagg gacgatatcg tgtacgtgcc agagcccatg 120
acatattggc gcgtgctggg agcatccgag acaatcgcca acatctacac cacacagcac 180
agactggatc agggagagat ctccgccggc gacgcagcag tggtcatgac cagcgcccag 240
atcacaatgg gcatgccata tgcagtgacc gacgccgtgc tggcacctca catcggagga 300
gaggcaggct ctagccacgc accaccccct gccctgacaa tctttctgga tcggcaccct 360
atcgccttca tgctgtgcta cccagccgcc agatatctga tgggcagcat gaccccacag 420
gccgtgctgg ccttcgtggc cctgatccca cccaccctgc caggaacaaa tatcgtgctg 480
ggcgccctgc cagaggacag gcacatcgat agactggcca agaggcagcg ccccggagag 540
cggctggacc tggcaatgct ggcagcaatc aggagagtgt acggcctgct ggccaacacc 600
gtgcggtatc tgcagtgtgg aggctcctgg agagaggact ggggacagct gtctggaaca 660
gcagtgcctc cacagggagc agagccacag tccaatgcag gacctaggcc acacatcggc 720
gataccctgt tcacactgtt tcgcgcacca gagctgctgg cacctaacgg cgatctgtac 780
aacgtgttcg catgggcact ggacgtgctg gcaaagcggc tgagatctat gcacgtgttc 840
atcctggact acgaccagag cccagccggc tgtagagatg ccctgctgca gctgacaagc 900
ggcatggtgc agacccacgt gaccacaccc ggctctattc caacaatctg cgacctggct 960
aggacctttg caagagaaat gggcgaagct aactga 996
<210> 71
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sr39TK氨基酸序列
<400> 71
Met Pro Thr Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly
1 5 10 15
Lys Thr Thr Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp
20 25 30
Ile Val Tyr Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala
35 40 45
Ser Glu Thr Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln
50 55 60
Gly Glu Ile Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln
65 70 75 80
Ile Thr Met Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro
85 90 95
His Ile Gly Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu
100 105 110
Thr Ile Phe Leu Asp Arg His Pro Ile Ala Phe Met Leu Cys Tyr Pro
115 120 125
Ala Ala Arg Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala
130 135 140
Phe Val Ala Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu
145 150 155 160
Gly Ala Leu Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln
165 170 175
Arg Pro Gly Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg
180 185 190
Val Tyr Gly Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys Gly Gly
195 200 205
Ser Trp Arg Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro
210 215 220
Gln Gly Ala Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly
225 230 235 240
Asp Thr Leu Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn
245 250 255
Gly Asp Leu Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys
260 265 270
Arg Leu Arg Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro
