JP2716267B2 - 全血試料を高速溶解するための多目的試薬系 - Google Patents
全血試料を高速溶解するための多目的試薬系Info
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Description
【発明の詳細な説明】 背景 本発明は、全血試料を高速分析するための多目的試薬
系及び方法に関する。より特定的には、本発明は、白血
球分別分析及び有核赤血球定量分析、又はリンパ球サブ
クラス分析（subclassification）を、免疫表現型決定
法（immunophenotyping technique）を用いて自動臨床
血液分析器（automated clinical hematology analyze
r）又はフローサイトメーターで実施するのに有用な、
赤血球を高速で溶解すると同時に白血球を固定すること
ができる多目的試薬系に関する。
系及び方法に関する。より特定的には、本発明は、白血
球分別分析及び有核赤血球定量分析、又はリンパ球サブ
クラス分析（subclassification）を、免疫表現型決定
法（immunophenotyping technique）を用いて自動臨床
血液分析器（automated clinical hematology analyze
r）又はフローサイトメーターで実施するのに有用な、
赤血球を高速で溶解すると同時に白血球を固定すること
ができる多目的試薬系に関する。
正常被験者の末梢血は、赤血球（red blood cell又は
erythrocyte）と、５種類の主要成熟白血球（white cel
l又はleukocyte）とを含んでいる。白血球は少なくとも
５種類に分けられ、これらは好中球、好酸球、単球、リ
ンパ球及び好塩基球として知られている。成熟血液細胞
は各種類毎に、宿主の恒常性維持に必要な特定機能を果
たす。各種の末梢血液細胞の濃度は、骨髄の微環境内に
存在する種々の因子が関与する動的プロセスによって厳
密に調節されモニターされる。骨髄は、ある疾患条件下
では、特定種類の白血球をより多く又はより少なく放出
し得る。別の条件下では、骨髄から放出される末梢血液
細胞の数の調節が妨害され、非調節数の未熟な白血球又
は赤血球が末梢血に放出される。
erythrocyte）と、５種類の主要成熟白血球（white cel
l又はleukocyte）とを含んでいる。白血球は少なくとも
５種類に分けられ、これらは好中球、好酸球、単球、リ
ンパ球及び好塩基球として知られている。成熟血液細胞
は各種類毎に、宿主の恒常性維持に必要な特定機能を果
たす。各種の末梢血液細胞の濃度は、骨髄の微環境内に
存在する種々の因子が関与する動的プロセスによって厳
密に調節されモニターされる。骨髄は、ある疾患条件下
では、特定種類の白血球をより多く又はより少なく放出
し得る。別の条件下では、骨髄から放出される末梢血液
細胞の数の調節が妨害され、非調節数の未熟な白血球又
は赤血球が末梢血に放出される。
従って、末梢血中の正常な５種類の白血球の濃度のモ
ニター、及び未熟な赤血球及び白血球の存在の確認は、
医師にとって重要な診断手段である。典型的には、これ
らの操作は、白血球の分別計数を行って、正常な５種類
の白血球と何らかの異常細胞との相対的比率を顕微鏡的
に調べることにより実施されてきた。このような手動操
作は時間が著しくかかり、主観的であり、労働集約的で
ある。
ニター、及び未熟な赤血球及び白血球の存在の確認は、
医師にとって重要な診断手段である。典型的には、これ
らの操作は、白血球の分別計数を行って、正常な５種類
の白血球と何らかの異常細胞との相対的比率を顕微鏡的
に調べることにより実施されてきた。このような手動操
作は時間が著しくかかり、主観的であり、労働集約的で
ある。
最近になって、白血球の分別分析の労力を軽減するた
めに、自動プロセス及び自動フローシステム装置が開発
された。これらのシステムの幾つかは、米国特許第4,09
9,917号、第4,617,257号、第4,521,518号及び第4,801,5
49号に記載されている。あるシステムは、細胞化学的操
作に基づいて個々の細胞の種類を特異的に同定する。あ
るシステムは、細胞体積の電子インピーダンス測定によ
り３種類の白血球を弁別する。別のシステムは、光学イ
ンピーダンス測定と電子インピーダンス測定とを組合わ
せて使用して、５種類の末梢白血球を弁別する。
めに、自動プロセス及び自動フローシステム装置が開発
された。これらのシステムの幾つかは、米国特許第4,09
9,917号、第4,617,257号、第4,521,518号及び第4,801,5
49号に記載されている。あるシステムは、細胞化学的操
作に基づいて個々の細胞の種類を特異的に同定する。あ
るシステムは、細胞体積の電子インピーダンス測定によ
り３種類の白血球を弁別する。別のシステムは、光学イ
ンピーダンス測定と電子インピーダンス測定とを組合わ
せて使用して、５種類の末梢白血球を弁別する。
細胞免疫学及びフローサイトメトリーの近年の発展
は、ヘルパーＴ細胞のようなリンパ球サブクラスの同定
及び定量に利用されている。リンパ球サブクラスの分析
は、特にエイズの流行の進行に鑑み、重要な診断手段と
なった。従来のリンパ球サブクラス分析は下記のステッ
プを含む：（１）密度勾配遠心分離によってリンパ球を
他の末梢血液細胞から分離する；（２）リンパ球を、特
定のリンパ球表面抗原に対するフルオロクロム標識モノ
クローナル抗体と反応させる；（３）フローサイトメト
リーを用いてリンパ球−抗体反応産物を分析する。現在
では、密度勾配遠心分離の必要を回避する全血法の開発
に多大な努力が払われている。最近開発されたリンパ球
サブクラス分析のための全血法は、赤血球を溶解し、赤
血球ゴースト及び細胞残渣を遠心分離で除去し、残った
白血球を適当な固定剤を含む等張生理食塩水に懸濁して
形態を保持させることからなる。これらの方法は密度勾
配遠心分離の必要はないが、遠心分離ステップは依然と
して必要であるため、既存の自動臨床血液分析器にはや
はり適合しない。
は、ヘルパーＴ細胞のようなリンパ球サブクラスの同定
及び定量に利用されている。リンパ球サブクラスの分析
は、特にエイズの流行の進行に鑑み、重要な診断手段と
なった。従来のリンパ球サブクラス分析は下記のステッ
プを含む：（１）密度勾配遠心分離によってリンパ球を
他の末梢血液細胞から分離する；（２）リンパ球を、特
定のリンパ球表面抗原に対するフルオロクロム標識モノ
クローナル抗体と反応させる；（３）フローサイトメト
リーを用いてリンパ球−抗体反応産物を分析する。現在
では、密度勾配遠心分離の必要を回避する全血法の開発
に多大な努力が払われている。最近開発されたリンパ球
サブクラス分析のための全血法は、赤血球を溶解し、赤
血球ゴースト及び細胞残渣を遠心分離で除去し、残った
白血球を適当な固定剤を含む等張生理食塩水に懸濁して
形態を保持させることからなる。これらの方法は密度勾
配遠心分離の必要はないが、遠心分離ステップは依然と
して必要であるため、既存の自動臨床血液分析器にはや
はり適合しない。
一般的には、有核赤血球（NRBC）の分析に使用できる
既存の試薬系は、赤血球の基質又は大きな血小板からの
NRBCシグナルの弁別及び計数を可能にすることはでき
ず、機器に可能なNRBCシグナルをつけることができるだ
けである。
既存の試薬系は、赤血球の基質又は大きな血小板からの
NRBCシグナルの弁別及び計数を可能にすることはでき
ず、機器に可能なNRBCシグナルをつけることができるだ
けである。
白血球分析では、総ての赤血球を完全に溶解すること
が重要である。赤血球の数は白血球の数を約700対１で
上回るため、１％の非溶解赤血球でも白血球の計数に誤
差を与える。赤血球の溶解に使用される試薬の中には、
必要なインキュベーション時間が長すぎるため自動臨床
分析器で実際に使用することができないものがある。例
えば、Clinical Cytometry,Ann.N.Y.Acd.Sci.,vol.468,
pp.113-127（1986）でK.A.Muriheadが推奨しているトリ
ス緩衝塩化アンモニウム溶液は赤血球を溶解するのに５
〜10分を要するが、これは自動化の場合には非実用的す
ぎる。
が重要である。赤血球の数は白血球の数を約700対１で
上回るため、１％の非溶解赤血球でも白血球の計数に誤
差を与える。赤血球の溶解に使用される試薬の中には、
必要なインキュベーション時間が長すぎるため自動臨床
分析器で実際に使用することができないものがある。例
えば、Clinical Cytometry,Ann.N.Y.Acd.Sci.,vol.468,
pp.113-127（1986）でK.A.Muriheadが推奨しているトリ
ス緩衝塩化アンモニウム溶液は赤血球を溶解するのに５
〜10分を要するが、これは自動化の場合には非実用的す
ぎる。
また、ある種の溶解試薬による不完全な溶血は、自動
臨床電子光学システムで大きなバックグラウンド計数を
発生させるのに十分なヘモグロビンを保持する赤血球基
質を発生させる。従って、分析すべき白血球を最初に遠
心分離で赤血球基質から除去しなければならない。これ
は、試薬系を自動化に適応させにくくする操作である。
臨床電子光学システムで大きなバックグラウンド計数を
発生させるのに十分なヘモグロビンを保持する赤血球基
質を発生させる。従って、分析すべき白血球を最初に遠
心分離で赤血球基質から除去しなければならない。これ
は、試薬系を自動化に適応させにくくする操作である。
赤血球の溶解に使用される別の試薬系、例えば米国特
許第4,902,613号及び第4,654,312号に記載の試薬系は、
屈折率の高い溶剤を含む。屈折率の高い細胞懸濁媒質に
は二つの欠点がある。即ち、（１）屈折率が高すぎて一
般的なフローセルサリーンシース（flow cell salline
sheath）には使用し得ない、（２）懸濁媒質の高い屈折
率が、小リンパ球及び細胞質溶解有核赤血球のような小
細胞成分からのシグナルを妨害し得る。従って、細胞を
遠心分離で高屈折率媒質から除去し、等張溶液に再懸濁
した後でなければ、細胞をフローセルで分析することは
できない。このような手動操作は望ましいものではな
く、又は完全に自動化された臨床分析器での使用に適応
できない。
許第4,902,613号及び第4,654,312号に記載の試薬系は、
屈折率の高い溶剤を含む。屈折率の高い細胞懸濁媒質に
は二つの欠点がある。即ち、（１）屈折率が高すぎて一
