JPS59184841A - サンプル中の白血球のサブクラスを識別する方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は粒子体積、光散乱および螢光を同時（（ｉｌｌ
ｌ定することによりサンプル中の粒子類の複数のサブボ
ビ隆−ションを識別する方法によび装置、とりわけフロ
ーサイトメトリー法を用いろ血１夜試料中の白血球のサ
ズクラスを識別する方法および装置に関するものである
。

粒子類のフロー分析は夫々の粒子の諸特性の１ｊｉｌｌ
定に使用されてきた。この分析は血液学、免疫学等の研
究分野に役立つ情報迄得るために細胞の特性を分析する
の（（最も有用である。研究者はそれらの細胞を分類、
同定、定量したり、或いは更に調査分析するために分類
したりてきるように、夫々の細胞の特定の性質を測定す
ることに興味を持っている。細胞の他の特性もフロー分
析装置により電子装置にて決定できるけれども、６つの
重要な特性は細胞体積、光散乱および螢光である。

周知のコールタ−原理による細胞体積の測定は、それら
の細胞に関する体積分布の情報を与えろ。

例えば、実験を通して測定した細胞体積を知られている
体積の細胞と比較することにより研究者は実、験に係る
細胞を分類することができる。電子装置による細胞体積
測定がかなりの間行なわれてきたので、多（メ研究者達
は比較や分析のための著しい量の細胞体積のデータを（
積してきた。従って、細胞体積は研究者に大変有益なデ
ータを提供する細胞特性の一つである。

同様に、また細胞については特に、螢光は細胞の同定、
分類および一層の分析に寄与する一つの特性である。周
知の染色技術において、抗原あるいは抗体と結合した典
型的な生化学的螢光色素がある種の細胞に染料を結合す
る。螢光色素が励起すると、通常色スはクトルの特定の
領域で再放射したり或いは螢光を発する。適当な光学シ
ステムを用いれば、螢光性の結合染料に親和性を有する
夫々の細胞を励起後に発する螢光により検出できる。従
って、螢光もまた夫々の粒子、特に細胞の分析において
重要な特性の一つである。

細胞による光散乱もまた研究者達がＡｆｆｌｌ胞に関す
る情報を得ろために用いてきたパラメーターの一つであ
る。周知のフローサイトメトリー装置を通して流れろ細
胞は、光の入射ビームをあてると種々の角度に光を散乱
する。この散乱光は細、吻形状、屈折率、不透明度、粗
さ等の指標として用いられてきた。

フロー分析システムで粒子類の多数の侍冷を測定する゛
（あ″たって夫々の細胞の上記の特性に関する多くの測
定を同時に行なうことが望ましい。多くの特性を同時に
測定することによりシステムの電子的要素を簡略化でき
る。特に、測定を実質的に同時に行えれば、電子的分析
において後に使用するだめの種々の遅延回路類や情報の
保持が必要なくなる。更に、所望のパラメーターの同時
分析が達成できれば粒子分析の速度を向上することが可
能である。先行技術によれば動いている流れ内を流れて
いる粒子類の緒特性の測定用の多くの異なったシステム
が見出されている。

米国特許第６．７丁０．９３３号にはコールタ−型の孔
を通して細胞体積を測定し、次いで散乱（細胞の大きさ
に関する）および螢光を測定する装置が開示されている
。しかしながら、これらの測定は同時に行なわれずに、
電子的細胞体積測定と散乱および螢光についての光学測
定との間に時間のずれがある。

米国特許第３．７３８，７５９号ては懸濁中を流れる粒
子類の％性を測定するエピ−イルミネーションシステム
が開示されている。測定部における粒子類の流れは光学
軸に対して平行であり、測定部から懸濁液を洗い流すた
めに洗浄流が用意されている。測定部における粒子によ
り放出あるいは反射される光に関する粒子の緒特性が次
に分析されている。この発明には細胞の体積を測定する
手段Ｖま採られていない。

螢光と細胞体積の同時分析は米国特許第４ｙ１９８，１
６０号に記載されている。この発明において粒子の流れ
は光学軸に平行であり、液体の流れは次に測定オリフィ
スを通して最初の流れの方向に対して直角方向に変えら
れる。螢光の測定は粒子類の流れる道筋に沿って測定オ
リフィスに光を同軸上に導くことにより行なわれろ。

米国特許第４，１１０．６０４号には流れの中を流れて
いる粒子類を中心に向けて縮少する環状の外鞘流で包む
ことにより、流、（ｔの中心部に粒子を含むザンプル液
？集中させて閉じ込める方、去よりなる粒子密度の」１
］定システムの記載がある。

ＧｅｏｒＢｅ　Ｌ、　Ｖｉ’ｉｅｄ編、アカデミツクプ
レス、ニューヨーク、１９７０年の八ｕｔＯ，ｍａｔｅ
ｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉ−ｃａｔｉｏｎ　ａｎ
ｄ、　Ｃｅ１ｌ　５ｏｒｔｉ二＋ｇ中の１３１−１５９
頁のＲｏｂｅｒｔ　Ｃ，ＬｅｉｆによるＡ　Ｐｒｏｐｏ
ｓａｌ’　Ｆｏｒ　ａｎ　ＡｕｔａｍａｔｉｃＭｕｉｔ
ｉｐａｒａｍｅｔｅｒ　Ａｎａｌｙｚｅｒ’　ｆｏｒ、
ｃｅｌｌｓ　（ＡＭＡＣ）と題する一節に、著者は細胞
体積および光学的特性の分析用のマルチパラメーター分
析装置について述べている。この著者は光の測定法とし
て工１スコピックイルミネーションを提案している。

Ｔｂｏ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅ−ｍ託ｔｒｙ、　２
５巻、７号、８２７−８３５頁、１９７７年のＲｏんＴ
ｈ＠ｍａθらによるＣｏｍｂｉｎｅｄ　０ｐｔｉｃａｌ
　ａｎｄＥｌｅｃｔｏｎｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ
　Ｃｅ１ｌｓ　−ｖＶｉｔｈ　ｔｈｅ　ＡｌｖｆＡＣ［
’ｒａｎｓｄｕｃｅｒｓに、著者らは電極をその両側に
取付けた孔を用いる光学的および電子的測定の組み合わ
されたシステムについて述べている。このシステムは螢
光、不透明度および電子的細胞体積測定を同時に行なう
ことができるとされている。粒子類の流れは光学軸に直
角（（向けられており、レンズの焦点面（（おいてレー
ザービームをさえぎるようになっている。更に、螢光の
放出を集めるに開口数０６０を有する長い光路の対物レ
ンズが使用されている。しかしながら、著者らはデータ
の同時獲得１ておいて４番目のパラメーターとして光散
乱を将来加える可能性があることを示した。彼らは光散
乱分布が一群の明確な指標を与えつるか否かについての
疑問は未解決のままにしている。

米国特許第４，２８４，４１２号に血液中のリンパ球の
選んだサブクラスの細胞を同定および計測するための方
法および装置について記載がある。この方法および装置
では特定のサブクラスの細胞の同定・計測のため（で、
前方光散乱、直角方向光散乱および螢光のテークに頼っ
ている。細胞をフローサイトメトリー７０−セルを通過
させ、そこで光をあてて、特定のサブクラスの細胞にラ
ベルした螢光性の抗体を励起する。この発明（（は細胞
体積を測定する手段は為されていない。

人の免疫機能の状態を評価するには一般（′コリンバ球
のサブポピユレーションの測定が必要とされている。顆
粒球Ｃ顆粒白血球）および単核白血球は普通はリンパ球
のサブポピユレーション測定用のサンプルから除去され
なければならない。ヒトの白血球のサブクラスの分析に
おいて、リンパ球の同定用に現在用いられる方法はフロ
ーサイトメトリー法であり、その中のいくつかは上述し
た。

とりわけ公知のフローサイトメトリー装置は前方および
直角方向光散乱をおそら（螢光と一緒に用いてきた。現
在知られている方法を用いるとリンパ球と単核白血球と
の間にかなりの重なりが観察され、誤まってリンパ球数
を多く与えてしまう。

従って、血液サンプルから得られる白血球のさまざまな
サブポピユレーションをより正確に計６４１１　ｆるた
めに隣接したポピユレーションからリンパ球の分離を向
上する必要性がある。