275 280 285
Ala Gly Cys Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln
290 295 300
Thr His Val Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala
305 310 315 320
Arg Thr Phe Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn
325 330
<210> 72
<211> 1508
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人T细胞受体 alpha链(TRAC) mRNA序列
<400> 72
ttttgaaacc cttcaaaggc agagacttgt ccagcctaac ctgcctgctg ctcctagctc 60
ctgaggctca gggcccttgg cttctgtccg ctctgctcag ggccctccag cgtggccact 120
gctcagccat gctcctgctg ctcgtcccag tgctcgaggt gatttttacc ctgggaggaa 180
ccagagccca gtcggtgacc cagcttggca gccacgtctc tgtctctgaa ggagccctgg 240
ttctgctgag gtgcaactac tcatcgtctg ttccaccata tctcttctgg tatgtgcaat 300
accccaacca aggactccag cttctcctga agtacacatc agcggccacc ctggttaaag 360
gcatcaacgg ttttgaggct gaatttaaga agagtgaaac ctccttccac ctgacgaaac 420
cctcagccca tatgagcgac gcggctgagt acttctgtgc tgtgagtgat ctcgaaccga 480
acagcagtgc ttccaagata atctttggat cagggaccag actcagcatc cggccaaata 540
tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg 600
tctgcctatt caccgatttt gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg 660
tgtatatcac agacaaaact gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg 720
ctgtggcctg gagcaacaaa tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta 780
ttccagaaga caccttcttc cccagcccag aaagttcctg tgatgtcaag ctggtcgaga 840
aaagctttga aacagatacg aacctaaact ttcaaaacct gtcagtgatt gggttccgaa 900
tcctcctcct gaaagtggcc gggtttaatc tgctcatgac gctgcggctg tggtccagct 960
gagatctgca agattgtaag acagcctgtg ctccctcgct ccttcctctg cattgcccct 1020
cttctccctc tccaaacaga gggaactctc ctacccccaa ggaggtgaaa gctgctacca 1080
cctctgtgcc cccccggtaa tgccaccaac tggatcctac ccgaatttat gattaagatt 1140
gctgaagagc tgccaaacac tgctgccacc ccctctgttc ccttattgct gcttgtcact 1200
gcctgacatt cacggcagag gcaaggctgc tgcagcctcc cctggctgtg cacattccct 1260
cctgctcccc agagactgcc tccgccatcc cacagatgat ggatcttcag tgggttctct 1320
tgggctctag gtcctggaga atgttgtgag gggtttattt ttttttaata gtgttcataa 1380
agaaatacat agtattcttc ttctcaagac gtggggggaa attatctcat tatcgaggcc 1440
ctgctatgct gtgtgtctgg gcgtgttgta tgtcctgctg ccgatgcctt cattaaaatg 1500
atttggaa 1508
<210> 73
<211> 2042
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人T细胞受体beta链(TRBC1) mRNA序列
<400> 73
tgcatcctag ggacagcata gaaaggaggg gcaaagtgga gagagagcaa cagacactgg 60
gatggtgacc ccaaaacaat gagggcctag aatgacatag ttgtgcttca ttacggccca 120
ttcccagggc tctctctcac acacacagag cccctaccag aaccagacag ctctcagagc 180
