CN112147326A - 一种肿瘤免疫细胞亚群分型精准检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞生物学检测技术领域，具体涉及一种肿瘤免疫细胞亚群分型精准检测试剂盒。本发明提供用于单细胞免疫细胞分型检测的标志物及其抗体组合，该组合涵盖了用于免疫基础检测、淋巴系细胞扩展检测和髓系细胞扩展检测的共计42个标志物及其金属预标记抗体。利用该抗体组合和质谱流式细胞技术进行免疫细胞的分型检测，可满足多样的检测需求，实现复杂的肿瘤免疫细胞异质性的精准检测以及免疫细胞亚群的快速、精准分型，且无需各通道单染对照和计算补偿，有效节约了样品，提高了检测效率。

Description

一种肿瘤免疫细胞亚群分型精准检测试剂盒

技术领域

本发明涉及细胞生物学检测技术领域，具体涉及一种肿瘤免疫细胞亚群分型精准检测试剂盒。

背景技术

肿瘤微环境中包含了除了肿瘤细胞以外的众多免疫细胞，免疫细胞在肿瘤的发生、发展和临床肿瘤免疫疗法中发挥着关键作用。肿瘤微环境受到免疫细胞的影响，免疫状态也影响着肿瘤疾病进程。无论是肿瘤组织微环境还是外周血循环系统中，免疫细胞都具有非常重要的检测意义和临床诊断价值。检测肿瘤患者免疫系统状态，可以对肿瘤患者进行精准分型并指导后续治疗。

传统的肿瘤免疫检测的细胞或分子水平的大多数分析方法和技术手段都是建立在群体细胞基础上的，无法在系统层面解决肿瘤发生发展和转移过程中肿瘤微环境中多种类型细胞同时共存相互作用的复杂肿瘤异质性问题。监测肿瘤患者的免疫系统状态具有重要的意义，然而，由于技术手段的缺陷，导致以往对肿瘤免疫微环境中的各类免疫细胞的检测精度不够，结果过于片面，例如：传统流式细胞技术中，荧光信号的交叠限制了荧光通道的数量增长，而且通道的发射光谱严重重叠，需要设置空白组、阴性对照组及各通道的单染组，使得操作复杂，并需要进行复杂的补偿计算，一次实验检测的通道数有限(通常<10个检测通道)，且对于样品消耗量巨大，难以全面对包括组织和血液在内的肿瘤免疫微环境中的复杂免疫细胞亚群进行精细的分型和特征检测，无法满足临床检测对复杂免疫系统的特征精细精准检测的需求。

质谱流式细胞技术(Mass Cytometry，CyTOF)是近年来刚发展起来的单细胞分子分型技术，其使用金属元素作为抗体分子的标签并利用ICP质谱检测系统对单细胞表面及内部多种蛋白分子同时进行检测。与传统流式细胞技术相比，具有检测通道多、通道间干扰小等特点，可以实现单细胞多指标蛋白表达检测的目的。质谱流式技术是全面深入分析肿瘤免疫细胞亚群的重要手段，可用于鉴定出新的免疫细胞亚群，很好的表征肿瘤免疫动态变化，为寻找疾病诊断指标、治疗靶点以及预后指标提供重要的研究基础。

目前常用的质谱流式系统包括Fluidigm公司生产的质谱流式系统CyTOF，该系统的检测功能强大，且已有超过600种已经过金属标记的专用于质谱流式分析的抗体，但是仍存在金属标记抗体来源单一、金属预标记抗体种类太少、成本昂贵、实验操作复杂等缺点。目前仍缺少直接用于肿瘤免疫细胞全面监测和快速精准分型的检测试剂盒，因此，开发基于质谱流式细胞检测技术的肿瘤免疫细胞亚群分型检测试剂盒具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供用于免疫细胞亚群分型的标志物组合以及用于检测该标志物组合的抗体组合。本发明的另一目的是提供含有该抗体组合、可用于肿瘤免疫细胞亚群分型的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明对免疫细胞各亚群的分型标志物进行了分析和组合方式筛选，以期获得能够以较少的分型标志物组合获得全面、精准的免疫细胞亚群分型。经大量筛选和验证，本发明获得了分别用于免疫基础检测标志物组合、淋巴系细胞扩展检测标志物组合和髓系细胞扩展检测标志物组合，利用这些标志物组合可实现免疫细胞亚群的精准分型。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供用于免疫细胞亚群分型的标志物组合，其包括选自标志物组合I、标志物组合II和标志物组合III中的一个或多个；

