CN113514639A - 精液白细胞群流式定量检测试剂、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种精液白细胞群流式定量检测试剂、试剂盒及检测方法。所述检测试剂和试剂盒包括：1)样品处理剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl；2)样品稀释剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl；3)样品分离剂：含聚蔗糖和泛影葡胺；4)抗体：带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体；5)样品固定剂：含多聚甲醛。本发明的检测方法基于流式细胞术原理，使用样品处理剂去除精液中的杂质以及非目的细胞，再用白细胞CD45抗体特异结合到精液中白细胞的表面，最后用流式细胞仪检测特异标志荧光，从而得到白细胞数量。本方法由机器检测和记录，较过氧化物酶法更客观稳定，且易标准化、特异性强；染色所用抗体性质稳定，储存时间长，方便取用。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断用试剂、试剂盒及检测方法技术领域，特别是涉及一种精液白细胞群流式定量检测试剂、试剂盒及检测方法。
背景技术
近年来，由于生产力的提升，大量机械化、自动化仪器设备的使用，男性逐渐成为了久坐的主力军，久坐导致的生殖道感染即成为男性不育的重要病因，且随着性传播疾病的蔓延，男性不育率更是逐年升高，对男性生殖道感染诊断的特异性和准确度的要求越来越高，呼声越来越强烈。白细胞精子症就是男性不育的一个重要原因，即是指精液中白细胞浓度超过1×106/ml，提示生殖系统可能存在感染。
现有的精液中白细胞常用检测方法有两种。一种为WHO推荐的白细胞过氧化物酶法，该法使用过氧化物酶对精液中粒细胞进行染色，对染上色的细胞进行计数过后，计算精液中白细胞浓度，该法检测相对简便，但这种方法只能检测到中性粒细胞，对淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞不能检出，且镜检计数由于是技术人员进行，存在主观因素的影响，会造成数据的丢失和结果的不稳定性。另一种为酶免组化染色法，也是WHO所推荐的方法，此法利用白细胞表面的特异性抗原CD45对白细胞进行检测，因此该方法检测白细胞精子症最为准确，但现有的酶免组化染色试剂中的显色底物极不稳定，需要现配现用，比较繁琐。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种精液白细胞群流式定量检测试剂、试剂盒及检测方法，用于解决现有技术中精液白细胞群定量检测方法存在的主观因素较强，不特异和操作繁琐等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种精液白细胞群流式定量检测试剂，包括：
1)样品处理剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl；
2)样品稀释剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl；
3)样品分离剂：含聚蔗糖和泛影葡胺；
4)抗体：带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体；
5)样品固定剂：含多聚甲醛。
进一步，所述检测试剂中样品处理剂、样品稀释剂、样品分离剂、抗体、样品固定剂均为溶液，包括：
1)样品处理液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的溶液；
2)样品稀释液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的溶液；
3)样品分离液：含聚蔗糖和泛影葡胺的溶液；
4)抗体溶液：带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体的溶液；
5)样品固定液：含多聚甲醛的溶液。
进一步，所述样品处理液、样品稀释液、样品分离液、抗体溶液、样品固定液均由去离子水配制而成；优选地，所述抗体溶液还含有胎牛血清FBS；更优选地，所述抗体溶液含0.01％的胎牛血清FBS。其中，所述去离子水为EW-Ⅰ到EW-Ⅲ级去离子水。
可选地，所述样品处理液中Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的浓度分别为1.30g/L-1.5g/L，0.19g/L-0.39g/L，7g/L-9g/L。
可选地，所述样品稀释液中Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的浓度分别为1.30g/L-1.5g/L，0.19g/L-0.39g/L，7g/L-9g/L，0.1-0.3g/L。
可选地，按质量百分比计，所述样品分离液包括：1-6％泛影葡胺，1-5％聚蔗糖，0.3-5％非糖基单元的亲水性高分子聚合物，余量为无热源的去离子水。
可选地，所述非糖基单元的亲水性高分子聚合物选自聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯磺酸中的至少一种。
可选地，所述抗体溶液中抗体的浓度为0.01μg-0.05μg/106cells。
可选地，所述样品固定液中多聚甲醛的含量为0.5％-4％。
