JP2001524666A - 赤芽球の識別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 有核の赤血球の識別のための方法が提供される。さらに、適当な電気的測定及び光学的測定により血液標本中の白血球の同時識別のための方法を提供する。この方法は成熟細胞を溶解する試薬系に血液細胞標本をさらし、続いて光学分析により流動セル中の有核の赤血球を分析することを含む。有核の血液細胞と白血球の同時識別は、電気的及び光学的分析を用いて実施し得る。電気的及び光学的分析は光散乱測定及びインピーダンス測定を含む。この方法は有核の赤血球の同定のための核染色剤の使用を排除する。本発明の方法は、最初に、蛍光を用いることのない有核の赤血球の識別及び数え上げを報告する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の属する技術分野 本発明は有核の（ｎｕｃｌｅａｔｅｄ）赤血球の識別のための方法に関する。
さらにこの方法は適切な電気的測定及び光学的測定により血液細胞標本における
白血球の同時識別方法を提供する。

【０００２】 発明の背景 正常な末梢血液は、核及び細網のない成熟赤血球を含有する。有核の赤血球（
ＮＲＢＣ）、または赤芽球は未成熟赤血球である。それらは通常骨髄に生じるが
、末梢血液には生じない。しかしながら、特定の病気、たとえば、貧血及び白血
病においては、ＮＲＢＣは末梢血液にも生じる。したがって、ＮＲＢＣを測定す
ることは臨床的に重要である。伝統的にＮＲＢＣの識別と数え上げは手動で実施
されている。その工程は、顕微鏡のスライド上の血液標本の塗り付け及びスライ
ドの染色に続いて、個々のスライドの手動の目視による分析を含む。ＮＲＢＣの
濃度は１００白血球当りのＮＲＢＣの数として報告される。通常、２００の白血
球及び血液塗抹標本上の同じ領域に存在するＮＲＢＣの数を数え、その数を２で
割って、ＮＲＢＣ濃度を１００白血球当りのＮＲＢＣの数として表わす。このア
プローチは非常に時間がかかると同時に個人のスライドの分析の解釈に対して主
観的である。

【０００３】 最近、いくつかの蛍光フローサイトメトリー法がＮＲＢＣの識別のために開発
された。これらの方法は、電気的または光学的性質に基づいてＮＲＢＣを識別す
ることは容易でないという理由で、ＮＲＢＣを他の細胞集団から識別するのに特
異的核染色技術を用いる。 米国特許第５，２９８，４２６号(Inami他に対する）は、ＮＲＢＣを識別する
ための蛍光方法を開示している。この方法は、酸性の低血圧の蛍光染料溶液であ
る第１流体及び第１流体のオスモル濃度及びpHを変える第２流体を用いる２工程
染色を用いる。イナミ(Inami）他は、第１流体は、有核の赤血球中に拡散して、
その核を特異的に染色する赤芽球染色染料を含有し、次いで、２次元プロットで
ＮＲＢＣの群を他の細胞群から分離して、それによりＮＲＢＣ識別の結果をコン
ピュータ化することを教示している。同時に白血球の亜集団を識別するために、
第１流体は、２つの追加の蛍光染料、すなわち、好酸球／好塩基球染色染料及び
白血球染色染料もこれらの細胞型の特異的染色のために含有する。

【０００４】 米国特許第５，５５９，０３７号(Kim他に対する）は、ＮＲＢＣ及び白血球の
フローサイトメトリー分析方法を開示する。この方法は、全血標本から赤血球及
びＮＲＢＣ細胞質を溶解して、ＮＲＢＣの核を生体核染色剤にさらすこと及び白
血球への生体核染色剤の浸透を最小限にすること並びに蛍光及び２つの角度の光
散乱を測定することによる標本の分析を含む。この方法は、デブリ（蛍光性及び
非蛍光性の）からのシグナルを阻止し、ＡＬＬトリガーの下であるが、ＮＲＢＣ
として蛍光トリガー（ＦＬ３）の上に落ちるシグナルを同定する三重トリガー方
法を特色とする。ＡＬＬは光の光軸損失または入射光から０°で検出された光散
乱シグナルである。したがって、１次元より大きい予備ゲーティングシグナルが
ＮＲＢＣ集団の同定のためのこの方法に必要となる。白血球も有核の細胞である
から、これらの細胞の染色は、蛍光測定への干渉を回避するために防止すること
が必要である。白血球膜の維持及び核染色剤の白血球への浸透を最小限にするこ
とは、赤血球の溶解の間に脂肪族アルデヒドで白血球を同時に固定することによ
り達成される。アルデヒド同定剤は危険な化学薬品として知られている。さらに
、この方法はＮＲＢＣと白血球の識別を得るために試薬を４２℃まで加熱する必
要がある。