このような改良の一例が本発明と同じ出願人による。１
９８１年６月２４日に出願された米国特許出願第２７６
．７３８号明細書に記載されている。この明細書におい
て、改良点は粒子体積および螢光のような光放射を同時
に分析する実用的かつ実現可能な装置に関するもの工あ
る。本発明は白血球のサメクラスをよりはつきりと識別
するため（（、とりわけ免疫機能の状態を評価するとき
に白血球を単核白血球および顆粒白血球から識別するた
めに上記特許出願に記載の発明を更に改良することを意
図している。

本発明の方法はサンプル中の粒子類の多くのサブポピユ
レーションを識別するものである。本法は粒子に向けら
れた光の領域を通して実質的に一度に一つずつサンプル
中の粒子類を通過させることを包含する。夫々の粒子の
体積は、粒子が光の領域を通過するときに同時に決定す
るのが好ましいが、必らずしも同時でなくてもよい。夫
々の粒子により散乱された光は粒子が光の領域を通過す
る時に光の方向に対して広い角度にわたって検出する。

粒子類の異なるサブポピユレーションは夫々の粒子の測
定した体積をその検知した光散乱と関連させろことによ
り識別する。

本発明のこの観点についての好ましい態様（でおいては
、本法は例えばリンパ球を単核白血球および顆粒白血球
から識別する場合のように、血液から得たサンプル中の
白血球のサブクラスを識別するものである。サンプル中
の白血球細胞類は白血球の流れの方向に対して実質的に
直角な軸方向から入射する照射ビームによる光の領域を
実質的に一度に一つずつ通過する。夫々の細胞の体積は
細胞が光の領域を流れる時に、この領域を流れる細胞に
関連した電気的インピーダンスの変化を検知することに
より決定する。夫々の細胞により散乱された光は、照射
ビームの入射軸に対して広い角度にわたって細胞が光の
範囲を通過する時に検出する。異なったサブクラスの白
血球細胞は夫々の細胞について測定した体積をその検出
した光散乱の関数として関連させることにより決定する
。

本発明のこの観点の別の態様においては、細胞のような
粒子類は一つ或いはそれより多い標識剤でラベルされる
。この標識剤は粒子か光の領域を通過する時に検知され
ろ。異なるサブポピユレーションの粒子は、体積の測定
、光散乱の検出、夫々の粒子と結合した標識剤の検知を
同時に行なうことによって識別されろ。

本発明の別の観点においては、この装置はサンプル中の
粒子類の複数のサブポピユレーションヲ識別する。この
装置は粒子に向けられた光の領域を通して実質的に一度
に一つずつサンプルの粒子を通過させる手段′を包含す
る。この手段は夫々の粒子の体積を、好ましくは粒子が
光の領域を通過する時に決定する。夫々の粒子により散
乱された光は、粒子が光の領域を通って流れる時（（、
光の方向に対して広い角度にわたって検出手段により検
知される。夫々の粒子の測定した体積を検出した広い角
度の光散乱と関連させることにより異なるサブポピユレ
ーションの粒子を識別する手段が用意されている。

本発明のこの観点の別の態様ではこの装置は粒子が標識
剤で標識されたサンプル中の粒子の複数のサブポピユレ
ーションを識別する。粒子が光の領域を通過する時に夫
々の粒子に結合した標識剤の有無、夫々の粒子の体積お
よび夫々の粒子による光散乱を同時に測定する手段が用
意されている。

異なるサブボヒ０ニレージョンの粒子は、測定した６つ
の上述のパラメーターのうち少なくとも２つを関係づけ
ることにより識別される。

本発明の原理によれば数多くの利益と目的が達成される
。第１に、本発明は白血球のサブクラスの分ｊ推を大い
に向上し、とりわけ、リンパ球を似た性質の単核白血球
や顆粒白血球からより明確に識別する。この大きな改良
は細胞体積の測定を夫々の細胞による広い角度の光散乱
と結びつけることにより達成される。更に、かつ重要な
ことに、本発明は細胞体積、ケイ光、および光散乱につ
いてのデータを同時に得られるよう設定されている。

従って、粒子のサブポヒ０ニレージョンを識別するため
に光散乱の関数として細胞体積に基づくことに加えて、
６番目のパラメーター、即ちケイ光を検出する。このパ
ラメータは関数を区別するのに助けとなる追加的なもの
として、あるいはコンピューター等に与える付加的なデ
ータ或いはその他として分析の目的に用いられる込加え
て、後述する好ましい実施例では、レーザーのような源
から得られるコヒーレント光のみならず、゛水銀アーク
ランプのような非コヒーレント性の光源も使用されうる
。本発明の装置は必要最少限の実、験台ス投−スにきち
んと載置しうると期待できる。この装置の使用および操
作は実用的であり簡単である一方、なお上記の諸利益と
諸口的を備えている。

第１図は粒子類の体積、光散乱および光放射特性の同時
ψ［ｊ定用の分析器の好ましい実施例の斜視図であり、
特に液体サンプリングコンソールを示しである。

第２図は第１図の２−２の戯に沿って眺めた本発明の好
ましいフローマニフォールドアセンブリーの拡大した横
断面図であり、本発明の光学的配置において用いる好ま
しい集光レンズアセンブリーも示しである。

第６図は第１図の分析器の液体流通経路と粒子体積測定
部分の模式的断面図であり、散乱光集光光学機器も示し
である。

第４図（・ま本発明の分析器において用いる好ましいフ
ローチャンバーの拡大した横断面図である。

第５図はフローチャンバーを通って流れろ粒子類の体積
、ケイ光および光散乱特性を特に同時（（測定するだめ
の光学要素と光路の概略図である。

第６図は第２図に記したＡ部分の詳細であり、フローチ
ャンバーの拡大した横断面図であり、フローチャンバー
を通って流れる粒子類の粒子体積および粒子のケイ光の
同時測定を示している。

第７図は細胞数の関数として表わされる４種のパラメー
ター、即ち、体積、光散乱および２種のケイ光特注のグ
ラフ図である。

第８図は第７図と同様なグラフ図であるが、領域境界部
の細胞を除くためにその体積および光散乱はゲート処理
しである。

第９図はゲートなしの体積の関数としての光散乱を示し
ている細胞研究のグラフ図である。

第１０図は第９図と同様なグラフ図であるが、第８図に
おいてゲート処理して示されているように光散乱と体積
はゲート処理しである。これによりリンパ球は単核白血
球および顆粒球から明確に分離されることが示されろ。

第１１図は第２のケイ光の関数として第１のケイ光の細
胞の研究のグラフ図であり、これは異なルサノボピュレ
ーションの細胞を示すために光散乱と体積のゲート弁に
頼っている。

本発明は種々の形態における実施例により達成されるけ
れども、ここでは本発明の好ましい実施例の図面および
詳細な記載が示しである。図面および詳細な説明は本発
明の原理を示す例であり、示した実施例に本発明を限定
するものではない。

本発明の範囲は特許請求の範囲およびそれに均等する範
囲によって判断される。

図面２寺に第１図および第２図について述べると、粒子
類の体積、光散乱（好ましくは広い角度ての光散乱）お
よび光放射特性（ケイ光は分析・に適した好ましい光放
射特開である）を同時に測定づ−ろための本発明の好ま
しい分析器１０か示されている。特（で、分、折器１０
は液体サンプリングコノノール１２を含む。このコンソ
ール１２は後（・て述べるように粒子の体積、光散乱お
よびケイ光を１ｉｌｌ定１−る要素類を含むように作ら
れているが、分析コンソール１４とは別になっている。

後に述べろように、分析コンソール１４は亀気的要素急
、ディスプレイスクリーンおよび分析器の作動制御に関
するその他のデータ情報を含む。第１図に見られる液体
サンプリングコンソールは分析する粒子類を含む液体を
流すように設計されたフローマユフォールト９アセンブ
リー１５を含む。フローマニホールド１５は好ましくは
２つの部分、即ち上部部品１６および下部部品１８から
製作される。これらの部品はフローマニホールドアセン
ブリー内のフローバス内に液体フローチャンバー２０を
交換可能に取付け、取外しできるように分解することが
できる。サンプル注入用マニホールド２１は記載の実施
例においては分析する粒子類を出たコンテナー２２をそ
の上に挿入できるように下向きに位置している。○−リ
ング２４は注入用マニホールドとコンテナー間の液体も
れが無いようにサンプル注入用マニホールド２１に含ま
れている。フローマニホールドアセンブリー１５の詳細
は第３図により一層明確に理解できるであろう。第６図
にはフローマニホールドアセンブリーの構成部分と機構
の概略を示しである。

