DE69532511T2

DE69532511T2 - Verfahren zur schnellen und gleichzeitigen analyse nukleierter roter blutzellen

Info

Publication number: DE69532511T2
Application number: DE69532511T
Authority: DE
Inventors: Ran Young KIM; W. Michael YEE; N. Suresh MEHTA; C. Josefino SAGALA; Johanna Kantor
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1994-12-15
Filing date: 1995-11-28
Publication date: 2004-11-11
Anticipated expiration: 2015-11-29
Also published as: DE69532511D1; US5559037A; CA2207396C; EP0797762A1; JPH10504398A; CA2207396A1; ES2215181T3; WO1996018878A1; EP0797762B1; ATE258677T1; JP2938976B2

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Differenzierung und genauen Zählung von nukleierten roten Blutkörperchen (nucleated red blood cells, „NRBC") in einer Vollblutprobe. Speziell bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren für die gleichzeitige Differenzierung und Zählung von Subpopulationen von „NRBC" und weißen Blutkörperchen (white blood cells, „WBC") in einer Vollblutprobe mittels Verwendung von zwei Lichtstreuungs-Parametern und von Fluoreszenz.
Die Vorgänge, die mit dem Beginn von Anämie zusammenhängen, müssen sorgsam überwacht werden. Das hämatologische Labor bietet einen Satz an Routine- oder Standardverfahren an, die für die Diagnose der Anämie relevant sind. Die wichtigsten dieser Verfahren sind das komplette Blutbild (das auf einem automatischen Blutkörperchen-Zähler durchgeführt wird), Blutausstrich-Morphologie und der Retikulozyten-Bildungsindex. Die NRBC Zählungen werden konventionell mit Hilfe der Blutausstrich-Morphologie bestimmt. Ein gefärbter Blutausstrich wird unter dem Mikroskop untersucht und die NRBC werden manuell gezählt. Im allgemeinen wird eine NRBC Konzentration als die Anzahl der NRBC pro 100 weiße Blutkörperchen („WBC") angegeben. Normalerweise werden 200 WBC und die Anzahl der NRBC, die sich in derselben Region des Blutausstriches eines Patienten befinden, gezählt, und die Zahlen werden durch 2 geteilt, um die NRBC Konzentration als die Anzahl der NRBC/100 WBC auszudrücken. Der Hauptnachteil dieser Art des manuellen mikroskopischen Verfahrens ist, dass es sehr arbeitsintensiv, zeitverbrauchend, subjektiv und ungenau ist, aufgrund dürftiger Statistiken. Deshalb wurde von Pathologen und Labortechnikern lange nach einem genauen automatisierten NRBC-Verfahren gesucht.
Ein wesentliches Problem bei der Automatisierung eines NRBC-Verfahrens für die Verwendung in einem klinischen Durchfluss-Zytometer war es dass, da NRBC seltene Ereignisse sind und RBC Populationen so zahlreich sind, die NRBC Populationen unter der Population der roten Blutkörperchen (red blood cells, „RBC") nicht leicht detektiert werden, weder durch die Unterschiede im elektrischen spezifischen Widerstand der Zelle (Impedanzmessungen) noch durch ihre Lichtstreuungs-Eigenschaften (optische Messungen). Obwohl viele Versuche unternommen worden sind, die NRBC mitten unter WBC Populationen zu zählen, statt unter einer RBC Population, waren diese Bestrebungen im allgemeinen nicht erfolgreich.
Die NRBC Populationen werden nicht leicht von WBC Populationen unterschieden, weil die NRBC bei den gewöhnlichen Differenzierungsverfahren im zweidimensionalen Raum, die bei Durchfluss-Zytometern verwendet werden, kein gut definiertes Cluster unter den WBC bilden. Man ist im allgemeinen nicht in der Lage, NRBC Populationen von den Lymphozyten Populationen zu trennen, wenn die detektierten Signale auf den allgemein anerkannten zweidimensionalen Lichtstreuungs- (vorwärts versus seitlich) oder Lichtstreuung versus Absorption-Punkte-Plots betrachtet werden. Üblicherweise sind die Signale der meisten NRBC Populationen mit den Signalen für RBC Stroma und Blutplättchen („PLT") vermischt und das obere Ende des NRBC Cluster wird sich meistens in den Raum erstrecken, der von der Lymphozyten Population besetzt ist.
Die automatischen, klinischen Hämatologie-Instrumente, wie das Technicon H*1^®, das Coulter STK^® und das Abbott Cell-Dyn^® 3000 und 3500, „markieren" nur die Proben auf das mögliche Vorhandensein von NRBC, falls der Punkte-Plot der Probe erhöhte Geräuschsignale unter dem Lymphozyten-Cluster zeigt. Diese Art von Markierung erzeugt sehr oft falsche positive Ergebnisse, weil das erhöhte Geräuschniveau durch PLT Klumpen, Riesen-PLT oder unvollständig lysierte RBC hervorgerufen werden könnte. Außerdem ist es aufgrund der Interferenz besonders schwierig genaue Gesamt-WBC- und WBC-Differential-(„WBC/Diff")Ergebnisse mit Proben, die NRBC enthalten, zu erhalten. Zusätzlich müssen Blutabstriche der markierten Proben von einem erfahrenen Laboranten unter dem Mikroskop untersucht und gezählt werden, um genaue WBC Differential- und NRBC-Zählungen zu erhalten. Dies ist ein sehr arbeitsintensives und subjektives Verfahren.
Kürzlich wurde U.S. Patent # 5.298.426, am 29 März 1994 für Inami et al. erteilt. Dieses Patent zeigt ein zwei-Schritt-Verfahren, das die Färbung von WBC und NRBC mittels spezifischer nuklearer Farbstoffe umfasst. In diesem patentierten Verfahren wird eine Blutprobe zuerst mit einer sauren hypotonen Lösung vermischt, die einen fluoreszierenden nuklearen Farbstoff enthält. Dann wird eine Lösung, die einen alkalischen Salzpuffer umfasst, um den pH-Wert und die Osmolarität einzustellen, mit der Probe/erstes Reagens-Lösung vermischt. Diese Endlösung wird dann in einen Durchfluss-Zytometer geladen, um NRBC zusammen mit anderen nukleierten Zellen zu detektieren und zu zählen.