【０００５】 上記方法は蛍光フローサイトメトリーによりＮＲＢＣと白血球を識別及び数え
上げることができる。しかしながら、蛍光測定は複雑で高価な検出方法である。 最近の自動血液分析機、たとえば、Ａｂｂｏｔｔ Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商
標）３５００、ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＳＴＫＳ（登録商標）、Ｔｅｃｈｎ
ｉｃｏｎ Ｈ^* １（登録商標）及びＴＯＡ Ｓｙｓｍａｘ（商標）ＮＥ−８００
０は、機器がヒストグラムの赤血球デブリ領域の近くに増加量のシグナルを感じ
た時、分析血液標本中に、ＮＲＢＣの存在の可能性をＮＲＢＣのフラッグ付け（
ｆｌａｇｇｉｎｇ）だけできる。しかしながら、このような技術は、多くの他の
血液の異常性が同じ領域に、増大したシグナル、たとえば血小板のかたまり及び
鎌状赤血球並びに不十分な溶解化血液標本からの赤血球デブリを引き起こすから
、しばしば、誤った陽性のフラッグ付けを生じさせる。これらの方法ではＮＲＢ
Ｃは同定されない。代りに、ヒストグラムまたは点プロットにおける、単なる共
通のＮＲＢＣ標本分布パターンが、上記他の原因により生じた同様のパターンと
容易に混同し得る機器により認識される。誤った陽性のフラッグを包含する、フ
ラッグを付された標本について、手動方法による再検査が臨床試験所で必要にな
る。標本を含有するＮＲＢＣについての他の問題は、血液分析機により報告され
た白血球の総数（ＷＢＣ）は、ＮＲＢＣは白血球と誤同定されることによりＷＢ
Ｃを上昇させることができるだろうから、これらの標本について正確でないこと
である。他方、全血標本からの白血球集団の分析は、病理学の多様性に関する診
断手順の必須の部分である。自動化方法で白血球の主要な亜集団を分析する能力
は、単一血液標本の急速診断及び多くの標本の同時の急速処理のために必須であ
る。

【０００６】 米国特許第５，１５５，０４４号（Ｌｅｄｉｓ他に対する）は全血標本からの
白血球の単離及び分析方法を開示し、それは、自動血液分析機で一工程測定にお
いて白血球を５つの亜集団に識別することを可能にする。この検出技術は、同時
光散乱測定と、ＤＣ（直流）及びＲＦ（高周波）の両方におけるインピーダンス
測定を含む。この方法は単純で速いが、ＮＲＢＣの識別を提供できない。

【０００７】 米国特許第５，３８４，５４９号(Hamaguchi他に対する）は、複雑な手順によ
り白血球を５つの亜集団に識別する溶解剤系及び方法を記載している。この方法
は３つの溶解試薬、３つの分離標本調製物並びに、リンパ球集団及び単球集団に
加えて、好酸球集団、好中球集団、好塩基球集団の同一性の測定を必要とする。
ハマグチ他は、溶解試薬系及びＤＣ対ＲＦ検出方法を用いる、単に異常な白血球
集団と有核赤血球の観察を記載している。しかしながら、この方法はいくつかの
異常な細胞型の存在を観察するだけで、ＮＲＢＣを識別または数え上げることが
できない。

【０００８】 米国特許第５，６８６，３０８号（Li他に対する）は、自動化血液分析機で一
工程で白血球を５つの亜集団に識別するための溶解化試薬系及び方法を記載して
いる。溶解試薬は、エトキシル化長鎖アミン化合物及び溶解試薬のpHを２．０〜
３．６の範囲内に調整するための酸を含む溶解試薬及び高張アルカリ性安定化剤
を含む。この特許は白血球亜集団の識別のための試薬及び方法を教示するが、有
核赤血球の識別を教示しない。

