DE69108757T2 - Reagens und Verfahren zum Gebrauch desselben für das automatische Zählen von basophilischen Leukocyten im Blut mit Vorrichtungen zur Messung der Variation der Resistivität. - Google Patents
Reagens und Verfahren zum Gebrauch desselben für das automatische Zählen von basophilischen Leukocyten im Blut mit Vorrichtungen zur Messung der Variation der Resistivität.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft die Analyse von Blutbildern durch Zählen und Diskriminieren mindestens einer leukozytären Unterpopulation und betrifft insbesondere ein Reagens und ein Anwendungsverfahren dafür zum Zählen von basophilen Granolozyten mittels der Fluß-Zytometrie durch Messen des Widerstandes.
- Die diagnostische Bedeutung der genauen Bestimmung verschiedener leukozytären Populationen ist seit langem bekannt. So kann tatsächlich das Auftreten von abnormen leukozytären Werten mit dem Auftreten verschiedener Erkrankungen korreliert werden.
- Die traditionellen Verfahren zum spezifischen Färben und Beobachten mit Hilfe des Mikroskops ermöglichen es bereits, die verschiedenen Leukozytentypen zu unterscheiden, wozu die Granolozyten (Basophile, Eosinophile und Neutrophile) und die Agranulozyten (Monozyten und Lymphozyten) zählen. Die Durchführung dieser Verfahren ist jedoch sehr langwierig.
- Es werden bereits verschiedene automatische Vorrichtungen vertrieben, die es ermöglichen, verschiedene leukozytäre Populationen des Gesamtblutes zu zählen. Zudem sind bereits verschiedene Reagentien und Farbstoffe im Einsatz, um in diesen Vorrichtungen Anwendung zu finden.
- Man kann auch die Größe von Zellen nach differentieller Lysis ihres Zytoplasmas messen, sei es durch Messen der Variationen des Widerstands (beispielsweise beschrieben in dem Patent WO 84/03771), sei es durch Messen der optischen Brechung (wie beschrieben beispielsweise in dem US-Patent 3740143). Man kann zudem spezifische Färbungen (enzymatische oder nicht) von verschiedenen Zelltypen und insbesondere von drei Granulozytentypen durchführen und dann die Größen und die optische Dichte der Zellen mit verschiedenen Wellenlängen messen (US-Patent 3740143).
- Das Zählen von basophilen Granulozyten ist insbesondere schwierig, da dieser Zelltyp nicht mehr als 0,5 bis 1 % der weißen Blutkörperchen ausmacht.
- Die basophilen Granulozyten unterscheiden sich durch ihren erhöhten Heparingehalt, ein sulfatiertes Polysaccharid, das durch Farbstoffe sichtbar gemacht werden kann, die zur Familie der Phtalocyanine, wie Alcian-Blau und Astra-Blau, zählen.
- Die Färbung von basophilen Granulozyten mit Neutral rot, klassischerweise als manuelles Verfahren eingesetzt, kann auch mit der Behandlung der differentiellen Lysis von Leukozyten kombiniert werden, um in einer automatischen Vorrichtung Anwendung zu finden (US-Patent 3740143).
- In der europäischen Patentanmeldung 0 177 137 ist ein lytisches Reagens beschrieben, welches die zunehmende Zerstörung aller Blutzellen mit Ausnahme der basophilen ermöglicht. Dieses Reagens zerstört die Zellmembranen, so daß das Zytoplasma austreten kann. Nach unterschiedlichen Zeitintervallen verschwinden die verschiedenen Zelltypen, d.h. nacheinander die Erythrozyten, die Lymphozyten, die Eosinophilen, die Neutrophilen und die Monozyten. Nach 80 Sekunden behalten lediglich die Basophilen ihre normale Größe und ihre normale Morphologie. Der Wirkstoff dieses Reagens besteht aus einem Gemisch aus einem grenzflächenaktiven Mittel und einer verdünnten Säure. Diese Mischung muß in einem genauen pH-Bereich zwischen 1,8 und 2,3 eingesetzt werden.
- Dieses Reagens liefert in den Vorrichtungen zum optischen Zählen gute Ergebnisse, es ist jedoch nicht für Widerstandsmessungen geeignet. So besteht ein schwerwiegendes Problem darin, daß die Zählöffnung der Vorrichtung zugesetzt bzw. verschmutzt wird, bevor die Zerstörung der Membranen der roten Blutkörperchen vollständig ist.