Es gibt mehrere Gründe, warum der Inami et al. Ansatz nicht annehmbar ist, insbesondere für ein automatisiertes Verfahren. Erstens beschädigt eine sauer-hypotone Lösung alle Zellmembranen, wobei alle WBC undicht gemacht werden, und somit ist die selektive Färbung der NRBC Nuklei durch einen nuklearen Farbstoff nicht möglich. Es gibt keine bekannten Farbstoffe, die nur NRBC Nuklei färben und keine WBC Nuklei, weil das nukleare Material (DNA) das gleiche ist. Der von Inami et al. beanspruchte Farbstoff, Propidiumiodid, ist ein gemeinhin verwendeter nuklearer Vitalfarbstoff, der die Nuklei abgestorbener Zellen färbt, durch Permeieren der beschädigten Zellmembran und sich in die DNA-Helix eines jeden Nukleus einlagern, nicht nur an den NRBC Nukleus. Zweitens trennt oder unterscheidet das Verfahren nicht die Fluoreszenzsignale der NRBC Nuklei von denen anderer nuklearer Reste, wie Howell-Jolly Körper, basophile Tüpfelung, RNA von lysierten Retikulozyten und retikulierten Blutplättchen, und DNA von WBC und Megakaryozytenfragmenten. Drittens erfordert das Inami et al. Verfahren, dass die Probe vorbehandelt wird, off-line, unter Verwendung verschiedener Reagenzien, um die Probe zu „präp", bevor die präparierte Probe/Reagens-Lösung in das Instrument geladen werden kann.
Die Europäische Patentanmeldung 0 105 614 offenbart ein Verfahren zum Differenzieren von Blutkörperchen, ähnlich jenem das im Anspruch 1 bekannt gemacht wird. Dieses bekannte Verfahren benötigt jedoch die Behandlung der Blutprobe mit einem Oberflächen- oder zytoplasmatischen Farbstoff und es werden Signale für nur zwei Parameter erhalten, d. h. gestreutes Licht in einem ersten und einem zweiten Bereich von Streuwinkeln.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wird ein Verfahren zur gleichzeitigen und quantitativen Durchfluss-Zytometrie-Analyse von nukleierten roten Blutkörperchen und weißen Blutkörperchen in einer Vollblutprobe bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Zerstörung von RBC- und NRBC-Zytoplasma aus einem Aliquot einer Vollblutprobe, um die NRBC-Nuklei einem nuklearen Vitalfarbstoff auszusetzen und die Permeation des nuklearen Vitalfarbstoffs in die WBC zu minimieren, das Unterwerfen des gefärbten Aliquots durchflusszytometrischen Lichtmessungen, das Erhalten von mindestens einem Signal für Parameter, die gestreutes Licht in einem ersten und einem zweiten Bereich von Streuwinkeln und Fluoreszenz (FL) einschließen, das Bewerten der erhaltenen Signale durch Verwendung von kombinatorischer Logik, worin ein bewertetes Signal größer sein muß als die zweite Streusignalschwelle, während es gleichzeitig größer sein muß als entweder die erste Streusignalschwelle oder die FL-Schwelle {[(erstes Streuwinkelsignal ODER FL-Signale) UND zweites Streuwinkelsignal]}, die Konstruktion eines dreidimensionalen Plots von bewerteten Intensitätssignalen von Fluoreszenz und gestreutem Licht von den detektierten Signalen und die Differenzierung der NRBC und WBC aus dem konstruierten dreidimensionalen Plot und das Bestimmen der jeweiligen Anzahl von Zellen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine Vorrichtung für die gleichzeitige und quantitative Analyse von NRBC und WBC in einer Vollblutprobe bereitgestellt. Die Vorrichtung umfasst einen Durchfluss-Zytometer, um mindestens ein Signal für Parameter zu erhalten, einschließlich gestreutes Licht in einem ersten und einem zweiten Bereich von Streuwinkeln und Fluoreszenz (FL oder Fl) und eine dreifache Triggerschaltung, die die von dem Durchfluss-Zytometer erhaltenen Signale für die Digitalisierung bewertet, mittels UND/ODER Logik, worin ein bewertetes Signal größer sein muß als die zweite Streusignalschwelle, während es gleichzeitig größer sein muß als entweder die erste Streusignalschwelle oder die FL-Schwelle {[(erstes Streuwinkelsignal ODER FL-Signale) UND zweites Streuwinkelsignal]}.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur gleichzeitigen und quantitativen Analyse von nukleierten roten Blutkörperchen und weißen Blutkörperchen in einer Vollblutprobe bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Beseitigung von roten Blutkörperchen („RBC") und dem Zytoplasma der NRBC aus einem Aliquot einer Vollblutprobe, um die NRBC-Nuklei zu exponieren, die Färbung der NRBC-Nuklei mit einem nuklearen Farbstoff, während die Färbung der WBC minimiert wird, das Unterwerfen des Aliquots den Durchfluss-Zytometrie-Lichtmessungen, das Erhalten von mindestens einem Signal für Parameter, die die Extinktion von gestreutem Licht bei von etwa 0° bis etwa 1° (ALL), gestreutem Licht von etwa 3°–10° (IAS) und Fluoreszenz (Fl) einschließen, das Bewerten der erhaltenen Signale durch Verwendung von UND/ODER Logik, worin die Logik [(ALL Signale) ODER (Fl-Signale) UND (3°–10° Streusignale)] umfasst, die Konstruktion eines dreidimensionalen Plots aus bewerteten Intensitätssignalen von Fluoreszenz und gestreutem Licht von den detektierten Signalen und die Differenzierung der NRBC und WBC aus dem konstruierten dreidimensionalen Plot und das Bestimmen der jeweiligen Anzahl von Zellen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine Vorrichtung für die Durchfluss-Zytometrie für die quantitative Analyse von nukleierten roten Blutkörperchen und weißen Blutkörperchen in einer Vollblutprobe bereitgestellt. Die Vorrichtung umfasst einen Durchfluss-Zytometer, um mindestens ein Signal für Parameter zu erhalten, die gestreutes Licht bei von etwa 0° bis etwa 1° und von etwa 3°–10° und Fluoreszenz (Fl) einschließen, und eine dreifache Triggerschaltung, die die vom Durchfluss-Zytometer erhaltenen Signale für die Digitalisierung bewertet, mittels UND/ODER Logik, worin die Logik [(0° bis etwa 1° Streusignale) ODER (Fl-Signale) UND (3°–10° Streusignale)] umfasst, um Signale für eine weitere Verarbeitung zu validieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein schematisches Diagramm der Optik eines klinischen Durchfluss-Zytometers, der zur Implementierung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
2 ist ein Diagramm, das eine „gültige" dreifache Triggerschaltung zeigt.
Die 3A, 3B und 3C sind Zeichnungen der WBC-, NRBC-, RBC-Stroma und anderer Hintergrundgeräusch-Verteilung einer Vollblutprobe, die wie in BEISPIEL 1 beschrieben behandelt wurde, wobei Standard- oder normale Detektions-Trigger verwendet wurden.