进一步，所述检测试剂中样品处理剂、样品稀释剂、样品分离剂、抗体、样品固定剂均为冻干粉，包括：
1)样品处理剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的冻干粉；
2)样品稀释剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的冻干粉；
3)样品分离剂：含聚蔗糖和泛影葡胺的冻干粉；
4)抗体：带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体的冻干粉；
5)样品固定剂：含多聚甲醛的冻干粉。
进一步，使用所述检测试剂检测精液白细胞群时，先用去离子水复溶冻干粉，配制得到样品处理液、样品稀释液、样品分离液、抗体溶液和样品固定液。其中，所述去离子水为EW-Ⅰ到EW-Ⅲ级去离子水。
可选地，所述样品处理液中Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的浓度分别为1.30g/L-1.5g/L，0.19g/L-0.39g/L，7g/L-9g/L。
可选地，所述样品稀释液中Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的浓度分别为1.30g/L-1.5g/L，0.19g/L-0.39g/L，7g/L-9g/L，0.1-0.3g/L。
可选地，按质量百分比计，所述样品分离液包括：1-6％泛影葡胺，1-5％聚蔗糖，0.3-5％非糖基单元的亲水性高分子聚合物，余量为无热源的去离子水。
可选地，所述非糖基单元的亲水性高分子聚合物选自聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯磺酸中的至少一种。
可选地，所述抗体溶液中抗体的浓度为0.01μg-0.05μg/106cells。
可选地，所述样品固定液中多聚甲醛的含量为0.5％-4％。
进一步，所述带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体来源于兔或者其他生化领域常用的实验动物。
进一步，所述荧光标记为现有的各色荧光标记，如FITC，PE，APC，PerCP-cy5.5。
本发明第二方面提供一种包含第一方面所述的检测试剂的精液白细胞群流式定量检测试剂盒。
进一步，所述试剂盒还包括：6)洗液；7)绝对计数微球。
可选地，所述洗液为含0.01％Tween-20的0.01M PBS溶液。
可选地，所述绝对计数微球为流式细胞仪用绝对计数荧光微球。
本发明第三方面提供一种精液白细胞群定量检测方法，采用如第一方面所述的检测试剂和/或如第二方面所述的检测试剂盒，所述方法包括如下步骤：
(1)用样品处理剂处理精液样本；
(2)用样品稀释剂稀释经样品处理剂处理过的精液样本；
(3)加入样品分离剂，离心，观察分层情况，吸取中间层液体；
(4)将洗液加入中间层液体中，混匀后离心，弃去上清，得细胞团块；
(5)用抗体溶液重悬细胞团块，孵育染色；
(6)用样品固定剂固定步骤(5)所得溶液中细胞抗体复合物，离心弃上清；
(7)加入样品稀释剂重悬细胞，再加入绝对计数微球beads，最后用流式细胞仪进行检测，记录并计算结果。
进一步，步骤(1)中，样品处理剂的用量与精液样本相同。
进一步，步骤(1)中，在室温条件下用样品处理剂处理精液样本，时间为5-10分钟。
进一步，步骤(2)中，稀释倍数为1-3倍。
进一步，步骤(3)中，离心条件为：1200-1800×g，离心20-30min。
进一步，步骤(4)中，向每毫升中间层液体中加入1-3mL洗液。
进一步，步骤(4)中，离心条件为：400-800×g，离心5-10min。
进一步，步骤(5)中，重悬每毫升细胞团块所需的抗体溶液的量为40-60μL。
进一步，步骤(5)中，在避光条件下进行孵育，孵育时间为20-30min。
进一步，步骤(6)中，向每毫升步骤(5)所得溶液中加入0.1-0.5mL样品固定液。
进一步，步骤(6)中，固定时间为10-20min。
进一步，步骤(6)中，离心条件为：300-400×g，离心5-10min。
进一步，步骤(7)中，所述流式细胞仪能检测PE、FITC、APC和PerCP-cy5.5通道。
进一步，步骤(7)中，采用流式数据分析软件对流式结果进行分析，通过绝对计数beads计算CD45+的细胞数，其中CD45+细胞为FITC通道；同时打开FITC通道和PerCP-Cy5.5通道，对beads进行设门。
进一步，CD45+细胞的计算公式为：A＝(X/Y)*(N*V)，其中，A为CD45+细胞绝对数目，X为流式检测CD45+细胞的数目，Y为流式检测beads的数目，N为检测用的beads浓度，V为检测用的beads体积。
如上所述，相较于现有技术，本发明的精液白细胞群流式定量检测试剂、试剂盒及检测方法，具有以下有益效果：
本发明提供了一种客观、稳定、特异和操作简便的精液白细胞群流式检测方案，基于流式的检测方法，使用样品处理剂去除精液中的杂质以及非目的细胞，再用白细胞CD45抗体，特异地结合到精液中白细胞的表面，最后用流式细胞仪对特异标志荧光进行检测，从而得到精液中白细胞的数量。
相较于已有的过氧化物酶法，本发明的检测试剂、试剂盒、检测方法基于流式细胞术原理，由机器检测和记录，无需技术人员主观判定，更客观稳定，且容易标准化；本发明所检测的是白细胞的特异标志蛋白，较已有的过氧化物酶法只能检测多核粒细胞的局限，本发明具有更高的准确性和更强的特异性；本发明染色所用抗体性质稳定，而常用的酶免组化染色法染液极不稳定，在2-8℃只能稳定1周的时间，而本方法所用抗体在小剂量分装存于-20℃条件下可以保存2-3年，极大地提高了储存时限，方便取用。