aaccctggct ccaacccctc ttccctttcc agaggacctg aacaaggtgt tcccacccga 240
ggtcgctgtg tttgagccat cagaagcaga gatctcccac acccaaaagg ccacactggt 300
gtgcctggcc acaggcttct tccccgacca cgtggagctg agctggtggg tgaatgggaa 360
ggaggtgcac agtggggtca gcacggaccc gcagcccctc aaggagcagc ccgccctcaa 420
tgactccaga tactgcctga gcagccgcct gagggtctcg gccaccttct ggcagaaccc 480
ccgcaaccac ttccgctgtc aagtccagtt ctacgggctc tcggagaatg acgagtggac 540
ccaggatagg gccaaacccg tcacccagat cgtcagcgcc gaggcctggg gtagagcagg 600
tgagtggggc ctggggagat gcctggagga gattaggtga gaccagctac cagggaaaat 660
ggaaagatcc aggtagcaga caagactaga tccaaaaaga aaggaaccag cgcacaccat 720
gaaggagaat tgggcacctg tggttcattc ttctcccaga ttctcagccc aacagagcca 780
agcagctggg tcccctttct atgtggcctg tgtaactctc atctgggtgg tgccccccat 840
ccccctcagt gctgccacat gccatggatt gcaaggacaa tgtggctgac atctgcatgg 900
cagaagaaag gaggtgctgg gctgtcagag gaagctggtc tgggcctggg agtctgtgcc 960
aactgcaaat ctgactttac ttttaattgc ctatgaaaat aaggtctctc atttattttc 1020
ctctccctgc tttctttcag actgtggctt tacctcgggt aagtaagccc ttccttttcc 1080
tctccctctc tcatggttct tgacctagaa ccaaggcatg aagaactcac agacactgga 1140
gggtggaggg tgggagagac cagagctacc tgtgcacagg tacccacctg tccttcctcc 1200
gtgccaacag tgtcctacca gcaaggggtc ctgtctgcca ccatcctcta tgagatcctg 1260
ctagggaagg ccaccctgta tgctgtgctg gtcagcgccc ttgtgttgat ggccatggta 1320
agcaggaggg caggatgggg ccagcaggct ggaggtgaca cactgacacc aagcacccag 1380
aagtatagag tccctgccag gattggagct gggcagtagg gagggaagag atttcattca 1440
ggtgcctcag aagataactt gcacctctgt aggatcacag tggaagggtc atgctgggaa 1500
ggagaagctg gagtcaccag aaaacccaat ggatgttgtg atgagcctta ctatttgtgt 1560
ggtcaatggg ccctactact ttctctcaat cctcacaact cctggctctt aataaccccc 1620
aaaactttct cttctgcagg tcaagagaaa ggatttctga aggcagccct ggaagtggag 1680
ttaggagctt ctaacccgtc atggtttcaa tacacattct tcttttgcca gcgcttctga 1740
agagctgctc tcacctctct gcatcccaat agatatcccc ctatgtgcat gcacacctgc 1800
acactcacgg ctgaaatctc cctaacccag ggggacctta gcatgcctaa gtgactaaac 1860
caataaaaat gttctggtct ggcctgactc tgacttgtga atgtctggat agctccttgg 1920
ctgtctctga actccctgtg actctcccca ttcagtcagg atagaaacaa gaggtattca 1980
aggaaaatgc agactcttca cgtaagaggg atgaggggcc caccttgaga tcaatagcag 2040
aa 2042
<210> 74
<211> 2008
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TRBC2 T细胞受体beta恒定2 (TCRB2)序列
<400> 74
atggcgtagt ccccaaagaa cgaggaccta gtaacataat tgtgcttcat tatggtcctt 60
tcccggcctt ctctctcaca catacacaga gcccctacca ggaccagaca gctctcagag 120
caaccctagc cccattacct cttccctttc cagaggacct gaaaaacgtg ttcccacccg 180
aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag gccacactgg 240
tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg gtgaatggga 300
aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag cccgccctca 360
atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc tggcagaacc 420
cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat gacgagtgga 480
cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg ggtagagcag 540
gtgagtgggg cctggggaga tgcctggagg agattaggtg agaccagcta ccagggaaaa 600
tggaaagatc caggtagcgg acaagactag atccagaaga aagccagagt ggacaaggtg 660
ggatgatcaa ggttcacagg gtcagcaaag cacggtgtgc acttccccca ccaagaagca 720
tagaggctga atggagcacc tcaagctcat tcttccttca gatcctgaca ccttagagct 780
aagctttcaa gtctccctga ggaccagcca tacagctcag catctgagtg gtgtgcatcc 840
cattctcttc tggggtcctg gtttcctaag atcatagtga ccacttcgct ggcactggag 900
cagcatgagg gagacagaac cagggctatc aaaggaggct gactttgtac tatctgatat 960
gcatgtgttt gtggcctgtg agtctgtgat gtaaggctca atgtccttac aaagcagcat 1020
tctctcatcc atttttcttc ccctgttttc tttcagactg tggcttcacc tccggtaagt 1080
gagtctctcc tttttctctc tatctttcgc cgtctctgct ctcgaaccag ggcatggaga 1140
atccacggac acaggggcgt gagggaggcc agagccacct gtgcacaggt acctacatgc 1200
tctgttcttg tcaacagagt cttaccagca aggggtcctg tctgccacca tcctctatga 1260
gatcttgcta gggaaggcca ccttgtatgc cgtgctggtc agtgccctcg tgctgatggc 1320
catggtaagg aggagggtgg gatagggcag atgatggggg caggggatgg aacatcacac 1380
atgggcataa aggaatctca gagccagagc acagcctaat atatcctatc acctcaatga 1440
aaccataatg aagccagact ggggagaaaa tgcagggaat atcacagaat gcatcatggg 1500
aggatggaga caaccagcga gccctactca aattaggcct cagagcccgc ctcccctgcc 1560
ctactcctgc tgtgccatag cccctgaaac cctgaaaatg ttctctcttc cacaggtcaa 1620
gagaaaggat tccagaggct agctccaaaa ccatcccagg tcattcttca tcctcaccca 1680
ggattctcct gtacctgctc ccaatctgtg ttcctaaaag tgattctcac tctgcttctc 1740
atctcctact tacatgaata cttctctctt ttttctgttt ccctgaagat tgagctccca 1800
acccccaagt acgaaatagg ctaaaccaat aaaaaattgt gtgttgggcc tggttgcatt 1860
tcaggagtgt ctgtggagtt ctgctcatca ctgacctatc ttctgattta gggaaagcag 1920
cattcgcttg gacatctgaa gtgacagccc tctttctctc cacccaatgc tgctttctcc 1980
tgttcatcct gatggaagtc tcaacaca 2008

Claims (155)

1.工程化不变自然杀伤T(iNKT)细胞，其表达至少一种不变自然杀伤(iNKT)T细胞受体(TCR)和以下中的一种或两者：(1)外源自杀基因产物；和(2)所述细胞的基因组已被改变为消除至少一种HLA-I或HLA-II分子的表面表达，其中所述至少一种iNKT TCR从在经重组修饰的启动子区的转录控制下的外源核酸和/或内源不变TCR基因表达。
2.权利要求1的工程化iNKT细胞，其中所述细胞的基因组已被改变为消除至少一种HLA-I或HLA-II分子的表面表达。
3.权利要求1或2的工程化iNKT细胞，其中所述不变TCR基因产物是αTCR基因产物。
4.权利要求1至3中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述不变TCR基因产物是βTCR基因产物。
5.权利要求1至4中任一项的工程化iNKT细胞，其中αTCR基因产物和βTCR基因产物两者都是表达的。