4A, 4B und 4C sind Zeichnungen der WBC-, NRBC-, RBC-Stroma und anderer Hintergrundgeräusch-Verteilung einer Vollblutprobe, die wie in BEISPIEL 1 beschrieben behandelt wurde, wobei nur ein 0° bis etwa 1° Streuungs-axialer Licht-Verlust (axial light loss – ALL)-Trigger verwendet wurde.
5A, 5B und 5C sind Zeichnungen der WBC-, NRBC-, RBC-Stroma und anderer Hintergrundgeräusch-Verteilung einer Vollblutprobe, die wie in BEISPIEL 1 beschrieben behandelt wurde, wobei nur ein 3°–10° intermediärer -Winkelstreuungs(intermediate angle scatter – IAS)-Trigger verwendet wurde.
6A, 6B und 6C sind Zeichnungen der WBC-, NRBC-, RBC-Stroma und anderer Hintergrundgeräusch-Verteilung einer Vollblutprobe, die wie in BEISPIEL 1 beschrieben behandelt wurde, wobei nur ein Fluoreszenz (FL3) Trigger verwendet wurde.
Die 7A, 7B und 7C sind Zeichnungen der NRBC-Verteilung einer Vollblutprobe, die wie in BEISPIEL 1 beschrieben behandelt wurde, wobei ein höheres Trigger-Niveau für FL3 verwendet wurde als für den in 6 verwendeten Trigger, um die Rauschsignale zu eliminieren.
8 ist eine Zeichnung der WBC-, NRBC- und anderer Hintergrundgeräusch-Verteilung einer Vollblutprobe, die wie in BEISPIEL 1 beschrieben behandelt wurde, wobei zwei Trigger verwendet wurden, ALL und FL3, die elektronisch zusammenge"ODER"t wurden.
9A, 9B und 9C sind Zeichnungen der WBC- und NRBC-Verteilung einer Vollblutprobe, die wie in BEISPIEL 1 beschrieben behandelt wurde, wobei zwei Trigger verwendet wurden, ALL und FL3, die elektronisch mit dem Niveau des FL3 Triggers, der auf einen höheren Wert als in der 8 gesetzt wurde, zusammenge"ODER"t wurden.
10A, 10B und 10C sind Zeichnungen der WBC- und NRBC-Verteilung einer Vollblutprobe, die wie in BEISPIEL 1 beschrieben behandelt wurde, mit Triggern für ALL, IAS und FL3.
11A–11C zeigen die Punkte-Plot-Displays einer normalen Vollblutprobe, die wie in BEISPIEL 1 beschrieben behandelt wurde, wobei normale und Standard-Detektionstrigger verwendet wurden.
12A und 12B zeigen die Zytogramme einer abnormen Vollblutprobe mit NRBC, die wie in BEISPIEL 2 beschrieben behandelt wurde, wobei Standard- und normale Detektionstrigger verwendet wurden.
13A und 13B zeigen die Zytogramme einer abnormen Vollblutprobe mit NRBC, die wie in BEISPIEL 3 beschrieben behandelt wurde, wobei normale Detektionstrigger verwendet wurden.
14A–14C zeigen die Verteilungen einer Vollblutprobe, die 56 NRBC/100 WBC enthielt, wobei das dreifach-Trigger (ALL, FL3 und IAS)-Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wurde.
15A und 15B zeigen die Verteilungen einer anderen Vollblutprobe, die 140 NRBC/100 WBC enthielt, wobei ebenfalls das dreifach-Trigger (ALL, FL3 und IAS)- Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wurde.
16A und 16B zeigen die Ergebnisse von Linearitätsproben, die wie in BEISPIEL 6 beschrieben hergestellt und behandelt worden sind, wobei ein Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wurde.
17 ist der Korrelationsplot einer NRBC Zählung (Ordinate) eines automatischen Hämatologie-Analysators, wobei ein Verfahren der vorliegenden Erfindung und manuelle mikroskopische NRBC-Zählungen (Abszisse) verwendet wurden. Die Daten wurden, wie in BEISPIEL 7 beschrieben, bearbeitet.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich, in weitem Sinne, auf ein automatisches Verfahren zur gleichzeitigen Analyse von WBC/Diff und NRBC in einer Vollblutprobe, wobei ein einzigartiges dreifaches Trigger-Verfahren verwendet wird. Dieses Verfahren ermöglicht gleichzeitige genaue NRBC Zählungen und WBC/Diff Daten von einer Vollblutprobe, die NRBC enthält.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, dass die Signale von Debris (sowohl fluoreszierend als auch nicht-fluoreszierend) von dem dreifach-Trigger-Verfahren blockiert werden und die Signale, die unter den ALL Trigger, aber über den FL3 fallen, identifiziert und als NRBC gezählt werden können. Deshalb werden genaue NRBZ Zahlen, die im wesentlichen frei von Kontamination seitens fluoreszierender nuklearer Debris sind, erhalten. Mit Hilfe der Verfahren dieser Erfindung könnten auch fragile Stammzellen und tote Zellen detektiert werden.
In dem dreifach-Trigger-Verfahren ist es auch möglich gleichzeitig WBC/Diff und NRBC genau zu zählen, durch Mischen der Blutprobe mit einem Blutverdünner, der RBC schnell lysiert und WBC konserviert, und zu dem ein geeigneter nuklearer Farbstoff hinzugefügt worden ist, der freie Nuklei der NRBC färben wird. Solch ein Verdünner wird im U.S. Patent 5.516.695 offenbart.
Die Verdünner/Probe Mischung wird dann, im wesentlichen eine Zelle pro Zeiteinheit, durch eine beleuchtete optische Durchflusszelle hindurchgeleitet. Dieses verursacht, dass die Zellen das Beleuchtungslicht streuen und dass alle vorhandenen gefärbten Nuklei fluoreszieren. Die Signale des gestreuten und fluoreszierenden Lichts werden durch bekannte Mittel detektiert und mittels Verwendung des dreifach-Trigger-Verfahrens in Verknüpfung mit der Verarbeitung der detektierten Signale ist es möglich WBC, WBC/Diff und NRBC zu identifizieren und zu quantifizieren. Hierin wird ein Hämatologie-Analysator offenbart, von dem festgestellt wurde, dass er mit dem dreifach-Trigger-Verfahren dieser Erfindung besonders kompatibel ist.
Die gleichzeitige Analyse von WBC/Diff/NRBC kann automatisch, genau und schnell durchgeführt werden, ohne Störung durch andere Zelldebris, wie RNA von lysierten Retikulozyten, Howell Jolly Körper, retikulierte Blutplättchen, Riesenblutplättchen, DNA von WBC und megakaryozytischen Fragmenten, Parasiten und RBC Fragmenten. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass sie einen sehr hohen klinischen Wert darin hat, dass das Verfahren in einen klinischen Hämatologie-Analysator integriert werden kann, der routinemäßig auf WBC-, RBC- und Blutplättchen-Zahlen kalibriert. Solch ein System ist in der Lage, genaue WBC/Diff/NRBC Daten (Prozent wie auch absolute Zahlen) für klinische Blutproben zu erzeugen. Dieses war vorher nicht möglich.