- Das Prinzip der Zellzählung durch Widerstand beruht auf der Aufrechterhaltung eines elektrischen Feldes, in dem ein konstanter Strom fließt. Der Eintritt einer Zelle in dieses Feld ruft eine Erhöhung der zum Aufrechterhalten des konstanten Stromes erforderlichen Spannung (nach dem Ohm schen Gesetz) hervor. Der durch den Eintritt bzw. Durchtritt einer Zelle erzeugte Spannungsimpuls (dieser stellt den durch die Vorrichtung gemessenen Wert dar) ist proportional zum entgegengesetzten Widerstand und somit zum Zellvolumen, unabhängig von ihrer Form. Dieses Detektionsverfahren spricht somit nur auf zuvor behandelte (insbesondere durch differentielle Zytolyse) Zellen an, um eine sehr genaue Diskriminierung der Größen der Unterpopulationen zu erhalten.
- Dieses Verfahren ist somit sehr einfach durchzuführen, da es nicht erforderlich ist, die Zellen zu färben.
- Die Anmelderin hat nun eine neue Reagensformulierung für die differentielle Lysis bereitgestellt, welche die basophilen Granulozyten schützt, um in den Vorrichtungen zum Messen des Widerstandes eingesetzt werden zu können.
- Demzufolge weist das erfindungsgemäße Reagens ein grenzflächenaktives Mittel vom Polyoxyethylenethertyp (wie BRIJR35 oder 23-Laurylether) in einer Konzentration von 1 bis 5 g/l und eine Mischung aus Phtalsäure in einer Konzentration von 0,5 bis 1,5 g/l und 0,25 mM HCl auf. Die relativen Konzentrationen der verschiedenen Bestandteile werden derart gewählt, daß ein pH von 2,5 bis 3,2 eingestellt wird.
- Es wurde festgestellt, daß die Empfindlichkeit der Detektion durch Hinzugeben von SDS (Natriumdodecylsulfat) in einer Konzentration von 50 bis 300 mg/l als Denaturierungsmittel für die Proteine, wodurch die Bildung von Ablagerungen in dem Meßinstrument vermindert wird, gesteigert werden kann. Außerdem beschleunigt das SDS die Lysis der Zellen.
- Das Reagens wird vorteilhafterweise mit einem Antioxidansmittel, wie butyliertem Hydroxytoluol oder BHT (C11 H60-di-tert-Butyl-4-methylphenol) in einer Konzentration von 30 mg/l versetzt.
- Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Reagens somit folgende Bestandteile: BrijR35 Phtalsäure HCl SDS butyliertes Hydroxytoluol
- Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Reagens mit Astra-Blau, einem spezifischen Farbstoff für Heparinkörnchen, wodurch diese besser fixiert werden, versetzt werden.
- Die Erfindung betrifft auch ein Anwendungsverfahren für dieses Reagens in einer automatischen Vorrichtung zur Fluß-Zytometrie durch Messen des Widerstandes für die Bestimmung von basophilen Leukozyten.
- Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die zu untersuchende Blutprobe mit dem Reagens in einer Umgebung, die auf eine Temperatur von 30 bis 40ºC thermostatisiert ist, während einer Dauer von 5 bis 30 Sekunden in Kontakt gebracht (die eingestellte Temperatur und die Kontaktzeit sind invers abhängig voneinander).
- Bei dem Verfahren werden dann die intakten Zellen, d.h. die basophilen, mittels einer Widerstandsmessung in einer geeigneten Detektionsvorrichtung detektiert; die Meßwerte werden in Form eines Histogramms aufgezeichnet.
- Die Figur zeigt ein bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltene representatives Histogramm für eine Probe von normalem Blut.
- Das folgende Beispiel dient zur Erläuterung der Erfindung, ohne diese zu beschränken.
- Für die Herstellung eines Liters des Reagens werden die folgenden Konzentrationen der verschiedenen Bestandteile berechnet: BrijR35 Phtalsäure HCl-1N SDS Butyliertes Hydroxytoluol Destilliertes Wasser Auffüllen bis auf 1 l
- Der pH wird bei 2,7 gehalten ( zwischen 2,5 und 3,2).
