CN115166252A - 淋巴细胞亚群分群与定量检测试剂盒及其检测方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淋巴细胞亚群分群与定量检测试剂盒，所述检测试剂盒至少包括一个试剂容器，所述试剂容器内装有单克隆抗体混合物。本发明基于流式细胞质谱检测原理，提供了在单细胞水平上多种标记有不同稀有金属元素的单克隆抗体同时与待分析的免疫细胞表面的抗原进行特异性的结合，通过对逐个单细胞表面的稀有金属元素含量和种类进行同时检测分析，确定细胞表面的抗原种类的含量，用于对样本中的免疫细胞亚群进行精细分群鉴定和定量的分析方法。为多种临床疾病的诊断、分级、治疗和预后监测提供辅助诊断信息。通过对免疫细胞中的亚群进行鉴定和数量进行定量分析，及时为临床的疾病诊断、治疗和监测提供信息，有较大的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，具体涉及淋巴细胞鉴定与定量检测试剂盒及其检测方法，尤其涉及淋巴细胞亚群分群与定量检测试剂盒及其检测方法与应用。
背景技术
人体的免疫系统由数量庞大以及类型非常丰富的免疫细胞组成。免疫细胞主要有两大类，淋巴细胞以及骨髓细胞。其中骨髓细胞有粒细胞，单核细胞等。按照细胞形态以及功能的差别又可以分为嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，中性粒细胞。单核细胞受不同种类的细胞分化因子刺激又会分化成各种类型的巨噬细胞或树突状细胞。淋巴细胞是白细胞的一种，是参与机体免疫应答功能最重要的细胞组成成分。按照淋巴细胞分化来源、细胞表面携带的表面抗原以及参与功能的不同，分为T淋巴细胞，B淋巴细胞、自然杀伤细胞等类别。其中T细胞又可分为细胞毒性T细胞，辅助性T细胞，调节性T细胞，记忆T细胞等；B细胞又可分为初始B细胞，浆细胞，记忆B细胞等亚细胞类群。
目前在免疫学领域目前已经发现了上百种细胞表面标志物，不同谱系细胞在分化、成熟、活化过程中，出现或者消失的特定抗原，称为分化抗原(CD分子)。这些CD分子主要是免疫细胞表面的黏附分子，细胞因子/趋化因子受体等。该特定抗原可以被特定的抗体所识别。这些CD分子在不同类型的免疫细胞上具有高度的差异性，通过对这些细胞表面标志物的分析可以将免疫细胞分为更为细致的亚细胞分类群，例如辅助性T细胞又可进一步分成原始辅助性T细胞，1型辅助T细胞，2型辅助T细胞，9型辅助T细胞，17型辅助T细胞，22型辅助T细胞，辅助性耗竭T细胞，辅助效应记忆T细胞，辅助中心记忆T细胞等。
免疫细胞分型和多种疾病有着密切的关系。对免疫细胞亚群的绝对定量或多种类群细胞的相对定量，对于如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、I型糖尿病，炎症、病毒感染等多种疾病的临床诊断、分析发病机制、检测治疗效果具有非常重大的意义。例如CD4+T淋巴细胞的绝对计数，临床上可用于HIV感染者的疾病分期，以及并发症判断；单核细胞表面HLA-DR的表达与手术和创伤后患者的预后成正相关；CD4/CD8 T淋巴细胞比值异常升高常见于类风湿性关节炎，I型糖尿病，以及器官移植后CD4/CD8比例明显升高预示免疫排斥发生的可能性较高；CD4+/CD25+/Foxp3+T细胞是免疫耐受的重要参与者，其数量异常可能导致自身免疫疾病的发生，也会用作骨髓移植术前术后的跟踪。
现有用于免疫细胞分型的方法主要有：免疫酶标法，流式细胞术法等。其中免疫酶标法是基于抗原抗体反应，对一个群体的免疫细胞所携带的一个或几个标志物进行检测，这种方法无法在单细胞水平进行检测，需要的样本细胞数量大，无法同时检测多种细胞标志物，而且存在检测范围窄，操作复杂等缺点，在临床应用中只能检测少数几个特定细胞类型。
流式细胞术通过多种抗体组合方式，可以在单细胞水平对免疫细胞做足够细致的亚细胞类群分型，其操作相对简单，在临床中得到广泛的应用。但是目前常规的荧光流式细胞术在使用中也存在明显的不足之处：(1)当多通道荧光标记同时使用时，由于荧光分子发射光谱宽，荧光发射光谱之间存在重叠，甚至会出现假阳性信号而干扰检测结果，进一步限制多种不同荧光分子同时用于分析。
(2)为了避免荧光光谱重叠带来的干扰，目前通过荧光补偿的方法修正信号的采集，但是这种荧光补偿为手动和主观判断为依据的调节，调节的效果因人而异，对结果的真实性带来不确定性。
(3)尽管采用了荧光补偿进行修正，但临床中应用流式细胞术通常采用最多6色组合方案，以保证分析的可靠性，无法在同一个细胞样品中同时对更多的标志分子进行检测；当需要进行多指标(6色以上)同时检测时，就需要将指标拆分成多个平行的检测管进行染色检测分析，由此一个样本检测变成多个样本检测，操作时间和样本用量增加，检测试剂浪费，检测速度降低。
(4)此外分析样本中可能会含有一定量自荧光，在检测分析中产生自发荧光，对结果产生一定的干扰。
