DE69120026T2

DE69120026T2 - Verfahren zur Leukozytenklassifizierung unter Verwendung der Duchflusszytometrie

Info

Publication number: DE69120026T2
Application number: DE69120026T
Authority: DE
Inventors: Yasunori Maekawa
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1990-11-16
Filing date: 1991-11-12
Publication date: 1996-11-28
Anticipated expiration: 2011-11-13
Also published as: JPH04184168A; JP2941041B2; US5434081A; AU8774191A; AU641566B2; EP0485945B1; DE69120026D1; EP0485945A3; EP0485945A2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten in der klinischen Testpraxis. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten mit einem Durchflußzytometer mittels optischer Messungen an mit fluoreszierenden Farbstoffen gefärbten Blutzellen, wobei das Verfahren dazu befähigt ist, die gewünschte Präzision der Leukozytenklassifizierung unabhängig von unterschiedlichen Zeiträumen im Anschluß an die Entnahme der Blutprobe aufrechtzuerhalten.
Leukozyten im peripheren Blut von normalen Personen lassen sich in fünf Typen klassifizieren: Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile. Unterschiedliche Leukozytentypen haben unterschiedliche Funktionen. Die Zählung von Leukozyten im Blut unter Berücksichtigung ihres Typs liefert wertvolle Informationen für diagnostische Zwecke. Beispielsweise tritt bei Entzündungen und Erkrankungen, wie Myokardinfarkt und Leukämie, ein Anstieg der Anzahl an Neutrophilen auf. Bei viralen Erkrankungen, hypoplastischer Anämie, Agranulozytose und dergl. nimmt deren Anzahl ab. Andererseits kommt es bei Erkrankungen, wie Parasitose, Hodgkin-Krankheit und Allergosen zu einem Anstieg der Anzahl von Eosinophilen. Eine erhöhte Anzahl an Monozyten tritt entweder während der Rekonvaleszenzperiode von Patienten mit infektiösen Erkrankungen oder bei Krankheiten, wie monozytischer Leukämie, auf.
Die Klassifizierung und Auszählung von Leukozyten wird üblicherweise durch das differentielle Zählverfahren durchgeführt, das auch als visuelles Zählverfahren oder einfach als manuelles Verfahren bezeichnet wird. Bei diesem Verfahren wird die Blutprobe auf einem Glasobjektträger ausgestrichen, und die Blutkörperchen im Ausstrich werden für die mikroskopische Untersuchung fixiert und gefärbt. Das technische Personal identifiziert den Typ der einzelnen Leukozyten gemäß ihrer morphologischen Merkmale (z. B. nach Größe, Morphologie von Kern und Zytoplasma und Anwesenheit oder Abwesenheit von Granula) oder nach dem Grad der Farbstoffaufnahme und führt dementsprechend die Klassifizierung und Zählung durch. In normalen Laboratorien werden üblicherweise für jede Probe 100-200 Leukozyten ausgezählt. Der prozentuale Anteil der Gesamtleukozytenzahl jedes Typs von Teilchen wird als Meßwert aufgezeichnet.
Das differentielle Zählverfahren hat verschiedene Nachteile. Erstens müssen der mikroskopischen Betrachtung aufwendige Probenvorbereitungsschritte vorausgehen, die das Ausstreichen einer Blutprobe auf einem Glasobjektträger, das Fixieren der Teilchen und deren Färbung umfassen. Zweitens stellt es für das technische Personal eine starke Belastung dar, die feinen Unterschiede zwischen den Teilchen durch mikroskopische Klassifizierung und Zählung zu identifizieren. Drittens ist es auch für ausgebildetes technisches Personal schwierig, durch das manuelle Verfahren zu übereinstimmenden Zählergebnissen zu kommen, da abgesehen von der geringen Anzahl an ausgezählten Leukozyten die ausgestrichene Probe häufig eine ungleichmäßige Verteilung der Blutkörperchen aufweist.
Es wurden verschiedene Verfahren zur Beseitigung dieser Nachteile beim manuellen Verfahren der Leukozytenklassifizierung vorgeschlagen, die sich einer Automatisierung bedienen. Diese automatisierten Techniken lassen sich grob in zwei Typen einteilen. Die erste Methode besteht darin, die Bilder von Körperchen mit einer Videokamera oder einer anderen geeigneten Abbildungsvorrichtung aufzuzeichnen und die Leukozyten durch Bildverarbeitung an einem Computer zu klassifizieren. Das Funktionsprinzip dieses Verfahrens ist ähnlich dem Prinzip des herkömmlichen visuellen Zählverfahrens, jedoch stellt dieses Verfahren vorwiegend aufgrund des Vorliegens von zahlreichen Körperchen, die bei der Klassifikation unter Verarbeitung mit einem Computer Schwierigkeiten bereiten noch keine ideale Alternative für das manuelle Verfahren dar. Ferner ist dieses Verfahren unwirtschaftlich, da es eine komplizierte, voluminöse und kostspielige Einrichtung erfordert.
Der zweite Weg zur automatischen Klassifizierung und Auszählung von Leukozyten basiert auf einem Durchflußsystem. Bei diesem Verfahren wird eine Blutprobe mit darin enthaltenen Körperchen in einem Verdünnungsmittel suspendiert und so in eine Strömungsbahn gebracht, daß sie einzeln (eines nach dem andern) einen verengten Detektor passieren. Die Leukozytenklassifizierung wird durch Analyse des vom Detektor erzeugten Signals durchgeführt. Dieses zweite Verfahren zur Leukozytenzählung, das sich eines Durchflußsystems bedient, wird zusätzlich in zwei Kategorien unterteilt.
Bei einem Verfahren der ersten Kategorie läßt man einen Elektrolyten, in dem sämtliche vorhandenen roten Blutkörperchen mit einem Lysierungsmittel zerstört worden sind, so daß nur noch Leukozyten darin suspendiert sind, durch eine Öffnung strömen. Die Veränderung der elektrischen Impedanz, die an der öffnung beim Passieren der einzelnen Körperchen erfolgt, wird erfaßt, wobei die Größe des erfaßten Signals als Basis für die Klassifizierung von Leukozyten verwendet wird.
Ein Verfahren der zweiten Kategorie ist durch die Verwendung eines Durchflußzytometers charakterisiert, der folgendes umfaßt: eine Lichtquelle, eine Durchflußzelle, die es ermöglicht, daß die Blutzellen in einer Probe einzeln nacheinander durch einen verengten Kanal strömen, eine Photometereinheit, die von jeder einzelnen Blutzelle ausgehendes Licht erfaßt, und einen Analysator zur Analyse des erfaßten Signals. Bei diesem Verfahren werden die Körperchen in der Probe, die gefärbt sind, mit Licht bestrahlt. Die von den bestrahlten Körperchen ausgesandte Fluoreszenz wird erfaßt, ggf. zusammen mit Streulicht, wobei die Leukozytenklassifizierung entsprechend der Intensität des erfaßten Signals vorgenommen wird.