Das dreifach-Trigger-Verfahren erlaubt auch die genaue Analyse von WBC/Diff in einer Blutprobe, die NRBC enthält, durch Subtrahieren der Signale, die als NRBC identifiziert worden sind von der Gesamtheit der WBC-Signale, bevor die WBC/Diff Analyse durchgeführt wird. Für die NRBC Färbung wird nur ein Farbstoff benötigt und die WBC/Diff Analyse kann durchgeführt werden mit Hilfe der Differenz in den Eigenschaften der Lichtstreuung bei den WBC-Unterklassen.
Die vorliegende Erfindung erreicht all die oben beschriebenen Ziele mit Hilfe eines dreifach-Trigger-Verfahrens in dem dreidimensionalen Raum von axialem Licht-Verlust (ALL), Intermediärer Winkelstreuung (IAS) und Roter Fluoreszenz (FL3).
Um dies zu erreichen werden ein oder mehrere Detektoren vorzugsweise in den Vorwärts-Lichtweg plaziert, um Vorwärts-Intermediäre-Winkelstreuung (IAS) und entweder Kleinwinkelvorwärtsstreuung (SAS) oder axialen Licht-Verlust (ALL, auch als Vorwärtsextinktion bekannt) zu messen. ALL ist im allgemeinen die Lichtenergieverminderung, verursacht durch eine Zelle, die vor einem Laserstrahl hindurchtritt und von einer Fotodiode detektiert wird. Der Lichtverlust ist im allgemeinen durch Streuung verursacht und wird definiert als die Lichtenergieverminderung, die einen Detektor auf dem Weg eines Laserstrahls erreicht, verursacht durch den Durchgang einer Zelle durch den Strahl (im allgemeinen wird ALL als ein Winkel von etwa 0° bis etwa 1° detektiert). Im Gegensatz dazu ist Kleinwinkelvorwärtsstreuung (small angle forward scatter – SAS) Lichtenergie, die einen Detektor außerhalb (aber innerhalb eines engen Winkels von etwa 1° bis 3°) des einfallenden Laserstrahls erreicht, verursacht durch die Streuung von einer Zelle, die durch den Strahl geht. Im allgemeinen wird ein Strahlenstop installiert, um zu verhindern, dass der Laserstrahl in den Detektor gelangt. Die ALL-Messsysteme fangen innerhalb des Einfallskegels der Laserbeleuchtung Licht auf, während Kleinwinkelstreuungs-Systeme Licht ausserhalb dieses Kegels auffangen. In ALL-Messsystemen ist das Signal von Interesse ein negatives Signal, das vom stationären Lasersignal subtrahiert wird, während in der Kleinwinkelvorwärtsstreuungs-Messung das Signal ein kleines positives Signal ist, das auf ein sehr niedriges Hintergrundslicht-Niveau aufgelegt ist. Intermediäre Vorwärts-Winkelstreuung (IAS) ist der Kleinwinkelvorwärtsstreuung ähnlich, außer dass das Licht in einem weiteren Winkel von dem einfallenden Laserstrahl gestreut wird. Konkreter bezieht sich IAS auf Licht, das in einem Ring zwischen etwa 3° und 10° weit vom Einfall oder der Mittellinie eines Laserstrahls gestreut wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ALL in Winkeln, kleiner als etwa 0,3° waagerecht und weniger als etwa 1,2° senkrecht von der Laserachse aufgefangen, und IAS wird bei Winkeln zwischen etwa 3° und 10° von der Laserachse aufgefangen.
Ein anderer technischer Vorteil des offenbarten Systems ist, dass es eine viel niedrigere Konzentration an Farbstoff benötigt, um für eine genaue Detektion und Zählung NRBC wirksam und schnell zu färben, weil die komplette Lyse des NRBC-Zytoplasmas ihre Nuklei dem Farbstoff gegenüber zugänglicher macht. Dieser Zustand erlaubt in der Detektion der NRBC ein hohes Signal-Rausch (S/N)-Verhältnis, größer als 100. Die Konzentration eines vitalen Farbstoffs, die dieses System benötigt, um die gleichzeitige Analyse von WBC/Diff/NRBC schnell durchzuführen, ist nur 1 bis 2 μg/ml, was mindestens 50-fach weniger ist als die im Stand der Technik.
Die vitalen Farbstoffe (Nuklearfarbstoffe, die nur tote oder beschädigte Zellen färben) die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können jeder vitale Farbstoff mit relativ hohem Extinktionskoeffizienten und niedriger Fluoreszenzintensität sein, wenn er nicht an eine Nucleinsäure gebunden ist. Die Spektraleigenschaften, d. h. Extinktion (EX) max. (nm)/Emission (EM) max. (nm), der vitalen Farbstoffe müssen mit der im System verwendeten Laserlichtquelle kompatibel sein.
Für die vitalen Farbstoffe für das offenbarte System sind folgende Eigenschaften erwünscht:
Hoher Extinktionskoeffizient
Hohe Quantenausbeute
Hohe Bindungsaffinität zu Nucleinsäuren
Niedrige Fluoreszenz wenn er nicht an Nucleinsäuren gebunden ist
Lichtquellen-Kompatibilität der Spektraleigenschaften.
(z. B. EX max. ~488 nm und EM max. ~630 nm mit einer Argon-Laser-Lichtquelle.)
Es gibt eine Anzahl von Nuklearfarbstoffen, die für die Verwendung im offenbarten System mit der geeigneten Lichtquelle geeignet sind. Einige der im Handel erhältlichen Farbstoffe, die im offenbarten System verwendet werden können, sind YOYO-1, YOYO-3, TOTO-1, TOTO-3, BO-PRO-1, YO-PRO-1, TO-PRO-1 und viele andere. Jenen mit Erfahrung im Fachgebiet ist bekannt, dass die Farbstoffe mit unterschiedlichen EX max. mit geeigneten Lichtquellen, wie He-Ne-, Xenon- oder Quecksilber-Lampen angeregt werden können.