第６図に示すように、フローマニホールドアセンブリー
１５は主流孔２６を含み、この主流孔は通常フローチャ
ンバー２０より直径が実質的に太きい。この主流孔は円
滑かつ層状の流れを促すために、フローチャンバー２０
に向けて収斂するテーパー付きのセグメント２８を含む
。主流孔２６にはサンプルチューブ２９か挿入され、そ
のチューブ２９内（では貫通する管腔６０が形成されて
いる。チューズ２９もまたフローチャンバー２０に向け
てテーパーするテーパー付きのセグメント６１を含む。

適旧な流れを与え、サンプル液と外箱流液の混合を避け
るために、テーパー付きのセグメント３１は主流孔の中
にその先端とフローチャンバー２０との間に僅かな空間
をあけて位置（〜でいる。このサンプルチューブの反対
側の端６２はコンテナ２２内のサンプルｉ夜６４の中に
浸るように注入用マニホールｌ−’２１を越えて延長し
ている。

このサンプル液はその中に分析する粒子却ろ６が分散し
ている。上述したように、Ｏ−リング２４は注入用マニ
ホールド２１と液体コンテナ２２の間の液体もれかない
ようにするためのシールとなっている。

チャンネル３５は主流孔２６と連絡している。

液体流中を流れている粒子類に対する外箱流液として液
体がチャンネル６５を通して主流孔に運ばれる。液体フ
ローマニホールドアセンブリーを組み立てるとチャンネ
ル３５の入口と液体サンプリングコンソールとの間には
適当な液体の連絡通路がつげられる。外箱液流（シース
流６６）には一般に圧力がかけてあり（例えば２５イン
チ（６６ｍ）Ｈ２Ｃ）典型的には１−２　ｍ４／分でチ
ャンネル３５を通って流れる。外箱液流（シース流）６
６はサンプｉ）ング液６４からの粒子類６６の分析を妨
害しないように実質的に粒子を含んでいてはならない。

又、シース流６６は後述するようにフローチャンバーの
オリフィスの両側に取位かかけられるように電流を伝え
ることができる必要かある。好ましくは食塩液がノース
流液として用いられる。

フローチャンバー２０の主流孔２６の反対側の端（（は
フローマニホールドアセンブリー１５内に別のチャンネ
ル３８が設けられている。チャンネル６８はフローチャ
ンバー２０の出口と液体が流通しうるようつながってい
る。第２のシース流３９はチャンネル６５内のシース流
６６の流れより若干低い圧力で通常チャンネル６８を通
って流れている。第２のシース流３９も又好ましくは食
塩水が用いられる。排液チューブ４０はフローマニホー
ルドアセンブリ〜内に位置し、チャンネルろ９と液体が
流通しうるようつながっており、その内側の端はフロー
チャンバー２０の出口端の近くにある。管腔４１は排液
チューブ４Ｄを通って完全に外部に連絡している。

ドレインチャンネル４２は主流孔２６と連絡しており、
マニホールドアセンブリーを通しての液体の主流が流れ
る時は普通閉じであるバルブ４４がついている。ドレイ
ンチャンネル４２は流れ操作が完了した後にマニホール
ドアセンブリーから液体を排水１−るために備わってお
り、７０−チャンバー２０および主流孔２６を通してそ
れらの目詰つを引き起こす可能性がある粒子類やその他
の妨害物を除去するために液体を逆方向（（流すことが
できる。このために、マニホールドアセンブリー内の７
一ス液体流を止め、そしてバルブ４４をこのアセンブリ
ーから液体内容物を排水するために開（する。バルブ４
４が開いている時にチャンネル６８からアセンブリーを
通して空気を次に注入することもできる。これによって
、システムから望ましくない粒子−状物質を一掃しシス
テムをきれいにする。

また別のフローチャ　ネル、４５はフローマニホール＼
ドアセンブリ−１５を通して延びており、サンプルチュ
ーブ２９に沿ってサンプル注入マニホールド２１内に開
口部４６で終る。粒子類６６およびサンプリング液６４
の入ったコンテナ２２がサンプル注入マニホールドに連
結した時に、液体サンプリングコンソール１２内の源か
ら加圧した空気がチャンネル４５を通して流されろ。通
常はこの空気はシース流液４６の圧よりも若干高い空気
圧でチャンネル４５を通して流される。この空気圧のも
とでは、サンプル液６４（・ま主流孔２６に向けてＬ向
きに（記載の実施例においては、第６図に見られるよう
に）サンプルチューブの管腔ろＯを通って運ばれる。サ
ンプリング液６４がサンプリングチューブのテーパー付
きの端６１を出ると、サンプリング液とシース流液が合
流する。好ましくは層流領域においては夫々異なる速度
を有する同軸上の２成分の液流が生じる。分析する粒子
類を含むサンプリング雇は流れる液体流の内側の成分と
なることがわかるであろう。この液体の流れがフローチ
ャンバー２０に入る頃にはシース流液とサンプリング液
の速度は実質的に平衡に達する。

更に、内１則のサンプリング液中の粒子類はこの液体流
の中心部を流れ、後述するようにオリフィスの壁から離
れている。従って、この流れの配置はフローチャンバー
の壁に粒子類が接、触する可能計を最少にしている。圧
力および流速を液体サンプリングコンソールでの制御に
より種々な値（で調節することができる。典型的な流速
としては、サンプリングチユーズを通るサンプリング液
・１・ま毎分５−５０マイクロリツトルである。更にチ
ャンネル４５におけろ空気圧は、フローチャンバーを通
って流れる粒子類の計算速度をコントロールするために
調節できる。典型的には、フローチャンバーを通って流
れる粒子数の計算速度は毎秒１００ないし１０００粒子
にわたる。主流孔２６のデザインおよび七の中のサンプ
リングチューブ２９の配置は２成分液体流がフローチャ
ンバー２０に向けて流れる時にそれに最小の流れ抵抗を
与えるよう意図されている。

光散乱光学器の一般的機能と位置を明らかにするために
光散乱集光レンズ１２１および光散乱孔１２５が第６図
に略図で示しである。光散乱光学器の詳細は後述される
であろう。

特に第６図と関連して第４図について述べると、フロー
チャンバー２０の好ましい実施例が示しである。第４図
から見てわかるように、フローチャンバー２０は好まし
くは円筒状であり、その中に流路が延びている。入口穴
４８および出口穴５０がフローチャンバーのお互いに反
対イ則についている。入口穴４８と連なっている滑らか
にテーパーしているくぼみ５１がフローチャンバー２０
の内側に内部に延びており、フローチャンバーの反対側
では出口穴５０とつながっている滑らかにテーパーして
いるくぼみ５２がフローチャンバーの内側に内部に延び
ている。液体の流路を形成するために小さな直径のオリ
フィス５４がくぽみ５１と５２をつないでいる。このオ
リフィスはフローチャンバー内の長袖上にあるように好
ましくは同心円に位置する。オリフィス５４は好ましく
ハ円形の横断面を有し、フローチャンバー２ｏの長手軸
に平行（Ｃ走る短かい円筒部をもつ。しがしながら、オ
リフィス５４の長手方向の長さは分析する粒子の種々の
要因によって変化するし、また、孔の横断面の形は円以
外の幾何学的形状をとってもよい。

更に、くぼみ５１および５２は好ましくはオリフィス５
４に向かって内部に滑らかにカーブしたテーパー表面と
して描がれているげｊｔども、例えば広い入口および出
口穴からより小さい直径のオリフィスに向けて直線的に
漸減する形のように他の形状も用いてよい。単に例示の
ために述べると、典型的なノロ−チャ／バーは外側の直
径約４　ｎｍでオリフィスの直径が０．０５ないし０．
１５晶である。

オリフィスの長手方向の長さは０．１０２ｗｎでフロー
チャンバーの全体の長さは４．７０ｍｍであろう。従っ
て、フローチャンバー２０を通る液体の流れに対してい
くらかの抵抗が流れろ液体がオリフィス５４を通過する
時に生ずることがわかるであろう。