其中，所述标志物组合I包括CD45、CD3、CD4、CD8a、CD19、CD20、CD56、CD16、CD14、CD15和Ki67；

所述标志物组合II包括CCR4、CCR6、CD25、FOXP3、CD127、TCRγδ、CD45RA、CD45RO、CCR7、CD279、CD278、TIM-3、CTLA-4、LAG-3、CD274、CD27和CD38；

所述标志物组合III包括HLA-DR、CD11c、CCR3、Siglec-8、CD123、CD117、CD11b、CD62L、CD33、CD40L、CD64、CD169、CD204和CD206。

以上标志物组合涵盖了42个免疫细胞检测标志物，可以检测几乎所有肿瘤微环境组织和外周血中的免疫细胞类型，鉴定所有的T细胞亚群(包括T、Treg、central memory T、effector T、effector memory CD4⁺T、CD8⁺T)以及B细胞、NK细胞、粒细胞、单核巨噬细胞亚群等。而且还涵盖了免疫检查点和细胞增殖指标，可以全面反映机体免疫状态。其中，标志物组合I为免疫基础检测panel，包含最为经典的免疫细胞标志物和细胞增殖情况标志物Ki67，可以对于外周血或肿瘤组织中的免疫状态进行基本表征。标志物组合II为淋巴系细胞扩展检测panel，可对于CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞，B细胞等淋巴系细胞进行更为详细的分型检测，几乎涵盖所有淋巴细胞亚群。标志物组合III为髓系细胞扩展检测panel，可对单核细胞，巨噬细胞，粒细胞等进行更深入的分型检测。

以上所述的标志物中，Ki67、FOXP3、CTLA-4和CD40L为胞内蛋白，其他标志物均为胞外(细胞表面)蛋白。

本发明所述的标志物组合可为标志物组合I、标志物组合II、标志物组合III，或者为标志物组合I和标志物组合II、标志物组合I和标志物组合III、标志物组合II和标志物组合III，或者为标志物组合I、标志物组合II和标志物组合III。

对于以上标志物组合，本领域技术人员可根据细胞分型检测的需要进行选择。

为更好地保证免疫细胞分型检测的全面性和精准度，所述标志物组合优选包括标志物组合I以及选自标志物组合II和标志物组合III中的一个或两个。

作为本发明的优选方案，所述标志物组合由标志物组合I、标志物组合II和标志物组合III组成。该标志物组合可很好地实现免疫细胞的全面和精准的分型检测。

由标志物组合I、标志物组合II和标志物组合III组成的标志物组合尤其适用于肿瘤组织或肿瘤患者血液中的免疫细胞的分型检测。在用于肿瘤组织或肿瘤患者血液中的免疫细胞的分型检测时，该标志物组合可有效保证分型检测的全面性和精准度。

第二方面，在以上所述的标志物组合的基础上，本发明进一步提供用于免疫细胞亚群分型的抗体组合，所述抗体组合包括如下(1)、(2)、(3)中的一个或多个组合：

(1)CD45抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD8a抗体、CD19抗体、CD20抗体、CD56抗体、CD16抗体、CD14抗体、CD15抗体和Ki67抗体；

(2)CCR4抗体、CCR6抗体、CD25抗体、FOXP3抗体、CD127抗体、TCRγδ抗体、CD45RA抗体、CD45RO抗体、CCR7抗体、CD279(PD-1)抗体、CD278(ICOS)抗体、TIM-3抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体、CD274(PD-L1)抗体、CD27抗体和CD38抗体；

