DE69806802T2

DE69806802T2 - Verfahren zur unterscheidung von erythroblasten

Info

Publication number: DE69806802T2
Application number: DE69806802T
Authority: DE
Inventors: Jing Li; Yi Li; Carole Young
Original assignee: Coulter International Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1997-11-21
Filing date: 1998-11-13
Publication date: 2003-02-27
Anticipated expiration: 2018-11-14
Also published as: EP1032818B1; JP2001524666A; US5874310A; JP4366478B2; DE69806802D1; EP1032818A1; WO1999027347A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unterscheidung kernhaltiger Erythrozytenvorläuferzellen. Außerdem sorgt das Verfahren für die gleichzeitige Unterscheidung von Leukozyten in einer Blutzellprobe durch geeignete elektronische und optische Messungen.

Hintergrund der Erfindung

Normales peripheres Blut enthält reife Erythrozyten, die kern- und retikulumfrei sind. Kernhaltige Erythrozytenvorläuferzellen (NRBCs) oder Erythroblasten sind unreife Erythrozyten. Sie kommen normalerweise im Knochenmark vor, aber nicht im peripheren Blut. Bei bestimmten Erkrankungen wie Anämie und Leukämie treten NRBCs jedoch auch im peripheren Blut auf. Deshalb ist es von klinischer Bedeutung NRBC zu messen. Traditionell werden die Unterscheidung und Zählung von NRBC manuell vorgenommen. Diese Vorgehensweise umfaßt das Ausstreichen einer Blutprobe auf einem Objektträger und das Anfärben des Trägers, gefolgt durch manuelle visuelle Analyse des einzelnen Objektträgers. Die NRBC- Konzentration wird als Anzahl der NRBCs pro 100 Leukozyten angegeben. Normalerweise werden 200 Leukozyten und die Zahl an NRBCs, die im selben Bereich auf einem Blutausstrich vorhanden sind, gezählt und die Zahlen durch 2 geteilt, um die NRBC-Konzentration als Zahl der NRBCs/100 Leukozyten auszudrücken. Dieser Ansatz ist äußerst zeitaufwendig und hinsichtlich der Interpretation der einzelnen Analyse des Objektträgers subjektiv.
In den letzten Jahren sind geeignete Fluoreszenz-Durchflußzytometrie-Verfahren zur Unterscheidung von NRBCs entwickelt worden. Diese Verfahren nutzen spezielle Kernfärbetechniken, um NRBCs von anderen Zelipopulationen zu unterscheiden, weil es nicht leicht ist, NRBCs auf Grundlage ihrer elektronischen und optischen Eigenschaften zu unterscheiden.
US-Patent Nr. 5.298.426 (Inami et al.) offenbart ein Fluoreszenzverfahren zur Unterscheidung von NRBCs. Das Verfahren nutzt eine zweistufige Anfärbung unter Verwendung eines ersten Fluids, das eine saure antihypertonische Fluoreszenzfarbstofflösung ist, und ein zweites Fluorid, das die Osmolalität und den pH des ersten Fluids ändert. Inami et al. lehren, daß das erste Fluid einen erytroblastfärbenden Farbstoff enthält, der in die kernhaltigen Erythrozytenvorläuferzellen diffundiert, um deren Kerne anzufärben, und dann wird eine Gruppe von NRBCs von anderen Zellgruppen auf einem zweidimensionalen Diagramm getrennt, mit dessen Hilfe die Ergebnisse der NRBC-Unterscheidung berechnet werden. Um gleichzeitig Leukozytsubpopulationen zu unterscheiden, enthält das erste Fluid zwei zusätzliche Fluoreszenzfarbstoffe, d. h. einen eosinophil/basophil-färbenden Farbstoff und einen leukozyten-färbenden Farbstoff zur spezifischen Färbung dieser Zelltypen.
US-Patent Nr. 5.559.037 (Kim et al.) offenbart ein Verfahren zur durchflußzytometrischen Analyse von NRBCs und Leukozyten. Das Verfahren umfaßt die Lyse von Erythrozyten und NRBC-Zytoplasma aus einer Vollblutprobe, um die NRBC-Kerne einer Vitalkernfärbung auszusetzen, wobei die Permeation der Vitalkernfärbung in die Leukozyten minimiert und die Probe durch Messen von Fluoreszenz und zwei Lichtstreuungswinkeln analysiert wird. Dieses Verfahren ist durch ein dreifaches Triggerverfahren gekennzeichnet, daß die Signale von Bruchstücken (fluorszierend oder nicht-fluoreszierend) blockiert und die Signale identifiziert, die unter den ALL- Trigger, aber über den Fluorszenztrigger (FL3) liegen wie NRBCs. ALL ist der axiale Lichtverlust oder die Lichtstreuungssignale, die bei 0º von dem einfallenden Licht detektiert werden. Deshalb sind Vorauftastsignale ("pre-gating signals") in mehr als einer Dimension bei diesem Verfahren zur Identifizierung von NRBC- Populationen erforderlich. Da Leukozyten auch kernhaltige Zellen sind, ist das Anfärben dieser Zellen notwendig, um eine Störung der Fluoreszenzmessung zu vermeiden. Die Konservierung der Leukozytmembran und die Minimierung der Permeation der Kernfärbung in die Leukozyten wird erreicht, in dem die Leukozyten gleichzeitig mit aliphatischen Aldehyden während der Lyse der Erythrozyten fixiert werden. Die Aldehydfixierungsmittel sind als gefährliche Chemikalien bekannt. Außerdem erfordert das Verfahren die Erwärmung des Reagens auf 42ºC, um die NRBC- und Leukozyt-Unterscheidung zu erreichen.