Techniken, die unter diese Kategorie der Durchflußzytometrie fallen, sind beispielsweise in der Japanischen Patentveröffentlichung 853/1984 und bei L. A. Kamentsky, Blood Cells, Bd. 6 (1980), S. 121-140 beschrieben. Gemäß diesen Techniken wird eine Blutprobe mit dem 10-fachen Volumen einer Lösung von Acridinorange gefärbt, 1 Minute inkubiert und mit einer Lichtquelle, z. B. einem Argonionenlaser bestrahlt. Die grüne Fluoreszenz und die rote Fluoreszenz, die von den einzelnen Körperchen emittiert wird, werden gemessen. Anschließend wird die Klassifizierung und Zählung der Leukozyten auf der Basis eines zweidimensionalen Diagramms der Fluoreszenzmessungen vorgenommen.
Weitere Beispiele für Techniken, die unter die Durchflußzytometrie fallen, finden sich in JP-A-20820/1975, bei H. M. Shapiro et al., J. Histochem. Cytochem., Bd. 24 (1) (1976), S. 396-411; und a. a. O., Bd. 25 (8) (1977), S. 976- 989. Gemäß diesen Verfahren wird eine Blutprobe mit dem 4- fachen Volumen einer Farbstofflösung I gefärbt, 3 Minuten inkubiert, ferner mit 20% Formaldehyd in einem dem Blut entsprechenden Volumen vermischt, 5 Minuten fixiert und mit einer verdünnenden Farbstofflösung II verdünnt, wodurch man eine Konzentration erhält, die 15- bis 20-fach geringer als der ursprüngliche Wert ist. Die auf diese Weise vorbereitetet Probe wird der Messung mit einem Durchflußzytometer unterworfen.
Das bei diesen Verfahren eingesetzte Durchflußzytometer weist entweder eine Quecksilberlampe auf, die Licht von drei unterschiedlichen Wellenlängen erzeugt, oder drei Laser, so daß die drei fluoreszierenden Färbungen von jeder der Farbstofflösungen angeregt werden. Bei den gemessenen Parametern handelt es sich um drei Arten von Fluoreszenz, in Vorwärtsrichtung gestreutes Licht, seitlich gestreutes Licht und absorbiertes Licht. Aufgrund dieser sechs Parameter werden zweidimensionale Diagramme in vier Stufen erstellt und zur Klassifizierung und Zählung der Leukozyten analysiert.
JP-A-70166/1988 beschreibt ein einstufiges Färbeverfahren, bei dem eine Blutprobe mit einer Farbstofflösung, die eine Pufferlösung, anorganische Salze und fluoreszierende Farbstoffe enthält, gefärbt wird. Bei diesem Verfahren tritt aber die Schwierigkeit auf, daß nicht-lysierte Erythrozyten in nachteiliger Weise die Meßdaten unter Erzeugung von unzuverlässigen Ergebnissen beeinflussen können.
JP-A-134958/1988 (Mitglied der Patentfamilie von EP-A-0 268 766) beschreibt ein zweistufiges Färbeverfahren, bei dem eine hypotonische, saure, fluoreszierende Farbstofflösung und eine Lösung, die ihre Osmolarität und ihren pH-Wert ändert, verwendet werden. Eine mit diesen Lösungen gefärbte Blutprobe wird in ein Durchflußzytometer gegeben, wodurch man Signale für Fluoreszenzlicht und seitliches Streulicht erhält. Auf der Basis dieser Signale wird ein zweidimensionales Diagramm gemäß der Darstellung in Fig. 2, bei dem die Fluoreszenzintensität gegen die Intensität von seitlichem Streulicht aufgetragen ist, erstellt, wobei die Leukozyten in der Probe in fünf Typen klassifiziert werden. Die Bezugszeichen 1-6 in Fig. 2 bedeuten die Populationen von Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen bzw. eine Rausch-Komponente.
Bei der ersten Version des Verfahrens unter Verwendung eines Durchflußsystems zur Klassifizierung und Zählung von Leukozyten stellt das Aufbrechen der Erythrozyten eine Vorbedingung dar, wobei es aber je nach der Blutprobe unmöglich ist, eine vollständige Lysis von Erythrozyten vorzunehmen, so daß in diesem Fall die Meßgenauigkeit beeinträchtigt sein kann.
Die in JP-B-853/1984 und Blood Cells, Bd. 6 (1980), S. 121- 140 beschriebenen Beispiele für die Durchflußzytometrie sind dadurch charakterisiert, daß Messungen zu einem Zeitpunkt, bevor die Farbstoffabsorption durch die Zellen ein Gleichgewicht erreicht, oder zu dem Zeitpunkt, an dem der Unterschied zwischen den Fluoreszenzintensitäten einzelner Leukozyten während des Färbevorgangs ein Maximum erreicht, durchgeführt werden. Jedoch unterscheidet sich die Zeitspanne, die zum Erreichen eines geeigneten Pegels der Fluoreszenzintensität in einer Probe, deren Leukozytenzahl sich bei einem von zwei Extremwerten befindet, erforderlich ist, von der Zeitspanne für eine normale Probe, so daß eine geeignete Anfärbungszeit für jede einzelne Probe gewählt werden muß. Ein weiteres Problem besteht darin, daß sich dieses Verfahren für die Leukozytenklassifizierung nur auf die differentielle Fluoreszenzintensität stützt und nicht notwendigerweise eine genaue Trennung zwischen unterschiedlichen Leukozytentypen, wie Lymphozyten und Monozyten, gewährleistet.
Die weiteren Beispiele für das zytometrische Verfahren, das in JP-A-20820/1975, J. Histochem. Cytochem., Bd. 24 (1) (1976), S. 396-411 und a. a. O., Bd. 25 (8) (1977), S. 976-989 beschrieben sind, haben den Nachteil, daß sie zahlreiche Bearbeitungsstufen beinhalten und die Färbung längere Zeit dauert und die Verwendung von Reagentien in einem komplexen System erfordern. Ferner ist bei der praktischen Durchführung dieser Verfahren eine sehr komplizierte und kostspielige Vorrichtung erforderlich, die drei Lichtquellen benötigt und die zur Messung von 6 Parametern befähigt ist. Ferner ist die Analyse einer so großen Anzahl von Parametern unvermeidlicherweise kompliziert und benötigt einen Analysator mit einer hohen Kapazität.
Sämtliche herkömmlichen Techniken der Durchflußzytometrie haben unter Einschluß des in JP-A-70166/1988 vorgeschlagenen Verfahrens ein gemeinsames Problem insofern, als der Nachweis mit einem Durchflußzytometer nicht möglich ist, wenn Neutrophile in einer Blutprobe abgestorben sind, wenn vor der Messung eine lange Zeitspanne verstrichen ist. Das in JP-A- 134958/1988 beschriebene Verfahren hat zum Ziel, abgestorbene Zellen zu erfassen, um eine korrekte Zählung von Neutrophilen zu erreichen, wobei es aber je nach der zu bestimmenden Probe gelegentlich unmöglich ist, eine Differenzierung von abgestorbenen Zellen zu erreichen. Das Problem stellt sich auch im Fall von beschädigten Zellen, da die Zone ihrer Verteilung sich mit der Verteilungszone intakter Zellen oder eines anderen Zelltyps vermischt, wodurch es unmöglich wird, eine vollständige Differenzierung zwischen den beiden Zellgruppen vorzunehmen. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, erfordern Messungen durch herkömmliche durchflußzytometrische Verfahren immer die Verwendung von frischen Blutproben.