(3)HLA-DR抗体、CD11c抗体、CCR3抗体、Siglec-8抗体、CD123抗体、CD117抗体、CD11b抗体、CD62L抗体、CD33抗体、CD40L抗体、CD64抗体、CD169抗体、CD204抗体和CD206(MMR)抗体。

为提高检测效率，本发明的以上标志物组合和抗体组合优选结合质谱流式细胞检测技术进行免疫细胞的分型检测。在质谱流式细胞检测技术中，抗体需要被金属元素标记。

以上所述的抗体组合中的抗体被金属元素标记。

优选地，所述金属元素为选自钐Sm、铒Er、钕Nd、钆Gd、镝Dy、镥Lu、钬Ho、镱Yb、铕Eu、铥Tm、镨Pr、钇Y、钌Ru、铑Rh、钯Pd、镉Cd、铟In、镧La、铈Ce、铽Tb、铂Pt、铋Bi中的一种。

本发明进一步优化了各抗体的标记方式及其组合方式，获得了用于免疫细胞分型检测的金属预标记抗体panel。

具体地，所述抗体组合包括如下(1)、(2)、(3)中的一个或多个组合：

(1)¹⁵⁴Sm标记的CD45抗体、¹⁷⁰Er标记的CD3抗体、¹⁴⁵Nd标记的CD4抗体、¹⁴⁶Nd标记的CD8a抗体、^142Nd标记的CD19抗体、¹⁴⁷Sm标记的CD20抗体、¹¹³Cd标记的CD56抗体、¹⁶⁷Er标记的CD16抗体、¹⁶⁰Gd标记的CD14抗体、¹⁵⁸Gd标记的CD15抗体和¹¹⁶Cd标记的Ki67抗体；

(2)¹¹⁰Cd标记的CCR4抗体、¹⁰⁶Cd标记的CCR6抗体、¹⁶²Dy标记的CD25抗体、¹⁵²Sm标记的FOXP3抗体、¹¹²Cd标记的CD127抗体、¹¹¹Cd标记的TCRγδ抗体、¹⁷⁵Lu标记的CD45RA抗体、¹⁶⁶Er标记的CD45RO抗体、¹⁶⁵Ho标记的CCR7抗体、¹⁶³Dy标记的CD279抗体、¹⁵⁵Gd标记的CD278抗体、¹⁶¹Dy标记的TIM-3抗体、¹⁷⁶Yb标记的CTLA-4抗体、¹⁵¹Eu标记的LAG-3抗体、¹⁶⁸Er标记的CD274抗体、¹⁴³Nd标记的CD27抗体和¹⁷⁴Yb标记的CD38抗体；

(3)¹⁷²Yb标记的HLA-DR抗体、¹⁵⁹Tb标记的CD11c抗体、¹¹⁴Cd标记的CCR3抗体、¹⁵⁶Gd标记的Siglec-8抗体、¹⁵⁰Nd标记的CD123抗体、¹⁴⁴Nd标记的CD117抗体、¹⁶⁴Dy标记的CD11b抗体、¹⁵³Eu标记的CD62L抗体、¹⁷¹Yb标记的CD33抗体、¹⁶⁹Tm标记的CD40L抗体、¹⁴¹Pr标记的CD64抗体、¹⁷³Yb标记的CD169抗体、¹⁴⁹Sm标记的CD204抗体和¹⁴⁸Nd标记的CD206抗体。