由于体内免疫细胞根据细胞表面抗原表达种类和数量差异，有众多亚群，亚群占比也不均匀，如何通过细胞表面抗原的种类和表达多少的检测对免疫细胞亚群的鉴定，以及从众多的免疫细胞中，便捷、快速并准确的检测出待分析细胞亚群对免疫细胞亚群的定量是亟待解决的。
因此，在单细胞水平上进行多种指标的检测，用于免疫细胞的亚群的鉴定和定量上亟需一种操作方便、性能优异和成本更低的检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计基于流式细胞质谱检测原理，用于对样本中的免疫细胞亚群进行精细分群鉴定和定量的分析方法。
本发明基于在单细胞水平上多种标记有不同稀有金属元素的单克隆抗体同时与待分析的免疫细胞表面的抗原进行特异性的结合，再通过对逐个单细胞表面的稀有金属元素含量和种类进行同时检测分析，确定细胞表面的抗原种类的含量。本发明方法用于对临床样本中的免疫细胞亚群进行精细分群鉴定和定量的分析方法。为多种临床疾病的诊断、分级、治疗和预后监测提供辅助诊断信息。
本发明提供了淋巴细胞亚群分群与定量检测试剂盒及其检测方法与应用。
本发明提供淋巴细胞亚群分群与定量检测试剂盒，所述检测试剂盒至少包括一个试剂容器，所述试剂容器内装有单克隆抗体混合物。
所述单克隆抗体混合物为149SmSm(149钐)标记的CD45抗体、209Bi(209铋)标记的CD3抗体、141Pr(141镨)标记的CD4抗体、156Gd(156钆)标记的CD8抗体、163Dy(163镝)标记的CD19抗体、159Tb(159铽)标记的CD16抗体、143Nd(143钕)标记的CD56抗体、166Er(166铒)标记的CD127抗体、164Dy(164镝)标记的CD14抗体、158Gd(158钆)标记的CD25抗体、148Nd(148钕)标记的CD27抗体、160Gd(160钆)标记的CD28抗体、154Sm(154钐)标记的CD38抗体、168Er(168铒)标记的CD45RA抗体和165Ho(165钬)标记的HLA-DR抗体。
进一步地，所述单克隆抗体混合物中，各单克隆抗体质量分别为：0.1-2.0μg的149Sm标记的CD45抗体、0.1-2.0μg的209Bi标记的CD3抗体、0.1-2.0μg的141Pr标记的CD4抗体、0.02-1.0μg的156Gd标记的CD8抗体、0.1-2.0μg的163Dy标记的CD19抗体、0.1-2.0μg的159Tb标记的CD16抗体、0.25-2.0μg的143Nd标记的CD56抗体、0.25-2.0μg的166Er标记的CD127抗体、0.25-2.0μg的164Dy标记的CD14抗体、0.1-2.0μg的158Gd标记的CD25抗体、0.1-2.0μg的148Nd标记的CD27抗体、0.1-2.0μg的160Gd标记的CD28抗体、0.1-2.0μg的154Sm标记的CD38抗体、0.1-2.0μg的168Er标记的CD45RA抗体和0.1-2.0μg的165Ho标记的HLA-DR抗体。
所述抗体混合溶液体积为10-50μL，优选10μL，更优选20μL。
本发明通过对15种免疫细胞表型鉴定的单克隆抗体进行组合使用，可以同时对免疫细胞中的单核细胞、淋巴细胞以及淋巴细胞中的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)淋巴细胞亚群进行鉴定和定量，同时还可以对T淋巴细胞中的CD4+和CD8+的T淋巴细胞中的CD28+/CD38+/HLA-DR+/CD25+/CD127+/CD45RA+的淋巴细胞亚群进行鉴定和定量，此外还可以对B淋巴细胞中的CD27+/CD38+的细胞亚群进行鉴定和定量。
本发明的另一目的是提供了淋巴细胞亚群精细分群鉴定与定量检测试剂盒的检测方法：
该方法包括下列步骤：
(1)收集待检测样本，制成单细胞悬液；
(2)将抗体混合溶液与单细胞悬液进行混合，对细胞表面多种抗原靶点进行抗体染色；
(3)将染色后的细胞样本用细胞固定剂进行细胞固定，同时对细胞DNA核进行染色；
(4)将染色好的细胞样本通过流式质谱系统进行检测，收集原始信息数据；
(5)基于所得到的流式细胞质谱的检测数据，将采集的原始数据，转化为细胞表面蛋白种类和含量的信息；经过数据的处理和降维算法计算后，绘制二维散点图、SPADE图等可视化展示数据，分析样本中细胞亚群的种类和相对比例含量。
本发明方法所述步骤(1)，单细胞悬浮样本选自外周血样本、骨髓样本、脑脊液样本或组织细胞液样本；所述样本经过红细胞裂解或密度梯度离心得到不含红细胞的单细胞样本悬液；
所述步骤(2)，使用的金属元素标记的抗体混合溶液为免疫细胞精细分群的组合形式，包括识别靶点抗原的抗体和金属标签：
| 识别靶点抗原的抗体 | 金属元素标签 |
| CD45抗体 | 149Sm(149钐) |
| CD3抗体 | 209Bi(209铋) |
| CD4抗体 | 141Pr(141镨) |
| CD8抗体 | 156Gd(156钆) |
| CD19抗体 | 163Dy(163镝) |