Die vorliegende Erfindung wurde angesichts der geschilderten Umstände gemacht und hat die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, das zur korrekteren Klassifizierung von Leukozyten befähigt ist, unabhängig vom Unterschied zwischen den Proben und vom Vorliegen von Zellen, die aufgrund einer geschädigten Zellmembran oder aus anderen Gründen in Positionen verteilt sind, die sich von den Positionen, die sie unter normalen Umständen einnehmen, unterscheiden. Das Verfahren ermöglicht eine genaue Klassifizierung und Zählung von Leukozyten durch einfache Maßnahmen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten beruht auf der Durchflußzytometrie unter Verwendung einer ersten Flüssigkeit, bei der es sich um eine hypotonische, saure, fluoreszierende Farbstofflösung handelt, und einer zweiten Flüssigkeit, bei der es sich um eine Lösung handelt, die die Osmolarität und den pH-Wert der ersten Flüssigkeit verändert. Erfindungsgemäß wird ein fluoreszierender Farbstoff, der spezifisch Kerne von beschädigten Leukozytenzellen färbt, zu der ersten Flüssigkeit gegeben, und die dabei erhaltene Flüssigkeit wird für die Messungen verwendet. Die Analyse wird auf der Basis der erhaltenen zwei Arten von zweidimensionalen, miteinander in Korrelation gesetzten Diagrammen durchgeführt, wobei die Anzahl der Leukozytenzellen, die aufgrund einer beschädigten Zellmembran oder aus anderen Gründen in Positionen verteilt sind, die sich von den Positionen, die sie unter normalen Umständen einnehmen, unterscheiden, bestimmt wird, um die endgültigen Ergebnisse der Leukozytenklassifizierung zu erhalten.
Genauer ausgedrückt, wird ein dritter Farbstoff, wie PI (Propidiumiodid) oder EB (Ethidiumbromid) zu der ersten Flüssigkeit gegeben, und zwei Arten von zweidimensionalen Diagrammen werden in Korrelation zueinander gesetzt und analysiert, wobei in einem Diagramm die Intensität der roten Fluoreszenz gegen die Intensität von seitlich gestreutem Licht und beim anderen Diagramm die Intensität der grünen Fluoreszenz gegen die Intensität von seitlich gestreutem Licht aufgetragen ist. Dabei kann die Anzahl von denaturierten Leukozytenzellen, z. B. von Neutrophilen mit beschädigten Zellmembranen, die sich aufgrund verschiedener Faktoren, z. B. aufgrund einer längeren Zeitspanne nach der Entnahme der Blutprobe, in Positionen verteilen, die von den Positionen unter normalen Bedingungen abweichen, bestimmt werden.
Nachstehend sind Farbstoffe aufgeführt, die erfindungsgemäß in der ersten Flüssigkeit verwendet werden können:
Erster Farbstoff: Astrazongelb 3G
Zweiter Farbstoff: Acridinrot;
Rhodamin S;
Rhodamin 6G;
Rhodamin B,
Rhodamin 19-perchlorat;
Rhodamin 123;
Eosin Y;
Cyanosin;
Cresyl-Echtviolett;
Darrow-Rot;
Acronol -Phloxine FFS;
1,1'-Dimethylthiocarbocyanin;
1,1'-Diethylthiocarbocyanin;
1,1'-Diethyl-9-methylthiocarbocyaninbromid;
2-[γ-(1-Ethyl-4',5'-benzothiazolyliden)- propenyl]-1-ethyl-4,5-benzoxazoliumiodid;
Astrazonrot 6B;
C. I. Basic Violet 16;
2-(p-Dimethylaminostyryl)-1-ethyl-4,5- benzothiazoliumiodid;
2,4-Bis-(p-dimethylaminostyryl)-1-ethylpyridiniumiodid;
2,6-Bis-(p-dimethylaminostyryl)-1-ethylpyridiniumiodid;
Astrazonorange R
Dritter Farbstoff: Propidiumiodid;
Ethidiumbromid;
M-264.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Optik eines Durchflußzytometers, das für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden kann.
Fig. 2 ist ein zweidimensionales Diagramm der Intensität aer grünen Fluoreszenz gegen die Intensität des seitlichen Streulichts, das bei Messung an einer frischen Blutprobe (innerhalb von 6 h nach der Probennahme) unter Verwendung eines herkömmlichen Reagens, d. h. der ersten Flüssigkeit in Abwesenheit des dritten Farbstoffs, erhalten wird.
Fig. 3 ist ein zweidimensionales Diagramm der Intensität der grünen Fluoreszenz gegen die Intensität von seitlichem Streulicht, das bei der gleichen Messung erhalten wird, mit der Ausnahme, daß die Blutprobe für eine längere Zeitspanne, beispielsweise 20 h, bei Raumtemperatur belassen worden ist.
Fig. 4 stellt einen ersten Typ eines zweidimensionalen Diagramms der Intensität der grünen Fluoreszenz gegen die Intensität von seitlichem Streulicht dar.
Fig. 5 stellt einen zweiten Typ eines zweidimensionalen Diagramms der Intensität der roten Fluoreszenz gegen die Intensität von seitlichem Streulicht dar.
Fig. 6 stellt ein zweidimensionales Diagramm dar, das durch Fraktionieren des ersten Typs des in Fig. 4 dargestellten zweidimensionalen Diagramms erhalten worden ist.
Fig. 7 stellt einen zweiten Typ eines zweidimensionalen Diagramms dar, das für die drei Zelltypen innerhalb der Zone II von Fig. 6 erstellt worden ist.
Fig. 8 ist ein Diagramm zur Darstellung der zeitabhängigen Profile der relativen Zählergebnisse von fünf Leukozytentypen, das durch Durchführung der Analyse mit der ersten und der zweiten Flüssigkeit, wie sie im nachstehend beschriebenen Beispiel verwendet wird, erhalten worden ist.
Fig. 9 ist ein Diagramm zur Darstellung der Ergebnisse einer Leukozytenklassifizierung, die mit der herkömmlichen ersten Flüssigkeit durchgeführt worden ist, wonach sich die Analyse auf der Basis eines zweidimensionalen Diagramms der Intensität der grünen Fluoreszenz gegen die Intensität von seitlichem Streulicht anschließt.
Fig. 10 ist ein zweidimensionales Diagramm der Intensität der grünen Fluoreszenz gegen die Intensität des seitlichen Streulichts.
Fig. 11 ist ein zweidimensionales Diagramm der Intensität der roten Fluoreszenz gegen die Intensität des seitlichen Streulichts.
Fig. 12 ist ein weiteres zweidimensionales Diagramm der Intensität der grünen Fluoreszenz gegen die Intensität des seitlichen Streulichts.
Fig. 13 ist ein weiteres zweidimensionales Diagramm der Intensität der roten Fluoreszenz gegen die Intensität des seitlichen Streulichts.
Die erste und die zweite Flüssigkeit, die im erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden, genügen vorzugsweise den folgenden Bedingungen:

(a) Farbstoffkonzentration

Die Farbstoffe müssen in der ersten Flüssigkeit in solchen Konzentrationen enthalten sein, daß die sich durch Vermischen der ersten und der zweiten Flüssigkeit ergebenden Endkonzentrationen innerhalb der nachstehend dargelegten Bereiche liegen.
Basic Yellow 11 und Astrazonorange R sind handelsübliche Produkte, die von der Fa. Aldrich Chemical Company Inc. bzw. von der Fa. Tokyo Kasei K. K. bezogen werden können.
Wenn die Konzentration von Basic Yellow 11 oberhalb eines bestimmten Werts liegt, ist die von Basophilen ausgehende Fluoreszenzintensität höher als die von anderen Leukozytentypen und die Fluoreszenzintensität von Eosinophilen nimmt ebenfalls bei höheren Konzentrationen zu. Die Fluoreszenzintensitäten aufgrund von Lymphozyten, Neutrophilen und Monozyten sind praktisch unabhängig von der Konzentration an Basic Yellow 11. Daher kann zur Erzielung einer Differenzierung zwischen Basophilen und Eosinophilen einerseits und anderen Typen von Leukozyten andererseits aufgrund der Fluoreszenzintensität die Konzentration von Basic Yellow 11 auf 70-100 ppm und höher eingestellt werden.
Eine Trennung zwischen Rauschen und Fluoreszenzintensität von Lymphozyten/Neutrophilen ist bei Astrazonorange R- Konzentrationen von 100 ppm und darüber möglich. Eine gute Trennung kann bei Konzentrationen von 200 ppm und darüber erreicht werden. Bei Konzentrationen von 300 ppm und darüber kommt es zu einer wesentlichen Abflachung der Trennwirkung und die Fluoreszenzintensitäten von Basophilen und Eosinophilen nehmen geringfügig ab. Daher liegt im Hinblick auf die Erzielung einer wirksamen Trennung von Leukozyten vom Rauschsignal die Konzentration von Astrazonorange R vorzugsweise bei 300 ppm oder in der Nähe davon.
Ethidiumbromid ist ein Handelsprodukt, das von der Fa. Nacalai Tesque, Inc., bezogen werden kann. Beträgt die Konzentration an Ethidiumbromid 3 ppm (3 g/ml) und weniger, so ist das Erscheinungsbild von beschädigten Zellen in einer zweidimensionalen Darstellung nicht konsistent (sie treten in variablen Positionen auf). Oberhalb von 100 ppm nimmt das Signal/Rausch-Verhältnis (S/N-Verhältnis) des Signalnachweises ab (die Differenz zwischen einem Fluoreszenzsignal und dem Hintergrund wird so gering, daß eine wirksame Signalerfassung verhindert wird). Die gleiche Erörterung gilt für die Konzentration an Propidiumiodid.

(b) pH-Wert der ersten Flüssigkeit

Um die Lysis von Erythrozyten herbeizuführen, wird der pH- Wert der ersten Flüssigkeit vorzugsweise auf 5,0 und darunter eingestellt, jedoch muß der pH-Wert der ersten Flüssigkeit zur Verhinderung einer Koagulation von Blutplättchen mindestens 3,5 betragen.

(c) Puffer in der ersten Flüssigkeit

Beliebige Puffer mit einem pKa-Wert von etwa 4,5, wie Citrat, Maleat und Diglykolat, können in der ersten Flüssigkeit eingesetzt werden. Bei Diglykolsäure kommt es zu einer geringfügigen Abnahme der Fluoreszenzintensität von Basophilen, wenn die Konzentration von Diglykolsäure 5 mM und weniger beträgt. Auf der anderen Seite ist die Lysis von Erythrozyten unzureichend, wenn die Konzentration von Diglykolsäure 50 mM und mehr beträgt. Eine optimale Diglykolsäurekonzentration beträgt etwa 10 mM.