以上所有金属元素标记的抗体均可通过市售购买途径获得，或者通过本领域常规的金属元素标记抗体的方法制备得到。

为更好地保证抗体与标志物的高效结合，以进一步提高检测效率和精准度，本发明进一步优化了各抗体的选择。

具体地，以上所述的抗体组合中CD45抗体为HI30，CD3抗体为UCHT1，CD4抗体为RPA-T4，CD8a抗体为RPA-T8，CD19抗体为HIB19，CD20抗体为H1(FB1)，CD56抗体为NCAM16.2，CD16抗体为3G8，CD14抗体为RMO52，CD15抗体为HI98，Ki67抗体为Ki67；CCR4抗体为L291H4，CCR6抗体为G034E3，CD25抗体为M-A251，FOXP3抗体为236A/E7，CD127抗体为A019D5，TCRγδ抗体为B1，CD45RA抗体为HI100，CD45RO抗体为UCHL1，CCR7抗体为G043H7，CD279抗体为EH12.2H7，CD278抗体为C398.4A，TIM-3抗体为F38-2E2，CTLA-4抗体为L3D10，LAG-3抗体为11C3C65，CD274抗体为E1L3N，CD27抗体为O323，CD38抗体为HIT2；HLA-DR抗体为L243，CD11c抗体为Bu15，CCR3抗体为5E8，Siglec-8抗体为7C9，CD123抗体为6H6，CD117抗体为104D2，CD11b抗体为ICRF44，CD62L抗体为DREG-56，CD33抗体为WM53，CD40L抗体为24-31，CD64抗体为10.1，CD169抗体为7-239，CD204抗体为351615，CD206抗体为15-2。

以上所有抗体均可根据抗体靶点名称(CD45、CD3等)和克隆号(HI30、UCHT1等)通过市售购买途径获得。

第三方面，本发明提供以上所述的标志物组合或所述的抗体组合在免疫细胞亚群分型检测或肿瘤患者的免疫动态监测中的应用。

第四方面，本发明提供以上所述的标志物组合或所述的抗体组合在制备检测试剂盒中的应用。

具体地，所述检测试剂盒用于单细胞免疫细胞亚群分型检测，或者用于肿瘤患者的免疫动态监测。

第五方面，本发明提供一种用于单细胞免疫细胞亚群分型的试剂盒，其包含所述抗体组合。该试剂盒结合质谱流式细胞检测技术可实现免疫细胞的快速、精确分型，可用于肿瘤患者的免疫细胞亚群分型检测，监测肿瘤患者的免疫动态。

优选地，所述试剂盒还包含选自顺铂、细胞染色缓冲液、封闭液、单细胞指示剂、固定试剂、破膜试剂中的一种或多种。

具体地，所述试剂盒的工作程序包括如下步骤：

(1)处理待测样本，获得单细胞悬液，加入终浓度为5～10μM的顺铂，染色1-3min；

(2)加入终止液终止反应，离心后在去除上清的细胞沉淀中加入封闭液封闭15-25min，再加入所述抗体组合中的胞外蛋白标志物的抗体，各抗体的用量均为0.4～0.6μL，染色25～35min；

(3)加入终止液终止反应，离心后在去除上清的细胞沉淀中加入单细胞指示剂和固定-破膜混合液，反应10-14h；

(4)加入终止液终止反应，离心后在去除上清的细胞沉淀中加入所述抗体组合中的胞内蛋白标志物的抗体，各抗体的用量均为0.4～0.6μL，染色25～35min；

(5)加入终止液终止反应，洗涤细胞后进行质谱流式细胞检测。

第六方面，本发明提供一种肿瘤患者免疫细胞分型的检测方法，其为利用本发明所述的抗体组合或试剂盒以及质谱流式细胞检测技术进行细胞分型。

优选地，所述检测方法包括如下步骤：

(1)处理待测样本，获得单细胞悬液，加入终浓度为5～10μM的顺铂，染色1-3min；

(2)加入终止液终止反应，离心后在去除上清的细胞沉淀中加入封闭液封闭15-25min，再加入所述抗体组合中的胞外蛋白标志物的抗体，各抗体的用量均为0.4～0.6μL，染色25～35min；

(3)加入终止液终止反应，离心后在去除上清的细胞沉淀中加入单细胞指示剂和固定-破膜混合液，反应10-14h；

(4)加入终止液终止反应，离心后在去除上清的细胞沉淀中加入所述抗体组合中的胞内蛋白标志物的抗体，各抗体的用量均为0.4～0.6μL，染色25～35min；

(5)加入终止液终止反应，洗涤细胞后进行质谱流式细胞检测。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的用于单细胞免疫细胞分型检测的标志物及其抗体组合涵盖了免疫基础检测(11个标志物)、淋巴系细胞扩展检测(17个标志物)和髓系细胞扩展检测(14个标志物)，共计42个标志物及其抗体。这些抗体采用金属元素预标记，可利用质谱流式细胞技术进行免疫细胞的分型检测，满足多样的检测需求，实现复杂的肿瘤免疫细胞异质性的精准检测，以及免疫细胞亚群的快速、精准分型。

