CN112748058B - 一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒 - Google Patents
一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒 Download PDFInfo
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Classifications
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Abstract
本发明提供了一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒，所述试剂盒内容物为存放于密闭容器中的2‑96个样本检测量的冻干微芯试剂；所述的冻干微芯试剂为按单个反应的量分装于容器，经过冷冻干燥制成的冻干微芯型试剂，在常温中活性稳定，无需冷链运输和储存，降低了管理成本和风险，单个反应份量的包装，避免了损耗，使用简便，使用成本大大降低，缩短了样本处理所需的时间，确保了样本染色处理的标准化，从而保证了结果的一致性，确保了输出结果的准确性。有较大的临床应用价值和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，具体涉及一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒。
背景技术
目前单细胞分析的方法主要分为两大类，基于单细胞核酸检测的单细胞测序技术和基于细胞层面蛋白表达的流式技术。其中单细胞测序技术是对单个细胞中相关的基因转录水平进行检测，以此对单个细胞中相关蛋白的表达量进行预测。但是此方法的最大缺陷在于，基因的检测不能直接对应于蛋白的表达，往往容易出现假阳性和假阴性，结果不够准确，同时检测周期长，费用高，不适合持续性监测。而基于细胞层面蛋白表达的流式细胞术能够直接通过抗原抗体反应直接检测蛋白的表达量，结果直观、准确、检测周期短，费用低，能够实现持续性的动态监测。
流式检测主要用于对体内外免疫细胞亚型的分析和定量。在人体内数量庞大和类型丰富的免疫细胞构成了人体的免疫系统。免疫细胞主要有两大类，淋系细胞和髓系细胞。其中髓系细胞有粒细胞，单核细胞等，按照细胞形态以及功能的差别又可以分为嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，单核细胞在不同种类的细胞分化因子的刺激性又会分化成各种类型的巨噬细胞或树突状细胞。淋巴细胞是白细胞的一种，是参与机体免疫应答功能最重要的细胞组成成分。早期研究，根据淋巴细胞发生迁移、表面分子和功能的不同，大体上将淋巴细胞分为T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。其中T细胞又分为细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞和记忆T细胞等；B细胞又可分为初始B细胞、浆细胞和记忆B细胞等亚细胞类群。随着科学研究的不断进步，免疫学领域发现了上百种细胞表面标志物，不同谱系细胞在分化、成熟、活化过程中，出现或者消失的特定抗原，称为分化抗原(CD分子)。这些CD分子主要是免疫细胞表面的黏附分子、细胞因子受体或趋化因子受体等，可以被特定的抗体所识别。这些分子在不同类型的免疫细胞上具有高度的差异性，通过对这些细胞表面标志物的分析可以将免疫细胞分为更为细致的亚细胞分类群。例如T细胞可以进一步分为辅助初始T细胞、辅助耗竭T细胞、辅助中心记忆T细胞、辅助效应记忆T细胞、细胞毒性初始T细胞、细胞毒性耗竭T细胞、细胞毒性中心记忆T细胞、细胞毒性效应记忆T细胞。