般的なフローセルサリーンシース（flow cell salline
sheath）には使用し得ない、（２）懸濁媒質の高い屈折
率が、小リンパ球及び細胞質溶解有核赤血球のような小
細胞成分からのシグナルを妨害し得る。従って、細胞を
遠心分離で高屈折率媒質から除去し、等張溶液に再懸濁
した後でなければ、細胞をフローセルで分析することは
できない。このような手動操作は望ましいものではな
く、又は完全に自動化された臨床分析器での使用に適応
できない。
また、米国特許第5,155,044号に記載されているよう
な溶解試薬は過度に低張であり及び／又は酸性である。
この種の溶解試薬は、分析を行うべく白血球の形態を保
持するために、高塩溶液（high salt solution）及び／
又はアルカリ塩溶液の迅速な「後追い（follow-up）」
添加を必要とする。また、米国特許第4,751,179号に記
載のような溶解試薬は、別個の固定剤を適当な時点及び
濃度で添加して白血球の溶解を防止しない限り、赤血球
を溶解するだけでなく白血球も溶解する。これらの試薬
は、特に（慢性リンパ性白血病［CCL］患者に由来する
血液試料のように）脆弱な白血球を含む異常血液試料の
場合に、白血球損傷の可能性を導入する。
な溶解試薬は過度に低張であり及び／又は酸性である。
この種の溶解試薬は、分析を行うべく白血球の形態を保
持するために、高塩溶液（high salt solution）及び／
又はアルカリ塩溶液の迅速な「後追い（follow-up）」
添加を必要とする。また、米国特許第4,751,179号に記
載のような溶解試薬は、別個の固定剤を適当な時点及び
濃度で添加して白血球の溶解を防止しない限り、赤血球
を溶解するだけでなく白血球も溶解する。これらの試薬
は、特に（慢性リンパ性白血病［CCL］患者に由来する
血液試料のように）脆弱な白血球を含む異常血液試料の
場合に、白血球損傷の可能性を導入する。
また、米国特許第4,099,917号、第4,801,549号及び第
4,978,624号に記載のような試薬系は、赤血球を完全に
溶解するために、例えば50℃を超える高温でのインキュ
ベーションを必要とする。温度が45℃を超えると通常は
大部分の細胞表面抗原が変質し始め、その過程でヘモグ
ロビンが凝集する。これらの系は白血球示差分析を実施
するために使用し得るが、リンパ球副次集団を弁別する
手段を破壊し、免疫表現型リンパ球分類（immunophenot
ypic lymphocyte classification）には使用できない。
4,978,624号に記載のような試薬系は、赤血球を完全に
溶解するために、例えば50℃を超える高温でのインキュ
ベーションを必要とする。温度が45℃を超えると通常は
大部分の細胞表面抗原が変質し始め、その過程でヘモグ
ロビンが凝集する。これらの系は白血球示差分析を実施
するために使用し得るが、リンパ球副次集団を弁別する
手段を破壊し、免疫表現型リンパ球分類（immunophenot
ypic lymphocyte classification）には使用できない。
現在使用されている試薬系の多くは、固定した白血球
を分別分析にかける前に、これら白血球の細胞化学的染
色を必要とする。これらの系は、複数の試薬の所定時点
での添加と、所定のインキュベーション時間とを必要と
し、通常は有核赤血球の定量又は免疫表現型リンパ球分
類には適応できない。また、試薬添加又は他の血液試料
操作の各ステップが、当該試料から得られる最終計数の
正確さを低下させる。
を分別分析にかける前に、これら白血球の細胞化学的染
色を必要とする。これらの系は、複数の試薬の所定時点
での添加と、所定のインキュベーション時間とを必要と
し、通常は有核赤血球の定量又は免疫表現型リンパ球分
類には適応できない。また、試薬添加又は他の血液試料
操作の各ステップが、当該試料から得られる最終計数の
正確さを低下させる。
以上の理由から、白血球の形態とリンパ球表面抗原と
を保持させながら、赤血球を高速で完全に溶解すること
ができる多目的試薬系の必要が起こってきた。
を保持させながら、赤血球を高速で完全に溶解すること
ができる多目的試薬系の必要が起こってきた。
概要 前述の問題は本発明で解決された。
従って本発明は、末梢全血細胞の自動電気光学分析の
ために、赤血球を高速かつ完全に溶解すると同時に、白
血球の形態とリンパ球表面抗原とを保持させる多目的試
薬系（多目的試薬組成物）を提供することを目的とす
る。
ために、赤血球を高速かつ完全に溶解すると同時に、白
血球の形態とリンパ球表面抗原とを保持させる多目的試
薬系（多目的試薬組成物）を提供することを目的とす
る。
本発明の別の目的は、自動臨床血液分析器での白血球
の高速弁別を可能にする多目的試薬系を提供することに
ある。
の高速弁別を可能にする多目的試薬系を提供することに
ある。
本発明の更に別の目的は、自動臨床血液分析器での有
核赤血球（NRBC）の同定及び定量を可能にする多目的試
薬系を提供することにある。
核赤血球（NRBC）の同定及び定量を可能にする多目的試
薬系を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、自動臨床フローサイトメー
ターでフルオロクロム複合抗体が結合したリンパ球サブ
クラスを計数する前にリンパ球−抗体反応産物を遠心分
離する必要を回避させる多目的試薬系を提供することに
ある。
ターでフルオロクロム複合抗体が結合したリンパ球サブ
クラスを計数する前にリンパ球−抗体反応産物を遠心分
離する必要を回避させる多目的試薬系を提供することに
ある。
本発明の多目的試薬系は、非第四アンモニウム塩と、
炭素数１〜４の脂肪族アルデヒドと、脂肪族アルデヒド
に対して実質的に不活性の非リン酸塩緩衝液と、約5.5
〜約7.5の実効pHを与え且つモル浸透圧濃度を約160〜約
310mOsm/l（ミリオズモル／リットル）にするための水
とを含む。本発明で使用する種々の任意的試薬として
は、サポニンのような界面活性剤、凝固防止剤、重炭素
アルカリ金属塩、核染料、又は特定の細胞表面抗原に対
する抗体が挙げられる。
炭素数１〜４の脂肪族アルデヒドと、脂肪族アルデヒド
に対して実質的に不活性の非リン酸塩緩衝液と、約5.5
〜約7.5の実効pHを与え且つモル浸透圧濃度を約160〜約
310mOsm/l（ミリオズモル／リットル）にするための水
とを含む。本発明で使用する種々の任意的試薬として
は、サポニンのような界面活性剤、凝固防止剤、重炭素
アルカリ金属塩、核染料、又は特定の細胞表面抗原に対
する抗体が挙げられる。
本発明の方法の一つは、多目的試薬系を調製し、該多
目的試薬系を全血試料と混合し、試料系−血液混合物を
10秒以上インキュベートし、自動血液分析器で血液試料
を分析することからなる。
目的試薬系を全血試料と混合し、試料系−血液混合物を
10秒以上インキュベートし、自動血液分析器で血液試料
を分析することからなる。
本発明の特徴及び技術的利点の一つは、開示する多目
的試薬系が赤血球を高速かつ完全に溶解することがで
き、それと同時に、第二の試薬又は固定剤の添加の必要
なしに、白血球の形態を保持させることにある。本明細
書で開示する赤血球溶解プロセスは、20秒以内で実施で
きる。
的試薬系が赤血球を高速かつ完全に溶解することがで
き、それと同時に、第二の試薬又は固定剤の添加の必要
なしに、白血球の形態を保持させることにある。本明細
書で開示する赤血球溶解プロセスは、20秒以内で実施で
きる。
本発明の別の特徴及び技術的利点は、開示する多目的
試薬系が白血球を適当に固定し、CLLリンパ球のような
脆弱なリンパ球をも溶解しないことにある。本発明の多
目的試薬系は更に、該試薬に暴露された白血球を長時間
にわたり安定させることが判明した。
試薬系が白血球を適当に固定し、CLLリンパ球のような
脆弱なリンパ球をも溶解しないことにある。本発明の多
目的試薬系は更に、該試薬に暴露された白血球を長時間
にわたり安定させることが判明した。
本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する多
目的試薬系が、別の血液学的測定で使用される等張生理
食塩水と類似の屈折率を有することにある。
目的試薬系が、別の血液学的測定で使用される等張生理
食塩水と類似の屈折率を有することにある。
本発明の別の特徴及び技術的利点は、開示する多目的
試薬系の溶解力が、16倍もの薄さに希釈した全血試料中
の赤血球を完全にかつ高速で溶解するのに十分なほど大
きく、従って正確且つ高速の細胞分析の実施に十分な白
血球密度が維持されることにある。これは、マルチパラ
メーター臨床器具での自動分析を可能にするものであ
る。
試薬系の溶解力が、16倍もの薄さに希釈した全血試料中
の赤血球を完全にかつ高速で溶解するのに十分なほど大
きく、従って正確且つ高速の細胞分析の実施に十分な白
血球密度が維持されることにある。これは、マルチパラ
メーター臨床器具での自動分析を可能にするものであ
る。
本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する多
目的試薬系が、リンパ球表面抗原、例えばCD3、CD4、CD
8及びCD19を保持させることにある。
目的試薬系が、リンパ球表面抗原、例えばCD3、CD4、CD
8及びCD19を保持させることにある。
本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する方
法が赤血球を極めて徹底的に溶解するため、赤血球基質
を洗浄するか又は除去しなくても、赤血球ゴーストから
のシグナルがリンパ球からのシグナルと明確に区別でき
るほど小さく、しかも副次集団分離がより良く実施され
ることにある。
法が赤血球を極めて徹底的に溶解するため、赤血球基質
を洗浄するか又は除去しなくても、赤血球ゴーストから
のシグナルがリンパ球からのシグナルと明確に区別でき
るほど小さく、しかも副次集団分離がより良く実施され
ることにある。
本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する末
梢血分析方法が、従来のステップ、又は密度勾配遠心分
離ステップを必要としないことにある。
梢血分析方法が、従来のステップ、又は密度勾配遠心分
離ステップを必要としないことにある。
本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する方
法が、臨床フローサイトメーターでの有核赤血球の定量