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren können NRBCs und Leukozyten durch Fluoreszenzdurchflußzytometrie unterscheiden und zählen. Jedoch ist die Fluoreszenzmessung ein komplexes und teueres Nachweisverfahren.
Aktuelle Hämatologie-Analyseautomaten wie Abbott Cell-Dyn® 3500, COULTER® STKS®, Technicon H·1® und TOA Sysmex NE-8000 können nur NRBC- Markierung für das mögliche Vorhandensein von NRBCs in einer analysierten Blutprobe liefern, wenn die Instrumente eine erhöhte Menge von Signalen in der Nähe der Erythrozyten-Bruchstückbereich eines Histogramms aufspüren. Jedoch erzeugen derartige Techniken häufig falsche positive Signale, weil viele andere Blut-Anormalitäten erhöhte Signale im selben Bereich verursachen können, wie beispielsweise Blutplättchenklumpen und Sichelzellen und auch Erythrozyt- Bruchstücke aus unzureichend lysierten Blutproben. Bei diesen Verfahren werden NRBCs nicht identifiziert. Statt dessen wird nur ein einfaches NRBC-Proben- Verteilungsmuster in einem Histogramm oder Punktdiagramm durch das Instrument erkannt, das leicht mit einem ähnlichen Muster verwechselt werden kann, das durch die oben erwähnten anderen Ursachen erzeugt wurde. Bei den markierten Proben, einschließlich der falschen positiven Markierungen, ist eine erneute Überprüfung der Proben mit manuellen Verfahren in klinischen Labors erforderlich. Ein weiteres Problem der NRBC-haltigen Proben besteht darin, daß die Leukozytenzahl (WBC), die von dem Hämatologie-Analysegerät angegeben wird, bei diesen Proben nicht genau ist, da NRBCs die WBC erhöhen können, indem sie fälschlich als Leukozyten identifiziert werden. Andererseits ist die Analyse der Leukozytenpopulationen aus Vollblutproben ein integraler Teil der Diagnoseverfahren im Hinblick auf eine Vielzahl von Krankheitserscheinungen. Die Fähigkeit, die Leukozyten-Hauptsubpopulationen automatisiert zu analysieren, ist wesentlich für eine schnelle Diagnose einer einzelnen Blutprobe und für die schnelle Verarbeitung vieler Proben auf einmal.
US-Patent Nr. 5.155.044 (Ledis et al.) offenbart ein Verfahren zur Isolierung und Analyse von Leukozyten aus einer Vollblutprobe, das die Unterscheidung von Leukozyten in fünf Subpopulationen in einer einstufigen Messung mit einem Hämatologie-Analyseautomaten ermöglicht. Die Nachweistechnik umfaßt gleichzeitig eine Lichtstreuungsmessung und Impedanzmessungen sowohl in DC (Gleichstrom) und RF (Radiofrequenz). Dieses Verfahren ist einfach und schnell, aber es liefert keine Unterscheidung von NRBCs.
US-Patent Nr. 5.384.549 (Hamaguchi et al.) beschreibt ein Lysereagenssystem und ein Verfahren zur Unterscheidung von Leukozyten in fünf Subpopulationen durch eine komplexe Verfahrensweise. Das Verfahren erfordert drei lytische Reagenzien, drei gesonderte Probenpräparationen und -messungen, um eosinophile, neutrophile und basophile Populationen zusätzlich zu den Lymphozyt- und Monozytpopulationen zu identifizierter. Hamaguchi et al. beschreiben bloß die Bebachtung von anormalen Leukozytpopulationen und kernhaltigen Erythrozytenvorläuferzellen unter Verwendung des Lysereagenssystems und des DC- gegenüber RF- Nachweisverfahrens. Jedoch ist dieses Verfahren nur auf die Beobachtung der Gegenwart einiger anormaler Zellarten begrenzt, kann aber NRBCs nicht unterscheiden und zählen.
US-Patent Nr. 5.686.308 (Li et al.) beschreibt ein Lysereagenssystem und ein Verfahren zur Unterscheidung von Leukozyten in fünf Subpopulationen in einer einstufigen Messung mit einem Hämatologie-Analyseautomaten. Das lytische Reagens umfaßt ein lytisches Reagens, das eine ethoxylierte langkettige Aminverbindung und Säure enthält, um den pH des lytischen Reagens zwischen 2,0 und 3,6 einzustellen; und ein hypertonisches, alkalisches Stabilisierungsreagens. Dieses Patent lehrt ein Reagens und ein Verfahren zur Unterscheidung von Leukozytsubpopulationen, lehrt aber keine Unterscheidung von kernhaltigen Erythrozytenvorläuferzellen.