| CD16抗体 | 159Tb(159铽) |
| CD56抗体 | 143Nd(143钕) |
| CD127抗体 | 166Er(166铒) |
| CD14抗体 | 164Dy(164镝) |
| CD25抗体 | 158Gd(158钆) |
| CD27抗体 | 148Nd(148钕) |
| CD28抗体 | 160Gd(160钆) |
| CD38抗体 | 154Sm(154钐) |
| CD45RA抗体 | 168Er(168铒) |
| HLA-DR抗体 | 165Ho(165钬) |
其中：
单核细胞为CD14+细胞
淋巴细胞为CD14-CD45+的细胞；
T淋巴细胞为CD14-CD45+CD3+细胞；
辅助性T淋巴细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+细胞；
CD4+初始T细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+CD27+CD45RA+细胞；
CD4+中央记忆性T细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+CD27+CD45RA-细胞；
CD4+效应记忆性T细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+CD27-CD45RA-细胞；
CD4+终末期细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+CD27-CD45RA+细胞；
辅助性T细胞活化细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+HLA-DR+细胞；
辅助性T细胞功能/激活细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+CD28+细胞；
调节性T淋巴细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+CD25+CD127+细胞；
杀伤性T淋巴细胞为CD14-CD45+CD3+CD8+细胞；
CD8+初始T细胞为CD14-CD45+CD3+CD8+CD27+CD45RA+细胞；
CD8+中央记忆性T细胞为CD14-CD45+CD3+CD8+CD27+CD45RA-细胞；
CD8+效应记忆性T细胞为CD14-CD45+CD3+CD8+CD27-CD45RA-细胞；
CD8+终末期细胞为CD14-CD45+CD3+CD8+CD27-CD45RA+细胞；
杀伤性T细胞功能/激活细胞为CD14-CD45+CD3+CD8+CD28+细胞；
抑制性T细胞为CD14-CD45+CD3+CD4-CD8+CD28-PD-1+细胞；
B淋巴细胞为CD14-CD45+CD3-CD19+细胞；
记忆性B细胞为CD14-CD45+CD3-CD19+CD27+CD38-细胞；
初始B细胞为CD14-CD45+CD3-CD19+CD27-细胞；
浆母细胞为CD14-CD45+CD3-CD19+CD38+细胞；
自然杀伤细胞为CD14-CD45+CD3-CD19-CD16/CD56+细胞；
所述步骤(3)，细胞固定剂为甲醛溶液和DNA染核剂(Ir(铱)嵌合剂)的混合溶液。
所述步骤(4)，将制备好的细胞样品，在流式细胞质谱仪系统上进行检测，收集细胞表面标记金属元素的强度原始信息数据。
所述步骤(5)，流式细胞质谱仪所采集的原始数据，经过FlowJo或FCS Express软件数据处理和降维算法绘制二维散点图或热图等，转化为细胞表面蛋白种类和含量的信息用于细胞种类和相对比例含量的分析。
本发明的又一目的是提供了淋巴细胞亚群精细分群鉴定与定量检测试剂盒在检测细胞中的应用。
本发明通过对15种免疫细胞表型鉴定的单克隆抗体进行组合使用，可以同时对免疫细胞中的单核细胞、淋巴细胞以及淋巴细胞中的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)淋巴细胞亚群进行鉴定和定量，同时还可以对T淋巴细胞中的CD4+和CD8+的T淋巴细胞中的CD28+/CD38+/HLA-DR+/CD25+/CD127+/CD45RA+的淋巴细胞亚群进行鉴定和定量，此外还可以对B淋巴细胞中的CD27+/CD38+的细胞亚群进行鉴定和定量。
本发明与现有技术相比较有显著的进步和效果：
(1)本发明克服了现有的荧光流式检测方法中，对于多个指标(6个以上)同时检测用于免疫细胞多种亚群的精细分群鉴定和定量时需要将待分析的指标分配到多个分组中分别进行分析的不足之处。由于15个抗体上连接的都是各不相同的金属元素标签，配套的流式质谱仪系统可以同时识别采集，因而可以对样本中的15个指标进行同时检测，无需拆分成多管分别进行分析，大大方便了试验操作，且节约了检测试剂的使用，且节约样本使用，也节省样本检测时间，提高了检测的效率。