を可能にすることにある。
法が、臨床フローサイトメーターでの有核赤血球の定量
を可能にすることにある。
本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する多
目的試薬系が、末梢白血球の高速、単一試薬、単一管、
自動示差分析を可能にすることにある。
目的試薬系が、末梢白血球の高速、単一試薬、単一管、
自動示差分析を可能にすることにある。
本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する方
法が、自動フローサイトメーターでのリンパ球サブクラ
スの高速分別分析を可能にすることにある。
法が、自動フローサイトメーターでのリンパ球サブクラ
スの高速分別分析を可能にすることにある。
本発明のこれらの及び他の特徴及び利点は、以下の好
ましい実施態様の説明によって明らかにされよう。
ましい実施態様の説明によって明らかにされよう。
図面の簡単な説明 本発明及びその利点がより良く理解されるように、こ
こで添付図面を参照しながら説明を行う。
こで添付図面を参照しながら説明を行う。
添付図面中、第１図は、実施例１に記載のように処理
した正常血液試料の白血球分析を示している。調製した
細胞懸濁液は直接CD3500（登録商標）分析器光学システ
ムにかけ、システムの液圧装置は使用しなかった。
した正常血液試料の白血球分析を示している。調製した
細胞懸濁液は直接CD3500（登録商標）分析器光学システ
ムにかけ、システムの液圧装置は使用しなかった。
第２図は、実施例12に記載のように処理した正常血液
試料の白血球分布を示している。処理した細胞懸濁液は
直接CD3500（登録商標）分析器光学システムにかけ、シ
ステムの液圧装置は使用しなかった。各クラスターは白
血球副次集団を標識されたものとして表している。
試料の白血球分布を示している。処理した細胞懸濁液は
直接CD3500（登録商標）分析器光学システムにかけ、シ
ステムの液圧装置は使用しなかった。各クラスターは白
血球副次集団を標識されたものとして表している。
第3a図は、ニワトリ赤血球核（CEN）を用いずに核染
料を用いて実施例５に記載のように処理した正常血液試
料のFACScan（登録商標）表示プリントアウトを示して
いる。
料を用いて実施例５に記載のように処理した正常血液試
料のFACScan（登録商標）表示プリントアウトを示して
いる。
第3b図は、核染料を用いて実施例５に記載のように処
理した、ニワトリ赤血球核を加えた正常血液試料のFACS
can（登録商標）表示プリントアウトを示している。FL3
染色CEN集団が左上方の隅に見える。
理した、ニワトリ赤血球核を加えた正常血液試料のFACS
can（登録商標）表示プリントアウトを示している。FL3
染色CEN集団が左上方の隅に見える。
第4a図、第4b図、第4c図及び第4d図は、実施例２、３
及び４に記載のように処理した正常血液試料のFACScan
（登録商標）表示プリントアウトを示している。
及び４に記載のように処理した正常血液試料のFACScan
（登録商標）表示プリントアウトを示している。
第5b図、第5d図、第5f図及び第5h図は、免疫表現型決
定のために実施例２、３及び４に記載のように処理した
正常血液試料のFACScan（登録商標）表示プリントアウ
トを示し、第5a図、第5c図、第5e図及び第5g図は、同じ
方法で調製した、但しBecton Dickinson社のFacsLyse
（登録商標）で溶解した同じ試料のFACScan（登録商
標）表示プリントアウトを示している。
定のために実施例２、３及び４に記載のように処理した
正常血液試料のFACScan（登録商標）表示プリントアウ
トを示し、第5a図、第5c図、第5e図及び第5g図は、同じ
方法で調製した、但しBecton Dickinson社のFacsLyse
（登録商標）で溶解した同じ試料のFACScan（登録商
標）表示プリントアウトを示している。
詳細な説明 本発明は、広義には、有核末梢血液細胞の高速分析に
適した多目的試薬系又は血液希釈剤に関する。本発明の
多目的試薬系は、赤血球を完全かつ速く溶解することが
でき、それと同時に白血球の形態とリンパ球表面抗原の
抗原性とを保持させる。
適した多目的試薬系又は血液希釈剤に関する。本発明の
多目的試薬系は、赤血球を完全かつ速く溶解することが
でき、それと同時に白血球の形態とリンパ球表面抗原の
抗原性とを保持させる。
本発明の一面は、約３〜約7g/lの非第四アンモニウム
塩と、約0.04〜約0.1％w/v（即ち100ml当たりのグラム
数）の炭素数１〜４の脂肪族アルデヒドと、約10〜約20
mMの、脂肪族アルデヒドに対して実質的に不活性の非リ
ン酸塩緩衝液と、水とを含む多目的試薬系からなる。該
試薬系のpHは約5.5〜約7.5のpH範囲にあり、該試薬系の
浸透圧濃度は約160〜310mOsm/Lである。該試薬系の屈折
率は生理食塩水と類似しており、約1.333〜約1.336の範
囲である。第一アミノ基を含まない非リン酸塩緩衝液は
脂肪族アルデヒドに対して不活性である。従って、非リ
ン酸塩緩衝液は通常、第一アミノ基を含まないのがよ
い。
塩と、約0.04〜約0.1％w/v（即ち100ml当たりのグラム
数）の炭素数１〜４の脂肪族アルデヒドと、約10〜約20
mMの、脂肪族アルデヒドに対して実質的に不活性の非リ
ン酸塩緩衝液と、水とを含む多目的試薬系からなる。該
試薬系のpHは約5.5〜約7.5のpH範囲にあり、該試薬系の
浸透圧濃度は約160〜310mOsm/Lである。該試薬系の屈折
率は生理食塩水と類似しており、約1.333〜約1.336の範
囲である。第一アミノ基を含まない非リン酸塩緩衝液は
脂肪族アルデヒドに対して不活性である。従って、非リ
ン酸塩緩衝液は通常、第一アミノ基を含まないのがよ
い。
本発明の好ましい実施態様は、約95mMの塩化アンモニ
ウム（5g/l）と、約0.075容量％のホルムアルデヒド
と、約10mM〜約20mMの酢酸塩緩衝液と、約10mMの重炭酸
カリウムと、約0.01％w/v（即ち100ml当たりのグラム
数）のサポニンとを含む多目的試薬系を使用する。該試
薬系のpHは約6.2〜約6.5の範囲に調節し、該試薬系の浸
透圧濃度は約215〜約270mOsm/lである。
ウム（5g/l）と、約0.075容量％のホルムアルデヒド
と、約10mM〜約20mMの酢酸塩緩衝液と、約10mMの重炭酸
カリウムと、約0.01％w/v（即ち100ml当たりのグラム
数）のサポニンとを含む多目的試薬系を使用する。該試
薬系のpHは約6.2〜約6.5の範囲に調節し、該試薬系の浸
透圧濃度は約215〜約270mOsm/lである。
浸透圧濃度（osmolality）は、単位容量の水溶液中に
溶解している粒子の数であると定義される。浸透圧濃度
（osmolarity）は、単位重量の水溶液中に溶解している
粒子の数であると定義される。実際には、両者は、本発
明で使用する範囲で極めて接近した数値を有する。1kg
当たりの溶解オスモルが1/1000である溶液は、１ミリオ
スモス（mOs）/kgの濃度を有する。オスモルは、1g分子
の非解離溶質中の粒子数である。張度は、血液の浸透圧
との関連における溶液の浸透圧の尺度である。低張溶液
は、張度浸透圧が血液より低い溶液である。低張溶液の
浸透圧濃度は通常、約80〜250mOs/lである。等張溶液は
血液と同じ張度を有する。ここでは、浸透圧濃度は通常
約280〜約310mOs/lである。高張溶液は、約310〜440mOs
/lの浸透圧濃度を有するのが普通である血液よりも、さ
らに大きい張度の溶液である。水は約10〜20mOs/lの浸
透圧濃度を有する。
溶解している粒子の数であると定義される。浸透圧濃度
（osmolarity）は、単位重量の水溶液中に溶解している
粒子の数であると定義される。実際には、両者は、本発
明で使用する範囲で極めて接近した数値を有する。1kg
当たりの溶解オスモルが1/1000である溶液は、１ミリオ
スモス（mOs）/kgの濃度を有する。オスモルは、1g分子
の非解離溶質中の粒子数である。張度は、血液の浸透圧
との関連における溶液の浸透圧の尺度である。低張溶液
は、張度浸透圧が血液より低い溶液である。低張溶液の
浸透圧濃度は通常、約80〜250mOs/lである。等張溶液は
血液と同じ張度を有する。ここでは、浸透圧濃度は通常
約280〜約310mOs/lである。高張溶液は、約310〜440mOs
/lの浸透圧濃度を有するのが普通である血液よりも、さ
らに大きい張度の溶液である。水は約10〜20mOs/lの浸
透圧濃度を有する。
本発明は、白血球の分別計数、有核赤血球及びリンパ
球の免疫表現型決定の自動測定における多目的試薬系の
使用にも関する。有核末梢全血細胞の高速分析方法は下
記のステップを含む：本発明の多目的試薬系を凝固防止
処理した全血試料と混合し（その結果血液は16〜100倍
に希釈される）、該希釈剤−血液混合物を約25℃〜46℃
の温度で10秒以上インキュベートし、有核末梢血液細胞
を自動血液分析装置で分析する。
球の免疫表現型決定の自動測定における多目的試薬系の
使用にも関する。有核末梢全血細胞の高速分析方法は下
記のステップを含む：本発明の多目的試薬系を凝固防止
処理した全血試料と混合し（その結果血液は16〜100倍
に希釈される）、該希釈剤−血液混合物を約25℃〜46℃
の温度で10秒以上インキュベートし、有核末梢血液細胞
を自動血液分析装置で分析する。
末梢白血球の分別分析で本発明の多目的試薬系を使用
する方法は、赤血球の溶解と白血球の固定とを同時に行
う高速単一試薬法であり、白血球は光散乱特性を維持す
る。実施例１は、本発明の多目的試薬系の好ましい具体
例を、白血球分別分析の高速プロセスに適用した場合の
説明である。第１図は、光散乱による（実施例１のよう
に処理した）正常血液試料中の白血球の分別分析を示し
ている。一般的には、細胞は光学観測チャンバを通って
流れ、該チャンバ内で光電測定プロセスにより、選択さ
れた角度で各細胞に吸収された光又は散乱された光が記
録される。種々の角度で集められた散乱光からの電子シ
グナルを、第１図に示すように二次元ドットプロットと
して記録する。第1c図に示すように顆粒球と白血球集団
の残りとの間に閾線を引くことにより、10度対90度の散
乱プロットであるサイトグラム（cytogram）で、まず顆
粒球が同定される。次いで、第1b図に示すように、直交
（ORTHOGONAL）対非偏光（DEPOL）サイトグラムで好酸