従って、フローチャンバーの形状により周知のコールタ
−原理の利用が可能である。この原理によれば、非伝導
性の粒子が電気伝導性の媒体を含むオリフィスを通って
進む時に、オリフィスでの電気的インピーダンスあるい
は抵抗が増加するであろう。オリフィスに電気的ポテン
シャルをかげることにより、電気的パルスとしてイン上
０−ダンスの増加を測定することが可能である。オリフ
ィスを通過する粒子の体積とその粒子かオリフィスを横
断する時に測定されろ電気的パルスの大きさとの間に比
例関係が確立されている。オリフィスの両端にポテンシ
ャルをかげるために、シース流６６が陰極５６と接触す
るように液体チャンネル３５中に陰極５６を置く。７０
−チヤンハー２０のもう一方の側に、２番目のシース流
６９がそこで陽極と接触するようにチャンネル３８内に
陽極５８を置く。電流をこの電極間に流すことにより、
オリフィス５４にわたって電圧がかかる。ここに記載の
実施例においては、排チューブ４０の管腔４１、に第６
番目の電極６０を置く。電極６０は検出電極として用い
る。即ち、検出電極上の各瞬間の電圧は夫々の粒子がオ
リフィスを通過する時（（オリフィスの両側に負荷され
る抵抗やインピーダンスの変化に比例している。検出電
極６０は排夜チューブ４００）端で電圧を測定する。排
液チューブ４０には電流は流れないのでチューブ内の粒
子は電場によりもはや影響をうげない。実際に、検出電
極６０はオリフィスと陰極間の抵抗を、１１１］定１−
る。従って、別の検出電極６０が設るすられているげれ
ども、この検出電極６０はフローチャンバーのオリフィ
スにわたって電場を作る陽極として作用することは本発
明においては必要でない。これらの電極がオリフィスに
わたって電位をかける間に、電極で発生する泡がオリフ
ィス（（入らないようにするために電極をフローチャン
バーの領域の外に置くことが好ましい。

第６図に戻ると、二成分の液体流が入口穴４８およびオ
リフィス５４を通って同軸上に流れる形で主流孔２６か
ら流れる。サンプリング液体中の夫々の粒子３６がオリ
フィス５４を横切るとき、このオリフィスの抵抗が変化
する。夫々の粒子に由来する抵抗の変化を測定すれば、
その粒子の体積は決定できる。オリフィスにががる抵抗
の増加ニｆＡ丁ルハルスの大きさは分析コンソール１４
あるいはその他のデータ収集、表示装置に表示できる。

更に、粒子体積についての情報は後の分析あるいは再生
のためにコン上０ニーターに記憶されよう。粒子体積（
（ついて測定、表示および情報記・憶のために使用する
電気要素は周知である。このようなシステムの一例は米
国特許第４．１’１０，６０４号（（記載されている。

フローチャンバー２０を通って流れた液体の流れは排液
チューブ４０に集めろ。２番目のシース流６９の目的は
液体流を直接に排液チューブ４゜に送り込むことである
。粒子類を検出領域から排液チューブに効果的に導くこ
とにより、種々の大小の渦巻き流が排除される。これら
はさもなげれば検出領域において、誤ったパルスの原因
となるであろう。フローチャンバー２０の入口部におい
てと同様に、出ｌコ部、チャンネル６８および排液チュ
ーブ４０は液を排液チューノに集める時に検出領域から
滑らかな層流が得られるように設計しである。

上述したような液体の流れの配置によって、オリフィス
を通過する粒子類の体積が効果的（（測定できる。粒子
体積か測定されると同時に本発明の光学的態様によれば
これらの粒子類の光散乱と光放出特性の測定もできる。

従って、夫々の粒子が７０−チャンバーのオリフィスを
通過１−る時（（体積、光散乱および光放出の測定を同
時（・て行なうことができる。第５図に、粒子体積の測
定と同時に粒子類の光散乱と光放出特性を測定てきる本
発明の好ましい光学成分の概略図を示しである。

本発明に記載の実施例の特定の成分に関する以下の論議
のためにはサンプル液中のすべてではないにしても幾つ
かの粒子はケイ光色素のような光を放出する標識物質に
対する親和性を有することが想定されている。記載の実
施例においては、粒子類を標識する物質はケイ光特性を
有している。

例示のために述べれば、このケイ光性物質は色スイクト
ルの青／緑の範囲に励起をうけて色ス投りトルの緑から
赤の領域に再放射あるいはケイ光を発する。実施例にお
いては例示のために光学成分はこれら模範的な色の領域
について述べである。

しかしながら、用いる標識物質によって本発明において
は異なる光学成分も使用できることがわかるであろう。

例えば、標識物質は励起されて異なった色領域に複数の
ケイ光を発したり、標識物質がケイ光の代りにリン光あ
るいはその他の光の放出を示したりするものでもよい。

第５図の概略図について述べると、白血球あるいはその
他の細胞類のような分析する粒子類はオリフィス５４を
通ってフロー線６５に沿って進むのが見られる。夫々の
粒子がオリフィスを通過する時にその体積は上述したよ
うにコールタ−原理に従い測定され、電気的なライン６
６に沿って示したように分析コンソール１４に送られる
。夫々の粒子は本発明の光学成分により光散乱および光
放出特性と同時に分析される。

粒子の標識に用いるケイ光性標識物質は共通して紫外勝
で励起されるから、本発明の好ましい励起光源は％（・
乞紫外領域に非コヒーレント性の光を発するものである
。光源７０は好ましくは１００ワツトの水銀小型アーク
ランプである。この水銀アークランプは黄色光から紫外
領域（Ｃわたって多（の輝線を放９寸する。本発明にお
いてはその他の非コヒーレント性光源も使用され得るこ
とは理解されるであろう。更に、レーザー等のようなコ
ヒーレント光もまた使用できよう。後述のフィルターエ
レメント類のいくつかは、狭い波長にわたる光を発生し
ケイ光性標識物質を励起させるのｉ・τ必要な色を選択
できるレーザーを用いる時は除くことができよう。しか
しながら、本発明の目的にはレーザーは水銀アークラン
プには必要でない、大きな容積、特別な電力および冷却
水を必要とするために好ましいものではない。

水銀アークランプ７０をとり囲んで曳）るのは楕円形の
反射鏡７１であり、これはランプからの光のすべて或い
は大部分を受は取る。この楕円形の反射鏡はランプから
のより大きな立体角の光を収束させる。像の質を高める
ためにレンズを使用することもできるカベ楕円形の反射
鏡が好ましい。

反射鏡は波長に影響されないが、レンズの場合は集合レ
ンズを使用しない限り、波長に影響されるからである。

光は次に楕円形反射鏡７１からコールドミラー７２に移
される。このコールドミラーは典型的には透明な薄いフ
ィルム状のガラス構造であり、短波長を反射し長波長を
通過させるような大小の反射率を示す。典型的には赤に
よび赤外の長波光は、熱を伴なう。従って、これらの長
波長を透過させろことによりランプから発生した熱の効
果のいくらかを除去する。図示はしていないが、２個あ
るいはこれより多くのコールドミラーを用い長波長の光
量を約１％にまで減少させたり、光学的成分のパッケー
ジにおいて光路を折り曲げたりできる。

ランプから誘導された光はコールドミラーの次に一連の
励起フィルター７４を通過する。ケイ光性標識物質を励
起するための波長帯は粒子類に結合したケイ光性標識物
質１（応じて選択される。これは記載の実施例では青／
緑である。水銀アークランプは一般に、粒子類が発する
可能性のあるケイ光の波長を含む広領域のスペクトルの
光を放射７するから、この励起フィルター類はバンクグ
ランドのケイ光を区別し、水銀アークランプ由来のケイ
光性標識′＃！Ｊ質と同じ波長の光を阻ＩＦづ−る。励
起フィルタ〜を通過後、ランプから送られた光はスリッ
トメンバー７５を通過づ−ろ。このスリットメンバーは
バックグランドの励起を除き、焦点７合わせ、粒子類イ
（分析するフローチャンバー２０内のオリフィス５４の
範囲に励起を限定する。第５図に見られるように、スリ
ットメンバー７５は長方形のスリット７６を含む。この
スリット７６はオリフィスの光軸に直角な平面における
長方形の断面形状に一般に合わせである。スリットメン
バー７５はその中に電気化学的に食刻したスリット７６
を有する真ち（少う製品であることが好ましい。