Geeignete Farbstoffe, die mit einem Argon Laser verwendet werden können, die ebenfalls im Handel erhältlich sind, sind Propidiumiodid (PI), Ethidiumbromid (Ebr), Ethidiumhomodimer-1 (EthD-1), Ethidiumhomodimer-2 (EthD-2) oder Diethylentriamin (DTA). In einer Anmeldung der vorliegenden Erfindung ist der verwendete Vitalfarbstoff PI. Um eine ein-Schritt gleichzeitige Analyse von WBC/Diff/NRBC bei etwa 42°C innerhalb einer Minute durchzuführen, wird ein Mehrzweck-Reagenssystem (US Anmeldung Serielle No. 08/297.662) verwendet, das einen pH-Wert von etwa 6,5, eine Osmolarität von etwa 260 hat und einen Acetatpuffer (etwa 15 mM), Ammoniumchlorid (etwa 5,0 g/l), Kaliumbikarbonat (etwa 2 g/l), Saponin (etwa 100 mg/l) und Formaldehyd (etwa 0,07%) enthält.
Ein bekannter automatischer Hämatologie-Analysator verwendet, unter anderen, ALL und IAS Lichtstreuungs-Signale, wie auch verschiedene fluoreszierende Signale, um Zellen und Zell-Unterklassen aus einer Vollblutprobe zu unterscheiden. Die folgende Beschreibung wird durch diesen Hämatologie-Analysator definiert. Solch eine Beschreibung dient nur der Bequemlichkeit und die vorliegende Erfindung ist auf keinen Fall auf nur ein einziges Instrument begrenzt.
Ein Teil einer Vollblutprobe, etwa 25 Mikroliter, wird mit Hilfe einer Probenansaugungs-Sonde in einen WBC-Behälter aufgetragen, die etwa 850 Mikroliter eines isotonischen Lysereagens enthält. Zur Lyse der Erythrozytenfraktion der Vollblutprobe und zur Lyse des NRBC-Zytoplasmas, um die Nuklei aller vorhandenen NRBC zu exponieren, wird ein Lysereagens verwendet. Außer dass es die Erythrozytenfraktion des Bluts lysiert, muß das Reagens schonend genug sein, um die WBC-Fraktion zu schützen oder nicht zu beschädigen. Solch ein Lysereagens-System ist im US. Patent 5.516.695 offenbart.
Dieses Reagens-System ist dadurch gekennzeichnet, dass es einen ein Reagens/ein Schritt Prozeß umfasst, der Mehrzweck-Ziele erreicht. Dieses Reagens ist schonend genug, um die Morphologie aller fragilen weißen Zellen zu konservieren und gleichzeitig um alle roten Zellen wirksam zu lysieren. Diese beiden Ziele werden auch in hämoglobinopathischen Proben erreicht, was erforderlich machen könnte, dass die Lysezeit verlängert werden muß. Unabhängig von der mit dem dreifach-Trigger-Verfahren verwendeten Formulierung der Lyse, wird das Reagens zusätzlich eine niedrige Konzentration eines nuklearen Vitalfarbstoffs enthalten, oder wird damit kombiniert werden, der jedes NRBC, das im peripheren Blut vorhanden sein könnte, wirksam markiert. Vorzugsweise wird, zur Verwendung mit dem obigen Referenzanalysator, die Chemie der Lyse so konfiguriert sein, dass der Brechungsindex mit dem einer Mantellösung auf im wesentlichen weniger als 0,1% zusammen paßt.
Die Mischung aus Lysereagens und Probe wird normalerweise in dem oben erwähnten WBC-Behälter nur 11 Sekunden lang bleiben. Dort wird sie lysiert und bei 42°C ± 3°C gemischt. Zu diesem Zeitpunkt werden die Inhalte des WBC-Behälters direkt in eine optische Durchflusszelle 100 zur Detektion geleitet, siehe 1.
Das Meßverfahren beginnt sobald der Zellstrom durch die Durchflusszelle 100 fließt, wobei er durch die Zugabe von Lysereagens verdünnt worden ist, so dass die Zellen durch das vom Laser beleuchtete Volumen eine hinter der anderen passieren, in einem laminar fließenden Probenstrom, der von Verdünner/Mantellösung umgeben ist. Das beleuchtete Volumen ist in den zwei Dimensionen begrenzt, normal zur Flußachse durch den hydrodynamisch fokussierten Zellstrom und in der Dimension parallel zur Flußachse durch den senkrechten Strahlenbund des Laserstrahls, der etwa 17 Mikron beträgt. Führt man diesen Test durch, ist die Probenfließgeschwindigkeit etwa 2,5 Mikroliter pro Sekunde und das entsprechende beleuchtete Abtastvolumen der WBC und NRBC Zellen nähert sich einem elliptischen Zylinder an, mit den Maßen von etwa 80 × 5 × 17 Mikrons. Die 17 Mikron Abmessung wird dem Zylinderachse entlang gemessen.
Zu diesem Zeitpunkt und wie in 1 gezeigt, wird das Vorhandensein einer Zelle von einer Verbundfotodiode 102, die axialen Lichtverlust (ALL) und intermediäre Winkelstreuung (IAS) detektiert, einem Photomultiplier 104, der rote Fluoreszenz detektiert und einer einzigartigen dreifach-Trigger-Schaltung, die in 2 gezeigt wird, im dreidimensionalen Merkmalraum von ALL, IAS und FL3 (rote Fluoreszenz) detektiert. Die dreifach-Trigger-Schaltung bewertet Signale für die Digitalisierung mit Hilfe der UND/ODER Logik. Ein geeignetes Signal muß größer als der IAS Trigger sein, während es gleichzeitig größer als entweder der ALL Trigger oder der FL3 Trigger sein muß. Die Kombination dieser einzigartigen Trigger-Schaltung und der Lyseeigenschaften, die ein ausgewogenes Fixierungsmittel einschließen, ermöglichen, dass die NRBC Nuklei schnell gefärbt und klar und eindeutig gezählt werden und aus der WBC Differential-Zellzählung ausgeschlossen werden, ohne die übliche Störung vom Hintergrund, sowohl fluoreszierend als auch nicht-fluoreszierend, wie DNA-Fragmente, RBC-Stroma und Plättchen.