(2)本发明中15种金属标记的单克隆抗体，由于金属元素各不相同，不存在通道信号重叠问题，无需对信号进行人工补偿，避免了数据因为人工调整补偿或补偿主观判断的不准确性，进一步提升检测结果的准确性。
(3)本发明通过对金属标签种类的组合，避免金属在离子化过程中产生的氢化物或氧化物对免疫细胞亚群中稀有亚群的鉴定和定量的干扰。
(4)本发明利用抗体上连接的稀有金属元素为检测信号来源，稀有金属在待分析的细胞样本中含量极低，甚至没有，几乎不存在样本自发荧光带来的干扰，可以有效避免样本自发荧光带来的检测结果不准确性，进一步提升检测结果的准确性。
本发明基于流式细胞质谱检测原理，在单细胞水平上多种标记有不同稀有金属元素的单克隆抗体同时与待分析的免疫细胞表面的抗原进行特异性的结合，再通过对逐个单细胞表面的稀有金属元素含量和种类进行同时检测分析，确定细胞表面的抗原种类的含量，用于对样本中的免疫细胞亚群进行精细分群鉴定和定量的分析方法。为多种临床疾病的诊断、分级、治疗和预后监测提供辅助诊断信息。通过对免疫细胞中的亚群进行鉴定和数量进行定量分析，及时为临床的疾病诊断、治疗和监测提供信息，有较大的临床应用价值。
附图说明
图1，实施例1利用本发明的核心抗体组合更精细分群鉴定抗体组合成基础淋巴细胞亚群精细分群组合，对外周血样本中的细胞进行鉴定和定量分析的结果树状图
其中：粒细胞为CD14-CD66b+细胞；
单核细胞为CD14+CD66b-细胞；
树突细胞为HLA-DR+CD123+细胞；
淋巴细胞为：CD14-CD66b-细胞
T淋巴细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+细胞；
TCRγδT细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+TCRgd+细胞；
TCRαβT细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+TCRab+细胞；
辅助性T淋巴细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD4+细胞；
CD4+初始T细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD4+CD27+CD45RA+细胞；
CD4+中央记忆性T细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD4+CD27+CD45RA-细胞；
CD4+效应记忆性T细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD4+CD27-CD45RA-细胞；
CD4+终末期细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD4+CD27-CD45RA+细胞；
1型辅助T细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD4+CD8-CD183+CD196-CD194-细胞；
2型辅助T细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD4+CD8-CD183-CD196-CD194+细胞；
辅助性T细胞活化细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD4+HLA-DR+细胞；
辅助性T细胞功能/激活细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD4+CD28+细胞；
纯真T细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD4+CD45RA+CD62L+/CD197+细胞；
杀伤性T淋巴细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD8+细胞；
CD8+初始T细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD8+CD27+CD45RA+细胞；
CD8+中央记忆性T细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD8+CD27+CD45RA-细胞；
CD8+效应记忆性T细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD8+CD27-CD45RA-细胞；
CD8+终末期细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD8+CD27-CD45RA+细胞；
杀伤性T细胞功能/激活细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD8+CD28+细胞；