Basierend auf dem vorhergehenden besteht ein Bedarf an einem einfachen und weniger teueren Analyseverfahren zur Unterscheidung und Zählung von NRBCs.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Unterscheidung von kernhaltigen Erythrozytenvorläuferzellen mit einem Hämatologie-Analyseautomaten ohne Verwendung von Fluoreszenz- oder Kernfärbung erlaubt. Das Verfahren umfaßt das Aussetzen einer Blutzellprobe einem Reagenssystem, um reife Erythrozyten zu lysieren; Analysieren der Probe in einer Durchflußzelle mittels Lichtstreuungsmessung, um kernhaltige Erythrozytenvorläuferzellen von anderen Zellarten zu unterscheiden; und Angeben der kernhaltigen Erythrozytenvorläuferzellen in der Blutzellprobe.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das eine gleichzeitige Unterscheidung von kernhaltigen Erythrozytenvorläuferzellen und Leukozyten erlaubt. Das Verfahren umfaßt das Aussetzen einer Blutzellprobe einem Reagenssystem, um reife Erythrozyten zu lysieren, ohne Leukozyten zu beschädigen; Analysieren der Probe in einer Durchflußzelle mittels Gleichstrom- und Lichtstreuungsmessungen, um kernhaltige Erythrozytenvorläuferzellen und Leukozytensubpopulationen zu unterscheiden; und Angeben der NRBCs und Leukozytensubpopulationen in der Blutzellprobe.
Aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen wird besser verständlich, daß die Erfindung im Vergleich zum Stand der Technik besonders vorteilhaft dahingehend ist, daß es die Unterscheidung von kernhaltigen Erythrozytenvorläuferzellen unter Verwendung von Lichtstreuung ohne Kernfärbung und der Nutzung eines komplexen Fuoreszenznachweisverfahrens bereitstellt. Ein zusätzliches Merkmal des vorliegenden Verfahrens ist es, daß es keine Erwärmung bei der Probenpräparation erfordert und optimal bei Raumtemperatur arbeitet. Die Erfindung wird besser aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen verständlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 bis 7 sind Streuungsdiagramme, die gemäß der in den Beispielen I bis VI beschriebenen Praxis der vorliegenden Erfindung erhalten wurden.
Fig. 8 ist eine Kurve, die die Korrelation zwischen Ergebnissen veranschaulicht, die durch das manuelle Referenzverfahren und das in Beispiel VII beschriebene, erfindungsgemäße Verfahren erhalten wurden.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unterscheidung von NRBCs. Außerdem sorgt das Verfahren für die gleichzeitige Unterscheidung von Leukozyten in einer Blutzellprobe.
In einer ersten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren das Aussetzen einer Blutzellprobe einem Reagenssystem, um reife Erythrozyten zu lysieren; anschließend Analysieren des Probengemischs in einer Durchflußzelle mittels Lichtstreuungsmessung, um NRBCs zu unterscheiden; und Angeben der NRBCs in der Blutzellprobe.
Ein für die vorliegende Erfindung geeignetes Reagenssystem umfaßt ein lytisches Reagens, das eine ethoxylierte langkettige Aminverbindung, die durch die allgemeine Formel
dargestellt wird, in der R eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen darstellt, m und n jeweils 1 oder mehr sind und m + n zwischen 20 und 40 liegt, und Säure umfaßt, um den pH des lytischen Reagens zwischen 2,0 und 3,6; und ein hypertonisches, alkalische Stabilisierungsreagens.
Gegebenenfalls können einer oder mehrere Stabilisatoren in dem lytischen Reagens in einer Menge enthalten sein, die wirksam ist, um die Erythrozytenbruchstücke zu verringern. Typischerweise sind die Lösungsvermittler Polyoxyethylen- und Polyoxypropylencopolymere sowie ethoxylierte Alkohole mit einem HLB von 16 oder größer. Geeignete Copolymere umfassen, ohne auf diese begrenzt zu sein, Pluronic-Copolymer (BASF Corporation, Parsippany, New Jersey), wie Pluronic F38 und Pluronic 25R8, und geeignete ethoxylierte Alkohole umfassen, ohne auf diese begrenzt zu sein, Plurafac A38 (BASF) und Hetoxol STA 30 (Heterene, Inc. Paterson, New Jersey).
