CN117030580A - LDNs在坏死性小肠结肠炎诊断中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了LDNs在坏死性小肠结肠炎诊断中的应用。本发明经过研究发现，与健康对照相比，NEC患儿外周血PBMCs中CD56‑HLA‑DR‑CD3‑CD33+CD11b+CD15+CD14‑细胞的比例明显上升，提示其可作为NEC诊断的标志物。进一步的ROC曲线分析结果显示，CD56‑HLA‑DR‑CD3‑CD33+CD11b+CD15+CD14‑细胞作为NEC诊断标志物时，AUC为0.8929，灵敏度为100％，特异度为71.43％，诊断价值较高。说明CD56‑HLA‑DR‑CD3‑CD33+CD11b+CD15+CD14‑细胞可作为特异性标志物用于NEC的诊断，能预示NEC的发生发展，有利于对患儿早诊断、早治疗，对提高患儿生存率和远期预后极为重要。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，尤其涉及LDNs在坏死性小肠结肠炎诊断中的应用。
背景技术
坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生儿阶段常见的最严重的消化道疾病急症，10％的极低出生体重儿可出现。死亡率在这些极低出生体重儿中可高达30％。轻度的NEC可能与喂养不耐受表现相似，而重度NEC则在数小时内即可迅速出现肠坏死或肠穿孔等需外科手术的干预。然而手术后的幸存者大多数存在短肠综合征或者肠狭窄等严重并发症，甚至可出现神经生长发育迟缓。NEC发病的高危因素很多，包括极低出生体重、肠道发育不成熟、免疫低下、菌群失调及缺血缺氧等，其中最关键是早产。这些高危因素诱发肠道炎症造成NEC，产生一系列过度的炎症级联反应。
对于NEC的诊断，主要应用“Bell”分期标准，主要结合NEC患儿的全身表现、胃肠道症状及影像学检查制定的诊断标准。但该标准缺乏组织病理标准，不能排除如自发性肠穿孔、缺血性肠坏死、食物蛋白诱导的小肠结肠炎综合征以及其他类似于NEC临床表现而非NEC病理改变的肠道疾病。而早期诊断不明确，容易延误NEC的治疗，NEC病情发展迅速，形成重症NEC需行手术干预治疗，对患儿创伤较大。因此，寻找新的早期预测NEC的生物标志物尤为重要。
LDNs(Low Density Neutrophils)，免疫表型为
CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-，研究者最初在SLE成人患者血液中证实LDNs的存在，其释放蛋白酶、防御素、组织蛋白酶、抗菌肽、促炎因子的能力增强。中性粒细胞除了吞噬作用和脱粒作用之外，还具有另一种抗微生物机制，即释放细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)用以捕获与杀灭入侵的病原体。NETs是中性粒细胞DNA与组蛋白、细胞质内颗粒(源性)蛋白质形成的胞外网络结构，形成NETs的过程是一种细胞死亡通路。其中有报道指出SLE患者的致敏中性粒细胞形成NETs，特别是LDNs形成NETs的能力显著增强。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供LDNs在坏死性小肠结肠炎诊断中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
检测CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞在生物样本中含量的试剂在制备坏死性小肠结肠炎检测试剂或试剂盒中的应用。
在一些实施例中，所述坏死性小肠结肠炎为新生儿坏死性小肠结肠炎。
在一些实施例中，所述试剂为用于流式细胞术检测的试剂。
在一些实施例中，所述试剂包括针对CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞的荧光检测抗体。
在一些实施例中，所述荧光检测抗体包括不同荧光基团标记的抗CD56荧光抗体、抗HLA-DR荧光抗体、抗CD3荧光抗体、抗CD33荧光抗体、抗CD11b荧光抗体、抗CD15荧光抗体、抗CD14荧光抗体。
在一些实施例中，所述生物样本为外周血。
在一些实施例中，所述CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞在坏死性小肠结肠炎患者生物样本中的含量高于健康对照者。
本发明还提供了一种坏死性小肠结肠炎检测试剂盒，所述试剂盒包含用于检测CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞在生物样本中含量的试剂。
在一些实施例中，所述试剂为用于流式细胞术检测的试剂。
在一些实施例中，所述试剂包括不同荧光基团标记的抗CD56荧光抗体、抗HLA-DR荧光抗体、抗CD3荧光抗体、抗CD33荧光抗体、抗CD11b荧光抗体、抗CD15荧光抗体、抗CD14荧光抗体。
本发明经过研究发现，与健康对照相比，NEC患儿外周血PBMCs中CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞的比例明显上升，差异具有统计学意义，提示CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞可作为NEC诊断的标志物。进一步的ROC曲线分析结果显示，CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞作为NEC诊断标志物时，AUC为0.8929，灵敏度为100％，特异度为71.43％，诊断价值较高。说明CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞可作为特异性标志物用于NEC的诊断，能预示NEC的发生发展，有利于对患儿早诊断、早治疗，对提高患儿生存率和远期预后极为重要。
附图说明