抑制性T细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD4-CD8+CD28-细胞；
调节性T淋巴细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3+CD8+CD25+CD127-细胞；
B淋巴细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3-CD19+细胞；
记忆性B细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3-CD19+CD27+CD38-细胞；
初始B细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3-CD19+CD27-细胞；
成熟B细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3-CD19+CD20+IgD+细胞；
调节B细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3-CD19+CD20+CD24+细胞；
过度性B细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3-CD19+CD20+CD27-IgD-CD24+CD38+细胞；浆母细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3-CD19+CD27+CD38+细胞；
自然杀伤细胞为CD14-CD66b-CD45+CD3-CD19-CD16/CD56+细胞；
图2，实施例2参照实施例1中的基础淋巴细胞亚群精细分群抗体组合与CD64使用，对感染患者的外周血样本中的细胞进行鉴定和定量分析的结果树状图其中，鉴定出的粒细胞为CD14-CD66b+细胞，粒细胞CD64的表达水平检测，可为患者感染的分级诊断以及治疗预后提供辅助诊断信息。
图3，实施例3参照实施例1中的基础淋巴细胞亚群精细分群抗体组合与CD161联合使用，对结核感染患者的外周血样本中的细胞进行鉴定和定量分析的结果树状图
其中：
可以鉴定出CD161+的T细胞亚群，可用于结核感染患者、结核潜伏感染者和健康人的区分提供辅助诊断信息。
图4，实施例4参照实施例1中的基础淋巴细胞亚群精细分群抗体组合与PD-L1联合使用，对肿瘤患者的实体瘤组织样本中的细胞进行鉴定和定量分析的结果树状图
其中：
可以鉴定出PD-L1+的细胞亚群。
图5，实施例5参照实施例1中的基础淋巴细胞亚群精细分群抗体组合与PD-1联合使用，对肿瘤患者的外周血样本中的细胞进行鉴定和定量分析的结果树状图
其中：
可以鉴定出PD-1+的细胞亚群。
具体实施方式
本实施例所用试剂除另有说明外，均可市售得到。
FACS溶血素(碧迪生命科学)
细胞染色液包括：磷酸盐(PBS)缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)和乙二胺四乙酸(EDTA)；所述细胞染色液中各物质占比为：BSA 0.2-1.0％，EDTA 0.03-0.3％，其余为PBS缓冲液；(品牌上海宸安生物)
细胞固定剂包括：多聚甲醛、Ir(铱)嵌合剂和PBS缓冲液；所述细胞固定剂中各物质的质量占比为：多聚甲醛2-8％，Ir(铱)嵌合剂0.01％-0.1％，其余为PBS缓冲液；(上海宸安生物科技有限公司，简称上海宸安生物)
上样缓冲液为质谱级纯化水(上海宸安生物科技有限公司)
实施例1：利用本发明的核心抗体组合更精细分群鉴定抗体形成基础淋巴细胞亚群精细分群组合对外周血样本中的细胞进行鉴定和定量分析。
(一)试剂
*抗体混合溶液中各抗体的含量和金属标签信息如下表所示：
| 识别靶点抗原 | 金属标签 | 用量 |
| CD45 | 149Sm | 0.5μg |
| CD3 | 209Bi | 0.5μg |
| CD4 | 141Pr | 0.25μg |
| CD8 | 156Gd | 0.0625μg |
| CD19 | 163Dy | 0.5μg |
| CD16 | 159Tb | 0.5μg |
| CD56 | 143Nd | 1.0μg |
| CD127 | 166Er | 1.0μg |
| CD14 | 164Dy | 0.125μg |
| CD25 | 158Gd | 0.5μg |
| CD27 | 148Nd | 0.5μg |
| CD28 | 160Gd | 0.25μg |
| CD38 | 154Sm | 0.25μg |
| CD45RA | 168Er | 1.0μg |
| HLA-DR | 165Ho | 0.25μg |
| CD66b | 169Tm | 0.5μg |
| IgD | 142Nd | 0.5μg |
| CD197 | 144Nd | 0.5μg |