Zusätzliche wahlweise Additive können ebenfalls in dem lytischen Reagens mit solchen Konzentrationen enthalten sein, daß ihre Anwesenheit mit der funktionellen Hauptkomponente der lytischen Reagenszusammensetzung vereinbar ist. Unter diesen Additiven sind Konservierungsmittel, die anti-oxidierende Eigenschaften aufweisen, um die Eigenstabilität der Zusammensetzung zu erhöhen, und die anti-mikrobielle Eigenschaften aufweisen. Konservierungsmittel, die antioxidative Eigenschaften aufweisen, umfassen EDTA und Butylmethylphenol, ohne auf diese beschränkt zu sein. Konservierungsmittel, die anti-mikrobielle Eigenschaften aufweisen, umfassen Dimethyloldimethylhydantoin, Iodpropinylbutylcarbamat und Isothiozolon-Derivate.
Ein weiteres geeignetes Reagenssystem, das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, wird im US-Patent Nr. 5.155.044 offenbart. Dieses Reagenssystem nutzt eine hypertonische saure Lyse, um Erythrozyten selektiv zu lysieren, und eine anschließend zugesetzte Abschrecklösung, um die Lyseaktivität zu hemmen und die Leukozyten für die Unterscheidungsanalyse zu schützen.
Die Unterscheidungsanalyse von NRBCs wird in einer Durchflußzelle mit einem Hüllfluid unter Verwendung vor Lichtstreuungsmessungen durchgeführt. Wenn ein Partikel wie beispielsweise eine Blutzelle die Öffnung einer Durchflußzelle passiert, streut es das einfallende Licht eines Laserstrahls in alle Richtungen. Das Lichtstreuungssignal kann mit einem Lichtdetektor bei verschiedenen Winkeln in bezug auf den einfallenden Lichtstrahl zwischen 0º und 180º nachgewiesen werden. Es ist festgestellt worden, daß jede Zellpopulation unterschiedliche, mehr oder weniger bedeutende Lichtstreuungseigenschaften aufweist, die zur Unterscheidung von unterschiedlichen Zelipopulationen genutzt werden können. Die Lichtstreuungssignale, die bei weniger als 10º von dem Einfallslicht nachgewiesen werden, werden gewöhnlich Kleinwinkellichtstreuung genannt. Die Eigenschaften der Kleinwinkellichtstreuung werden durch die Größe einer Zelle und auch die Inhalte einer Zelle beeinflußt.
Ein Lichtstreuungssignal eines Partikels oder einer Zelle, die die Durchflußzelle passieren, wird für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet. Vorzugsweise werden zwei Winkel von Lichtstreuungssignalen zur Unterscheidung von NRBCs verwendet. Stärker bevorzugt sind beide Lichtstreuungswinkel kleiner als 10º. Der stärker bevorzugte Bereich des ersten Winkels liegt zwischen etwa 0º und etwa 4º. Der stärker bevorzugte Bereich des zweiten Winkels liegt zwischen etwa 3º und etwa 7º.
Fig. 1 zeigt ein LS1-(1º-3º)/LS2-(4º-6º)-Streuungsdiagramm einer klinischen Vollblutprobe, die 14 NRBC/100 WBC enthält und gemäß der in Beispiel I beschriebenen Vorgehensweise verarbeitet und analysiert wurde. In diesem Streuungsdiagramm bilden NRBCs einen Cluster, der deutlich von den Erythrozyten- Bruchstücken unterschieden ist die unter den NRBCs angegeben sind, und deutlich von den Leukozyten (die außerhalb des Diagrammumfangs liegen) unterschieden sind. Auf der Gleichstromskala liegen die in Fig. 1 bezeichneten NRBC- Populationen unter den Lymphozyten in einem Bereich, der normalerweise als Bruchstückbereich, betracht wird, wie in Fig. 2 gezeigt wird.
Fig. 4A zeigt ein LS1/LS2-Streuungsdiagramm mit identischen Skalen wie Fig. 1, das aus einer normalen frischen Vollblutprobe erhalten wurde, die gemäß der in Beispiel IV beschriebenen Verfahrensweise verarbeitet und analysiert wurde. Wie leicht zu erkennen ist, ist dort kein Cluster in dem Bereich vorhanden, wo NRBCs erscheinen (wie in Fig. 1 gezeigt ist), weil normales peripheres Blut keine NRBCs aufweist. Dieselbe Probe wurde bei Raumtemperatur (etwa 23ºC) etwa dreißig Stunden gehalten und dann unter Verwendung derselben Verfahrensweise verarbeitet und analysiert. Fig. 4B zeigt das resultierende Streuungsdiagramm. Kein Cluster wird in dem Streuungsdiagramm im NRBC-Bereich gefunden. Dies veranschaulicht, daß das erfindungsgemäße Verfahren ein geringes Risiko besitzt, falsche positive Signale für normale Blutproben anzugeben, selbst wenn die Proben gealtert sind.