- Das Reagens kann mit Astra-Blau in einer Konzentration von 10 bis 100 mg/l versetzt werden; bei den gewählten pH-Bedingungen ist Astra-Blau löslich und stabil.
- Dieses Reagens kann in jeder Vorrichtung zum automatischen Zählen von Blutkörperchen auf Basis des Prinzips der Widerstandsmessung (beispielsweise ABX-Modell 504F) eingesetzt werden. Die Spannung der Elektroden wird auf 100 Volt eingestellt.
- Die Vorrichtung wird derart eingestellt, daß eine Probe mit 15 ul Gesamtblut mit 2 ml Reagens in Kontakt gebracht wird. Diese Mischung wird in einer Umgebung hergestellt, die für 17 Sekunden auf eine Temperatur von 40ºC thermostatisiert wird (man erhält das gleiche Ergebnis, wenn man die Temperatur erniedrigt und die Kontaktzeit erhöht und vice versa).
- Das Reagens ruft eine unmittelbare Lysis der roten Blutkörperchen und dann eine progressive Lysis aller weiteren Typen von Körperchen mit Ausnahme der basophilen Granulozyten hervor. Nach einer Kontaktzeit von 30 Sekunden bei 40ºC kann man durch manuelles Bestimmen und Beobachten durch das Mikroskop verifizieren, daß alle Basophilen eine intakte Morphologie bewahrt haben.
- Wenn das Reagens Astra-Blau enthält, ist die Färbung der Basophilen proportional zur Konzentration des eingesetzten Blau's.
- Ein repräsentatives Histogramm für eine Probe von normalen Blut ist in der Figur 1 gezeigt. Die Kurve 1.1 zeigt die in einem Milieu ohne SDS und Astra-Blau bei einem pH von 1,9 durchgeführte Bestimmung; man beobachtet, daß die Membranreste von roten Blutkörperchen die Widerstandsmessung behindern. Die Kurve 1.2 zeigt die mit dem erfindungsgemäßen Reagens durchgeführte Bestimmung; die Zone A entspricht den Kernen der lysierten Zellen, während die Zone B den basophilen Leukozyten entspricht, deren Zytroplasma intakt ist.
Claims (8)
1. Reagens zur differentiellen Lysis für die Zählung von
basophilen Leukozyten des Blutes in einer automatischen
Analysiervorrichtung durch Messen des Widerstandes,
dadurch gekennzeichnet, daß es enthält
- ein grenzflächenaktives Mittel vom
Polyoxyethylenethertyp
- eine Mischung aus Phtalsäure - HCl
- SDS (Natriumdodecylsulfat)
- ein Antioxidans vom butylierten Hydroxytoluoltyp,
wobei der pH-Wert des Reagens 2,5 bis 3,2 beträgt und
das Reagens einen elektrischen Leiter darstellt.
2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das grenzflächenaktive Mittel
Polyoxyethylen-23-laurylether in einer Endkonzentration von 1 bis 5 g/l ist.
3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die Säuremischung Phtalsäure in einer
Endkonzentration von 0,5 bis 1,5 g/l und HCl in einer
Endkonzentration von 0,25 mM enthält.
4. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis
3, dadurch gekennzeichnet, daß es SDS in einer
Endkonzentration von 50 bis 300 mg/l enthält.
5. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis
4, dadurch gekennzeichnet, daß es butyliertes
Hydroxytoluol in einer Endkonzentration von 10 bis 30 mg/l
enthält.
6. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis
5, dadurch gekennzeichnet, daß es Astra-Blau in einer
Konzentration von 10 bis 100 mg/l enthält.
7. Verfahren zum Zählen der Population von basophilen
Leukozyten des Blutes in einer automatischen Vorrichtung
zur Fluß-Zytometrie, dadurch gekennzeichnet, daß eine
Blutprobe mit dem Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis
6 in einer thermostatisierten Umgebung in Kontakt
gebracht wird, die intakten Zellen, d.h. die basophilen,
durch Messen der Variation des Widerstandes detektiert
werden und- diese Messung in Form eines Histogramms
aufgezeichnet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß das Blut mit dem Reagens bei einer Temperatur von 30
bis 40ºC und während eines Zeitraumes von 5 bis 30
Sekunden in Kontakt gebracht wird.
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