| CD24 | 162Dy | 0.25μg |
| CD183 | 161Dy | 1.0μg |
| CD196 | 153Eu | 1.0μg |
| TCRγδ | 145Nd | 0.5μg |
| TCRαβ | 152Sm | 0.5μg |
| CD123 | 155Gd | 0.5μg |
| CD194 | 147Sm | 1.0μg |
| CD20 | 167Er | 0.5μg |
| CD45RO | 151Eu | 0.5μg |
| CD62L | 146Nd | 0.5μg |
(二)检测方法：
(1)在来自医院的EDTA(乙二胺四乙酸)抗凝的人外周血样本100μL中加入800μL的溶血素，室温(18-25℃)温和旋转孵育10分钟，然后600g离心10分钟去除上清；
(2)加入10mL细胞染色液，500g离心10分钟去除上清后，用1mL的细胞染色液重悬细胞，得到白细胞单细胞悬液1mL；
(3)取上述含有3x106个细胞的白细胞单细胞悬液中加入金属标记的抗体混合溶液20μL，室温孵育30分钟；
(4)加入2mL细胞染色液，500g离心5分钟弃上清,洗涤掉多余抗体，然后加入含有Ir-DNA嵌合剂的细胞固定剂100μL，室温固定10分钟；
(5)加入2mL细胞染色液洗涤样本，500g离心5分钟去除上清；
(6)2mL的上样缓冲液洗涤样本后，500g离心10分钟去除上清，然后加入2mL上样缓冲液重悬细胞样本，准备上机检测；
(7)用流式细胞质谱检测系统(泰州宸安生物的Starion-M1型)对样本进行检测；
流式细胞质谱系统所采集的原始数据，经过数据分析处理软件FlowJo转换为细胞蛋白信息，经过数据处理和降维算法计算后，进行可视化数据展示，绘制SPADE树状图，对免疫细胞分型亚群组成和数量进行分析。
试验结果：
与常规流式荧光检测方法相比较，本发明的优势在于：
(1)对于需要同时检测分析多种(6个以上)指标的细胞样本，本试剂盒相比较传统和目前常规的流式荧光检测方法具有无法比拟的优势。
(2)通常荧光流式只能进行6个以内的标志物的检测，由于荧光通道的数量限制，以及荧光通道间的光谱重叠，通常都需要复杂的荧光手动补偿，且6个以上的标志物难以同时检测，通常需要分为几个平行组同时染色，再将结果整合分析，既浪费时间又浪费抗体试剂；而本试剂盒，可以通过一次细胞染色，可以实现十个以上，甚至30个以上的细胞抗体指标的同时检测，及细胞亚群的定量检测。
(3)本实施例中28个指标检测的同时检测，本发明方法无需将样本分管做，也不需要通道间信号的手动补偿。结果准确性更好，节省操作时间，同时也更节省抗体试剂。而荧光流式方法则需要将样本分成至少5管以上才能完成28个指标的同时检测，且各个指标间荧光通道的配色复杂，操作难度大，试剂浪费多。
实施例2：利用本发明对感染患者的免疫细胞亚群进行鉴定和定量
参照实施例1中的基础淋巴细胞亚群精细分群抗体组合与CD64联合使用的方法，对感染患者的外周血样本中的细胞进行鉴定和定量分析。
(一)试剂
*抗体混合溶液中各抗体的含量和金属标签信息如下表所示：
(二)检测方法：
检测方法步骤同实施例1中方法相同。
试验结果：
其中，鉴定出的粒细胞为CD14-CD66b+细胞，粒细胞CD64的表达水平检测，可为患者感染的分级诊断以及治疗预后提供辅助诊断信息。
实施例3：利用本发明对结核感染患者的免疫细胞亚群进行鉴定和定量
参照实施例1中的基础淋巴细胞亚群精细分群抗体组合与CD161联合使用的方法，对结核感染患者的外周血样本中的细胞进行鉴定和定量分析。
(一)试剂
抗体混合溶液中各抗体的含量和金属标签信息如下表所示：
(二)检测方法：
检测方法步骤同实施例1中方法相同。
试验结果：
其中：
可以鉴定出CD161+的T细胞亚群，可用于结核感染患者、结核潜伏感染者和健康人的区分提供辅助诊断信息。
实施例4：利用本发明对非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中的细胞亚群进行鉴定和定量
参照实施例1中的基础淋巴细胞亚群精细分群抗体组合与PD-L1联合使用的方法，对肿瘤患者的实体瘤组织样本中的细胞进行鉴定和定量分析。
(一)试剂
*抗体混合溶液中各抗体的含量和金属标签信息如下表所示：
| 识别靶点抗原 | 金属标签 | 用量 |
| CD45 | 149Sm | 0.5μg |
| CD3 | 209Bi | 0.5μg |
| CD4 | 141Pr | 0.25μg |
| CD8 | 156Gd | 0.0625μg |
| CD19 | 163Dy | 0.5μg |
| CD16 | 159Tb | 0.5μg |
| CD56 | 143Nd | 1.0μg |
| CD127 | 166Er | 1.0μg |
| CD14 | 164Dy | 0.125μg |
| CD25 | 158Gd | 0.5μg |
| CD27 | 148Nd | 0.5μg |