综上所述，本发明检测所用抗体具有特异性，所用到的试剂都可以提前配制且保存时间较长，又使用仪器检测和记录，因此，本发明的方法较过氧化物酶法更加客观、特异、稳定，较酶免组化染色法更加高效。
附图说明
图1显示为本发明实施例13中所得的精液白细胞检测结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明提供了一种精液白细胞群流式定量检测试剂，包括：
1)样品处理剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl；
2)样品稀释剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl；
3)样品分离剂：含聚蔗糖和泛影葡胺；
4)抗体：带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体；
5)样品固定剂：含多聚甲醛。
本发明提供的检测试剂具体分为两种类型，第一种，所述检测试剂中样品处理剂、样品稀释剂、样品分离剂、抗体、样品固定剂均为溶液，包括：
1)样品处理液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的溶液；
2)样品稀释液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的溶液；
3)样品分离液：含聚蔗糖和泛影葡胺的溶液；
4)抗体溶液：带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体；
5)样品固定液：含多聚甲醛的溶液。
具体的，所述样品处理液、样品稀释液、样品分离液、抗体溶液、样品固定液均由去离子水配制而成；优选地，所述抗体溶液还含有胎牛血清FBS，有利于试剂的长期保存；更优选地，所述抗体溶液含0.01％的胎牛血清FBS。其中，所述去离子水为EW-Ⅰ到EW-Ⅲ级去离子水；以下实施例中，所使用的去离子水为EW-Ⅲ级去离子水。
具体的，所述样品处理液中Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的浓度分别为1.30g/L-1.5g/L，0.19g/L-0.39g/L，7g/L-9g/L。
具体的，所述样品稀释液中Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的浓度分别为1.30g/L-1.5g/L，0.19g/L-0.39g/L，7g/L-9g/L，0.1-0.3g/L。
具体的，按质量百分比计，所述样品分离液包括：1-6％泛影葡胺，1-5％聚蔗糖，0.3-5％非糖基单元的亲水性高分子聚合物，余量为无热源的去离子水。
具体的，所述非糖基单元的亲水性高分子聚合物选自聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯磺酸中的至少一种。
具体的，所述抗体溶液浓度为0.01μg-0.05μg/106cells。
具体的，所述样品固定液中多聚甲醛的含量为0.5％-4％。
第二种检测试剂中的样品处理剂、样品稀释剂、样品分离剂、抗体、样品固定剂均为冻干粉，包括：
1)样品处理剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的冻干粉；
2)样品稀释剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的冻干粉；
3)样品分离剂：含聚蔗糖和泛影葡胺的冻干粉；
4)抗体：带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体的冻干粉；
5)样品固定剂：含多聚甲醛的冻干粉。
第二种检测试剂使用时，先用去离子水复溶冻干粉，配制得到样品处理液、样品稀释液、样品分离液、抗体溶液和样品固定液；优选地，所述抗体溶液还含有胎牛血清FBS，有利于试剂的长期保存；更优选地，所述抗体溶液含0.01％的胎牛血清FBS。其中，所述去离子水为EW-Ⅰ到EW-Ⅲ级去离子水；以下实施例中，所使用的去离子水为EW-Ⅲ级去离子水。
具体的，所述样品处理液中Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的浓度分别为1.30g/L-1.5g/L，0.19g/L-0.39g/L，7g/L-9g/L。
具体的，所述样品稀释液中Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的浓度分别为1.30g/L-1.5g/L，0.19g/L-0.39g/L，7g/L-9g/L，0.1-0.3g/L。
具体的，按质量百分比计，所述样品分离液包括：1-6％泛影葡胺，1-5％聚蔗糖，0.3-5％非糖基单元的亲水性高分子聚合物，余量为无热源的去离子水。
具体的，所述非糖基单元的亲水性高分子聚合物选自聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯磺酸中的至少一种。
具体的，所述抗体溶液浓度为0.01μg-0.05μg/106cells。
具体的，所述样品固定液中多聚甲醛的含量为0.5％-4％。