【０００９】 先の記載に基づいて、ＮＲＢＣを識別及び数え上げるための簡単で費用の少な
い方法についての必要性がある。 発明の概要 本発明の一つの目的は、蛍光または核染色剤を用いずに自動化血液分析機で有
核赤血球の識別を可能とする方法を提供することである。この方法は、血液細胞
標本を成熟赤血球を溶解する試薬系にさらし、光散乱測定により流動セル中の前
記標本を分析して有核赤血球を識別し、前記血液細胞標本中の有核赤血球を報告
することを含む。

【００１０】 本発明の他の目的は有核赤血球と白血球の同時識別を可能とする方法を提供す
ることである。この方法は、白血球を損傷することなく成熟赤血球を溶解する試
薬系に血液細胞標本をさらし、ＤＣ測定及び光散乱測定により流動セル中の標本
を分析して有核赤血球及び白血球亜集団を識別し、そして、血液細胞標本中のＮ
ＲＢＣ及び白血球亜集団を報告することを含む。

【００１１】 後の発明の好ましい態様の詳細な説明からよりよく分かるように、本発明は、
核染色及び複雑な蛍光検出方法を用いることなく、光散乱を用いて有核赤血球の
識別を与える点で従来の技術に比較して特に有益である。本発明の追加の特徴は
、標本調製物の加熱を必要とせず、室温で最適に働くことである。本発明は後の
好ましい態様の記載からよりよく理解されるだろう。

【００１２】 好ましい態様の詳細な説明 本発明はＮＲＢＣの識別のための方法に関する。さらに、本方法は血液細胞標
本中の白血球の同時識別を提供する。 第１の態様では、本発明は、血液細胞標本を成熟赤血球を溶解する試薬系にさ
らし、続いて、光散乱を用いて流動セル中で前記標本混合物を分析して、ＮＲＢ
Ｃを識別し、前記血液細胞標本中のＮＲＢＣを報告することを含む。

【００１３】 本発明のために適当な１つの試薬系は、一般式：

【００１４】

【化１】 （式中、Ｒは１２〜２２の炭素原子を有するアルキル、アルケニルまたはアルキ
ニル基であり、ｍ及びｎは各々１以上であり、ｍ＋ｎは２０〜４０の間である）
で表わされるエトキシル化長鎖アミン化合物及び溶解試薬のpHを２．０〜３．６
の範囲内に調整するための酸を含む溶解試薬並びに高張アルカリ性安定化試薬を
含む。

【００１５】 任意に、赤血球デブリを減らすのに有効な量で１以上の溶解化剤を溶解試薬に
包含させることができる。典型的には溶解化剤はポリオキシエチレン及びポリオ
キシプロピレンコポリマー並びに１６以上のＨＬＢを有するエトキシル化アルコ
ールである。適当なコポリマーはＰｌｕｒｏｎｉｃコポリマー（ＢＡＳＦコーポ
レイション、ニュージャージー州、パーシッパニー）、たとえばＰｌｕｒｏｎｉ
ｃ Ｆ３８及びＰｌｕｒｏｎｉｃ ２５Ｒ８を含むが、これらに限定されない。
適当なエトキシル化アルコールはＰｌｕｒａｆａｃ Ａ３８（ＢＡＳＦ）及びＨ
ｅｔｏｘｏｌ ＳＴＡ３０(Heterene, Inc. ニュージャージー州、パタソン）を
含むが、これらに限定されない。

【００１６】 さらなる任意の添加剤を、溶解試薬中に、それらの存在が溶解試薬組成物中の
主要機能性成分と相溶性である濃度で含ませることもできる。これらの添加剤の
中では、組成物の棚寿命を増加するための、酸化防止性を有する保存剤、及び抗
微生物性を有する保存剤である。抗酸化性を有する保存剤はＥＤＴＡ及びブチル
メチルフェノールを含むが、これらに限定されない。抗微生物活性を有する保存
剤は、ジメチロールジメチルヒダントイン、ヨードプロピニルブチルカーバメー
ト及びイソチオゾロン誘導体を含むが、これらに限定されない。