6.权利要求1至5中任一项的工程化iNKT细胞，其中至少一种不变TCR基因产物从外源核酸表达。
7.权利要求1至6中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述外源自杀基因产物和/或所述外源核酸具有一个或多个针对在所述细胞中表达而优化的密码子。
8.权利要求1至7中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述自杀基因产物是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、羧肽酶G2、细胞色素P450、亚麻苦苷酶、β-内酰胺酶、硝基还原酶(NTR)、羧肽酶A或诱导型胱天蛋白酶9。
9.权利要求1至8中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述自杀基因是基于酶的。
10.权利要求9的工程化iNKT细胞，其中所述自杀基因编码胸苷激酶(TK)或诱导型胱天蛋白酶9。
11.权利要求10的工程化iNKT细胞，其中所述TK基因是病毒TK基因。
12.权利要求11的工程化iNKT细胞，其中所述TK基因是单纯疱疹病毒TK基因。
13.权利要求1至12中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述自杀基因产物被底物激活。
14.权利要求13的工程化iNKT细胞，其中所述底物是更昔洛韦、喷昔洛韦或其衍生物。
15.权利要求1至14中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述细胞包含编码多肽的外源核酸，所述多肽具有可被标记用于显像的底物。
16.权利要求15的工程化iNKT细胞，其中所述自杀基因产物是具有可被标记用于显像的底物的所述多肽。
17.权利要求1至16中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述自杀基因是sr39TK或诱导型胱天蛋白酶9。
18.权利要求1至17中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述iNKT TCR特异性结合α-半乳糖神经酰胺(α-GC)。
19.权利要求1至18中任一项的工程化iNKT细胞，其中通过破坏编码β-2-微球蛋白(B2M)、主要组织相容性复合体II反式激活物(CIITA)和/或单独的HLA-I和HLA-II分子的基因表达，所述iNKT细胞不表达表面HLA-I或HLA-II分子。
20.权利要求19的工程化iNKT细胞，其中由于所述细胞由基因编辑操纵，所述HLA-I或HLA-II不在所述iNKT细胞表面上表达。
21.权利要求20的工程化iNKT细胞，其中所述基因编辑牵涉CRISPR-Cas9。
22.权利要求1至21中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述iNKT细胞包含来自引入所述细胞中的重组载体的核酸。
23.权利要求22的工程化iNKT细胞，其中所述核酸掺入所述细胞的基因组中。
24.权利要求22或23的工程化iNKT细胞，其中所述重组载体是病毒载体。
25.权利要求24的工程化iNKT细胞，其中所述病毒载体是慢病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒或腺病毒。
26.权利要求1至25中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述细胞未暴露于包含动物血清的培养基。
27.权利要求1至26中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述细胞是冷冻的。
28.权利要求1至26中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述细胞先前已经是冷冻的，并且其中所述细胞在室温稳定至少1个小时。
29.权利要求1至28中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述细胞在包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖和DMSO中的一种或多种的溶液中。
30.权利要求1至29中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述细胞在无菌、无热源且等张的溶液中。
31.权利要求1至30中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述细胞源自造血干细胞。
32.权利要求31的工程化iNKT细胞，其中所述细胞源自G-CSF动员的CD34+细胞。
33.权利要求1至32中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述细胞源自来自未患癌症的人类患者的细胞。
34.权利要求1至33中任一项的工程化iNKT细胞，其中所述细胞不表达内源TCR。
35.细胞群，其包含权利要求1至34中任一项的工程化不变自然杀伤T(iNKT)细胞。
36.权利要求35的细胞群，其中所述iNKT细胞包含编码自杀基因的外源核酸。
37.权利要求36的细胞群，其中所述自杀基因是基于酶的。
38.权利要求37的细胞群，其中所述自杀基因编码胸苷激酶(TK)或诱导型胱天蛋白酶9。
39.权利要求38的细胞群，其中所述TK基因是病毒TK基因。
40.权利要求39的细胞群，其中所述TK基因是单纯疱疹病毒TK基因。
41.权利要求36至40中任一项的细胞群，其中所述自杀基因产物被底物激活。
42.权利要求41的细胞群，其中所述底物是更昔洛韦、喷昔洛韦或其衍生物。