スリット７６を通過した後、進んだ光は励起ビームスプ
リッタ−７８に向かう。好ましくは、励起ビームスプリ
ンター７８は二色性フィルターである。記載の実施例に
おいては、この二色性フィルターは粒子類に励起エネル
ギーを運ぶための波長の光に対して効率の良い透過性を
示し、他方、この二色性フィルターはケイ光の色の領域
において粒子類から放出されたケイ光の色領域の光に対
しては効果的な反射板である。例えば、励起ビームスプ
リッタ−７８は粒子の方向にその励起のため（（青／緑
の光を透過するが、励起された粒子から放出される緑／
赤の光を効果的に反射する。第５図に見られるように、
透過する光の道すじは線７９ａ−７９ｂに示しである。

励起ビームスプリッタ−７８を通過した光は次にビーム
スプリッタ−８０に向かう。このビームスプリッタ−は
波長に関係な（光の約４係を取り出す。この４％あるい
は他の微量の光は、それからスリット７６を通ってくる
光を検出する励起光モニター８１に反射される。励起光
モニター８１は光の強度に比例する光電流を発生する。

励起光モニターのアウトプットは分析コンンール内の電
子機器に接続している。本質的に、励起光モニターはケ
イ光のゲインのフィードフォーワードな補ｉＥを行なう
。例えばスリットを通過づ−る光の発光強度が減少すれ
ば、粒子類上のケイ光標識物質のケイ光の強度もまた減
少するだろう。測定操作中の形式的な安定を得るため、
ランプから直接伝わってくるングナルか弱くなってしま
った場合、コンノールにおけるケイ光パルスによるゲイ
ンを比例的て増加させるように分析コンソール内にある
検知ユニットである前置増幅器に信号イど与える３、ラ
ンプは、時間、寿命、揺らぎなどととも（て変化づ−る
から励起光モニターの有用性はこれらの異常を補正する
機構？提供する。

励起ビームスプリッタ−７８からの光の大部分はビーム
スプリッタ−８０を通り、集光レンズアセンブリー８２
にはいる。集光レンズアセンブリー８２の目的Ｑま励起
光をフローチャンバー２０の中にあるオリフィス５４に
集めろことである。第２図および第６図は、第５図とと
もに励起光およびケイ光の伝達経路と同時に、粒子の体
積が決定できるようにフローチャンバーを流れる粒子類
６３の液流が描かれている。光の散乱の測定については
第２図および第６図では理解できない。なぜなら、光散
乱を測定する装置は好ましくは実質的に光の入射ビーム
に対して直角（（なっているからである。集光レンズア
センブリーは好ましくは粒子類からの励起光の像を結ば
せたり、ケイ光の放射を受光したりするのに同じレンズ
を用いるエビ０イルミネーテイングな方式がよい。特に
第６図でわかるよつ（（、ナヤンバー５４へ流れる液体
の同軸流は粒子類を液流の中心に保持し、その結果、粒
子類は、不均一な電場分布によりゆがんだ電気的信号が
生じるオリフィスの周囲の〜には近づかない。この中心
だけに限られた同軸流により、粒子類は均一な光・照射
を受ける極めて狭い領域内に制限される。従って、集光
レンズアセンフリー８２は好ましくはレンズ前面８４を
フローチャンバー２０の外径に直筬接して位置させるの
がよい。屈折調整液の薄層、例えばグリセロール８５が
固有ケイ光の影響を除去すると同時に、効果的な紫外光
伝達を行なわせるためにレンズとフローチャンバーの界
面につげられる。このグリセロールの層はまた必要に応
じて微調整や焦点を合わせるため、レンズアセンブリー
を若干動かすことも可能にする。レンズ前面８４とオリ
フィス５４を通過するフローチャンバー２０の長手軸と
の藺の距離を調節するには集光レンズアセンブリー８２
はオリフィス５４の中心に集められた粒子類に正しく焦
点を合わせるため、適当な作動距離を必要と１−る。

−例として述べれば、本記載の実施例（（おける作動距
離は約２０６ミリメーターである。しかし、フローチャ
ンバー２０の直径を小さくすることにより、作動距離を
約０．２５ミ！Ｊメーターまで減少させることが可能で
ある。典型的な高倍率拡大顕微鏡の通常の作動距離は０
．２５ミリメーター以下であり、本発明の集光レンズア
センブリーは、との種類のレンズの配列において通常よ
り大きな作動距離になるように設計されている。更に、
粒子類からの光の収集を最大にするためには、し／ズア
センブリーの開口数をできるだけ太き（し、一方レンズ
の球面収差の効果を最小にするのが望ましい。本発明の
目的のためには、必須ではないが、開口数が１．０以上
のものを使用するのが好ましい。

第２図を参照すると特にわかるように、集光レンズアセ
ンツリーは前述の要件を満たす複数のレンズ群からなる
ものである。更に、集光レンズアセンブリーは近紫外領
域の６５０ナノメーターから可視赤色光領域の６５０ナ
ノメーターまでの波長において、透過量の損失が低いこ
とも好ましい。

また、レンズアセンブリーは５０マイクロメーターのス
リットで適度に鋭いエツジを与えるため、対物面で０１
マイクロメーター以下のプラーサークルの解像力がある
ことが望ましい。この解像力は前述の６５０ナノメータ
ーから６５０ナノメーターのスペクトル領域て維持され
なげればならない。

また、集光レンズアセンブリーの製作においては固有ケ
イ光の小さい材料を用いるのが好ましい。

レンズ材料、大きさ、曲率や配置は上述の特徴を与える
ため種々変化させられうろことは明らかである。勿論、
レンズのシステムはエビイルミネーテイングな構造であ
るから励、収光とケイ光の変化に対して色収差が補償的
に修正されるように設計されている。

第６図で特にわかるように、光の経路７９ａから７９１
ｂで示される励起光はフローチャンバー２０の壁を通し
て伝わる。実際、励起光７９ａ−’７９ｂ、は集光レン
ズを通過するとき内１１１］へ曲けられて円錐型の形に
集まる。この光の円錐の頂点はスリット像を表わす長方
形平面のビーム断面をオリフィスの中に形成し、それ（
Ｃより流れの中の粒子類するいは細胞類の経路に大きな
光強度を持つ領域か生生じる。典型的には、光ビームの
軸に対して４５度の半角をなす、大きな立体角に対−ｊ
る高い伝達ビームを測定領域（でおけるエネルギーの高
度な集中をもたらすのに使用する。７０−チャンバーは
従って、励起光、ケイ光の波長、照射領域内（そある粒
子から反射したり散乱したりする光の波長にもっとも望
ましくはバックグラウンドのケイ光（ノイズ）を最小に
抑匍］′１−るため、固有のケイ光が低くなくてはいけ
ない。石英や種々の夕′イブのガラスといった使用可能
な透明物質が仄さんあるが、フローチャンバーば溶融シ
リカがらイ乍るのが好ましい。従って励起光はオリフィ
ス５４を通るとき、個々の粒子６３上に集められる。ケ
イ光標識物質に対して親和性を有づ−る粒子類は励起エ
ネルギーか粒子類に達した時、急速、知励起される。

一旦励起されると、ケイ光が例えば緑／赤といった色領
域に生じ、それは青／′緑の励起光の色領域とは異なっ
ている。このケイ光粒子はフローチャンバー２０の壁を
通１−てケイ光を放射し、８８ａ−８８ｂに図式的に示
した光学経路を通って集光レンズアセンズリ−８２へ入
る。粒子類が放射−ｒるケイ光はあらゆる方向に生じ、
その例えば約６０パーセントが集光レンズアセンブリー
により集められる。

第５図に戻るとケイ光あるいは再放射光は集光レンズア
センブリー８２とビームスプリッタ−８゜に伝わる。再
放射光のうち少量、例えば４パーセントが反射のためビ
ームスプリッタ−８０を通過するとき失われる。反射さ
れた再放射光はバソソル（図示せず）の中に捕えられ、
その結果光のノイズは最少に保たれる。再放射光が励起
ビームスプリッタ−７８に到達した時、この二色性フィ
ルターの反射性は例えば緑／赤の領域の波長の再放射光
の反射を引き起こ￥。粒子類からの再放射光が効率的か
つ効果的に捕えられるため、励起ビームスプリッタ−７
８はパッケージさ２ｔたアセンブリーにおいて再放射光
の光軸に対して角度をずらして配置されることになる。

励起ビームスプリンターの方向角度は変化させてもよい
が、しかしながら、再放射光の光軸に対してできるだけ
直角に近く維持するのが好まし℃・０勿論、励起ビーム
スプリッタ−を再放射光の光軸に対して全く直角にする
ことばできない。なぜなら、その場合光は反射して集光
レンズに戻されてしまうからである。