【００１７】 本発明の方法に用いることができる他の試薬系は米国特許第５，１５５，０４
４号に開示されている。この試薬系は、赤血球を選択的に溶解するために低張酸
溶解を利用し、続いて、溶解化活性を遅延し、示差分析のために白血球を保護す
るために、急冷（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）溶液を加える。 ＮＲＢＣの識別分析は光散乱測定を用いて外筒流体を用いる流動セル中で実施
する。粒子、たとえば血液細胞が流動セルの開口を通過する時、レーザービーム
からの入射光を全方向に散乱させる。光散乱シグナルを０〜１８０°の間の入射
光に呼応する種々の角度で光検出器により検出できる。各細胞集団は大きいか小
さいかのいずれかで異なった光散乱特性を有し、異なった細胞集団の識別のため
に利用し得ることが分かった。入射光から１０°未満で検出される光散乱シグナ
ルは一般に低角度光散乱と呼ばれる。低角度光散乱の特徴は、細胞のサイズ並び
に細胞の量により影響を受ける。

【００１８】 流動セルを通過する粒子または細胞からの光散乱シグナルを本発明の目的のた
めに用いる。好ましくは、２つの角度の光散乱シグナルをＮＲＢＣの識別に用い
る。より好ましくは、光散乱の両方の角度は１０°未満である。第１の角度のよ
り好ましい範囲は約０°〜約４°である。第２の角度のより好ましい範囲は約３
°〜約７°である。

【００１９】 図１は、例Ｉに記載された手順に従って処理し、分析された１４ＮＲＢＣ／１
００ＷＢＣを含有する、臨床的全血標本のＬＳ１（１°〜３°）対ＬＳ２（４°
〜６°）の散布図を示す。この散布図では、ＮＲＢＣは、ＮＲＢＣの下に記され
、赤血球デブリから明確に識別され、かつ白血球（この散布図の範囲の外にある
）から明確に識別されるクラスターを形成する。ＤＣのスケールでは、図１に記
載されたＮＲＢＣ集団は、通常は図２で示されるようなデブリ領域と考えられる
領域中でリンパ球の下にある。

【００２０】 図４Ａは、図１と同一のスケールにおける、ＬＳ１対ＬＳ２散布図を示し、そ
れは、例IVに記載された手順に従って処理及び分析された正常な新鮮な全血標本
から得られる。すぐに分かるように、正常な末梢血はＮＲＢＣを持たないから、
ＮＲＢＣの現れる（図１に示すような）領域にはクラスターが存在しない。同じ
標本を室温（約２３℃）に約３０時間保持し、次いで同じ手順を用いて再び処理
及び分析した。図４Ｂはその得られた散布図を示す。散布図のＮＲＢＣ領域には
クラスターが見つからない。これは、本発明の方法は、標本が古くなった時です
ら、正常な血液標本に対して、誤りの陽性の結果を報告する危険が少ないことを
示している。

【００２１】 古い血液標本がＮＲＢＣの検出を妨げないことは非常に重要である。古い血液
標本中の血球は溶解条件に対してよりこわれやすく、より敏感である。古い血液
標本を溶解試薬にさらすと、いくつかの白血球の細胞質または細胞膜も破壊され
る。部分的にさらされた白血球の核も蛍光方法がＮＲＢＣの分析のために用いら
れる時、核染色により染色されるだろう。それらの蛍光シグナルも検出されるだ
ろう。ＮＲＢＣ及び染色された白血球からのシグナルは、通常互いに重なる。し
たがって、蛍光方法を用いて、古い血液標本中の他の細胞型からＮＲＢＣを識別
するのはもっと難しい。本発明の方法でもって、こわれやすい白血球はＮＲＢＣ
クラスターの中に侵入または重ならない。だから、本発明は古い血液標本中のＮ
ＲＢＣを検出するのに有利であることは容易に明らかである。