球が同定される。その後、単球及びリンパ球が、サイズ
対複雑度（COMPLEXITY）サイトグラム（第1a図）でＹ軸
に沿って同定される。なぜなら単球がリンパ球より大き
いからである。Ｘ軸（複雑度）に沿ってリンパ球と顆粒
球との間に位置し、既に同定された集団（好中球及び好
酸球）のいずれにも属さないＹ軸沿いの単球のシグナル
より弱いシグナルは、標識された状態の好塩基球である
（第1a図）。
する方法は、赤血球の溶解と白血球の固定とを同時に行
う高速単一試薬法であり、白血球は光散乱特性を維持す
る。実施例１は、本発明の多目的試薬系の好ましい具体
例を、白血球分別分析の高速プロセスに適用した場合の
説明である。第１図は、光散乱による（実施例１のよう
に処理した）正常血液試料中の白血球の分別分析を示し
ている。一般的には、細胞は光学観測チャンバを通って
流れ、該チャンバ内で光電測定プロセスにより、選択さ
れた角度で各細胞に吸収された光又は散乱された光が記
録される。種々の角度で集められた散乱光からの電子シ
グナルを、第１図に示すように二次元ドットプロットと
して記録する。第1c図に示すように顆粒球と白血球集団
の残りとの間に閾線を引くことにより、10度対90度の散
乱プロットであるサイトグラム（cytogram）で、まず顆
粒球が同定される。次いで、第1b図に示すように、直交
（ORTHOGONAL）対非偏光（DEPOL）サイトグラムで好酸
球が同定される。その後、単球及びリンパ球が、サイズ
対複雑度（COMPLEXITY）サイトグラム（第1a図）でＹ軸
に沿って同定される。なぜなら単球がリンパ球より大き
いからである。Ｘ軸（複雑度）に沿ってリンパ球と顆粒
球との間に位置し、既に同定された集団（好中球及び好
酸球）のいずれにも属さないＹ軸沿いの単球のシグナル
より弱いシグナルは、標識された状態の好塩基球である
（第1a図）。
本発明の多目的試薬系の第一の成分は、非第四アンモ
ニウム塩である。好ましくは、ジアンモニウム塩もトリ
アンモニウム塩も使用しない。種々のモノアンモニウム
塩、特にハロゲン化塩を、約３〜約7g/l、好ましくは5g
/l使用し得る。この種の非第四アンモニウム塩の具体例
としては、NH4X［式中、Ｘはハロゲンである］が挙げら
れる。この種の非第四アンモニウム塩は、好ましくはNH
4Clである。
ニウム塩である。好ましくは、ジアンモニウム塩もトリ
アンモニウム塩も使用しない。種々のモノアンモニウム
塩、特にハロゲン化塩を、約３〜約7g/l、好ましくは5g
/l使用し得る。この種の非第四アンモニウム塩の具体例
としては、NH4X［式中、Ｘはハロゲンである］が挙げら
れる。この種の非第四アンモニウム塩は、好ましくはNH
4Clである。
本発明の多目的試薬系の第二の成分は、短鎖脂肪族ア
ルデヒドである。この種の脂肪族アルデヒドは、１〜４
個の炭素を有するのが好ましい。アルデヒドの具体例と
しては、ホルムアルデヒド及びそのポリマー、即ちパラ
ホルムアルデヒドが挙げられる。アルデヒドは適当な比
率及び濃度で使用すると、非第四アンモニウム塩及び緩
衝液と協働して、赤血球を短時間でかつ完全に溶解す
る。また、アルデヒドは白血球を固定し、その膜の完全
な状態を保持させる。本発明では、ホルムアルデヒド又
は類似のアルデヒドを、約0.04容量％〜約0.10容量％、
好ましくは約0.08容量％〜約0.1容量％の量で使用す
る。
ルデヒドである。この種の脂肪族アルデヒドは、１〜４
個の炭素を有するのが好ましい。アルデヒドの具体例と
しては、ホルムアルデヒド及びそのポリマー、即ちパラ
ホルムアルデヒドが挙げられる。アルデヒドは適当な比
率及び濃度で使用すると、非第四アンモニウム塩及び緩
衝液と協働して、赤血球を短時間でかつ完全に溶解す
る。また、アルデヒドは白血球を固定し、その膜の完全
な状態を保持させる。本発明では、ホルムアルデヒド又
は類似のアルデヒドを、約0.04容量％〜約0.10容量％、
好ましくは約0.08容量％〜約0.1容量％の量で使用す
る。
本発明の多目的試薬系の第三の成分は、該試薬系のア
ルデヒド成分に対して実質的に不活性の非リン酸塩緩衝
液である。従って、該緩衝液は第一アミノ基を含んでい
てはならない。該緩衝液はまた、約5.5〜約7.5のpHの実
効緩衝能力を示すものでなければならない。効果的な有
機緩衝液の具体例としては、酢酸塩緩衝液、コハク酸塩
緩衝液、マレイン酸塩緩衝液及びクエン酸塩緩衝液が挙
げられる。効果的な生理緩衝液の具体例としては、２−
（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝液、
３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）緩
衝液、及びＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−
Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）（HEPES）緩衝液が挙
げられる。本発明では、酢酸塩又は他の適当な緩衝液を
約10mM〜約20mMの濃度、好ましくは約20mMの濃度で使用
する。MES緩衝液、MOPS緩衝液及びHEPES緩衝液を使用す
る本発明の実施態様は、それぞれ実施例６、７及び８で
記述する。
ルデヒド成分に対して実質的に不活性の非リン酸塩緩衝
液である。従って、該緩衝液は第一アミノ基を含んでい
てはならない。該緩衝液はまた、約5.5〜約7.5のpHの実
効緩衝能力を示すものでなければならない。効果的な有
機緩衝液の具体例としては、酢酸塩緩衝液、コハク酸塩
緩衝液、マレイン酸塩緩衝液及びクエン酸塩緩衝液が挙
げられる。効果的な生理緩衝液の具体例としては、２−
（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝液、
３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）緩
衝液、及びＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−
Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）（HEPES）緩衝液が挙
げられる。本発明では、酢酸塩又は他の適当な緩衝液を
約10mM〜約20mMの濃度、好ましくは約20mMの濃度で使用
する。MES緩衝液、MOPS緩衝液及びHEPES緩衝液を使用す
る本発明の実施態様は、それぞれ実施例６、７及び８で
記述する。
本発明の多目的血液希釈剤の任意的成分は、界面活性
試薬である。好ましい界面活性剤は、サポニン、即ちキ
ラヤ樹皮及び他の供給源から分離した商業グレード粉末
形態で入手できる植物抽出物である。市販のサポニンの
化学的純度はロット毎に異なるが、赤血球に対する選択
性が第四アンモニウム塩より大きい。本発明では、サポ
ニン又は他の界面活性剤を約10〜約200mg/l、好ましく
は約100mg/lの量で使用する。サポニンは、多目的試薬
系の他の成分と協働して、全血中に存在する赤血球を完
全に溶解する。正常血液試料の赤血球フラクション、即
ち赤血球細胞は、室温で約20秒以内に溶解する。しかし
ながら、溶解しにくい血液試料（例えば乳児、腎透析患
者、多発性骨髄腫患者、糖尿病又は尿毒症患者に由来す
る血液試料）の場合は、赤血球を完全に溶解するため
に、血液を試薬系と共に約38℃〜約43℃の温度で20秒ま
でインキュベートする必要がある。血液試料を多目的試
薬系と共にインキュベートすると、上記のように多少昇
温しても、白血球の膜の完全な状態が効果的に保持さ
れ、リンパ球表面抗原の抗原性が維持される。これに対
し、赤血球を溶解するためにサポニンを単独で使用する
場合は、本発明で使用する濃度の10〜20倍の濃度にしな
ければならない。このような濃度は白血球の一体性を著
しく損ない、白血球の形態を保持するためには試薬の溶
解活性の急速停止を必要とする。本発明の利点は、多目
的試薬系の成分が協働して白血球を穏やかに固定し、そ
れと同時に赤血球を溶解することにある。従って、比較
的長いインキュベーション時間でも白血球の完全な状態
が保持される。実際、慢性リンパ性白血病に見られるよ
うな脆弱な白血球でも、本発明の多目的試薬系中では20
分までのインキュベーション時間にわたって安定してい
る。
試薬である。好ましい界面活性剤は、サポニン、即ちキ
ラヤ樹皮及び他の供給源から分離した商業グレード粉末
形態で入手できる植物抽出物である。市販のサポニンの
化学的純度はロット毎に異なるが、赤血球に対する選択
性が第四アンモニウム塩より大きい。本発明では、サポ
ニン又は他の界面活性剤を約10〜約200mg/l、好ましく
は約100mg/lの量で使用する。サポニンは、多目的試薬
系の他の成分と協働して、全血中に存在する赤血球を完
全に溶解する。正常血液試料の赤血球フラクション、即
ち赤血球細胞は、室温で約20秒以内に溶解する。しかし
ながら、溶解しにくい血液試料（例えば乳児、腎透析患
者、多発性骨髄腫患者、糖尿病又は尿毒症患者に由来す
る血液試料）の場合は、赤血球を完全に溶解するため
に、血液を試薬系と共に約38℃〜約43℃の温度で20秒ま
でインキュベートする必要がある。血液試料を多目的試
薬系と共にインキュベートすると、上記のように多少昇
温しても、白血球の膜の完全な状態が効果的に保持さ
れ、リンパ球表面抗原の抗原性が維持される。これに対
し、赤血球を溶解するためにサポニンを単独で使用する
場合は、本発明で使用する濃度の10〜20倍の濃度にしな
ければならない。このような濃度は白血球の一体性を著
しく損ない、白血球の形態を保持するためには試薬の溶
解活性の急速停止を必要とする。本発明の利点は、多目
的試薬系の成分が協働して白血球を穏やかに固定し、そ
れと同時に赤血球を溶解することにある。従って、比較
的長いインキュベーション時間でも白血球の完全な状態
が保持される。実際、慢性リンパ性白血病に見られるよ
うな脆弱な白血球でも、本発明の多目的試薬系中では20
分までのインキュベーション時間にわたって安定してい
る。
第２図は、実施例12に記載のように処理し、CD3500
（登録商標）分析器（Abbott Diagnostic,Mountain Vie
w,CA）システムに、システムの液圧装置は使用せずに光
学システムを介して直接かけた正常血液試料中の白血球
の分析を示している。第2c図に示すように閾線を設定す