当前用于免疫细胞分型的方法主要有：免疫酶标法，流式细胞术法等。其中免疫酶标法是基于抗原抗体反应，对一个群体的免疫细胞所携带的一个或几个标志物进行检测，但这种方法无法在单细胞水平进行检测，需要的样本细胞数量大，无法同时检测多种细胞标志物，而且存在检测范围窄、操作复杂等缺点，在临床应用中只能检测某几个特定细胞类型。而流式细胞术通过多种抗体组合方式，可以在单细胞水平对免疫细胞做足够细致的亚细胞类群分型，其操作相对简单，在临床中得到广泛的应用。流式细胞术是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或者其他生物离子进行多参数、高通量、快速的定量分析。可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有通道多速度快、精度高、准确性好的优点。流式细胞术可以实现对细胞群体精准的免疫分型，对细胞内信号传导网络进行全面的分析，分析细胞亚群之间的功能联系，以及对于大量样品的高通量多参数检测。在造血、免疫、干细胞、癌症以及药物筛选等多个领域的研究有着广泛的应用。
现有流式检测系统主要分为两大类，一类是基于光学检测系统的经典型流式细胞检测系统，通过荧光素标记的抗体对细胞进行染色，通过光学检测系统对不同荧光素激发光光谱的分析从而对单个细胞的多种蛋白水平进行分析。另一类是基于质谱检测系统的新型流式系统，通过金属元素标记的抗体对细胞进行染色，并且通过质谱检测器分析金属元素的含量从而对单个细胞多种蛋白水平进行分析。两种流式检测系统都具有通道多，分析速度快，灵敏度高的特点。
但是由于流式细胞仪通道多的特点，在现有的试验方案中往往会同时对几种，甚至多达四十多种的指标进行检测，这就导致在样本染色时，需要同时将多达四十多种的单个的液体抗体逐一的、微量的加入到待检测的样本中，这一过程操作繁琐，并且耗时长。而液体抗体在环境中的长时间暴露，部分抗体还会存在反复冻融的情况，这不利于抗体的长期稳定保存以及运输的困难。因此克服现有检测系统的缺点具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种新的能够提高多指标同时染色单细胞样本时的高效性、准确性、以及一致性、同时可以无需冷链运输和冷藏保存的，能用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒及方法，
本发明提供了一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒。
本发明所述试剂盒内容物为存放于密闭容器中的2-96个样本检测量的冻干微芯试剂：所述的冻干微芯试剂为按单个反应的量分装于容器，经过冷冻干燥制成的冻干微芯型试剂。
所述冻干微芯试剂包括四种至六十种抗体；每个冻干微芯试剂含有与抗体等体积的冻干赋形剂，所述冻干赋形剂选自甘油、海藻糖、蔗糖、甘露醇或乳糖一种或多种的混合物；所述冻干微芯试剂，其形态为白色球形颗粒，所述球形颗粒的体积为5微升-60微升的；所述密闭容器选自12×75毫米5毫升流式管、0.1-2毫升离心管、0.1-5毫升西林瓶或铝塑泡罩包装。
所述的抗体选自特异性结合细胞膜表面抗原、细胞外因子、细胞内因子或细胞核内因子的抗体。
优选的为，CD44抗体，CD57抗体，CD49d抗体，CD127抗体，CD161抗体，CCR7抗体，CXCR3抗体，CCR4抗体，CCR5抗体，CCR7抗体，CD3抗体，CD4抗体，CD8抗体，CD16抗体，CD19抗体，CD20抗体，CD56抗体，CD45抗体，CD45RA抗体，CD45RO抗体，TCR-γδ抗体，CD24抗体，CD27抗体，CD38抗体，IgD抗体。这些抗体均可市售得到。
所述冻干微芯试剂中的抗体分别被标记上不同的标签，标签为荧光标签或金属元素标签。
所述荧光标签选自荧光蛋白、合成荧光素、量子点、聚合物荧光标签和串联标签，优选的，如异硫氰酸荧光素FITC、藻红蛋白PE、多甲藻叶绿素蛋白PerCP或碘化丙啶PI。
所述金属元素标签选自金属元素或其同位素，例如，钇Y、钌Ru、铑Rh、钯Pd、镉Cd、铟In、镧La、铈Ce、镨Pr、钕Nd、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu、铂Pt或铋Bi。
本发明所述的试剂按单个反应的量分装在流式管、离心管、西林瓶或铝塑泡罩包装中，并经过冷冻干燥制成冻干型的试剂，冻干后的试剂形态为白色球形颗粒，在常温状态下保持检测活性。
按照单个或多个反应的份量冻干在容器中，优选的，可按照单个反应的份量冻干在能直接上机检测的流式管中或离心管中。
一种冻干微芯试剂的制备方法，其基本步骤包括：
(1)冻干溶液的制备：将流式抗体和冻干赋形剂经过充分搅拌混合；
(2)冻干溶液的赋形：冻干溶液滴入液氮中进行赋形；