【００２２】 図５は、例Ｖに記載された本発明の方法を用いて分析された５％の網状赤血球
を含有する臨床標本から得られた散布図である。散布図はＮＲＢＣの左にさらに
クラスターを示し、それは網状赤血球に相当する。網状赤血球は、核を含有しな
いが、ＲＮＡを含有する他の型の未成熟赤血球である。ＮＲＢＣと異なり、網状
赤血球は骨髄及び末梢血液の両方に出現する。特定の病気、たとえば、溶血性貧
血、サラセミア及び鉄芽球貧血においては、増加した網状赤血球が生ずる。ＮＲ
ＢＣを染色するために用いられるほとんどの核染色剤は網状赤血球においてＲＮ
Ａも染色する。網状赤血球の染色はＮＲＢＣ蛍光シグナルと重なる蛍光シグナル
を生ずる。したがって、網状赤血球についての特別の補正が行なわれないなら、
蛍光方法を用いるＮＲＢＣの結果は誤りであろう。

【００２３】 図６は、ＮＲＢＣと網状赤血球の両方を含有する臨床的標本の散布図を示す。
標本は例Ｖと同じ手順を用いて分析された。ＮＲＢＣの報告は手動の参考の結果
と矛盾しない。したがって、網状赤血球の存在は本発明の方法を用いるＮＲＢＣ
の測定を妨げない。 低角度光散乱（ＬＳ１及びＬＳ２）によるＮＲＢＣの識別は容易で、かつ、簡
単である。それは他の細胞からＮＲＢＣを識別するのに通例の２次元点プロット
または散布図を用いる。以前の方法では、ＮＲＢＣシグナルは、赤血球デブリ及
び他の細胞型、たとえば、白血球及び網状赤血球からのシグナルと１以上の次元
で重なるから、従来技術の方法は、ＮＲＢＣ集団を同定するための検出された蛍
光及び光散乱シグナルの予備ゲーティングまたは多ゲーティングを必要とする。
本方法は検出されたシグナルの予備ゲーティングまたは編集の必要がない。なぜ
なら、ＮＲＢＣは２次元検出方法により、赤血球デブリを含む他の細胞型から分
離されるからである。

【００２４】 ＬＳ１におけるＮＲＢＣの上の細胞集団は総白血球（ＷＢＣ）として数えられ
る。さらに他の方法は総白血球（ＷＢＣ）を決定するのに用いられる。ＤＣ検出
装置も用いられるなら、リンパ球の最小ＤＣ容積より上の細胞集団は総白血球と
して数えることができる。これらの方法の両方で得られたＷＢＣはＮＲＢＣの干
渉がなく、補正されたＷＢＣと等しく、それは、通例の商業的な血液計算器によ
り産出されたＷＢＣから手動のＮＲＢＣ総数を引き去ることにより生じる。

【００２５】 分析した標本のＮＲＢＣ濃度は、同定されたＮＲＢＣクラスター（図１）中に
数えた細胞の数を数えた総白血球（ＷＢＣ）により割り、そして、その商に１０
０を掛けることにより計算できる。ＮＲＢＣ濃度はＮＲＢＣ／１００ＷＢＣの数
として報告することができ、それは、手動の報告単位と同じであるか、または１
μｌの全血に対する絶対ＮＲＢＣとして報告することができる。

【００２６】 本発明の第２の態様では、白血球の識別分析はＮＲＢＣの識別といっしょに実
施できる。識別分析は同じ試薬系及び１つの標本調製物を用いて、電気的及び光
学的分析を用いて１工程で実施できる。電気的及び光学的分析は光散乱測定及び
インピーダンス測定を含む。自動血液分析機による白血球分析に用いられるＤＣ
インピーダンス測定装置は当業者に知られており、一般にRodriguez 他に対する
米国特許第５，１２５，７３７号に記載されており、その全体を参照により本明
細書に組み入れる。ＮＲＢＣ及び白血球の識別分析のために、流動セルを通過す
る粒子または細胞からの低及び中角度光散乱シグナルを検出可能な光散乱検出器
が用いられる。