一方、ろ０度から４５度あるいは更に大きな方向角をと
ると反射光と透過光の切り換えの鋭敏性が減少する。従
って、可視スペクトルのＲ／赤の領域だけ捕えて反射す
る代りに、重複した広範囲の可視光領域の光を反射する
ことになる。これは望ましい可視領域の強度を減少させ
る。これを考慮すると、励起ビームスプリッタ−は再放
射光の光軸に対して直角な面から好ましくは１０度以下
の角度をとるのがよい。

再放射光は励起ビームスプリッタ−の二色性パラメータ
ーにより反射された後、球面鏡９０に向かう。球面鏡９
０は好ましくは装置を小型に納める目的のため、光学経
路を色収差を起こすことなく屈折させるために都合良く
使用される。もし、装置の大きさに何の制限もなげれば
球面鏡は省略することができる。本記載の実施例におい
て、装置の小型化が望ましい時は、球面鏡を励起および
遮断フィルター（後述する）の両者と物理的に近い位置
に置き、これらを１つのモジュールにまとめることが可
能である。このようにすることによって、異なるケイ光
標識物質が分析する粒子類に用いられた時は、フィルタ
ーモジュール全体を容易に取り外したり、交換したりす
ることができる。

球面鏡９０の次に粒子類からの再放射光は本記載の実施
例においてもう一つの二色性ミラー９１に向かう。二色
性ミラー９１の役割は再放射光の光路を伝わってきた２
つの異なる色の光を分けることにあり、その結果、それ
らは別々に分析が可能トなる。二色性ミラー９１か含ま
れるのは、球面鏡９０からの再放射光がさらに分ける必
要なく分析できる限りは単なる好ましい実施例と１〜て
理解できる。従って、二色性ミラ〜９１が含まれるのは
、１つあるいはそれ以上の可視領域におけるケイ光の分
析を可能にする本発明の融通性を表わしている。よって
、二色性ミラー９１は例え１・ま可視スペクトルの赤色
領域と緑色領域をわけるために用いられろ。赤色領域の
波長の光を光学経路９２ａ−，９２ｂに沿って反射させ
、一方、緑色領域の波長の光は光学経路９４ａ−９４１
）Ｋ沿って、二色性ミラー９１を通って透過させるよう
にすることができる。他の色の光を二色性ミラーにより
分離することも可能であり、例えば、緑色領域から青色
領域の分離が可能である。

放射光９２ａ−９２ｂはただ１つの可視領域、例えば本
例の場合赤色の波長の光を伝達するよう（でデザインさ
れたバリアーフィルター　９５に伝わる。

従って、バリアーフィルター９５は二色性ミラ〜９１か
も反射される緑色領域の波長の光を遮るのに用いられる
。また、粒子類に当たってはね返り、再反射光の中に含
まれていた青色励起領域の波長の光もいく分存在する。

バリアーフィルター９５はまた明らかに好ましくないノ
ミノクダラウントゝのノイズを除くため、青色光のこう
した逆散乱をも遮るようになっている。同降（（バリア
ーフィルター９６か緑色光の光学経路９４ａ−９４ｂに
沿って設けられている。バリアーフィルター９６は緑色
領域の波長の光を通過させ、一方、二色性ミラー９１を
透過してくるかも知れぬ外来の赤色光を遮るようになっ
ている。この経１＠（（沿った青色の逆数乱光もまたバ
リアーフィルター９６によす遮られ、それによりこの経
路を伝わるバックグランドののノイズは除去されるか、
あるいは最小になる。

分析コンソール１４における電気回路の構成部分におし
するケイ光の補償を与えることも可能である。

即ち、用いられるのが赤緑あるいはその他の色のどれか
であるかに拘わらず、ケイ光帯が重なり易い場合には、
電子機器はケイ光検出器の中で検出される好ましくない
色のバンドに由来する相当面の信号を減少させるように
デザインすることか可能である。

スリットメンバー９８と１００は光かそれぞれスリット
９９と１０１を通るように、それぞれの光学経路に設け
られる。スリット９９と１０１・）まスリット７６に類
似する。前者のスリットは励起ビームがそこを流れてく
る粒子類の流れと衝突する場所であるフローチャン・ｚ
−２０のオリスイス５４０２次元領域だけを光検出器が
とらえるようπする。これらのスリットは従って、光検
出器に散乱したバックグラウンド光が入るのを排除する
。例えば、スリット９９と１０１は真ちゅうの板に電気
化学的方法でエツチングされた穴でもよい。

２つのケイ光検出器１０２と１０４は、２つの分のを受
は取るようになっている。これらのケイ光検出器は光学
的信号を電気的信号に変換する通常の光覗子倍増管であ
る。これらの眠気的信号は次いでそれぞれ電気回路１０
５と１０６を通って分析コンソールに入力され、分析の
目的のため電気的信号が電子機器（（より処理される。

分析コンソール内には種々の表示手段および清報の提供
、収集、記録手段が備えられている。グイ光に関する電
気的信号の分析を行な５　’を気的装！電は公知技術手
段を含み、分析やテータ供与の複雑さの７ベルに応して
変化する。ケイ光の測定のための、そのような電気的シ
ステムの１例は米国特許第３．８２６．３６４号に記載
されている。

第５図はまた光散乱光学ｒａ器を構成する本発明の装置
を図示している。上述したように、フローチャンバー２
０を流れる粒子類に衝突する光は多くの方向に拡散する
。従って、発明の最も広い意味において光散乱光学機器
はあらゆる方向のこうした散乱光（それが入射光ビニ不
の正方向、逆方向あるいはその中間の角度のものであろ
うと）を捕えるごとに向けられる。細胞類、特に白血球
のサブクラスの良好な識別は、光散乱が光の入射ビーム
に対して好ましくは広い角度で検出されることにより可
能であることがわかった。

装置の好ましい配置を満足させるために、次に説明する
光散乱装置は流路６５によって代表されるフローチャン
バーを通る粒子の流れの方向に対して、はぼ直角かある
いは完全に直角になったｎ１１１１２０の上に位置する
。光散乱光学機器の１！１１＋　１２　Ｑは光の入射ビ
ーム（（対してもは１ぼ直角あるいは好ましくは直角に
なるように位置する。フローチャンバー２０を通る粒子
類により散乱される光はあらゆる方向に進む。よって、
この散乱光を最大３６０度の方向で検出することが可能
である。しかし本発明の範囲の広角度とは実際上可能な
程度に散乱光を集めることである。ここで用いられろよ
うに、広角度の検出は光の入射ビームに対して１０度か
ら１７０度の範囲の角度で代表される。この広い角度範
囲の中で、本発明は光散乱光学機器が光の入射ビームの
軸に対して６５度から１１５度の角度範囲にある散乱光
を検出づ−る場合に最も満足のいく結果を与える。

散乱光を集める散乱光レンズ１２１はフローチャンバー
の隣りあるいはａ＜Ｋ粒子類が通るオリフィス５４と一
列をなすように位置する。散乱光レンズ１２１の実際の
位置は第２図簗び第６図を組み合わせて既に説明［−だ
フローチャンバーの障りの集光レンズアセンブリー８２
の配置と同様である。

粒子類によって散乱された九を集め、この光を光検出器
１２２に収束させるのが散乱光レンズの役割てある。こ
の目的において、光散乱を集める正確さは橡面開ロメン
・＜−１２４により高められる。

第５図に見られるように像１匂開ロメンバー１２４は光
検出器１２２に散乱光が伝わるためのスリット形状の開
口１２５を含む。像面開しコは散乱光を集めるレンズの
像形成面にあり、ノイズを発生するバックグラウンドの
光を遮ぎる役割を果たし、一方、実質上粒子類や細胞類
からの散乱光だけ開口を通すようにする。粒子類からの
散乱光は列えばして通常は伝えられる。光中継機１２６
から散乱光は好ましくは検出器１１］２や１０４と同様
の光電子倍増管である検出器１１２２に向１ノ・う。粒
子かにより散乱された光を集め、それらの光学的信号を
電気的信号に変換し、電気回路１２８を通して分析コン
ソール１４に伝えるのが検出器の１２２の役割である。