43.权利要求35至42中任一项的细胞群，其中所述细胞包含编码多肽的外源核酸，所述多肽具有可被标记用于显像的底物。
44.权利要求43的细胞群，其中所述自杀基因产物是具有可被标记用于显像的底物的所述多肽。
45.权利要求39至44中任一项的细胞群，其中所述自杀基因是sr39TK。
46.权利要求35至45中任一项的细胞群，其中通过破坏编码β-2-微球蛋白(B2M)、主要组织相容性复合体II反式激活物(CIITA)和/或单独的HLA-I和HLA-II分子的基因表达，所述iNKT细胞不表达表面HLA-I或HLA-II分子。
47.权利要求46的细胞群，其中由于所述细胞由基因编辑操纵，所述HLA-I或HLA-II不在所述iNKT细胞的表面上表达。
48.权利要求47的细胞群，其中所述基因编辑牵涉CRISPR-Cas9。
49.权利要求35至48中任一项的细胞群，其中所述iNKT细胞包含来自引入所述细胞中的重组载体的核酸序列。
50.权利要求49的细胞群，其中所述重组载体是病毒载体。
51.权利要求50的细胞群，其中所述病毒载体是慢病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒或腺病毒。
52.权利要求35至51中任一项的细胞群，其中所述细胞未暴露于包含动物血清的培养基。
53.权利要求35至52中任一项的细胞群，其中所述细胞是冷冻的。
54.权利要求35至53中任一项的细胞群，其中所述细胞在包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖和DMSO的溶液中。
55.权利要求35至54中任一项的细胞群，其中所述细胞在无菌、无热源且等张的溶液中。
56.权利要求35至56中任一项的细胞群，其中所述iNKT TCR特异性结合α-半乳糖神经酰胺(α-GC)。
57.权利要求35至56中任一项的细胞群，其中所述iNKT细胞已被激活。
58.权利要求57的细胞群，其中所述iNKT细胞已被α-半乳糖神经酰胺(α-GC)激活和扩增。
59.权利要求35至58中任一项的细胞群，其中所述细胞群包含至少约102至106个工程化iNKT细胞。
60.权利要求35至59中任一项的细胞群，其中所述细胞群包含至少约106至1012个工程化iNKT细胞。
61.权利要求35至60中任一项的细胞群，其中超过70％的所述细胞是工程化iNKT细胞。
62.权利要求61的细胞群，其中超过80％的所述细胞是工程化iNKT细胞。
63.权利要求62的细胞群，其中超过90％的所述细胞是工程化iNKT细胞。
64.权利要求63的细胞群，其中超过95％的所述细胞是工程化iNKT细胞。
65.权利要求64的细胞群，其中超过99％的所述细胞是工程化iNKT细胞。
66.细胞群，其包含工程化不变自然杀伤T(iNKT)细胞，所述细胞包含编码iNKT T细胞受体(T细胞受体)和胸苷激酶自杀的一种或多种外源核酸，其中所述iNKT细胞已被工程化为不表达一种或多种表面HLA-I和/或HLA-II分子，并且其中所述细胞群为至少约106至1012个工程化iNKT细胞。
67.权利要求66的细胞群，其中所述细胞是冷冻的。
68.权利要求35至67中任一项的细胞群，其中所述细胞包含高水平的NK激活物NKG2D和DNAM-1，低水平或检测不到的水平的NK抑制性受体KIR，和高水平的细胞毒性分子穿孔蛋白和粒酶B中的一种或多种。
69.权利要求35至68中任一项的细胞群，其中大于90％的所述群包含高水平的NK激活物NKG2D和DNAM-1，低水平或检测不到的水平的NK抑制性受体KIR，和高水平的细胞毒性分子穿孔蛋白和粒酶B中的一种或多种。
70.权利要求69的细胞群，其中大于90％的所述群包含高水平的NK激活物NKG2D和DNAM-1，低水平或检测不到的水平的NK抑制性受体KIR，和高水平的细胞毒性分子穿孔蛋白和粒酶B。
71.制备工程化不变自然杀伤T(iNKT)细胞群的方法，其包括：
a)从多个造血干细胞或祖细胞中选择CD34+细胞；
b)引入编码至少一种人不变自然杀伤(iNKT)T细胞受体(TCR)的一种或多种核酸；
c)消除分离的人CD34+细胞中一种或多种HLA-I和/或HLA-II分子的表面表达；以及
d)培养分离的表达iNKT TCR的CD34+细胞，以产生iNKT细胞。
72.权利要求71的方法，其中培养分离的表达iNKT TCR的CD34+细胞包括在人工胸腺类器官(ATO)系统中培养所述CD34+细胞以产生iNKT细胞，其中所述ATO系统包含3D细胞聚集体和无血清培养基，所述3D细胞聚集体包含选择的表达Notch配体的基质细胞群。
73.权利要求71或72的方法，其中所述CD34+细胞来自包含分化的造血细胞的群。
74.权利要求73的方法，其中所述分化的造血细胞是外周血单个核细胞(PBMC)。
75.权利要求71或72的方法，其中所述干细胞或祖细胞包括脐带血细胞、胎儿肝细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或骨髓细胞。
76.权利要求71至75中任一项的方法，其还包括分离CD34-细胞。
77.权利要求71至76中任一项的方法，其还包括在将一种或多种核酸引入所述细胞中之前，在培养基中培养选择的CD34+细胞。
78.权利要求77的方法，其中所述培养包括将所述选择的CD34+细胞与包含一种或多种生长因子的培养基一起温育。
79.权利要求78的方法，其中所述一种或多种生长因子包括c-kit配体、flt-3配体和/或人血小板生成素(TPO)。
80.权利要求79的方法，其中所述一种或多种生长因子的浓度为约5ng/ml至约500ng/ml。
81.权利要求71至80中任一项的方法，其中一种核酸包含编码α-TCR的核酸序列。
82.权利要求71至81中任一项的方法，其中一种核酸包含编码β-TCR的核酸序列。
83.权利要求71至82中任一项的方法，其中一种核酸包含编码α-TCR和β-TCR两者的核酸。