【００２７】 図１においては、白血球はＬＳ１対ＬＳ２散布図の範囲外にあり、この図には
示されていない。しかしながら、白血球の識別及びＮＲＢＣの識別のための標本
分析を一工程測定で実施できる。両方の識別のためのデータ分析は、一工程の測
定から得られた異なったパラメータを用いて同時に実施できる。 図２は、例II（例Ｉで用いられたのと同じ試薬及び手順）にしたがって処理さ
れた新鮮な正常全血標本から得られたＤＣ対ＬＳ３（中角度散乱、約２４°〜約
３５°）散布図である。図２は白血球亜集団である、リンパ球、単球、好中球及
び好酸球の４つの別個のクラスターを示す。標本を一つの標本調製物において処
理し、ＮＲＢＣの識別と同時に分析した。ＤＣ対ＬＳ３散布図においては、リン
パ球集団の最小ＤＣ容積より上のすべての細胞集団を総白血球（ＷＢＣ）として
数え、それは、ＬＳ１対ＬＳ２散布図におけるＮＲＢＣクラスターより上の集団
に等しい。

【００２８】 本発明の方法は、初めて、核染色及び蛍光を用いずに有核赤血球の識別及び数
え上げを報告する。核染色の除去は、染料汚染のために、器械及び流体系維持の
減少、試薬持ち越しに対する系の感度の減少及び高価な蛍光染料による試薬のコ
ストの減少における利点を提供する。本発明の方法は、速く、確かで自動化血液
分析に適当である。さらに、この検出技術は蛍光方法に比較して複雑でなく、高
価でない。

【００２９】 本発明の方法は完全に室温、すなわち、１８〜２８℃で操作するという利点を
も提供する。従来技術の方法は白血球亜集団またはＮＲＢＣの識別のために上昇
した温度で操作する。この上昇温度の必要性は、反応を自動温度調節しなければ
ならないから、著るしくより複雑である分析機械の使用を必要とする。本発明は
室温で最適に操作することにより自動温度調節のためのこの必要性を克服する。

【００３０】 本発明の他の有利な特徴は、他の流体標本、たとえば、非ヒト種の骨髄及び血
液標本の識別分析のためのその利用性である。例VIは本方法の家畜の標本ＮＲＢ
Ｃ分析における適用についての例を提供する。 本発明の方法は、さらに次の例を参照することにより理解できる。しかしなが
ら、本発明が記載された例に限定されないことが分かるだろう。

【００３１】 例Ｉ ２８μｌのＥＤＴＡ−抗凝固化臨床全血標本に対して、０．１８％のギ酸、２
％の式：

【００３２】

【化２】 （式中、Ｒはステアリルで、ｍ＋ｎは２７に等しい）で表わされるエトキシル化
長鎖アミン、溶解化剤としての１．４％のＰｌｕｒａｆａｃ Ａ３８及び保存剤
を含む、４１７μｌの溶解試薬を加え、血液分析機の混合室で約４秒間混合した
。次いで、１．４％のＮａＣｌ、３．２％のＮａ₂ ＳＯ₄ 及び０．６６％のＮａ ₂ ＣＯ₃ を含み、pH１１．０である、１８０μｌの安定化試薬を加えて、混合し
、溶解反応を遅延させた。

【００３３】 安定化試薬の添加１０秒後、標本混合物を外筒流体であるＩＳＯＴＯＮ（登録
商標）III 希釈剤（フロリダ州、マイアミのCoulter Corporation の製品) を有
する流動セルに、ＤＣ及び光散乱検出器を装備した血液分析機でのＮＲＢＣ及び
白血球の識別分析のために供給した。光散乱検出器は、いくつかの範囲の角度、
すなわち、約１°〜約３°（ＬＳ１）、約４°〜約６°（ＬＳ２）、約２４°〜
約３５°（ＬＳ３）及びさらに高い角度で、流動セルを通過する細胞からの光散
乱シグナルを検出する。

【００３４】 得られる散布図を図１に示す。図１は、ＬＳ１対ＬＳ２散布図において、赤血
球デブリ（下）及び白血球（上、しかし、この散布図の範囲の外）から識別され
たＮＲＢＣのクラスターを示す。 分析された標本のＮＲＢＣ濃度は、同定されたＮＲＢＣクラスターにおいて数
えた細胞の数（図１）を数えた総白血球（ＷＢＣ）で割り、その商に１００を掛
けることにより計算する。ＮＲＢＣ濃度はＮＲＢＣ／１００ＷＢＣの数として報
告され、それは手動の報告単位と同じである。この標本について、手動の参考方
法及び上記方法の両方が１４ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣを報告した。