(d) Osmolarität der zweiten Flüssigkeit

Es gibt auch dann keine Veränderung des Trennungsmusters, wenn die endgültige Osmolarität der Farbstofflösung von 167 bis 387 mOsm/kg verändert wird, indem man die Menge eines Osmolaritätskompensationsmittels (z. B. Natriumchlorid), das der zweiten Flüssigkeit zugesetzt wird, verändert. Es ist empfehlenswert, die Osmolarität der zweiten Flüssigkeit so einzustellen, daß die endgültige Osmolarität der Farbstofflösung einen annähernd isotonischen Wert erreicht (280 mOsm/kg)

(e) Puffer in der zweiten Flüssigkeit

Beliebige Puffer mit einem pka-Wert im ungefähren Bereich von 8,5 bis 9,0, wie Borat, Tris und Tricin, können in der zweiten Flüssigkeit eingesetzt werden. Bei Verwendung von Tricin nimmt die Fluoreszenzintensität von Basophilen und Eosinophilen bei einer Tricinkonzentration von 50 mM und darunter ab. Eine bevorzugte Tricinkonzentration beträgt etwa 300 mM.
Erfindungsgemäß wird von Leukozyten nicht nur ein Fluoreszenzsignal sondern auch ein Seitenstreulichtsignal erzeugt. Das Fluoreszenzsignal spiegelt den zytochemischen Charakter der Leukozyten wider und hängt von der Wechselwirkung zwischen der Färbung und dem individuellen Leukozytentyp ab, wobei Signale unterschiedlicher Intensitäten von den Leukozyten erzeugt werden. Das rechtwinklige Streulichtsignal spiegelt die strukturelle Information eines einzelnen weißen Blutkörperchens wider. Je größer der Kern eines weißen Blutkörperchens ist und je mehr Granula in ihm vorhanden sind, desto größer ist die Lichtreflexion, die in der Zelle erfolgt, wodurch sich ein intensiveres Seitenstreulicht ergibt. Ein Lymphozyt enthält wenige oder gar keine Granula, so daß das von Lymphozyten erzeugte Streulicht das schwächste sämtlicher Leukozyten ist. Andererseits enthält ein Neutrophiler zahlreiche Granula und weist einen großen Kern auf, so daß er ein intensiveres Streulicht erzeugt. Eosinophile erzeugen ein Streulicht, dessen Intensität mit dem Streulicht von Neutrophilen vergleichbar ist. Monozyten und Basophile erzeugen Streulicht in einer Intensität in der Mitte zwischen dem Streulicht von Lymphozyten und Neutrophilen.
Daher lassen sich, wie nachstehend näher erläutert, durch Kombination eines Fluoreszenzsignals mit einem Seitenstreulichtsignal Leukozyten erfindungsgemäß in fünf Typen klassifizieren.
Ein spezielles Beispiel für die Optik eines erfindungsgemäß verwendeten Durchflußzytometers wird nachstehend unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben. Die in Fig. 1 dargestellte Optik wird in einem Durchflußzytometer zum Messen von Seitenstreulicht, roter Fluoreszenz und grüner Fluoreszenz verwendet. Die allgemein mit dem Bezugszeichen 10 bezeichnete Optik verwendet einen Argonionenlaser 12 als Lichtquelle und arbeitet bei einer Wellenlänge von 488 nm mit einer Leistung von 10 mW. Vom Laser 12 emittiertes Licht wird von einer zylindrischen Linse 16 gebündelt und erleuchtet eine durch eine Durchflußzelle 14 strömende Blutprobe.
Wenn die gefärbten Leukozyten in der Probe durch das Laserlicht bestrahlt werden, erzeugen sie Streulicht und Fluoreszenz. Das Seitenstreulicht und die Fluoreszenz werden von einer Kondensorlinse 18 gebündelt und gelangen durch eine Öffnung 20 auf einen dichroitischen Spiegel 22. Der dichroitische Spiegel 22 reflektiert das Seitenstreulicht 24 und läßt die Fluoreszenz 26 durch. Das am dichroitischen Spiegel 22 reflektierte Seitenstreulicht 24 wird in einer Photomultiplierröhre 28 erfaßt. Von den zwei Fluoreszenzarten 26, die den dichroitischen Spiegel 22 passieren, wird die rote Fluoreszenz 32 von einem dichroitischen Spiegel 30 reflektiert und die grüne Fluoreszenz 38 durch den Spiegel durchgelassen. Die reflektierte rote Fluoreszenz 32 passiert einen Farbfilter 34 und wird in einer Photomultiplierröhre 36 erfaßt. Die durchgelassene grüne Fluoreszenz 38 passiert einen Farbfilter 40 und wird in einer Photomultiplierröhre 42 erfaßt.
Erythrozyten in der Blutprobe erzeugen nur Fluoreszenz von einer sehr geringen Intensität, so daß wenn nur die Fluoreszenzintensität zu messen ist, Erythrozyten das Leukozyten-Zählergebnis nicht stören, selbst wenn Erythrozyten und Leukozyten gleichzeitig auftreten (d. h. wenn Erythrozyten und Leukozyten gleichzeitig den Detektorbereich passieren). Will man jedoch das Streulicht messen, so erzeugen Erythrozyten ein Streulicht, dessen Intensität mit der des von Leukozyten emittierten Streulichts vergleichbar ist, so daß es zu einer Störung des Leukozyten- Zählergebnisses kommt. In diesem Fall kann man gleichzeitig die Fluoreszenz und das Streulicht messen und als Leukozyten nur die Körperchen ansehen, die Fluoreszenz mit einer über einem bestimmten Niveau liegenden Intensität emittieren. Wenn jedoch Leukozyten und Erythrozyten gleichzeitig auftreten, so überlagert sich das Streulicht von Erythrozyten mit dem Streulicht von Leukozyten, wodurch eine genaue Messung des Streulichts von Leukozyten unmöglich wird. In der Optik 10 eines in Fig. 1 gezeigten Durchflußzytometers läßt man eine Blutprobe durch die Durchflußzelle 14 strömen, nachdem sie beispielsweise auf das 20-fache verdünnt worden ist, so daß die Wahrscheinlichkeit des gleichzeitigen Auftretens von Erythrozyten und Leukozyten verringert wird und die mögliche Störung durch Erythrozyten auf ein für die Praxis vernachlässigbares Niveau verringert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt insbesondere eine Verbesserung der Erfindung gemäß JP-A-134958/88 (Mitglied er Patentfamilie EP-A-0 268 766) (Beispiel 2, 2: 2-stufiges Verfahren) dar und wird nachstehend anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß das folgende Beispiel die Erfindung in keiner Weise beschränken soll.