Einer oder mehrere Detektoren werden vorzugsweise in den vorderen Lichtweg platziert, um vorwärts – intermediäre – Winkelstreuung (IAS) und entweder Kleinwinkelvorwärtsstreuung (SAS) oder axialen Lichtverlust (ALL, auch bekannt als Vorwärtsextinktion) zu messen. ALL ist im allgemeinen die Lichtenergieverminderung, verursacht durch eine Zelle, die vor einen Laserstrahl läuft und von einer Fotodiode detektiert wird. Im allgemeinen wird der Lichtverlust durch die Streuung verursacht und als die Lichtenergieverminderung definiert, die den Detektor im Weg eines Laserstrahls erreicht, verursacht durch den Durchlauf einer Zelle durch den Strahl (im allgemeinen wird ALL bei einem Winkel von etwa 0° bis etwa 1° detektiert). Im Gegensatz dazu ist Kleinwinkelvorwärtsstreuung (SAS) Lichtenergie, die einen Detektor außerhalb des einfallenden Laserstrahls (aber innerhalb eines engen Winkels von. etwa 1°C bis 3°) erreicht, verursacht durch Streuung von einer Zelle die den Strahl durchläuft. Im allgemeinen wird ein Strahlenstop installiert, um zu verhindern, dass der Laserstrahl in den Detektor gelangt. Die ALL-Messsysteme fangen innerhalb des Einfallskegels der Laserbeleuchtung Licht auf, während Kleinwinkelstreuungs-Systeme Licht ausserhalb dieses Kegels auffangen. In ALL-Messsystemen ist das Signal von Interesse ein negatives Signal, das vom stationären Lasersignal subtrahiert wird, während in der Kleinwinkelvorwärtsstreuungs-Messung das Signal ein kleines positives Signal ist, das auf ein sehr niedriges Hintergrundslicht-Niveau aufgelegt ist. Intermediäre Vorwärts-Winkelstreuung (IAS) ist der Kleinwinkelvorwärtsstreuung ähnlich, außer dass das Licht in einem weiteren Winkel vom einfallenden Laserstrahl gestreut wird. Konkreter bezieht sich IAS auf Licht, das in einem Ring zwischen etwa 3° und 10° weit vom Einfall oder der Mittellinie eines Laserstrahls gestreut wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ALL in Winkeln kleiner als etwa 0,3° waagerecht und kleiner als etwa 1,2° senkrecht von der Laserachse aufgefangen, und IAS wird bei Winkeln zwischen etwa 3° und 10° von der Laserachse aufgefangen.
Wenn derart getriggerte Zellen das vorhin erwähnte beleuchtete Volumen passieren, werden bei den Detektoren 102, 104, 106 und 108 Impulse erzeugt. Die Amplituden dieser Impulse werden dann gefiltert, amplifiziert, digitalisiert und in Listenmodus gespeichert, im entsprechenden fünfdimensionalen Merkmalraum von ALL, IAS, FL3, PSS (polarisierte Seitenstreuung) und DSS (depolarisierte Seitenstreuung). Die normale Zählzeit durch Durchflusszelle 100 ist 10 Sekunden. Bei den oben beschriebenen Flußrate und Verdünnungsverhältnis, mit einer WBC-Zahl von 7000 Zellen pro Mikroliter Blutvolumen eines normalen Patienten, würde die resultierende Ereigniszahlrate 5000 sein. In niedrig-Zahl Proben kann diese Zählzeit automatisch verlängert werden, um die Statistik der Messung zu verbessern. Am Ende der Meßzeit wird der Probenstrom zum Abfall geleitet und die Sonde wird gereinigt und getrocknet und für die Verarbeitung einer folgenden Probe vorbereitet.
Dann werden für die Listenmodusdaten des vorhin erwähnten Merkmalraums von ALL, IAS, FL3, PSS und DSS Algorithmen angewendet und innerhalb weniger als 30 Sekunden Verarbeitungszeit werden folgende Zelltypen gezählt und/oder markiert:
Die ALL- und IAS-Signale werden für die WBC/Diff Analyse detektiert und aufgefangen und FL3-Signale von gefärbten NRBC Nuklei werden für die NRBC-Analyse aufgefangen, wie weiter unten beschrieben. Die dreifach-Trigger-Schaltung, die in 2 gezeigt wird, bewertet diese Signale für die Digitalisierung mit Hilfe der UND/ODER Logik. Um bewertet zu werden, muß ein Signal größer als der IAS-Trigger sein, während es gleichzeitig größer als entweder der ALL-Trigger oder der FL3-Trigger sein muß.
Die verschiedenen Komponenten und die erzeugten oder verwendeten Signale, die in. 2 angegeben werden, entsprechen folgenden Bezeichnungen:

300: ALL Spannungskomparator (Voltage Comparator)
302: ALL Signal
304: ALL Schwellenspannung (Threshold Voltage – Vth1)
306: ALL Spannungskomparatorausgabe (Voltage Comparator Output)
310: FL3 Signal
312: FL3 Schwellenspannung (Threshold Voltage – Vth2)
314: FL3 Spannungskomparator (Voltage Comparator)
316: FL3 Spannungskomparatorausgabe (Voltage Comparator Output)
318: IAS Signal
320: IAS Schwellenspannung (Threshold Voltage – Vth3)
322: IAS Spannungskomparator (Voltage Comparator)
324: IAS Spannungskomparatorausgabe (Voltage Comparator Output)
326: ODER Gatter
328: ODER Gatterausgabe
330: UND Gatter
332: gültige Triggerausgabe

Von ihren entsprechenden Kanälen sind die Echtzeitsignale bei den Eingaben der Spannungskomparatoren vorhanden. Die Spannungskomparatoren 300, 314 und 322 funktionieren indem sie die „+ Eingaben" (302, 310 und 318) mit den „– Eingaben" (304, 312 und 320) vergleichen, das zu den resultierenden Ausgaben (306, 316, 324) führt. Wenn die „+ Eingabe" von höherer Spannung ist als die „– Eingabe", wird die Ausgabe hoch sein. Wenn die „+ Eingabe" von niedrigerer Spannung ist als die „– Eingabe", dann wird die Ausgabe niedrig sein.
Die Schwellenspannungen sind unabhängige Spannungen, die von den Systemparametern bestimmt werden.
Die Ausgaben der Komparatoren 300 und 314 sind Eingaben für das ODER Gatter 326, um die resultierende ODER Gatter Ausgabe 328 zu ergeben. Das ODER Gatter funktioniert durch den Vergleich seiner Eingaben. Die Ausgabe wird hoch sein, wenn eine der Eingaben oder beide hoch sind.
Die Ausgabe des ODER Gatters 328 und die Ausgabe der Komparatoren 322 und 324 sind Eingaben für das UND Gatter 330. Das UND Gatter funktioniert durch den Vergleich seiner Eingaben, um seine Ausgebe 332 abzuleiten, die ebenfalls die validierte Triggerausgabe ist. Die Ausgabe wird nur dann hoch sein, wenn beide Eingaben hoch sind.
Die gültige Triggerausgabe 332 wird nur dann hoch sein, wenn das IAS IAS Signal 318 größer ist als seine Schwellenspannung 320 und entweder oder beide, das ALL Signal 302 größer ist als seine Schwellenspannung 304 oder das FL3 Signal 310 größer ist als seine Schwellenspannung 312.