| CD28 | 160Gd | 0.25μg |
| CD38 | 154Sm | 0.25μg |
| CD45RA | 168Er | 1.0μg |
| HLA-DR | 165Ho | 0.25μg |
| CD66b | 169Tm | 0.5μg |
| IgD | 142Nd | 0.5μg |
| CD197 | 144Nd | 0.5μg |
| CD24 | 162Dy | 0.25μg |
| CD183 | 161Dy | 1.0μg |
| CD196 | 153Eu | 1.0μg |
| TCRγδ | 145Nd | 0.5μg |
| TCRαβ | 152Sm | 0.5μg |
| CD123 | 155Gd | 0.5μg |
| CD194 | 147Sm | 1.0μg |
| CD20 | 167Er | 0.5μg |
| CD45RO | 151Eu | 0.5μg |
| CD62L | 146Nd | 0.5μg |
| PD-L1 | 170Er | 0.5μg |
(二)检测方法：
检测方法步骤同实施例1中方法相同。
试验结果：
其中：
从结果中，可以鉴定出淋巴细胞各亚群和相对比例，以及PD-L1+的细胞亚群。
实施例5：利用本发明对肿瘤患者的外周血中免疫细胞亚群进行鉴定和定量
参照实施例1中的基础淋巴细胞亚群精细分群抗体组合与PD-1联合使用的方法，对肿瘤患者的外周血样本中的细胞进行鉴定和定量分析。
(一)试剂
*抗体混合溶液中各抗体的含量和金属标签信息如下表所示：
(二)检测方法：
检测方法步骤同实施例1中方法相同。
试验结果：
其中:
从结果中可以鉴定出PD-1+T淋巴细胞亚群和相应比例。
Claims (10)
1.淋巴细胞亚群分群与定量检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒至少包括一个试剂容器，所述试剂容器内装有单克隆抗体混合物。
2.根据权利要求1所述的淋巴细胞亚群分群与定量检测试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体混合物为149Sm标记的CD45抗体、209Bi标记的CD3抗体、141Pr标记的CD4抗体、156Gd标记的CD8抗体、163Dy标记的CD19抗体、159Tb标记的CD16抗体、143Nd标记的CD56抗体、166Er标记的CD127抗体、164Dy标记的CD14抗体、158Gd标记的CD25抗体、148Nd标记的CD27抗体、160Gd标记的CD28抗体、154Sm标记的CD38抗体、168Er标记的CD45RA抗体和165Ho标记的HLA-DR抗体。
3.根据权利要求2所述的淋巴细胞亚群分群与定量检测试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体混合物中，各单克隆抗体质量分别为：0.1-2.0μg的149Sm标记的CD45抗体、0.1-2.0μg的209Bi标记的CD3抗体、0.1-2.0μg的141Pr标记的CD4抗体、0.02-1.0μg的156Gd标记的CD8抗体、0.1-2.0μg的163Dy标记的CD19抗体、0.1-2.0μg的159Tb标记的CD16抗体、0.25-2.0μg的143Nd标记的CD56抗体、0.25-2.0μg的166Er标记的CD127抗体、0.25-2.0μg的164Dy标记的CD14抗体、0.1-2.0μg的158Gd标记的CD25抗体、0.1-2.0μg的148Nd标记的CD27抗体、0.1-2.0μg的160Gd标记的CD28抗体、0.1-2.0μg的154Sm标记的CD38抗体、0.1-2.0μg的168Er标记的CD45RA抗体和0.1-2.0μg的165Ho标记的HLA-DR抗体。
4.根据权利要求1所述的淋巴细胞亚群分群与定量检测试剂盒，其特征在于，所述抗体混合物的溶液体积为10-50μL，优选10μL，更优选20μL。
5.淋巴细胞亚群精细分群鉴定与定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
(1)收集待检测样本，制成单细胞悬液；
(2)将抗体混合溶液与单细胞悬液进行混合，对细胞表面多种抗原靶点进行抗体染色；
(3)将染色后的细胞样本用固定剂进行细胞固定，同时对细胞DNA核进行染色；
(4)将染色好的细胞样本通过流式质谱系统进行检测，收集原始信息数据；
(5)基于所得到的流式细胞质谱的检测数据，将采集的原始数据，转化为细胞表面蛋白种类和含量的信息；经过数据的处理和降维算法计算后，绘制二维散点图、SPADE图等可视化展示数据，分析样本中细胞亚群的种类和相对比例含量。
6.根据权利要求5所述的淋巴细胞亚群精细分群鉴定与定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)，单细胞悬浮样本选自外周血样本、骨髓样本、脑脊液样本或组织细胞液样本；所述样本经过红细胞裂解或密度梯度离心得到不含红细胞的单细胞样本悬液。