进一步地，所述带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体来源于兔或者其他生化领域常用的实验动物。以下实施例中采用的带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体来源于兔。
进一步地，抗体所带的荧光标记为现有的各色荧光标记，如FITC，PE，APC，PerCP-cy5.5。
本发明还提供了一种包含如上所述的检测试剂的精液白细胞群流式定量检测试剂盒，所述试剂盒还包括：6)洗液；7)绝对计数微球。
具体的，所述洗液为含0.01％Tween-20的0.01M PBS溶液。
具体的，所述绝对计数微球为流式细胞仪用绝对计数荧光微球。以下实施例中，使用的绝对计数微球来自于Biolegend，precision count beads，cat：424902，但不限于此。
基于上述的检测试剂和检测试剂盒，本发明还提供了一种精液白细胞群定量检测方法，包括如下步骤：
(1)用样品处理剂处理精液样本；
(2)用样品稀释剂稀释经样品处理剂处理过的精液样本；
(3)加入样品分离剂，离心，观察分层情况，吸取中间层液体；
(4)将洗液加入中间层液体中，混匀后离心，弃去上清，得细胞团块；
(5)用抗体溶液重悬细胞团块，孵育染色；
(6)用样品固定剂固定步骤(5)所得溶液中细胞抗体复合物，离心弃上清；
(7)加入样品稀释剂重悬细胞，再加入绝对计数微球，最后用流式细胞仪进行检测，记录并计算结果。
具体的，步骤(1)中，样品处理剂的用量与精液样本相同。
具体的，步骤(1)中，在室温条件下用样品处理剂处理精液样本，时间为5-10分钟。
具体的，步骤(2)中，稀释倍数为1-3倍。
具体的，步骤(3)中，离心条件为：1200-1800×g，离心20-30min。
具体的，步骤(4)中，向每毫升中间层液体中加入1-3mL洗液。
具体的，步骤(4)中，离心条件为：400-800×g，离心5-10min。
具体的，步骤(5)中，重悬每毫升细胞团块所需的抗体溶液的量为40-60μL。
具体的，步骤(5)中，在避光条件下进行孵育，孵育时间为20-30min。
具体的，步骤(6)中，向每毫升步骤(5)所得溶液中加入0.1-0.5mL固定液。
具体的，步骤(6)中，固定时间为10-20min。
具体的，步骤(6)中，离心条件为：300-400×g，离心5-10min。
具体的，步骤(7)中，采用流式数据分析标准软件对流式结果进行分析，通过绝对计数beads计算CD45+的细胞数，其中CD45+细胞为FITC通道；同时打开FITC通道和PerCP-Cy5.5通道，对beads进行设门。本发明使用的流式数据分析标准软件为Flow Jo软件。
具体的，CD45+细胞的计算公式为：A＝(X/Y)*(N*V)，其中，A为CD45+细胞绝对数目，X为流式检测CD45+细胞的数目，Y为流式检测beads的数目，N为检测用的beads浓度，V为检测用的beads体积。
具体的，检测用的beads数目＝beads浓度*检测用的beads体积，如果严格按操作步骤的话，以biolegend的precision count beads为例，检测用的beads数目＝(9.84×105particle/mL)×0.02mL＝1.968×104。
下面具体的例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行具体的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
一种精液白细胞群流式定量检测试剂，包括：
1)样品处理液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的溶液，Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的浓度分别为1.42g/L、0.27g/L、8g/L；
2)样品稀释液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的溶液，Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的浓度分别为1.42g/L、0.27g/L、8g/L、0.2g/L；
3)样品分离液：含聚蔗糖和泛影葡胺的溶液，按质量百分比计，包括：5％泛影葡胺，4.3％聚蔗糖，1.7％聚乙二醇，余量为无热源的去离子水；
4)抗体溶液：选择来源于兔的带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体为抗体，以去离子水溶解胎牛血清FBS和抗体制得抗体溶液，FBS浓度为0.01％，抗体浓度为0.02μg/106cells，荧光标签为FITC；
5)样品固定液：含0.5％多聚甲醛的溶液。
上述试剂中抗体用于与白细胞表面的CD45抗原结合，因为该抗体带有荧光标签，故可用流式细胞仪进行检测。
实施例2
一种精液白细胞群流式定量检测试剂，包括：
1)样品处理液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的溶液，Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的浓度分别为1.30g/L、0.19g/L、7g/L；
2)样品稀释液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的溶液，Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的浓度分别为1.30g/L、0.19g/L、7g/L、0.1g/L；