Beispiel

Zwei Reagentien wurden hergestellt, deren Zusammensetzungen nachstehend angegeben sind. Beim ersten Farbstoff in der ersten Flüssigkeit handelte es sich um einen fluoreszierenden Farbstoff, der selektiv sowohl Eosinophile als auch Basophile färbt. Beim zweiten Farbstoff in der ersten Flüssigkeit handelte es sich um einen fluoreszierenden Farbstoff, der die Kerne von Leukozyten färbt. Der dritte Farbstoff in der ersten Flüssigkeit war ein fluoreszierender Farbstoff, der die Kerne von Leukozyten, die an der Zellmembran geschädigt waren, färbt.

Erste Flüssigkeit

Erster Farbstoff Basic Yellow 11 (Aldrich) 100 ppm
Zweiter Farbstoff Astrazonorange R (Tokyo Kasei) 330 ppm
Puffer Diglykolsäure-Natriumhydroxid 10 mM
Dritter Farbstoff Ethidiumbromid 5,5 ppm (vorzugsweise 3-100 ppm)
pH-Wert 4,0; Osmolarität, 30 mOsm/kg
In der ersten Flüssigkeit bindet EB (Ethidiumbromid) an ein G-C-Paar in DNA durch Interkalation, was auch für PI (Propidiumiodid) gilt.