本发明提供的含有42种金属预标记抗体的检测试剂盒经验证可以实现肿瘤病人组织及外周血中所有免疫细胞亚群的快速、系统、动态、精准的分型。与传统流式细胞分析相比，可利用一次分析实现42个通道的同时检测，快速量化超过50种免疫细胞亚群组成，而且无需各通道单染对照和计算补偿，有效节约了样品，提高了检测效率。

附图说明

图1为本发明实施例2中肿瘤患者的外周血单个核细胞PBMC免疫细胞精准分型的结果。

图2为本发明实施例2中53个亚群分属的细胞大类统计结果。

图3为本发明实施例2中肿瘤患者和正常人的细胞分型比较结果。

图4为本发明实施例2中肿瘤患者和正常人的细胞分型差异统计结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1免疫细胞分型检测抗体panel

本实施例提供1组用于免疫细胞分型检测的抗体panel，该抗体panel共含有42个金属预标记抗体，该抗体panel可以鉴定所有的T细胞亚群(包括T、Treg、central memoryT、effector T、effector memory CD4⁺T、CD8⁺T)以及B细胞、NK细胞、粒细胞、单核巨噬细胞亚群等，还涵盖了免疫检查点和细胞增殖指标。

该抗体panel结合质谱流式细胞检测技术可用于免疫细胞的分型检测，42种抗体使用42个通道。

42个金属预标记抗体的抗体克隆号、金属元素标记以及抗体结合的标志物的信息如表1所示。其中，编号11、15、24、38的标志物为胞内蛋白，其它为胞外(细胞表面)蛋白。

表1抗体panel信息

实施例2抗体panel在肿瘤患者免疫细胞分型中的应用

本实施例利用实施例1的抗体panel进行肿瘤患者免疫细胞的分型检测，具体方法如下：

1、准备新鲜的正常人和肿瘤患者的外周血，提取外周血单个核细胞PBMC。

2、将步骤1提取的外周血单个核细胞PBMC平均分成对照组和实验组两组，每组约3×10⁶个细胞，分别用PBS重悬，调节体积至1mL。

3、加入终浓度为5μM的顺铂(Cell-ID Cisplatin，201094，Fluidigm)，室温染色2min。

4、加入2ml Cell Staining Buffer(201068，Fluidigm)终止反应，常温、500×g离心5min。

5、吸除上清，加入50μL封闭液(5μl Fc Receptor Blocking Solution(422301，Biolegend)和45μL Cell Staining Buffer)，冰上封闭20min。

6、对照组加入50μL Cell Staining Buffer作为空白对照，实验组加入50uL胞外抗体混合液(表1中37种胞外蛋白标志物抗体各0.5μL，Cell Staining Buffer 31.5μL)，重悬细胞，冰上染色30min。

7、加入2ml Cell Staining Buffer，常温、500×g离心5min，吸弃上清。加入含有0.5v/v％单细胞指示剂191/193Ir(201192B，Fluidigm)的固定-破膜混合液(fix and permbuffer，Fluidigm，201067)1ml，重悬细胞，4℃过夜。

8、加入2ml Cell Staining Buffer，800×g，离心5min，吸除上清。

9、对照组加入50μL Perm-S Buffer缓冲液(Perm-S Buffer,)，Fluidigm，201066)(先用去离子水稀释到1×，然后使用)作为空白对照，实验组加入50μL胞内抗体混合液(表1中4种胞内蛋白标志物抗体各0.5μL，Perm-S Buffer 48μL)，重悬细胞，冰上放置30min。