3)样品分离液：含聚蔗糖和泛影葡胺的溶液，按质量百分比计，包括：4％泛影葡胺，5.0％聚蔗糖，1.0％聚乙烯吡咯烷酮，余量为无热源的去离子水；
4)抗体：选择来源于兔的带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体为抗体，以去离子水溶解胎牛血清FBS和抗体制得抗体溶液，FBS浓度为0.01％，抗体浓度为0.01μg/106cells，荧光标签为FITC；
5)样品固定液：含1％多聚甲醛的溶液。
上述试剂中抗体用于与白细胞表面的CD45抗原结合，因为该抗体带有荧光标签，故可用流式细胞仪进行检测。
实施例3
一种精液白细胞群流式定量检测试剂，包括：
1)样品处理液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的溶液，Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的浓度分别为1.50g/L、0.39g/L、9g/L；
2)样品稀释液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的溶液，Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的浓度分别为1.50g/L、0.39g/L、9g/L、0.3g/L；
3)样品分离液：含聚蔗糖和泛影葡胺的溶液，按质量百分比计，包括：4％泛影葡胺，4.0％聚蔗糖，2.0％聚苯乙烯磺酸，余量为无热源的去离子水；
4)抗体：选择来源于兔的带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体为抗体，以去离子水溶解胎牛血清FBS和抗体制得抗体溶液，FBS浓度为0.01％，抗体浓度为0.05μg/106cells，荧光标签为PE；
5)样品固定液：含2％多聚甲醛的溶液。
上述试剂中抗体用于与白细胞表面的CD45抗原结合，因为该抗体带有荧光标签，故可用流式细胞仪进行检测。
实施例4
一种精液白细胞群流式定量检测试剂，包括：
1)样品处理液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的溶液，Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的浓度分别为1.45g/L、0.35g/L、8.5g/L；
2)样品稀释液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的溶液，Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的浓度分别为1.45g/L、0.35g/L、8.5g/L、0.3g/L；
3)样品分离液：含聚蔗糖和泛影葡胺的溶液，按质量百分比计，包括：1％泛影葡胺，1.0％聚蔗糖，0.3％聚苯乙烯磺酸，余量为无热源的去离子水；
4)抗体：选择来源于兔的带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体为抗体，以去离子水溶解胎牛血清FBS和抗体制得抗体溶液，FBS浓度为0.01％，抗体浓度为0.05μg/106cells，荧光标签为PE；
5)样品固定液：含4％多聚甲醛的溶液。
上述试剂中抗体用于与白细胞表面的CD45抗原结合，因为该抗体带有荧光标签，故可用流式细胞仪进行检测。
实施例5
一种精液白细胞群流式定量检测试剂，包括：
1)样品处理剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的冻干粉；
2)样品稀释剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的冻干粉；
3)样品分离剂：含聚蔗糖和泛影葡胺的冻干粉；
4)抗体：来源于兔的带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体的冻干粉，荧光标记为FITC；
5)样品固定剂：含多聚甲醛的冻干粉。
使用时，先用EW-Ⅲ级去离子水复溶冻干粉，配制成实施例1所述浓度的样品处理液、样品稀释液、样品分离液、抗体溶液和样品固定液。
实施例6
一种精液白细胞群流式定量检测试剂，包括：
1)样品处理剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的冻干粉；
2)样品稀释剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的冻干粉；
3)样品分离剂：含聚蔗糖和泛影葡胺的冻干粉；
4)抗体：来源于兔的带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体的冻干粉，荧光标记为FITC；
5)样品固定剂：含多聚甲醛的冻干粉。
使用时，先用EW-Ⅲ级去离子水复溶冻干粉，配制成实施例2所述浓度的样品处理液、样品稀释液、样品分离液、抗体溶液和样品固定液。
实施例7
一种精液白细胞群流式定量检测试剂，包括：
1)样品处理剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的冻干粉；
2)样品稀释剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的冻干粉；