Mit Hilfe de obigen Triggerschaltung bilden die NRBC einen einzigartigen Cluster im vorhin erwähnten dreidimensionalen Raum, siehe 14 und 15, der im Laufe der Optischen WBC Differential-Analyse leicht gezählt werden und eindeutig von der WBC-Zählung ausgeschlossen werden kann. Somit wird eine Zahl von NRBC pro 100 WBC und eine absolute NRBC-Anzahl pro μl Patientenblut berichtet. Demzufolge werden NRBC von den Gesamt-WBC-Zahlen subtrahiert, wodurch eine genaue Gesamt-WBC- und Differential-Analyse beim Vorhandensein von NRBC in einer Blutprobe erlaubt wird. Das Hintergrundgeräusch, sowohl fluoreszierend als auch nicht-fluoreszierend, von DNA-Fragmenten, RBC Stroma, Plättchen, Howell-Jolly Körpern, basophiler Tüpfelung, RNA von lysierten Retikulozyten und DNA von WBC und Megakaryozytenfragmenten werden in wesentlichen eliminiert. Die gefärbten NRBC Nuklei werden von den verschiedenen Hintergrundrausch-Signalen mit Hilfe des offenbarten dreifach-Trigger-Verfahrens (auf ALL, IAS und FL3) getrennt und nur die FL3 + Signale von NRBC Nuklei oberhalb des FL3 Triggers auf dem ALL in Abhängigkeit von FL3 Punkte-Plot werden als NRBC gezählt.
In den 3 bis 10 entsprechen die Zellpopulations-Flächen, die von den weiter unten aufgelisteten Zahlen angegebenen werden, folgenden Zelltypen:

202: Lymphozyten
204: Monozyten
206: Granulozyten
208: Ursprung Rauschen
210: NRBC
212: Stroma

BEISPIEL 1
Ein EDTA-antikoaguliertes frisches Normalblut wurde auf einer experimentellen Einheit des oben beschriebenen automatischen klinischen Hämatologie-Analysators laufen gelassen.
Obwohl man die vorliegende Erfindung in den vorhin erwähnten Analysator inkorporierte, wurde sie nicht immer in allen der folgenden Beispiele verwendet. Fünfundzwanzig (25) Mikroliter der Blutprobe wurden online mit 675 Mikrolitern des isotonischen Mehrzweckreagens (pH 6,5, 260 mOsm/l), das im U.S. Patent 5.516.695 offenbart ist, gemischt.
Zum Zwecke dieser Experimente ist das Mehrzweckreagenssystem aus etwa 95 mM Ammoniumchlorid (5 g/l), etwa 0,075% Volumenanteile Formaldehyd, von etwa 10 mM bis etwa 20 mM Acetatpuffer, etwa 10 mM Kaliumbikarbonat und etwa 0,01% Gewicht/Volumen-Anteile (d. h. Gramm pro 100 ml) Saponin zusammengesetzt. Der pH-Wert des Reagenssystems wird im Bereich von etwa 6,2 bis etwa 7,0 eingestellt und die Osmolalität des Reagenssystems ist von etwa 215 bis etwa 270 mOsm/l.
Das Reagens wird in der beheizten Mischkammer des Instruments auf 42°C ± 3°C vorgewärmt, wo die Probe und das Reagens gemischt werden und 11 Sekunden lang inkubiert werden. Dann wurde diese Mischung zur Durchflusszelle transportiert (was 8 und 1/2 Sekunden dauert), zur WBC/Diff/NRBC Analyse. Die optische Konfiguration des Systems wird in 1 dargestellt. Die Analyse wurde ohne Implementierung der dreifach-Trigger-Schaltung durchgeführt; wobei nur ALL und FL3 Dualtrigger verwendet wurden, wie es im Fachgebiet üblich ist. Siehe alle Figuren, durchgehend von 3A bis 10C.
Die obige Punkte-Plot-Darstellung, 11A, bildet die Lichtstreuungs-Signale (ALL in Abhängigkeit von IAS) ab, die von der Probe erhalten wurden, und zeigt 3 getrennte WBC-Populationen. Der Basophile Cluster erscheint hier nicht, weil normales Blut nicht viele Basophile enthält. Der Eosinophile Cluster wird hier nicht gezeigt, weil Eosinophile über einen DSS in Abhängigkeit von. PSS Punkte-Plot (nicht gezeigt) getrennt werden, und das mittlere Zytogramm, 11B, ist eine Punkte-Plot-Darstellung aller ALL und FL3 Signale, wie markiert. Anmerkung: Normalblut enthält keine NRBC. Der unterer-Boden-FL3+ Cluster, 11B und 11C, besteht scheinbar aus Zelldebris, die RNA oder DNA enthalten, wie vorhin beschrieben.
BEISPIEL 2
Die 12A und 12B, oberes beziehungsweise unteres Zytogramm, sind Punkte-Plot-Darstellungen eines abnormen Bluts mit NRBC (47 NRBC/100 WBC), das wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert wurde, mit Hilfe eines Standard-Detektionsverfahrens. Der Cluster dicht unter der Lymphozytenpopulation im oberen Zytogramm gehört zu NRBC und der kleine Cluster am Boden, linke Ecke, gehört dem Ursprungs-Rauschen an, das RBC Stroma (Retikulozyten, Howell Jolly Körper usw.), Plättchen und WBC Debris enthält. Die 12B zeigt, dass der Ursprungs-Rausch-Cluster dieser Probe mit dem nuklearen Farbstoff hell gefärbt wurde, dem gefärbten MRBC Cluster sehr nahe in FL3 Kanal folgend, wodurch es unmöglich wird, den FL3 Trigger so zu setzen, dass die NRBC genau gezählt werden.
BEISPIEL 3
Die Zytogramme in 13A und 13B sind Punkte-Plot-Darstellungen eines abnormen Bluts mit NRBC (51 NRBC/100 WBC), das wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert wurde, mit Hilfe eines Standard-Detektionsverfahrens. Der Cluster dicht unter der Lymphozytenpopulation in der oberen Darstellung, 13A, gehört zu NRBC. Es kann ein erhöhtes FL3 Ursprungs-Rauschen dieser Probe gesehen werden. Der Rausch-Cluster befindet sich sehr nahe am NRBC Cluster im FL3 Kanal. Somit interferiert das FL3 Rauschen mit der Position des FL3 Trigger. Wenn der FL3 Trigger hoch genug gesetzt wurde, um das ganze Ursprungs-Rauschen zu eliminieren, ging ein Teil der NRBC-Population unter den FL3 Trigger ebenfalls verloren, wie in 13B gezeigt wird.
BEISPIEL 4
Die offenbarte dreifach-Trigger-Schaltung (ALL/IAS/FL3) der vorliegenden Erfindung wurde in das selbe Instrument inkorporiert, das in den fortlaufenden Beispielen 1 bis 3 verwendet worden war, und während dieses Verfahrens benutzt wurde.