Es ist sehr wichtig, daß gealterte Blutproben den NRBC-Nachweis nicht stören. Blutzellen in einer gealterten Blutprobe sind brüchiger und empfindlicher gegen Lysebedingungen. Wird eine gealterte Blutprobe einem lytischen Reagens ausgesetzt, werden auch Cytoplasma der Zellmembran einiger Leukozyten zerstört. Der teilweise freigelegte Leukozytkern wird ebenfalls durch Kernfärbung angefärbt, wenn ein Fluoreszenzverfahren für die NRBC-Analyse verwendet wird. Ihre Fluoreszenzsignale werden ebenfalls nachgewiesen. Die Signale von NRBCs und gefärbten Leukozyten überlappen einander normalerweise. Deshalb ist es schwieriger, NRBC von anderen Zellarten in gealterten Blutproben unter Verwendung eines Fluoreszenzverfahrens zu unterscheiden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren stören die brüchigen Leukozyten nicht in dem NRBC-Cluster oder überlappen diesen. Deshalb ist es ohne weiteres offensichtlich, daß die vorliegende Erfindung beim Nachweis von NRBCs in gealterten Blutproben vorteilhaft ist.
Fig. 5 zeigt ein Streuungsdiagramm, das von einer klinischen Probe erhalten wurde, die 5% Retikulozyten enthält und unter Verwendung des in Beispiel V beschriebenen Verfahrens der vorliegenden Erfindung analysiert wurde. Das Streuungsdiagramm zeigt einen zusätzlichen Cluster links von den NRBCs, der den Retikulozyten entspricht. Ein Retikulozyt ist eine andere Art eines unreifen Erythrozyten, die keinen Kern, aber RNA enthält. Anders als NRBCs kommen Retikulozyten sowohl im Knochenmark als auch im peripheren Blut vor. Bei bestimmten Erkrankungen wie hämolytischer Anämie, Thalassämie und Sideroblastenanämie treten Retikulozyten verstärkt auf. Die meisten Kernfärbungen, die zum Färben von NRBCs verwendet werden, färben auch RNA in Retikulozyten. Das Anfärben von Retikulozyten erzeugt Fluoreszenzsignale, die mit NRBC-Fluoreszenzsignalen überlappen. Deshalb könnten die NRBC-Ergebnisse bei Verwendung eines Fluoreszenzverfahrens falsch sein, wenn keine spezielle Korrektur für die Retikulozyten vorgenommen wird.
Fig. 6 zeigt ein Streuungsdiagramm einer klinischen Probe, die sowohl NRBCs als auch Retikulozyten enthält. Die Probe wurde unter Verwendung derselben Verfahrensweise von Beispiel V analysiert. Die NRBC-Angabe stimmt mit dem Ergebnis der manuellen Referenz überein. Somit stört das Vorhandensein von Retikulozyten bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens die NRBC-Messung nicht.
Die Unterscheidung von NRBCs durch Kleinwinkellichtstreuungen (LS1 und LS2) ist einfach und eindeutig. Sie nutzt ein normales zweidimensionales Punktdiagramm oder Streuungsdiagramrri, um NRBCs von anderen Zellarten zu unterscheiden. Weil in früheren Verfahren NRBC-Signale mit den Signalen von Erythrozytenbruchstücken und anderen Zellarten wie Leukozyten und Retikulozyten in einer oder mehr Dimensionen überlappen, erfordern die Verfahren des Standes der Technik Vorauftastung ("pre-gating") oder mehrfache Auftastung ("multiple gating") der detektierten Fluoreszenz- und Lichtstreuungssignale zur Identifizierung von NRBC-Population. Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert keine Vorauftastung ("pre-gating") oder Editierung der detektierten Signale, da NRBCs von anderen Zellarten, einschließlich Erythrozytenbruchstücken, durch das zweidimensionale Nachweisverfahren getrennt werden.
Die Zeilpopulationen über dem NRBC-Cluster werden als Gesamtzahl an Leukozyten (WBC) gezählt. Außerdem kann ein weiteres Verfahren verwendet werden, - um die Gesamtzahl an Leukozytan zu bestimmen. Wenn auch ein Gleichstrom- Nachweisgerät verwendet wird, können die Zellpopulationen über dem minimalen Gleichstromvolumen der Lymphozyten als Gesamtzahl an Leukozyten gezählt werden. Die in beiden Verfahren erhaltene WBC ist frei von NRBC-Störungen und entspricht der korrigierten WBG, die durch Subtrahieren einer manuellen NRBC-Zahl aus einer WBC erhalten wurde, die durch eine normale kommerzielle Blutzählvorrichtung erhalten wurde.
Die NRBC-Konzentration der analysierten Probe kann durch Teilen der Zahl von Zellen, die in dem identifizierten NRBC-Cluster (Fig. 1) gezählt wurden, durch die gezählte Gesamtleukozytenzahl (WBC) und Multiplizieren des Quotienten mit 100 berechnet werden. Die NRBC-Konzentration kann als Zahl der NRBC/100 WBC angegeben werden, d. h. derselben wie der manuellen Angabeeinheit, oder als absolute NRBC pro ul Vollblut angegeben werden.