3)样品分离剂：含聚蔗糖和泛影葡胺的冻干粉；
4)抗体：来源于兔的带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体的冻干粉，荧光标记为FITC；
5)样品固定剂：含多聚甲醛的冻干粉。
使用时，先用EW-Ⅲ级去离子水复溶冻干粉，配制成实施例3所述浓度的样品处理液、样品稀释液、样品分离液、抗体溶液和样品固定液。
实施例8
一种精液白细胞群流式定量检测试剂，包括：
1)样品处理剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的冻干粉；
2)样品稀释剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的冻干粉；
3)样品分离剂：含聚蔗糖和泛影葡胺的冻干粉；
4)抗体：来源于兔的带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体的冻干粉，荧光标记为FITC；
5)样品固定剂：含多聚甲醛的冻干粉。
使用时，先用EW-Ⅲ级去离子水复溶冻干粉，配制成实施例4所述浓度的样品处理液、样品稀释液、样品分离液、抗体溶液和样品固定液。
实施例9
本实施例的检测试剂与实施例5相同，样品处理剂、样品稀释剂、样品分离剂、抗体、样品固定剂均为冻干粉，使用时，先采用EW-Ⅲ级去离子水复溶，不同之处在于，还在抗体溶液中加入了0.01％胎牛血清FBS，这样更有利于试剂的长期保存。
实施例10
一种精液白细胞群流式定量检测试剂盒，包括实施例1中的检测试剂，还包括：
6)洗液：含0.01％Tween-20的0.01M PBS溶液。
7)绝对计数微球：流式细胞仪用绝对计数荧光微球，Biolegend，precision countbeads，cat：424902。
实施例11
一种精液白细胞群流式定量检测试剂盒，包括实施例2中的检测试剂，还包括：
6)洗液：含0.01％Tween-20的0.01M PBS溶液。
7)绝对计数微球：流式细胞仪用绝对计数荧光微球，Biolegend，precision countbeads，cat：424902。
实施例12
一种精液白细胞群流式定量检测试剂盒，包括实施例7中的检测试剂，还包括：
6)洗液：含0.01％Tween-20的0.01M PBS溶液。
7)绝对计数微球：流式细胞仪用绝对计数荧光微球，Biolegend，precision countbeads，cat：424902。
实施例13
一种使用实施例10所述的试剂盒进行精液白细胞定量检测的方法，包括以下步骤：
1、取0.2mL精液样本到1个1.5mL的离心管中，加入0.2mL的样品处理液，上下颠倒10次混匀，室温孵育5min。
2、加入0.6mL样品稀释液，上下颠倒10次混匀。
3、吸取200μL样品分离液，将移液器枪头伸到溶液底部缓慢加入样品分离液，注意此时可以看到样品分离液和样本有一个分界层，才能保证分离效果；1500×g离心25min；离心后观察有明显分层，吸取中间层细胞(中间层液体)后加入到一个新的1.5mL离心管中，体积大约0.2～0.3mL左右，注意不要吸到底部的细胞。
4、加入0.5mL洗液，上下颠倒10次，混匀，500g离心5min；样品离心后，弃上清，得细胞团块。
离心过程中可以配制染色抗体：计算实验所需抗体量，以10个样品为例，取0.5mL样品稀释液，加入10μL抗体溶液，混匀后，即为染色抗体溶液，染色为50μL/管。
5、将上述处理得到的细胞团块重悬在50μL的抗体溶液中，则为样品染色管；所有染色样本室温避光孵育20min。
注意：在细胞重悬的过程中一定要充分吹打混匀，才能保证染色效果。
6、细胞重悬到0.2mL样品固定液中，固定10min；350×g，离心5min，弃上清。
此时细胞悬液体积大约20μL，再加入0.2mL的样本稀释液重悬细胞，此时细胞悬液体积为240μL。
7、涡旋绝对计数微球beads 20秒使其分散均匀，吸取约1.96×104个绝对计数微球beads，加入步骤6所得细胞悬液，吹打混匀后，上机检测(24h之内完成检测即可)。采用流式细胞仪进行检测，其中仪器要求能检测PE和FITC通道。
8、采用Flow Jo软件对流式结果进行分析，通过绝对计数beads计算CD45+的细胞数，其中CD45+细胞为FITC通道；同时打开FITC通道和PerCP-Cy5.5通道，可以对beads进行设门。
CD45+细胞的计算方法为：
CD45+细胞绝对数目(A)＝(流式检测CD45+细胞的数目(X)/流式检测beads的数目(Y))*(检测用的beads浓度(N)*检测用beads的体积(V))
其中，检测用的beads数目＝beads浓度*检测用beads体积，如果严格按操作步骤的话，检测用beads数目＝(9.84×105particle/mL)×0.02mL＝1.968×104。
图1显示为本发明实施例中所得的精液白细胞检测结果图。由图1可知，所有细胞中CD45+的白细胞含量为4.89％。
实施例14
一种使用实施例11所述的试剂盒进行精液白细胞定量检测的方法，包括以下步骤：
1、取0.2mL精液样本到1个1.5mL的离心管中，加入0.2mL的样品处理液，上下颠倒10次混匀，室温孵育8min。
2、加入0.8mL样品稀释液，上下颠倒10次混匀。
3、吸取200μL样品分离液，将移液器枪头伸到溶液底部缓慢加入样品分离液，注意此时可以看到样品分离液和样本有一个分界层，才能保证分离效果；1200×g离心30min；离心后观察有明显分层，吸取中间层细胞(中间层液体)后加入到一个新的1.5ml离心管中，体积大约0.2～0.3mL左右，注意不要吸到底部的细胞。