84.权利要求71至83中任一项的方法，其中一种核酸包含编码α-TCR的核酸序列，而第二核酸包含编码β-TCR的核酸序列。
85.权利要求71的方法，其还包括将编码自杀基因的核酸引入所述选择的CD34+细胞中。
86.权利要求85的方法，其中一种核酸编码所述α-TCR和所述β-TCR两者。
87.权利要求86的方法，其中一种核酸编码所述α-TCR、所述β-TCR和所述自杀基因。
88.权利要求85至87中任一项的方法，其中所述自杀基因是基于酶的。
89.权利要求88的方法，其中所述自杀基因编码胸苷激酶(TK)或诱导型胱天蛋白酶9。
90.权利要求89的方法，其中所述TK基因是病毒TK基因。
91.权利要求89的方法，其中所述TK基因是单纯疱疹病毒TK基因。
92.权利要求85至91中任一项的方法，其中所述自杀基因产物被底物激活。
93.权利要求92的方法，其中所述底物是更昔洛韦、喷昔洛韦或其衍生物。
94.权利要求71至93中任一项的方法，其中所述细胞包含编码多肽的外源核酸，所述多肽具有可被标记用于显像的底物。
95.权利要求94的方法，其中所述自杀基因产物是具有可被标记用于显像的底物的所述多肽。
96.权利要求91至95中任一项的方法，其中所述自杀基因是sr39TK。
97.权利要求71至96中任一项的方法，其中在破坏编码β-2-微球蛋白(B2M)、主要组织相容性复合体II反式激活物(CIITA)和/或单独的HLA-I和HLA-II分子的基因表达后，所述iNKT细胞不表达表面HLA-I和/或HLA-II分子。
98.权利要求97的方法，其中消除所述分离的人CD34+细胞中细胞表面HLA-I和/或HLA-II分子的表达包括将CRISPR和一种或多种对应于B2M、CIITA和/或单独的HLA-I和HLA-II分子的向导RNA(gRNA)引入所述细胞中。
99.权利要求98的方法，其中通过电穿孔或脂质介导的转染将CRISPR或所述一种或多种gRNA转染至所述细胞中。
100.权利要求71至99中任一项的方法，其中使用重组载体将编码所述TCR受体的所述核酸引入所述细胞中。
101.权利要求100的方法，其中所述重组载体是病毒载体。
102.权利要求101的方法，其中所述病毒载体是慢病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒或腺病毒。
103.权利要求102的方法，其中所述病毒载体是慢病毒。
104.权利要求71至103中任一项的方法，其中所述无血清培养基还包含外部添加的抗坏血酸。
105.权利要求71至104中任一项的方法，其中所述无血清培养基还包含：外部添加的FLT3配体(FLT3L)、白介素7(IL-7)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-21、TNF-α、TGF-β、干扰素-γ、干扰素-λ、TSLP、胸腺喷丁、pleotrophin、中期因子或其组合。
106.权利要求71至105中任一项的方法，其中所述无血清培养基还包含维生素。
107.权利要求106的方法，其中所述维生素包括生物素、DLα-生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、肌醇、维生素B12，或其组合或其盐。
108.权利要求106的方法，其中所述维生素包括生物素、DLα-生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A，或其组合或盐。
109.权利要求71至108中任一项的方法，其中所述无血清培养基还包含蛋白质。
110.权利要求109的方法，其中所述蛋白质包括白蛋白或牛血清白蛋白、BSA的级份、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶，或其组合。
111.权利要求71至110中任一项的方法，其中所述无血清培养基还包含皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘甲状腺原氨酸，或其组合。
112.权利要求71至111中任一项的方法，其中所述无血清培养基包含
Figure FDA0002916540470000121
补充剂、无异物
Figure FDA0002916540470000122
补充剂、GS21TM补充剂或其组合。
113.权利要求71至112中任一项的方法，其中所述无血清培养基包含或进一步包含氨基酸、单糖、无机离子。
114.权利要求113的方法，其中所述氨基酸包括精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸，或其组合。
115.权利要求113的方法，其中所述无机离子包括钠、钾、钙、镁、氮或磷，或其组合或盐。
116.权利要求71至115中任一项的方法，其中所述无血清培养基还包含钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰，或其组合。
117.权利要求71至116中任一项的方法，其中通过在物理基质或支架上将CD34+转导的细胞与所述选择的基质细胞群混合创建所述3D细胞聚集体。
118.权利要求117的方法，其还包括将所述CD34+转导的细胞和基质细胞离心以形成置于所述物理基质或支架上的细胞团块。
119.权利要求71至118中任一项的方法，其中由所述基质细胞表达的所述Notch配体是完整的、部分的或经修饰的DLL1、DLL4、JAG1、JAG2或其组合。
120.权利要求119的方法，其中所述Notch配体是人Notch配体。
121.权利要求120的方法，其中所述Notch配体是人DLL1或DLL4。
122.权利要求71至121中任一项的方法，其中基质细胞与CD34+细胞之间的比例为约1:5至1:20。