10、加入2mL Cell Staining Buffer，800×g，5min离心，弃上清。重复一次。

11、加入2mL去离子水，800×g，5min离心，吸除上清。重复一次。

12、细胞计数，调整体积，每个样本上样前，过30μm滤筛，补充1/10体积EQ beads(201078，Fluidigm)。

13、上机进行质谱流式细胞检测。

肿瘤患者外周血待测样本的外周血单个核细胞PBMC免疫细胞精准分型的结果如图1所示，根据检测标志物的表达情况，共鉴定得到免疫系统的53个精细亚群；这53个亚群分属的细胞大类统计结果如图2所示。

肿瘤患者和正常人的免疫状态比较结果如图3所示，细胞分型差异的统计结果如图4所示，结果显示，肿瘤患者和正常人的外周血单个核细胞PBMC免疫细胞分型结果存在明显差异，表明两者的免疫状态存在明显差异。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于免疫细胞亚群分型的标志物组合，其特征在于，包括选自标志物组合I、标志物组合II和标志物组合III中的一个或多个；

所述标志物组合I包括CD45、CD3、CD4、CD8a、CD19、CD20、CD56、CD16、CD14、CD15和Ki67；

所述标志物组合II包括CCR4、CCR6、CD25、FOXP3、CD127、TCRγδ、CD45RA、CD45RO、CCR7、CD279、CD278、TIM-3、CTLA-4、LAG-3、CD274、CD27和CD38；

所述标志物组合III包括HLA-DR、CD11c、CCR3、Siglec-8、CD123、CD117、CD11b、CD62L、CD33、CD40L、CD64、CD169、CD204和CD206。

2.根据权利要求1所述的标志物组合，其特征在于，包括标志物组合I以及选自标志物组合II和标志物组合III中的一个或两个。

3.用于免疫细胞亚群分型的抗体组合，其特征在于，所述抗体组合包括如下(1)、(2)、(3)中的一个或多个的组合：

(1)CD45抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD8a抗体、CD19抗体、CD20抗体、CD56抗体、CD16抗体、CD14抗体、CD15抗体和Ki67抗体；

(2)CCR4抗体、CCR6抗体、CD25抗体、FOXP3抗体、CD127抗体、TCRγδ抗体、CD45RA抗体、CD45RO抗体、CCR7抗体、CD279抗体、CD278抗体、TIM-3抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体、CD274抗体、CD27抗体和CD38抗体；

(3)HLA-DR抗体、CD11c抗体、CCR3抗体、Siglec-8抗体、CD123抗体、CD117抗体、CD11b抗体、CD62L抗体、CD33抗体、CD40L抗体、CD64抗体、CD169抗体、CD204抗体和CD206抗体。

4.根据权利要求3所述的抗体组合，其特征在于，所述抗体被金属元素标记；

优选地，所述金属元素为选自钐Sm、铒Er、钕Nd、钆Gd、镝Dy、镥Lu、钬Ho、镱Yb、铕Eu、铥Tm、镨Pr、钇Y、钌Ru、铑Rh、钯Pd、镉Cd、铟In、镧La、铈Ce、铽Tb、铂Pt、铋Bi中的一种。

5.根据权利要求3或4所述的抗体组合，其特征在于，所述抗体组合包括如下(1)、(2)、(3)中的一个或多个的组合：

(1)¹⁵⁴Sm标记的CD45抗体、¹⁷⁰Er标记的CD3抗体、¹⁴⁵Nd标记的CD4抗体、¹⁴⁶Nd标记的CD8a抗体、^142Nd标记的CD19抗体、¹⁴⁷Sm标记的CD20抗体、¹¹³Cd标记的CD56抗体、¹⁶⁷Er标记的CD16抗体、¹⁶⁰Gd标记的CD14抗体、¹⁵⁸Gd标记的CD15抗体和¹¹⁶Cd标记的Ki67抗体；