In einer zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform kann eine Unterscheidungsanalyse von Leukozyten zusammen mit der Unterscheidung von NRBCs durchgeführt werden. Die Unterscheidungsanalyse kann unter Verwendung desselben Reagenssystems und einer Einprobenpräparation in einer einstufigen Messung unter Verwendung einer elektronischen und optischen Analyse vorgenommen werden. Die elektronische und optische Analyse umfaßt Lichtstreuungs- und Impedanzmessungen. Das Gleichstrom-Impedanzmeßgerät, das für die Leukozytenanalyse mittels eines Hämatologie-Analyseautomaten verwendet wird, ist dem Fachmann bekannt und wird allgemein in dem US-Patent Nr. 5.125.737 (Rodriguez et al.) beschrieben, dlas hierin durch Verweis vollständig enthalten ist. Zur Unterscheidungsanalyse von NRBC und Leukozyten wird ein Lichtstreuungsdetektor verwendet, der Lichtstreuungssignale mit kleinem und mittlerem Winkel von einem Partikel oder einer Zelle detektieren kann, die durch die Durchflußzelle strömen.
In Fig. 1 befinden sich die Leukozyten außerhalb des Bereiches des LS1/LS2- Streuungsdiagramms und sind in dieser Figur nicht dargestellt. Jedoch kann die Probenanalyse zur Leukozytenunterscheidung und NRBC-Unterscheidung in einer einstufigen Messung durchgeführt werden. Die Datenanalyse für beide Unterscheidungen kann gleichzeitig unter Verwendung verschiedener Parameter durchgeführt werden, die aus der einstufigen Messung erhalten wurden.
Fig. 2 ist ein Gleichstrom/LS3-(Lichtstreuung mit mittlerem Winkel von etwa 24 bis etwa 35º)-Streuungsdiagramm, das von einer frischen normalen Vollblutprobe erhalten wurde, die gemäß Beispiel II verarbeitet wurde (die gleichen Reagenzien und dieselbe Verfahrensweise wie in Beispiel I wurden verwendet). Fig. 2 zeigt vier verschiedene Cluster von Leukozytensubpopulationen, Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen. Die Probe wurde in einer Einprobenpräparation verarbeitet und gleichzeitig mit NRBC-Unterscheidung analysiert. Im dem DC/LS3- Streuungsdiagramm werden alle Zellpopulationen über dem minimalen Gleichstromvolumen der Lymphozytenpopulation als Gesamtleukozytenzahl (WBC) gezählt, die den Populationen über dem NRBC-Cluster in dem LS1/LS2- Streuungsdiagramm entspricht.
Das erfindungsgemäße Verfahren gibt erstmals die Unterscheidung und Zählung von kernhaltigen Erythrozytenvorläuferzellen an, ohne Kernfärbung und Fluoreszenz zu verwenden. Die Beseitigung der Kernfärbung liefert Vorteile hinsichtlich der Verringerung der Geräte- und Flußsystemunterhaltung aufgrund der Farbstoffkontamination, bei der Verringerung der Systemempfindlichkeit gegen Reagensverschleppung und der Verringerung der Reagenskosten aufgrund teuerer Fluoreszenzfarbstoffe. Das erfindungsgemäße Verfahren ist schnell, zuverlässig und für eine automatische Blutanalyse geeignet. Außerdem ist die Nachweistechnik weniger komplex und preisgünstig im Vergleich zum Fluoreszenzverfahren.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat auch den Vorteil, daß es vollständig bei Raumtemperaturen, 18 bis 28ºC, durchgeführt werden kann. Verfahren des Standes der Technik arbeiten bei einer erhöhten Temperatur zur Unterscheidung von Leukozytensubpopulationen oder zur Unterscheidung von NRBCs. Das Erfordernis einer erhöhten Temperatur macht eine Analyseinstrumentierung erforderlich, die wesentlich komplexer ist, weil die Reaktionen thermostatisch kontrolliert werden müssen. Die vorliegende Erfindung überwindet diese Notwendigkeit zur thermostatischen Kontrolle, indem sie optimal bei Raumtemperatur arbeitet.
Ein weiteres vorteilhaftes Merkmal dieser Erfindung ist deren Nutzen bei der Unterscheidungsanalyse anderer flüssiger Proben, wie Knochenmark, und Blutproben nicht-humaner Arten. Beispiel VI ist ein Beispiel für die Anwendung der vorliegenden Erfindung bei der Veterinärproben-NRBC-Analyse.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter in bezug auf die folgenden Beispiele verstanden werden. Es ist jedoch verständlich, daß die Erfindung nicht auf die beschriebenen Beispiele begrenzt ist.