Zweite Flüssigkeit

Puffer Tricin-Natriumhydroxid 300 mM
Mittel zur Einstellung der Osmolarität Natriumchlorid 750 mM
pH-Wert 9,8-9,9; Osmolarität, 2200 mOsm/kg
Unter Verwendung der auf diese Weise hergestellten ersten und zweiten Flüssigkeit wurden Fluoreszenz und Streulicht zur Leukozytenklassifizierung auf folgende Weise gemessen.
Zunächst wurde das Blut einer gesunden Person einer Antikoagulationsbehandlung unterzogen. 100 µm des auf diese Weise antikoagulierten Bluts wurden gleichmäßig mit 1800 µl der ersten Flüssigkeit vermischt. Nach Bewegen wurde das Gemisch etwa 20 Sekunden bei 25ºC inkubiert. Anschließend wurden 200 µl der zweiten Flüssigkeit zugesetzt, und das Gemisch wurde bewegt, wonach etwa 40 Sekunden bei 25ºC inkubiert wurde. Die endgültige Probenlösung wies einen pH- Wert von 8,6-8,7 und eine Osmolarität von etwa 280 mOsm/kg (isotonisch) auf.
Auf diese Weise wurden Probenlösungen hergestellt, in denen die Erythrozyten lysiert und die verschiedenen Typen von Leukozyten gefärbt waren. Diese Probenlösungen wurden in ein Durchflußzytometer zur Messung der von den Leukozyten ausgehenden Intensitäten an Fluoreszenz und Streulicht gegeben.
Die Meßergebnisse sind nachstehend unter Bezugnahme auf die beigefügten Figg. 2-13 beschrieben.
Fig. 2 ist ein zweidimensionales Diagramm der Intensität der grünen Fluoreszenz gegen die Intensität des Seitenstreulichts bei Durchführung der Messungen mit einem herkömmlichen Reagens, wobei die erste Flüssigkeit keinen dritten Farbstoff enthielt. Die Bezugszeichen 1-6 im Diagramm bezeichnen die Verteilungszonen von Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen bzw. Erythrozyten-"Geistern". (Ein zweidimensionales Diagramm der Intensität der roten Fluoreszenz gegen die Intensität von Seitenstreulicht zeigte das gleiche Verteilungsmuster). Durch Trennen der einzelnen Verteilungszonen und Auszählen der Anzahl der darin enthaltenen Teilchen läßt sich die Zahl von Leukozyten eines bestimmten Typs erhalten. Durch Wiederholung dieses Vorgangs lassen sich die Anteile von unterschiedlichen Typen von Leukozyten bestimmen.
Das zweidimensionale Diagramm von Fig. 2 zeigt die Meßergebnisse an frischem Blut, das nicht mehr als 6 Stunden nach der Probennahme stehengelassen worden ist. Wird eine Blutprobe bei Raumtemperatur für eine längere Zeitspanne, beispielsweise 20 Stunden, vor der Messung stehengelassen, werden die Zellmembranen von Leukozyten beschädigt. Einige von ihnen teilen sich in einer Zone, die sich von der Zone unterscheidet, wo sich die fraglichen Zellen normalerweise befinden. Erfolgt die Verteilung derartiger Zellen innerhalb der Zone eines anderen Zelltyps, so vermindert dies die Präzision der Leukozytenklassifizierung. Der Einfluß der Überlappung zwischen zwei Verteilungszonen ist besonders groß, wie in Fig. 3 dargestellt, wenn ein Teil der Neutrophilenpopulation in der Zone von Monozyten verteilt ist. Bei Verwendung des herkömmlichen Reagens ergeben sich folgende zwei Arten von zweidimensionalen Diagrammen: Ein Diagramm, bei der die Intensität der grünen Fluoreszenz gegen die Intensität des Seitenstreulichts aufgetragen ist, und ein zweites Diagramm, bei dem die Intensität der roten Fluoreszenz gegen die Intensität von Seitenstreulicht aufgetragen ist. Damit gibt es gemäß der herkömmlichen Praxis in beiden zweidimensionalen Diagrammen eine bestimmte Zone, in der im wesentlichen keine Leukozyten verteilt sind, wenn das Blut frisch ist, während darin eine meßbare Anzahl von Leukozyten auftritt, wenn das Blut für längere Zeit stehengelassen worden ist. Die in dieser Zone auftretenden Zellen werden als abgestorbene neutrophile Zellen angesehen.
Jedoch gewährleistet diese Methode aufgrund verschiedener Faktoren, wie Variationen unter den Proben und unterschiedlicher Grad der Zellschädigung, nicht immer eine ausreichende Genauigkeit.
Im Hinblick auf diese Umstände wurde beim erfindungsgemäßen Verfahren das herkömmliche Reagens modifiziert. Dabei wird eine erste Flüssigkeit verwendet, der der dritte Farbstoff einverleibt ist. Dies hat sich als sehr wirksam im Hinblick auf eine Aufrechterhaltung einer hohen Genauigkeit der Leukozytenklassifizierung erwiesen. Das in diesem Beispiel eingesetzte Ethidiumbromid ist als Substanz bekannt, die abgestorbene Zellen färbt. Wurden jedoch die Messungen unter Verwendung einer Flüssigkeit durchgeführt, die nicht den ersten oder zweiten Farbstoff enthielt, sondern Ethidiumbromid als einzigen Farbstoff enthielt (die übrigen Herstellungsbedingungen entsprachen den vorstehend angegebenen Bedingungen), so wurden geschädigte Zellen auch in Blutproben, die zahlreiche geschädigte Leukozytenzellen enthielten, nicht erfaßt. Diese Tatsache geht aus den Figg. 12 und 13 klar hervor. Fig. 12 ist ein zweidimensionales Diagramm der Intensität der grünen Fluoreszenz gegen die Intensität von Seitenstreulicht. Fig. 13 ist ein zweidimensionales Diagramm der Intensität von roter Fluoreszenz gegen die Intensität von Seitenstreulicht. Offensichtlich waren geschädigte Leukozytenzellen in beiden Fällen nicht erfaßbar.
Bei Durchführung der Messungen an den gleichen Proben unter Verwendung der ersten Flüssigkeit, die nicht nur den dritten Farbstoff, sondern auch den ersten und den zweiten Farbstoff enthielt, konnten geschädigte Leukozytenzellen als deutlich sich von intakten Zellen unterscheidende Einheiten erfaßt werden. Figg. 10 und 11 sind zweidimensionale Diagramme: In Fig. 10 ist die Intensität der grünen Fluoreszenz gegen die Intensität von Seitenstreulicht und in Fig. 11 die Intensität von roter Fluoreszenz gegen die Intensität von Seitenstreulicht aufgetragen. Die geschädigten Leukozytenzellen sind in Fig. 11 eingekreist. Kurz zusammengefaßt, es ist von erheblicher Bedeutung, nicht nur den ersten und den zweiten Farbstoff, sondern auch den dritten Farbstoff in das Reagens zur Klassifizierung von Leukozyten einzuverleiben. Auf der Basis dieses wichtigen Befunds wurde die Erfindung fertiggestellt.
Die Verteilungszonen unterschiedlicher Leukozytentypen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung der vorstehend beschriebenen ersten Flüssigkeit erhalten werden konnten, sind nachstehend näher erörtert.
Fig. 5 ist ein zweites zweidimensionales Diagramm der Intensität der roten Fluoreszenz gegen die Intensität von Seitenstreulicht. Die Bezugszeichen 1-8 im Diagramm bedeuten die Zonen von Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen, Erythrozyten- "Geistern", Neutrophilen mit geschädigter Zellmembran bzw. Lymphozyten mit geschädigter Zellmembran. Fig. 4 ist ein erstes zweidimensionales Diagramm der Intensität der grünen Fluoreszenz gegen die Intensität von Seitenstreulicht. Das in Fig. 4 gezeigte Verteilungsmuster ist im wesentlichen das gleiche, wie es bei Verwendung der herkömmlichen ersten Flüssigkeit erhalten wird. Die Zone von Lymphozyten 8 mit geschädigter Zellmembran liegt innerhalb der Zone von intakten Lymphozyten 1, während die Zone von Neutrophilen 7 mit geschädigter Zellmembran sich innerhalb der Zone von Monozyten 2 befindet. Es ist darauf hinzuweisen, daß das erste zweidimensionale Diagramm (Fig. 4) ein Verteilungsmuster aufweist, das sich vom zweiten zweidimensionalen Diagramm (Fig. 5) unterscheidet. Eine genaue Leukozytenklassifizierung läßt sich durch Durchführung der Analyse mit den beiden Diagrammen, die miteinander in Korrelation gesetzt werden, durchführen.
Das spezielle Verfahren zur Datenanalyse ist nachstehend beschrieben. Die Verteilungszonen im ersten zweidimensionalen Diagramm, die sich klar voneinander unterscheiden, werden als solche getrennt. Was die nicht klar voneinander unterscheidbaren Zonen betrifft, wird das zweite zweidimensionale Diagramm zur Durchführung einer genaueren Trennung herangezogen.
Zunächst wird das zweidimensionale Diagramm (Fig. 4) gemäß der Darstellung in Fig. 6 in Fraktionen zerlegt. Die Zone I umfaßt sowohl intakte Lymphozyten 1 als auch geschädigte Lymphozyten 8. Die Zone II umfaßt Monozyten 2, intakte Neutrophile 3 und geschädigte Neutrophile 7. Die Zone III umfaßt Eosinophile 4. Die Zone IV umfaßt Basophile 5.
In der nächsten Stufe wird das zweite zweidimensionale Diagramm (vgl. Fig. 7) für die drei Typen von Zellen in Zone II, die nicht klar voneinander unterscheidbar sind, aufgestellt. Diese drei Typen von Zellen ergeben im ersten zweidimensionalen Diagramm keine unterschiedlichen Verteilungen, ergeben aber im zweiten zweidimensionalen Diagramm unterschiedliche Verteilungen. Dies ist der Grund dafür, daß die drei Typen von Zellen in der Zone II einer weiteren Trennung unterworfen werden, wie in Fig. VII gezeigt ist: Die Zone V umfaßt Monozyten 2, die Zone VI umfaßt intakte Neutrophile 3 und die Zone 7 umfaßt geschädigte Neutrophile 7. Durch Vereinigung der Zellen in den Zonen VI und VII erhält man die Gesamtzahl an Neutrophilen.
Somit lassen sich die Zahlen sämtlicher interessierender Leukozytentypen mit hoher Genauigkeit bestimmen.
Die Richtigkeit der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführten Leukozytenklassifizierung wird nachstehend erörtert.
Fig. 8 ist ein Diagramm, das die zeitabhängigen Profile der relativen Zählergebnisse von fünf Leukozytentypen bei Durchführung der Analyse mit der im fraglichen Beispiel verwendeten ersten und zweiten Flüssigkeit zeigt. Auf der horizontalen Achse ist die Zeit (in Stunden) aufgetragen, für die das Blut bei Raumtemperatur nach der Probennahme stehengelassen worden ist. Die Symbole im Diagramm haben die folgenden Bedeutungen: Neutrophile; + Lymphozyten; Monozyten; Δ Eosinophile; und x Basophile.
Wie Fig. 8 zeigt, blieben die Anteile der fünf Leukozyten- Zählergebnisse mehr als 20 Stunden nach der Probennahme stabil.
Fig. 9 ist ein Diagramm zur Darstellung der Ergebnisse der Leukozytenklassifizierung, die mit der herkömmlichen ersten Flüssigkeit durchgeführt wurde, wonach sich die Analyse auf der Basis des zweidimensionalen Diagramms der Intensität der grünen Fluoreszenz gegen die Intensität von Seitenstreulicht anschloß. Offensichtlich nahm etwa 8 Stunden nach der Probennahme der Anteil an Neutrophilen allmählich ab und der Anteil an Monozyten allmählich zu.
In dem fraglichen Beispiel wurde Ethidiumbromid als dritter Farbstoff verwendet. Es können aber auch Propidiumiodid und M-264 mit gleicher Wirksamkeit eingesetzt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzende erste Flüssigkeit enthält nicht nur den ersten und den zweiten Farbstoff, sondern auch den dritten Farbstoff. Dies gewährleistet, daß selbst Leukozyten mit einer geschädigten Zellmembran in einem zweidimensionalen Diagramm als Einheiten verteilt werden, die sich von anderen Leukozytentypen unterscheiden. Somit können geschädigte Leukozytenzellen unabhängig von Unterschieden zwischen den Proben und dem Grad der Zellschädigung in richtiger Weise erfaßt werden. Erfindungsgemäß werden endgültige Meßergebnisse erhalten, indem man die Erfassungsdaten analysiert. Somit ist eine Leukozytenklassifikation von hoher Präzision selbst in dem Fall möglich, wo Blut getestet wird, das aufgrund einer längeren Standzeit bei Raumtemperatur nach der Probennahme geschädigte Zellen enthält.