ることにより、10度対90度散乱プロットから、まず顆粒
球が標識された状態で白血球集団の残りから同定され
る。次いで、第1b図のように好酸球と好中球との間の閾
線を設定することにより、直交対非偏光散乱プロット
（第2b図）で好酸球が標識された状態で同定される。そ
の後、単球及びリンパ球が複雑度対サイズ散乱プロット
で、標識された状態で同定される（第2a図）。Ｘ軸（複
雑度）に沿ってリンパ球と顆粒球との間に位置し、既に
同定された集団（好中球及び好酸球）のいずれにも属さ
ないＹ軸沿いの単球のシグナルより弱いシグナルは、標
識された状態の好塩基球である（第2a図）。
（登録商標）分析器（Abbott Diagnostic,Mountain Vie
w,CA）システムに、システムの液圧装置は使用せずに光
学システムを介して直接かけた正常血液試料中の白血球
の分析を示している。第2c図に示すように閾線を設定す
ることにより、10度対90度散乱プロットから、まず顆粒
球が標識された状態で白血球集団の残りから同定され
る。次いで、第1b図のように好酸球と好中球との間の閾
線を設定することにより、直交対非偏光散乱プロット
（第2b図）で好酸球が標識された状態で同定される。そ
の後、単球及びリンパ球が複雑度対サイズ散乱プロット
で、標識された状態で同定される（第2a図）。Ｘ軸（複
雑度）に沿ってリンパ球と顆粒球との間に位置し、既に
同定された集団（好中球及び好酸球）のいずれにも属さ
ないＹ軸沿いの単球のシグナルより弱いシグナルは、標
識された状態の好塩基球である（第2a図）。
本発明の多目的試薬系の、好ましい、但し任意的な成
分は、アルカリ塩、好ましくは一価の重炭酸アルカリ塩
である。一価の重炭酸アルカリ塩は本発明の希釈剤に必
須の成分ではないが、試薬系の赤血球溶解能力を低下さ
せずに浸透圧濃度を増加させるために該希釈剤に添加し
得る。他の多くの化合物、例えば塩化ナトリウム、塩化
カリウム又はリン酸塩緩衝液は、試薬系の浸透圧濃度を
上げるために使用すると、試薬系の溶解能力を低下させ
る。一価の重炭酸アルカリ塩の具体例としては、重炭酸
カリウム、重炭酸ナトリウム又は重炭酸リチウムが挙げ
られる。本発明では、重炭酸カリウム又は他のアルカリ
金属重炭酸塩を約0.005〜約0.015％w/v（即ち100ml当た
りのミリグラム数）、好ましくは約0.01％w/vの量で使
用し得る。
分は、アルカリ塩、好ましくは一価の重炭酸アルカリ塩
である。一価の重炭酸アルカリ塩は本発明の希釈剤に必
須の成分ではないが、試薬系の赤血球溶解能力を低下さ
せずに浸透圧濃度を増加させるために該希釈剤に添加し
得る。他の多くの化合物、例えば塩化ナトリウム、塩化
カリウム又はリン酸塩緩衝液は、試薬系の浸透圧濃度を
上げるために使用すると、試薬系の溶解能力を低下させ
る。一価の重炭酸アルカリ塩の具体例としては、重炭酸
カリウム、重炭酸ナトリウム又は重炭酸リチウムが挙げ
られる。本発明では、重炭酸カリウム又は他のアルカリ
金属重炭酸塩を約0.005〜約0.015％w/v（即ち100ml当た
りのミリグラム数）、好ましくは約0.01％w/vの量で使
用し得る。
本発明の多目的試薬系の別の任意的成分は血小板凝集
防止剤（anti-clumping agent）である。例えば、試料
／試薬混合物中の血小板の凝集を防止するために、エチ
レンジアミン四酢酸（EDTA）塩を試薬系に添加し得る。
本発明では、テトラナトリウムEDTA又は他のEDTA塩を約
20〜約200mg/l、好ましくは100mg/lの量で使用する。
防止剤（anti-clumping agent）である。例えば、試料
／試薬混合物中の血小板の凝集を防止するために、エチ
レンジアミン四酢酸（EDTA）塩を試薬系に添加し得る。
本発明では、テトラナトリウムEDTA又は他のEDTA塩を約
20〜約200mg/l、好ましくは100mg/lの量で使用する。
本発明の別の実施態様は、自動血液分析器での有核赤
血球の定量分析を可能にする。全血試料中に存在する有
核赤血球の比率を分析するために、核染料、例えばエチ
ジウムホモダイマーを、血液試料に加える前の多目的試
薬系に加える。この実施態様では、核染料を約0.05mg％
〜約0.15mg％w/v（即ち100ml当たりのミリグラム数）、
好ましくは0.1mg％w/vの量で加える。該試薬系は、赤血
球を完全に溶解すると同時に白血球の膜の完全な状態を
保持させる。該多目的試薬系では、添加した核染料が未
熟赤血球の露出核と反応するが、無傷の白血球には侵入
できない。核染料と相互作用し得る唯一の核物質は有核
赤血球に由来するものであるため、染料核物質は血液試
料の有核赤血球フラクションに比例し、自動電気光学分
析器で定量できる。この本発明の単一試薬プロセスは、
種々の白血球集団を有核赤血球から高速で弁別し、ある
種の獣医学的用途で特に有用である。
血球の定量分析を可能にする。全血試料中に存在する有
核赤血球の比率を分析するために、核染料、例えばエチ
ジウムホモダイマーを、血液試料に加える前の多目的試
薬系に加える。この実施態様では、核染料を約0.05mg％
〜約0.15mg％w/v（即ち100ml当たりのミリグラム数）、
好ましくは0.1mg％w/vの量で加える。該試薬系は、赤血
球を完全に溶解すると同時に白血球の膜の完全な状態を
保持させる。該多目的試薬系では、添加した核染料が未
熟赤血球の露出核と反応するが、無傷の白血球には侵入
できない。核染料と相互作用し得る唯一の核物質は有核
赤血球に由来するものであるため、染料核物質は血液試
料の有核赤血球フラクションに比例し、自動電気光学分
析器で定量できる。この本発明の単一試薬プロセスは、
種々の白血球集団を有核赤血球から高速で弁別し、ある
種の獣医学的用途で特に有用である。
第3a図及び第3b図は、実施例５に記載のように処理し
た、ニワトリ赤血球核（CEN）を含む正常血液試料のFAC
Scan（登録商標）表示を示している。第3a図に示す試料
は、CENを使用せずに核染料で処理し、第3b図に示す試
料は核染料及びCEN両方の存在下で処理したものであ
る。左側の二次元ドットプロットは、側方散乱（SSC）
を前方散乱（FSC）に対してプロットしている。右側の
二次元ドットプロットは、SSCシグナルを、試料中の総
ての細胞からの赤色蛍光（FL3）に対してプロットして
いる。第3b図の上方左の隅に、FL3染色CEN集団が見える
ことに留意されたい。
た、ニワトリ赤血球核（CEN）を含む正常血液試料のFAC
Scan（登録商標）表示を示している。第3a図に示す試料
は、CENを使用せずに核染料で処理し、第3b図に示す試
料は核染料及びCEN両方の存在下で処理したものであ
る。左側の二次元ドットプロットは、側方散乱（SSC）
を前方散乱（FSC）に対してプロットしている。右側の
二次元ドットプロットは、SSCシグナルを、試料中の総
ての細胞からの赤色蛍光（FL3）に対してプロットして
いる。第3b図の上方左の隅に、FL3染色CEN集団が見える
ことに留意されたい。
本発明の別の実施態様は、リンパ球副次集団の定量分
析を可能にする。リンパ球サブクラス分析は、特定のリ
ンパ球表面抗原に対するフルオロクロム複合モノクロー
ナル抗体を、多目的試薬系又は血液希釈剤を添加する前
の全血と混合することにより実施する。血液試料に加え
る標識抗体フラクションの濃度は個々の抗体調製物に依
存するが、市販の抗体調製物の場合は通常、血液の量の
約1/2〜1/10である。試薬系を加え、赤血球を溶解した
後、リンパ球−抗体反応産物を自動フローサイトメータ
ーシステムで分析し得る。開示する試薬系は、フルオロ
クロム標識抗体に頻繁に使用されるフルオレセンイソチ
オシアネート（FITC）又はフィコエリテリン（PE）のよ
うな蛍光マーカーを「停止」しない。リンパ球サブクラ
スの分析は、エイズの流行に伴い、診断手段としての重
要性を増している。血液細胞集団の表面マーカーを同定
する能力は、リンパ球及び他の白血球フラクション、例
えば単球及び好中球の副次集団の表面成分及び特徴に関
する科学者の知識が増加しているため、年々重要になっ
てきていると思われる。
析を可能にする。リンパ球サブクラス分析は、特定のリ
ンパ球表面抗原に対するフルオロクロム複合モノクロー
ナル抗体を、多目的試薬系又は血液希釈剤を添加する前
の全血と混合することにより実施する。血液試料に加え
る標識抗体フラクションの濃度は個々の抗体調製物に依
存するが、市販の抗体調製物の場合は通常、血液の量の
約1/2〜1/10である。試薬系を加え、赤血球を溶解した
後、リンパ球−抗体反応産物を自動フローサイトメータ
ーシステムで分析し得る。開示する試薬系は、フルオロ
クロム標識抗体に頻繁に使用されるフルオレセンイソチ
オシアネート（FITC）又はフィコエリテリン（PE）のよ
うな蛍光マーカーを「停止」しない。リンパ球サブクラ
スの分析は、エイズの流行に伴い、診断手段としての重
要性を増している。血液細胞集団の表面マーカーを同定
する能力は、リンパ球及び他の白血球フラクション、例
えば単球及び好中球の副次集団の表面成分及び特徴に関
する科学者の知識が増加しているため、年々重要になっ
てきていると思われる。
第4a図、第4b図、第4c図及び第4d図は、実施例２、３
及び４に記載のように処理した正常血液試料のFASCcan
（登録商標）表示を示している。第4a図は、ドナー試料
の陰性対照として抗体を加えずに処理したものである。
第4b図は、pan B細胞（CD19＋リンパ球）及びpan T細胞
（CD3＋リンパ球）を同定するために実施例４に記載の
ように処理したものである。リンパ球集団はまず前方散
乱（FSC）対側方散乱（SSC）プロットで区分し、緑色蛍
光（FL1）対橙色蛍光（FL2）チャネルで再分析した。第
4a図、第4b図、第4c図及び第4d図から明らかなように、
非標識リンパ球は総て下方左部分にあり、CD3-FITC抗体
標識Pan T細胞は下方右部分に移動し、CD19-PE標識Pan
B細胞は上方左部分に移動している。第4c図の試料は、
ヘルパーＴ細胞（CD4＋リンパ球）を同定するために実
施例２に記載のように処理した。ヘルパーＴ細胞はＴリ
ンパ球の副次集団であり、細胞表面にCD3抗原及びCD4抗
原の両方を有し、従って抗CD3抗体のFITC標識に起因し
て右に移動し、抗体CD4抗体のPE標識に起因して上方右
部分に移動している。第4d図の試料は、サプレッサーＴ
細胞（CD8＋リンパ球）を同定するために実施例３に記
載のように処理した。サプレッサーＴ細胞もＴリンパ球