本発明の操作の結果は第７図から第１１図に示され、そ
れらはサンプル中の粒子類のサブボヒ０ニレージョンを
識別するための本発明のいくつかの優れた特徴を表わし
ている。例えば、献血者から得られた人の全血サンプル
は既知の方法で赤血球厨胞を除いたり、あるいは嘔離し
てから、残っている白血球や他の細胞の分析を可能とす
るため準備される。白血球細胞をフローサイトメトリー
法に付する前に白血球は２つの適当な免疫ケイ光性染料
により標識される。例えば、励起されたとき可視ス投り
トルの緑色領域における発光スにクトルを与えるフルオ
レセイン・イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）や、励起さ
れたとき可視ス硬りトルのオレンジ色の領域に発光スは
クトルを与えるフィコエリスリン（ＰＥ）がある。

このサンプルを例えば前記したフローサイトメトリー法
置に流し、個々の細胞類の体積、ケイ光、光散乱の特徴
に関するデータを集めると、こうした情報は白血球の種
々のサックラスを識別するのに用いられる。上述したよ
うに、免疫機能の状態を分析する場合にはリンパ球のサ
ブポピユレーションに注意が払われ、顆粒白血球や単核
白血球はこの分析から除外されなければならない。第７
図に示したように、４つのパラメーター（それらはすべ
て細胞数に関するものである）が１つのヒストグラムと
して表わされる；体積、光散乱、２種のケイ光レベルが
表示される。第７図では、一般的に１ｅｕ２と呼ばれる
白血球の１つのサブクラスはＰＥにより標識され、一方
、白血球の２番目のサブクラスは上述したようにＦＩＴ
Ｃで標識される。

前記した分析器の中の４つのチャンネル表示器を用いて
、体積、光散乱、２種、のケイ光の特徴に関する情報が
使用者に１回の表示で示されうる。

第８図は体積や光散乱の周辺的領域がゲート処理で除去
されたことを除き、第７図について得られるのと同じ情
報を表わしている。その結果、第８図においては体積と
光散乱のグラフによる表示は第７図に示された同じパラ
メーターの高い部分および低い部分の周辺的領域が切断
除去されて表示されている。一方、第８図のケイ光の表
示のどちらも第７図のものとは異なる曲線を示している
。

その理由はゲート処理で残された光散乱と体積の領域の
中に入っている１ｅｕ２と１ｅｕ３の細胞だけが数えら
れたからである。このように、これらの細胞のより詳細
な分析はゲート処理の要ビトにより可能となる。

ヒストグラムの方法の代りに、第９図及び第１０図では
上述の分析装置により、好ましくは同時＋＝’ｖ得られ
た細胞類の光散乱と体積のパラメーターの［点プロット
ｊによる表示を表わしている。第９図では個々の細胞を
表わす各点がサンプル中の研究されるすべての細胞の体
積の関数としての光散乱の分布を示している。第９図に
よれば細胞あるいは点は６つあるいは４つの異なる領域
に集まっていることは確かであるが、何らかの混入また
は不明瞭性か認められろ。これは、すべての細胞類が体
積や検知される光散乱の全領域について測定される時に
は、領域の境界においである程度のオーバーラツプがあ
り、そのため各領域の識別が困難になるという事実のた
めである。

点の領域の境界におけるこうした重なりや交わりを克服
するため、光散乱と体積のゲート処理が第８図に用いて
上述したように用いられろ。今、第１０図に注目すると
、第９図に見られた多くの点が除去されていることがわ
かる。これらの点は第１０図に示しであるようにＸ軸と
Ｙ軸（（沿って６つの領域にゲート処理することにより
光散乱対体積のプロットから排除する。いわゆる重複領
域にある周辺の点が一旦排除されろと白血球の種々のサ
ブクラスを分離し、同定し、区別するのに最も実際的と
なる。例えば、数値１６０で示される点の集合はサンプ
ル中のリンパ球のサブポピユレーションを表わす。数値
１３２で示される点の集合はサンプル中の単核白血球の
サブポピユレーションを表わす。数値１３４で示される
点の集合はサンプル中の顆粒白血球のサブポピユレーシ
ョンを表わｆ。こうした白血球のサブクラスの明らかな
分離と区別により、本発明は種々のサブポピユレーショ
ンのより正確な同定を可能１（するのである。

さらに第１１図に示されるように、ＦＩＴＣ及びＰＥで
標識されたサンプル中の白血球は、それらのそれぞれの
体積や光散乱のパラメーターと好ましくは同時に、２種
のケイ光パラメーターの「点プロット］として表わされ
る。それぞれの免疫ケイ光染料で標識された１ｅｕ２と
１ｅｕ３の細胞類は前述した体積と光散乱のゲートを施
こ￥特徴を組み合わせて表わされる。よって、数１直１
３６と１６８によって表わされる１ｅｕ２と１ｅｕ３の
サブクラスはそれぞれ体積、光散乱、２種のケイ光パラ
メーターについて同時に得られる情報を信頼することに
より、一層明確に分離することができる。それにより、
使用者が細胞の種々のサブポピユレーションを識別する
ためのより多くの情報が得られろ。

以上説明した通り、本発明はサンプル中の粒子類のい（
つがのサブポピユレーションを識別する方法及び装置を
提供づ−る。最も重要な点は、本発明は細胞の体積と光
散乱を用いるフロニブイトメトリー法によりヒト白血球
のサブクラスを測定′するのに有用だということである
。更に個々の細胞の体積、ケイ光、光散乱の特徴が好ま
しくは同時に得られ、その結果、サンプル中の細胞の種
々のサブポピユレーションを分析し、分離し、同定１−
るのに有意義なデータが得られろわけである。

