CN115524490A

CN115524490A - Hla-dr+cd14+cd56+单核细胞在aa或hlh中诊断的应用

Info

Publication number: CN115524490A
Application number: CN202211301482.5A
Authority: CN
Inventors: 刘雨丰; 周睿卿; 莫文健; 王顺清; 韩雪; 陈寅春; 王剑威; 周铭; 陈小卫
Original assignee: Guangzhou First Peoples Hospital
Current assignee: Guangzhou First Peoples Hospital
Priority date: 2022-10-24
Filing date: 2022-10-24
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2042-10-24
Also published as: CN116699131A; CN115524490B; CN116699131B

Abstract

本发明涉及医学检验技术领域，尤其是涉及HLA‑DR+CD14+CD56+单核细胞作为再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症标志物的应用以及HLA‑DR+CD14+CD56+单核细胞在制备再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症检测试剂中的应用。与健康志愿者相比，再生障碍性贫血患者外周血中HLA‑DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞的比例显著升高，差异具有统计学意义。HLA‑DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在诊断再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症具有较佳的灵敏度和特异性。

Description

HLA-DR+CD14+CD56+单核细胞在AA或HLH中诊断的应用

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，尤其是涉及HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在AA或HLH中诊断的应用。

背景技术

再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)是指由化学、物理、生物因素或不明原因引起的骨髓造血功能衰竭，以骨髓造血细胞增生减低和外周血全血细胞减少为特征，骨髓无异常细胞浸润和网状纤维增多，临床表现以贫血、出血和感染为主。再生障碍性贫血可分为先天性再生障碍性贫血和获得性再生障碍性贫血两大类，其中绝大多数为获得性再生障碍性贫血。

噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH)，又称噬血细胞综合征，是一种由遗传性或获得性免疫功能异常导致的以病理性炎症反应为主要特征的临床综合征。主要由淋巴细胞、单核细胞和吞噬细胞系统异常激活、增殖，分泌大量炎性细胞因子，引起的一系列炎症反应。临床以持续性发热、肝脾肿大、全血细胞减少以及骨髓、肝、脾、淋巴结组织发现噬血现象为主要特征。由于其临床表现错综复杂，临床医师对其认识不足易延误诊治，疾病本身进展迅速，导致患者病死率较高。因此及时正确的诊断是HLH治疗成功的第一步。

HLA-DR是MHC II类抗原，它主要分布在B细胞、单核细胞及激活的T淋巴细胞上。CD14是一种存在于单核细胞、巨噬细胞等细胞表面的白细胞分化抗原。CD56一般表达在自然杀伤细胞(NK)以及CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞等表面。目前还未有研究公开HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞可以作为AA或HLH的诊断标志物进行使用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在再生障碍性贫血(AA)或HLH(噬血细胞性淋巴组织细胞增多症)中诊断的应用，再生障碍性贫血和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症外周血中HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞比例显著上调，差异具有统计学意义，检测灵敏度和特异性均较高。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一目的，本发明提供HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在制备再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症检测试剂中的应用。

第二目的，本发明提供HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在筛选再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症检测试剂中的应用。

第三目的，本发明提供HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞检测试剂在制备再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症检测试剂盒中的应用。

本发明经过大量实验得出，HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症患者中显著升高，可以作为AA或HLH的诊断标志物，有利于AA或HLH的早期诊断，不容易错过治疗时期。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症患者中表达显著高于正常人群。

与健康志愿者相比，再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症患者外周血中HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞的比例显著升高，差异具有统计学意义。

在检测再生障碍性贫血患者时，经过ROC曲线分析发现，AUC为0.8539，诊断准确性较高，当HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞的比例大于17.1％时，敏感性和特异性分别是74.47％和93.33％，具有较好的临床诊断特性。

在检测噬血细胞性淋巴组织细胞增多症患者时，经过ROC曲线分析发现，AUC为0.8636，检测灵敏度为85％，特异性为81.82％，说明，HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞应用于再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断中，检测灵敏度和特异性均较高。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述的检测试剂盒为HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞含量检测试剂盒。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述检测试剂为流式细胞术检测试剂。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述检测试剂为流式细胞术检测抗体。