の副次集団であり、CD3抗原及びCD8抗原の両方を有す
る。従って、該細胞は両方の抗体で標識され、上方右部
分に位置した。
及び４に記載のように処理した正常血液試料のFASCcan
（登録商標）表示を示している。第4a図は、ドナー試料
の陰性対照として抗体を加えずに処理したものである。
第4b図は、pan B細胞（CD19＋リンパ球）及びpan T細胞
（CD3＋リンパ球）を同定するために実施例４に記載の
ように処理したものである。リンパ球集団はまず前方散
乱（FSC）対側方散乱（SSC）プロットで区分し、緑色蛍
光（FL1）対橙色蛍光（FL2）チャネルで再分析した。第
4a図、第4b図、第4c図及び第4d図から明らかなように、
非標識リンパ球は総て下方左部分にあり、CD3-FITC抗体
標識Pan T細胞は下方右部分に移動し、CD19-PE標識Pan
B細胞は上方左部分に移動している。第4c図の試料は、
ヘルパーＴ細胞（CD4＋リンパ球）を同定するために実
施例２に記載のように処理した。ヘルパーＴ細胞はＴリ
ンパ球の副次集団であり、細胞表面にCD3抗原及びCD4抗
原の両方を有し、従って抗CD3抗体のFITC標識に起因し
て右に移動し、抗体CD4抗体のPE標識に起因して上方右
部分に移動している。第4d図の試料は、サプレッサーＴ
細胞（CD8＋リンパ球）を同定するために実施例３に記
載のように処理した。サプレッサーＴ細胞もＴリンパ球
の副次集団であり、CD3抗原及びCD8抗原の両方を有す
る。従って、該細胞は両方の抗体で標識され、上方右部
分に位置した。
第5b図、第5d図、第5f図及び第5h図は、実施例２、３
及び４に記載のように処理した正常血液試料のFASCcan
（登録商標）表示プリントアウトを示している。第5a
図、第5c図、第5e図及び第5g図は、前述と同じ実施例に
記載のように処理した、但し赤血球を実施例11に記載の
ように市販の溶解溶液であるBecton Dickinson社のFacs
Lyse（登録商標）で溶解した、前述と同じ試料を示して
いる。カラム１及び３はFSC対SSCサイトグラムであり、
カラム２及び４は区分したリンパ球のFL1対FL2二次元ド
ットプロットである。比較のために、両方の試料の分析
で、同一のFSC、SSC、FL1及びFL2ゲインを使用した。
及び４に記載のように処理した正常血液試料のFASCcan
（登録商標）表示プリントアウトを示している。第5a
図、第5c図、第5e図及び第5g図は、前述と同じ実施例に
記載のように処理した、但し赤血球を実施例11に記載の
ように市販の溶解溶液であるBecton Dickinson社のFacs
Lyse（登録商標）で溶解した、前述と同じ試料を示して
いる。カラム１及び３はFSC対SSCサイトグラムであり、
カラム２及び４は区分したリンパ球のFL1対FL2二次元ド
ットプロットである。比較のために、両方の試料の分析
で、同一のFSC、SSC、FL1及びFL2ゲインを使用した。
FSC対SSCサイトグラムから明らかなように、右側カラ
ムのサイトグラムは、好中球、好酸球、単球及びリンパ
球の明確に規定されたクラスターを示している。これら
のクラスターはいずれも、ノイズ（主に赤血球基質から
のシグナル）から明確に分離されている。これは、白血
球が本発明の多目的血液希釈剤中で良好に保存されたこ
とを示すものである。これは、より正確なリンパ球区分
を可能にする。これと比較して、左側カラムのサイトグ
ラムの細胞クラスターはそれほど明確に規定されていな
い。各細胞クラスターの分別がそれほど明確ではなく、
顆粒球のシグナルが右側カラムのシグナルより遥かに弱
い。これは、ある種のタンパク質成分の漏洩に起因し得
るこれらの細胞の屈折率の変化を示唆するものである。
最後のカラムの区分したリンパ球のFL1対FL2二次元ドッ
トプロットの質は、赤血球をFacsLyse（登録商標）で溶
解した第二のカラムの対応するドットプロットの質と本
質的に同等である。
ムのサイトグラムは、好中球、好酸球、単球及びリンパ
球の明確に規定されたクラスターを示している。これら
のクラスターはいずれも、ノイズ（主に赤血球基質から
のシグナル）から明確に分離されている。これは、白血
球が本発明の多目的血液希釈剤中で良好に保存されたこ
とを示すものである。これは、より正確なリンパ球区分
を可能にする。これと比較して、左側カラムのサイトグ
ラムの細胞クラスターはそれほど明確に規定されていな
い。各細胞クラスターの分別がそれほど明確ではなく、
顆粒球のシグナルが右側カラムのシグナルより遥かに弱
い。これは、ある種のタンパク質成分の漏洩に起因し得
るこれらの細胞の屈折率の変化を示唆するものである。
最後のカラムの区分したリンパ球のFL1対FL2二次元ドッ
トプロットの質は、赤血球をFacsLyse（登録商標）で溶
解した第二のカラムの対応するドットプロットの質と本
質的に同等である。
第5a図は、実施例２の記載のように処理した、但し抗
体と反応させずに、FacsLyse（登録商標）で溶解した正
常血液の陰性対照を示している。第5b図も同じ試料の陰
性対照であるが、赤血球は本発明のある実施態様の多目
的希釈剤で溶解した。第5c図、第5e図及び第5g図は、実
施例２、３及び４に記載のように処理した、但し赤血球
を実施例11のようにFacsLyse（登録商標）で溶解した、
同じ試料を表している。第5d図、第5f図及び第5h図は、
赤血球を本発明のある実施態様の多目的希釈剤で溶解し
て、実施例２、３及び４に記載のように処理した同じ試
料に関するものである。
体と反応させずに、FacsLyse（登録商標）で溶解した正
常血液の陰性対照を示している。第5b図も同じ試料の陰
性対照であるが、赤血球は本発明のある実施態様の多目
的希釈剤で溶解した。第5c図、第5e図及び第5g図は、実
施例２、３及び４に記載のように処理した、但し赤血球
を実施例11のようにFacsLyse（登録商標）で溶解した、
同じ試料を表している。第5d図、第5f図及び第5h図は、
赤血球を本発明のある実施態様の多目的希釈剤で溶解し
て、実施例２、３及び４に記載のように処理した同じ試
料に関するものである。
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
尚、これらの実施例は本発明を説明するためのものであ
ってこれを限定するためのものではない。
尚、これらの実施例は本発明を説明するためのものであ
ってこれを限定するためのものではない。
実施例１ 白血球分別分析 50μｌのEDTA凝集防止処理正常血液試料を、予め40℃
に暖めた多目的試薬系1mlと混合し、室温で16秒間イン
キュベートした。試薬系は、0.5％w/vの塩化アンモニウ
ムと、0.08％w/vのホルムアルデヒドと、0.01％w/vのサ
ポニンと、0.1％w/vの重炭酸カリウムと、20mMの酢酸塩
緩衝液とを含んでいた。該試薬系は、pHが約6.2、浸透
圧濃度が267mOsm/lであった。この混合物を38±２℃で1
6秒間インキュベートし、システムの液圧装置を使用せ
ずに光学システムを介してCD3500（登録商標）システム
に直接かけた。該試料のサイトグラムは第１図に示す通
りである。
に暖めた多目的試薬系1mlと混合し、室温で16秒間イン
キュベートした。試薬系は、0.5％w/vの塩化アンモニウ
ムと、0.08％w/vのホルムアルデヒドと、0.01％w/vのサ
ポニンと、0.1％w/vの重炭酸カリウムと、20mMの酢酸塩
緩衝液とを含んでいた。該試薬系は、pHが約6.2、浸透
圧濃度が267mOsm/lであった。この混合物を38±２℃で1
6秒間インキュベートし、システムの液圧装置を使用せ
ずに光学システムを介してCD3500（登録商標）システム
に直接かけた。該試料のサイトグラムは第１図に示す通
りである。
実施例２ リンパ球免疫表現型決定 試験管で、50μｌのEDTA凝集防止処理全血を、抗CD3-
FITC及び抗CD4-PEを含むモノクローナル抗体溶液10μｌ
と混合した。
FITC及び抗CD4-PEを含むモノクローナル抗体溶液10μｌ
と混合した。
該混合物を室温で15分間インキュベートした後、0.5
％w/vの塩化アンモニウムと、0.02％w/vのテトラナトリ
ウムEDTAと、0.1容量％のホルムアルデヒドと、0.0075
％w/vのサポニンと、0.01％w/vの重炭酸カリウムと、20
mMの酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬系を1.0m
l加えた。試薬系は、pHが約6.2、浸透圧濃度が270mOsm/
lであり、試薬系−血液溶液はpHが約7.0であった。
％w/vの塩化アンモニウムと、0.02％w/vのテトラナトリ
ウムEDTAと、0.1容量％のホルムアルデヒドと、0.0075
％w/vのサポニンと、0.01％w/vの重炭酸カリウムと、20
mMの酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬系を1.0m
l加えた。試薬系は、pHが約6.2、浸透圧濃度が270mOsm/
lであり、試薬系−血液溶液はpHが約7.0であった。
試薬系−血液溶液を室温で20秒〜10分間インキュベー
トした。このようにインキュベーション時間を許容し得
る範囲内で変化させることにより、複数の試料分析が可
能になる。
トした。このようにインキュベーション時間を許容し得
る範囲内で変化させることにより、複数の試料分析が可
能になる。
CD3＋及びCD4＋リンパ球副次集団の比率を、第4a図に
示すようにFACScan（登録商標）フローサイトメーター
で測定した。
示すようにFACScan（登録商標）フローサイトメーター
で測定した。
実施例３ リンパ球免疫表現型決定 試験管で、50μｌのEDTA凝集防止処理全血を、抗CD3-
FITC及び抗CD8-PEを含むモノクローナル抗体溶液10μｌ
と混合した。
FITC及び抗CD8-PEを含むモノクローナル抗体溶液10μｌ
と混合した。
該混合物を室温で15分間インキュベートした後、0.5
％w/vの塩化アンモニウムと、0.02％w/vのテトラナトリ
ウムEDTAと、0.1容量％のホルムアルデヒドと、0.0075
％w/vのサポニンと、0.01％w/vの重炭酸カリウムと、20
mMの酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬系を1.0m
l加えた。実施例１に記載のように、試薬系はpHが約6.