7.根据权利要求5所述的淋巴细胞亚群精细分群鉴定与定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)，使用的金属元素标记的抗体混合溶液为免疫细胞精细分群的组合形式，包括识别靶点抗原的抗体和金属标签：
CD45-149Sm、CD3-209Bi、CD4-141Pr、CD8-156Gd、CD19-163Dy、CD16-159Tb、CD56-143Nd、CD127-166Er、CD14-164Dy、CD25-158Gd、CD27-148Nd、CD28-160Gd、CD38-154Sm、CD45RA-168Er、HLA-DR-165Ho；
其中：
单核细胞为CD14+细胞
淋巴细胞为CD14-CD45+的细胞；
T淋巴细胞为CD14-CD45+CD3+细胞；
辅助性T淋巴细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+细胞；
CD4+初始T细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+CD27+CD45RA+细胞；
CD4+中央记忆性T细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+CD27+CD45RA-细胞；
CD4+效应记忆性T细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+CD27-CD45RA-细胞；
CD4+终末期细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+CD27-CD45RA+细胞；
辅助性T细胞活化细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+HLA-DR+细胞；
辅助性T细胞功能/激活细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+CD28+细胞；
调节性T淋巴细胞为CD14-CD45+CD3+CD4+CD25+CD127+细胞；
杀伤性T淋巴细胞为CD14-CD45+CD3+CD8+细胞；
CD8+初始T细胞为CD14-CD45+CD3+CD8+CD27+CD45RA+细胞；
CD8+中央记忆性T细胞为CD14-CD45+CD3+CD8+CD27+CD45RA-细胞；
CD8+效应记忆性T细胞为CD14-CD45+CD3+CD8+CD27-CD45RA-细胞；
CD8+终末期细胞为CD14-CD45+CD3+CD8+CD27-CD45RA+细胞；
杀伤性T细胞功能/激活细胞为CD14-CD45+CD3+CD8+CD28+细胞；
抑制性T细胞为CD14-CD45+CD3+CD4-CD8+CD28-PD-1+细胞；
B淋巴细胞为CD14-CD45+CD3-CD19+细胞；
记忆性B细胞为CD14-CD45+CD3-CD19+CD27+CD38-细胞；
初始B细胞为CD14-CD45+CD3-CD19+CD27-细胞；
浆母细胞为CD14-CD45+CD3-CD19+CD38+细胞；
自然杀伤细胞为CD14-CD45+CD3-CD19-CD16/CD56+细胞。
8.根据权利要求5所述的淋巴细胞亚群精细分群鉴定与定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)，固定剂为甲醛溶液和DNA染核剂Ir嵌合剂的混合溶液；
所述步骤(4)，将制备好的细胞样品，在流式细胞质谱仪系统上进行检测，收集细胞表面标记金属元素的强度原始信息数据；
所述步骤(5)，流式细胞质谱仪所采集的原始数据，经过FlowJo或FCSExpress软件数据处理和降维算法绘制二维散点图或热图等，转化为细胞表面蛋白种类和含量的信息用于细胞种类和相对比例含量的分析。
9.淋巴细胞亚群精细分群鉴定与定量检测试剂盒的应用，其特征在于，所述应用为在检测细胞中的应用。
10.根据权利要求9所述的淋巴细胞亚群精细分群鉴定与定量检测试剂盒的应用，其特征在于，所述在检测细胞中的应用为对15种免疫细胞表型鉴定的单克隆抗体进行组合使用；或同时对免疫细胞中的单核细胞、淋巴细胞以及淋巴细胞中的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤NK淋巴细胞亚群进行鉴定和定量；或同时对T淋巴细胞中的CD4+和CD8+的T淋巴细胞中的CD28+/CD38+/HLA-DR+/CD25+/CD127+/CD45RA+的淋巴细胞亚群进行鉴定和定量；或对B淋巴细胞中的CD27+/CD38+的细胞亚群进行鉴定和定量。
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