第四目的，本发明提供一种再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症检测试剂盒，所述试剂盒包括检测HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在生物样本中的含量的试剂。

HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞作为诊断再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症的标志物，检测灵敏度高、特异性强，将HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞检测试剂可作为再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症的早期诊断试剂，用于制备再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症早期诊断试剂盒。

作为本发明所述检测试剂盒的优选实施方式，所述检测HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在生物样本中的含量的试剂包含抗HLA-DR抗体、抗CD14抗体和抗CD56抗体；优选地，所述抗HLA-DR抗体包括HLA-DR-APC-cy7；所述抗CD14抗体包括CD14-APC；所述抗CD56抗体包括CD56-PE-CF594。

作为本发明所述检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括外周血单个核细胞分离试剂、红细胞裂解液和PBS缓冲液。在一些实施例中，检测试剂盒还包括本领域试剂盒的常见组分，都含括在本发明中。

以上HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞中的“⁺”代表阳性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过对再生障碍性贫血和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症患者外周血样本进行分析发现，与健康志愿者相比，再生障碍性贫血患者外周血中HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞的比例显著升高，差异具有统计学意义。经过ROC曲线分析发现，AUC为0.8539，诊断准确性较高，当HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞的比例大于17.1％时，敏感性和特异性分别是74.47％和93.33％，具有较好的临床诊断特性。与健康志愿者相比，噬血细胞性淋巴组织细胞增多症患者外周血中HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞的比例显著升高，差异具有统计学意义。经过ROC曲线分析发现，AUC为0.8636，检测灵敏度为85％，特异性为81.82％，HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在诊断再生障碍性贫血和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症均具有较佳的准确性，表明HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞是一个诊断效果很好的诊断再生障碍性贫血和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症的早期标记物，具有很高的临床应用价值，可及时指导临床用药，减轻患者的负担和痛苦。因此，HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞检测试剂可作为再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症的早期诊断试剂，用于制备再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症早期诊断试剂盒。

附图说明

图1为流式细胞分析结果统计图；其中，HDs代表健康志愿者；AAs代表再生障碍性贫血患者；

图2为HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在用于再生障碍性贫血诊断时的ROC曲线分析图；

图3为流式细胞分析结果统计图；其中，HDs代表健康志愿者；HLH代表噬血细胞性淋巴组织细胞增多症患者；

图4为HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在用于噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断时的ROC曲线分析图。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

以下结合具体实施例对本发明进行说明。

实施例1

本实施例利用流式细胞术对健康志愿者、再生障碍性贫血患者、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症患者外周血样本中HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞的含量进行检测。具体如下：

一、实验方法

1、样本信息

1)再生障碍性贫血患者的纳入标准：

(1)血常规检查：

全血细胞(包括网织红细胞)减少，淋巴细胞比例增高。至少符合以下三项中两项：HGB<100g/L；PLT<50×10⁹/L；中性粒细胞绝对值(ANC)<1.5×10⁹/L。

(2)骨髓穿刺：

多部位(不同平面)骨髓增生减低或重度减低；小粒空虚，非造血细胞(淋巴细胞、网状细胞、浆细胞、肥大细胞等)比例增高；巨核细胞明显减少或缺如；红系、粒系细胞均明显减少。

(3)骨髓活检(髂骨)：

全切片增生减低，造血组织减少，脂肪组织和(或)非造血细胞增多，网硬蛋白不增加，无异常细胞。

(4)除外检查：

除外全血细胞减少和骨髓增生减低的其他疾病。

Clinical details	HDs	AA
			Patients,N	15	47
Median age,y	38.5±10.14	40.6±9.34
			Sex(F/M)	5/6	24/23

2)噬血细胞性淋巴组织细胞增多症患者的纳入标准：所有HLH患者均符合HLH-2004诊断标准，所提供的数据来自预处理样本。HLH的预处理定义为:小于2周的皮质类固醇治疗、无使用针对HLH的免疫抑制剂。入组后48小时内抽取样本，进行后续检测分析。