4、加入0.6mL洗液，上下颠倒10次，混匀，400g离心10min；样品离心后，弃上清，得细胞团块。
离心过程中可以配制染色抗体：计算实验所需抗体量，以10个样品为例，取0.42mL样品稀释液，加入10μL抗体溶液，混匀后，即为染色抗体溶液，染色为40μL/管。
5、将上述处理得到的细胞团块重悬在40μL的抗体溶液中，则为样品染色管；所有染色样本室温避光孵育25min。
注意：在细胞重悬的过程中一定要充分吹打混匀或者涡旋混匀，才能保证染色效果。
6、细胞重悬到0.5mL样品固定液中，固定20min；300×g，离心10min，弃上清。
此时细胞悬液体积大约20μL，再加入0.2mL的样本稀释液重悬细胞，此时细胞悬液体积为240μL。
7、涡旋绝对计数微球beads 15秒以使微球分散均匀，取约1.96×104个绝对计数微球beads，加入步骤7所得细胞悬液，吹打混匀后，上机检测(24h之内完成检测即可)。
采用流式细胞仪进行检测，其中仪器要求能检测PE和FITC通道。
8、采用Flow Jo软件对流式结果进行分析，通过绝对计数beads计算CD45+的细胞数，其中CD45+细胞为FITC通道；同时打开FITC通道和PerCP-Cy5.5通道，可以对beads进行设门。
CD45+细胞的计算方法为：
CD45+细胞绝对数目(A)＝(流式检测CD45+细胞的数目(X)/流式检测beads的数目(Y))*(检测用的beads浓度(N)*检测用beads的体积(V))
其中，检测用的beads数目＝beads浓度*检测用beads体积，如果严格按操作步骤的话，检测用beads数目＝(9.84×105particle/mL)×0.02mL＝1.968×104。
实施例15
一种使用实施例12所述的试剂盒进行精液白细胞定量检测的方法，包括以下步骤：
1、取0.2mL精液样本到1个1.5mL的离心管中，加入0.2mL的样品处理液，上下颠倒10次混匀，室温孵育10min。
2、加入1.0mL样品稀释液，上下颠倒10次混匀。
3、吸取200μL样品分离液，将移液器枪头伸到溶液底部缓慢加入样品分离液，注意此时可以看到样品分离液和样本有一个分界层，才能保证分离效果；1800×g离心20min；离心后观察有明显分层，吸取中间层细胞(中间层液体)后加入到一个新的1.5ml离心管中，体积大约0.2～0.3mL左右，注意不要吸到底部的细胞。
4、加入0.8mL洗液，上下颠倒10次，混匀，800g离心5min；样品离心后，弃上清，得细胞团块。
离心过程中可以配制染色抗体：计算实验所需抗体量，以10个样品为例，取0.62mL样品稀释液，加入10μL抗体溶液，混匀后，即为染色抗体溶液，染色为60μL/管。
5、将上述处理得到的细胞团块重悬在60μL的抗体溶液中，则为样品染色管；所有染色样本室温避光孵育30min。
注意：在细胞重悬的过程中一定要充分吹打混匀或者涡旋混匀，才能保证染色效果。
6、细胞重悬到0.5mL样品固定液中，固定20min；400×g，离心5min，弃上清。
此时细胞悬液体积大约20μL，再加入0.2mL的样本稀释液重悬细胞，此时细胞悬液体积为240μL。
7、涡旋绝对计数微球beads 25秒以使微球分散均匀，取约3.92×104个绝对计数微球beads，加入步骤7所得细胞悬液，吹打混匀后，上机检测(24h之内完成检测即可)。
采用流式细胞仪进行检测，其中仪器要求能检测PE和FITC通道。
8、采用Flow Jo软件对流式结果进行分析，通过绝对计数beads计算CD45+的细胞数，其中CD45+细胞为FITC通道；同时打开FITC通道和PerCP-Cy5.5通道，可以对beads进行设门。
CD45+细胞的计算方法为：
CD45+细胞绝对数目(A)＝(流式检测CD45+细胞的数目(X)/流式检测beads的数目(Y))*(检测用的beads浓度(N)*检测用beads的体积(V))
其中，检测用的beads数目＝beads浓度*检测用beads体积，如果严格按操作步骤的话，检测用beads数目＝(9.84×105particle/mL)×0.04mL＝3.936×104。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种精液白细胞群流式定量检测试剂，其特征在于，包括：
1)样品处理剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl；
2)样品稀释剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl；
3)样品分离剂：含聚蔗糖和泛影葡胺；
4)抗体：带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体；
5)样品固定剂：含多聚甲醛。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述检测试剂中样品处理剂、样品稀释剂、样品分离剂、抗体、样品固定剂均为溶液，包括：
1)样品处理液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的溶液；
2)样品稀释液：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的溶液；
3)样品分离液：含聚蔗糖和泛影葡胺的溶液；