2、浸透圧濃度が270mOsm/lであった。
％w/vの塩化アンモニウムと、0.02％w/vのテトラナトリ
ウムEDTAと、0.1容量％のホルムアルデヒドと、0.0075
％w/vのサポニンと、0.01％w/vの重炭酸カリウムと、20
mMの酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬系を1.0m
l加えた。実施例１に記載のように、試薬系はpHが約6.
2、浸透圧濃度が270mOsm/lであった。
全血−試薬系溶液は室温で20秒〜10分間の範囲の任意
の時間にわたってインキュベートし得、それによって複
数の試料分析が可能となる。
の時間にわたってインキュベートし得、それによって複
数の試料分析が可能となる。
CD3＋及びCD8＋リンパ球副次集団の比率を、FACScan
（登録商標）フローサイトメーターを用いて測定した。
（登録商標）フローサイトメーターを用いて測定した。
実施例４ リンパ球免疫表現型決定 試験管で、50μｌのEDTA凝集防止処理全血を、抗CD3-
FITC及び抗CD19-PEを含むモノクローナル抗体溶液10μ
ｌと混合した。
FITC及び抗CD19-PEを含むモノクローナル抗体溶液10μ
ｌと混合した。
該混合物を室温で15分間インキュベートした後、0.5
％w/vの塩化アンモニウムと、0.02％w/vのテトラナトリ
ウムEDTAと、0.1容量％のホルムアルデヒドと、0.0075
％w/vのサポニンと、0.01％w/vの重炭酸カリウムと、20
mMの酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬系を1.0m
l加えた。多目的試薬系は、実施例１に記載のように、p
Hが約6.2、浸透圧濃度が270mOsm/lであった。
％w/vの塩化アンモニウムと、0.02％w/vのテトラナトリ
ウムEDTAと、0.1容量％のホルムアルデヒドと、0.0075
％w/vのサポニンと、0.01％w/vの重炭酸カリウムと、20
mMの酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬系を1.0m
l加えた。多目的試薬系は、実施例１に記載のように、p
Hが約6.2、浸透圧濃度が270mOsm/lであった。
全血−試薬系溶液は室温で20秒〜10分間インキュベー
トし得た。インキュベーション時間をこのように変化さ
せると、複数の試料分析が可能になる。
トし得た。インキュベーション時間をこのように変化さ
せると、複数の試料分析が可能になる。
CD3＋及びCD19＋リンパ球副次集団の比率を、第4b図
に示すように、FACScan（登録商標）フローサイトメー
ターを用いて測定した。
に示すように、FACScan（登録商標）フローサイトメー
ターを用いて測定した。
実施例５ 有核赤血球の決定 ニワトリ核を含む又は含まないEDTA凝集防止処理全血
試料50μｌを、0.1mg％w/vの核染料と、0.5％w/vの塩化
アンモニウムと、0.075容量％のホルムアルデヒドと、
0.01％w/vのサポニンと、0.01％w/vの重炭酸カリウム
と、20mMの酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬系
950μｌと混合した。多目的試薬系は、pHが約6.0、浸透
圧濃度が270mOsm/lであった。
試料50μｌを、0.1mg％w/vの核染料と、0.5％w/vの塩化
アンモニウムと、0.075容量％のホルムアルデヒドと、
0.01％w/vのサポニンと、0.01％w/vの重炭酸カリウム
と、20mMの酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬系
950μｌと混合した。多目的試薬系は、pHが約6.0、浸透
圧濃度が270mOsm/lであった。
全血−試薬系溶液を38±２℃で20秒間インキュベート
した。
した。
全血試料中の有核赤血球の比率を、第3a図及び第3b図
に示すように、FACScan（登録商標）フローサイトメー
ターで測定した。
に示すように、FACScan（登録商標）フローサイトメー
ターで測定した。
実施例６ 白血球分別分析 EDTA凝集防止処理全血50μｌを、20mMのMES緩衝液
と、0.5％w/vのフッ化アンモニウムと、0.08容量％のホ
ルムアルデヒドと、0.01％w/vのサポニンとを含む本発
明の多目的試薬系950μｌと混合した。試薬系は、pHが
約6.2、浸透圧濃度が280mOsm/lであった。
と、0.5％w/vのフッ化アンモニウムと、0.08容量％のホ
ルムアルデヒドと、0.01％w/vのサポニンとを含む本発
明の多目的試薬系950μｌと混合した。試薬系は、pHが
約6.2、浸透圧濃度が280mOsm/lであった。
全血−試薬系溶液を40℃で20秒間インキュベートし
た。
た。
白血球の分別分析を、実験用臨床フローサイトメータ
ーで実施した。
ーで実施した。
実施例７ 白血球分別分析 EDTA凝集防止処理全血50μｌを、20mMのMOPS緩衝液
と、0.5％w/vの塩化アンモニウムと、0.1容量％のホル
ムアルデヒドと、0.012％w/vのサポニンと、0.01％w/v
のテトラナトリウムEDTAとを含む本発明の多目的試薬系
1.0mlと混合した。多目的試薬系はpHが約7.0、浸透圧濃
度が280mOsm/lであった。
と、0.5％w/vの塩化アンモニウムと、0.1容量％のホル
ムアルデヒドと、0.012％w/vのサポニンと、0.01％w/v
のテトラナトリウムEDTAとを含む本発明の多目的試薬系
1.0mlと混合した。多目的試薬系はpHが約7.0、浸透圧濃
度が280mOsm/lであった。
全血−試薬系溶液を42℃で20秒間インキュベートし
た。
た。
白血球の分別分析を、実験用臨床フローサイトメータ
ーで実施した。
ーで実施した。
実施例８ 白血球分別分析 EDTA凝集防止処理全血50μｌを、20mMのHEPES緩衝液
と、0.4％w/vのフッ化アンモニウムと、0.08容量％のホ
ルムアルデヒドと、0.01％w/vのサポニンと、0.1％w/v
の重炭酸カリウムとを含む本発明の多目的試薬系1.0ml
と混合した。試薬系はpHが約7.0、浸透圧濃度が270mOsm
/lであった。
と、0.4％w/vのフッ化アンモニウムと、0.08容量％のホ
ルムアルデヒドと、0.01％w/vのサポニンと、0.1％w/v
の重炭酸カリウムとを含む本発明の多目的試薬系1.0ml
と混合した。試薬系はpHが約7.0、浸透圧濃度が270mOsm
/lであった。
全血−試薬系溶液を40℃で約20秒間混合した。
白血球の分別分析を、実験用臨床フローサイトメータ
ーで実施した。
ーで実施した。
実施例９ 白血球を決定するための分別インキュベーション時間 EDTA凝集防止処理全血50μｌを、本発明の多目的試薬
系950μｌと38±２℃で混合した。試薬系は、0.5％w/v
の塩化アンモニウムと、0.08容量％のホルムアルデヒド
と、0.01％w/vのサポニンと、0.1％w/vの重炭酸カリウ
ムと、20mMの酢酸塩緩衝液とを含んでいた。試薬系はpH
が約6.2、浸透圧濃度が267mOsm/lであった。
系950μｌと38±２℃で混合した。試薬系は、0.5％w/v
の塩化アンモニウムと、0.08容量％のホルムアルデヒド
と、0.01％w/vのサポニンと、0.1％w/vの重炭酸カリウ
ムと、20mMの酢酸塩緩衝液とを含んでいた。試薬系はpH
が約6.2、浸透圧濃度が267mOsm/lであった。
前記混合物を38±２℃でインキュベートし、該混合物
のアリコートを14秒、２分、４分、６分、８分及び10分
の時点で逐次採取した。
のアリコートを14秒、２分、４分、６分、８分及び10分
の時点で逐次採取した。
アルゴン−イオンレーザーを備えた実験用臨床フロー
サイトメーターで、白血球の５種分別分析を各アリコー
ト毎に実施した。
サイトメーターで、白血球の５種分別分析を各アリコー
ト毎に実施した。
実施例10 白血球を決定するためのインキュベーション時間及び温
度の変化 EDTA凝集防止処理全血50μｌを、0.5％w/vの塩化アン
モニウムと、0.08容量％のホルムアルデヒドと、0.01％
w/vのサポニンと、0.01％w/vの重炭酸カリウムと、20mM
の酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬系950μｌ
と混合した。試薬系はpHが約6.2、浸透圧濃度が267mOsm
/lであった。
度の変化 EDTA凝集防止処理全血50μｌを、0.5％w/vの塩化アン
モニウムと、0.08容量％のホルムアルデヒドと、0.01％
w/vのサポニンと、0.01％w/vの重炭酸カリウムと、20mM
の酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬系950μｌ
と混合した。試薬系はpHが約6.2、浸透圧濃度が267mOsm
/lであった。
得られた混合物のアリコートを、10分までの種々の時
間間隔で、それぞれ36℃、38℃、40℃、42℃、45℃及び
46℃でインキュベートした。
間間隔で、それぞれ36℃、38℃、40℃、42℃、45℃及び
46℃でインキュベートした。
自動光電システムを用いて、白血球の５種分別分析を
各アリコートの試料について実施した。
各アリコートの試料について実施した。
実施例11 市販の溶解溶液及び本発明の多目的試薬系の比較検査 免疫表現型決定実験で、Becton Dickinson社の市販溶
解溶液（FacsLyse（登録商標））を、本発明の多目的試
薬系（多目的希釈剤）の一つと比較した。試料は実施例
２、３及び４と同様に処理した。結果は表１に示す。
解溶液（FacsLyse（登録商標））を、本発明の多目的試
薬系（多目的希釈剤）の一つと比較した。試料は実施例
２、３及び４と同様に処理した。結果は表１に示す。
市販のFacsLyse（登録商標）の場合は、検査試料とFa
csLyse（登録商標）との混合物をまず室温暗所で10分間
インキュベートした。その後、得られた混合物を3000g