(3)微芯的冻干制备：冷冻干燥；
(4)冻干微芯的封装：冻干后的试剂做充氮气保护处理，再密封包装于流式管、离心管、西林瓶或铝塑泡罩包装中。
所述冻干微芯试剂溶解后即可用于一个单细胞样本的染色，无需分装。
本发明所述的一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂，能够用于流式细胞仪检测，流式细胞仪包括经典型荧光流式细胞仪和质谱流式细胞仪。所述的试剂按单个反应的量分装在流式管、离心管、西林瓶或铝塑泡罩包装中，并经过冷冻干燥制成冻干型的试剂，冻干后的试剂形态为白色球形颗粒，可在常温状态下保持检测活性。
本发明所述的一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒，所述冻干微芯试剂溶解后即可用于一个单细胞样本的染色，无需分装。
其中的抗体无需再次配制及分装，直接用单细胞悬液将其充分溶解即可进行染色。
本发明试剂盒无需冷链运输和保存，且可以长时间保持抗体稳定的活性。
本发明的又一目的是提供了所述一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒用于单细胞流式分析的方法，该方法包括下列步骤：
(1)获取单细胞悬液；对于外周血样本，单细胞悬液的制备方法是用红细胞裂解液裂解外周血中的红细胞，经过离心、洗涤、重悬得到外周血单核细胞单细胞悬液；或
对于组织样本，单细胞悬液的制备方法是用研磨过滤法，经离心、洗涤、重悬得到组织的单细胞悬液；
(2)将抗体冻干微芯试剂溶解于步骤(1)的单细胞悬液中进行染色处理；使用时，对步骤(1)的单细胞悬液进行细胞计数，从中取出2×106个细胞，将冻干微芯试剂直接加入待检测的单细胞悬液至100微升的反应体积，涡旋振荡10秒钟溶解，室温(25℃)孵育30分钟；(3)用流式细胞仪或者质谱流式对处理后的单细胞样本进行检测；使用时，在步骤(2)孵育后的单细胞悬液中加入1毫升磷酸盐缓冲液，混合均匀后500g离心10分钟，弃去上清液，并重复一次，洗去多余抗体，用缓冲液按照适当的细胞浓度重悬后即可上机检测。本发明的有益效果：
现有技术在多指标同时染色细胞时，是将液体抗体单个的、逐一的、微量的加入到反应体系中，而每个反应体系中需要加入的抗体种类可能是几个，甚至是几十个。
本发明克服了现有技术的缺陷，从设计上简化了操作步骤，在使用前无需解冻、无需等候，避免了反复冻融对试剂活性的影响，单份分装，使用时无需配液、分装步骤、减少了试剂损耗和污染的风险，简化了繁琐的染色过程，不仅提高了结果的准确性，也缩短了工作时间，提高了工作效率。
本发明运用真空冷冻干燥技术将多种流式抗体混合后制成单细胞多指标流式检测试剂，成品无需冷链的冻干型试剂。该冻干型试剂在常温中活性稳定，无需冷链运输和储存，降低了管理成本和风险，单个反应份量的包装，避免了损耗，使用简便，使用成本大大降低，特别适合冷链运输和保存条件差的基础研究实验室、基层医疗机构和检验机构使用。不仅如此，该冻干型试剂大大减少了多个抗体逐个加入到待检测样本中的工作量，缩短了样本处理所需的时间，确保了样本染色处理的标准化，从而保证了结果的一致性，确保了输出结果的准确性。
另外，本发明运用冷冻干燥技术将用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体制成无需冷链的冻干微芯型试剂，避免了常规液体试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险。有较大的应用价值和社会效益。
具体实施方式
以下实施例所用原料和试剂除另有说明外，均可市售得到。
实施例1：
本实施例通过冷冻干燥技术制作用于人外周血淋巴细胞分型的冻干微芯试剂。
本实施例中用于人外周血中淋巴细胞TBNK细胞分型的抗体和标签，以及制作冻干微芯试剂的抗体量如下表所列:
| 识别靶点 | 抗体名称 | 金属标签 | 抗体含量 | 抗体浓度 | 抗体体积 |
| CD3 | 抗人CD3抗体 | 154Sm | 100微克 | 500微克/毫升 | 200微升 |
| CD4 | 抗人CD4抗体 | 173Yb | 100微克 | 500微克/毫升 | 200微升 |
| CD8 | 抗人CD8抗体 | 168Er | 100微克 | 500微克/毫升 | 200微升 |