Eine EDTA anti-koagulierte klinische Probe, die 56 NRBC/100 WBC enthielt, wurde wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Die Ergebnisse werden in den fortlaufenden 14A bis 14C dargestellt. Zu beachten ist das Verschwinden des FL3 Rausch-Clusters. Die Rausch-Signale werden durch den hinzugefügten IAS Trigger blockiert. Das fluoreszierende Ursprungs-Rauschen dieses abnormen Bluts ist oberhalb des FL3 Triggers nicht mehr sichtbar, obwohl der Trigger niedrig genug gesetzt wurde um die gesamte NRBC Population wiederherzustellen. (Zu beachten ist die runde Form des NRBC Cluster).
BEISPIEL 5
Die 15A und 15B zeigen die Punkte-Plot-Darstellungen der NRBC-Verteilung einer anderen klinischen Vollblutprobe, die 140 NRBC/100 WBC enthielt, auch nach der dreifach-Trigger (ALL, FL3 und IAS) Implementierung. Das Ursprungs-Rauschen ist nicht sichtbar und die gesamte NRBC Population wird oberhalb des FL3 Triggers wiederhergestellt. Zu beachten ist die hohe Dichte des NRBC-Clusters, wegen der sehr hohen Konzentration an NRBC in dieser Probe.
BEISPIEL 6
Es wurden Linearitäts-Proben hergestellt durch Zugabe verschiedener Konzentrationen an nicht fixierten Hühner-Erythrozyten zu einem EDTA anti-koagulierten normalen humanen Blut. Die Proben wurden wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt, wobei das dreifach-Trigger Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wurde. Im Verfahren der vorliegenden Erfindung lysiert das Zytoplasma der Hühner-Erythrozyten, wobei nur freie Nuklei übrigbleiben (CEN). Mit dem nuklearen Vitalfarbstoff (PI) färbten die CEN im Verdünner sehr schnell an und wurden fluoreszierend (FL3). Die FL3+ CEN werden als NRBC gezählt und als Anzahl von NRBC/100 WBC angegeben und als absolute Zählungen pro μl Vollblutprobe im Verfahren der vorliegenden Erfindung. Die Ergebnisse werden in den 16A und 16B dargestellt. Die Linearitätsplots von NRBC/100 WBC und NRBC in absoluten Zahlen in der Figur zeigen, dass das Verfahren der vorliegende Erfindung eine lineare NRBC Zählung erzeugt.
BEISPIEL 7
Die 17 zeigt den Korrelationsplot von NRBC Zählungen (Ordinate) von 85 klinischen Proben, der mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erhalten wurde. Die Ergebnisse wurden mit denen von manuellen mikroskopischen Referenz-Zählungen (Abszisse) korreliert. Für manuelle NRBC Zählungen wurde ein 200 Zellen WBC Differential mit jedem der Patienten-Blutausstriche, die mit Wright-Giemsa gefärbt wurden, durchgeführt und NRBC Zählungen, die in der gleichen Region vorhanden waren, wurden durch 2 geteilt, um NRBC/100 WBC zu berichten. Der Korrelationskoeffizient (R) ist 0,973 (R2 = 0,946), die Neigung ist 0,86 und der Y-Abschnitt ist 1,32.

Claims

Ein Verfahren zur Differenzierung von Normoblastenzellen (nucleated red blood cells = NRBC) von anderen Zellen durch Durchfluss-Zytometrie, das folgendes umfasst: a) Mischen eines Aliquots einer Blutprobe mit einem Reagenzsystem, worin das Reagenzsystem eine rote Blutzellen(RBC)-lysierende Komponente, eine Leukozyten-fixierende Komponente und eine nukleare Vitalfarbstoffkomponente umfasst, um die Nuklei der NRBC zu färben; b) durch eine Röhre leiten des gemischten Aliquots, im wesentlichen eine Zelle pro Zeiteinheit, durch einen optischen Anregungsbereich (100); c) Erhalten von mindestens einem Signal für jeden Parameter, einschließlich gestreutem Licht in einem ersten Bereich von Streuwinkeln und gestreutem Licht in einem zweiten Bereich von Streuwinkeln, und weiterhin einschließlich Fluoreszenz (FL); d) Bewerten der Signale, die erhalten werden, indem die Signale (302, 310, 318) einer logischen Prüfung unterworfen werden, worin ein bewertetes Signal (332) größer sein muss als eine zweite Streusignalschwelle (320), während es zur selben Zeit größer sein muss als entweder eine erste Streusignalschwelle (304) oder eine FL-Schwelle (312), worin die Schwellen durch System-Parameter bestimmt werden; e) Konstruieren eines dreidimensionalen Plots von Intensitätssignalen von FL, gestreutem Licht in einem ersten Bereich von Streuwinkeln und gestreutem Licht in einem zweiten Bereich von Streuwinkeln, anhand eines detektierten Signals; und f) Differenzieren der NRBC-Cluster und der weißen Blutzellen (WBC) in dem konstruierten dreidimensionalen Plot und den bewerteten Signalen, und Bestimmen der jeweiligen Anzahl an Zellen.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin der erste Bereich von Streuwinkeln von ungefähr 0° bis ungefähr 1° ist.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin ein erhaltener Signal-Parameter axialen Licht-Verlust (Axial Light Loss, ALL) umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin ein erhaltener Signal-Parameter Kleinwinkelvorwärtsstreuung (Small Angle forward Scatter, SAS) umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 3, worin der ALL bei einem Winkel von ungefähr 0° bis ungefähr 1° erhalten wird.
Das Verfahren von Anspruch 4, worin die SAS bei einem Winkel von ungefähr 1° bis ungefähr 3° erhalten wird.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin der zweite Bereich von Streuwinkeln von ungefähr 3°–10° ist.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin das nukleare Färbemittel gewählt ist aus der Gruppe von Vitalfarbstoffen bestehend aus Propidiumiodid (PI), Ethidiumbromid (Ebr), Ethidium Homodimer-1 (EthD-1), Ethidium Homodimer-2 (EthD-2) und Diethylentriamin (DTA).
Ein Durchfluss-Zytometer für die Differenzierung von Zellen aus einer Blutprobe, das eine Schaltung umfasst, die folgendes enthält: eine Vielzahl an Spannungskomparatoren (300, 314, 322), die die Signale mit den entsprechenden Schwellensignalen (304, 312, 320) vergleichen; und eine Vielzahl an logischen Gattern (326, 330), wobei die Schaltung so angeordnet ist, um eine logische Formel zu implementieren, um die Signale zu bewerten, dadurch gekennzeichnet, dass die Signale 0° bis ungefähr 1° Streusignale (302), 3°–10° Streusignale (318) und Fluoreszenz-Signale (310) sind, wobei die logische Formel definiert ist als [(0° bis ungefähr 1° Streusignale) ODER (Fluoreszenz-Signale)] UND (3°–10° Streusignale).