で５分間遠心分離した。上清を分離し、細胞ペレット
（button）を1mlのリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し
た。該細胞懸濁液を再び3000gで５分間遠心分離した。
その後、細胞ペレットを、１重量％のパラホルムアルデ
ヒドを含むリン酸塩緩衝生理食塩水に再懸濁した。次い
で、FACScan（登録商標）でアッセイを行った。
csLyse（登録商標）との混合物をまず室温暗所で10分間
インキュベートした。その後、得られた混合物を3000g
で５分間遠心分離した。上清を分離し、細胞ペレット
（button）を1mlのリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し
た。該細胞懸濁液を再び3000gで５分間遠心分離した。
その後、細胞ペレットを、１重量％のパラホルムアルデ
ヒドを含むリン酸塩緩衝生理食塩水に再懸濁した。次い
で、FACScan（登録商標）でアッセイを行った。
前記のような手のかかる長時間の赤血球溶解操作と対
照的に、本発明の多目的試薬系（多目的希釈剤）の一つ
を使用した場合は、アッセイ操作全体が約20秒で完了し
た。洗浄ステップは必要なかった。
照的に、本発明の多目的試薬系（多目的希釈剤）の一つ
を使用した場合は、アッセイ操作全体が約20秒で完了し
た。洗浄ステップは必要なかった。
比較データを表１にまとめて示す。この表から明らか
なように、市販の溶解溶液を用いた操作で得られた結
果、及び本発明の多目的試薬系を用いた操作で得られた
結果は、本質的に同等である。
なように、市販の溶解溶液を用いた操作で得られた結
果、及び本発明の多目的試薬系を用いた操作で得られた
結果は、本質的に同等である。
実施例12 白血球分別分析 EDTA凝集防止処理全血試料50μｌを、予め40℃に暖め
た本発明の多目的試薬系1mlと混合し、室温で16秒間イ
ンキュベートした。試薬系は、0.5％w/vの塩化アンモニ
ウムと、0.08容量％のホルムアルデヒドと、0.01％w/v
のサポニンと、0.1％w/vの重炭酸カリウムと、10mMの酢
酸塩緩衝液とを含んでいた。試薬系はpHが約6.2、浸透
圧濃度が225mOsm/lであった。この混合物を38±２℃で1
6秒間インキュベートし、システムの液圧装置を使用せ
ずに光学システムを介してCD3500（登録商標）分析器シ
ステムに直接かけた。試料のサイトグラムは第２図に示
す通りである。
た本発明の多目的試薬系1mlと混合し、室温で16秒間イ
ンキュベートした。試薬系は、0.5％w/vの塩化アンモニ
ウムと、0.08容量％のホルムアルデヒドと、0.01％w/v
のサポニンと、0.1％w/vの重炭酸カリウムと、10mMの酢
酸塩緩衝液とを含んでいた。試薬系はpHが約6.2、浸透
圧濃度が225mOsm/lであった。この混合物を38±２℃で1
6秒間インキュベートし、システムの液圧装置を使用せ
ずに光学システムを介してCD3500（登録商標）分析器シ
ステムに直接かけた。試料のサイトグラムは第２図に示
す通りである。
以上、本発明及びその利点を詳細に説明してきたが、
本明細書に開示する概念及び特定実施態様を、本発明と
同じ目的を達成するための別の系又は試薬の改質又は設
計のベースとして使用し得ることは当業者には明らかで
あろう。また、このような均等の構成が「請求の範囲」
に記載の本発明の精神及び範囲から逸脱するものではな
いことも当業者によって認識されよう。
本明細書に開示する概念及び特定実施態様を、本発明と
同じ目的を達成するための別の系又は試薬の改質又は設
計のベースとして使用し得ることは当業者には明らかで
あろう。また、このような均等の構成が「請求の範囲」
に記載の本発明の精神及び範囲から逸脱するものではな
いことも当業者によって認識されよう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/49 Ｇ０１Ｎ 1/28 Ｘ (56)参考文献 特開 昭56−16872（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−71857（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−502277（ＪＰ，Ａ)
Claims (13)
- 【請求項１】有核血液細胞を決定するために、全血試料
の赤血球を溶解すると同時に白血球を固定するのに適し
た多目的試薬組成物であって、約３〜約7g/lの非第四の
アンモニウム塩と、約0.04〜約0.10容量％の短鎖脂肪族
アルデヒドと、前記脂肪族アルデヒドに対して実質的に
不活性であるという特徴を有し且つ第一アミノ基を含ま
ない約10〜約20mMの非リン酸塩緩衝液と、約10〜約200m
g/lの界面活性剤と、前記多目的試薬組成物を約5.5〜約
7.5のpH及び約160〜約310mOsm/lの浸透圧濃度に維持す
るような水とを含む前記多目的試薬組成物。 - 【請求項２】前記非第四のアンモニウム塩が、塩化アン
モニウム及びフッ化アンモニウムの中から選択したモノ
アンモニウム塩からなる請求項１に記載の多目的試薬組
成物。 - 【請求項３】前記短鎖脂肪族アルデヒドが炭素数１〜４
の脂肪族アルデヒドからなる請求項１に記載の多目的試
薬組成物。 - 【請求項４】前記短鎖脂肪族アルデヒドが、ホルムアル
デヒド及びパラホルムアルデヒドの中から選択したもの
である請求項３に記載の多目的試薬組成物。 - 【請求項５】前記界面活性剤がサポニンからなる請求項
１に記載の多目的試薬組成物。 - 【請求項６】更に、約0.05mg％〜約0.15mg％w/vの核染
料も含む請求項１に記載の多目的試薬組成物。 - 【請求項７】有核血液細胞を決定するために、全血試料
の赤血球を溶解すると同時に白血球を固定するのに適し
た多目的試薬組成物であって、約5g/lの非第四のアンモ
ニウム塩と、約0.075容量％の短鎖脂肪族アルデヒド
と、10mM〜約20mMの酢酸塩緩衝液と、約100mg/lのサポ
ニンと、前記多目的試薬組成物を約6.2〜約6.5のpH範囲
及び約215〜約270mOsm/lの浸透圧濃度に維持するような
水とを含む前記多目的試薬組成物。 - 【請求項８】免疫表現型リンパ球副次集団の決定に有用
な診断キットであって、約10mM〜約20mMの酢酸塩緩衝液
と約0.075容量％のホルムアルデヒドとを含むpH約5.5〜
約7.5の溶液と、前記緩衝溶液100ml当たり約0.5gの塩化
アンモニウムと約0.1gの重炭酸カリウムと約10mgのサポ
ニンとを含む組成物とからなる前記診断キット。 - 【請求項９】有核赤血球の決定に有用な診断キットであ
って、請求項１に記載の多目的試薬組成物と核染料溶液
とからなる前記診断キット。 - 【請求項１０】全血から有核末梢血液細胞を高速で分析
するための方法であって、 全血と多目的試薬組成物とを約１部に対して約16〜約10
0部の範囲までの比率で混合することにより混合物を調
製し、但し前記試薬組成物は、約３〜約7g/lの非第四の
アンモニウム塩と、約0.04〜約0.1容量％の短鎖脂肪族
アルデヒドと、前記脂肪族アルデヒドに対して実質的に
不活性であることを特徴とする約10〜約20mMの非リン酸
塩緩衝液と、前記多目的試薬組成物を約5.5〜約7.5のpH
及び約160〜約310mOsm/lの浸透圧濃度に維持するような
水とを含み、 前記混合物を約25℃〜約46℃の温度で少なくとも約10秒
間インキュベートし、 自動電気光学的血液分析装置で有核末梢血液細胞を決定
する ステップを含む前記方法。 - 【請求項１１】更に、細胞表面マーカーに対する抗体を
全血試料に加えるステップも含む請求項10に記載の方
法。 - 【請求項１２】有核末梢血液細胞の決定が、少なくとも
５種類の白血球の決定からなる請求項10に記載の方法。 - 【請求項１３】有核末梢血液細胞の決定が有核赤血球の
決定からなる請求項10に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2304293A | 1993-02-25 | 1993-02-25 | |
| US023,042 | 1993-02-25 | ||
| US08/023,042 | 1993-02-25 | ||
| PCT/US1994/001306 WO1994018828A1 (en) | 1993-02-25 | 1994-02-03 | Multipurpose reagent system for rapid lysis of whole blood samples |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08507147A JPH08507147A (ja) | 1996-07-30 |
| JP2716267B2 true JP2716267B2 (ja) | 1998-02-18 |
Family
ID=21812791
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6519006A Expired - Fee Related JP2716267B2 (ja) | 1993-02-25 | 1994-02-03 | 全血試料を高速溶解するための多目的試薬系 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5648225A (ja) |
| EP (1) | EP0685994B1 (ja) |
| JP (1) | JP2716267B2 (ja) |
| AU (1) | AU6235994A (ja) |
| CA (1) | CA2156752C (ja) |
| DE (1) | DE69434942T2 (ja) |
| ES (1) | ES2284160T3 (ja) |
| WO (1) | WO1994018828A1 (ja) |
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