123.权利要求71至122中任一项的方法，其中所述基质细胞是鼠基质细胞系、人基质细胞系、选择的原代基质细胞群、从多能干细胞体外分化的选择的基质细胞群，或其组合。
124.权利要求71至123中任一项的方法，其中所述基质细胞是从造血干细胞或祖细胞体外分化的选择的基质细胞群。
125.权利要求71至124中任一项的方法，其中选择缺乏HLA-I/II分子表面表达的iNKT细胞包括使用微珠或流式细胞术对iNKT细胞进行阳性选择且对HLA-I/II阴性细胞进行阴性选择。
126.权利要求71至125中任一项的方法，其中所述细胞是冷冻的。
127.权利要求1至126中任一项的方法，其中所述细胞在包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖和DMSO的溶液中。
128.权利要求1至127中任一项的方法，其中所述细胞在无菌、无热源且等张的溶液中。
129.权利要求71至128中任一项的方法，其中所述细胞源自来自未患癌症的人类患者的细胞。
130.权利要求71至129中任一项的方法，其中所述细胞不表达内源TCR。
131.权利要求1至130中任一项的方法，其中饲养细胞包含CD34-细胞。
132.权利要求71至131中任一项的方法，其还包括激活所述选择的iNKT细胞。
133.权利要求132的方法，其中所述选择的iNKT细胞已被α-半乳糖神经酰胺(α-GC)激活和扩增。
134.权利要求133的方法，其中饲养细胞已用α-GC脉冲。
135.权利要求71至134中任一项的方法，其中所述方法产生包含至少约102至106个工程化iNKT细胞的工程化iNKT细胞群。
136.权利要求71至135中任一项的方法，其中所述方法产生包含至少约106至1012个工程化iNKT细胞的细胞群。
137.权利要求71至136中任一项的方法，其中将所述细胞群冷冻，然后解冻。
138.权利要求137的方法，其还包括将一种或多种其他核酸引入所述冷冻并解冻的细胞群中。
139.权利要求138的方法，其中所述一种或多种其他核酸编码一种或多种治疗性基因产物。
140.权利要求71至138中任一项的方法，其中大于90％的所述工程化iNKT细胞群包含高水平的NK激活物NKG2D和DNAM-1、低水平或检测不到的水平的NK抑制性受体KIR和高水平的细胞毒性分子穿孔蛋白和粒酶B中的一种或多种。
141.权利要求140的方法，其中大于90％的所述工程化iNKT细胞群包含高水平的NK激活物NKG2D和DNAM-1、低水平或检测不到的水平的NK抑制性受体KIR和高水平的细胞毒性分子穿孔蛋白和粒酶B。
142.离体制备包含工程化不变自然杀伤(iNKT)T细胞的细胞群的方法，所述方法包括：
a)从人外周血单个核细胞中选择CD34+细胞；
b)用包含生长因子的培养基培养所述CD34+细胞，所述生长因子包括c-kit配体、flt-3配体和人血小板生成素(TPO)；
c)用慢病毒载体转导所述选择的CD34+细胞，所述慢病毒载体包含编码iNKT TCRα链、iNKT TCRβ链和胸苷激酶自杀/显像报告基因的核酸序列；
d)将Cas9和用于β2微球蛋白(B2M)和/或CTIIA的gRNA引入所述选择的CD34+细胞中，以破坏B2M或CTIIA基因的表达；
e)将所述经转导的细胞与经辐照的表达外源Notch配体的基质细胞系培养2至10周，以在3D聚集细胞培养物中扩增iNKT细胞；
f)选择缺乏HLA-I/II分子表面表达的iNKT细胞；以及
g)将所述选择的iNKT细胞与经辐照的饲养细胞进行培养。
143.权利要求142的方法，其中从所述选择的CD34+细胞制备108至1013个iNKT细胞。
144.用iNKT细胞治疗患者的方法，其包括向所述患者施用权利要求1至34中任一项的细胞或者权利要求35至70中任一项的细胞群。
145.权利要求144的方法，其中所述患者患有癌症。
146.权利要求144的方法，其中所述患者患有涉及炎症的疾病或病况。
147.权利要求146的方法，其中所述疾病或病况是自身免疫疾病。
148.权利要求144至147中任一项的方法，其中所述细胞或细胞群就所述患者而言是同种异体的。
149.权利要求144至148中任一项的方法，其中所述患者未表现出所述细胞或细胞群完全消减的体征。
150.权利要求144至149中任一项的方法，其还包括向所述患者施用启动所述自杀基因产物的化合物。
151.权利要求145的方法，其中在向所述患者施用所述细胞或细胞群之后所述患者中的肿瘤进展受到控制或抑制。
152.权利要求146或147中任一项的方法，其中炎症减轻。
153.工程化不变自然杀伤T细胞，其表达至少一种不变T细胞受体(TCR)基因产物和外源自杀基因产物，其中所述至少一种不变TCR基因产物从经重组修饰的启动子区的转录控制下的外源核酸和/或内源不变TCR基因表达，其中所述iNKT细胞通过包括以下的方法产生：
a)从多个造血干细胞或祖细胞中选择CD34+细胞；
b)引入编码至少一种人不变自然杀伤(iNKT)T细胞受体(TCR)的一种或多种核酸；
c)消除分离的人CD34+细胞中一种或多种HLA-I和/或HLA-II分子的表面表达；以及
d)培养分离的表达iNKT TCR的CD34+细胞，以产生iNKT细胞。
154.工程化iNK T细胞，其表达至少一种不变自然杀伤(iNKT)T细胞受体(TCR)，其中所述细胞包含高水平的NK激活物NKG2D和DNAM-1、低水平或检测不到的水平的NK抑制性受体KIR以及高水平的细胞毒性分子穿孔蛋白和粒酶B。
155.工程化iNKT细胞群，其表达至少一种不变自然杀伤(iNKT)T细胞受体(TCR)，其中大于90％的所述群包含高水平的NK激活物NKG2D和DNAM-1，低水平或检测不到的水平的NK抑制性受体KIR以及高水平的细胞毒性分子穿孔蛋白和粒酶B。
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