| CD19 | 抗人CD19抗体 | 165Ho | 100微克 | 500微克/毫升 | 200微升 |
| CD16 | 抗人CD16抗体 | 145Nd | 100微克 | 500微克/毫升 | 200微升 |
| CD56 | 抗人CD56抗体 | 151Eu | 100微克 | 500微克/毫升 | 200微升 |
按照表中所述的将所有的抗体成分充分混合，混合后抗体的总体积是1200微升，取等体积(即1200微升)的冻干赋形剂，冻干赋形剂为20％的海藻糖和8％的甘露醇混合物，将冻干赋形剂与混合好的抗体溶液充分混合均匀，将混合后的液体平均分成100份，每份的体积是24微升，每份即一个反应体系用量，按照每一个反应体系用量滴入液氮中进行赋形；再冷冻干燥；得到用于外周血淋巴细胞分型的冻干型冻干微芯试剂，形态为白色球形颗粒、体积为24微升的冻干微芯试剂，按每管一个反应用量，即每管一个白色球形颗粒分装于5毫升流式管中。为防止试剂受潮，冻干后的试剂先和硅胶干燥剂一起做充氮气保护处理，再密封包装于铝箔袋中，每个铝箔袋中含有一根流式管，在常温中保存。
实施例2：
本实施例通过冷冻干燥技术制作用于人外周血中淋巴细胞TBNK细胞分型的冻干微芯试剂和具体使用方法。
本实施例中用于人外周血中淋巴细胞TBNK细胞分型的抗体和标签，以及制作冻干微芯试剂的抗体量如下表所列:
按照表中所述的将所有的抗体成分充分混合，混合后抗体的总体积是1200微升，取等体积(即1200微升)的冻干赋形剂，冻干赋形剂为20％的海藻糖和8％的甘露醇混合物，将冻干赋形剂与混合好的抗体溶液充分混合均匀，将混合后的液体平均分成100份，每份的体积是24微升，每份即一个反应体系用量，按照每一个反应体系用量滴入液氮中进行赋形；再冷冻干燥；得到用于外周血淋巴细胞分型的冻干型冻干微芯试剂，形态为白色球形颗粒、体积为24微升的冻干微芯试剂，按每管一个反应用量，即每管一个白色球形颗粒分装于5毫升流式管中。为防止试剂受潮，冻干后的试剂先和硅胶干燥剂一起做充氮气保护处理，再密封包装于铝箔袋中，每个铝箔袋中含有一根流式管，在常温中保存。
以下使用本实施例的冻干试剂通过质谱流式系统进行检测：
1.取新鲜人外周血样本1毫升，加入3毫升红细胞裂解液，轻轻涡旋或颠倒混匀，静置15分钟，其间轻轻涡旋混匀两次；
2. 500g 4℃离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸去上清液，加入1毫升磷酸盐缓冲液重悬细胞；
3.细胞计数，根据计数结果取出2×106个细胞进行抗体染色；
4.在步骤3的细胞悬液中加入5微升Fc受体封闭液，室温(25℃)孵育10分钟；
5.在上述细胞悬液中加入5微升Fc受体封闭液，室温(25℃)孵育10分钟；
6.打开含有冻干微芯试剂的流式管，将上述单细胞悬液转移到流式管中，涡旋震荡10秒钟使冻干微芯试剂充分溶解混匀，室温(25℃)孵育30分钟；
7. 500g，4℃离心5分钟，弃去上清，加入2毫升染色缓冲液洗涤细胞，重复此步骤3遍；
8.细胞悬液加入100微升的1.6％甲醛溶液，室温(25℃)固定10分钟，加入2毫升染色缓冲液洗涤细胞，重复3遍，加入1毫升染色缓冲液重悬，准备检测；
9.将标记好的细胞样品通过质谱流式系统(Starion)进行检测，质谱流式系统输出的原始数据信号为金属元素标签的金属原子丰度信号，根据前述相应抗体所带的金属标签信息，转换为细胞中相应靶标蛋白的表达丰度信息。
实施例3：本实施例演示通过冷冻干燥技术制作用于人外周血中淋巴细胞免疫分型的冻干微芯试剂和具体使用方法。
本实施例中用于人外周血中淋巴细胞免疫分型的抗体和标签，以及制作冻干微芯试剂的抗体量如下表所列:
按照表中所述的将所有的抗体成分充分混合，混合后抗体的总体积是850微升，取等体积(即850微升)的冻干赋形剂，冻干赋形剂为20％的海藻糖和8％的甘露醇混合物，将冻干赋形剂与混合好的抗体溶液充分混合均匀，将混合后的液体平均分成100份，每份的体积是17微升，每份即一个反应体系用量，按照每一个反应体系用量滴入液氮中进行赋形；再冷冻干燥；得到用于外周血淋巴细胞分型的冻干型冻干微芯试剂，形态为白色球形颗粒、体积为17微升的冻干微芯试剂，按每管一个反应用量，即每管一个白色球形颗粒分装于5毫升流式管中。为防止试剂受潮，冻干后的试剂先和硅胶干燥剂一起做充氮气保护处理，再密封包装于铝箔袋中，每个铝箔袋中含有一根流式管，在常温中保存。