4)抗体溶液：含带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体的溶液；
5)样品固定液：含多聚甲醛的溶液；
所述样品处理液、样品稀释液、样品分离液、抗体溶液、样品固定液均由去离子水配制而成；
或，所述检测试剂中样品处理剂、样品稀释剂、样品分离剂、抗体、样品固定剂为冻干粉，包括：
1)样品处理剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的冻干粉；
2)样品稀释剂：含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的冻干粉；
3)样品分离剂：含聚蔗糖和泛影葡胺的冻干粉；
4)抗体：带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体的冻干粉；
5)样品固定剂：含多聚甲醛的冻干粉；
使用所述检测试剂检测精液白细胞群时，先用去离子水复溶冻干粉，配制得到样品处理液、样品稀释液、样品分离液、抗体溶液和样品固定液。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于：所述抗体溶液还含有胎牛血清FBS，所述抗体溶液含0.01％的胎牛血清FBS；
和/或，所述样品处理液中Na2HPO4、KH2PO4、NaCl的浓度分别为1.30g/L-1.5g/L，0.19g/L-0.39g/L，7g/L-9g/L；
和/或，所述样品稀释液中Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的浓度分别为1.30g/L-1.5g/L，0.19g/L-0.39g/L，7g/L-9g/L，0.1-0.3g/L；
和/或，按质量百分比计，所述样品分离液包括：1-6％泛影葡胺，1-5％聚蔗糖，0.3-5％非糖基单元的亲水性高分子聚合物，余量为无热源的去离子水；所述非糖基单元的亲水性高分子聚合物选自聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯磺酸中的至少一种；
和/或，所述抗体溶液中抗体的浓度为0.01μg-0.05μg/106 cells；和/或，所述样品固定液中多聚甲醛的含量为0.5％-4％。
4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述带荧光标记的抗人CD45的IgG型单克隆抗体来源于兔；
和/或，所述荧光标记选自FITC、PE、APC、PerCP-cy5.5中的任意一种。
5.一种包含权利要求1-4任一项所述的检测试剂的精液白细胞群流式定量试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：6)洗液；7)绝对计数微球。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述洗液为含0.01％Tween-20的PBS溶液；和/或，所述绝对计数微球为流式细胞仪用绝对计数荧光微球。
8.一种精液白细胞群定量检测方法，其特征在于：采用如权利要求1-4任一项所述的检测试剂和/或如权利要求5-7任一项所述的检测试剂盒，所述方法包括如下步骤：
(1)用样品处理剂处理精液样本；
(2)用样品稀释剂稀释经样品处理剂处理过的精液样本；
(3)加入样品分离剂，离心，观察分层情况，吸取中间层液体；
(4)将洗液加入中间层液体中，混匀后离心，弃去上清；
(5)用抗体溶液重悬细胞团块，孵育染色；
(6)用样品固定剂固定步骤(5)所得溶液中细胞抗体复合物，离心弃上清；
(7)加入样品稀释剂重悬细胞，再加入绝对计数微球beads，最后用流式细胞仪进行检测，记录并计算结果。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，样品处理剂的用量与精液样本相同；
和/或，步骤(1)中，在室温条件下用样品处理剂处理精液样本，时间为5-10分钟；
和/或，步骤(2)中，稀释倍数为1-3倍；
和/或，步骤(3)中，离心条件为：1200-1800×g，离心20-30 min；
和/或，步骤(4)中，向每毫升中间层液体中加入1-3 mL洗液；
和/或，步骤(4)中，离心条件为：400-800×g，离心5-10min；
和/或，步骤(5)中，重悬每毫升细胞团块所需的抗体溶液的量为40-60μL；
和/或，步骤(5)中，在避光条件下进行孵育，孵育时间为20-30min；
和/或，步骤(6)中，向每毫升步骤(5)所得溶液中加入0.1-0.5 mL固定液；
和/或，步骤(6)中，固定时间为10-20min；
和/或，步骤(6)中，离心条件为：300-400×g，离心5-10min；
和/或，步骤(7)中，采用流式数据分析软件对流式结果进行分析，通过绝对计数beads计算CD45+的细胞数，其中CD45+细胞为FITC通道；同时打开FITC通道和PerCP-Cy5.5通道，对beads进行设门。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：CD45+细胞的计算公式为：A＝(X/Y)*(N*V)，其中，A为CD45+细胞绝对数目，X为流式检测CD45+细胞的数目，Y为流式检测beads的数目，N为检测用的beads浓度，V为检测用的beads体积；检测用的beads数目＝beads浓度*检测用的beads体积。
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