Beispiel I

Zu 28 ul einer EDTA-antikoagulierten klinischen Vollblutprobe wurden 417 ul eines lytisches Reagens, das 0,18% Ameisensäure, 2% ethoxyliertes langkettiges Amin der Formel
in der R Stearyl darstellt und m + n gleich 27 ist, 1,4% Plurafac A38 als Löslichkeitsverbesserer und Konservierungsmittel umfaßt, zugegeben und in einer Mischkammer an einem Hämatologie-Analysegerät etwa 4 Sekunden vermischt. Dann wurden 180 ul eines Stabilisierungsreagens, das 1,4% NaCl, 3,2% Na&sub2;SO&sub4; und 0,66% Na&sub2;CO&sub3; umfaßt und einen pH von 11,0 besitzt, zugegeben und vermischt, um die lytische Reaktion zu verzögern.
Zehn Sekunden nach der Zugabe des Stabilisierungsreagens wurde das Probengemisch zu einer Durchflußzelle mit einem Hüllfluid, ISOTON® III- Verdünnungsmittel (Erzeugnis von Coulter Corpotation, Miami, Florida), zur NRBC- und Leukozyten-Unterscheidungsanalyse an einem Hämatologie-Analysegerät mit Gleichstrom- und Lichtstreuungsdetektoren befördert. Der Lichtstreuungsdetektor detektiert Lichtstreuungssignale einer Zelle, die durch die Durchflußzelle strömt, in verschiedenen Winkelbereichen, d. h. zwischen etwa 1º und etwa 3º (LS1), zwischen etwa 4º und etwa 6º (LS2), zwischen etwa 24º und etwa 35º (LS3) und höheren Winkeln.
Die resultierenden Streuungsdiagramme sind in Fig. 1 dargestellt. Fig. 1 zeigt ein NRBC-Cluster, das von Erythrozyten-Bruchstücken (unten) und Leukozyten (oben, aber außerhalb des Streuungsdiagrammumfangs) getrennt ist, in einem LS1/LS2- Streuungsdiagramm.
Die NRBC-Konzentration der analysierten Probe wird berechnet, indem die Anzahl an Zellen, die in dem identifizieren NRBC-Cluster (Fig. 1) gezählt wurden, durch die gezählte Gesamtzahl an Leukozyten (WBC) geteilt und der Quotient mit 100 multipliziert wird. Die NRBC-Korizentration wird angegeben als NRBC- Zahl/100 WBC, was dasselbe wie die manuelle Angabeeinheit ist. Bei dieser Probe ergaben sowohl das manuelle Referenzverfahren als auch das oben beschriebene Verfahren 14 NRBC/100 WBC.

Beispiel II

Ein frische normale Vollblutprobe wurde unter Verwendung der gleichen Reagenzien und Verfahrensweise, die in Beispiel I beschrieben wurden, analysiert. Das Probengemisch wurde gleichzeitig in der Durchflußzelle an dem in Beispiel I verwendeten Hämatologie-Analysegerätes hinsichtlich Leukozytenunterscheidung und NRBC-Unterscheidung analysiert. Fig. 2 ist ein erhaltenes Gleichstrom/LS3- Streuungsdiagramm, das vier getrennte Cluster von Leukozyten-Subpopulationen zeigt, Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen.

Beispiel III

Zu 28 ul einer EDTA-antikoagulierten klinischen Vollblutprobe wurden 449 ul eines lytisches Reagens gegeben, das aus 0,12% Ameisensäure und 0,07% Saponin bestand, und in einer Mischkammer an einem Hämatologie-Analysegerät etwa 5 Sekunden vermischt. Dann wurden 177 ul des gleichen, in Beispiel I beschrieben Stabilisierungsreagens zugegeben und vermischt, um die lytische Reaktion zu verzögern.
Etwa 8 Sekunden nach der Zugabe des Stabilisierungsreagens wurde das Probengemisch zu einer Durchflußzelle mit einem Hüllfluid, ISOTON® III- Verdünnungsmittel, zur NRBC- und Leukozyten-Unterscheidungsanalyse an dem in Beispiel I beschriebenen Hämatologie-Analysegerät befördert. Fig. 3 ist das resultierende LS1/LS2-Streuungsdiagramm (mit demselben Maßstab wie in Fig. 1), das den von anderen Zellarten getrennten NRBC-Cluster zeigt.

Beispiel IV

Das Reagenz und die Verfahrensweise, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, wurden zur Analyse einer frischen normalen Vollblutprobe verwendet. Die Probe wurde bei Raumtemperatur (etwa 23ºC) etwa dreißig Stunden gehalten und wieder verarbeitet und analysiert. Die resultierenden Streuungsdiagramme werden in Fig. 4A für frisches Blut und in Fig. 4B für gealtertes Blut gezeigt. In Fig. 4A ist kein Cluster in dem Bereich vorhanden, in dem NRBCs auftreten, weil normales peripheres Blut keine NRBCs enthält. Auch in Fig. 4B wird in der NRBC-Region kein Cluster gefunden. Dieses Beispiel zeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren ein geringes Risiko aufweist, falsche positive Ergebnisse für normale Blutproben anzugeben, selbst wenn die normalen Blutproben gealtert sind.