【００３５】 例II 新鮮な正常な全血標本を例Ｉの記載と同じ試薬及び手順を用いて分析した。標
本混合物を、白血球の識別及びＮＲＢＣの識別のための例Ｉで用いたのと同じ血
液分析機の流動セルで同時に分析した。図２は得られたＤＣ対ＬＳ３散布図であ
り、それは白血球亜集団、すなわち、リンパ球、単球、好中球及び好酸球の４つ
の別個のクラスターを示す。

【００３６】 例III ２８μｌのＥＤＴＡ−抗凝固化臨床全血試料に対して、０．１２％のギ酸及び
０．０７％のサポニンからなる４４９μｌの溶解試薬を加え、血液分析機の混合
室中で約５秒間混合した。次いで１７７μｌの例Ｉに記載されたのと同じ安定化
試薬を加えて、混合し、溶解反応を阻止した。

【００３７】 安定化剤の添加の約８秒後、標本混合物を外筒流体であるＩＳＯＴＯＮ（登録
商標）III 希釈剤を有する流動セルに、例Ｉに記載したのと同じ血液分析機での
ＮＲＢＣ及び白血球識別分析のために供給した。図３は得られたＬＳ１対ＬＳ２
散布図（図１と同じスケールの）で、それはＮＲＢＣクラスターが他の細胞型か
ら分離されていることを示す。

【００３８】 例IV 例Ｉに記載した試薬及び手順を新鮮な正常全血標本の分析に用いた。標本を室
温（約２３℃）で約３０時間保持し、次いで、再び処理及び分析した。得られた
散布図は新鮮な血液について図４Ａで、古い血液について図４Ｂに示す。図４Ａ
では、正常な末梢血液はＮＲＢＣを含有しないから、ＮＲＢＣの出現する領域に
クラスターは存在しない。図４ＢのＮＲＢＣ領域にもクラスターは見つからない
。この例は、本発明の方法は、たとえ正常な血液標本が古くなった時ですら、正
常な血液標本に誤った陽性の結果を報告する危険が少ないことを示す。

【００３９】 例Ｖ 例Ｉに記載した手順及び試薬を網状赤血球を含有する血液標本の分析に用いた
（手動の参考により５％と報告された）。図５は得られたＬＳ１対ＬＳ２散布図
である。それはＮＲＢＣの左に追加のクラスターを示し、それが網状赤血球に相
当する。図６は同じ手順を用いて、ＮＲＢＣと網状赤血球の両方を含有する臨床
標本から得られた散布図を示す。ＮＲＢＣの報告は手動の参考結果と一致し、本
発明の方法からの１７ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣに対し、手動の参考からの１６Ｎ
ＲＢＣ／１００ＷＢＣであった。

【００４０】 例VI ４μｌのアリゲーターの血液と４．１５mlの例Ｉの溶解試薬とを試験管中で手
動で約４秒間混合した。１．８mlの例Ｉの安定化試薬を加え、標本混合物を手動
で混合し、例Ｉに記載した血液分析機に導入した。図７は、得られたＬＳ１対Ｌ
Ｓ２散布図である。明らかなようにＮＲＢＣははっきりとしたクラスターを形成
した。

【００４１】 例VII ８４の臨床標本を包含する全部で１３０の全血を、本発明の方法及び例Ｉの溶
解試薬を用いて分析した。これらの標本のＮＲＢＣも参考の手動の方法を用いて
数えた。手動のＮＲＢＣ総数について、ライト染色剤で染色した各患者の血液塗
沫標本について２００ＷＢＣを数え、ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣを報告するために
、同じ領域に存在するＮＲＢＣの数を数え、２で割った。図８は手動の参考方法
と本発明の方法との相関を示す。相関係数は０．９７４で傾斜は０．９０で、イ
ンターセプトは１．７１である。

【００４２】 本発明を特に好ましい態様に関連して記載してきた。しかしながら、種々の変
更を本発明の精神を離れることなくなすことができ、そのような変更は添付の請
求の範囲内に入ることを意図することは明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 例Ｉに記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。