Claims

1. Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten durch Durchflußzytometrie, umfassend folgende Stufen (a) bis (e):

(a) Vermischen von Blut mit einer hypotonischen ersten Flüssigkeit, die einen ersten Farbstoff, bei dem es sich um einen fluoreszierenden Farbstoff, der zur selektiven Färbung sowohl von Eosinophilen als auch Basophilen befähigt ist, handelt, einen zweiten Farbstoff, bei dem es sich um einen fluoreszierenden Farbstoff, der zur Färbung der Kerne von Leukozyten befähigt ist, handelt, einen dritten Farbstoff, bei dem es sich um einen fluoreszierenden Farbstoff, der zur Färbung der Kerne von Leukozyten mit geschädigter Zellmembran befähigt ist, handelt, und einen Puffer zur Aufrechterhaltung eines pH-Werts im sauren Bereich enthält;

(b) Vermischen der in Stufe (a) erhaltenen Probenlösung mit einer zweiten Flüssigkeit, die einen Puffer, der die Säure in der ersten Flüssigkeit neutralisiert, um den pH-Wert der Lösung bei einem Färbe-pH-Wert zu halten, und ein Mittel zur Einstellung der Osmolarität der Lösung auf einen Wert, bei dem die Leukozyten in unveränderter Form verbleiben, enthält;

(c) Einsetzen der auf diese Weise vorbereiteten Probenlösung in einen Durchflußzytometer und Aufnehmen von mehr als einem Signal für die Parameter der Fluoreszenz und des Streulichts in Verbindung mit einzelnen Typen von Leukozyten;

(d) Erstellen eines ersten zweidimensionalen Diagramms der Intensitäten von zwei der von Leukozyten emittierten Signale; und

(e) Trennen der Verteilungszonen von einzelnen Leukozytentypen auf dem ersten zweidimensionalen Diagramm durch Festlegen der Verteilungszonen von Zellgruppen, die aufgrund eines bestimmten Faktors, wie des Zeitablaufs nach der Entnahme der Blutprobe, von den Zonen abweichen, an denen sie sich ansonsten befinden würden, Erstellen eines zweiten zweidimensionalen Diagramms der Intensitäten der beiden anderen Signale für die Zellgruppen in diesen festgelegten Zonen, Trennen dieser Zellgruppen mit abweichender Verteilung im zweiten zweidimensionalen Diagramm, wobei beim ersten zweidimensionalen Diagramm die Intensität der grünen Fluoreszenz gegen die Intensität von Seitenstreulicht aufgetragen ist und beim zweiten zweidimensionalen Diagramm die Intensität von roter Fluoreszenz gegen die von Seitenstreulicht aufgetragen ist, und Bestimmen der Zellzahl in den einzelnen Zonen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der dritte Farbstoff in der ersten Flüssigkeit aus der Gruppe Propidiumiodid, Ethidiumbromid und N-Methyl-4-(1-pyrenvinyl)-pyridiniumiodid ausgewählt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich beim ersten Farbstoff in der ersten Flüssigkeit um Astrazongelb 3G handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der zweite Farbstoff in der ersten Flüssigkeit aus folgender Gruppe ausgewählt wird:

Acridinrot;

Rhodamin 5;

Rhodamin 6G;

Rhodamin B;

Rhodamin 19-perchlorat;

Rhodamin 123;

Eosin Y;

Cyanosin;

Cresyl-Echtviolett;

Darrow-Rot;

Acronol-Phloxine FFS;

1,1'-Dimethylthiocarbocyanin;

1,1'-Diethylthiocarbocyanin;

1,1'-Diethyl-9-methylthiocarbocyaninbromid;

2-[γ-(1'-Ethyl-4',5'-benzothiazolyliden)- propenyl]-1-ethyl-4,5-benzoxazoliumiodid;

Astrazonrot 6B;

Basic Violet 16;

2-(p-Dimethylaminostyryl)-1-ethyl-4,5- benzothiazoliumiodid;

2,4-Bis-(p-dimethylaminostyryl)-1-ethylpyridiniumiodid;

2,6-Bis-(p-dimethylaminostyryl)-1-ethylpyridiniumiodid; und

Astrazonorange R.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei den im ersten zweidimensionalen Diagramm festgelegten Zonen um die Verteilungszonen von Monozyten und Neutrophilen handelt und wobei Monozyten, intakte Neutrophile und Neutrophile mit geschädigter Zellmembran im zweiten zweidimensionalen Diagramm voneinander getrennt werden.