Beispiel V

Die Verfahrensweise und das Reagens, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, wurden zur Analyse einer Blutprobe verwendet, die Retikulozyten enthielt (5%, erhalten durch manuelle Referenz). Fig. 5 ist das resultierende LS1/LS2- Streuungsdiagramm. Es zeigt einen zusätzlichen Cluster links von den NRBCs, der den Retikulozyten entspricht Fig. 6 zeigt ein Streuungsdiagramm, das aus einer klinischen Probe erhalten wurde, die sowohl NRBCs als auch Retikulozyten enthielt, unter Verwendung derselben Verfahrensweise. Die NRBC-Angabe stimmte mit der manuellen Referenz überein, d. h. 17 NRBC/100 WBC nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gegenüber 16 NRBC/100 WBC gemäß der manuellen Referenz.

Beispiel VI

4 ul Alligatorblut wurden mit 4,15 ml des lytischen Reagens von Beispiel 1 in einem Teströhrchen etwa 4 Sekunden manuell vermischt. 1,8 ml des Stabilisierungsreagens von Beispiel 1 wurden zugegeben und das Probengemisch manuell vermischt und in das in Beispiel I beschriebene Hämatologie-Analysegerät eingeführt. Fig. 7 zeigt das erhaltene LS1/LS2- Streuungsdiagramm. Wie gezeigt, bildeten die NRBCs ein getrenntes Cluster.

Beispiel VII

Insgesamt 130 Vollblutproben, einschließlich 84 klinischer Proben, wurden unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und des lytischen Reagens von Beispiel I analysiert. Die NRBCE dieser Proben wurden unter Verwendung des manuellen Referenzverfahrens gezählt. Zur manuellen NRBC-Zählung wurden 200 WBC auf jedem Patientenblutausstrich gezählt, der mit Wright-Färbung angefärbt wurde, und die Zahl von NRBCs, die in demselben Bereich vorlagen, wurde gezählt und durch zwei geteilt, um NRBC/100 WBC anzugeben. Fig. 8 zeigt die Korrelation zwischen dem manuellen Referenzverfahren und dem erfindungsgemäßen Verfahren. Der Korrelationskoeffizient beträgt 0,974, der Anstieg 0,90 und der Schnittpunkt 1,71.

Claims

1. Verfahren zur Unterscheidung kernhaltiger Erythrozyten, umfassend

(a) Aussetzen einer Blutzellprobe einem Reagenzsystem, um reife Erythrozyten zu lysieren;

(b) Analysieren der Probe in einer Durchflußzelle mittels Lichtstreuungsmessung, um kernhaltige Erythrozytenvorläuferzellen von anderen Zellarten zu unterscheiden; und

(c) Angeben der kernhaltigen Erythrozytenvorläuferzellen in der Blutzellprobe.

2. Verfahren zur Unterscheidung kernhaltiger Erythrozytenvorläuferzellen und Leukozyten, umfassend

(a) Aussetzen einer Blutzellprobe einem Reagenzsystem, um reife Erythrozyten zu lysieren, ohne Leukozyten zu beschädigen;

(b) Analysieren der Probe in einer Durchflußzelle mittels Gleichstrom- und Lichtstreuungsmessungen, um kernhaltige Erythrozytenvorläuferzellen und Leukozytensubpopulationen zu unterscheiden; und

(c) Angeben der kernhaltigen Erythrozytenvorläuferzellen und Leukozytensubpopulationen in der Blutzellprobe.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Lichtstreuungsmessung unter 20 Verwendung von zwei Winkeln von Lichtstreuungssignalen durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Lichtstreuungsmessung unter Verwendung von Kleinwinkel-Lichtstreuungssignalen durchgeführt wird, die bei weniger als 10º detektiert werden.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die zwei Winkel der Lichtstreuungssignale Kleinwinkel-Lichtstreungssignale sind, die bei weniger als 10º detektiert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei ein Kleinwinkel-Lichtstreuungssignal zwischen etwa 0º und etwa 4º liegt.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das andere Kleinwinkel- Lichtstreuungssignal zwischen etwa 3º und etwa 7º liegt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei die Leukozytensubpopulationen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen besteht.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei die Angabe der Leukozytensubpopulationen als absolute Anzahl pro Volumeneinheit der Blutprobe oder als Prozentsatz der Gesamtleukozyten in der Blutprobe erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Angeben der kernhaltigen Erythrozytenvorläuferzellen in Form der Angabe der Anzahl der kernhaltigen Erythrozytenvorläuferzellen pro einhundert Leukozyten oder als absolute Anzahl der kernhaltigen Erythrozytenvorläuferzellen pro Volumeneinheit einer Blutzellprobe erfolgt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Blutzellprobe menschliches peripheres Blut, nicht-menschliches peripheres Blut, menschliches Rückenmark und nicht-menschliches Rückenmark umfaßt.