3)健康志愿者(HDs)纳入标准：同时收集健康人样本分别与AA和HLH进行性别和年龄均和HLH患者组相匹配。

二、患者和健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)分离

(1)向收集到的外周血样本中加入血液3倍体积的PBS溶液，混合均匀，获得稀释后的血液样本；

(2)将与稀释后的血液样本等体积的淋巴细胞分离液加入离心管中，然后用吸管将稀释后的血液样本沿着离心管的管壁缓慢地加至淋巴细胞分离液的上层，于18℃下600g(升5，降0)条件下离心25min；

(3)离心后可看到白膜层，小心地将中间白膜层吸出放于干净的离心管中，加入10ml预冷的PBS溶液，混匀；室温2000rpm/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀；

(4)像细胞沉淀中加入3ml红细胞裂解液(ACK)，室温裂解5min后，加入10ml预冷的PBS进行终止裂解；然后室温2000rpm/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀；

(5)用5ml PBS重悬细胞沉淀，获得PBMC单细胞悬液，计数备用。

三、流式细胞术染色

(1)每个样本取1million的PBMC单细胞悬液加入流式管中，然后加入5ml PBS混匀，2000rpm/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀；

(2)取用于分析人HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞的流式抗体：人抗HLA-DR抗体和人抗CD14抗体、人抗CD56抗体，按1:200的比例使用PBS缓冲液对抗体进行稀释得到抗体稀释液(上述3种抗体同时加入同一离心管中进行稀释，得到抗体稀释液)；

(3)分别取100μl抗体稀释液加入每个样本对应的流式管中，将流式管置于涡旋振荡器上振荡，充分混匀，然后于4℃冰箱避光染色30min；

(4)向流式管中加入4ml预冷的PBS缓冲液，然后于2000rpm/min离心5min，弃上清；加入300μl预冷PBS重悬细胞，然后使用流式分析仪(BD Canto II，USA)进行上机检测，获取数据，并用FlowJo10软件进行分析。

3、统计学分析

利用GraphPad 9.2.0计算各组数据中位数和计算P值，以P＜0.05视为差异具有统计学意义。

四、实验结果

参考图1-2，采用流式分析各样本中HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞的比例，与健康志愿者(HDs)相比，再生障碍性贫血患者(AAs)外周血中HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞的比例显著升高，差异具有统计学意义，提示HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞可作为再生障碍性贫血患者(AAs)潜在的诊断标记物。

为此，本发明进一步进行了ROC曲线分析，结果显示，HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在用于再生障碍性贫血患者(AAs)的早期诊断时，AUC为0.8539，诊断准确性较高，当HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞的比例大于17.1％时，敏感性和特异性分别是74.47％和93.33％，具有较好的临床诊断特性。

参考图3-4，与健康志愿者相比，噬血细胞性淋巴组织细胞增多症患者外周血中HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞的比例显著升高，差异具有统计学意义。经过ROC曲线分析发现，AUC为0.8636，检测灵敏度为85％，特异性为81.82％。

上述结果表明，HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞是一个诊断效果很好的诊断再生障碍性贫血和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症的早期标记物，具有很高的临床应用价值，可及时指导临床用药，降低再生障碍性贫血和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症的相关发病率和死亡率，减轻患者的负担和痛苦。因此，HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞检测试剂可作为再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症的早期诊断试剂，用于制备再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症早期诊断试剂盒。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在制备再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症检测试剂中的应用。

2.HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在筛选再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症检测试剂中的应用。

3.HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞检测试剂在制备再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症检测试剂盒中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症患者中表达显著高于正常人群。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒为HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞含量检测试剂盒。

6.如权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为流式细胞术检测试剂。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为流式细胞术检测抗体。

8.一种再生障碍性贫血或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在生物样本中的含量的试剂。

9.如权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测HLA-DR⁺CD14⁺CD56⁺单核细胞在生物样本中的含量的试剂包含抗HLA-DR抗体、抗CD14抗体和抗CD56抗体，优选地，所述抗HLA-DR抗体包括HLA-DR-APC-cy7；所述抗CD14抗体包括CD14-APC；所述抗CD56抗体包括CD56-PE-CF594。

10.如权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括外周血单个核细胞分离试剂、红细胞裂解液和PBS缓冲液。