使用本实施例的冻干试剂通过质谱流式系统进行检测：
1.取新鲜人外周血样本1毫升，加入3毫升红细胞裂解液，轻轻涡旋或颠倒混匀，静置15分钟，其间轻轻涡旋混匀两次；
2. 500g 4℃离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸去上清液，加入1毫升磷酸盐缓冲液重悬细胞；
3.细胞计数，根据计数结果取出2×106个细胞进行抗体染色；
4.在步骤3的细胞悬液中加入5微升Fc受体封闭液，室温(25℃)孵育10分钟；
5.打开含有冻干微芯试剂的流式管，将上述单细胞悬液转移到流式管中，涡旋震荡10秒钟使冻干微芯试剂充分溶解混匀，室温(25℃)孵育30分钟；
6. 500g，4℃离心5分钟，弃去上清，加入2毫升染色缓冲液洗涤细胞，重复此步骤3遍；
7.细胞悬液加入100微升的1.6％甲醛溶液，室温(25℃)固定10分钟，加入2毫升染色缓冲液洗涤细胞，重复3遍，加入1毫升染色缓冲液重悬，准备检测；
8.将标记好的细胞样品通过质谱流式系统进行检测，质谱流式系统输出的原始数据信号为金属元素标签的金属原子丰度信号，根据前述相应抗体所带的金属标签信息，转换为细胞中相应靶标蛋白的表达丰度信息。
实施例4：本实施例演示通过冷冻干燥技术制作用于鼠源脾脏淋巴细胞免疫分型的冻干微芯试剂和具体使用方法。
本实施例中用于鼠源脾脏淋巴细胞免疫分型的抗体和标签，以及制作冻干微芯试剂所需的抗体量如下表所列:
按照表中所述的将所有的抗体成分充分混合，混合后抗体的总体积是1200微升，取等体积(即1200微升)的冻干赋形剂，冻干赋形剂为20％的海藻糖和8％的甘露醇混合物，将冻干赋形剂与混合好的抗体溶液充分混合均匀，将混合后的液体平均分成100份，每份的体积是24微升，每份即一个反应体系用量，按照每一个反应体系用量滴入液氮中进行赋形；再冷冻干燥；得到用于外周血淋巴细胞分型的冻干型冻干微芯试剂，形态为白色球形颗粒、体积为24微升的冻干微芯试剂，按每管一个反应用量，即每管一个白色球形颗粒分装于5毫升流式管中。为防止试剂受潮，冻干后的试剂先和硅胶干燥剂一起做充氮气保护处理，再密封包装于铝箔袋中，每个铝箔袋中含有一根流式管，在常温中保存。
使用本实施例的冻干试剂通过质谱流式系统进行检测：
1.将小鼠的脾脏经70微米滤膜研磨过滤得到单细胞悬液，500g
离心10分钟，用1毫升磷酸盐缓冲液重悬制成单细胞悬液；
2.在上述单细胞悬液中加入3毫升红细胞裂解液，轻轻涡旋或颠倒混匀，冰上放置15分钟，其间轻轻涡旋混匀两次；
3. 500g 4℃离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液，1毫升磷酸盐缓冲液重悬细胞；
4.细胞计数，根据计数结果取出2×106个细胞进行抗体染色；
5.在步骤4的细胞悬液中加入5微升Fc受体封闭液，室温(25℃)孵育10分钟；
6.打开含有冻干微芯试剂的流式管，将上述单细胞悬液转移到流式管中，涡旋震荡10秒钟使冻干微芯试剂充分溶解混匀，室温(25℃)孵育30分钟；
7. 500g，4℃离心5分钟，弃去上清，加入2毫升染色缓冲液洗涤细胞，重复此步骤3遍；
8.细胞悬液加入100微升的16％甲醛溶液，室温(25℃)固定10分钟，加入2毫升染色缓冲液洗涤细胞，重复3遍，1毫升染色缓冲液重悬，准备检测；
9.将标记好的细胞样品通过质谱流式系统进行检测，质谱流式系统输出的原始数据信号为金属元素标签的金属原子丰度信号，根据前述相应抗体所带的金属标签信息，转换为细胞中相应靶标蛋白的表达丰度信息。
Claims (10)
1.一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内容物为存放于密闭容器中的2-96个样本检测量的冻干微芯试剂；所述的冻干微芯试剂为按单个反应的量分装于容器，经过冷冻干燥制成的冻干微芯型试剂；所述冻干微芯试剂包括四种至六十种抗体；每个冻干微芯试剂含有与抗体等体积的冻干赋形剂，所述冻干赋形剂选自甘油、海藻糖、蔗糖、甘露醇或乳糖一种或多种的混合物；所述冻干微芯试剂，其形态为白色球形颗粒，所述球形颗粒的体积为5微升-60微升。