【図面の簡単な説明】

第１図は粒子類の体積−光散乱および光放射特性の同時
測定用の分析器の好ましい実施例の斜視図であり、特に
液体サンプリングコンソールを示しである。 第２図は第１図の２−２のｆｇ（ｌこ沿って眺めた、本
発明の好ましいフローマニフォールドアセンブリーの拡
大した横断面図であり、本発明の光学的配置において用
いる好ましい集光レンズアセンズリ−も示しである。− 第６図は第１図の分析器の液体流通経路と粒子体積測定
部分の模式的断面図であり、散乱光集光光学機器も示し
である。 第４図は本発明の分析器にどいて用いる好ましイフロー
チャンバーの拡大した横断面図である。 第５図はフローチャンバーを通って流れる粒子類の体積
、ケイ光および光散乱時１１を特に同時に測定するため
の光学要素と光路の概略図である。 第６図は第２図に記したＡ部分の詳＋Ｍｔｌであり、フ
ローチャンバーの拡大１−だ横断面図であり、フローチ
ャンバーを通って流れる粒子類の粒子体積および粒子の
ケイ光の同時θ１ｊ定を示している。 第７図は細胞数の関数として表わされる４種のパラメー
ター、即ち、体積、光散乱および２種のケイ光特性のグ
ラフ図である。 第８図は第７図と同様なグラフ図であるが、領域境界部
の細胞を除くためにその体積および光散乱はゲート処理
しである。 第９図はゲートなしの、体積の関数としての光散乱を示
」−でいる細胞研究のグラフ図である。 第１０図は第９図と同様なグラフ図であるが、第８図に
３いてゲート処理して示されているように光散乱と体積
（・まゲート処理しである。これによりリンパ球は単核
白血球およびＭ粒球から明確に分離されることが示され
る。 第１１図は第２のケイ光の関数として第１のケイ光の細
胞の研究のグラフ図であり、これは異なるサブポピユレ
ーションの、＋＋＋＋胞を示すために光散乱と体７漬の
ゲート弁に頼っている。 １０　　本発明の分析器の一例、　　　２０　　　フロ
ーチャンバー、　　２６　　主流孔、　　６５　　粒子
、　　３４　　ザンプル液、　　　３５．３８．４５チ
ヤンネル、　　６６　　外相液流（シース流）。 ６９・・　第２のシース流、　　５４　　・オリフィス
。 ５６　　陰極、　　５８−　陽極、　　　６０・・・　
第６の極、　　７０　　・光源、　　７１　・　反射鏡
、７２コールドミラー、　　７４　　励起フィルター。 ７５．９８，１００・　スリットメンバー、　　　７８
．８０ビームスプリッタ−１８１励起光モニ ター、　　８２　　集光レンズアセンブリー。 ９０　　球面鏡、　　９１　　二色性ミラー。 ９５．９６　　・・バリアーフィルター、　　　１０２
，１０４ケイ光検出器、　　１２１・・　光散乱集光レ
ンズ（散乱光レンズ＞、　　　１２−ｓ　　　開口。 ｑ＋　作出願人　　ｋクトン・デイツキンソン・アンド
・カンパニー 代　理　人　　弁理士　　湯　浅　恭　三：　　：（外
４名）′− ＦＩＧ、４ グＬト。 ＦＩＧ、１０　　、　　　　　　　　ｉ卆槙ケ゛’−１ ＦＩＧ、１１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）サンプル中の白血球細胞を白血球の流れの方向に
   実質的に直角な軸方向から入射する照射ビームから供給
   される光の領域を通して実質的に一度に一個ずつ通過さ
   せ； 上記の領域を通過する細胞に関する電気的インビ′−ダ
   ンスの変化を検知することにより、細胞か上記の範囲を
   通過する時に夫々の細胞の体積を測定し； 細胞が上記の領域を通過する時に、夫々の細胞によって
   散乱される光を入射する照射ビームの入射軸に対して広
   い角度にわたって検出し；そして夫々のｗＩ胞について
   測定した体積をそれぞれについて検出した光散乱の関数
   として関連付けることにより、異なるサブクラスの白血
   球細胞を識別する； ことを特徴とする、血液から得たサンプル中の白血球の
   サックラスを識別する方法。 （２）細胞をオリアイスを有する透明なフローチャンバ
   ーに通過させ、細胞がオリフィスを流れる時に電気的イ
   ンピーダンスの変化を特徴する特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 （３）細胞が、細胞を含まない電気伝導性の外鞘液流お
   よびそれと同軸方向に流れる細胞を含む内液流よりなる
   二層液流としてフローチャンバーを特徴する特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 （４）夫々の細胞によって散乱された光を、照射ビーム
   の入射軸に対して６５°ないし１１５°におよぶ広い角
   度で検出する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 （５）夫々の細胞によって散乱された光を、照射ビーム
   の入射軸に対して実質的に９０゛＼の軸上で検出する、
   特許請求の範囲第４項記載の方法。 （６）識別の採業がリンパ球を単核白血球および顆粒白
   血球から識別することを特徴とする特許請求の範囲第゛
   １項記載の方法。 （７）細胞通過の工程において、流れる細胞（てコヒー
   レントな照射ビームを照射することを含む、特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 （８）照射ビームによる特定の光学的刺激に対して所定
   の螢光反応を示す螢光色素で上記のサンプル中の白血球
   を標識し； 細胞が光の領域を通過する時に螢光色素により放射され
   る螢光を検出し；そして 夫々の細胞についての螢光、体積および光散乱に基づき
   白血球細胞の異なるサックラスを識別する； ことを更に包含する、特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 （９）夫々の細胞により放出される螢光を細胞体積の測
   定および夫々の細胞により散乱される光の検出と同時に
   測定する、特許請求の範囲第８項記′載の方法。 （１０）サンプル中の粒子類を上記の粒子類に向けられ
   た光の領域を通して実質的に一度に一個ずつ流し； 夫々の粒子の体積を測定し； 粒子が上記の領域を通過する時に光の上記の方向に対し
   て広い角度にわたって夫々の粒子によって散乱される光
   を測定し；そして 夫々の粒子について測定した体積をその測定した広い角
   度にわたる光散乱と関連させることにより上記粒子類の
   異なるサブポピユレーションを識別することを特徴とす
   る、サンプル中の粒子類の複数ノサメボピュレーノヨン
   を識別する方法。 （ＩＩ）夫々の粒子の体積を、粒子が光の領域を通過す
   る時に測定する、特許請求の範囲第１０項記載の方法。 （１２）　　粒子類を標識剤で標識し；光の領域を通過
   する粒子と結合した標識剤を検知し；そして夫々の粒子
   についての体積の測定、光散乱の検出および標識剤の検
   知を同時に行うことにより粒子類の異なるサブポピユレ
   ーションを識別することを特徴とする特許請求の範囲第
   １０項記載の方法。 ０３）標識工程が粒子類を複数の異なる標識剤で標識す
   ることよりなり、上記の粒子類の異なるサブポピユレー
   ションを識別するために異なる標識剤を検知するように
   した、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 （１４）　　′４気感受性のオリフィス；細胞の体積に
   応じて電気的信号の発生を引き起こすために、サンプル
   中の白血球細胞を実質的に一度に一個ずつオリフィスを
   通る流路に流す手段；上記のオリフィスを通して上記の
   細胞の流れの方向（（対して実質的に直角な軸方向から
   入射する照射ビームを与える手段； 夫々の細胞により散乱される光を細胞か光の領域を通過
   する時に、照射ビームの入射軸に対して広い角度にわた
   って検出する手段；および夫々の細胞の体積についての
   電気的信号をその検出した光散乱の関数として関連伺け
   ることにより白血球細胞の異なるサックラスを識別Ｊ−
   る手段；を有することを特徴とする、血液から得たサン
   プル中の白血球の異なるサブクラスを識別する装置。 （１５）　　オリフィスが透明なフローヂャンバー内に
   ある、特許請求の範囲第１４項記載の装置。 ０６）オリフィスの両１則にそれぞれ位置し、その間に
   電位差を発生させるための一対の電極を特徴する特許請
   求の範囲第１５項記載の装置。 ０７）照射ビームを与えろ手段が非コヒーレント性の光
   源である、特許請求の範囲第１４項記載の装置。 （１８ｊ　　照射手段がオリフィスに向けて実質的に円
   錐形状の光ビームを与える、特許請求の範囲第１７項記
   載の装置。 ０９）光源か水銀アークランプである、特許請求の範囲
   第１７項記載の装置。 （２０）散乱光を検出する手段か照射ビームの入射軸に
   対して６５°ないし１１５°にわたる角度で散乱光を特
   徴する特許請求の範囲第１４項記載の装置。 （２１）散乱光を検出する手段が照射ビームの入射軸に
   対して実質的に９０’の軸上で散乱光を特徴する特許請
   求の範囲第２０項記載の装置。 （２２）散乱光検出手段が、光学的信号を電気的信号に
   変換できるように光電子倍増装置を包含する、特許請求
   の範囲第１４項記載の装置。 （２３）　　散乱光検出手段が、細胞により散乱された
   光を光電子倍増装置へ向けて収束させるために、オリフ
   ィスの近くに置かれた散乱光集光レンズを特徴とする特
   許請求の範囲第２２項記載の装置。 （２４）　　散乱光検出手段が、散乱光集光レンズと光
   電子倍増装置との間の上記集光レンズの結像面１ｃ位置
   する像面間［」を特徴とする特許請求の範囲第２６項記
   載の装置。 （２５）細胞に結合した励起螢光色素（・でより放射さ
   れろ螢光を検出する手段を特徴とする特許請求の範囲第
   １４項記載の装置。 （２６）識別の手段が、同時に測定する夫々の剖旧胞の
   螢光、体積および広い角度にわたる光散乱を関連させろ
   ことよりなる、特許請求の範囲第２５項記載の装置。 （２７）螢光を検出する手段が色スＲクトルの特定の領
   域における光を検出することができる光検出装置を特徴
   する特許請求の範囲第２５項記載の装置。 （２８）識別の手段がサンプル中の白血球細胞の測定体
   積および光散乱の分布を示す表示手段を特徴とする特許
   請求の範囲第１４項記載の装置。 （イ）サンプル中の粒子類をその粒子に向けられた光の
   範囲を通して実質的に一度に一個ずつ通過させる手段； 夫々の粒子の体積を測定する手段； 夫々の粒子により散乱される光を、粒子が上記の領域を
   通過する時に光の上記の方向に関して広い角度にわたっ
   て検出する手段； および測定した夫々の粒子の体積を検出した広イ角度ニ
   わたる粒子の光散乱と関連させることにより上記の粒子
   類の異なるサズボビ゛ニレージョンを識別する手段； を有することを特徴とする、サンプル中の粒子類の複数
   のサブポピユレーションを識別する装置。 （３０）サンプル中の標識した粒子類を実質的に一度に
   一個ずつ上記の粒子類に向けられた光の領域を通して通
   過させる手段； 夫々の粒子の標識剤の存在、体積および光散乱を、粒子
   か上記の領域を通過する時に同時に測定する手段；およ
   び 上記で測定したパラメーター類の少なくとも２つの組み
   合わせを基に粒子類の異なるサブポピユレーションを識
   別する手段； を有することを特徴とする、標識剤で標識したサンプル
   中の粒子類の複数のサブポピユレーションを識別する装
   置。