【図２】 例IIに記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。

【図３】 例III に記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。

【図４】 例IVに記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。

【図５】 例Ｖに記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。

【図６】 例Ｖに記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。

【図７】 例VIに記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。

【図８】 手動の参考の方法により得られた結果と、例VII に記載の本発明の方法により
得られた結果の相関を示すカーブである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リー，ジン アメリカ合衆国，フロリダ 33176，マイ アミ，ジー４，サウスウエスト 141 ス トリート 8701 (72)発明者 ヤング，キャロル アメリカ合衆国，フロリダ 33176，マイ アミ，サウスウエスト 195 テラス 9801 Ｆターム(参考） 2G045 AA03 BB39 CA25 FA37 GA10 JA01

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 有核の赤血球を識別する方法であって、 （ａ）血液細胞標本を、成熟赤血球を溶解する試薬系にさらし、 （ｂ）流動セル中の前記標本を光散乱測定により分析して、有核の赤血球を識別
   し、そして、 （ｃ）前記血液細胞標本中の有核の赤血球を報告することを含む方法。
2. 【請求項２】 前記光散乱測定を２つの角度の光散乱シグナルを用いて実施
   する請求項１の方法。
3. 【請求項３】 前記光散乱測定を１０°未満で検出される低角度光散乱シグ
   ナルを用いて実施する請求項１の方法。
4. 【請求項４】 前記２つの角度の光散乱シグナルが１０°未満で検出される
   低角度光散乱シグナルである請求項２の方法。
5. 【請求項５】 １つの低角度光散乱シグナルの範囲が約０°〜約４°である
   請求項４の方法。
6. 【請求項６】 他の低角度光散乱シグナルの範囲が約３°〜約７°である請
   求項４の方法。
7. 【請求項７】 前記有核の赤血球の報告が、１００個の白血球当りの有核の
   赤血球の数によるか、あるいは単位容積の血液細胞標本当りの有核の赤血球の絶
   対数による請求項１の方法。
8. 【請求項８】 前記血液細胞標本が、ヒトの末梢血液、非ヒトの末梢血液、
   ヒトの骨髄、非ヒトの骨髄から選択される請求項１の方法。
9. 【請求項９】 有核の赤血球と白血球とを識別する方法であって、 （ａ）血液細胞標本を、白血球を損傷せずに、成熟赤血球を溶解する試薬系にさ
   らし、 （ｂ）ＤＣ測定及び光散乱測定により流動セル中の前記標本を分析して、有核の
   赤血球及び白血球亜集団を識別し、そして、 （ｃ）前記血液細胞標本中の有核の赤血球及び白血球亜集団を報告することを含
   む方法。
10. 【請求項１０】 前記有核の赤血球を識別するための光散乱測定を２つの角
    度の光散乱シグナルを用いて実施する請求項９の方法。
11. 【請求項１１】 前記有核の赤血球を識別するための光散乱測定を１０°未
    満で検出される低角度光散乱シグナルを用いて実施する請求項９の方法。
12. 【請求項１２】 前記２つの角度の光散乱シグナルが１０°未満で検出され
    る低角度光散乱シグナルである請求項１０の方法。
13. 【請求項１３】 １つの低角度光散乱シグナルの範囲が約０°〜約４°であ
    る請求項１２の方法。
14. 【請求項１４】 他の低角度光散乱シグナルの範囲が約３°〜約７°である
    請求項１２の方法。
15. 【請求項１５】 前記白血球亜集団が、リンパ球、単球、好中球及び好酸球
    である請求項９の方法。
16. 【請求項１６】 前記白血球集団の報告が単位容積の前記血液標本当りの絶
    対総数または前記血液標本中の総白血球の％による請求項９の方法。
17. 【請求項１７】 前記有核の赤血球の報告が１００個の白血球当りの有核の
    赤血球の数によるか、あるいは単位容積の血液細胞標本当りの有核の赤血球の絶
    対数による請求項９の方法。
18. 【請求項１８】 前記血液細胞標本がヒトの末梢血液、非ヒトの末梢血液、
    ヒトの骨髄、非ヒトの骨髄から選択される請求項９の方法。