2.根据权利要求1所述的一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒，其特征在于，所述密闭容器选自12×75毫米5毫升流式管、0.1-2毫升离心管、0.1-5毫升西林瓶或铝塑泡罩包装。
3.根据权利要求1所述的一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒，其特征在于，所述的抗体选自特异性结合细胞膜表面抗原、细胞外因子、细胞内因子或细胞核内因子的抗体。
4.根据权利要求3所述的一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒，其特征在于，所述抗体选自CD2抗体、CD5抗体、CD7抗体、CD25抗体、CD44抗体、CD57抗体、CD49d抗体、CD127抗体、CD161抗体、CXCR3抗体、CCR4抗体、CCR5抗体、CCR7抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD8抗体、CD16抗体、CD19抗体、CD20抗体、CD56抗体、CD45抗体、CD45RA抗体、CD45RO抗体、TCR-γδ抗体、CD24抗体、CD27抗体、CD38抗体或IgD抗体。
5.根据权利要求1所述的一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒，其特征在于，所述冻干微芯试剂中的抗体分别被标记上不同的标签，所述标签为荧光标签或金属元素标签。
6.根据权利要求5所述的一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒，其特征在于，所述荧光标签选自荧光蛋白、合成荧光素、量子点、聚合物荧光标签或串联标签。
7.根据权利要求5所述的一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒，其特征在于，所述荧光标签选自异硫氰酸荧光素FITC、藻红蛋白PE、多甲藻叶绿素蛋白PerCP或碘化丙啶PI。
8.根据权利要求5所述的一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒，其特征在于，所述金属元素标签选自金属元素或其同位素：钇Y、钌Ru、铑Rh、钯Pd、镉Cd、铟In、镧La、铈Ce、镨Pr、钕Nd、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu、铂Pt或铋Bi。
9.根据权利要求5所述的一种用于单细胞分析的多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒，其特征在于，所述冻干微芯试剂通过下列方法制备，包括下列步骤：
(1)冻干溶液的制备：将流式抗体和冻干赋形剂经过充分搅拌混合；
(2)冻干溶液的赋形：将冻干溶液匀速的滴入液氮中进行赋形；
(3)微芯的冻干：冷冻干燥；
(4)冻干微芯的封装：冻干后的试剂做充氮气保护处理，再密封包装于密闭容器中。
10.一种如权利要求1所述多指标混合型流式抗体冻干微芯试剂盒用于单细胞流式分析的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
(1)获取单细胞悬液；对于外周血样本，单细胞悬液的制备方法为：用红细胞裂解液裂解外周血中的红细胞，经过离心、洗涤、重悬得到外周血单核细胞单细胞悬液；或
对于组织样本，单细胞悬液的制备方法为：用研磨过滤法或酶解法，经离心、洗涤、重悬得到组织的单细胞悬液；
(2)将抗体冻干微芯试剂溶解于步骤(1)的单细胞悬液中进行染色处理；使用时，对步骤(1)的单细胞悬液进行细胞计数，从中取出2×106个细胞，将冻干微芯试剂直接加入待检测的单细胞悬液至100微升的反应体积，涡旋振荡10秒钟溶解，室温25℃孵育30分钟；
(3)用流式细胞仪或者质谱流式对处理后的单细胞样本进行检测；使用时，在步骤(2)孵育后的单细胞悬液中加入1毫升缓冲液，混合均匀后500g离心10分钟，弃去上清液，并重复一次，洗去多余抗体，用缓冲液按照适当的细胞浓度重悬后即可上机检测。
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