(2)¹¹⁰Cd标记的CCR4抗体、¹⁰⁶Cd标记的CCR6抗体、¹⁶²Dy标记的CD25抗体、¹⁵²Sm标记的FOXP3抗体、¹¹²Cd标记的CD127抗体、¹¹¹Cd标记的TCRγδ抗体、¹⁷⁵Lu标记的CD45RA抗体、¹⁶⁶Er标记的CD45RO抗体、¹⁶⁵Ho标记的CCR7抗体、¹⁶³Dy标记的CD279抗体、¹⁵⁵Gd标记的CD278抗体、¹⁶¹Dy标记的TIM-3抗体、¹⁷⁶Yb标记的CTLA-4抗体、¹⁵¹Eu标记的LAG-3抗体、¹⁶⁸Er标记的CD274抗体、¹⁴³Nd标记的CD27抗体和¹⁷⁴Yb标记的CD38抗体；

(3)¹⁷²Yb标记的HLA-DR抗体、¹⁵⁹Tb标记的CD11c抗体、¹¹⁴Cd标记的CCR3抗体、¹⁵⁶Gd标记的Siglec-8抗体、¹⁵⁰Nd标记的CD123抗体、¹⁴⁴Nd标记的CD117抗体、¹⁶⁴Dy标记的CD11b抗体、¹⁵³Eu标记的CD62L抗体、¹⁷¹Yb标记的CD33抗体、¹⁶⁹Tm标记的CD40L抗体、¹⁴¹Pr标记的CD64抗体、¹⁷³Yb标记的CD169抗体、¹⁴⁹Sm标记的CD204抗体和¹⁴⁸Nd标记的CD206抗体。

6.根据权利要求3～5任一项所述的抗体组合，其特征在于，CD45抗体为HI30，CD3抗体为UCHT1，CD4抗体为RPA-T4，CD8a抗体为RPA-T8，CD19抗体为HIB19，CD20抗体为H1(FB1)，CD56抗体为NCAM16.2，CD16抗体为3G8，CD14抗体为RMO52，CD15抗体为HI98，Ki67抗体为Ki67；

CCR4抗体为L291H4，CCR6抗体为G034E3，CD25抗体为M-A251，FOXP3抗体为236A/E7，CD127抗体为A019D5，TCRγδ抗体为B1，CD45RA抗体为HI100，CD45RO抗体为UCHL1，CCR7抗体为G043H7，CD279抗体为EH12.2H7，CD278抗体为C398.4A，TIM-3抗体为F38-2E2，CTLA-4抗体为L3D10，LAG-3抗体为11C3C65，CD274抗体为E1L3N，CD27抗体为O323，CD38抗体为HIT2；

HLA-DR抗体为L243，CD11c抗体为Bu15，CCR3抗体为5E8，Siglec-8抗体为7C9，CD123抗体为6H6，CD117抗体为104D2，CD11b抗体为ICRF44，CD62L抗体为DREG-56，CD33抗体为WM53，CD40L抗体为24-31，CD64抗体为10.1，CD169抗体为7-239，CD204抗体为351615，CD206抗体为15-2。

7.权利要求1或2所述的标志物组合或权利要求3～6任一项所述的抗体组合在制备检测试剂盒中的应用；

优选地，所述检测试剂盒用于单细胞免疫细胞亚群分型检测，或者用于肿瘤患者的免疫动态监测。

8.一种用于单细胞免疫细胞亚群分型的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3～6任一项所述的抗体组合。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含选自顺铂、细胞染色缓冲液、封闭液、单细胞指示剂、固定试剂、破膜试剂中的一种或多种。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作程序包括如下步骤：

(1)处理待测样本，获得单细胞悬液，加入终浓度为5～10μM的顺铂，染色1-3min；

(2)加入终止液终止反应，离心后在去除上清的细胞沉淀中加入封闭液封闭15-25min，再加入所述抗体组合中的胞外蛋白标志物的抗体，各抗体的用量均为0.4～0.6μL，染色25～35min；

(3)加入终止液终止反应，离心后在去除上清的细胞沉淀中加入单细胞指示剂和固定-破膜混合液，反应10-14h；

(4)加入终止液终止反应，离心后在去除上清的细胞沉淀中加入所述抗体组合中的胞内蛋白标志物的抗体，各抗体的用量均为0.4～0.6μL，染色25～35min；

(5)加入终止液终止反应，洗涤细胞后进行质谱流式细胞检测。

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