图1为HDs和NEC组生物样本中LDNs含量的典型流式分析图。
图2为HDs和NEC组生物样本中LDNs含量的统计分析图。
图3为ROC曲线分析图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
本实施例抽取临床NEC患儿和纠正胎龄匹配新生儿外周血样本，采用Ficoll-Hypaque密度梯度制备技术分离PBMCs，然后利用流式细胞分析技术从PBMCs中分辨出CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞。
共采集8例经临床确诊的新生儿NEC患儿和7例纠正胎龄匹配健康新生儿外周血样本。所述新生儿是指胎儿娩出母体并自脐带结扎起，至出生后未满28天这一段时间的婴儿。
具体实验步骤如下：
利用淋巴细胞分离液(天津灏洋)分离所有外周血样本中的单个核淋巴细胞(PBMC)，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。将分离获得的PBMC按如下步骤进行染色：
(1)每个样本对应取1*106个PBMC加入流式管中，然后加入5ml PBS缓冲液混匀，2000rpm/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀；
(2)向所述细胞沉淀中加入100μL流式抗体稀释液，所述流式抗体稀释液包含人CD56抗体、人HLA-DR抗体、人CD3抗体、人CD33抗体、人CD11b抗体、人CD15抗体、人CD14抗体，按1：200的比例将全部种类的抗体加入PBS缓冲液中进行稀释，得到所述流式抗体稀释液；
(3)将流式管置于涡旋振荡器上振荡混匀，然后于4℃条件下避光染色30min；
(4)向流式管中加入预冷的PBS缓冲液，然后于2000rpm/min离心5min，弃上清；加入300μL预冷PBS缓冲液重悬细胞，然后使用流式分析仪(BD Canto II，USA)上机检测，获取数据，并用FlowJo10软件进行分析。
实验结果如下：
采用如图1所示的方法分析CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞在PBMCs中的比例。如图2所示，与健康志愿者(HDs)相比，NEC患儿外周血PBMCs中CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞的比例明显上升，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结果提示CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞是NEC患儿诊断的潜在标志物。
进一步地，ROC曲线分析结果显示，CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞在用于NEC患儿诊断时，AUC为0.8929，灵敏度为100％，特异度为71.43％，诊断价值较高，说明CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞可作为特异性标志物用于NEC的诊断，能预示NEC的发生发展，有利于对患儿早诊断、早治疗，对提高患儿生存率和远期预后极为重要。
综上所述，本发明提供了CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞在NEC诊断中的应用，有利于NEC患儿的早诊早治。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.检测CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞在生物样本中含量的试剂在制备坏死性小肠结肠炎检测试剂或试剂盒中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述坏死性小肠结肠炎为新生儿坏死性小肠结肠炎。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为用于流式细胞术检测的试剂。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括针对CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞的荧光检测抗体。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述荧光检测抗体包括不同荧光基团标记的抗CD56荧光抗体、抗HLA-DR荧光抗体、抗CD3荧光抗体、抗CD33荧光抗体、抗CD11b荧光抗体、抗CD15荧光抗体、抗CD14荧光抗体。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物样本为外周血。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞在坏死性小肠结肠炎患者生物样本中的含量高于健康对照者。
8.一种坏死性小肠结肠炎检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测CD56-HLA-DR-CD3-CD33+CD11b+CD15+CD14-细胞在生物样本中含量的试剂。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为用于流式细胞术检测的试剂。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括不同荧光基团标记的抗CD56荧光抗体、抗HLA-DR荧光抗体、抗CD3荧光抗体、抗CD33荧光抗体、抗CD11b荧光抗体、抗CD15荧光抗体、抗CD14荧光抗体。
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